Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция систем интерферона и иммунитета модулирубщими препаратами как основа совершенствования профилактики гриппа

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция систем интерферона и иммунитета модулирубщими препаратами как основа совершенствования профилактики гриппа"

На правах рукописи

ПРОТАСОВА Светлана Федоровна

РЕГУЛЯЦИЯ СИСТЕМ ИНТЕВЕЕРОНА И ИММУНИТЕТА МОДУ ЖРУЩИМИ ПРЕПАРАТАМИ КАК ОСНОВА СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ПРОФИЛАКТИКИ ГРИША

(03.00.06 - вирусология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте гриппа РАМН.

Научные консультанты:

член-корреспондент РАШ, академик РАЕН, «профессор Ф.И.ЕРПЮВ

докт. биол. наук О.И.КИСЕЛЕВ

Официальные оппоненты: академик РАШ, профессор Л.Б.БОРИСОВ докт.мед.наук, профессор О.А.АКСЕНОВ докт.мед.наук П.Г.НАЗАРОВ

Ведущее учреждение:

Государственный научный центр пульмонологии МЗ и Ш РФ.

Защита состоится " Ust-Q«^. 199 £ г. в_ /3 часов на заседании диссертационного совета (Д 074.48.01) при НИИ гриппа РАШ (Санкт-Петербург, 197022, ул.проф.Попова, 15/17).

Автореферат разослан 199 b г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Е.Е.ПОКРОВСКАЯ

ОЩАЯ ХАРАХТШСТШ РАБОТУ

Актуальность исследования. Ироалема профилактики гриппа остается до настоящего времени все еще окончательно не решенной, хотя в последние года появились определенные достижения в этой области. Основной трудностью, лимитирующей создание и использование эффективных гриппозных вакцин, считается выраженная антигенная изменчивость гирусз грипп«, Однако. причиной этого могут быть и другие особенности, присущие возбудителю гриппозной инфекции.

Анализ литературы свидетельствует о том, что репродукция вируса гриппа, являвшаяся пусковым механизмом развития гриппозной ивфекции, происходит на фоне выраженного угнетения защитных сил организма. Установлено, что для большинства штаммов вируса гриппа в структуре гемагглютинина характерно наличие консенсус-последовательности, близкой по структуре к участкам поверхностных белков вирусов иммунодефицита человека, которая, вероятно, и обусловливает ишунодеярессивные эффекты вируса гриппа /1^ль-тяев A.D. а др., 1988/. Наблюдается угнетение выработки интерферона, интершейкина-2 и всего каскада защитных механизмов неспецифической резистентности и клеточного иммунитета, основными эффекторами которых являются ЕК, а такде Т-киллеры, К-клетки, обеспечивающие антителозависимую цитотоксичность, макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты / James I,., Hitchi a.,v., 1384; de Kartino м. et ai., 1985; Труишнская Г.Н. и др., 1988; Grigorian S.S., Ershov F.i., 1991/. Это позволяет придтл к заключению, что одними из основных звеньев патогенеза гриппозной инфекции является вызываемые вирусам гриппа интерферон-дефицитный синдром и состояние иммунодефицита клеточного типа.

Вирус гриппа способствует выработке гуморальных антител, но в силу выраженной антигенной изменчивости вируса они не оказывают защитного действия при появлении нового штамма, в отличие от факторов клеточного типоспецифического иммунитета / Taylor P.M., HSkonaa В.А., 1Э86; Ada G. L. , 1988/.

В ответ на внедрение вируса гриппа в организме начинают вырабатываться биорегуляторы и гомеостатические агенты - интер-фероны, способствующие восстановлению нарушенного гомеостаза. Имцуномодулирущее действие интерферонов эндогенного'или экзогенного происхождения имеет противоположную вирусу гриппа на-

правленность и сводится к активизации, в основном, вышеперечисленных клеточных факторов иммунитета / Beiadi J. е. et ai.,IS83; Iicrbermun В. В., 1986; Gastl G., Hubcr С., 1988/. ЭТО Дает основания полагать, что одним из важнейших свойств интерферона является его антидепрессивный эффект.

Однако, способность вируса гриппа угнетать функциональное состояние систем интерферона и иммунитета, с одной стороны, и его выраженная антигенная изменчивость, в связи с чем антитела не мо-17т нейтрализовать вновь аоявлялцийся штамм - с другой, помогает вирусу преодолевать иммунный барьер организма и вызывать возникновение новых эпидемий. Есть основания полагать, что с сочетанием этих двух особенностей вируса гриппа связана и низкая профилактическая эффективность современных гриппозных вакцин, а также возможность ее повышения у животных с помощью некоторых интерферон индуцирующих веществ (глзакан) ЛИваршан Я.С. и др./.

Наряду с этим есть данные о том, что вирусу не всегда удается ся спровоцировать возникновение интерферондефицитного и иммуно-дефицитного синдромов. В таких случаях гриппозная инфекция не развивается. Врожденная интерферонзависимая резистентность к вирусу ГрИПДа СВЯЗаНа С ГеЯОМ MX / Towbin н. et ai., 1992/. Описана также невосприимчивость к гриппозной инфекции, связанная с наличием у таких людей противогриппозного клеточного иммунитета / bazar А., Wright p. F. , 1980/.

Все это свидетельствует о необходимости разработки нового подхода к проблеме профилактики гриппа, основанного на регуляции систем интерферона и иммунитета модулируидими препаратами с целью обеспечения невосприимчивости ко всем антигенным вариантам вируса гриппа, что представляет одну из наиболее актуальных проблем борьбы с гриппозной инфекцией.

Разработка новых методов профилактики гриппа является базовой задачей для совершенствования профилактики не только этого заболевания, но в будущем и-для разработки новых методов профилактики широкого круга вирусных заболеваний человека.

Цель и задачи исследования. Цель исследования состояла в повышении эффективности профилактики гриппозной инфекции с помощью отобранных модулирущах препаратов, обладающих свойством защищать системы интерферона и иммунитета от депрессивного действия вируса гриппа, а также усиливать выработку интерферона и формирование типоспедифического клеточного иммунитета.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

I. Отобрать в процессе скрининга соединения, обладающие интерферониндуцируыцим, иммуностимулирующим и противовирусным действием при гриппозной инфекции среди препаратов растительного и микробного происхождения, а также полученных путем синтеза.

'¿. Изучит». ннтерФерониндуцируквдее, имцуностпмулирующее и противовирусное действие при гриппозной инфекции новых фитопрепаратов, полученных на основе растений семейства аралиевых.

3. Разработать способы снижения заболеваемости гриппом

с помощью отобранных препаратов, оказывающих симулирующее воздействие на системы интерферона и иммунитета.

4. Доказать в условиях эксперимента, что с помощью комплексного использования иммуномодуляторов и гриппозных вакцин мояно добиться стимуляции противогриппозной защиты, не зависящей от антигенной изменчивости вируса гриппа.

5. Предложить и апробировать в исследованиях на людях способы профилактики гриппозной инфекции, не зависящие от антигенной изменчивости вируса гриппа, основанные на целенаправленном управлении вакцинальным иммунитетом с помощью имиуномодуляторов.

6. Разработать новую лекарственную форму человеческого ре-комбянантного альфа-2 интерферона - мази, и, используя предложенную технологии, создать ряд высокоэффективных иммуностимулирующих препаратов местно-резорбтивного действия.

Научная новизна и значимость работы. В результате исследований разработана новая концепция оптимизации профилактики гриппа, основанная на управлении функциональным состоянием систем интерферона и иммунитета с помощью отобранных шлмуномодуляторов, обладающих свойством защищать эти системы от депрессивного воздействия вируса гриппа и усиливать выработку интерферона и формирование противогриппозного клеточного иммунитета широкого спектра действия.

Впервые обнаружено наличие лнтерферониндуцирущего, иммуностимулирующего и противогриппозного действия у ряда соединений растительного, микробного и синтетического происхождения, в том числе у некоторых офицянальных препаратов, используемых в медицинской практике по другим назначениям (расширение показаний для применения) и проведено их сравнительное изучение, как в условиях эксперимента, так я в клинических наблюдениях (препараты женьшеня.

экстракт элеутерококка, сапарал, настойка китайского лимонника, мефена.млновая кислота, германийорганические соединения и др.). Установлена и изучена возможность регуляции систем интерферона и иммунитета с помощью отобранных наиболее эффективных препаратов

Впервые обнаружено противовирусное действие при экспериментальном гриппе нового типа индукторов интерферона, разработанных на основе нового вида лекарственного растительного сырья, содержащего помимо биологически активных веществ растительного происхождения синтетические соединения, обладающие интерферониндуцирую щим действием.

Впервые получен профилактический эффект, не зависящий от антигенной изменчивости вируса гриппа, при использовании гриппозных вакцин в сочетании с индукторами интерферона типа гамма, разрешенными доя применения в медицинской практике, что позволяет использовать одну и ту же вакцину для зашиты людей от гриппозной инфекции, вызываемой любым штаммом вируса гриппа типа А.

Разработан способ получения новой лекарственной формы человеческого рскомбинантного альфа-2 интерферона - мазей, и создан ряд оригинальных препаратов интерферона местно-резорбтивного действия.

Изучено влияние одного из важнейших иммунорегуляторов ин-терлейкина-2 на митоген-индуцированную продукцию гамма-интерферона, С-реактявного белка и интенсивность реакции бласттрансфор-мации лимфоцитов, и разработаны показания для назначения имцуномо-дуляторов с целью создания противогриппозного вакцинального иммунитета широкого спектра действия, а также разработаны тесты, гарантирующие безопасность использования этих препаратов.

Практическая ценность, внедрение полученных результатов.

Сравнительное изучение интерферониндуцирующего, иммуномоду-лирующего и противовирусного действия свыше 100 природных и синтетических соединений позволило отобрать клинически перспективные препараты, оказывающие регулирующее воздействие на системы интерферона и иммунитета: фитопрепараты, полученные на основе растений семейства аралиевых и культур их тканей, в том числе обогащенные соединениями германия, дипиридамол, продигиозан, германийоргани-ческие соединения, левамизол, мефенаминовую кислоту, амиксин.

Разработаны схемы использования ряда отобранных препаратов с целью защиты от гриппа и других ОРЗ.

Совместно с Химико-фармацевтическим институтом (Санкт-Петер-

бург) выявлен« оригинальные индукторы интерферона и иммуномоду-ляторы, полученные на основе культур тканей растений семейства аралиевых и разработаны рекомендации по их применению. Получено авторское свидетельство на изобретение а 1412295 от 22.03.1908 г. - "Штамм культивируемых клеток растений Рапах £з.пяепг; с. "л. ь'.су, используемый дая получения биологически активных веществ и как иммуномодулятор" совместно с Мининой С.А., Слепян Л.И., Михайло-' вой Н.В. и др. Проведены доклинические испытания одного из этих препаратов ("Биоженьшеня") при экспериментальном гриппе, что послужило основой для проведения клинических испытаний и в дальнейшем для получения разрешения Минздрава РФ на его производство и использование у людей. В 1988 году начато производство препарата производственно-экспериментальным заводом "Санитас" (Латвия).

'В СНГ "Биоженьшень" выпускается биохимическим заводом в г.Кириши Ленинградской области.

Наряду с этим проведены исследования по усилению интерферон-индуцирувдего и противовирусного действия нового фитопрепарата с помощью гершнийорганяческого соединения ЬК ¡з . что позволило создать более эффективный шдулирущий препарат "Ьиоженьшень-13" (или "Панаксел"). Проведены его доклинические испытания при экспериментальном гриппе, на основании чего получено разрешение на проведение клинических испытаний. В 1993 году Фармакологическим комитетом ¡Минздрава РФ разрешен ограниченный промышленный выпуск препарата "Панаксел".

Результаты изучения интерферокиндуцирующего и иммуномодули-рующего действия отобранных фитопрепаратов была использованы при разработке биологически активных добавок к пище, нормализующие функциональное состояние иммунной системы и способствующих оздоровлению всего организма. Среди них "Биопан" и "Панасорб" продай клинические испытания и имеют гигиенические сертификаты. Биологически активные пищевые добавки а также указанные выше лекарственные фитопрепараты созданы на базе Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института.

Народу с этим разработан ряд высокоактивных препаратов человеческого рекомбинантного альфа-2 интерферона местно-резорбтивно-го действия. С их помощью удается достичь высоких концентраций интерферона непосредственно в очаге поражения и вокруг него, следствием чего является их выраженное противовирусное, иммуностимулирующее и обезболивающее действие. Совместно с НИИЗ.М ям.Н.Ф.Га-

далей РАЛ! на один из препаратов альфа-2 интерферона местно-ре-зорбтивного действия (товарный знак Тштерген") разработаны пакеты научно-технической документации (экспериментально-производственный регламент, временная фармакопейная статья, программа Государственных испытаний и др.), переданные в Пик им.Л.А.Тара-севича и Фармакологический комитет Минздрава РФ, и проведены Государственные испытания препарата при хронической рецидивирунцей герпетической инфекции на клинических базах Москвы и Санкт-Петербурга, показавшие его высокую эффективность.

Предложены способы усиления профилактической эффективности гриппозных вакцин с помощью официналышх препаратов, обладающих свойством индуцировать в организме человека выработку гамма-интерферона, что дало возможность осуществлять у лвдей эффективную профилактику гриппозной инфекции вне зависимости от антигенной изменчивости вируса гриппа. Предложенные методические разработки (получено 4 удостоверения на рационализаторские предложения) использованы в работе НИИ гриппа МЗ РФ.

Разработаны и внедрены в практику работы вирусологических лабораторий Таллиннского НИИ эпидемиологии, микробиологии и гигиены МЗ Эстонии и НИИ гриппа РАМН методические рекомендации "Микрометоды лабораторной оценки безвредности и иммуногенной активности гриппозных вакцин и неспецифичеокой резистентности к вирусам гриппа в наблюдениях на детях" (Таллинн, 1983).

Разработаны показания для назначения иммуномодуляторов, а также тесты, гарантирующие безопасность их использования.

Положения, выносимые на защиту.

Расширен спектр препаратов, обладащих интерферониндуцирую-щей активностью и отобранных в процессе скрининга среди веществ растительного и микробного происхождения, а также полученных путем синтеза. Исследованы профилактический и терапевтический эффекты отобранных препаратов при гриппозной инфекции. Выявлено наличие интерфероногенного и противовирусного действия у новых фитопрепаратов, созданных на основе культур тканей растений семейства аралиевых.

Установлено противовирусное действие нового гада индукторов интерферона, разработанных на основе нового вида лекарственного растительного сырья, содержащего помимо биологически активных веществ растительного происхождения синтетические соединения, обладавшие интерферониндуцирущим действием.

Разработана новая лекарственная форма человеческого реком-бинантного альфа-2 интерферона - мази, и с использованием предложенной технологии создан ряд высокоэффективных иммуностимулирующих препаратов местно-резорбтивного действия, имевдипцих длительней срок хранения и обладающих выраженными противовирусным и обезболивающим эффектами.

Установлено наличие антиденрессивного действия у интерферо-нов эндогенного и экзогенного происхождения пи отношению к функциональному состоянию систем интерферона и клеточного иммунитета, на которые вирус гриппа оказывает депрессивное воздействие.

Разработана новая концепция борьбы с вирусными инфекциями и свойственными им интерферондефицитным и иммунодефицитным синдромами, заклтакщаяся в целенаправленной коррекции функционального состояния систем интерферона и иммуногенеза с помощью иммуномо-дуляторов, способствующих предотвращению развития этих синдромов.

Обоснован новый подход к борьбе с вирусными инфекциями, позволивших разработать схемы повышения профилактической эффективности гриппозных вакцин, используя которые можно создать перекрестный иммунитет между штаммами вируса гриппа типа А, чего не удается достигнуть при введении вакцин без иммуномодуляторов.

Впервые наряду с экспериментальными препаратами для усиления профилактической эффективности гриппозных вакцин использованы официнальные препараты, отобранные в процессе скрининга и обладающие свойством индуцировать в организме человека выработку гамма-интерферона, оказывающего антидепрессивное действие. Это позволит осуществить у людей эффективную профилактику гриппозной инфекции вне зависимости от антигенной разновидности эпидемического штамма вируса гриппа, чего не удается достичь при использовании современных гриппозных вакцин.

Показано тесное взаимодействие гамма-интерферона с одным из основных медиаторов иммунитета интерлейкином-2, который не только значительно усиливает его продукцию в ответ на введение Т-ми-тогена, но и сам является индуктором гамма-интерферона в культуре человеческих лимфоцитов. Эти результаты были использованы при разработке показаний и противопоказаний для назначения модулирующих препаратов, в том числе и при их применении в сочетании с гриппозными вакцинами, а также при разработке тестов, гарантирующих безопасность использования этих препаратов.

Апробация работы. Основные экспериментальные материалы и положения диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции молодых ученых "Вирусы человека и животных" (Рига, 1981); на заседаниях Ленинградского отделения Всероссийского научного общества эпидемиологов и микробиологов (1982 - 2 доклада; 1967; 1988 - 2 доклада; 1989); на У Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию физиологически активных веществ (Рига, 1583), на Всесоюзном симпозиуме "Комплексная профилактика гриппа и других вирусных острых респираторных заболеваний у детей" (Таллинн, 1963); на П Международном симпозиуме по элеутерококку (Москва,

1984 - 2 доклада); на П Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995).

Основные положения диссертации отражены в I авторском свидетельстве на изобретение, I методических рекомендациях и 24 опубликованных научных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах машинописного текста, включая 71 таблицу и 10 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов. Список литературы включает 85 отечественных и 306 иностранных источников.

Работа выполнена в плане исследований НИИ гриппа РАЖ.

Отдельные разделы работы выполнены совместно со Слешш Л.И. (Хим.-фарм.институт, Санкт-Петербург), Чижовым Н.П., Щекановой С.М., Злышшм В.М., Дюбиной Т. А., Захаровой Н.Г. (НИИ гриппа РА;М), дроф.Фроловым А.Ф. (КШ-С1 эпид. и инфекц.болезней :£3 Укр.), Найхиным А.Н. (НИ1Ш РАЖ, Санкт-Петербург), Парфеновым В.В. (Е1*Ж им.Н.Ф.Гамалеи, Москва).

Всем соавторам исследования выракаю искреннюю благодарность. Глубоко признательна за постоянное внимание и поддержку своему научному консультанту чл.-корр.РАМН, акад.РАЕН, проф.Ершову Ф.И. Искренне благодарна за поддержку другому научному консультанту д.б.н., проф.Киселеву О.И. Выражаю искреннюю благодарность коллективам клинического отдела и отдела эпидемиологии НИИ гриппа РАМП.

МАТЕРИАЛЫ Н [дЫ'ОДЫ

Исследования проводили на беспородных белых мышах в возрасте 30-45 дней. Часть исследований была проведена на людях.

Материалы

Вирусы. Для заражения гннотны* и куриных эмбрионов использовали следующие штаммы вируса гриппа:

1. А/Ленинград/9/46 (НОШ),

2. А/Швеция/650/51 (Н1УП,

3. А/Гонконг/1/68 (НЗУ2),

4. А/Виктория/35/72 (НЗ/2), а также:

вирус парагриппа Сендай,

вирус везикулярного стоматита, штамм Индиана,

вирус болезни Ньюкастла.

Вакцины, используемые у животных:

1. Гриппозная инактивированная хроматографическая вакцина (коммерческий препарат);

2. Гриппозная живая экспериментальная вакцина.

Вакцины, используемые у людей:

1. Инактивированная гриппозная хроматографическая вакцина состава А/Техас/1/77 (Н3^2)+А/Уфа/1/77 (ШУП;

2. Инактивированная кошерческая дивакцина, приготовленная из вирусов А/Бразилия/П/78 (НШ)+А/Еангкок/1/79 (НЗ//2);

3. Инактивированная очищенная хроматографическая вакцина для перорального введения типа А, состоящая из вакцинных штаммов

А/Киев/59/79 (НШ) и А/Бангкок/1/79 (Н3л£);

4. Живая гриппозная сухая вакцина, приготовленная из штамма А/17/42/3 (НЗУ2).

Препараты. Использовали биологические препараты растительного, микробного и животного происховдения, а также высокомолекулярные и низкомолекулярные синтетические препараты, основные из которых представлены ниже.

I. Растительные препараты:

1). настойка из биомассы культуры ткани корня женьшеня, выраженной на обычной питательной среде;

2). настойка из биомассы культуры ткани корня женьшеня, выращенной на питательной среде, содержащей 0,1 г/л германийорпничес-

кого соединения под шифром L Х^(2-карбоксиэтилгерманийсесквиок-еан) ;

3). настойка из биомассы культуры ткани корня женьшеня с добавленным к ней 0,5> раствором германийорганического соединения под шифром L Х13;

4). настойка из ткани корня растения женьшень;

5). настойка лолисциаса папоротниколистного.

1-5 - перечисленные экспериментальные препараты растительного происхождения были получены из Химико-фармацевтического института (С.-Петербург).

6). Экстракт элеутерококка жидкий;

7). настойка аралии маньчжурской;

8). сапарал (таблетированный препарат аралии маньчжурской);

9). настойка семян лимонника китайского;

10). фитогемагглютинин.

6-10 - коммерческие препараты.

Все фитопрепараты кроме 10 и II получены на основе растений семейства аралиевых.

П. Биологические препараты микробного происхождения:

Д. препарата эндотоксинов s. paratyphi В;

2).препараты эндотоксина s. typhi .

1-2 - получены из НИИИВС ИЗ РФ (С.-Петербург).

3). Продигиозан;

4). препарат человеческого рекомбинантного альфа-интерферона "Реаферон" и полуфабрикат "Реаферона".

3-4 - коммерческие препараты.

Ш. Биологические препараты животного происхоящения:

1). мышиный сывороточный альфа-интерферон;

2). мышиный сывороточный гамма-интерферон;

1-2 - экспериментальные препараты. Получены индукцией "ин ви во" вирусом болезни Ньюкасгла и препаратами эндотоксина

о. paratyphi В.

А также: коммерческий препарат человеческого лейкоцитарного альфа-интерферона.

1У. Высокомолекулярные синтетические препараты:

1). синтетический полирибонуклеотид полиИ:полиЦ (фирмы s chuch ага, Германия);

2). сополимер винилового спирта и виниламиноянтарной кислоты (ВС-ВАЯК).

У. Низкомолекулярные синтетические препарата:

1). германийорганическое соединение под шифром ь

2). германийорганическое соединение под шифром и Х^з (2-карбокоиэтилгерманийсесквиоксан);

3). кватерин.

1-3 - перечисленные синтетические препараты, содержащие германий, получены из Института органического синтеза Латв.АН.

5). амиксин;

6). левамизол;

7). мефенаминовая кислота;

8). дипиридамол (курантил).

5-8 - коммерческие препараты.

Методы

/

Определение биологической активности интерферона в сыворотках крови. Титры интерферона в сыворотках крови животных определяли по методу количественной гемадсорбции / рз-^ег к. е., 1967/. Их выражали в виде конечных разведений сывороток, подавляхщих на 50,репродукцию вируса Сендай, что сопровождалось соответствующим снижением интенсивности гемадсорбции. В каждой группе использовали кровь, взятую не менее чем от 5 шшей. Для определения биологической активности интерферона в сыворотках крови людей и в препаратах местно-резорбтивного действия использовали микрометод титрования интерферона, основанный на защите монослоя клеток от цитопатогенного действия вируса везикулярного стоматита /Кондратьева Г.А. и др., 1989/. Активность интерферона вычисляли

в международных единицах (М£) по формуле: А

о т

Р

где А0 - активность исследуемого интерферона в сыворотке;

Ар - активность референс-препарата, выраженная в :<1Е стандартного образца 42-28-П9-93П;

Т0 - титр исследуемого интерферона в опыте;

Т - титр референс-препарата в опыте.

изучение профилактического и лечебного действия препаратов. Для изучения профилактического действия препараты вводили животным I раз в день однократно или на протяжении нескольких дней до инфицирования. С целью воспроизведения летальной гриппозной ин-

фисцпи животных заражали интраназально адаптированным.: к ним штаммами вируса гриппа А/Ленинград/9/46 (НО/Я), А/ГоикоНг/1/68 ШЗЛ'г), А/Викторая/35/72 (зарахаицая доза составляла от 5

до 10.000 ЛДзд/ОД мл). Учитывали кумулятивную выживаемость мышей на протяжении периода времени между 5 и 12 сутками после инфициро вания и выживаемость на 14 сутки, т.е. к моменту окончания учета опыта (показатель защищенности). Эффективность профилактического действия препаратов оценивали по увеличению кумулятивной выживаемости и защищенности животных в опытных группах цо сравнению с контрольными и рассчитывали индексы эффективности.

Для изучения лечебного действия иммуномодуляторы вводили животным один раз в день однократно или на протяжении нескольких дней после заражения вирусом гриппа. Учитывали кумулятивную выживаемость и защищенность мышей. Увеличение этих показателей у инфицированных животных после введения препаратов по сравнению с этими же показателями в контрольных группах расценивали как проявление их лечебного действия. В каждой группе было использовано не менее 30 животных.

При изучении профилактического действия иммуномодуляторов у людей их вводили в соответствии с инструкцией по применению в межэпидемическом периоде или во время эпидемий гриппа. Эффективность действия испытуемых препаратов оценивали по интенсивности продукции интерферона, а также по уровню снижения заболеваемости гриппом и другими ОРЗ.

Оценка иммукомодулиствдего действия препаратов. Иммуномодуляторы вводили животным перорально до вакцинации или одновременно с ней. Через 1-2 недели после вакцинации животных заражали летальными дозами вируса гриппа. Иммуномодулирувдий эффект препаратов оценивали по увеличению кумулятивной выживаемости и защищенности мышей в опытных группах по сравнению с этими же показателями, полученными в контрольных группах (иммуностимулирующее действие), а также по снижению этих показателей в опытных группа) по сравнению с контрольными (иммуносупрессивный эффект). Одна группа включала не менее 30 мышей.

При изучении иммуномодулируыцего действия препаратов у людей их вводили до вакцинации, одновременно и после нее. На протяжении 1-4 недель после вакцинации оценивали уровень продукции интерферона, а также показатели клеточного в реакции бласттрансфор-мации лимфоцитов /Кондаков, 1989/ и гуморального в реакции тормо-

женил гемагглюгинации и в реакции ингибиции элюции эритроцитов /Найхин А.Н., 1965/ иммунитета.

Достоверность различий между опытными и контрольными группами оценивали путем вычисления X и выражали в уровнях значимости Р, а также рассчитывали среднюю ошибку т при Р < 0,05. Достоверность корреляции изучаемых параметров структуры и биологических спсйств г.реплрятоп оценивали по стандартному методу корреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции г /Ро-кицкий И.Ф., 1967/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Иммуномодуляторы - новое поколение противовирусных препаратов

Методом скрининга изучено около 100 препаратов растительного, микробного и животного происхождения а также полученных путем синтеза. Отбор иммуномодуляторов осуществляли на основе сравнительного изучения интерферониндуцируодей активности, имцуномодулирующего, а также профилактического и лечебного действия при экспериментальной гриппозной инфекции. Предпочтение отдавали индукторам интерферона типа гамма в связи с его способностью вызывать в организме бласттрансформацию Т-лимфоцитов, их пролиферацию и стимулировать формирование иммунитета клеточного типа.

Из группы фитопрепаратов были отобраны активные вещества, полученные, в основном, на основе растений семейства аралиевых.

Было показано, что изученные фитопрепараты, используемые в дозах от 0,05 до 0,2 мл на мышь перорально, способны индуцировать в организме животных высокие титры сывороточного интерферона (до 1000 ед/'ш).

При изучении лечебно-профилактического действия отобранных фитопрепаратов при летальной гриппозной инфекции было обнаружено, что экстракт элеутерококка способствует двукратному увеличению выживаемости зараженных животных по сравнению с этим же показателем в контрольной группе (выживало 28 мышей из 56, Р •£ 0,01) (рис.1). Несколько меньший эффект был отмечен при использовании настойки корня женьшеня. Однако, введение животным препарата, полученного на основе биомассы культуры ткани корня женьшеня, выращенной на обычной питательной среде, но с добавленным к нему германийорганическим соединением I Х^-д, также способствовало почти двукратному увеличению выживаемости зараженных животных (Р 0,01). Наиболее выраженный лечебно-профилактический эффект при

2 -

v

v.

•v

«Г

X

Рис. 1. Противовирусное действие отобранных фитопрепаратов при экспериментальной гриппозной инфекции

А - препараты, полученные на основе растений семейства аралиевых; Б - препараты, полученные на основе биомассы культур растительных тканей.

По оси абсцисс - препараты; по оси ординат - индексы эффективности.

летальной гриппозной инфекции был получен при использовании препарата, полученного на основе биомассы культуры ткани корня женьшеня, выращенной на селективной по содержанию соединений германия ( L Xj-g-ОД г/л) питательной среде, индекс эффективности в данном случае составил 3,1 (выжило 40 мышей из 52, Р 0,001). В то же время при использовании препаратов аралии индекс эффективности достигал 1,8. Причем, этот процесс сопровождался выраженным снижением вирусной репродукции в легких: экспериментальных животных (до 5 fy ЭИД50/0,2 мл).

Полученные результаты по изучению интерферонин.цуцирувдего и противовирусного действия фитопрепарата, разработанного на основе биомассы культуры ткани корня женьшеня, выращенной на обычной питательной среде (получившего коммерческое название "Биоженьшень"), послужили основой для проведения клинических испытаний и дальнейшего практического его использования в качестве им-муномодулятора и адаптогена. Проведенные исследования положили начало внедрению в практику другого фитопрепарата, разработанного на основе биомассы культуры ткани корня женьшеня, выращенной на селективной по содержанию соединений германия питательной среде и получавшего в дальнейшем коммерческое название "Панаксел".

При изучении препаратов микробного происхождения были отобраны для дальнейшего изучения эндотоксины бактерий тифо-паратн-фозной группы. Было показано, что введение животным препаратов эндотоксина 3» typhi , детоксицированных лимонной кислотой, индуцировало выработку сывороточного интерферона с максимальной активностью 400 ед/мл.

Значительно более высокие титры эндогенного интерферона удалось получить при использовании препаратов эндотоксинов 3. paratyphi В, выделенных разными методами. Фракционирование исходных препаратов эндотоксинов выявило их молекулярную гетерогенность. Независимо от метода получения все они содержали высокомолекулярную и низкомолекулярную фракции. Наиболее выраженным интерферон-индуцируыцим действием обладали высокомолекулярные фракции эндотоксинов. Они индуцировали в организме животных выработку сывороточного интерферона с активностью от 1000 до 2000 щ/мл.

При изучении зависимости интерферониндуцирувдей активности от дозы вводимого препарата оказалось, что для высокомолекулярной фракции минимальная интерферониндуцируодая доза составила 10 мкг на мышь, в то время как для низкомолекулярной фракции эта

доза была равна IOO мкг. Таким образом, молекулярные параметры играют значительную роль в проявлении способности эндотоксинов индуцировать выработку интерферона.

Исследование химического состава выявило четкую корреляцию между интерферониндуцирупцей способностью препаратов и содержанием компонентов полисахаридной части эндотоксина (гексозы, геп-тозы, кетодезоксиоктулоновая кислота) (рис.2).

Количество белка, общее количество липидов, примеси нуклеиновых кислот или их низкомолекулярных фрагментов практически не влияли на интерферониндуцируицую активность.

Было показано, что изученные препараты микробного происхож дения обладают как профилактическим, так и лечебным действием при летальной гриппозной инфекции. При использовании официального препарата микробного происхождения продигнозана с целью профилактики экспериментального гриппа у животных индекс эффективности достигал 2,S (выжило 25 мьаией из 44, Р ^ 0,001). Причем, эффекты препарата проявлялись даже при его использовании в малых дозах (ниже 5 мкг на мышь). Благодаря своей высокой активности и возможности использования у лцдей продагиозан был отобран в качестве одаого из активных противовирусных препаратов для дальнейшей разработки новых эффективных способов профилактики гриппозной инфекции у лвдей.

Одним из направлений поиска новых активных противовирусных средств является изучение синтетических препаратов. С этой целью проводили изучение интерферониндуцируыщего действия препаратов германия, занидавдего видное место среди микроэлементов, игращих роль в проявлении микробиологических функций человека и животных.

В частности, было показано, что соединение L Xjg способно индуцировать в организме животных выработку интерферона с активностью до 265 ед/мл. Еде более высокие тигры интерферона были получены при введении мышам германийорганлческого соединения L Xg (до 650 ед/мл).

Среди синтетических препаратов наиболее выраженная интерфе-рониндуцирущая активность была обнаружена у дипирздамола. Титры сывороточного интерферона у животных составляли 8150 ед/мл и выше

При изучении противовирусного действия препаратов синтетического происхождения при летальной гриппозной инфекции было показа но, что германийорганические ссщинения не обладают выраженной эффективностью. Наиболее выраженное противовирусное действие было

Гексозы, %

Рис. 1. Корреляционная зависимость между интер-фероногекной активностью и химическим составом препаратов

эндотоксинов.

А - зависимость между содержанием.гексоз и титром интерферона. Б - зависимость между содержанием белка и титром интерферона. По оси ординат - титр интерферона.

обнаружено у синтетического индуктор гаммл-уитерфсрона - кефена-ьипюг.ок кислоты. Индекс эффективности достигал при этом 2,5 (выжило 31 мыши из 54, Р -¿.0,001). Препарат бил отобран для разработки новых способов профилактики гриппа у ладей наряду с левами-золом и амиксином.

Почта у всех изученных препаратов было отмечено наличие им-муномодулирупцего действия, что определялось по наличию иммуно-адъювантного эффекта при их сочеганном введении с гриппозными вакцинами.

Подводя итог изложенному выше, можно заключить, что при срав нительном изучении интерферониндуцируицей активности, а также профилактического, лечебного и иммуномодулируюцего действия различных соединений при летальной гриппозной инфекции был выявлен ряд препаратов растительного, микробного и синтетического происхождения, обладавдих выраженным противогриппозным действием. В связи с высокой противовирусной эффективностью и отсутствием токсического влияния на организм фитопрепараты можно рассматривать как наиболее перспективные средства для профилактики гриппа и других OPS.

2. Иммунокоррекция противогриппозного вакцинального иммунитета с помощью эндогенного интерферона в условиях эксперимента

Современным гриппозным вакцинам в большей или меньшей степени могут быть присущи иммуномодулирущие свойства, характерные ю самого вируса гриппа, а именно: депрессивное воздействие на клегс ное звено иммунитета и стимулирующее - на выработку гуморальных антител. Эти свойства помогают вирусу гриппа уйти от полноценной иммунного ответа: формирование клеточного иммунитета, направленного практически против всех антигенных вариантов вируса, подавлено, а выработавшиеся гуморальные антитела не могут нейтрализовать вновь появляпцийся антигенный вариант. В связи с этим не представляется возможным создать с помощью обычных вакцин полноценный противогриппозный иммунитет, который не зависел бы от выр женной изменчивости поверхностных антигенов вируса гриппа.

Все это требует разработки нового подхода к профилактике ви русных инфекций, сопровождающихся избирательным депрессивным воз действием вирусов на формирование клеточного противовирусного им мунитета, с помощью которого удалось бы устранить это воздействи на клеточное звено иммунитета и стимулировать его формирование.

Наиболее перспективными средствами для его осуществления представляются препараты и индукторы интерферона, которые, как отмечено выше, обладают выраженным антидепрессивным действием и способностью стимулировать формирование клеточного типоспецифическо-го иммунитета.

Для изучения возможности регуляции функционального состояния систем интерферона и иммунитета с цедьи обеспечения невосприимчивости к гриппозной инфекции били использованы отобранные наиболее активные иммуномодуляторы.

Предварительно была изучена возможность обеспечения невосприимчивости животных; к инфицированию высокими летальными дозами вируса гриппа с помощью препаратов экзогенного гамма-интерферона, способствующего формированию, в основном, клеточного противовирусного иммунитета, в отличие от альфа-интерферона, обладающего менее выраженным иммуностимулируицим действием и индуцирующего, преиму-цественно, формирование состояния неспецифяческой резистентности / Moore м., 1983/.

Было обнаружено, что мышиный эндотоксин-индуцированный гам-ад-интерферон, который вводили один раз в день внутрибрюшинно на протяжении четырех суток (суммарная доза 200-400 ед/кг) за неделю цо инфицирования животных 3000-5000 ДД^ф/ОД мл вируса гриппа, защищал от летальной гриппозной инфекции 55,0£ мышей (рис.3). Мы-ниный вирус-индуцированный альфа-интерферон, введенный по такой же 2хеме, защитного действия не оказывал. Гамма-интерферон, введений в той же дозе однократно, оказывал оптимальный защитный эффект - выживаемость животных составляла 88,0^. При изменении интервала зремени между введением гамма-интерферона и инфицированием живот-шх вирусом гриппа его защитный эффект снижался, при этом проти-зовирусное действие альфа-интерферона, используемого в такой низ-сой дозе, практически отсутствовало.

Для сравнительного изучения профилактического эффекта гамма-штерферона при летальной гриппозной инфекции было исследовано также влияние на выживаемость животных как препарата экзогенного альфа-интерферона, так и активного индуктора его образования по-шнуклеотида полиЛ:полиЦ. Введение 500-1000 мкг/кг полирибонук-¡еотида за сутки до инфицирования животных 3000-5000 ЛД50/0,1 мл

Дни после заражения

Рис.З. Сравнение защитного действия вирус-индуцнрованного и. эндотонокн-шдуцарованного интерферонов, введенных мышам за 7 дней до заражения вирусом гриппа А Ден1:нград/9/46 (НО/1).

•-----«---контроль; л-Л--4-кратное введение в;:рус-ш-

дуцкрованного интерферона (суммарная доза 200-400 ел/кг); а-Оь- 4-кратное введение эндотоксин-инлуцарованного интерферона в той же дозе; о-о--однократное введение эндо-

токспн-индуцированного интерферона (200-400 ед/кг).

вируса гриппа резко снижало их гибель в течение первых 3-6 суток, однако, в дальнейшем, к У-Ю суткам количество погибших мышей приближалось к контролю (рис.4А). ПолиИ:полиЦ, введенный за 7 суток до заражения, оказывал слабый защитный эффект. С другой стороны, введенный в это время гамма-интерферон полностью защищал Ü7.0ÍS животных от развития летальной гриппозной инфекции (рис.4Б). Результаты исследований, представленные на рисунках 3 и 4,являются статистически достоверными (Р ^-0,01- O.COI).

Ьолее того, было показано, что профилактическое действие гамма-интерферона не зависит от заражающей дозы вируса гриппа: введенный мышам внутрибрюшинно в дозе 2-10 ед/мл за сутки до инфицирования, он защищал до 75,0$ животных от летального гриппа при использовании от 2 до 5000 ЛД^/0,1 мл. При этом в интервале времени между введением гамма-интерферона и инфицированием животных активность интерферона в сыворотках крови не выявлялась: Наличия антител в реакции тордажения гемагглютинации и реакции нейтрализации на 6 день после заражения (перед гибелью мышей в контрольных группах) также обнаружено не было.

В связи с этим было изучено влияние гамма-интерферона на клеточные факторы иммунитета.

На рис.5 представлены данные по изменению соотношения клеток брюшного экксудата мышей после введения этого типа интерферона. Экссудат был получен через 7 дней после введения гамма-интерферона или плацебо перед инфицированием животных, а также у выживших инфицированных мышей к моменту 60,0%-Q0,0% гибели в контроле. Кроме выраженного усиления активности макрофагов у здоровых животных под влиянием гамма-интерферона отмечен сдвиг клеток лимфоидного ряда в сторону большего образования лим£областов при незначительном увеличении количества лимфоцитова также увеличение количества полиморфноядерных лейкоцитов. У животных, зараженных летальными дозами вируса гриппа, отмеченное изменение соотношения клеток брюшного экссудата усиливалось, что, по-видимому, и способствовало появлению высокой невосприимчивости к гриппозной инфекции.

Следует отметить, что у небольшого процента выживших в контрольной группе мышей было обнаружено увеличенное количество лимфоцитов и особенно лим&областов, что также подтверждает важность клеточных факторов в защите животных от летальной гриппозной ин-. фекции. Т.е. использование гамма-интерферона приводило к тому, что вирус гриппа не оказывал больше угнетающего воздействия на

-1---1-1-г

9 10 3 4 5 Дни после заражения

ю ю

10 11

Рис. 4. Сравнение защитно?» активности препарата полиИ:полиЦ и эндотоксин-индуцированного интерферона при экспериментальной гриппе у мышей.

Б - эксперименты с эндотоксин-икдуцнр интерфероном:

»---О- контроль; о о— — интерфер

А - эксперименты с препаратом полиИ:полиЦ: ----0- контроль; ■-■— полиИ:по-

лкЦ, введенный за сутки до заражения;

о-о- -гслиИ; полиЦ, введенный за 7 суток до

заражения.

об екньас он, еве-

денный за 7 суток до заражения.

1.000800 -600т-

200-

М ЛБ I ПЛ

М ЛБ Л ПЛ

Рис. 5. Изменение соотношения клеток брюшного экссудата мышей после введения эндотоксин-индуцированного интерфероне

А - экссудат до заражения животных вирусом (через 7 дней после введения интерферон^. Б - экссудат к моменту 50,0 - 80,0 / гибели мышей после заражения.

По оси ординат - количество клеток в 1,0 мл экссудата. По осу абсцисс - разновидности клеток: М - макрофаги, ЛБ - лимфобла-сты, Л - лимфоциты, ПЛ - полиморфноядерные лейкоциты.

■■ВВН - клетки мышей, не получивших интерферона, [ 1 - клетки мышей, получивших интерферон.

факторы клеточного иммунитета, а наоОорот, начинал действовать как иммуностимулятор.

Полученные данные позволили сделать вывод о том, что выраженный противовирусный эффект гамма-ИФ при летальной гриппозной инфекции обусловлен его свойствами оказывать антидепрессивное действие на систему клеточного иммунитета и стимулировать его формирование.

Подобный эффект гамма-интерферона следовало ожидать и при замене вирулентного вируса вакцинным штаммом. В связи с этим была изучена возможность защиты животных от летальной гриппозной инфекции, вызываемой вирусом А/Виктория/35/72 (H3V2), с помощью экспериментальной гриппозной вакцины, приготовленной из вируса, относящегося к другому подтипу - А/Швеция/650/51 (HlVl) и используемой в сочетании с индуктором гамма-интерферона - препаратом эн дотоксина s.paratyphi в в дозе 100 мкг на мышь. Было показано, что при использовании вакцины в сочетании с индуктором интерферона от летальной гриппозной инфекции выжило больше половины всех животных - 64 из 125 (51,2%), в то время, как в группе мышей, получивших одну вакцину, выжило 28 животных из 90 (31,1$) при Р ^ 0,05.

Таким образом, было показано, что с помощью вакцины, приготовленной из вируса гриппа, относящегося к одному подтипу (AI) и используемой в сочетании с индуктором гамма-интерферона, можно увеличить выживаемость животных от летальной гриппозной инфекции, вызываемой вирусом гриппа, относящимся к другому подтипу (A3).

Одним из механизмов, которые могут способствовать выраженной стимуляции клеточного поствакцинального иммунитета и за счет этого значительному усилению профилактического действия гриппозных вакцин, является, вероятно, усиление иктерфероногенеза при использовании индукторов образования гамма-интерферона в ко,далекое с вакцинами. В частности, при изучении иммуностимулирующего действия экстракта элеутерококка, используемого в сочетании с живой гриппозной вакциной, было показано, что активность интерферона в сыворотгах крови животных достигала 964 ед/мл, в то время как индуктор интерферона и живая вакцина, используемые в отдельности, способствовали выработке не более 60 ед/мл интерферона.

Наряду с этим было показано, что иммуностимулирующий эффект изучаемых препаратов находится в непосредственной зависимости от используемой дозы. Так, на примере левамизола показано, что введение индуктора интерферона в дозе 140 мкг на мышь в сочетании

с гриппозной вакциной способстиошло увеличению кумулятивной выживаемости животных до 59,0^, в то время как одна вакцина защищала 45,0'/? мшией. При снижении дозы левамизола до 35-70 мкг его иммуностимулируодий эффект переставал проявляться. При дальнейшем снижении дозы левамизола до 0,5-2,2 мкг на мышь выживаемость вакцинированных животных уменьшалась, соответственно, в 2,2 и 1,5 раза по сравнвнию с выживаемостью мышей, получивших одну вакцину.

Таким образом, в зависимости от используемой дозы препарата иммуностимулирующий эффект сменялся иммунодепрессивным, что является характерным для иммуномодуляторов. Это свидетельствует о важности разработки эффективных схем использования индукторов гамма-интерферона в сочетании с гриппозными вакцинами для достижения оптимального профилактического эффекта при гриппозной инфекции.

На основании результатов проведенных исследований были разработаны в условиях эксперимента способы усиления профилактического действия гриппозных вакцин с помощью как экспериментальных, так и официнальных препаратов, обладающих интерферониндуцирущим и иммуностимулирующим действием. Было устаноалено, что такие экспериментальные препараты, как настойка из биомассы культуры ткани корня женьшеня, выращенной на питательной среде с добавлением германийорганического соединения Ь ^3, квэтерин и настойка полисциаса способствуют увеличению кумулятивной выживаемости животных в 1,5-1,7 раза по сравнению с выживаемостью шшей, получивших одну вакцину. При этом защищенность животных от летальной гриппозной инфекции увеличивалась в 2,2-2,6 раза по сравнению с этими же показателями в группах мышей, получивших вакцину без иммуномодулятора (рис.6). Данные статистически достоверны (Р с 0,05- <0,01).

С помощью аптечных препаратов левамизола и настойки китайского лимонника удалось добиться увеличения кумулятивной выживаемости животных до 58,0>, в то вреда как в группе мышей, получивших одну вакцину, выжиеэло лишь 44,0% животных. При этом защищенность увеличилась в 2 раза.

Значительно более высокие результаты удалось получить при введении живой гриппозной вакцины в сочетании с такими аптечными препаратами, обладающими способностью индуцировать продукцию гамма-интерферона, как продигиозан и экстракт элеутерококка. Так, при использовании вакцины в сочетании с продигиозаном кумулятивная выживаемость животных составила у5,0£ (выжило 72 мыши из 75).

к

Препараты, используемые в сочетании с вакциной

Рис. 6. Защита от летальной гриппозной инфекции белых мышей живой гриппозной аллантоисной ввкциной, используемой в сочетании с отобранными иммуно-модуляторами.

показатель защищенности возрос в 3 раза по сравнению с этим же показателем, полученным при введении одной вакцины. .'Максимальный защитный эффект был получен при сочетанием введении животным гриппозной вакцины и экстракта элеутерококка - кумулятивная выживаемость составила 90,0:» (выжило 68 мышей из 76), защищенность при этом увеличилась в 3,6 раза.

Полученные данные свидетельствуют о том, что можно добиться значителыпл'и усиления профилактической эффективности и расширения спектра действия гриппозных вакцин за счет стимуляции клеточного звена иммунитета с помощью иммуномодуляторов, включая известные официнальные препараты'.

Б этих случаях механизм профилактического действия эндогенного интерферона обусловлен не только его свойством индуцировать состояние неспецифической резистентности клеток, но и выраженным антидепрессивным действием до отношению к системе клеточного иммунитета и способностью стимулировать его формирование.

На основании проведенных экспериментальных исследований а также данных литературы была сформулирована новая концепция защиты от гриппозной и других вирусных инфекций, сопровождающихся депрессивным воздействием вируса на формирование клеточного противовирусного иммунитета. Сущность ее заключается в коррекции негативного влияния вируса гриппа на формирование противовирусного иммунитета с помощью препаратов, обладающих антидепрессивным действием по отношению к клеточному типоспецифическому иммунитету и стимулирущих его формирование, с целью создания прочного противогриппозного иммунитета, обеспечивающего невосприимчивость практически к любым вновь появляющимся антигенным вариантам вируса гриппа. Механизм коррекции депрессивного действия вируса с помощью эндогенного интерферона схематически представлен на рисунке 7. Он основан на^ противоположной направленности действия интерферона на основные защитные системы организма по сравнению с вирусом гриппа.

Вирус гриппа, как описано выше, оказывает депрессивное действие на системы интерферона и иммунитета, угнетая выработку интерферона, интерлейкина-2, функциональную активность естественных киллеров, Т-киллеров, К-клеток, полиморфноядерных лейкоцитов, ци-тотоксичность и фагоцитарную активность макрофагов (верхние неза-штрихованные части фигур). Эндогенный интерферон, продуцируемый лейкоцитами в ответ на введение индукторов его образования, в основном типа гамма, наоборот, стимулирует все эти факторы, предот-

Цитотоксич-ность макрофагов.

Антителе широкого спектра

аолвфоН -нв!ч члао'н

ЛИОЯОЛОЛИП

Рис. ?.' Коррекция депрессивного действия вируса гриппа на системы интерферона и иммунитета с помощью эндогенного интерферона, индуцируемого иммуномодуляторами

Верхние части фигур:

^ Д " ВИрус

^ ^ угнетение

Нижние части фигур: интерферон

? г-

стимуляция I

IV! сг)

- -

вращая развитие депрессивного действия вируса гриппа (нижние заштрихованные части фигур). Наряду с этим вирус гриппа стимулирует выработку штаммоспецифических антител и мало влияет на продукцию антител широкого спектра действия. Влияние интерферона на синтез гуморальных антител, в основном, также имеет противоположную направленность и, как далее показано, может сопровождаться выработкой широкого спектра антител.

Т.е. влрус гриппа и интерферон действуют на одни и те же защитные механизмы, но в обратном направлении: один их угнетает, а другой стимулирует, предотвращая развитие интерферондефицитного и иммунодефицитного синдромов. Все это может позволить полностью устранить депрессивное действие патогенных и вакцинных штаммов вируса гриппа на формирование типоспецифического иммунитета и способствовать его стимуляции, чего не удается достичь при использовании одних вакцин.

Антидепрессивное действие эндогенного гамма-интерферона, возможно, являющееся одной из основных его функций в иммуногенезе, диктует необходимость использования гриппозных вакцин в сочетании с индукторами его образования с целью создания прочного иммунитета ко всем антигенным вариантам вируса гриппа.

3. Результаты использования иммуномодулирудцих препаратов для профилактики острых респираторных заболеваний у людей

Результаты проведенных экспериментальных исследований получили свое подтверждение и дальнейшее развитие в наблюдениях на людях. Проводили изучение противовирусного действия отобранных официнальных препаратов, обладающих интерферониндуцируыцим и им-муномодулирующим действием и относящихся к группам фитопрепаратов, препаратов микробного и синтетического происхождения. В частности, было проведено изучение интерфероногенного и профилактического действия фитопрепаратов и продигиозана в наблюдениях на 65 детях школьного и дошкольного возраста после проведения предварительных наблюдений на взрослых в клинике волонтеров НЮ" гриппа РА:Ш. Препараты использовали в соответствии с инструкцией по применению для повышения неспецифической резистентности организма с целью защиты от гриппа и дргугих ОРЗ.

При изучении интерферониндуцирущего действия экстракта элеутерококка определяли активность интерферона в сыворотках кро-

- Л; -

вл детей, взятой до первого и второго циклов введения препарата и послс- них. Было показано, что по окончании двух циклов введения экстракта элеутерококка активность интерферона в сыворотках крови достигала, в среднем, 385 Ма/мл и почти в 3 раза превышала его средний уровень в фоновых сыворотках. Более того, активность интерферона после введения препарата была обнаружена в сыворотках крови почти всех обследованных детей, в то время как до введения его активность была обнаружена только у части обследованных. Эти данные коррелировали со снижением заболеваемости гриппом и другими ОРЗ, частотой возникновения осложнений и уменьшением средней продолжительности одного случая заболевания.

В наблюдениях на детях было изучено также профилактическое действие продигиозана, используемого в период эпидемии гриппа типа В. В наблюдениях участвовали как здоровые дети школьного возраста, редко болеющие респираторными заболеваниями, так и дети с ослабленными системами интерферона и иммунитета, часто болеющие этими заболеваниями.

У здоровых детей после трехкратного введения продигиозана активность интерферона в сыворотках крови повысилась, в среднем, до 384 ;ль/мя, в то время как этот же показатель в контрольной группе составил 130 МЕ/мл. Активность интерферона была обнаружена в сыворотках крови детей, получавших продигиозан, и после эпидемии гриппа В (примерно через месяц после последнего введения препарата), средний титр - 244 МЕ/мл, в то же времт в контрольной группе этот показатель был значительно ниже-93 МЕ/мл. Следует отметить, что регистрируемая в сыворотках крови активность интерферона у части обследуемых в контрольных группах, а также в фоновых сыворотках в этом и других наблюдениях обусловлена, возможно, их встречей с циркулирующими в этих коллективах респираторными вирусами в неблагоприятный по заболеваемости период времени. Повышение уровня активности интерферона в сыворотках крови детей под влиянием продигиозана сопровоадалось снижением заболеваемости как гриппом, так и другими ОРЗ.

Наряду с этим была изучена зависимость интерферониндударующего действия продигиозана от исходного уровня активности интерферона в сыворотках крови редко и часто болеющих респираторными заболеваниями детей. Препарат использовали в виде двух циклов с интервалом в два месяца. Было показано, что при исходном уровне активности интерферона, составляющем, в среднем, 215 МЕ/мл, под влиянием продигиозана происходит его снижение, в среднем, до 80

ii 120 /IE/мл у редко и часто болеющих детей, соответственно (табл. I). Однако, эти показатели вше тех, которые зафиксированы в контрольной группе для редко болекщих детей - в 8 раз, а для часто болеющих - в 3 раза. Через два месяца после первого цикла введения продигиозана уровень активности сывороточного интерферона составил 60 и 115 Mt/мл у редко и часто болеющих детей, соответственно, при 26 и 160 Ж/т в контрольных группах. Однако, после второго цикла средний титр сывороточного интерферона, в основном, уменьшился по сравнению с фоновыми показателями и с уровнем его активности в контрольных сыворотках.

Таким образом, при тигре интерферона больше 200 iSL/un в сыворотках крови как у редко, так и у часто болеющих детей индуктор интерферона может снижать его уровень (особенно у редко болеющих), однако, даже через два месяца после введения препарата уровень активности сывороточного интерферона остается повышенным по сравнению с этим же показателем в контрольной группе. Но при этом второй цикл использования продигиозана является нежелательным, т.к. под его влиянием происходит снижение уровня активности сывороточного интерферона даже по сравнению с его уровнем в контрольных сыворотках. Полученные результаты могут быть связаны с возникновением гипореактивности в системе интерферона, обусловленной длительной его продукцией. Поэтому наличие интерферона в сыворотках крови с активностью больше 200 .'.!i/wi может существенно влиять на эффективность использования индукторов его образования и может являться противопоказанием для их назначения.

Таблица I

Влияние исходного уровня активности сывороточного интерферона на ашврферониндуциругацее действие продигиозана у детей

С^е.иние титры интерферона в

Группы первый цикл второй цикл

фон после вве-фон после вве-

дения ин-Д5КГора дения индуктора

Получившие индуктор редко болеющие 215 80 60 ¿35

часто болеющие 215 120 115 ¿30

Получившие плацебо редко болеющие 145 10 26 180

часто болеющие 110 40 160 190

В группе индукторов интерферона синтетического происхождения было проведено сравнительное изучение интерферониндуцирунце-го действия сополимера К-ВАЯК и амиксина в наблюдениях на 30 добровольцах. Обследуемые получали ВС-ЪАЯК пероралыю на протяжении трех дней в курсовой дозе 700 мг. Было показано, что препарат индуцирует выработку интерферона в невысоких титрах (до 32 МЕ/мл) во время его использования и на протяжении нескольких дней после окончания курса приема. Двукратное увеличение курсоноЛ дозы индуктора интерферона не способствовало усилению его интерферониндуцирукщего действия.

Намного более сильный эффект был получен при использовании низкомолекулярного индуктора интерферона амиксина. Добровольцы получали амиксин перорально по схеме: две таблетки трижды с интервалом 48 часов (курсовая доза 750 мг). При этом было показано, что на 2-4 дни наблюдения уровень интерферона в сыворотках крови добровольцев опытной группы увеличился, в среднем, до 70-90 М^/мл, соответственно, при фоновом уровне 36 НЕ/мл. На протяжении последующих 5 и 6 дней наблюдения средний уровень интерферона также превышал фоновые показатели. Через три дня после окончания приема препарата средний титр интерферона составлял 80 Ж/мл. Довольно высокий уровень интерферона (100 МЕ/мл) был обнаружен у добровольцев опытной группы и через 14-17 дней после окончания приема препарата.

При снижении курсовой дозы амиксина его интерферониндуцирую-щее действие также уменьшалось.

Таким образом, было показано, что синтетический препарат амиксин оказался значительно более сильным индуктором интерферона, способным индуцировать его выработку до 100 М1./мл и через 2 недели после окончания приема, по сравнению с ВС-ВАЯК.

Представленные данные свидетельствуют о том, что изученные в наблюдениях на людях официнальные препараты различного происхождения, обладащие интерферокиндуцирующим и иммуномодулирующим действием, - экстракт элеутерококка, продигиозан и амиксин - могут быть использованы в качестве профилактических препаратов и стимуляторов клеточного иммунитета для защиты от грипаа и других ОРЗ.

4. Новые иммуномодулацуицис препараты местно-резорбтивного действия, созданные на основе человеческого рекомбинантного альфа-2 интерферо;

В связи с тем, что не все люди отвечают выраженной индукцией эндогенного интерферона в ответ на введение индуктора, было проведено сравнительное изучение противовирусного действия препаратов экзсгсппсгс интерферона я эпидемический по гриппу период. Использовали препараты лейкоцитарного и рекомбинантного альфа-интерферона с активностью от 300-600 .Ж/мл до Ю6 Ж/мл, соответственно, которые вводили интраназально с помощью распылителя. При этом рекомбинантный альфа-интерферон способствовал большему снижению заболеваемости гриппом и другими ОРЗ (в 2,1 раза по сравнению с этим же показателем в контрольной группе), однако, статистически достоверной разницы с показателем снижения заболеваемости при использовании лейкоцитарного интерферона (в 1, раза), несмотря на значительно более высокую биологическую активность рекомбинантного препарата, отмечено не было. Поскольку активность интерферона в сыворотках крови обследуемы> лиц не выявлялась, то их защитный эффект мог быть связан с индукцией состояния неспецифической резистентности в области верхних дыхательных путей, являющихся входными воротами для респираторных вирусов.

Так как препараты интерферона в' виде раствора быстро смываются с поверхности слизистой оболочки, то для получения более выраженного эффекта была разработана новая лекарственная фор;ла человеческого рекомбинантного альфа-2 интерферона - мази, и при использовании предложенной технологии создан ряд высокоэффективных иммуностимулирующих препаратов месгно-резорбгивного действия. Ьыло изучено влияние на биологическую активность интерферона как компонентов основы, так и стабилизаторов, пролонгаторов и носителей активного начала, и подобраны такие их соотношения, при которых противовирусное действие интерферона проявляется в наибольшей степени.

Один из препаратов человеческого рекомбинантного альфа-2 интерферона с коммерческим названием "Интерген" был испытан в наблюдениях на людях. В состав препарата в качестве мазевой основы входит сплав ланолина безводного с вазелином медицинским, а в качестве стабилизатора - сывороточный альбумин человека. "Интергег подлежит длительному сроку хранения - больше I года.

Были проведены Государственные испытания разработанного препарата у больных хронической рецидивирующей герпетической инфекцией (НО человек) в амбулаторно-консультативном отделении клинического отдела НИИ гриппа РАМН и на клинической базе кафедры дерматологии Московской медицинской академии. Установлено, что препарат обладает хорошей переносимостью, способствует значительному уменьшению выраженности (или исчезновению) субъективных проявлений обострения хронической рецидивирующей герпетической инфекции. Побочных отрицательных явлений и противопоказаний не обнаружено .

Применение препарата у больных (лабиальный герпес) в стадии обострения путем аппликации на пораженные участки кожи и слизистой оболочки 3-4 раза в день с интервалом 4-6 часов (курсовая доза 3,0-10,0 г, продолжительность курса лечения от I до 8 дней в зависимости от стадии рецидива) показало, что у 30,0% обследуемых произошло купирование рецидива без развития клинических признаков, у 40,0^ наблюдалось абортивное течение рецидива, и у 30,0% - продолжительность обострения сократилась, в среднем, до 5,2 дня по сравнению с 10,1 дня у больных контрольной группы, пользовавшихся плацебо (и с 8,8 дня - средняя продолжительность предшествовавших периодов заболевания). При этом было отмечено уменьшение выраженности герпетических высыпаний. Подобные результаты были получены при лечении герпетических поражений кожи и слизистых другой локализации .

Препарат "Интерген" способствует предотвращению развития рецидива или его абортивному течению, а также выраженному уменьшению субъективных и объективных проявлений обострения в случае его возникновения в зависимости от стадии развития герпетического поражения кожи и слизистых оболочек, на которой его начали использовать. Более раннее назначение препарата приводит к получению наиболее выраженных результатов при лечении рецидива. Разработанный препарат является одним из самых эффективных противо-герпетических средств для наружного применения.

В ходе,проведенных клинических испытаний обнаружено выраженное местное анальгезирущее действие препарата "Интерген". Этот феномен, вероятно, связан с тем, что под действием протеаз коки и слизистых оболочек молекулы альфа-ингерферона могут распадаться с выделением аминокислотных последовательностей, аналогичных опиоидному пептиду гамма-эндорфину, снимающему болевые ощущения

/ыа1осК .7;£, ЧтИиЕ.Ш., 1У82/.

Выраженные противовирусный и обезболивающий эффекты препарата "Интерген", а также полученные предварительные результаты его использования для защиты от гриппа и других ОРЗ позволяют рассматривать "Интерген" в качестве одного из возможных профилактических и лечебных препаратов (для применения на ранней стадии развития инфекционного процесса) при этих заболеваниях у людей с ослабленными системами интерферона и иммунитета, а также в качестве средства их экстренной профилактики.

К изложенаому выше следует добавить, что присущее как препаратам, так и индукторам интерферона стимулирукщее воздействие на системы интерферона и иммунитета может существенно расширить область их применения и способствовать их использованию не только для защиты от гриппа и других ОРЗ, но и для профилактики и лечения других заболеваний, сопровождавшихся интерферон- и иммуноде-фицитными синдромами.

5. Профилактическое действие гриппозных вакцин,

используемых в сочетании с иммуномодуляторами у людей

До настоящего времени поиски резервов для усиления профилактического действия гриппозных вакцин у людей были связаны, в основном, с попытками или заранее определить будущий эпидемический штамм вируса, или максимально охватить и включить в состав вакцины циркулирующие в человеческой популяции вирусы гриппа.

Нами были предложены и апробированы в наблюдениях на людях, проведенных в клинике волонтеров НИИ гриппа РАМН, способы стимуляции противогриппозного иммунитета, не зависящего от антигенной изменчивости вирусов, основанные на целенаправленном управлении вакцинальным иммунитетом с помощью иммуномодуляторов.

Из группы фитопрепаратов было изучено иммуностимулирующее действие экстракта элеутерококка, сапарала и настойки аралии. При проведении наблюдений с экстрактом элеутерококка, в котором участвовало 29 человек, использовали инактивированную гриппозную хро-матографическую вакцину состава А/Техас/1/77 (НЗЛ"2)+АДфа/1/77 (Н1Л1). У волонтеров, получивших вакцину и вакцину+иммуномодуля-тор (по 2,0 мл в течение 7 дней), были отмечены достоверные иммунологические сдвиги по сравнению с группой лиц, получивших плацебо (рис.8). Как ранее в условиях эксперимента, так и в наблюдениях на людях было показано, что фитопрепарат, являщийся -лндукто-

я 5

к

ч я

>> О

г: е< 4

К 5

и о 3

ея а

5 2

1

Вакцина+индуктор интерферона

вакцина

1280 .

640 -

300

200

300

200

100-

Фоновые показатели (

К 1

Показатели после введения преп аратов

рил я.

Группы волонтеров Показатели клеточного и гуморального иммунитета при использовании вакцины

ром гамма-интерферона, способствовал усилению клеточного иммунного ответа. Так, среднеарифметический индекс стимуляции лимфоцитов (отношение среднего уровня включения 3Н-тимидина в импульсах в минуту до стимуляции к исходному уровню) в реакции бласт-трансформации на соответствующий гриппозный антиген до вакцинации составил 1,93, после введения вакцины он несколько снизился и составил 1,69. В другой группе волонтеров этот показатель до вакцинации был равен 1,19, а после введения вакцины в сочетании с иммуномодулятором возрос до 2,61, т.е. более чем в 2 раза (Р ^ 0,05).

При сопоставлении показателей клеточного и гуморального иммунитета в группе добровольцев, получивших вакциНу в сочетании с индуктором интерферона, определенной корреляции обнаружено не было. На фоне повышенной функциональной активности лимфоцитов в реакции бласттрансформации наблюдалась как высокая продукция антител, так и низкий гуморальный ответ. В группе волонтеров, получивших только вакцину, при отсутствии значимом разницы в показателях функциональной активности лимфоцитов до вакцинации и после титры гуморальных антител были повышены, но не достигал:! показателей, которые имели место в группе лиц, получивших вакцину в сочетании с индуктором интерферона (у последних в половине случаев титры антител достигали 1:1280).

В последующем было проведено изучение спектра гуморальных антител, вырабатывающихся после вакцинации при дополнительном использовании фитопрепаратов. Для иммунизации добровольцев (75 человек) была использована инактивированная коммерческая дивакцина, приготовленная из вирусов А/Бразилия/П/78 (Н1л1)+А/Бангкок/ 1/79 (Н3л£), которую вводили однократно в объеме 0,2 мл внутри-кожно с помощью безыгольного инъектора (В1-3). Среди этих людей опытную группу составили лица, получившие экстракт элеутерококка в дозе 2,0 мл на прием на протяжении 1-5 дней или сапарал в дозе 0,05 г на прием в течение 3 дней. В контрольную группу вхо-■дили лица, иммунизированные вакциной без модулирующих препаратов.

Было обнаружено, что 3-5-дневный прием экстракта элеутерококка обеспечивал повышение числа достоверных приростов титров антигемагглгатининов и антинейраминидазных антител к вакцинным штаммам в 1,5-6,7 раза, а к актуальным дрейфовым вариантам, выделенным 3-6 лет спустя после выделения штаммов вируса гриппа, подобных вакцинным (к "опережающим" вирусам - А/Оилиппины/2/82 (113^2), А/Данэдин/27/83 (КШ), А/Ленинград/107/83 (НЗА2),

- зь -

А/Прага/1/84 (ИМ), - в 1,5-6,8 раза (Р < 0,05-0,001). Средняя геометрическая кратность прироста титров антител к тем же вирусам возросла, соответственно, в 1,2-1,3 и 1,2-1,7 раза. Однократный прием экстракта элеутерококка непосредственно перед иммунизацией влиял на количественные показатели антителогенеза значительно слабее.

Процесс выраженного усиления иммуногенной активности инак-тивированной гриппозной вакцины с помощью фитопрепаратов происходил не только в случае аппликации вакцины традиционным внутри-кожным путем, но и при пероральном введении, при котором она полностью не эффективна. Увеличение синтеза гуморальных антител сопровождалось расширением их спектра - количество достоверных се-роконверсий к "опережающим" штаммам увеличивалось от 2,7 до 7,0 раз (Р с 0,01-0,001).

Прием сапарала также повышал число достоверных сероконвер-сий к вакцинным штаммам в 2,8-4,4 раза, а к "опережащим" вирусам - в 2,8-4,3 раза (Р ^ 0,05-0,001). Средняя геометрическая кратность прироста уровня антител возростала в 1,6-3,2 раза.

Обнаруженный феномен выработки гуморальных антител к "опережающим" штаммам может быть связан с тем, что используемые фитопрепараты, полученные на основе растений семейства аралиевых, обладают способностью активировать В-лимфоциты и вызывать пролиферацию клеток-продуцентов иммуноглобулинов. В частности, было показано, что интерлейкин-2, продукцию которого индуцирует гамма-интерферон, может являться ростовым фактором не только для Т-лимроцитов, но и для В—лимфоцитов в том случае, если они предварительно подверглись активации / о. с-ь .1., 1988/.

Данные клинических иссадований по усилению профилактического действия гриппозных вакцин с помощью препаратов, обладающих иммуномодулирупцим действием, были подтверждены результатами наблюдений на НО работающих лицах, подвергшихся вакцинации. В качестве иммуностимулятора была использована настойка аралии в дозе 2,0 мл на прием перорально однократно в день вакцинации. Было показано, что процент лиц с титром антигемагглютининов » 1:40 выше у тех обследуемых, которым вводили вакцину в сочетании с фитопрепаратом. Кратность прироста титров антител у этих людей составила к антигенам А(Н1Л'1) и А(НЗЛ'2) 3,4 и 3,9; соответственно, против 1,8 и 2,1 при использовании только инактквированной гриппозной вакцины. Наряду с этим данные реакции ингибкции элщии

- -

эритроцитов такжй свидетельствовали о более высокой имг.тупогенной активности вакцины, используемой в сочетании с настойкой аралии, в стимуляции антинейраминидазных антител. Да1шые являются статистически достоверными.

Таким образом, результаты провиденных исследований свидетельствуют о том, что при использовании гриппозных вакцин в сочетании с иммуномодуляторами растительного происхождения по специально разраоотанным схемам происходит выраженной усиление профилактического действия вакцин как за счет стимуляции клеточного противогриппозного иммунитета, так и благодаря выработке широкого спектра гуморальных антител. При этом по данным эпидемиологических наблюдений было отмечено значительное снижение заболеваемости гриппом в коллективах, где вакцинацию проводили в сочетании с использованием фитопрепаратов.

Подобные результаты были получены также при использовании одного из официнальных синтетических препаратов - меаенаминовой кислоты, способного индуцировать, как было показано, выработку гамма-интерферона у людей, в сочетании как с живой (41 волонтер), гак и с инактивированной (30 волонтеров) гриппозными вакцинами. Пммуномодулятор применяли перорально в дозе 1,0 г в сутки в течение 3 дней. На 2 день приема вводили интраназально живую или внутрикожно инактнвированную гриппозную вакцину.

Было показано, что при сочетанном использовании живой сухой вакцины (приготовленной из штамма А/17/42/3 (НЗЛ£) с мефенамино-вой кислотой через 7 дней после их введения имела место активация клеточного иммунитета (индекс стимуляции лимфоцитов 1,36) по сравнению с фоном и с уровнем стимуляции, обусловленным одной гриппозной вакциной. На 22 сутки после введения препаратов индекс стимуляции значительно повысился (до 2,01) по сравнению с фоновым уровнем (0,99), Р < 0,05.

В противоположность этому, при использовании одной живой грип позной вакцины через 7 дней после ее введения было зафиксировано выраженное угнетение клеточного иммунитета (в 2,7 раза) по сравнению с фоном, что, по-видимому, связано с иммунодепрессивным действием живого вакцинного штамма вируса гриппа. В дальнейшем у добровольцев этой группы наблюдалось постепенное увеличение функциональной активности лимфоцитов. Однако, и через 3 недели после иммунизации живой гриппозной вакциной функциональная активность лимфоцитов по отношению к гриппозному антигену оставалась ниже фонового уровня.

- 'К! -

Подученные данные свидетельствуют о том, что индуктор гамма-интерферона оказывал иммунокоррегируацее воздействие на процесс формирования клеточного противогриппозного иммунитета: способствовал устранению иммунодепрессивного действия вакцинного штамма вируса гриппа и на этом фоне оказывал стимулирующее воздействие на иммуногенез.

В то же время при сочетанном использовании живой гриппозной вакцины с мефенаминовой кислотой не удалось определить стимулирующего воздействия индуктора интерферона на формирование гуморального иммунитета.

При изучении влияния мефенаминовой кислоты на формирование противогриппозного клеточного иммунитета после вакцинации добровольцев инактивированной гриппозной вакциной было обнаружено, что выраженная активация клеточного иммунитета по отношению к гриппозному антигену (индекс стимуляции лимфоцитов 3,02) имела место через 8 дней после введения препаратов по сравнению с фоном (индекс стимуляции 1,48) и по сравнению с уровнем стимуляции лимфоцитов, обусловленным одной гриппозной вакциной (индекс стимуляции 2,16), Р < 0,05. В отличие от живой гриппозной вакцины при использовании инактивированной вакцины не было отмечено ее выраженного депрессивного действия на формирование клеточного противогриппозного иммунитета.

В отношении гуморального иммунитета было обнаружено, что дополнительное использование синтетического индуктсра гамма-интерферона способствовало снижению выработки штажоспецифических антител в ответ на вакцинацию инактивированной гриппозной вакциной.

Таким образом, было показано, что результаты проведенных экспериментальных исследований по изучению возможности регуляции систем интерферона и иммунитета модулирующими препаратами с целью усиления профилактической эффективности гриппозных вакцин оказались сопоставимыми с данными, полученными в наблюдениях на людях. Так, с помощью отобранных официнальных препаратов, полученных на основе растений семейства аралиевых (экстракт элеутерококка, настойка аралии, сапарал) и используемых у лкщей по разработанным схемам удавалось усилить формирование поствакцинального типоспе-цифического клеточного иммунитета и тем самым значительно повысить профилактическую эффективность используемых вакцин. Подобные результаты были получены и при использовании синтетического ин-

дуктора интерфоронц-мефенаминовой кислоты. Депрессивное действие кивого вакцинного штамма"вируса гриппа по отношению к факторам клеточного иммунитета при атом не проявлялось. Препарат предотвращал развитие лоствакщшальной ямл^яоделрессии в системе клеточного иммунитета и способствовал его усилению.

Результаты клинико-лабораторного изучения влияния иммуномо-дуляторов и гриппозных вакцин на организм здоровых людей свидетельствуют о хорошей переносимости препаратов и сб отсутствии реэн-тогенности как при раздельном, так и при сочетанием применении.

Данные клинических наблюдений по усилению профилактического действия гриппозных вакцин были подтверждены результатами эпидемиологических наблюдений за снижением уровня заболеваемости гриппом у лиц, привитых вакцинами, используемыми в сочетании с имму-номодуляторами.

С. Показания и противопоказания к назначению препаратов, обладающих иммуномодулирукщим действием

Назначение индукторов интерферона монет иметь определенные ограничения, связанные как с различной интерферонпродуцируюией способностью лейкоцитов отдельных людей, так и в условиях продукции сывороточного интерферона, что, в основном, имеет место при острых и хронических вирусных инфекциях, аутоиммунных и аллергических заболеваниях и может сопровождаться интерферондефицитным синдромом /Готовцева Е.П., Ершов Ф.И., 1969/.

Поскольку примерно у 20,0$ здоровых лиц, а также у детей раннего возраста и пожилых ладей интерферонпродуцзрующая способность лейкоцитов снижена /Малиновская ^.В., 1985; Ершов О.И., Готовцева Е.П., 1989/, назначение индукторов эндогенного интерферона может не принести желаемого результата.

С другой стороны, при длительной продукции интерферона и высоких показателях активности сывороточного интерферона назначение индукторов его образования может быть нежелательным, поскольку , как нами было показано, это может привести к снижению его активности и, соответственно, защитного действия. Поэтому перед тем, как использовать такие препараты и особенно с целью создания противовирусного иммунитета широкого спектра действия, желательно определить возможность его стимуляции "ин витро" :: подобрать соответствующий индуктор, дающий наибольшую продукцию гамма-интерферона у данного человека.

Необходимость контроля за безопасностью использования иммуно-модуляторов, что особенно важно при подозрении на наличие хронических заболеваний, сопровождающихся патологическими изменениями со стороны систем интерферона и иммунитета, послу}кила разработке тестов, позволяющих отдифференцировать нормальное состояние этих систем от патологического. В связи с этим было изучено влияние митогенов (фитогемагглютинина, конканавалина А) и интерлейкина-2 на продукцию лимфоцитами гамма-интерферона и С-реактивного белка, обладающего митогенностью для лимроцитов, а также на реакцию бласттрансформации лимфоцитов как у доноров (8 человек), так и у больных с наличием интерферондефицитного синдрома (15 человек).

При этом было обнаружено, что фитогемагглютинин, используемый в дозе 7,5 мкг/мл, индуцировал в культуре лимфоцитов больных 68 Ш/мл интерферона, у доноров активность интерферона была в 3,9 раза выше и составляла 265 мумл (табл.2). Конканавалин А в дозе 10 мкг/мл индуцировал у больных 70 МЕ/мл интерферона, в то время, как у доноров активность интерферона составляла 200 Ж/мл, т.е. была в 2,8 раза выше, чем у больных. Наряду с этим было установлено наличие интерферониндуцируодего действия,у интерлейкина-2 -в дозе 100 МЕ/мл он стимулировал продукцию 152 МЕ/мл интерферона в лимфоцитах больных людей, в то же время лимфоциты здоровых людей продуцировали 436 М£/мл интерферона. Интерлейкин-2 также увеличивал продукцию интерферона лимфоцитами больных людей, индуцированную митогенама, до 215-332 МЕ/мл. Однако, у доноров эти показатели были значительно выше (890-1210 МЕ/мл).

При изучении влияния митогенов и интерлейкина-2 на пролифера-тивную активность лимфоцитов больных и здоровых людей было показано, что фитогемагглютинин вызывал весьма активное включение 3И-тимидина лимфоцитами больных (10.092 импульса в мин.), в то время как у доноров этот показатель составил всего 2.687 импульсов в мин. При использовании конканавалина А интенсивность включения метки составила 2.868 импульсов в мин., в то время как у доноров этот показатель был в 4,0 раза ниже. Тем не менее интерлейкин-2 значительно увеличивал интенсивность пролиферации лимроцигов под влиянием митогенов у доноров. У больных, наоборот, при использовании фитогемагглютинина интенсивность поглощениями -тимидина снизилась под влиянием интерлейкина-2 почти в 2 раза, а при использовании конканавалина А в сочетании с интерлейкином-2 этот показатель практически не изменился.

Таблица 2

Влияние митогенов и интерлейкина-2 на продукцию интерферона и пролиферацию лимфоцитов у больных и доноров

Наличие :,!итогены интер-лейкина -2

Средние титры Кратность сни-интерферона в жения показа-МБ/мл телей у боль--ных по сравне-

больные доноры нию с донора__ми _

Средние уровни вклю- Кратность уве- Р ченияЗн-тимидана личения локаза-(имп./мин.) телей у боль--ных по сравне-

больные доноры нию с донорами

- фитогемагглютинин 68 265 3,9 10.092+941 2.687+307 3,8 <0,001

- конканавалин А 70 200 2,8 2.868+697 713+44 4.0 < 0,01

- контроль 68 35 0,5 279+50 575+79 0,7 -

+ фитогемагглютинин 254 1210 4,8 5.803+779 4.030+572 1.4 у- 0,05

+ конканавалин А 215 890 4,1 3.452+504 2.338+236 1.5 0,05

+ контроль 152 436 2,9 1.494+333 1.287+26 1,2 -

со I

У больных был зарегистрирован весьма высокий уровень спонтанной продукции С-реактивного белка (211+22 импульсов в мин.), в то время как у доноров этот показатель не превышал 84+5 импульсов в мин. Фитогемагглютинин и интерлейкин-2 способствовали повышению уровня продукции лимфоцитами С-реактивного белка, особенно у доноров, однако он не превышал 236+19 импульсов в мин.у них.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что у здоровых людей лимфоциты в ответ на введение митогенов, и особенно в сочетании с интерлейкином-2, продуцируют гамма-интерферон в высоких титрах, что сопровождается увеличением интенсивности реакции бластгрансформации. Это может являться показателем того, что у них можно создать прочный противогриппозный иммунитет, используя вакцины в сочетании с индукторами гамма-интерферона. У некоторых людей лимфоциты продуцируют низкие уровни гамма-интерферона -в таких случаях, вероятно, будет необходимо дополнительное введение интерлейкина-2 или использование гриппозных вакцин в сочетании с препаратами гамма-интерферона.

В противоположность этому показано, что в условиях хронического поступления интерферона в сыворотку крови и наличия интер-ферондефицитного синдрома продукция гамма-интерферона лимфоцитами в ответ на введение митогенов и интерлейкина-2 резко снижена по сравнению с донорами. Наряду с этим отмечена парадоксально высокая интенсивность реакции бласттрансформации лимфоцитов в ответ на введение митогенов (значительно выше, чем у доноров), причем, дополнительное использование интерлейкина-2 способствовало снижению ее интенсивности в отличие от доноров. У больных наблюдался __ также высокий уровень спонтанной продукции С-реактивного белка, который еще больше возрастал под влиянием фитогемагглютинина и интерлейтана-2.

Полученные данные свидетельствуют о том, что разработанные тесты отражают функциональное состояние гамма-звена системы интерферона и клеточного иммунитета в их взаимосвязи. С их помощью можно определять возможные отклонения в их функционировании и в условиях приема иммуномодуляторов, что позволит полностью гарантировать безопасность их использования, особенно при подозрении на наличие хронической вирусной инфекции.

Анализ результатов проведенных исследований и данных литературы позволяет придти к заключению, что показаниями к назначению иммуномодуляторов с целью профилактики респираторных и других вл-

- <Ц) -

русных инфекций является отсутствие (или низкий уровень активности) интерферона в сыворотках крови людей при достаточно высокой интерферонпродуцируацей способности лейкоцитов.

Назначение ишуномодуляторов может быть противопоказано при наличии интерферона в сыворотках крови в значительных титрах (200 М1<умл и выше), т.к. это может привести к снижению его активности и, соответственно, противовирусного действия. Наличие интерферона в сыворотках кропи и низкая интепЬеоонпродуцируодая способность лейкоцитов, а также высокий уровень спонтанной продукции С-реактивного белка и интенсивности реакции бласттрансфор-мации лимроцитов в ответ на введение митогенов и интерлейкина-2 могут свидетельствовать о хронической продукции интерферона лейкоцитами этих людей и возможном наличии хронической вирусной инфекции. При этом иммуномодуляторы можно использовать только при контроле за этими показателями с целью их нормализации.

ЗАКЛШЕНИЕ

Разработано новое направление профилактической медицины, расширяющее возможности создания невосприимчивости к вирусным инфекциям, сопровождающимся выраженным иммунодефицитным синдромом. Сформулирован новый подход к пониманию основных механизмов патогенеза гриппозной инфекции, сущность которого заключается в определении доминирующего влияния депрессивного действия вируса гриппа на формирование клеточного противовирусного иммунитета. Впервые показано выраженное антидепрессивное действие интерферона экзогенного а эндогенного происхождения и отобраны индукторы его образования для рефляции функционального состояния систем интерферона и иммунитета с целью обеспечения невосприимчивости к инфекциям, вызывающим состояние иммунодефицита. Обоснована необходимость использования этих препаратов для коррекции противовирусного иммунитета и стимуляции эффекторной активности иммуноцитов.

На этой основе разработаны новые способы стимуляции противогриппозного иммунитета, не зависящего от антигенной изменчивости вируса гриппа. Впервые наряду с экспериментальными препаратами для усиления профилактической эффективности гриппозных вакцин использованы официнальные препараты. Значительное расширение диапазона профилактического действия вакцин, используемых в сочетании с иммуномодуляторами, связано с выработкой эндогенного интерферона,

предотвращения поствакцинальной иммунодепрессии в системе клеточного иммунитета и его усиления, а для фитопрепаратов - и за счет увеличения выработки и расширения спектра гуморальных антител. Испытание новых способов усиления профилактической эффективности гриппозных вакцин как в условиях клиники волонтеров, так и в эпидемиологических наблюдениях показали их высокую эффективность, значительно превосходящую показатели, полученные при использовании одних вакцин.

Результаты изучения интерферониндуцирувдего и иммуномодули-рующего действия отобранных соединений растительного происхождения были использованы при создании новых лекарственных фитопрепаратов для практической медицины. Разработаны препараты человеческого рекомбинантного альфа-2 интерферона местно-резорбтивного действия. Определены показания и противопоказания для назначения модулирующих препаратов и разработаны методы контроля за безопасностью их использования.

ВЫВОДЫ

1. Методом скрининга среда свыше 100 природных и синтетических соединений отобран ряд оригинальных и официнальных клинически перспективных препаратов различного происхождения, обладающих интерфероно- и иммуномодулирупцим действием: фитопрепараты, полученные на основе растений семейства аралиевых, германийорганичес-кие соединения, продигиозан, дипиридамол, левамизол, мефенамино-вая кислота, амиксин.

2. Установлено наличие противовирусного действия и разработаны рекомендации по его усилению у фитопрепаратов, созданных на основе нового вида лекарственного сырья, содержащего помимо биологически активных веществ растительного происховдения синтетические соединения, обладаюцие интерферониндуцирущей активностью.

3. Показано, что наиболее активными индукторами интерферона среди изученных препаратов растительного происхождения являются соединения, полученные на основе биомассы культуры ткани корня женьшеня, выращенной на селективной по содержанию соединений германия питательной среде. Впервые обнаружен иммуностимулирующий эффект, зависящий от используемых доз фитопрепаратов. Все изученные препараты растительного происхождения, введенные однократно, обладают профилактическим действием при экспериментальной гриппозной инфекции (индексы эффективности составляют 1,6-1,9).

4. Установлено, что выраженный противовирусный эффект гамма-интерферона обусловлен его свойствами оказывать антидепрессивное действие на систему клеточного иммунитета и стимулировать его формирование. Показано, что он обеспечивает выживание от летальной гриппозной инфекции до 88,0 % животных, в то время, как адекватные количества альфа-интерферона такого действия не оказывают.

5. Сфор?.™лированя. ипняя кониепиия зашиты от вирусных инфекций, сопровождающихся депрессивным воздействием вирусов на формирование клеточного противовирусного иммунитета. Сущность ее заключается в коррекции негативного влияния вирусов на формирование противогриппозного иммунитета с помощью отобранных препаратов, обладающих антидепрессивным действием по отношению к клеточному типоспецифическому иммунитету и стимулирующих его формирование. Экспериментально доказано, что с помощью комплексного использования этих препаратов и гриппозных вакцин можно добиться стимуляции противогриппозного иммунитета, не зависящего от антигенной изменчивости вируса гриппа.

6. Разработаны способы защиты от летальной гриппозной инфекции путем сочетанного использования гриппозных вакцин и отобранных экспериментальных препаратов, обладающих иммуномодулирующим действием. Наибольший иммуностимулирующий эффект получен при использовании вакцины в виде смеси с препаратом, полученным на основе биомассы культуры ткани женьшеня, выращенной на селективной по содержанию соединений германию питательной среде (индекс эффективности составляет 1,7), а также с кватерином и настойкой полис-циаса (индексы эффективности составляют, соответственно, 1,6 и 1,5).

7. Впервые в эксперименте на животных показано усиление профилактического действия гриппозных вакцин с помощью отобранных официнальных препаратов: экстракта элеутерококка, продигиозана, левамизола, настойки китайского лимонника. Наибольший иммуностимулирующий эффект получен при использовании гриппозной вакцины в виде смеси с экстрактом элеутерококка или продигиозаном (индской эффективности составляют, соответственно, 2,0 и 2,1; защищенность достигает 90,0% при 25,0$ защищенности в случае использования одной вакцины).

8. Предложены и апробированы в исследованиях на людях способы стимуляции противогриппозного иммунитета, не зависящего от антигенной изменчивости вирусов, основанные на целенаправленном управлении вакцинальным иммунитетом с помощью иммуномодуляторов.

9. Установлено, что использование гриппозных вакцин в сочетании с фитопрепаратами у людей (экстракт элеутерококка, настойка аралии, сапарал) и мефенаминовой кислотой может способствовать значительному расширению диапазона их профилактического действия за счет выработки эндогенного интерферона, предотвращения поствакцинальной иммунодепрессии в системе клеточного иммунитета и его усиления, а для фитопрепаратов - и за счет увеличения выработки

и расширения спектра гуморальных антител.

10. Разработаны рекомендации для клинического использования новых отечественных высокоактивных оригинальных интерфероно- и иммуноыодулируюдих препаратов "Биоженьшень" и "Панаксел" - для профилактики гриппа и других ОРЗ отдельно или в сочетании с вакцинами.

11. Разработан новый препарат человеческого рекомбинантного альфа-2 интерферона местно-резорбтиваого действия "Интерген", показавший высокую эффективность при лечении больных хронической рецидивирущей герпетической инфекцией.

12. С помощью разработанных тестов, отражающих функциональное состояние гамма-звена системы интерферона и клеточного иммунитета в их взаимосвязи, определены показания и противопоказания для назначения модулирующих препаратов и методы контроля за безопасностью их использования.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ

1. Разработанные способы усиления вакцинального ответа могут быть использованы при проведении вакцинации против гриппа.

2. Использование методических рекомендаций "Микрометоды лабораторной оценки безвредности и иммуногенной активности гриппозных вакцин и неспецифической резистентности к вирусам гриппа в наблюдениях на детях" (Таллин, 1983) поможен оценить напряженность противовирусного иммунитета и интерфероновый статус и позволит уточнить показания для проведения вакцинации против гриппа.

3. Препараты "Биоженьшень" и "Панакссл" могут быть рекомендованы для профилактики гриппа и других ОРЗ как отдельно, так и

в сочетании с вакцинами для усиления их профилактической эффективности. Биологически активные пищевые добавки "Ьиопан" и "Па-насорб" могут быть использованы для укрепления именной системы и оздоровления всего организма.

4. Препарат "Интерген" обладает выраженным противовирусным, иммуностимулирующим и обезболиващим действием, в связи с чем он может быть использован для лечения герпетических поражений кп*и и слизистых оболочак. а также для лечения инфекционных заболеваний другой этиологии, сопровождающихся местными проявлениями.

5. Разработанные тесты, позволяющие контролировать функциональное состояние иммуноцитов и их интерферонпролуцирующую способность, могут быть использованы с целью определения показаний

и противопоказаний для назначения модулирующих препаратов, а также для осуществления контроля за безопасностью их использования, особенно при подозрении на наличие хронической вирусной инфекции.

Список работ, опубликованннх по теме диссертации

1. Протасова С.Ф. О динамике периодов противовирусной резистентности после двукратных введений индукторов интерферона у животных// Сб. трудов НИИ гриппа "Проблемы гриппа и ОРЗ". - Л.,1975.-№ 12.-С.91-94,

2. Васильева Т.Г., Протасова С.Ф., Шапиро Н.И. йнтерфероногенная активность эндотоксинов и ее связь с молекулярными параметрами и химическим составом// Доклады Академии наук СССР. -1977.-Т.238,Л 6.

-С.1468-1470.

3. Протасова С.Ф., Шапиро Н.И. Сравнение защитного действия эндотоксин -индуциров энного и вирус-индуцированного интерферонов при экспериментальной гриппозной инфекции// Сб.трудов НИИ гриппа "Иммунология, клиника и лечение гриппа". -Л., 1980. - С.70-75.

4. Протасова С.Ф., Колоткнская Т.М. Особенности противогриппозного иммунитета при использовании иммунного и вирус-индупированного интерферонов// Тезисы докладов Всесоюзной конференции молодых ученых "Вирусы человека и животных". - Рига, 1981. -С.72-73.

5. Зыков М.П., Протасова С.Ф., Егорова Т.С. Иммуномодулируемая вакцинация против гриппа// Тезисы докладов У Всесоюзного симпозиума по целенапр.изысканию физиол.активных веществ. - Рига, 1983.-С.59-60.

6. Протасова С.Ф., Егорова Т.С., Зыков М.П. Иммуномодулируемая вакцинация и перспективы ее применения для защиты детей от гриппа// Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Комплексная профилактика гриппа и других ОРЗ у детей". - Таллин, 1983. - С.48-49.

Приймяги Л.е., Суби К.Х., Кромермш. И.Б., Зыков М.П., Сиротенко Е.А, Волкова В.А., Румель Н.Б., Протасова С.Ф., Сосунов A.B. Микрометоды лабораторной оценки безвредности и иммуногенной активности гриппозных вакцин и неспецифической резистентности к вирусам гриппа в наблюдениях на детях// Методические рекомендации. - Таллин, 1983. - 28 с.

3. Зыков М.П., Васильева Р.И., Протасова С.Ф. Временные поствакцинальные иммунодефицита и предупрежу ение их развития// Тезисы докладов конференции по проблеме иымунодефипитов. - Ташкент, 1984. - С.8.

3. Zykov М.Р., Protasova S.P. Prospects of imraunostimulating vaccination against influenza including the use of Eleutherococcus and other preparations of plant origin//Proceeding of the Second Internatiom;' Symposium on Eleutherococcus. Part IX.-Vladivostok, 1986.-P.164-169.

3. Protasova 5.F., Zykov Ы.Р. Antiviral effect of Eleutherococcus in experimental influenza infection.-.-is above.-P.170-174.

[. Игнатьева Г.С., Турьева A.B., Гагаринова В.М., Дриневский В.П.,

Олейникова Е.В., Протасова С.Ф., Волкова В.А. Эффективность продиги-озана среди детей школьного возраста в эпидемию гршша в 1986 г.// Сб. трудов НИИ гриппа "Профилактика гриппа и ОРЗ у взрослых и детей".-Л., 1987.- С.116-120.

2. Волгарева Е.В., Протасова С.Ф. Подавление синтеза ДНК в лимфоцитах плазмой, подвергнутой УФ-облучению// Бюллетень эксп.биол.мед. -1987. - Jé 8. - С.205-206.

3. Протасова С.Ф. Щеканова С.М. Профилактическое действие некоторых фитопрепаратов при гриппозной инфекции// В сб."Фитопрепараты". -M., 1983. - С.24.

4. Минина С.А., Слепян Л.И. Михайлова Н.В., Старцев Ф.Н., Комов В.П., Грушвицкий И.В., Бутенко Р.Г., Дуденас Г.З., Миронов В.Ф., Протасова С.Ф. и др. Штамм КуЛЬТИВИруемЫХ КЛеТОК растений Panax ginseng с.«. Key, используемый для получения биологически активных веществ и как иммуномодулятор// Авт.сеид.й I4I2295 от 22.03.1988 г.

5. Островская С.А., Гагаринова В.М., Протасова С.Ф., Родина М.А., Пис-карева H.A. Результаты интерферонопрофилактики гриппа и ОРЗ в детских дошкольных организованных коллективах Ленинграда// Сб.трудов НИИ гриппа "Реаферон". - Л., 1988. - C.II0-II5.

6. Гагаринова В.М., Карпухина О.Г., Майкова Э.В., Падалко Ю.В., Протасова С.Ф., Игнатьева Г.С., Турьева A.B., Каторгина Л.Г. Изучение эффективности реаферона в организованном коллективе взрослых// Сб. трудов НИИ гриппа "Реаферон". - Л., 1988. - С.53-58.

7. Протасова С.Ф., Элькин В.М., Найхин А.Н., Дюбина Т.А. Курилова Д.И., Гагаринова В.М., Осипова М.В. Усиление профилактического действия гриппозных вакцин с помощью препаратов, повышающих неспецифическую резистентность организма// Сб.трудоЕ НИИ гриппа "Проблема конструн-

рования гриппозных вакцин". - Л., 1988. - С.98-105.

18. Найхин А.Н., Элькин В.М., Курилова Д Э., Дюбина Т.А., Протасова С.Ф., Кинго З.Н., Кагоргина Л.Г., Кротова И.М., Ким Т.Н. Иния-ние элеутерококка и сапарала на формировании клеточного и гуморального иммунитета к гриппу// Ред.журн. Вопр.вирусол. - М., 1989. - 12с. - ДЕЛ. в ВИНИТИ 04.05.89. - Л 2905-В89.

19. Протасова С.Ф., Щеканова С.М. Лечебно-профилактическое действие некоторых препаратов, повышающих нес1шцифичеик.ую резистентность при летальной гриппозной инфекции// Тезисы докладов Всес.симп. по проблеме неспецифической резистентности. - Л., 1989. - С.34.

20. Протасова С.Ф., Щеканова С.М. Влияние продигкозана на течение экспериментальной гриппозной инфекции// Сб.трудов НИИ гриппа "Клиника, патогенез и лечение гриппа и других ОРЗ". - Л., 1989.

- С .163-166.

21. Кустикова В.Г., Гагаринова В.М., Чистякова А.И., Протасова С.Ф. Профилактика гриппа и ОРЗ у организованных детей дошкольного возраста с помощью неспецифических средств и методов// Вопросы охраны мат. и дет. - 1990. - Т.35, Н 9. - С.72.

22. Протасова С.Ф. Новое поколение иммуномодуляторов в профилактике и лечении гриппа и других ОРЗ// Тезисы докладов П Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - М., 1995.

- С.191.

23. Щеканова С.М., Протасова С.Ф. К вопросу о создании лекарственных препаратов интерферона местно-резорбтивного действия// Вест.АМН. - 1996. - № 3.

24. Протасова С.Ф., Щеканова С.М., Васильевых Л.А., Руденко Д.И., Лобзин B.C., Барклай-де-Толли М.Н. Влияние интерлейкина-2 на продукцию интерферона лимфоцитами человека и значение этого теста при аутоиммунных заболеваниях// Вест.АМН. - 1996 - Je I.

- С.54-58.