Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование специфических и неспецифических факторов защиты при локальной иммунизации инактивированной гриппозной вакциной со стимулятором иммуногенеза

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Формирование специфических и неспецифических факторов защиты при локальной иммунизации инактивированной гриппозной вакциной со стимулятором иммуногенеза"

р Г Б 0 Российская академия медицинских наук

научно-исследовательский институт гриппа

На правах рукописи

удк 616.98 : 578.832.1 — 084

МАРКЕВИЧ Надежда Александровна

ФОРМИРОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ЗАЩИТЫ ПРИ ЛОКАЛЬНОЙ ИММУНИЗАЦИИ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНОЙ СО СТИМУЛЯТОРОМ ИММУНОГЕНЕЗА

Специальность — 03.00.06 — вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

санкт-петербург 1994

Работа выполнена ® НИИ г.риппа Академии медицинских наук России.

Научные руководители:

доктор . медицинских наук А. В. ИСПОЛАТОВА;

| доктор медицинских наук, профессор Я. С. ШВАРЦМАН. |

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор О. А. АКСЕНОВ; доктор медицинских наук, профессор Э. А. ФРИДМАН.

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский научшьисследовательский институт вакцин и сывороток.

Защита состоится 1994 года

в «/ч^.» часов на заседании специализированного совета (Д 074.48.01) при научно-исследовательском институте гриппа Академии медицинских наук России. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17.

|С диссертацией .можно ознакомиться в библиотеке НИИ гриппа.

Автореферат разослан «

Л .-»/еал^крхш г.

Ученый секретарь специализированного совета И. Н. ЖИЛИНСКАЯ

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Гриппозная инфекция остается одним из наиболее распространенных и не очень контролируемых инфекционных заболеваний, приносящих существенный урон здоровью населения.

Основными причинами неудач вакцинации являются изменим -вость антигенной характеристики вируса гриппа А и несовершен -ство вакцинального гриппозного иммунитета. Учитывая вышесказанное, во всем мире ведутся разработки вакцин, которые способны обеспечивать у иммунизированных защищенность ко всем вариантам вируса гриппа А, независимо от их антигенной характеристики.

В опубликованных за последние годы работах рассмотрены различные аспекты создания таких вакцин. Эти исследования можно условно распределить на следующие группы: создание рекомбинант-ных вакцин, генно-инженерных препаратов, пептидных вакцин и вакцин, включающих индукторы-интерферона - стимуляторы имыуно -генеза ( Петров Р.В., 1989; Askcr^ô ft А ., 1986; ¿ViapirA- К\ ., 1986; liLmei- f1.6> ., 1993).

Общий недостаток, который свойственен всем предложенным до сих пор генно-инженерным и полипептидным гриппозным вакци -нам - это необходимость их парентерального введения, что ограничивает возможность вовлечения в формирование защитной реак -ции механизмов иммунитета дыхательной системы, а также дороговизна подобных вакцин и трудность проведения прививок только по эпидемиологическим показаниям.

Некоторое промежуточное положение между современными вакцинами и вакцинами будущего занимают препараты, состоящие из инактивированных гриппозных вакцин и индукторов интерферона -стимуляторов иммуногенеза. Препараты вводятся интранаэально или перорально (Тлти.д j. ., 1992; Кл1г j- ., 1992). При создании таких препаратов учитывается, что иммунитет к гриппу и вирусам других 0F3 представляет собой полифакторный феномен, в реализации которого участвуют, выраженно взаимодействуя менду собой, факторы гуморального, клеточного иммунитета и неспецифической защиты. Поэтому наиболее перспективны вакцинные препараты, при введении которых гармонично стимулируется формирование секреторных, сывороточных антител, ЦГЛ и интерферона, что и достигается сочетанным введением инактивированной гриппозной вакцины и индуктора - стимулятора. Кроме этого, основной целью разработки

подобных препаратов является формирование у иммунизированных гетерологичного иммунитета, что открывает перспективы реального контроля за заболеваемостью гриппом.

Учитывая вышесказанное, цель настоящего исследования, посвященная-разработке и внедрению в практику нового препарата для защиты; от'.-гриппа, безопасного, удобного для практики и обеспечивающего стимуляцию иммунитета с широким спектром активности является актуальной. В качестве препарата предлагается ис -пользовать коммерческую инактивированную гриппозную вакцину с индуктором интерферона' - стимулятором иммуногенеза. Препарат предназначен для интраназального и перорапьного введения.

Цель исследования. Цель исследования состоит в изучении механизмов формирования гетерологичной защиты к вирусу гриппа типа А и поиске методов направленной регуляции этого процесса как научной основы для совершенствования иммунопрофилактики гриппа.

Исходя из этого были поставлены следующие основные задачи:

1. Выяснить возможность разработки препаратов для профилактики гриппа, обеспечивающих формирование иммунитета с широким спектром активности и вводимых интраназально или перораль-но.

2. Отобрать вещество, обладающее наибольшей эффектив -

н остью как стимулятора-иммуногенеза и индуктора интерферона при введении ИГВ на слизистые оболочки дыхательных и пищеварительных путей.

3. Изучить формирование факторов неспецифической защиты.

4. Определить влияние иммунизации ИГВ со стимулятором на слизистые оболочки дыхательного и пищеварительного трактов на устойчивость животных к гомологичной и гетерологичной инфекции.

5. Провести исследования по изучению механизмов формирования гетерологичной защиты к вирусу гриппа типа А при интра -назальной .и пероральной иммунизации.

6. Изучить иммунологическую безопасность, "острую", "хроническую" токсичность ИГВ со стимулятором иммуногенеза, вводимых на слизистые оболочки.

.. 7. Подготовить и отправить научно-техническую документа -цию на препарат в Фармкомитет РФ.

Научная новизна работы. Впервые обоснована возможность создания гетерологичного иммунитета к вирусу гриппа типа- А' при введении И1В с индуктором-стимулятором на слизистые оболочки дыхательного и пищеварительного тракта. Впервые показана воз -можность стимуляции системы общего и местного иммунитета при пероральной иммунизации НТВ со стимулятором. Выявлены принци -пиальные различия в динамике антителогенеза при интранаэальной и пераральной экспериментальной иммунизации ИЕВ со стимулято -ром. Впервые проведено комплексное изучение- механизмов форми -рования гетерологичной устойчивости животных;к вирусу гриппа типа А. Впервые установлена возможность переноса гетерологич -ного иммунитета к вирусам гриппа типа А пулами смывов с дыха -тельных путей и сывороток крови крыс, иммунизированных комплексным противогриппозным препаратом, мышам. Показано значение интерферона и ЦТЛ в формировании гетерологичной защиты. Доказана роль антител к внутреннему белку М вируса гриппа в формирова -нии этой защиты.

Практическая ценность. -;

Основным практическим результатом исследования является разработка и усовершенствование метода профилактики гриппа с помощью препарата, состоящего из НТВ и индуктора-интерферона -стимулятора иммуногенеза, вводимого на слизистые оболочки да -хательного и пищеварительного тракта..Проведено доклиническое изучение препарата для профилактики гриппа, включающее исследование иммунологической безопасности, а также "острой" и "хронической" токсичности. Подготовлена и отправлена в Фармкомитет РФ научно-техническая документация на препарат.

Положения, выносимые на защиту.

1. Добавление к ИГВ веществ, обладающих активностью не -специфических стимуляторов иммуногенеза, сопровождается повы -шением антителогенеза при введении этих препаратов в дыхательные и пищеварительные пути. Помимо этого индуцируется синтез интерферона.

2. Наиболее важное различие ответной иммунной реакции организма на интраназальное и пероральное введение препаратов' ИГВ со стимулятором состоит в том, что при интраназальном введении указанных препаратов для комплексной стимуляции местного ■ и общего иммунитета требуется использовать на порядок меньшую

дозу антигена и стимулятора, чем при пероральном введении.

, 3. У мышей, иммуниз1фОванных ИГВ со стимулятором иммуногенеза да слизистые оболочки дыхательного и пищеварительного тракта формируется выраженная гомологичная устойчивость. Помимо этого формируется гетерологичная устойчивость к летальной инфекции различными вариантами вируса гриппа типа А, но не вируса гриппа В. .,

Опыты пассивного переноса показали важное значение антител секретов дыхательных путей и сыворотки крови в формирова -нии гетерологичной,устойчивости. У мышей, иммунизированных ИГВ со стимулятором иммуногенеза на слизистые оболочки, помимо антител к гемагглютинину;и.нейраминидазе вируса гриппа формируются антитела к внутреннему белку гетерологичного вируса гриппа - М-белку. Показана роль интерферона и ЦТЛ в формировании гетерологичной устойчивости. •

4. Иммунизация ИГВ со стимулятором на слизистые оболочки дыхательного и пищеварительного тракта безвредна. Она не оказывает депрессивного воздействия на основные показатели гуморального и клеточного иммунитета. Препарат, предлагаемый для такого способа иммунизации, обладает низкой токсичностью и может при -меняться по эпидемиологическим показаниям.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись и обсуждались на конференциях молодых ученых НШ гриппа ( Спб., 1991, 1992, 1993 гг.), на международном Симпозиуме "Интерферон-90" ( Спб., 1990), на отчетной научной конференции НИИ гриппа ( Спб., 1993).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 159 с. машинописного текста. Состоит из введения, обзора литерату -ры, включающего 4 раздела, трех глав собственных исследований, заключения и выводов. Материалы диссертации иллюстрированы 33 таблицами и £ рисунками. Библиографический список включает 219 работ, в том числе 134 статей иностранных авторов.

■,Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 6 печатных работах.

,; ' МАТЕРИАЛЫ И МЕТОда

Экспериментальные животные: в опытные группы животных, которым вводили препараты, и контрольные группы, получавшие плацебо, входили: 251 мышей-самцов линии СВА, 48 мышей-самцов линии

С57^Ьи:к, 4090 беспородных мышей, 260 крыс, 65 морских свинок и 2 кролика. Материалы для исследования: кровь, её сыворотка, смывы из дыхательных путей, ткани селезенки, легких, ткани других органов и моча.

Для иммунизации животных, воспроизведения летальной инфекции и приготовления диагностических препаратов использовали следующие вирусы гриппа: А/РЕ/8/34(Н1П1), А/^^^/Ю/бЗ (Н2П2), А/Аи ги /2/68(НЗП2), А/Ленинград/289/83(НЗП2), В/и?е/40. Препараты инактивированной (ИГВ) вакцины готовили из хорионал-лантоисной жидкости инфицированных развивающихся куриных эмб -рионов. При получении ИГВ вирус очищали я'концентрировали сорб-цией-элюцией на куриных формалинизированных эритроцитах и скоростным центрифугированием. Вирус инактивировали УШ-облучением. Полноту инактивации проверяли на инфицированных развивающихся куриных эмбрионах. Вирусы, предназначенные для инфицирования, адаптировали к организму мышей серийными пассажами. Для определения величины ДЦзд животных делили на группы по 7 мышей в каждой и инфицировали логарифмическими разведениями вируса. Ги -бель животных учитывали в течение 10 дней. Для определения причины гибели проводили визуальное обследование ткани легких. Результаты опытов статистически обрабатывали по методу / ^ в модификации Крамера.

Концентрацию антител к вирусам;гриппа в сыворотках крови и секретах из верхних дыхательных путей определяли в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), антитела к эритроцитам барана - в реакции агглютинации, антитела в сыворотках крови и секретах к М-белку гетерологичного вируса - в реакции иммуноблоттин-га, АОК - по модифицированному методу локального лизиса Сапт^'-Ь\<1;А(1965), концентрацию комплемента, системную анафилаксию, РБТ и активность ЦТЛ исследовали по стандартным методикам ("Методические рекомендации по экспериментальному (фармакологичес -кому) изучению иммуномодулирующего действия фармакологических средств". -М.,1986). Интерферон титровали по методу Гттег (1967). Активность альвеолярных макрофагов определяли по пока -зателю поглощения латекса и подсчитывали фагоцитарный индекс ("Методические рекомендации по выявлению иммунологической недостаточности у больных острой пневмонией и хроническим бронхитом", -л.,1961). "Острую" токсичность изучали на мышах и крысах, "хроническую" - на крысах и собаках совместно с сотрудниками СпбХШ'.

•. Таким образом, использованный при проведении исследований. комплекс методов позволял получить информацию о формировании общего и местного гуморального иммунитета и фактора неспецифической устойчивости - интерферона, влиянии иммунизации комплексным -препаратом на устойчивость животных к различным вариантам вируса гриппа А и Б, механизмах формирования гетеро-логичной устрйчивости, а также иммунологической безопасности и безвредности,изучаемого препарата.

Основные результаты собственных исследований Формирование местного*'«1.'общего Как известно, иммунитет к гуморального иммунитета гриппу предСтавлЯет собой

полифакторный феномен, в котором выраженно взаимодействуют факторы гуморального, клеточного иммунитета и неспецифической резистентности. При этом наиболее удачной может считаться такая вакцина, которая обеспечивает одновременную стимуляцию защит -ных приспособлений разной природы для формирования максимально полноценной защиты от гриппозной инфекции. Ввиду особенностей патогенеза гриппа и других респираторных инфекций, местный иммунитет вообще и секреторный в' частности, а также интерферон можно рассматривать как первою линию обороны организма.

Поэтому в настоящем разделе представлены результаты ис -следований по изучению формирования сывороточных, секреторных антител и интерферона у различных экспериментальных животных, иммунизированных на слизистые оболочки препаратом, состоящим из инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ) и вещества с актив -ностью индуктора интерферона - стимулятора иммуногенеза (ИИСИ). Такой препарат был назван комплексным препаратом для профилактики гриппа - КПГ.

Задача первой серии опытов состояла в отборе ИИСИ, оптимального для выполнения цели настоящей работы. Было исследовано 27 веществ, относящихся к полисахаридам, липополисахаридам, синтетическим полирибонуклеотидаы и химическим веществам. По интерфероногенному и антителостимулирующему действию оптимальным оказалась основная цепь (кор) полисахарида аубазидана - кор-аубазидан. Преимущество этого вещества подтверждалось также тем, что. кораубазццан обладает низкой токсичностью при введении на слизистые оболочки. Таким образом, во всех дальнейших опытах в качестве ИИСИ был использован полисахарид кораубазидан.

После выбора ИИСИ встала задача изучить формирование спе-

ь.

цифического местного и общего иммунитета и интерфероногенез при иммунизации животных КПГ на слизистые оболочки дыхательного и пищеварительного тракта. При проведении этой серии опытов выявилось, что совместное пероральное введение ИГВ с корауба -зиданом позволило получить следующие результаты: во-первых, на всех сроках наблюдения титры секреторных антител были в 4-10 раз выше, чем при введении ИГВ без ИИСИ. Во-вторых, протектив-ные концентрации секреторных антител удалось,■документировать уже на первый день после введения КПГ, а при введении только ИГВ протективные концентрации секреторных антител не регистрировались и на 14 день. В-третьих, что, ..пожалуй, самое важное, ' введение вакцины со стимулятором позволило воспроизвести гар -моничную стимуляцию антителогенеза в обеих системах иммунитета, то есть к 7 дню зарегистрирован антителогенез в системе общего иммунитета.

Аналогичные результаты были получены и при интраназаль -ной иммунизации КПГ.

Целесообразность сочетания ИГВ и кораубазидана в едином препарате КПГ как при пероральном, так и при интраназальном введении этого препарата выявилась ещё более отчетливо в ходе определения концентрации интерферона в гомогенатах легких имму -низированных мышей. Интерфероногенез выраженно усиливался при обоих изучавшихся способах аппликации КПГ, хотя пероральное введение указанного препарата стимулирует интерфероногенез на порядок слабее. Следует отметить, что интерферон, образующийся у животных, иммунизированных КПГ, относится преимущественно к д'-типу (иммунный интерферон), в то время как у животных, иммунизированных только ИГЗ, интерферон относится в основном к -типу. Как известно, эффективность ^-интерферона как лимфокина играет важную роль в регуляции иммунного ответа, активируя Т- и В-лимфоциты.

Подводя итог сказанному, может быть сделан весьма существенный вывод, а именно: при иммунизации комплексным препаратом один фактор невосприимчивости как бы передает эстафету другому. С первых суток, когда значительное повышение концентраций сек -реторных и сывороточных антител ещё отсутствует, высоких кон -центраций достигает интерферон в ткани легких, то есть в органе, где у мышей регистрируется максимальная репродукция вируса при: летальной гриппозной инфекции. Супериндуцирование синтеза интерферона, достигаемое введением двух индукторов разной природы,

продлевает персистенцию концентрации интерферона до двух и даже четырех суток, когда в секрете и сыворотке крови начинают появляться антитела в протективной концентрации. К 7 дню защитное действие интерферона исчезает, но именно в этот период максимальных концентраций достигают оба типа антител. Основываясь на приведенном выше представлении о комплексной природе проти -вогриппозного иммунитета и взаимодействии отдельных компонентов этого комплекса в защите организма, полученная при введении КПГ сочетанная стимуляция синтеза интерферона, секреторных и сыво -роточных антител представляется весьма целесообразной.

Устойчивость мышей, иммунизиро- Один из основных элементов

ванных КПГ' на слизистые оболоч- современной теории ^тойчи-ки, к летальной гриппозной ин - современной теории устоичи-

фекции вости к гриппу - это кон -

цепция наличия, наряду со штаммоспецифическим, гетерологичного иммунитета, действие которого распространяется на все вирусы гриппа А. Не вызывает сомнений принципиальная значимость создания таких вакцин, введение которых формирует устойчивость ко всем вариантам вируса гриппа А. Поэтому в настоящем разделе работы была поставлена задача определить как введение КПГ' на слизистые оболочки формирует у экспериментальных животных невос -приимчивость к гомологичной и гетерологичной летальной инфекции.

Опыты были начаты с определения устойчивости к вирусу, по антигенной структуре гомологичному иммуногену. При этом выяви -лось два принципиальных преимущества интраназального и перораль-ногс введения КПГ: во-первых, устойчивость у животных развива -лась не позднее 16 часов после иммунизации, что открывает перспективу проведения вакцинации строго по эпидемическим показаниям, то есть тогда, когда возникает реальная угроза развития заболевания. Во-вторых, устойчивость животных, привитых КПГ', бы -ла на всех сроках выше, чем при введении ИГВ или плацебо.

В следующем исследовании группу мышей иммунизировали пе -рорально КПГ с вирусом А/Аи-'п1 /2/66(НЗН2), вторая группа получала плацебо. Инфицирование проводили на 1,3,7,14,21 и 26 дни после иммунизации вирусом А/РР/б/34(Н1Н1). Результаты опыта представлены в таблице. Как видно из таблицы, пероральная им -мунизация КПГ' на 1,2-2,8 10 -ВД^д снижает гибель животных.

При проведении этой серии опытов оказалось, что при су -щественно меньших дозах иммуногена интраназальная иммунизация КПГ позволяет воспроизвести более напряженную гетерологичную устойчивость, чем пероральная. ( При интраназальной иммуниза -

Таблица I

Влияние пероральной иммунизации ИГЕ с индуктором интерферона на устойчивость мышей к гетерологич-ному вирусу гриппа А

Спок инфицирования после иммунизации ('сутки )

Количество животных в группе

Величина лДэд ( М + иг) при изучении

ИГВ + кораубазидан

Плацебо

I 3 7 14 21 26

35 35 35 35 35 35

1,80 + 0,31 х 2,60 + 0,32 х 2,64 + 0,32 х 3,50 + 0,31 х 2,60 + 0,31 х 3,50 + 0,31 х

4,60 + 0,34

4,60 + 0,31

3,66 + 0,32

4,Ь0 + 0,32

4,66 + 0,34

4,80 + 0,31

х - Р ^ 0,05 по сравнению с контролем

ции мышей КПГ с вирусом А/А5х\а/&/б8(НЗН2) и инфицировании их вирусом А/РР/8/34(Н1Ш) оказалось, что введение этого препарата снижает гибель животных на 2,0-3,6 ДЦ^д). Это обстоятельство, очевидно, не должно обескураживать, так как в случае, если величина прививочной дозы не будет ограничивать проведение вакцинации, можно будет использовать дополнительные резервы повышения эффективности пероральной иммунизации, а именно: увеличить величину прививочной дозы, количество введения препарата, подобрать оптимальную для воспроизведения бустер-эффекта схему введения вакцины.

Выявленная гетерологичная защита представляет, по-видимому, универсальный феномен в пределах серотипа А, так как аналогичные результаты были получены и в следующей серии опытов, когда для иммунизации мышей использовали дивакцину из вирусов АДенинград/269/63(КЗП2)+А/РР/5/34(Н1Н1), а для инфицирования использовали вирус А/?>с-"и^,1л/Ю/63(Н2К2). При этом различия в устойчивости опытной и контрольной групп составляли на разных сроках от 2,3 до 3,7 1с( .Щзд.

Ь то же время было показано, что наблюдаемая невосприим -чивость имеет специфическую природу, так как незначительное различие в устойчивости (на 1,5 1а Щ^) между контрольными и им -

мунизированными животными в отношении вируса гриппа В было выявлено только на первые сутки, когда активно синтезировался интерферон.

Подводя итог исследованиям настоящего раздела работы можно сделать вывод, что КПГ' представляет собой препарат, введение которого обеспечивает формирование иммунитета с широким спект -ром специфической активности.

Обоснование низкой токсичности, им- Б соответствии с целями мунологической безопасности КПГ. и задачаШ1 исслеДования

основное внимание при проведении опытов, результаты которых описаны в этом разделе, было уделено определению ряда параметров, характеризующих иммунологическую безопасность КПГ. Совместно с сотрудниками СпбХФЙ изучали также "острую", "хроническую" токсичность препарата.

При этом выявилось, что при введении мышам и крысам инт-раназально, перорально и парентерально КПГ в дозах (по корау -базидану) от 5 мг/кг до 1г/кг/массы тела животных "острая" токсичность отсутствовала. Эти данные кажутся особенно существенными, если учесть, что максимальная предполагаемая доза на человека составит 6 мг в год, то есть 85,7 мкг/кг или в 10^ раз меньше максимальной дозы, которую вводили животным. Аналогич -ные результаты были получены и при изучении "хронической" токсичности на крысах и собаках.

Изучение иммунологической безопасности КПГ было начато с определения воздействия этого препарата на гуморальную систему иммунитета. Опыты были начаты с определения влияния иммунизации КПГ1 на антителогенеэ в отношении антигенов, не входящих в его состав. При этом статистически значимого влияния КПГ и его компонентов на изучаемый параметр выявлено не было. Отсутствие повреждающего-воздействия КПГ на гуморальную систему иммунитета было подтверждено и изучением количества антителообразующих клеток в селезенке мышей, иммунизированных КПГ. Было обнаружено статистически значимое стимулирующее действие КПГ на количество АОК (в "контрольной группе - 2000 АОК х 10° спленоцитов, в опытной - 8000 АОК х 10° спленоцитов).

Серией экспериментов было показано отсутствие повреждаю -щего воздействия иммунизации КПГ на формирование анафилактического шока и систему комплемента.

Для характеристики воздействия КПГ на систему клеточного иммунитета использовался такой универсальный тест как бластоге-нез лимфоцитов. При этом было проведено определение интенсив -ности образования бластов под влиянием поликлональных митогенов - ФГА и ЛПС, а также изучение бластогенной активности самого препарата КПГ. Б результате опытов был сделан вывод об отсутствии у КПГ свойства депрессивно воздействовать на систему клеточного иммунитета.

Все проведенные исследования позволили сделать основной еывод: КПГ в иммунологическом отношении безопасен и относится к препаратам с низкой токсичностью. Можно было бы сказать, что КПГ вообще не токсичен, но такое понятие в фармакологии отсутствует.

С природе гетерологичной невос- Единого мнения о ведущей hKZSx МИВ0ТНЫХ' - Р™ * гетерологичной не -

восприимчивости тех или иных факторов иммунитета в настоящее время не существует. Ряд исследователей - SmaLL D (I992),Lvcw 7. (1964) отдают главную роль антителам класса Ig А. В то же время, bums 7. (1990), Suiv (1980) приходят к выводу о первостепенном значении в формировании данного типа устойчивости факторов клеточного иммунитета, в частности ЦТЯ.

В наших опытах гетерологичную устойчивость впервые уда -лось перенести сывороточными и секреторными антителами. Крыс иммунизировали КПГ, в состав которого входила вакцина из вируса А/Ленинград/289/63(НЗН2). Второй, равной по численности группе животных ввели интраназально физиологический раствор. Спустя 10 дней всех животных забивали и собирали пулы сывороток и смывов из дыхательных путей. Мышам вводили внутрибрюшинно пули сывороток или интраназально смывы, освобожденные от клеток. Использование животных двух видов позволило исключить влияние на результаты опыта интерферона, который мог находиться в исследуемом материале. Через 3 часа после переноса мышей инфицировали вирусом A/PR/8/34(HIKI). При этом выявилось, что лучше всего оказались защищенными мыши, получившие интраназально иммунный смыв (разница между опытом и контролем - 1,6 Ii и> особен-

но, получившие интраназально иммунный смыв и внутрибрюшинно иммунную сыворотку (разница между опытом и контролем - 1,6 Ig a^q) .

Следовательно, результаты этого исследования подтверждают важное значение в формировании иммунитета широкого спектра антител, в первую очередь, секреторных.

Задача следующей серии опытов состояла в решении вопро -са - образуются ли антитела к консервативным антигенам вируса гриппа типа А. Ь реакции иммуноблоттинга было показано, что начиная с 7 дня в секретах дыхательных путей и сыворотках крови мышей, перорально иммунизированных КПГ с вирусом A/PR/8/34 (HIEI), образуются антитела к М-белку гетерологичного вируса А/Ленинград/289/63(НЗН2).

При проведении.следующего исследования оказалось, что при изучении механизмов гетерологичной невосприимчивости нельзя игнорировать и факторы клеточного иммунитета, в частности цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ). Еыло показано, что величина цитотоксического индекса на I сутки у мышей, перорально имму -низированных КПГ, не отличалась от таковой у мышей, получавших ИГВ или плацебо. Однако, на 7 день она возросла и уже к 14 дню статистически значимо отличалась от контрольных показателей (57,2+3,6 в опытной группе по сравнению с 34,8+1,5 в контроле). По-видимому, на ранних сроках после инфицирования генерация ЦТЛ сулрессируется антителами, которые и обеспечивают на этих сроках гетерологичную устойчивость.

Изучая механизм действия комплексного препарата, мы обратили внимание на систему альвеолярных макрофагов, выполняющих ряд важнейших функций в организме. Оказалось, что максимальное увеличение количества макрофагов, в 2,5 раза большее, чем в контроле, выявляется у животных, перорально иммунизированных КПГ. Иммунизация этим же препаратом сопровождается и максимальной активацией поглотительной функции макрофагов. В этом случае среднее количество частиц латекса, поглощенных одной клеткой, было в 5 раз выше rio сравнению с контролем. Таким образом, можно считать , что одним из основных механизмов иммунопатенцирующей ак -тивности КПГ' является система альвеолярных макрофагов. Очевид -но, в процессе взаимодействия Т- и B-лимфоцитов макрофаги представляют антиген лимфоциту таким образом, что при этом образу -ются антитела к минорному белку вируса гриппа - U-белку, общему для всех вирусов гриппа типа А.

Результаты наших исследований показывают, что гетерологич-ный иммунитет представляет собой комплексный феномен, в реализации которого участвуют, выраженно кооперируя между собой анти -

тела секретов дыхательных путей и сыворотки крови, а также пе-рекрестнореагирующие ЦТл. Важную роль играют антитела к консервативному антигену вирусов гриппа типа А - М-белку.

Таким образом, в ходе проведения настоящего исследования были получены данные, характеризующие иммунологическую актив -ность, защитное действие и иммунологическую безопасность нового препарата для иммунопрофилактики гриппа, который, как можно надеяться, в случае проведения успешных клинико-эпидемиологи -ческих испытаний окажется полезным для усовершенствования профилактики этой инфекции. Данные вошли в отчет, представленный в Фармкомитет РФ для получения разрешения испытания КПГ в специализированной клинике, а в случае получения положительных результатов - и в эпидемиологических наблюдениях.

ВЫВОДЫ

I. При внесении на слизистые оболочки дыхательного и пищеварительного тракта инактивированной гриппозной вакцины совместно с веществами, обладающими активностью индукторов интерферона - стимуляторов иммуногенеза, выраженно повышается интенсивность антителогенеза в системах местного и общего иммунитета и интерфероногенез.

£. В ходе изучения 27 препаратов, относящихся к полисахаридам, липополисахаридам, полирибонуклеотидем и химическим веществам, оптимальным в качестве индуктора интерферона - стимулятора иммуногенеза оказалась основная цепь полисахарида пулу-лана - кораубазидан.

3. При пероральном введении комплексного препарата, состоящего из ИГВ и кораубазидана, для стимуляции антителогенеза в системах местного и общего иммунитета необходимо увеличить дозу обоих компонентов на порядок по сравнению с тем, что не -обходимо при интраназальном введении того же препарата.

4. Интраназальная и пероральная иммунизация КПГ выраженно повышает устойчивость экспериментальных животных к летальной для них гриппозной инфекции по сравнению с тем, что наблюдается при введении гриппозных вакцин без индуктора-стимулятора.

5. К наиболее важным характеристикам защитного эффекта от введения КПГ относятся его быстрое развитие и широта спектра. Устойчивость мышей к вирусам гриппа А различных подтипов формировалась уже в первые сутки после иммунизации и сохраня -лась не менее 3 недель. Некоторое повышение устойчивости к ви-

русу гриппа В документировано только на первые сутки после иммунизации и могло быть объяснено высокой концентрацией интер -серока в ткани легких в этот период.

0. Получено доказательство роли антител к !.'1-белку к ЦТл в формировании гетерологичнсй устойчивости.

7. Получено доказательство низкой токсичности КПГ и отсутствие повреждающего воздействия введения этого препарата на иммунную систему.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБлИКОЗАННЫХ ПО т»ш ДИССЕРТАЦИИ

1. Исполатова л.В., Корнеева Э.П., Лебедева H.A. (Марке-бич H.A.), Иванников Ц.Г., Шварцман п.С. "Участие антител в формировании противогриппозного гетеротипического иммунитета к вирусу А." - деп. во ВИНИТИ 23.02.1967.

£. кпилюк Г.&. „ Шапиро К.И., Полянская H.L., Гускин Я.Р., Сухинин b.ii., Овдейчук P.A., Ыварцман л.С., леоедева H.A. (laap-кевич H.A.)."Изучение реакции повышенной чувствительности за -медленного типа при вакцинации мышей ИГВ". - Rev. Rcurn Wed.YireL.-I9E7. -3£, :2. -Р. 127-133.

3. Исполатова A.b., Шварцман fi.C., Ыаркевич H.A. " Комплексный препарат .с широким спектром противовирусной активности". - ыезд. симпозиум "Интерферон-90". -Л., 1990.

4. Маркевич H.A., Осипова М.В., лесиовская Е.Е., Масленникова И.П., Покровская л.1., Полынская И.В., Богданова И. л., Вавилова В.А., Пастушенков J..B. , Исполатова A.B., Шварцман Я.С. " Обоснование безопасности кошлексного препарата для профилактики гриппа - КПГ". - Иммунология и патогенез гриппа и гриппо -подобных заболеваний. -IS9I. -С.46-49.

5. ¡.¡аркевич H.A., Масленникова И.И. , Покровская B.Z., Осипова М.В. , Исполатова A.B. " Изучение механизмов формирования гетеротипической устойчивости при пероральной иммунизации комплексным противогриппозны!.! препаратом". - Актуальные проблемы инфекционной патологии. -Часть ¿. Иммунология и биотехнология.-Сп:., 1993. -С.120.

с. Исполатова A.d., ¿¡аркевич H.a. "Разработка и внедрение б практик; нового препарата для профилактики гриппа". -Симпозиум "Новые подходы к целенаправленному конструированию противо -вирусных препаратов". -Сп^., 19^4.-С.31.

МГПП "Курс". 3ак.243ст. - 94 г.