Патоморфологические, молекулярно-клеточные основы патогенеза гриппа A/H5N1 у млекопитающих и особенности его развития при профилактике модифицированным декстраном

Потапова, Оксана Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Патоморфологические, молекулярно-клеточные основы патогенеза гриппа A/H5N1 у млекопитающих и особенности его развития при профилактике модифицированным декстраном
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Патоморфологические, молекулярно-клеточные основы патогенеза гриппа A/H5N1 у млекопитающих и особенности его развития при профилактике модифицированным декстраном"

На правах рукописи

ПОТАПОВА ОКСАНА ВАЛЕНТИНОВНА

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ, МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ ОСНОВЫ ПАТОГЕНЕЗА ГРИППА А/Н51Ч1 У МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ОСОБЕННОСТИ ЕГО РАЗВИТИЯ ПРИ ПРОФИЛАКТИКЕ МОДИФИЦИРОВАННЫМ ДЕКСТРАНОМ

03.03.04 - клеточная биология, гистология, цитология 14.03.02 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Шкуруппй Вячеслав Алексеевич

Официальные оппоненты:

руководитель лаборатории иммунологии репродукции

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрав России)

Защита состоится «18 » декабря 2012 г. в 10.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.048. 01. при ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2, тел./факс (383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН

ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН доктор медицинских наук, профессор

Трунов Александр Николаевич

профессор кафедры патологической анатомии ГБОУ ВПО «НГМУ» Минздрав России доктор медицинских наук, профессор

Агеева Татьяна Августовиа

руководитель группы молекулярно-генетических н морфологических методов исследования ФГБУ «НИИТО» Минздрав России доктор медицинских наук, профессор

Ларионов Петр Михайлович

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Пальчикова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Грипп занимает особое место в инфекционной патологии человека, не имея себе равных по распространенности и частоте заболеваний Особый интерес представляет возбудитель гриппа A/H5N1, характерными особенностями которого является широкая географическая распространенность, высокая патогенностъ для человека, приводящая к тяжелому заболеванию с высокой смертностью при отсутствии специфического иммунитета в человеческой популяции (То K.F. et al., 2001; Peí F. et al., 2005; Suzuki Y., 2005). По данным ВОЗ на 10 августа 2012 года заболеваемость человека гриппом A/H5N1 зарегистрирована в 58 странах мира, а общее количество вирусологически подтверждённых случаев заболевания людей, вызванного штаммами гриппа A/H5NI, составило 608, из которых 359 (60%) закончились летальным исходом При этом среди детей до 15 лет летальность при гриппе A/H5N1 достигает 89% (www.who.int/ш/, 2012).

По оценке ВОЗ в связи с высокой изменчивостью вирусов гриппа A/H5N1 и его способностью к прямой передаче от птиц к человеку существует постоянная угроза возникновения пандемии (www.who.int/ni/, 2012).

Несмотря на многочисленные исследования, проведенные за последние 10 лет, механизмы высокой вирулентности новых рекомбинантных высокопатогенных штаммов вируса гриппа A/H5NI остаются малоизученными. Имеющиеся в современной литературе данные не дают полноценного представления о механизмах развития заболевания и его осложнений, что диктует необходимость дальнейшего изучения патогенетических аспектов, особенно для новых, ранее неисследованных штаммов, в частности, выделенных на территории Российской Федерации.

Комплексное исследование на молекулярно-клеточном уровне структурно-функциональных особенностей клеток органов-мишеней у млекопитающих при гриппе A/H5N1 является необходимым условием для понимания основных механизмов развития вирусной инфекции и важнейших ее пато-морфологнческих проявлений, обусловливающих высокую летальность у людей и животных. Это позволит улучшить проспективное прогнозирование исходов инфекционного заболевания, обусловленного вирусами гриппа А, и одновременно разработать принципиально новые патогенетически обоснованные подходы к профилактике и лечению гриппа A/H5N1 у людей, направленные на снижение риска заболеваемости, уменьшение частоты и тяжести его осложнений.

Высокая антигенная вариабельность, свойственная вирусам гриппа А, отсутствие специфических вакцин, нерациональная фармакотерапия приводят к появлению новых штаммов, резистентных к основным противовирусным препаратам (Cheung С L. et al.. 2006; Menno N. el al., 2006). Все это определяет особую значимость разработок по созданию новых эффективных средств неспецифической профилактики гриппа А, не оказывающих прямого действия на вирус, что исключало бы возможность возникновения лекарственной резистентности.

Такими препаратами являются иммуномодуляторы микробного происхождения, в частности, модифицированные полисахариды (окисленные декстраны), которые способны повышать функциональную активность клеток моноцитарно-макрофагальной системы (Шкурупий В А , 2007). Однако исследований, направленных на изучение эффективности таких препаратов при вирусных инфекциях и, в частности, при гриппе A/H5N1 у млекопитающих и человека не проводили.

На основании вышеизложенного были сформулированы цель и задачи исследования.

Цель исследования: изучить патоморфогенез гриппа A/H5N1 A/goose/Kiasnoozerskoye/627/05 у мышей и его молекулярно-клеточные проявления при профилактике модифицированным декстра-ном.

Задачи исследования:

1. Исследовать патогенностъ вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 для млекопитающих на мышиной модели.

2. Исследовать топологию вируса в клетках легких, печени, почек, селезенки, головного мозга мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5М1 А/^05е/Кга5поогегекоуе/627Д)5, на разных сроках заболевания методом иммуногистохимии.

3. Исследовать морфофункциональные изменения в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа АУН5Ы1 А^оозе/Кгаотоо2ег5коуе/627/05, и особенности морфогенеза вирусной инфекции.

4. Исследовать роль про- и противовоспалительных цитокинов в патогенезе гриппа А/Н5Ы1 по цнтокиновому профилю инфицированных мышей в сыворотке крови и в клетках органов в динамике развития вирусной инфекции.

5. Исследовать молекулярно-клеточные пути реализации клеточной гибели в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5>11 А^оозе/к1а5поо2егекоуе/б27/05.

6. Изучить динамику фибротических проявлений в органах инфицированных мышей и молекулярно-клеточные механизмы их регуляции при гриппе А/Н51Ч1.

7. Сформулировать патогенетическое обоснование профилактики гриппа А/Н5М модифицированным декстраном (диальдегиддекстраном) на основе полученных данных о патогенезе вирусной инфекции, изучить его профилактическую эффективность для мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1 А^оо5е/к.га5поогег5коуе/627/05

8. Исследовать особенности иммунологических реакций у мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5И1 А/§оо8е/Кгазпоогегзкоуе/627/05, при профилактике диальдегиддекстраном.

9. Изучить структурно-функциональные проявления гриппа А/Н5>П в органах инфицированных животных после профилактического введения им диальдегиддекстрана.

Научнаи новизна. В ходе эксперимента впервые методом иммуногистохимии выявлены особенности топологии вируса гриппа А/Н5Ы1 А/£ОО5е/Кга5поогегекоуе/627/05 в динамике развития вирусной инфекции. Показана пролонгированная персистенция вируса гриппа А/Н5Ж в альвеолоцитах, макрофагах, фибробластах, эндотелиоцитах легких; гепатоцитах, клетках Купфера, синусоидальных эндотелиоцитах печени; мезангиальных и эндотелиальных клетках почек; лимфоцитах, макрофагах синусов и эндотелиоцитах селезенки; нейронах, глиальных и эндотелиальных клетках головного мозга.

Высокая тропность вируса гриппа А к эндотелиоцитам сосудов легких и экстрапульмонарных органов способствует ранней диссеминации вируса и генерализации инфекционного процесса, а также детерминирует структурные изменения микроциркуляторного русла с деструкцией эндотелиаль-ной выстилки сосудов, повышением их проницаемости, тромботическими и геморрагическими осложнениями, создающие условия для острой гипоксии - фактора риска развития в органах ишемии, ведущей к распространенным деструктивным изменениям и полиорганным нарушениям.

Показано, что успешная пролонгированная репликация вируса гриппа А/Н5Ы1 А^оо5е/К.га5поогег5коуе/627/05 в клетках органов инфицированных мышей, отчасти, обусловлена блокадой интерферонового противовирусного ответа, проявляющейся в снижении уровня эндогенных интерферонов - ИТЧ-а, что в дальнейшем усугубляется масштабным апоптозом лимфоид-ных клеток селезенки и тимуса и угнетением лимфоидного ростка костного мозга.

Персистенция вируса гриппа А/Н51>Л А^оазе/Кга5поогегзкоуе/б27/05 в клетках различного гистогенеза сопряжена с существенной активацией клеточного звена иммунитета, проявляющейся в увеличении экспрессии провоспалительных цитокинов (ТИР-а и 1Ь-б), лизосомальных протеаз (лизо-цима, катепсина Д, миелопероксидазы), ЫО-синтаз (еЫОБ и ¡N05), ростовых факторов и их рецепторов (РОИ, РвРЯ, УЕОИЯ) в клетках легких, печени, головного мозга, селезенки. Это является пусковым фактором процессов деструкции, пролиферации, ангиогенеза и раннего фиброзирования в органах инфицированных животных. Высокий уровень пролиферации в рассматриваемых экспериментальных условиях носит двойственный характер: с одной стороны, способствует восстановлению утраченных структур, с другой - увеличивает концентрацию новых клеток, необходимых для про-

никновения, репликации и персистенции вируса гриппа А, способствуя тем самым прогрессировали) инфекции.

Показано, что масштабы некроза и апоптоза и их соотношение, а также пути реализации этих процессов в различных органах при гриппе A/H5NI зависят от длительности развития инфекции и органно-тканевой принадлежности, в печени, почках и головном мозге инфицированных мышей гибель клеток происходит в большей степени путем некроза, в легких и селезенке в структуре деструктивных изменений преобладает гибель клеток апоптозом. Основными механизмами апоптоза при гриппе A/H5N1 являются: митохондриальиый, реализуемый на ранних сроках инфекционного процесса и связанный преимущественно с цитопатическим действием вирусов; рецепторно-опосредованный, обусловленный гиперсекрецией провоспалительных цитокинов, в частности TNF-a, и активацией каспазы-3 через TRAIL - домены.

Персистенция вируса гриппа A/H5NI в фибробластах органов инфицированных мышей является триггерным фактором инициации фиброзирования. Прогрессирующее развитие фиброза в органах мышей при гриппе AVH5N1 детерминировано многими факторами: пролонгированной персистенцией вируса в клетках органов, включая макрофаги и фибробласты, блохадой интерферонового ответа, ишемией, инфильтративными изменениями с повышением гидролитического потенциала и избыточной продукцией свободных радикалов в локусах воспаления, гиперцитокинемией. «Дисбаланс» этих процессов в динамике развития вирусной инфекции, видимо, одна из причин раннего фиброза.

Предложено средство (диальдегиддекстран) и патогенетически обосновано его применение для профилактики вирусной инфекции, индуцированной вирусом гриппа A/H5NI. Показана его высокая профилактическая зффективность при экспериментальном инфицировании мышей вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozersk.oye/627/05, которая проявляется увеличением средней продолжительности жизни животных на 24,8%, уменьшением легальности в 3,2 раза, уменьшением числа инфицированных клеток различного гистогенеза в органах мышей, прежде всего, макрофагов и фибробла-стов, уменьшением масштабов повреждения паренхиматозных органов, выраженным шггифиброти-ческим эффектом.

Механизмы профилактического действия диальдегиддекстрана при гриппе A/H5N1 у мышей опосредованы повышением мощности механизмов естественной резистентности макрооргапизма, прежде всего, клеток системы мононуклеарных фагоцитов, проявляющимся повышением уровня IFN-a, lFN-у за счет усиления интерферон-продуцирующей функции эффекторных клеток, нормализацией дифференцировочного потенциала и баланса между различными ростками костномозгового кроветворения, уменьшением масштабов апоптоза лимфоцитов в органах иммуногенеза, снижением внутриклеточного синтеза провоспааительных цитокинов - TNF-a, IL-6, лизосомальных прогеаз (ли-зоцима, катепсина Д, миелопероксидазы), NO-синтаз, что существенно снижает масштабы гемодина-мических, деструктивных, фибротических осложнений.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные существенно дополняют известные сведения о морфопатогенезе гриппа A /H5N1, в том числе вызываемого новым штаммом, дополняют сведения о механизмах развития осложнений вирусной инфекции, свидетельствуют о необходимости поиска новых средств и способов ранней профилактики и лечения гриппа.

Результаты исследования молекулярно-клеточных и патоморфологических особенностей морфогенеза вирусной инфекции, вызываемой новыми штаммами вируса гриппа A/H5N1, могут бьггь использованы в процессе преподавания патологической физиологии, патологической анатомии, клеточной биологии, курса «инфекционные болезни», послужить основой для разработки средств и способов патогенетически обоснованной профилактики и терапии гриппа А.

Полученные данные о высокой эффективности предложенного средства (диальдегиддекстрана) при профилактики гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 у мышей могут служить основой для доклинических испытаний данной субстанции как средства профилактики гриппа А и ею осложнений у человека

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013гг.», государственный контракт №02.740.11.0709.

Внедрение результатов. Результаты исследования внедрены в учебный процесс в ГЪОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России: на кафедре патологической анатомии лечебного факультета по темам: «Компенсаторно-приспособительные процессы», «Клеточная смерть. Некроз. Апоптоз», «Инфекционные болезни. ОРВИ»; на кафедре патологической физиологии и клинической патофизиологии по теме «Воспаление».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Высокая патогенность вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 связана с его пролонгированной персистенцией в клетках альвеолярного эпителия, гепатоцитах, нейронах, резидентных макрофагах, фибробластах, эндотелиоцитах сосудов и во внеклеточных пространствах, что обусловлено блокадой иктерферонового ответа и детерминирует каскад патологических реакций в морфогенезе гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 с развитием вазопатического, отечно-деструктивного, гиперпластического и фибропластического синдромов, вследствие которых формируется капиллярно-паренхиматозный блок с развитием острой гипоксии, что определяет масштабные процессы деструкции, реализуемые путем некроза и апоптоза, и инициирует пролиферацию и ускоренную дифференцировку коллагенпродуцирующих клеток с ранним постгипоксическим фиброзиро-ванием органов.

2. Персистенция вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в клетках различного гистогенеза сопряжена с активацией клеточного звена иммунитета, проявляющейся в увеличении экспрессии провоспалительных цитокинов (TNF-a и IL-6), лизосомальных протеаз (лизоцима, ка-тепсина Д, миелопероксидазы), NO-синтаз (eNOS и iNOS), матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов, ростовых факторов и их рецепторов (FGF, FGFR, VEGFR) в клетках легких, печени, головного мозга, селезенки, что приводит к вторичной альтерации тканей, расширяя масштабы повреждения органов, и ускоряет процессы пролиферации клеток, приводя к неполноценной репарации тканей с развитием фиброза.

3. Диальдегиддекстран оказывают выраженный профилактический дозозависимый эффект при экспериментальном инфицировании мышей вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, который проявляется увеличением средней продолжительности жизни животных и снижением летальности, уменьшением инфицирующей способности вирусов, снижением масштабов деструктивных и фибротических процессов, что, видимо, обусловлено его иммуномодулирующими свойствами, опосредованными через активацию системы мононуклеарных фагоцитов, способствующими стимуляции интерфероногенеза, снижению синтеза провоспалительных цитокинов, лизосомальных протеаз, NO-синтаз, что существенно снижает масштабы осложнений - гемодинамических, деструктивных, фибротических.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России за 2007-2012г.г.» (Москва, 2007); The Third European Influenza Conference (Vilamoura, Portugal, 2008); Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России за 2007-2012г.г.» (Москва, 2008); III Съезде Российского общества патологоанатомов (Самара, 2009); IV Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009); V Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2011); XL1X Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Студент и научно-

технический прогресс» (Новосибирск, 2011); IV Международной Научно-практической конференции молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины" (Москва, 2012).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, из которых 11 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации материалов диссертационных исследований; 1 Евразийский патент на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 389 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы, приложение. Диссертация иллюстрирована 62 таблицами и 80 рисунками, в том числе микрофотографиями. Список литературы включает 451 источник, из которых 350 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве инфекционного агента был выбран вирус гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, выделенный из легкого гуся, погибшего во время вспышки гриппа птиц в селе Красноэерское Новосибирской области в сентябре 2005 года. Экспериментальные работы с данным штаммом вируса гриппа A/H5N1 были проведены на базе лаборатории отдела зооноэных инфекций и гриппа ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск) в соответствии с санитарными правилами безопасности работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами (СП 1.2.731 от 25.01.05).

Для проведения экспериментов использовали беспородных белых мышей-самцов 6-8 - недельного возраста (питомник лабораторных животных ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора). Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к пище и воде. Продолжительность периода адаптации животных к условиям содержания перед проведением эксперимента составила две недели. Исследование проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755), с соблюдением международных принципов Хельсинской декларации. Из эксперимента мышей выводили под эфирным наркозом путем дислокации позвонков в шейном отделе.

Исследование выполнено в трех экспериментах на 360 мышах.

В первом эксперименте исследовали морфогенез гриппа A/H5N1 у мышей. Для этого было сформировано две группы экспериментальных животных. Мышам контрольной группы, состоявшей из 40 животных, вводили 50 мкл стерильного фосфатного буфера рН=7,2 по 25 мкл в каждый носовой ход. Вторая группа состояла из 60 мышей, которых интранаэально инфицировали вирусом гриппа (ВГ) A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в дозе 10 МЛД» в 50 мкл фосфатного буфера рН=7,2 по 25 мкл в каждый носовой ход. По 20 животных в каждой группе оставляли для определения средней продолжительности жизни и процента летальности.

Второй эксперимент был направлен на разработку схемы профилактики гриппа A/H5N1 у млекопитающих с применением окисленной формы декстрана с молекулярной массой бОкДа (диальде-гидцекстран, далее ДАД), созданной путем химической активации декстрана в 2% водном растворе калия марганцевокислого в лаборатории биосовмесгимых наночастиц и наноматериа-лов ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН.

Выбор данной субстанции обусловлен тем, что при гриппе A/H5N1 происходит угнетение неспецифического противовирусного интерферонового ответа с истощением лимфоидной ткани в центральных и периферических органах иммуногенеза (Pei F. et al., 2005). Помимо этого наблюдали успешную репликацию вирусов в макрофагах с задержкой их апоптоза (Peiris М., 2006). Модифицированные (окисленные) формы полисахаридов, в частности, ДАД, обладающие иммуномодулирую-

щими свойствами, воздействуют на факторы естественной резистентности - клетки моноцитарно-макрофагальной системы, вызывая повышение их функциональной активности (Шкурупий В.А., 2007). Способ и оптимальную профилактическую дозу определяли экспериментальным путем с учетом разрешенных доз полисахаридов для применения в медицинской практике у человека (Машков-ский А.Д., 1999). Эффективность оценивали по показателям летальности и средней продолжительности жизни мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5М1. Учитывая генерализованный характер вирусной инфекции, был выбран внутривенный способ введения ДАД.

Для проведения второго эксперимента было сформировано б групп по 20 животных. Первая группа - интактные - служила контролем. Мышей из остальных пяти групп инфицировали вирусом гриппа А/Н5Ш А^оозе/К1а8поо2ег5коуе/627/05. Мышам 2, 3, 4 и 5 групп предварительно за 3 и 1 сутки до инфицирования вводили ДАД в дозах 125мг/кг, 250мг/кг, 500мг/кг и 1000мг/кг, соответственно. Поскольку период после введения декстранов характеризуется фазностью ответа иммунной системы (Шкурупий В.А., 2007) двукратное профилактическое введение препарата было оптимальным для достижения максимальной стимуляции иммунной системы на момент заражения (через сутки после второй инъекции). Инфицированным животным б группы внутривенно вводили 0,2 мл 0,85% водного раствора хлорида натрия.

В третьем эксперименте исследовали патоморфологические особенности развития вирусной инфекции у мышей после профилактического введения диальдегиддекстрана. Для проведения эксперимента было сформировано 3 опытные группы животных.

Первая группа - контрольная - интактные животные (20 мышей).

Вторая группа (Н5Ы1) состояла из 60 мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5№ А^оо5е/Кгазпоогегекоуе/627/05 без предварительного введения ДАД.

Третья группа (Н5Ш+ДАД) состояла из 60 мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5И1 А^оо5е/Кга5поогег8коуе/627/05 после профилактического внутривенного введения ДАД в дозе 1000 мг/кг. Доза инфицирования и сроки получения экспериментального материала для исследования были аналогичными таковым в 1 эксперименте.

В каждом эксперименте определяли летальность в процентах и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) инфицированных животных в течение 14 суток. Для определения СПЖ находили среднее арифметическое от продолжительностей жизни в сутках всех экспериментальных мышей, причем продолжительность жизни выживших считали равной 14 суткам. Летальность выражали как частоту смертей (%) особей от общего числа мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1.

Исследование выполнено с использованием оборудования центра коллективного пользования ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН «Современные оптические системы».

Для исследования цитокинового профиля у инфицированных мышей в динамике заболевания определяли уровни цитокинов в сыворотке крови: ТКР-а, эндогенных интерферонов П-Ы-а, №N-7 с применением метода иммуноферментного анализа (ИФА) по следующей методике. Образцы сыворотки в объеме 200 мкл инкубировали 1 час при +37°С при непрерывном встряхивании с последующим промыванием буфером и дистиллированной водой. Инкубировали с вторичными антителами 1 час при +37°С. Индикаторным компонентом являлся конъюгат пероксидазы со стрептавидином, при этом измеряли активность связанной пероксидазы с использованием автоматического фотометра для микропланшетов.

Во всех экспериментах для светооптического исследования образцы тканей органов (легких, печени, почек, головного мозга, селезенки, тимуса) животных, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1, получали через 1, 3, 6 и 10 сутки после инфицирования от 10 животных на каждом сроке эксперимента. Животных контрольной группы выводили из эксперимента на 1 и 10 сутки.

Образцы тканей для светооптического исследования фиксировали в 10% растворе формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в парафиновую заливочную смесь «Н18ТАМ1Х» (Россия). Срезы толщиной 4-5 мкм готовили на ротационном микротоме

HM355S ("Microm", Германия). Or каждого объекта изготавливали по 5-8 микроскопических срезов. Для изучения использовали следующие гистохимимческие окраски: на фибрин по Вейгерту, пиро-крофуксином по ван Гизон (Пирс Э., 1962). После окрашивания препараты помещали в заключающую среду BioMaunt («BioVitrum», Россия).

Для исследования топологии вируса гриппа A/H5N1 в динамике заболевания использовали им-муногистохимический (ИГХ) метод, который основан на связывании антитела Inf А («Abcam») с антигеном вируса гриппа А на поверхности или внутри микроорганизмов. В качестве контроля использовали нативную ткань, которую предварительно депарафинизировали стандартным методом.

Проводили ИГХ-исследование с использованием непрямого стрептавидин-пероксидазного метода с применением специфических первичных антител (табл. I).

Таблица 1

Список первичных антител на исследуемые маркеры

Название антитела (производитель) Характеристика Разведение

Calhepsin D (DBS) Myeloperoxidase (DBS) Lysozyme (DBS) Оценка лизосомального синтеза клетками органов-мишеней 1:100 1:100 1:50

iNOS (Spring Bioscience) eNOS (Abcam) Оценка экспрессии клетками исследуемых органов различных иэоформ Х0-синтаз, которые посредством радикалов N0 блокируют электрон-транспортные группы вируса 1:100 1:130

TNF - a (DBS) IL- 6 (Novocastra) Оценка численной плотности клеток, экспрессирующих провосполителькые цитокины 1:100 1:50

CD -la (Spring Bioscience) CD - 4 (Spring Bioscience) CD - 8 (Abeam) CD - 68 (DBS) Fibroblast (DBS) Маркеры фенотипирования деццритных клеток, лимфоцитов, макрофагов и многоядерных клеток, фиб-робластов для исследования клеточного состава инфильтратов в строме органов-мишеней 1:80 1:50 1:25 1:100 1:25

PCNA (Novocastra) Оценка пролиферативной и репаративной активности компетентных клеток 1:200

Caspase - 3 (Abcam) Caspase - 9 (Abcam) TRAIL (Novocastra) Granzim В (Spring Bioscience) Оценка путей реализации клеточной гибели компетентных клеток 1:100 1:100 1:100 1:100

CD-31 (BioCare Medicine) CD-34 (Spring Bioscience) Эндотелнальный клеточный маркер, маркер стволовых клеток, адгезии и новообразованных сосудов 1:200 1:100

Inf A (Abcam) Оценка репликации вируса гриппа А в клетках 1:120

VEGFR (Spring Bioscience) FGF-b (Abcam) FGFR-1 (Spring Bioscience) Маркер рецептора фактора роста сосудов Маркеры фактора роста фибробластов и его рецептора 1:100 1:500 1:50

MMP-2(Spring Bioscience) MMP-9 (Spring Bioscience) MMP-10 (Spring Bioscience) TIMP-2 (Spring Bioscience) Определение эхспрессии матриксных металлопротсиназ Определение экспрессии тканевого ингибитора мат-риксной металлопротеиназы-2 1:100 1:50 1:50 1:100

Для проведения ИГХ - исследования срезы легких толщиной в 3 мкм подвергали депарафини-зации, регидратации, демаскировке антигенов в микроволновой печи мощностью 700W, в течение 2025 минут. Затем, после однократного промывания в дистиллированной воде и фосфатном буфере, производили блокирование эндогенной пероксидазы в течение 5 минут. Время экспозиции с первичными антителами составляло 30-45 минут при температуре 37°С. Срезы инкубировали со стрептави-дин-пероксидазным комплексом, DAB-субстратом и дополнительно докрашивали гематоксилином Майера. Для визуализации была применена система детекции NovoLink (Novocastra).

Анализ гистологических препаратов проводили на микроскопе Axiolmager AI с фотокамерой AxioCam MRc5 («Carl Zeiss», Германия). Морфометрию структурных элементов тканей осущестнля-

ли с помощью закрытой тестовой системы из 100 точек площадью 3,64х105 мкм2 (при определении численной и/или объемной плотностей структур) (Автандилов Г Г., 1990) и инструментов программы AxioVision (reí. 4.8).

При оценке характера и степени выраженности структурных изменений в органах учитывали численную плотность (Nai) клеток, экспрессирующих исследуемые маркеры (табл.1), объемную плотность (Vv) и клеточный состав инфильтратов, объемную (Vv) и численную (Nai) плотность сосудов, долю тромбированных сосудов (%), объемную плотность (Vv) кровоизлияний, объемную плотность (Vv) волокнистой соединительной ткани. Расчет «фибропластической активности» проводили по соотношению объемной плотности коллагеновых волокон, приходящихся на один фибробласт (Шкурупий В. А., 2007) в закрытой тестовой системе.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета статистического анализа Microsoft Office Excel 2007 и стандартного пакета программ STATISTICA v.6. Определяли средние арифметические величины (М), стандартную ошибку средней величины (гп). Для выявления вероятности достоверности различий сравниваемых средних величин применяли t-критерий Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при 5% уровне значимости (р<0,05). Корреляционный анализ применялся для нахождения связей (зависимостей) между нормально распределенными количественными признаками. Силу предполагаемой взаимосвязи между величинами определяли по значению коэффициента корреляции Пирсона (Петри А., Сэбин К., 2003). На рисунках данные представлены как М±ш.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Исследование патогенности для мышей (по показателю легальности и средней продолжительности жизни) штамма вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

При инфицировании мышей вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в дозе ЮМЛД50 наблюдали гибель животных начиная с 7 суток после инфицирования. По окончанию срока наблюдения - 14 суток - летальность инфицированных животных составила 75% при показателе средней продолжительности жизни животных — 9,4 суток. Гибели интактных мышей не наблюдали. Полученные данные указывают на высокую патогенность исследуемого штамма ВГ A/H5N1 для мышей, показанную в ранее проведенных исследованиях (Шестопапов A.M. и др., 2008).

Патогенность ВГ определяется уникальными свойствами вирусов, обусловливающими нейро-тропность, эффективность репликации, как в легких, так и в других органах. В связи с этим были изучены особенности топологии ВГ A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в органах инфицированных мышей в динамике инфекционного процесса.

3.2 Исследование топологии вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в органах мышей в динамике инфекционного процесса

При исследовании образцов органов с помощью ИГХ-аналиэа с использованием Inf А -антитела к антигену вируса гриппа А - уже через сутки после инфицирования выявляли белок ВГА в клетках всех исследуемых органов. Динамика изменений численной плотности Inf А+ клеток органов представлена на рисунке 1.

Поскольку адгезия вирусов гриппа А и их проникновение в клетки макроорганизма связаны с наличием на их поверхности определенного типа рецепторов сиаловых кислот (Russell RJ. et al., 2008), первичными клетками-мишенями для ВГ A/H5N1 являются альвеолоциты, располагающие этими рецепторами, о чем свидетельствовали величины показателя численной плотности Inf А+ альвеолоцитов (рис. 1).

Следует отметить, что во все сроки наблюдения из всех типов инфицированных клеток органов наибольшая частота репликации ВГ A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 была зарегистрирована

в эндотелиоцнтах сосудов (рис.1). Наличие вирусного антигена в эндотелии сосудов всех органов доказывает его выраженную эндотелиотропность. что может обусловливать успешную диссеминацию вируса гриппа А/Н5Ы1 А^оозе/К.газпоо2ег5коуе/627/05 и раннюю генерализацию процесса с эффективной репликацией вирусов в высокоспецнализированных клетках органов с поражением всех систем макроорганизма.

Легкие

Печень

Вторыми по частоте инфицирования были клетки системы мононуклеарных фагоцитов.

Увеличение количества Inf А+ эндотелиоцитов сосудов в органах с 1 по 3 сутки эксперимента свидетельствует об успешной репликации вируса гриппа A/H5NI в эндотелии и высвобождении их в кровяное русло с развитием виремии и ранней генерализацией процесса. На это указывало увеличение численной плотности Inf А+ специализированных клеток органов с I по 3 сутки эксперимента. Количество инфицированных макрофагов также было максимальным на 3 сутки эксперимента.

В период с 3 по 10 сутки эксперимента наблюдали уменьшение численной плотности содержащих вирусный антиген клеток всех типов в 2 и более раза (рис.1), что свидетельствует о частичной элиминации вируса, возможно, за счет гибели клеток, в том числе путем апоптоза, при репликации вируса гриппа А. При этом наименьшую скорость снижения величины данного показателя отмечали для эндотелиальных клеток, что, по-видимому, связано с активацией ангиогенеза. Снижение показателя численной плотности Inf А+ макрофагов может быть относительным за счет формирования многоядерных клеток путем слияния макрофагов, а так же за счет клеточной гибели макрофагов в процессе репликации в них вируса гриппа A/HSNI.

1 з в ю

Сроки после инфицирования, сутки

□ Апьвеолоциты □ Эндотелиоциты Ш Макрофаги а Фибробласты

Головной мозг

Сроки после инфицирования, сутхи

В Нейроны Q Эндотелиоциты

И Глиоциты

Рнс. 1. Численная плотность laf А+ ¡слеток A/goose/Kiasnoozerskoye/627/05

1 з 6 ю

Сроки после инфицирования, сутки

В Гепатоциты □ Эндотелиоциты

И Макрофаги

Селезенка

Сроки после инфицирования, сутки

В Лимфоциты Е? Эндотелиоциты а Макрофаги

органах мышей, инфицированных ВГ АУН5М

Таким образом, исследование образцов легких, печени, селезенки мышей, экспериментально зараженных вирусом гриппа A'H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, выявило наличие большого количества вируса в тканевых структурах органов на всех сроках эксперимента и способность использованного штамма эффективно реплицироваться не только в легких, но и в других органах мышей. Достаточно значимая концентрация Inf А+ клеток в головном мозге мышей свидетельствует о его высокой нейротропности и способности преодолевать гемато-энцефалический барьер, что может быть одной из причин высокой патогенное™ данного штамма вируса гриппа A/H5N1. Персистенция вируса, хотя и в существенно меньшем количестве клеток, сохранялась на 10 сутки эксперимента, когда клинически наблюдали начальные признаки выздоровления.

Для исследования возможных механизмов развития инфекционного процесса было проведено изучение образцов органов экспериментально зараженных мышей на тканевом, молекулярно-клеточном и субклеточном уровнях.

3.3 Патоморфологичсскне особенности развития инфекционного процесса в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5М А/£ео5е/Кга5поогеп*коуе/627/05

При гистологическом исследовании образцов легких мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1 регистрировали признаки острого респираторного повреждения легких: паретическое расширение сосудов с тромбозом микроциркуляторного русла, множественные кровоизлияния, интер-стициальный и альвеолярный отек легких, многочисленные воспалительные инфильтраты в интер-стиции, участки некроза с формированием очагов острой эмфиземы, прогрессирующий перибронхи-альный, периваскулярный и интерстициальный фиброз.

При морфометрическом анализе полученных образцов легких инфицированных мышей с 1 по 3 сутки выявлено увеличение численной и объемной плотностей сосудов на 16,4% и 23,4% соответственно, что было связано с прогрессированием фибриноидных изменений в стенке сосудов и, одновременно, активацией процессов неоангиогенеза (более 30% сосудов было представлено новообразованными С034+сосудами). Об активации ангиогенеза свидетельствовало и увеличение с 1 по 10 сутки в 2,5 раза количества эндотелиальных клеток, на мембране которых регистрировали . экспрессию УЕСРЯ (рис.2). Однако, по-видимому, их доля была недостаточной для эффективного восстановления трофики органов (об этом свидетельствовали масштабные деструктивные процессы в органах макроорганизма).

iE 50 с 40

Контроль 1 3 6 10

Сроки после инфицирования, суши

Сосуды

-VEGFR+ эндотвпиоциты

Контроль 1 3 в 10

Сроки поелг инфицирования, сутки ««"Инфильтраты ---»---Кровоизлияния — Фиброзная ткань

Рис. 2. Патоморфологнчсскпе A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

изменения в легких мышей, ннфпцпровапных ВГ A/H5N1

Численная доля тромбированных сосудов составила на 3 сутки после инфицирования 21,8% от общей численной плотности сосудов в легочной ткани и была в 2 раза выше по сравнению с величиной аналогичного параметра в I сутки после заражения. В период с 3 по 10 сутки развития инфекционного процесса уменьшение величины данного показателя составило 27%. Объемная плотность кровоизлияний в интерстиции легкого к 10 суткам была в 4 раза большей, чем ка первые сутки

(рис.2), в результате фибрииоидного некроза стенки сосудов, приводящего к повышению их проницаемости. Объемная плотность инфильтратов в интерстиции легких была высокой уже на первые сутки после инфицирования с последующим увеличением величины данного параметра к 10 суткам на 48% (рис.2).

При ИГХ-исследовании клеточного состава инфильтратов с 1 по 6 сутки после инфицирования отмечали преобладание (выше 70%) СБбв+клеток — макрофагов. Также наблюдали СОб8+многоядерные клетки, численная плотность которых увеличилась с 1 по 6 сутки в 1,6 раза с последующим уменьшением к 10 суткам. Поскольку многоядерные клетки экспрессировали молекулярный маркер С068, характерный для клеток макрофагального ряда, можно предположить, что происходит задержка апоптоза инфицированных клеток либо их слияние.

Клетки, составляющие от 15% до 18% от общего числа клеток инфильтратов у инфицированных мышей, были представлены преимущественно С08+-лимфоцитами (супрессо-ры/цитотоксические лимфоциты), в то время как у животных контрольной группы единичные лимфоциты, встречающиеся в альвеолярных перегородках, имели положительное окрашивание с С04+ (хелперы). Таким образом, в составе инфильтратов в легких инфицированных мышей преобладали клетки, обладающие цитотоксическим потенциалом - цитотоксические лимфоциты и активированные макрофаги, что создало в локусах воспаления высокий уровень провоспалительных цитокинов и лизосомальных протеаз, приводящих к вторичной альтерации легочной ткани. Следует отметить, что уже с 3 суток развития инфекционного процесса в инфильтратах увеличивалось количество фиб-робластов. Это, отчасти, детерминировало раннее прогрессирование фибротических осложнений: величина показателя объемной плотности фиброзной ткани в легких мышей увеличилась в период с 1 по 3 сутки после инфицирования в 4,1 раза, в период с 3 по 10 сутки — в 3 раза (рис.2).

При светооптическом исследовании в паренхиме печени инфицированных животных в первые шесть суток обнаружены паретическое расширение и полнокровие крупных вен и синусоидов с явлениями стаза и гемолиза эритроцитов. С первых суток после заражения наблюдали гепатоциты в состоянии гидропической дистрофии с переходом в балонную, центролобулярные некрозы. Объемная плотность деструктивных изменений (сумма некротических и дистрофических изменений) в печени на 6 сутки после инфицирования была максимальной и составила 93,78%, что свидетельствует о субтотальном повреждении гепатоцитов и развитии печеночной недостаточности. К 10 суткам от начала эксперимента величина данного показателя уменьшилась на 17,6%, оставаясь на высоком уровне (рис.3).

Коктроль 1 3 в IV

Сроки после инфицирования, сутки Деструктивные изменения

Рис. 3. Патоморфологическне изменения АУ§оо5е/Кга5поогег5коуе/627/05

§10

Контроль 1 3 6 10

Сроки после инфицирования, сутки

2-яд. гепатоциты —РСМ\+ гепатоциты

печени мышей, инфицированных ВГ А/Н5Ж

Помимо деструктивных изменений оценивали активность репаративных процессов в паренхиме печени по численности двуядерньгх гепатоцитов и экспрессии маркера пролиферации РС^ в их ядрах.

В группе инфицированных животных в первые сутки после заражения численная плотность двуядерных гепатоцитов была почти в 5 раз меньшей по сравнению с величиной аналогичного параметра у мышей контрольной группы, что свидетельствует о резком угнетении репаративных процессов В период с 1 по 6 сутки численная плотность двуядерных гепатоцитов продолжала снижаться, однако, с 6 по 10 сутки после инфицирования регистрировали увеличение данного параметра в 8 раз (рис.3), что свидетельствует об активации регенераторных процессов у выживших животных. Об активации пролиферативных процессов свидетельствовало и возрастание количества РС^А+гепатоцитов с 1 по 10 сутки инфекционного процесса в 6,2 раза (рис.3). Эти изменения в па-реихиме печени, видимо, обусловили относительное уменьшение доли деструктивно измененных гепатоцитов к 10 суткам развития воспаления.

Таким образом, проведенные исследования показали, что в морфогенезе изменений в печени при вирусной инфекции, вызванной вирусом гриппа А/Н5Ы1, преобладают деструктивные изменения с угнетением репаративных процессов в первую фазу инфекционного процесса.

В почках ведущим патоморфологическим признаком были структурные проявления гемодина-мичсских нарушений, которые наблюдали в виде паретического расширения сосудов с тромбозом мнкроциркуляторного русла. Показатель численной плотности сосудов в интерстиции в период с первых до третьих суток после инфицирования животных уменьшился на 15%, что связано с увеличением диаметра сосудов в эти же сроки эксперимента на 34,8% в результате фибриноидных изменений. Гемоциркуляторные нарушения и ишемия определяли выраженные дистрофические изменения в эпителии проксимальных канальцев, регистрируемые с первых суток после заражения, которые были представлены гидропической дистрофией с переходом в балонную с формированием очагов некро-нефроза Объемная плотность деструктивных изменений в почках была максимальной на 6 сутки инфицирования и составила 82,5% с последующим уменьшением величины данного показателя к 10 суткам на 15% (рис.4), что, видимо, связано с восстановлением гемодинамики в паренхиме почек, обусловленное активацией ангиогенеза С 3 по 10 сутки после инфицирования регистрировали увеличение численной плотности капилляров мнкроциркуляторного русла на 41,5%. При этом величина данного показателя увеличилась за счет новообразованных сосудов с тонкими стенками, что было сопряжено с увеличением количества УЕОРЯ+эндотеллальньгх клеток с 1 по 10 сутки заболевания в 3,4 раза (рис 4).

е»

г 2«

Контроль 1 3 в 1

Сроки после инфицирования, сутки

^ео

—70

Ёео

|5°

сэо 2«

Контроль 1 Э 6 10

Сроки поело инфицирования, сутки Деструктивные изменения — Ф иброзная ткань

» Сосуды —*— \/КЖ+ эндотелиоцкты

Рис. Патоморфологичсскис изменения в почках мышей, инфицированных ВГ А/Н5Ю

А/£оо.«/Кго5поомгекоуе/627/05

Вероятно, как следствие ишемии происходила активация фибропластических процессов с развитием перииаскулярного фиброза, величина показателя объемной плотности фиброзной ткани в почках мышей в период с 1 по 10 сутки после инфицирования увеличилась в 2,8 раза (рис.4).

Таким образом, инфицирование мышей вирусом гриппа А/Н5Ы1 А/§оо5е/Кга5ПОО2егвкоуе/627/05 сопровождается развитием острого тубулонекроза, связанного, прежде всего, с гемодипамическими нарушениями, наблюдаемыми при гриппе А.

При гистологическом исследовании в головном мозге мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ш А^оо5е/кга5поо2ег8коуе/627/05, в мягкой мозговой оболочке отмечали признаки серозного лептоменингита в виде отека и единичных лимфоцитов. Одним из ведущих патоморфологических признаков вирусного поражения центральной нервной системы при гриппе А/Н5Ы1 является отечно-деструктивный синдром, связанный с ранними гемоциркуляторными нарушениями. Начиная с 3 суток, и ткани головного мозга мышей отмечали явления неоангиогенеза с увеличением численной плотности сосудов к 10 суткам заболевания на 25,6% (рис.5) преимущественно за счет С034+капилляров Количество УЕСРЯ+эндотелиоцитов с I по 10 сутки эксперимента увеличилось в 6,5 раз. На фоне развивающейся сосудистой ишемии в ткани головного мозга были выражены нарастающий перицеллюлярный и периваскулярный отек, мультифокальные очаги ишемических некрозов. Величина показателя объемной плотности деструктивных изменений с 1 по 6 сутки инфицирования возросла в 3,5 раза с последующим уменьшением к 10 суткам на 19% (рис.5).

£8С

860 Ебо о

§40

530

510 £ 0

Г"

>45

£30 8 25

5'5

.у.

Контроль 1 3 б 11

Сроки после инфицирования, сутки

-- Сосуды

-\/ЕОПЧ+ эндотвлиоциты

Контроль 1 3 6 11

Сроки после инфицирования, сутки Деструктивные изменения —■— Периваскулярный инфильтраты

Рис. 5. Патоморфологнческне изменения в головном мозге мышей, инфицированных ВГ А/Н5И1 А^оо5е/Кга5шииег5коуе/627/05

Наряду с деструктивными процессами в головном мозге инфицированных мышей регистрировали гиперплазию глиальных элементов. Большинство клеток микроглип, выполняющих функции фагоцитов, были расположены в виде муфтообразных скоплений вокруг сосудов и зон некроза. Гиперплазию астроцитов, количество которых увеличилось с 1 по 10 сутки заболевании в 2 раза, наблюдали преимущественно в виде цепочечных скоплений вокруг сосудов, что может свидетельствовать о защитной роли астроцитов в востановлении и поддержании структурно-функциональной целостности гематоэнцефалического барьера.

В костном мозге мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1 А/§оо5е/Кга5поО2егекоуе/627/05, с 1 по 3 сутки после заражения происходила активация кроветворения, проявляющаяся увеличением численности ранних предшественников (недифференцированных бластов, миелобластов, промиело-цитов и миелоцитов). Одновременно отмечали снижение относительного количества зрелых клеток (нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов), чго, вероятно, связано с их «выходом» в периферические компартменты в результате высокой концентрации хематтрактантов в локусах воспаления, наиболее выраженных в легких мышей На более поздних сроках (6 и 10 сутки после инфицирования) относительное содержание зрелых нейтрофилов в костном мозге практически достигало контрольных величин, а число лимфоцитов - оставалось ниже контроля.

При морфометрическом исследовании в селезенке мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1, через сутки после заражения отмечали снижение количества лимфоцитов в герминативной зоне фолликулов и в периартериальных зонах с последующим прогрессирующим истощением лим-фоидной ткани. Величина показателя численной плотности фолликулов с I по 10 сутки развития инфекционного процесса уменьшилась в 2,2 раза с одновременным уменьшением диаметров фолликулов на 45% в эти же сроки наблюдения. Герминтагивные центры в фолликулах практически не визуализировали. В расширенных синусоидах наблюдали гемостаз, скопления нейтрофилов. гиперплазию

клеток макрофагалыюго ряда. С 1 по 10 сутки инфекционного процесса количество иммунопоэитив-ных СБ68+клеток увеличилось в 1,7 раза (рис.6). Также в синусоида* наблюдали гигантские СПб8+многоядерные клетки, численная плотность которых с 3 по 10 сутки развития болезни возросла в 2,1 раза.

=-100 А

Z 160 (£ 140 О 120 ¡т ЮО

Контроль 1 3 в 10

Сроки после инфицирования, сутки ? ■ CD4+nnemt ■-■•--•СМ+клетхи t СМв+клетки

Рис. 6. Патоморфологическне изменения A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

#16 I"

Е »

g e s ^

i 2

£ ° о

Контроль 1 3 В 10

Сроки после инфицирования, сутки

Деструктивные изменения

* Фиброзная ткань

в селезенке мышей, инфицированных ВГ А/Н51Ч1

При иммуногистохимическом исследовании было показано одновременное уменьшение CD4 + лимфоцитов в 1,75 раза, CD8+ лимфоцитов - в 1,5 раза (рис.6), в большей степени связанное с апоптозом лимфоцитов В цитоплазме лимфоцитов на всех сроках наблюдения отмечали положительную реакцию с моноклональными антителами к caspase-З - индуктору апоптоза, количество им-мунопоэитивных клеток лимфоидного ряда с 1 по 10 сутки заболевания увеличилось 1,7 раза, при этом количество caspase-3+макрофагов было единичным на всех сроках наблюдения. Вместе с апоптотнческими изменениями в паренхиме селезенки визуализировали очаги некроза. Объемная плотность деструктивных процессов в селезенке нарастала с 1 по 10 сутки в 3 раза (рис.6). Полученные данные, вероятно, могут свидетельствовать о развитии инфекционно-ассоциированного гемо-фагоцитарного синдрома (гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза) (Fisman D.N., 2000) при гриппе А, сопровождающегося блокадой каспазо-зависимого апоптоза макрофагов

В динамике развития инфекционного процесса в селезенке регистрировали фибротическис осложнения: разрастание фиброзной ткани наблюдали преимущественно в периваскулярных зонах. Величина показателя объемной плотности фиброзной ткани в период с 1 по 10 сутки после инфицирования вирусом гриппа A/H5N1 увеличилась в 5 раз (рис.6).

Истощение лимфоидной ткани по типу акцидентальной инволюции с замещением жировой и фиброзной тканями наблюдали и в тимусе инфицированных мышей. С 1 по 10 сутки инфекционного процесса регистрировали прогрессирующее уменьшение количества лимфоцитов в 3,6 раза. Увеличение объемной плотности фиброзной ткани в этот же период составило 3,8 раз.

Особенности морфогенеза гриппа АШ5Ы1 А/§оо5е/Кга5поо2сг5коуе/627/05

Обобщая полученные данные по исследованию структурных изменений в органах экспериментальных животных, инфицированных вирусом гриппа А/Н5>11 А^оо5е/Кга5поо2егзкоуе/627/05, в морфогенезе вирусной инфекции можно выделить ведущие патоморфологические синдромы:

1. Вазопатический, представленный гемодинамическими нарушениями в органах с многочисленными кровоизлияниями, явлениями гиперкоагуляции и тромбоза микроциркуляторного русла по типу синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, которые приводят к недостаточности кровоснабжения, гипоксии и ишемии тканей органов.

2. Деструктивный, характеризующийся распространенными дистрофическими, некротическими и апоптотнческими процессами, обусловленными персистенцией вируса гриппа А/Н5Ы1 в клетках органах и его цитопатическим действием, вторичными гемодннамическими нарушениями и цитоток-

сическими повреждениями, вызванными реакцией клеточного звена иммунитета мышей в ответ на инфицирование вирусом гриппа А/ГОЖ. Это приводило к проявлениям полиорганных нарушений, которые наблюдали в клинической картине заболевания с явлениями острой дыхательной недостаточности, гепато-реналыюго синдрома, церебральных нарушений, приводящих к высокой летальности животных (75%). Истощение лимфоидной ткани в органах иммуногенеза (селезенка, тимус), связанное с индукцией апоптоза в лимфоцитах, приводило к угнетению клеточного звена иммунитета и прогрессированию инфекции.

3. Гиперпластический, выраженный увеличением количества альвеолоцитов, гепатоцитов. глиоцитов и эндотелиоцитов, новообразованием капилляров; гиперплазией клеток системы моно-нуклеарных фагоцитов с образованием мкогоядерных (полиплоидных) макрофагов и развитием ии-фекционно-ассоциированного гемофагоцитарного синдрома. Высокий уровень пролиферации носит двойственный характер: с одной стороны способствует репарации поврежденных тканевых структур, с другой - увеличивает концентрацию новых клеток, необходимых лля репликации и персистенции вируса гриппа А, способствуя тем самым пролонгированной персистенции вируса гриппа А/Н51\11.

4. Фибропластический, обусловленный ранней активацией процессов фиброгенеза с пролиферацией фибробластов и развитием фибротических осложнений в органах инфицированных мышей, наиболее выраженных в легких.

3.4. Молекулярно - клеточные основы патогенеза гриппа А/Н5!Х1 у млекопитающих

Исследование цитокннового профиля в сыворотке кровн и клетках органов мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ш А/^оо!,е/Кга5Поогегзкоуе/б27/05

Концентрации 1РЫ-о и в сыворотке мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1

А^оо5е/Кга5поо2ег5коуе/627/05, были ниже показателей контрольной группы во все сроки наблюдения. Наименьшие значения исследуемых параметров регистрировали на 3 сутки после инфицирования, которые были ниже контрольных показателей в 7 раз для 1Ш-а и в 3,2 для ПЭД-у (рис.7).

Сроки после инфицирования, сутки .. * Н5 N1 —*— Контрол ь

Сроки после инфицирования, сутхи Н5М —*— Контроль

пг/мл

120

100 •

60 ■

40 •

20 •

0 •

1 3 6 10

Сроки после инфицирования, сутки +--Н5М —*—Контроль

Рис, 7. Концентрации эндогенных интерфсронов 1 ЬА-у и цитокина Г\К-а в сыворотке крови мышеи, инфицированных. ВГ А/Н51\'1 А/й005с/Кгачпоо/епкоуе/627/()5

На 6 сутки наблюдали повышение уровня 1Ж-а в 1,7 раза с последующим снижением к 10 суткам на 33,4%. Концентрация И-И-у в сыворотке крови инфицированных мышей увеличилась с 3 по 10 сутки на 87,5%, оставаясь на 10 сутки в 1,9 раза меньше аналогичного показателя в контрольной группе (рис 7). Значительное снижение уровней Н^-а и в крови мышей на 3. сутки может быть обусловлено ТОТ-индуцированным апоптозом лимфоцитов.

Уровень Т№-а в сыворотке крови инфицированных мышей в 1 сутки после заражения был выше по сравнению с контрольной группой в 3,1 раза. С 1 по 3 сутки инфекционного процесса регистрировали повышение исследуемого параметра на 73,5%, а его значение превосходило показатели контроля в 4,3 раза. К 10 суткам заболевания происходило снижение уровня ТЫР-а (рис.7).

Были изучены экспрессии цитокинов - ТЫР-а, 1Ь-б - в органах мышей на 1, 3, 6, 10 сутки после инфицирования. Положительная иммуногистохимическая реакция с исследуемыми маркерами была выявлена в клетках различного гистогенеза в органах на всех сроках наблюдения, а количество им-мунопозитивных клеток у инфицированных мышей в несколько раз превосходило таковое у интакт-ных животных (рис.8).

Легкие

Контроль 1 Э 6 1С

Сроки после инфицирования, сутки

во

^55 а

250

8«

? 35 430

5й 120

£10-=Г 5-

Печень

-Н.-6

-Т№-а

Контроль 1 3 в 1

Сроки после инфицирования, сутки 11.-6

он

£12

с,о

5 >

1 6

Головной мозг

Контроль 13 6 1

Сроки после инфицирования, сутки

» II--« _»_-гмр_а

¿£0 и

О 40 С

530

Контроль 13 6 1

Сроки после инфицирования, сутхи

* 11.-6 —ТМ^а

Рис, 8. Экспрессия провоспдлительных шттокннов в тканях внутренних органов мышей, инфицированных ВГ А/ШМ А^оо5е/Кга5поогегз1<оуе/627/05

При этом, в 1 сутки после инфицирования наибольшее количество клеток, экспрессирующих ТМГ-а и 1Ь-б, было зарегистрировано в легких мышей. Вероятно, репликация ВГ А/Н5Ы1 в клетках легких выступает инициатором острой фазы воспаления.

Максимальные значения величин показателей численной плотности IL-6+ клеток во всех органах достигало на 3 сутки, которые были выше величин аналогичных параметров в легких - в 6,8 раза, в печени - в 7,5 раз, в головном мозге - 3,8 раза, в селезенке - 8,2 раза (рис.8).

Наибольшие количества TNF-a+ клеток регистрировали на 6 сутки после инфицирования, превосходящие значения исследуемого параметра у нкгакгных мышей в легких — в 8,3 раза, в печени - в 11,2 раза, в головном мозге - 4,6 раза, в селезенке - 7,6 раз (рис.8).

Наибольший процент 1Ы> - и TNF-a - иммунопозитивных клеток составляли эндотедиоциты сосудов органов, вторыми по численности были клетки системы мононуклеарных фагоцитов (альвеолярные макрофаги, клетки Купфера, синусоидальные макрофаги селезенки). На 10 сутки инфекционного процесса регистрировали уменьшение величин исследуемых параметров, но их значения существенно превышали величины аналогичных параметров в контрольной группе (рис.8).

Из полученных результатов следует, что высокая патогенность вируса гриппа A/H5N1 для мышей обусловлена с цитотоксическими эффектами самих вирусов и с длительной гиперпродукцией провоспалительных цитокинов в ответ на инфицирование, приводящими к гемодинамическим нарушениям с явлениями гиперкоагуляции и повышению цитотоксического потенциала эффекторных клеток, преимущественно макрофагов, с развитием необратимых изменений в органах

Исследование кислород-независимых факторов защиты клеток органов мышей после инфицирования вирусом гриппа A/H5N! A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Для оценки гидролитического потенциала клеток органов мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, и роли кислород-независимых факторов неспецифической защиты организма при гриппе A/H5N1 было проведено ИГХ-исследование с моноклональны-ми антителами к лизоциму, катепсину Д и миелопероксидазе, осуществляющих внутриклеточное расщепление белковых структур вирусов (Burster Т. el al., 2007).

Экспрессию исследуемых маркеров наблюдали в клетках всех органов, а их количество на всех сроках исследования в несколько раз превосходило значения аналогичных параметров в контрольной группе (рис. 9).

Несмотря на то, что через сутки после инфицирования большинство визуализируемых lnfA+клеток были представлены эндотелиоцитами, максимальная концентрация клеток, экспресси-рующих лиэосомальные протеазы, была в популяциях клеток системы мононуклеарных фагоцитов (макрофагах легких, клетках Купфера, макрофагах селезенки). Наибольшее количество гидролаз-продуцирующих клеток регистрировали в легких инфицированных мышей, что, по-видимому, отражает их барьерную функцию прн инфицировании ВГ гриппа A/H5N1.

При исследовании лизоцим-содержащих клеток в органах инфицированных мышей отмечали, что их количество было максимальным на 3 сутки заболевания и превосходило контрольные значения в легких в 8,4 раза, печени - в 7,4 раза, головном мозге - 4,25 раза, селезенке - 8,3 раза - с постепенным снижением к 10 суткам после инфицирования (рис. 9). Величина показателя катепсин Д -иммунопозитивных клеток также была наибольшей на 3 сутки заболевания и была выше контрольных величин - более, чем в 6 раз в легких, печени, головном мозге, в 9 раз - в селезенке. К 10 суткам происходило снижение величии исследуемого параметра (рис.9). Такую же динамику - с повышением на 3 сутки инфекционного процесса и снижением к 10 суткам - регистрировали и при исследовании численности клеток, экспрессирующих миелопероксидазу, в органах инфицированных мышей (рис.9).

Таким образом, полученные данные позволяют предполагать, что инфицирование мышей ВГ A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 ведет к ранней (1-3 сутки заболевания) активации кислород-независимых факторов защиты в клетках различного гистогенеза.

5 20

Легкие

Контроль 1 3 в 1С

Сроки после инфицирования, сутки

Lys

-CathD

-Мув!

^50 £

О40

gZO О

J10

Печень

Контроль 1 3 & 1

Сроки после инфицирования, сутки

-Lys

-CathD

-Myel

f«

ё10 3 «

Головно

Контроль 1 э 6 10

Сроки после инфицирования, сутки

-Lys

■CathD

"Myel

65 -I

60 -

=55 fl

Z50 £45 -§40

fas

с зо

Iх

г 20

g1S

S10

Селезенка

Контроль 1 3 6 10

Сроки после инфицирования, сутки

•Lys

-CathD

"Myel

Рис. 9. Экспрессия Lysozyme, Cathepsin D и Myeloperoxidase в органах мышей, инфицированных ВГ A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Высокий гидролитический потенциал клеток играет двойственную роль в патогенезе гриппа A/H5N1. С одной стороны, это является фактором ранней неспецифической защиты, способствующим элиминации вирусов, с другой — может стать тригтерным моментом в инициации гибели собственных клеток макроорганизма с развитием распространенных деструктивных осложнений в органах в случае лабилиэации мембран фаголизосом после поглощения вирусных частиц.

Исследование кислород-зависимых факторов зашиты клеток органов мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Важную роль в противовирусной защите отводят системе оксида азота, которая через активацию идуцибельной и эндотелиальной NO-синтаз (iNOS и eNOS) ингибирует электрон-транспортные группы ферментов вирусов, участвующих в цикле Кребса и синтезе ДНК (Gutierrez G. et al., 1995; Львова А.В. и др., 2010).

Для определения роли кислород-зависимых факторов защиты в патогенезе гриппа A/H5N1 у мышей, инфицированных ВГ A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, было проведено ИГХ-исследование образцов органов с моноклональными антителами к iNOS и eNOS. Экспрессию исследуемых маркеров наблюдали в клетках всех органов инфицированных мышей, а их количество на всех сроках исследования в несколько раз превосходило значения аналогичных параметров в контрольной группе и имело наибольшие значения в легких животных (рис. 10).

Количество клеток, в цитоплазме которых регистрировали экспрессию eNOS, было максимальным в 1 сутки эксперимента и по сравнению с контролем было большим в легких и печени в 6,2 раза, головном мозге - в 3,8 раза, селезенке - в 3,9 раза. При этом большинство клеток было представлено эндотелиоцитами сосудов органов. К 6 суткам эксперимента концентрация клеток, экспрессирующих eNOS, уменьшалась во всех исследуемых органах в 1,2-1,5 раза (рис.10). Это, возможно, может быть связано с «переключением» на продукцию ¡NOS, как более сильного индуктора оксида азота. К 10 суткам инфекционного процесса значимого снижения величин данного показателя не происходило (рис. 10), что может быть обусловлено уменьшением числа 1пСА+ клеток в органах инфицированных мышей. Экспрессия ¡NOS в макрофагах легких, печени и селезенки, а также альвеолоцитах и эндоте-лиоцитах сосудов легких и головного мозга усиливалась по мере снижения экспрессии eNOS: с I по б сутки инфекционного процесса в органах инфицированных мышей наблюдали увеличение количества iNOS-иммунопозитивных клеток: величины данного параметра превосходили контрольные значения в легких - в 3,6 раза, в печени - в 8 раз, головном мозге - в 3,2 раза, селезенке - в 7 раз (рис.10). С 6 по 10 сутки происходило снижение величины данного параметра в печени и селезенке, менее выраженное уменьшение наблюдали в легких и головном мозге (рис. 10)

ОАО

Легкие

Контроль 1 3 б 1(

Сроки после инфицирования, сутки

—'40 О

Iм

ЁТ5 «

g«

Печень

Контроль 1 Э 6 II

Сроки после инфицирования, сутки

INOS

-eNOS

-¡NOS

-eNOS

Головной мозг

Контроль 1 3 в 11

Сроки после инфицирования, сутки

-♦—INOS —»-eNOS

«40 ¿"35 • О 30 ё» ho

Селезенка

Контроль 1 Э fi II

Сроки после инфицирования, сутки

-ч— INOS

-eNOS

Рис 10, Экспрессия NO-chhtbî A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

в органах мышей, инфицированных ВГ A/H5N1

Выявленные особенности экспрессии N0-^1033 в органах инфицированных мышей могут свидетельствовать о том, что в легких кислород-зависимые механизмы являются наиболее предпочтительными для эффективной противовирусной защиты. С другой стороны, избыточная выработка про-

дуктов перекисного окисления ведет к дестабилизации клеточных н лизосомальных мембран, способствуя вторичной альтерации ткани органов.

Пути реализации гибели клеток в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа (\ZH5N1 А/всмве/Кпш1002егбкоуе/б27/05, н их роль в морфогенезе инфекционного процесса

При проведении световой микроскопии в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5М .А/£005е/Кгазпоогег5коуе/627/05, регистрировали распространенные деструктивные изменения. представленные участками некроза и апоптоэа.

В структуре деструктивных изменений в легких превалировали апоптотические изменения (более 70%): количество савра5е-3+ клеток уже на 1 сутки после инфицирования было в 17,3 раза выше по сравнению с контрольными величинами, с 1 по 10 сутки заболевания величина данного показателя у инфицированных мышей возросла в 2,6 раза (рис.11). С 1 по 3 сутки заболевания реализация апоптоза в легких инфицированных мышей происходила преимущественно по митохондриальному пути через активацию каспазы-9, что, вероятно, в большей степени связано с цитопатическим действием вирусов, на что указывает данные корреляционного анализа между численностью сазра5е-9+ клеток и 1п£А+ клеток в легких мышей (г = +0,85). Концентрация савраае-Я- клеток легких с 1 по 3 сутки инфекционного процесса увеличилась в 2,2 раза с последующим снижением к 10 суткам на 70% (рис. 11).

Контроль 1 3 в 10

Сроки после инфицирования, сутки рис п Экспресса, маркеров ¡шоптом . клетках

—созр-3 (H5N1) —•—смр-9 (HSN1) леппц мышей, ннфицированны! ВГ A/H5N1

° TRAIL (H6N1) A/goose/Krasooozerskoye/i27/05

Снижение было обусловлено переключением на рецепторно-плазмолеммный путь реализации апоптоза клеток легких через активацию доменов смерти TRAIL. Количество TRAIL+ клеток в легких инфицированных мышей с 3 по б сутки заболевания увеличилось в 1,6 раза (рис.11) и коррелировало +0,98) с повышением экспрессии TNF-a в клетках легких (рис.8) в эти же сроки заболевания, что может служить свидетельством реализации прокаспазного механизма клеточной гибели, связанного с гиперцитокинемией.

Свой вклад в инициацию апоптоза в легких инфицированных мышей вносят циготоксичиеские С08+лимфоциты, которые за счет секреции перфорина формируют в мембране альвеолоцитов трансмембранные каналы, по которым внутрь клетки поступают сериновые протеазы, в частности, гранзим В, превращающий прокаспазу-3 в активную каспазу-3. Увеличение численной плотности лимфоцитов, экспрессирующих гранзим В, наблюдали с 3 по 10 сутки после инфицирования в 2,2 раза, что по срокам совпадало с наибольшими значениями объемной плотности инфильтративных тменемий в легких инфицированных животных

о 120

о do X

Селезенка

Преобладание в структуре деструктивных изменений масштабов апоптоза (более 75%) над масштабами некроза регистрировали и при исследовании образцов селезенки инфицированных мышей на всех сроках наблюдения. Изменение величин численной плотности ТЯА1Ь+ клеток и саяразе-

9+ клеток имели ту же тенденцию, что и в легких инфицированных животных (рис.12). В составе апоптотически измененных клеток преобладали лимфоциты, тогда как макрофаги, экспрессиру-ющие исследуемые маркеры, были единичными. С масштабной гибелью лимфоцитов и истощением лимфоидной ткани, по-видимому, связана недостаточность интерферонового ответа у экспериментальных животных, инфицированных вирусом гриппа А/Н5М1, которую наблюдали при исследовании цитокинового профиля в сыворотке крови

Контроль 1 3 £ К

Сроки после инфицирования, сутки — сазр-3 (HSN1) —*— casp-9 (H5N1) -^w. TRAIL (H6N1)

Рис. 12. Экспрессив маркеров апоптоза в клетках селезенки мышей, инфицированных ВГ A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/OS

В структуре деструктивных изменений в ткани печени, почек и головного мозга мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, преобладали дистрофические и некротические изменения: в печени свыше 90%, головном мозге - более 60%, почках - до 85%, что, видимо, связано с нарушением оксигенации тканей за счет сосудистых изменений с явлениями гиперкоагуляции и формированием тромбов в микроциркуляторном русле. Об ишемическом механизме наблюдаемых повреждений свидетельствовали и локализации зон некрозов в органах: центролобу-лярные в печени, периваскулярные в головном мозге, субтогальные повреждения в почках по типу некронефроза. Клеточную гибель путем апоптоза в исследуемых органах наблюдали лишь в небольшом проценте клеток: в головном мозге — до 12%, в почках — до 3%, в печени — до 10%. При этом, реализация апоптоза происходила рецепторно-плазмолеммным путем, о чем свидетельствовало преобладание TRAIL-иммунопозитивных клеток (рис. 13).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в органах мышей при инфицировании вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 происходит масштабная по распространенности гибель паренхиматозных клеток органов, обусловленная персистенцией вируса и патологическими изменениями сосудистого русла и, как следствие этого, гемодинамическими нарушениями с многочисленными кровоизлияниями в тканях, гиперкоагуляцией и тромбозом микроцир-куляторного русла. Гемоциркуляторные нарушения, в свою очередь, приводят к ишемии и некробио-тическпм изменениям в печени, почках, головном мозге Кроме очагов некрозов, обусловленных ци-топатическим действием вируса и гипоксией, в органах наблюдали апоптоз клеток, доминирующим ь структуре деструктивных процессов в легких и селезенке инфицированных животных Основными механизмами апоптоза явились:

-митохондриапьный, реализуемый через активацию каспаэы-9 и связанный преимущественно с цитопатическим действием вирусов гриппа А и ишемическими повреждениями;

- рецепторно-плазмолеммный, связанный с гиперсекрецией провоспалительных цитокинов, в частности, TNF-a и активацией каспазы-3 через TRAIL- домены смерти.

Головной мозг

Контроль 1 3 6 10

Сроки поело инфицирования, сутки — casp-3 (H5N1) —а—casp-9 (H5N1) TRAIL (H5N1)

Печень

Контроль 1 3 б 10

Сроки после инфицирования, сутки

casp-3 (H5N1) -*—casp-9 (H5N1)

--TRAIL (H5N1)

Контроль 1 э а 10

Сроки после инфицирования, сутки «—casp-3 (H5N1) —It—casp-9 (H5N1) TRAIL (H5N1)

Рис. 13. Экспрессия маркеров апоптоза в клетках печени, головного мозга н почек мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н51Ч1 А^оо5е/Кга8поогег51шуе/627/05

Особенности фиброгеыеза в органах мышей в динамике развит ии гриппа Л/Н5М

При гистологическом исследовании образцов органов мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1 А/§оо5е/Кгазпоо2егБкоуе/627/05, наблюдали увеличение объемной плотности соединительной ткани во всех органах в динамике развития заболевания. Но масштабы фиброзирования были наиболее выражены в легких инфицированных мышей.

Величина показателя объемной плотности фиброзной ткани в легких мышей увеличилась в период с 1 по 3 сутки после инфицирования в 4,1 раза, в период с 3 по 10 сутки - в 3 раза. При этом, на ранних сроках заболевания (1-3 сутки) увеличение содержания коллагеновых волокон было более выражено перибронхиально и периваскулярно. Начиная с 6 суток отчетливо выявляли прирост соединительной ткани в межальвеолярных перегородках и в инфильтратах с формированием очагов интерстициального фиброза.

Увеличение концентрации соединительной ткани в легких инфицированных мышей уже с 1 суток инфекционного процесса было обусловлено, прежде всего, персистенцией вируса гриппа А/Н5Ш в фибробластах, что было показано при ИГХ-исследовании: количества 1п£А+ фибробластов возросло в 2 раза с 1 по 3 сутки после инфицирования (с 7,1 до 14,7) с последующим снижением к 10 суткам инфекционного заболевания в 2,3 раза (рис 1). Успешная репликация вирусов в фибробластах, вероятно. запускает процессы пролиферации данного типа клеток, что нашло отражение в повышении величины численной плотности фибробластов с I по 10 сутки инфекционного процесса в 2,9 раза. На

активацию пролиферативных процессов указывала и повышение количества PCNA+ фибробластов в 2 раза в динамике заболевания. «Фибропластическал активность» фибробластов в 1 сутки после инфицирования была меньшей, чем у интактных животных в 1,8 раз, с последующим увеличением к 10 суткам более, чем в б раз, что могло свидетельствовать об ускоренной дифференцировке фибробластов.

С 1 по б сутки после заражения в легких инфицированных мышей наблюдали увеличение в 2,5 раза количества клеток, экспрессирующих матриксные металлопротеиназы - ММР-2, ММР-9, ММР-10, большая часть из которых была представлена интерстициальными макрофагами и макрофагами инфильтратов, вторыми по численности были фибробласты. Также с 1 по 10 сутки инфекционного процесса в легких мышей регистрировали увеличение в 3,4 раза числа клеток с экспрессией тканевого ингибитора металлопротеиназ - TIMP-2.

Таким образом, раннее фиброзирование легких мышей при гриппе A/H5NJ детерменировано многими факторами: персистенцией вируса в клетках органов, включая макрофаги и фибробласты с последующей их пролиферацией, блокадой интерферонового ответа, ишемией, инфильтративными изменениями с повышением гидролитического потенциала и избыточной продукцией свободных радикалов в локусах воспаления, гиперцитокинемией. «Дисбаланс» этих процессов при гриппе А, видимо, одна из причин раннего фиброза легких.

Патогенетические аспекты гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/OS

Анализ полученных результатов позволил выделить ключевые патогенетические аспекты в развитии экспериментальной вирусной инфекции, обусловленной вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.

Одной из причин высокой патогенности вируса гриппа A/H5N1 для млекопитающих является воздействие белков вируса на иммунную систему. На ранних сроках после инфицирования (cl по 6 сутки) в сыворотке крови животных при ИФА были снижены уровни IFN-a , IKN-y. Известно, что неструктурный белок NS2 вируса гриппа A/H5N1 опосредованно нейтрализует синтез и эффекты ии-терферонов, что приводит к угнетению неспецифического противовирусного интерферонового ответа (Walowich S.J. et al., 1994). Угнетение вирусом выработки интерферонов эффекторными клетками приводит к его продуктивной репликации в клетках хозяина и, учитывая тропность ко многим органам, к генерализации инфекции.

Под действием вирусной РНК в эпителиоцитах, эндотелиоцитах и макрофагах происходит гиперпродукция провоспалительных цитокинов (1L-6, TNF-a), уровни которых были повышены с 1 суток не только в сыворотке крови инфицированных животных, но и непосредственно в тканях органов (легких, печени, селезенки, головного мозга). Цигокины вызывают иммунный ответ с выраженной реакцией сосудистого русла, сопровождающейся гиперкоагуляцией и тромбозом сосудов с развитием острой гипоксии и ишемии. Это является пусковым фактором процессов деструкции, пролиферации, ангиогенеза и раннего фиброзирования в органах инфицированных животных. Цитокины стимулируют мобилизацию нейгрофипов, моноцитов из костного мозга, активацию полиморфноядерных лейкоцитов, макрофагов, тромбоцитов, что было показано в результате цитологических исследований костного мозга.

Персистенция вируса гриппа A/H5N1 в клетках различного гистогенеза мышей приводит к активации кислород-независимых (протеазы) и кислород-зависимых (eNOS и iNOS-синтазы) факторов защиты, сопровождающихся лабилиэацией клеточных мембран с развитием вторичной альтерации тканей органов, что расширяет масштабы повреждения клеток и их пролиферацию.

Зарегистрированная при ИГХ-исследовании в легких и селезенке блокада каспазо-зависимого апоптоза клеток системы мононуклеарных фагоцитов с их пролиферацией опосредует развитие ин-фекционно-зависимого гемофагоцитарного синдрома, что, может свидетельствовать о снижении микробицидного потенциала макрофагов, способствующем пролонгированной персистенции вируса.

Персистенция вируса гриппа и гиперцитокинемия индуцируют масштабный по распространенности алоптоз лимфоцитов в органах иммуногенеза (селезенке, тимусе), зарегистрированный при ИГХ- исследовании, приводящий к истощению лимфоидной ткани, обнаруженной при патоморфоло-гическом исследовании. С данным проявлением, вероятно, связана недостаточность интерферонового ответа у экспериментальных животных на поздних сроках инфицирования вирусом гриппа А/Н5Ы1, которую наблюдали при исследовании цитокинового профиля в сыворотке крови.

Важным моментом в генезе нарастающей функциональной недостаточности систем органов инфицированных мышей является ранний и быстропрогрессирующий фиброз тканей, выявленный при гистохимическом окрашивании (по ван Гизон), что детерминировано пролиферацией фибробла-стов и макрофагов с повышением их функциональной активности, дисбалансом уровня матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов, экспрессией профибротических факторов роста и их рецепторов в условиях ишемии и гиперцитокинемии. В основе формирования и поддержания дисбаланса процессов дезорганизации и синтеза компонентов внеклеточного матрикса лежит пролонгированная персистенция вируса гриппа АУН5Ы1 в клетках различного гистогенеза, в первую очередь, фибробластах и макрофагах органов.

Таким образом, в основе патогенеза гриппа А/Н5Ы1 лежит, прежде всего, персистенция вируса гриппа А/Н5Ы1 и неполноценный противовирусный интерфероновый ответ, запускающий каскад цитокин-опосредованных реакций, приводящих к необратимым структурно-функциональным изменениям в системах органов млекопитающих (мышей).

3.5, Патогенетическое обоснование профилактики гриппа А/Н5М у млекопитающих с применением модифицированного полисахарида (диальдегидаекстраиа)

Учитывая полученные данные об угнетении неспецифического противовирусного интерферонового ответа вирусами гриппа АУНбШ, предположили, что иммуномоделирующая терапия в сочетании с противовирусными препаратами может способствовать более легкому развитию вирусной инфекции со снижением частоты возникновения осложнений и процента летальности у пациентов.

Помимо снижения интерферонового ответа при инфекции, вызванной вирусом гриппа А/Н5Ы1, также наблюдали успешную репликацию вирусов в макрофагах с задержкой их апоптоэа. Это может свидетельствовать о снижении микробицидного потенциала клеток системы мононуклеарных фагоцитов. В связи с этим, можно полагать, что для усиления противовирусного иммунитета наиболее целесообразно применение иммуномодуляторов, воздействующих на клетки моноцитарно-макрофагальной системы, вызывая повышение их функциональной активности. Это определяет актуальность разработки и создания новых эффективных антивирусных лекарственных форм, оптимально сочетающих в спектре фармакологической активности вирусингибирующие свойства и способность стимулировать неспецифическую резистентность организма со снижением токсических осложнений.

В работах, выполненных под руководством академика РАМН, профессора В.А.Шкурупия было показано, что вышеперечисленными свойствами обладают модифицированные полисахариды (Шку-рупий В.А., 2007). К тому же, они обладают дополнительными свойствами, а именно: детоксициру-ющим, гепатопротекгорным, активируют пластические процессы. В связи с вышесказанным в нашем исследовании для профилактики гриппа А/Н5Ы1 у мышей был выбран окисленный полисахарид -диальдегиддекстран (ДАД) с молекулярной массой бОкДа. Учитывая генерализованный характер инфекционного процесса, для достижения максимального эффекта был выбран внутривенный способ его введения. Дозу ДАД подбирали экспериментальным путем, учитывая разрешенные дозы полисахаридов в медицинской практик у человека (Машковский А.Д., 1999). Для выбора оптимальной эффективной профилактической дозы ДАД при экспериментальном инфицировании мышей вирусом гриппа А/Н5Ы1 А^оо5е/Кгазпоогег5коуе/б27/05 был проведен 3 эксперимент, в котором было сформировано 6 экспериментальных групп. Первая группа - интактные - служила контролем. Мышей из

остальных пяти групп инфицировали вирусом гриппа А/Н5Ш А^оо5е/Кга5Поогег5коуе/627/05. Мышам 2,3,4 и 5 групп предварительно за 3 и I сутки до инфицирования вводили ДАД в дозах 125мг/кг, 250мг/кг, 500мг/кг и 1000мг/кг соответственно. Инфицированным животным 6 группы внутривенно вводили 0,2 мл 0,85% водного раствора ЫаС1.

Определение профилактической эффективности диальдепзддекстрвна при инфицировании мышей ВГ А/Н5И1 А^оо$е/Кга5Поогег5коуе/627/05, выбор оптимальпой дозы

Согласно полученным данным по исследованию профилактической эффективности ДАД, представленным в таблице 2, наилучшего результата удалось добиться при применении препарата в наибольшей из исследуемых доз (1000мг/кг). В опытной группе, для которой ДАД был применен в указанной дозе, наблюдали увеличение показателя СПЖ на 24,2 %, и уменьшение процента летальности в 3,2 раза по сравнению с группой мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5М1 А/§оо5е/Кга5поогегзкоуе/627/05, без профилактического введения ДАД (табл 2). В группе интактных животных гибели особей не наблюдали.

Таблица 2

Результаты исследования профилактический эффективности препарата ДАД при экспериментальном

инфицировании мышей ВГ А/Н5Ш А/£ОО8е/Кгвякгагсгскоуе/б27/05

Экспериментальные группы Доза СПЖ Легталъность,%

Н51Ч1+ДАД 125мг/кг в объеме 0,1 мл 9,0 ± 0,6 80,0 ± 10,0

250мг/кг в объеме 0.2 мл 9,9 ± 0,3 63,3 ±5,8

500мг/кг в объеме 0,2 мл 10,7 ± 0,3 53,3 ±5,8

ЮООмг/кг в объеме 0,4 мл 12,3 ± 0,3 23,5 ± 5,8

Н5М МЛД.о 9,9 ± 1,2 76,6 ± 11,6

Примечание: Н5Ю+ ДАД - экспериментальные группы, в которых мышей инфицировали ВГ А/Н5М после профилактического введения ДАД; Н5.\ 1 - экспериментальная группа, в которой мышей иифииировали ВГ А/Н5М1 без профилактического введение ДАД.

Таким образом, исходя из приведенных выше данных, можно сделать вывод о том, что ДАД оказывает профилактическое действие при экспериментальном инфицировании мышей вирусом гриппа А/Н5Ы1 А^оо5е/К1а5поогег8коуе/б27/05 при двукратном внутривенном введении за 3 и 1 сутки до инфицирования в дозе превышающей 250мг/кг. При введении препарата в дозе ЮООмг/кг наблюдается выраженный профилактический эффект, который проявляется увеличением показателя СПЖ и уменьшением процента летальности по сравнению с инфицированными животными без профилактического введения ДАД. Доза препарата 125 мг/кг не оказывает профилактического действия при гриппе А.

3.6. Молекулярно-клеточные особенности гриппа А/Н5М1 у мышей при профилактическом введении диальдегнддекстрана

При иммуногистохимическом исследовании в органах мышей (легких, печени, селезенки, головного мозга, почек), инфицированных вирусом гриппа А'Н5Ы1 А/£оо5е/Кга5Поогег.чкоуе/627/05 после предварительного введения ДАД, было обнаружено снижение числа М+клеток, преимущественно макрофагов. Существенные различия в численности инфицированных клеток отмечали, начиная с 3 суток после инфицирования. К 10 суткам эксперимента величииы показателя численной плотности М+клеток в органах инфицированных мышей после профилактического введения ДАД были меньше по сравнению с инфицированными животными, не получавшими ДАД — в легких в 1,7 раза, головном мозге - в 1,6 раза, в печени и селезенке - в 1,4 раза.

В динамике развития инфекционного процесса на 10 сутки после инфицирования доля тромби-рованных сосудов в ткани легкого инфицированных мышей была в 11,9 раза больше, чем в контроле

и в 6,6 раза больше, чем в группе мышей с профилактическим введением ДАД. Снижение интенсивности процессов тромбирования сосудов и уменьшение объемной плотности кровоизлияний в строме лег ких при профилактическом введении ДАД может быть связано как с лучшей сохранностью эндо-телиальной выстилки сосудов вследствие опосредованного эффекта ДАД, так и со способностью декстранов улучшать реологические свойства крови и стимулировать репаративные процессы (Шку-рупий В.А., 2007). У инфицированных мышей после профилактического введения ДАД к 10 суткам заболевания отмечали уменьшение объемной плотности воспалительных инфильтратов в интерсти-ции легких более чем в 3 раза, фиброзной ткани - в 8,6 раз по сравнению с животными, не получавших ДАД.

При введении ДАД у инфицированных мышей отмечали уменьшение деструктивных изменений в паренхиме печени и головном мозге на всех сроках наблюдения в 2 и более раз по сравнению с инфицированными животными, не подвергавшихся профилактике ДАД. Количество двуядерных ге-натоцитов в печени животных, получавших ДАД, на 10 сутки после заражения превосходило в 3,5 раза значение аналогичного показателя в группе инфицированных животных без профилактики.

Таким образом, результаты исследования образцов легких, печени и головного мозга мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1, при профилактическом введении ДАД показали, что ДАД способствует уменьшению масштабов деструктивных изменений и снижению объема фибрсгтических осложнений

В костном мозге инфицированных мышей, получавших ДАД. на 1 и 3 сутки после заражения было отмечено увеличение содержания палочкоядерных нейтрофилов по сравнению с инфицированными мышами без профилактики. В последующие сроки содержание палочкоядерных нейтрофилов в костном мозге инфицированных мышей обеих групп практически не отличалось. У инфицированных мышей после профилактического введения ДАД отмечали увеличение относительного содержания лимфоцитов костного мозга по сравнению с группой инфицированных животных без профилактики: на 1 сутки и 10 сутки инфекционного процесса в 3,5 раза и в 1,3 раза соответственно. В группе мышей с профилактическим введением ДАД на 1 сутки после инфицирования относительное содержание моноцитов в костном мозге увеличилось более, чем в 3 раза по сравнению с группой инфицированных животных. Таким образом, профилактическое введение ДАД способствует поддержанию нормальной численности лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови мышей при гриппе А/Н5Ы1 за счет нормализации дифференцировочного потенциала и баланса между различными ростками костномозгового кроветворения.

Профилактическое введение ДАД приводит к увеличению численной плотности и диаметров лимфоидных фолликулов по сравнению с нелеченными животными. Уменьшение количества многоядерных клеток в синусах селезенки может свидетельствовать о противовирусной активности ДАД, связанной с активацией механизмов естественной резистентности, которые реализуются через элиминацию вируса путем гибели инфицированных макрофагальных клеток.

В исследовании были изучены профили цитокинов - ТИР-и, эндогенных интерферонов - 1Ж-а. 1ПЧ-у - в сыворотке крови экспериментальных животных с применением метода иммунофермент-ного анализа. Профилактическое введение ДАД приводило к значительному повышению уровня 1Ж-а в сыворотке крови инфицированных мышей на всех сроках наблюдения. Уже на 1 сутки после заражения величина данного показателя составила 25пг/мл, превышая в 1,6 раза аналогичный параметр у мышей, не получавших ДАД. С 1 по 10 сутки отмечали равномерное снижение величины данного параметра на 40%. (рис.14).

Уровень 1РТ4-у у мышей, которым вводили ДАД, был значительно выше величин аналогичного параметра в группе мышей, не получавших препарат. Эти отличия были наиболее значимыми (в 2,1 раза) на 6 сутки после заражения (рис.14), что можно связать с увеличением количества лимфоцитов в костном мозге животных.

пг/мл

за

25 •

20 •

15 •

10 <

Сроки после инфицирования, сутки -Н5М1 —•—Контроль —*—Н5М+ДАД

л г/мл

45 1

40 ■

35 <

ЗС •

25 <

20 <

10 •

5 ■

0 •

Сроки пост инфицирования, сул<и >—нет « Контроль —л—Н5Ы1+ДДД

ШГ-а

1 з е «

Сроки после инфицирования, сутки

-Н5П11

- Контроль

-Н5Ж+ДАД

Рис. 14. Концентрации эндогенных нтгтерферонов ИТ^-а, №N-7 и цитокина TNF-(I в сывороткс крови мышей, инфицированных ВГ А/Н51Ч1 АУБОО5е/Кга5ПОогепкоуе/627/05, без профилактики (115NI) и послс профилактического введения ДАД (Н5М+ДАД)

Уровень Т^-а у инфицированных мышей, не получавших ДАД, был выше по сравнению с величиной аналогичного параметра в контроле и у мышей, которым вводили ДАД, на всех сроках наблюдения. При этом отмечали его повышение с I по 3 сутки после заражения в 1,65 раза с последующим снижением на 24% У мышей, получавших до инфицирования ДАД, уровень ТЫР-а был повышен только на 1 сутки после заражения па 10% по сравнению с контролем. Затем наблюдали его постепенное снижение к 10 суткам на 34% (рис.14).

Иммуногистохимическое исследование экспрессии цитокинов з тканях органов мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5М1 А/§оозе/Кгазпоогег5коуе/627/05 после профилактического введения ДАД, показало уменьшение численной плотности клеток органов, экспрессирующих "П^-а и 1Ь-6, по сравнению с величиной аналогичного показателя в группе, не получавшей ДАД, на всех сроках наблюдения (рис.15). Это свидетельствует о снижении экспрессии провоспалительных цитокинов, что согласовано со снижением объемной плотности кровоизляннй и деструктивных изменений, наблюдавшимся при светооптическом изучении ткани легких, печени, почек, головного мозга

После профилактического введения ДАД у мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1, отмечали уменьшение численной плотности клеток с положительной иммуногистохимической реакцией к маркерам апогттоза: сазраэе-З, сайрам.' 9,ТКА"Х (рис.16,17). Количество сазра5е-3+ клеток в органах мышей дайной группы на 10 сутки после заражения было меньше в сравнении с величиной аналогичного показателя в группе инфицированных животных, не получавших ДАД - в легких и печени в 1,5 раза, в головном мозге - в 2,4 раза, в селезенке - в 1,3 раза (рис. 16,17), что свидетельствует об уменьшении масштабов апоптотической гибели клеток, прежде всего, за счет рецепторно-опосредованного механизма в результате снижения выработки провоспалительных цитокинов при профилактическом введении ДАД.

Z50 • £45

8«

f3S

l2S

»15 ¡10 Г s

Печень

I-

Контроль 1 3 6 10

Сроки после инфицирования, сутки - 11.-6 —*— ТМЯча

(Н5Ж+ДАД) - -ТЫР-а (Н5Ы1+ДАД) о—1|_-6 (Н5№*ДАД) - -ПЧР-а (Н5М+ДАД)

Контроль 13 6 1

Сроки после инфицирования, сутки —11.-6 * ПЧР-а

¿и о

с,о

а 8

1 б

Головной мозг

*£0 ^ О 40

|зо

¡20 5

Контроль 1 Э 6 10

Сроки после инфицирования, сутки

.......11.-6 —а—ТМР-о

—К.-6 (Н5М +ДАД) - -*- - ТПРс (Н5М +ДАД)

Селезенка

Контроль 1 3 6 10

Сроки после инфицирования, сутки

— И--6 —*—™Р<1

— 11.-6 (Н5М+ДАД) • -тарЧ1(Н5М1+ДДД)

Рис. 15. Экспрессия провоспалительных цнтокинов в тканях внутренних органов мышей, инфицированных ВГ А/Н51Ч1 А/£оо$е/Кгязпоогег5коуе/627/05, без профилактики (Н5№) н после профилактического введения ДАД (Н5М+ДАД)

Легкие

Контроль 1 3 6 10

Сроки после инфицирования, сутки —»— casp-3 (H5N1) —*—casp-9 (HSN1) TRAIL (H5N1)

Контроль 1 3 0 10

Сроки после инфицирования, сутки

— са>р-3 (Н5М1+ДАД) -Я—ы>р-9 (Н6МИ-ДАД)

—ТТОМЦЮКП+ДАД)

Рис. 16. Экспрессия маркеров апоптоза а легких мышей, инфицированных ВГ А/Н5№ А/£005е/Кга9ооогег5коуе/627/05, без профилактики (П5» 1) и после профилактического введения ДАД

(Н5М+ДАД)

Контроль 1 Э 6 10

Сроки после инфицирования, сутки •«— casp-3 (HSN1) —*— casp-9 {H5N1) -TRAIL (H5N1)

Контроль 1 3 в 10

Сроки после инфицирования, сутки

~ casp-3 (H5N1+flAfl) -*—casp-9 (Н5М+ДАД)

—TRAIL (HSNI+ДАД)

Головной мозг

Контроль 1 Э 6 10

Сроки после инфицирования, сутки •—casp-3 (H5N1) —*—casp-9 (H5N1) TRAIL (HSN1)

Селезенка

|l20 с

I во

X «

5 40

Контроль 1 Э 6 10

Сроки после инфицирования, сутки — casp-3 (HSNI+ДАД) —*—casp-9 (HSNI+ДАД) —TRAIL (HSNI+ДАД)

Селезенка

=200 2

Контроль 13 6

Сроки после инфицирования, сутки

-casp-3 (HSNI+ДАД) -•—casp-9 (HSNI+ДАД)

-■TRAIL (HSNI+ДАД)

Контроль 1 3 6 10

Сроки после инфицирования, сутки —«—casp-3 (HSN1) —*—casp-9 (H5N1) -ww.TRAIL (HSN1)

Pnc. 17. Экспрессия маркеров апоптоза в печени, головном мозге, селезенке мышей, инфицированных ВГ A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, без профилактики (H5N1) и после профилактического введения ДАД (HSNI+ДАД)

Таким образом, профилактическое введение ДАД оказывает выраженное действие на уровни цитокинов, определяющих патогенез гриппа A/H5N1, что приводит к нормализации цитокинового ответа и, как следствие, уменьшению деструктивных изменений в пораженных органах.

Также после профилактического введения ДАД отмечали выраженное снижение численной плотности клеток, экспрессирующих лизосомальные протеазы, во всех органах, начиная с 1 суток после инфицирования (рис.18,19), что профилактировало деструктивные изменения в органах инфицированных мышей в динамике гриппа А/Н5Ы1.

g е

5 <

Е ' 3 ■

1 : О

5 :

х ■

Легкие

Контроль 1 Э в К

Сроки после инфицирования, сутки

Цв

-CathD

-Myel

110

100

î 90

Z -«

С 70

¡Е ео о

| 50

S «

Легкие

Контроль 1 3 в 10

Сроки после инфицирования, сутки -1_у*(Н5М1«ДАД) —*—Са№ О (№N1 ОДА) ~Муе1 (Н5М1+ДАД)

|so i

О 40

Печень

Контроль 13 6 1

Сроки после инфицирования, сути

«Цв

-CathD

"Myel

¿хя

f 50 ■ О

O40 H С

¡30 X

S 30

¿10

Печень

Контроль 1 3 в 10

Сроки после инфицирования, сутки

— Ly» (HJNI+ДАД) -*—CathD(Н5М+ДАД)

*Myel (HSNI+ДАД)

ên о

= 10

« S

1 а

5 4

X 2

Головной

Контроль 1 3 В 10

Сроки после инфицирования, сутки

1-У5

-CathD

-Myel

?1ê Z —16

ën e

£12 e

gio

s »

î e

5 <

X 2

Головной мозг

Контроль 1 3 в 10

Сроки после инфицирования, сутки — Lys (Н5М1+ДАД) —*— Cath D (HSNI+ДАД) —■Myel (HSNI+ДАД)

Рис. 18. Экспрессия Ьузохуте, Са(Ьерз1в О н Муе1орегох1<1аяе в легких, печени и головном мозге мышей, инфицированных ВГ А/Н51Ч1 А/£оозе/Кгазпоогегзкоуе/627/05, без профилактики (Н5ГЧ1) и после профилактического введение ДАД (Н5М1+ДАД)

¿AS . ¡40.

f 35 С 30

S25 120 X

£15 • ¡103- 5-

Селезенка

=65

Z50 ¿AS

1«

S 35

B1S 8щ

Селезенка

Контроль 1 3 В

Сроки поело инфицирования, сутки -»—CathD

-Lys

Myel

Контроль 1 3 6 10

Сроки после инфицирования, сутки

— Ly» (HSNI+ДАД) -*— Cath D (HSNI+ДАД)

—-Myal (HSNI+ДАД)

Рис. 19. Экспрессия Lysozyme, Cathcpsin D и Myeloperoxidase в селезенке мышей, инфицированных ВГ A7H5N1 A/goose/Krasnoozer9koye/627/05, без профилактики (H5N1) и после профилактического введения ДАД (HSNI+ДАД)

Анализ результатов исследования экспрессии NO-синтаз в клетках органов инфицированных животных показал, что численная плотность eNOS+клеток и iNOS-позитивных клеток была ниже во все сроки эксперимента в группе мышей, получавших ДАД (рис.20). Легкие

в» О

É30 о

S»

5ю

У 5

Контроль 1 Э В 10

Сроки поело инфицирования, сутки

— INOS —*—oNOS

— INOS (HSNI+ДАД) - -И -oNOS (HSNI+ДАД)

Контроль 1 3 в 10

Сроки после инфицирования, сутки — ¡NOS —*— «NOS

--»•¡NOS(Н5М+ДАД) - -«NOS(HSNI+ДАД)

Головной мозг

¿40

Ê35 в 30

Î 5

Контроль 1 Э • 10

Сроки после инфицирования, сутки — INOS —*—oNOS —

»INOS(HSNI+ДАД) • -«- -eNOS (HSNI+ДАД) --

контроль 1 3 • 10

Сроки посла инфицирования, сутки — INOS —»—eNOS

"INOS(HSNI+ДАД) - -*- -eNOS(HSNI+ДАД)

Рис. 20. Экспрессия NO-синтаэ в клетках органов мышей, инфицированных ВГ A/H5N1 A/goosi/Krasnoozerskoye/627/05, без профилактики (H5N1) н после профилактического введения ДАД (HSNI+ДАД)

Результаты исследования показали, что диальдегиддекстран оказывает профилактическое действие при экспериментальной вирусной инфекции, индуцированной вирусом гриппа А/Н5М1 А/£005е/КгаБпоогег5коуе/627/05, при его двукратном внутривенном введении за 3 и 1 сутки до инфицирования в дозе превышающей 250мг/кг. Наиболее выраженный профилактический эффект ДАД, проявлением которого было увеличение показателя средней продолжительности жизни на 24,8% и уменьшения процента летальности в 3,2 раза по сравнению с инфицированными животными без профилактики, был выявлен при введении ДАД в дозе 1000мг/кг.

Эффективность профилактического введения ДАД у мышей инфицированных вирусом гриппа А/Н5№ А^оо5е/Кгазпоогегекоуе/627/05, подтверждается уменьшением количества клеток внутренних органов, содержащих антиген вируса гриппа А, снижением объемной плотности деструктивных изменений и воспалительных инфильтратов, объемной плотности фиброзной ткани в интерстиции органов мышей. Профилактическое введение ДАД приводит к увеличению численной плотности и диаметров лимфоидных фолликулов по сравнению с животными без профилактики. Уменьшение количества многоядерных клеток в синусах селезенки может свидетельствовать о противовирусной активности ДАД, связанной с активацией механизмов естественной резистентности, которые реализуются через элиминацию вируса путем гибели инфицированных клеток макрофагального ряда.

Профилактическое введение ДАД приводит к снижению экспрессии и секреции провоспали-тельных цитокинов (Т№-а и 1Ь-6), внутриклеточных протеаз (лизоцима, катепсина Д, миелоперок-сидаэы), ЫО-синтаэы в клетках органов инфицированных животных, способствуя тем самым уменьшению выраженности проявлений альтеративной фазы воспаления. Возможно, ДАД способствует стимуляции интеферон-индуцирующей функции клеток - мишеней, способствуя значительному повышению уровня 1Ш-а, Н-Н-у, и следовательно, более эффективному противовирусному ответу по сравнению с таковым у инфицированных мышей, не получавших ДАД.

Таким образом, вышеописанные эффекты ДАД позволяют предположить перспективность использования модифицированных полисахаридов в качестве иммуномодулирующих средств, воздействующих на клетки моноцитарно-макрофагальной системы, вызывая повышение их функциональной активности, механизм действия которых требует дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1. Вирус гриппа А/Н5Ы1 А^оозе/Кгазпоогег5коуе/627/05 обладает высокой патогенностью для млекопитающих (мышей), вызывая системный инфекционный процесс с высокой летальностью (более 75%) и пролонгированной персистенцией вируса в период начала реконвалесценции.

2. Высокая патогенность вируса гриппа А/Н5Ы1 А/^оо5е/К.га5Поогег5коуе/627/05 связана, прежде всего, с его способностью к персистенции в клетках альвеолярного эпителия, гепатоцитах, нейронах, резидентных макрофагах, фибробластах, эндотелиоцитах сосудов и во внеклеточных пространствах.

3. Высокая тропность вируса гриппа А/Н5Ы1 А^оо5е/Кгазпоогег5коуе/627/05 к эндотелиоци-там сосудов органов мышей, его цитотоксичность детерминируют деструктивные изменения микро-циркуляторного русла (эндотелиальной выстилки и стенки сосудов), проявляющиеся увеличением их проницаемости, тромботическими и геморрагическими осложнениями, создающие патогенетические условия для острой гипоксии - фактора риска усиления деструктивных процессов в тканях органов вне прямой связи с цитопатичностью вируса.

4. Инфицирование мышей вирусом гриппа А/Н5Ы1 А/§оозе/Кгазпоогег5коуе/627/05 приводит к угнетению неспецифического противовирусного иктерферонового ответа, проявляющегося в опосредованном уменьшении синтеза интерферонов - ГКЫ-у в связи с угнетением лимфоидного ростка гемопоэза и апоптоза лимфоцитов в органах иммуногенеза (селезенке, тимусе), что способствует репликации вируса в клетках хозяина и, учитывая его тропность ко многим органам, к генерализации инфекции.

5. Персистенция вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в эпителиоцитах и макрофагах органов мышей сопряжена с гиперпродукцией провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-a), уровни которых были повышены в сыворотке крови и клетках различного гистогенеза у инфицированных животных во все сроки наблюдения; выраженным иммунным ответом, проявляющимся мобилизацией нейтрофилов, моноцитов из костного мозга, гемоциркуляторными нарушениями с развитием отечно-деструктивного синдром, индукцией рецепторно-опосредованного апоптоза клеток органов

6. Инфицирование мышей вирусом гриппа A/H5N1 приводит к стимуляции клеточного звена иммунитета с активацией кислород-независимых (протеазы) и кислород-зависимых (eNOS и iNOS-синтазы) факторов защиты в клетках различного гистогенеза, вне зависимости от выполняемых ими специфических функций, что характеризует их как единую систему противовирусной зашиты организма, с другой стороны, сопровождается лабилизацией клеточных мембран с развитием вторичной альтерации тканей органов, расширял масштабы повреждения клеток и их пролифирации, приводя к неполноценной репарации тканей с развитием фиброза органов.

7. Инфицирование мышей вирусом гриппа A/H5N1 сопряжено с масштабными по распространенности деструктивными изменениями в органах, связанными с персистенцией вируса, гемодина-мическими нарушениями и токсическими эффектами, обусловленными реакцией клеточного звена иммунитета.

А. Масштабы некроза и апоптоза, их соотношение и пути реализации при гриппе A/H5N1 зависят от длительности инфекционного процесса в различных органах: с преобладанием некротических изменений в печени, головном мозге и почках инфицированных мышей, обусловленных преимущественно гемодинамнческими нарушениями; реализацией апоптозного пути гибели клеток легких и селезенки.

Б. Основными механизмами апоптоза при гриппе A/H5N1 являются: митохондриальный, реализуемый на ранних сроках инфекционного процесса и связанный в большей степени с цитопатическим действием вирусов, рецепторно-опосредованный, обусловленный гиперсекрецией провоспалительных цитокинов, в частности, TNF-a и активацией каспазы-3 через TRAIL - домены.

8. Для вирусной инфекции A/H5N1 A/goose/Krasnaozerskoye/627/05 характерна картина ранней активации репаративных процессов в органах, проявляющаяся пролиферативной активностью альвеолоцитов, гепатоцитов, глиоцитов и эндотелиоцитов, новообразованием капилляров, заместительной регенерацией в системе соединительной волокнистой ткани. Гиперпластические процессы обусловлены активацией инфицированных клеток, экспрессирующих ростовые факторы и их рецепторы (FGF, FGFR, VEGFR). Высокий уровень пролиферации в рассматриваемых экспериментальных условиях носит двойственный характер - способствует восстановлению утраченных структур, с другой стороны - увеличивает концентрацию новых клеток, необходимых для проникновения, репликации и персистенции вируса гриппа А, способствуя тем самым прогрессированию инфекции.

9. Персистенция вируса гриппа A/H5N1 в фибробластах и макрофагах органов мышеи является триггерным фактором, «запускающим» процессы раннего и избыточного коллагенообразования. при этом процессы синтеза и протеолиза структур внеклеточного матрикса детерминированы многими факторами: персистенцией вирусов в клетках, блокадой интерферонового ответа, ишемией, ин-фильтративными изменениями с повышением гидролитического потенциала и избыточной продукцией свободных радикалов в локусах воспаления, гиперцитокинемией, численностью фибробластов и макрофагов. «Дисбаланс» этих процессов при гриппе A/H5N1, видимо, одна из причин раннего фиброза легких.

10. Модифицированный полисахарид (диальдегиддекстран) оказывает выраженный профилактический дозозависимый эффект при экспериментальном инфицировании мышей вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, который проявляется увеличением средней продолжительности жизни животных, уменьшением процента летальности, уменьшением числа инфицированных

клеток различного гистогенеза в органах мышей, прежде всего, макрофагов и фибробластов легких, уменьшением масштабов повреждения паренхиматозных органов, выраженным антифибротическим эффектом.

11. Эффекты профилактического действия диальдегиддекстрана при гриппе A/H5N1 у мышей опосредованы повышением мощности механизмов естественной резистентности макроорганизма -активацией клеток системы мононуклеарных фагоцитов, проявляющейся повышением уровня LFN-a, IFN-y за счет усиления интерферон-продуцирующей функции эффекторных клеток, нормализацией дифференцировочного потенциала и баланса между различными ростками костномозгового кроветворения, уменьшением масштабов апоптоза лимфоцитов в органах иммуногенеза, снижением внутриклеточного синтеза провоспалительных цитокинов - TNF-a, IL-6, лизосомальных протеаз (лизоци-ма. катепсина Д, миелопероксидазы), NO-синтаз, что существенно снижает масштабы гемодинамиче-ских, деструктивных, фибротических осложнений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Потаиова О.В. Патоморфогенез птичьего гриппа, обусловленного штаммами вируса H5N1, выделенными на территории России, с целью разработки средств и способов его профилактитки и лечения у млекопитающих / О.В. Потапова, В.А Шкурупий, Н.Г. Лузгина // Материалы итоговой конференции по результатам мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП по приоритетным направлениям развития НТК России за 2007-2012гг. -Москва. 2007 -С. 82-83.

2. Структурные изменения в печени мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц субтипа H5N1 / Т В. Шаркова, О.В, Потаиова, В.А. Шкурупий, А.М. Шестопалов, И Г Дроздов, Л.В. Ше-стопалова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 146 - №7,- С. 210212. (Из списка ВАК).

3. Characteristics of Morphogenesis of Pathological Changes of Mice Target Organs Developing under the influence of Highly Pathogenic Influence Vi-rus of H5N1 Subtype / А.М. Шестопалов, Jl.B. Шесто-палова, T.В. Шаркова, В.А. Шкурупий, А.В. Зайковская, О.В. Потапова // Addedum & Participants List. - The Tird European Influenza Conférence. - Portugal 14-17 September 2008. - P. 6-7.

4. Структурные изменения легких y мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц H5N1 субтипа / Л.В. Шестопалова, В.А. Шкурупий, Т В. Шаркова, О.В. Потапова, А.В. Зайковская, А.М. Шестопалов // Вестник НГУ,- 2008. - Т.6.- выпуск 3 - ч.2 - С. 3-10. (Из списка ВАК).

5. Изучение патогенности штаммов вируса гриппа птиц H5N1 субтипа, выделенных на территории Российской Федерации, на мышиной модели / А.М. Шестопалов, К.А. Шаршов, А.В. Зайковская, Ю Н. Рассадкин, И Г. Дроздов, В.А. Шкурупий, О.В. Потапова, Н.Г. Лузгина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 145,-№9 - С. 317-320. (Из списка ВАК).

6. Потапова О.В. Структурные изменения в лимфоидных органах мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц H5N1-субтипа A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 / О.В. Потапова, В.А. Шкурупий, Н.Г. Лузгина, А.М. Шестопалов, И Г. Дроздов, И.В. Одарченко // Бюллетень СО РАН .- 2008.- №5. -С 174-178. (Из списка ВАК).

7. Потапова О.В. Изучить патогенез гггичьего гриппа, обусловленного штаммами вируса H5N1, выделенными на территории России, с целью разработки средств и способов его профилактитки и лечения у млекопитающих I О.В. Потапова, В.А. Шкурупий, Н.Г. Лузгина //' Материалы итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП по приоритетным направлениям развития НТК России за 2007-2012годы». - Москва, 2008,- С. 237-238.

8. Потапова O.B. Структурно-функциональные изменения в органах иммуногенеза у мышей, инфицированных вирусом гриппа H5N1 / О.В. Потапова, Одарченко И.В., В.А. Шкурупий, Н.Г Лузгина, A.M. Шестопалов // Материалы III Съезда Российского общества патологоанатомов. - Самара, 26-30 мая 2009 г. - С. 429-431.

9. Структурные изменения в паренхиме почек мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц Н5М1-субтипа A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 / Л.А. Черданцева, О.В. Потапова, В.А. Шкурупий, A.M. Шестопалов // Материалы III Съезда Российского общества патологоанатомов. - Самара, 2630 мая 2009 г. - С. 550-552.

10. Патоморфогенез проявлений птичьего гриппа в легких и печени мышей и при его профилактике модифицированным декстраном / В.А. Шкурупий, О.В. Потапова, Н.Г. Лузгина, A.M. Шестопалов, Л.В. Шестопалова // Материалы III Съезда Российского общества патологоанатомов. - Самара, 26-30 мая 2009 г. - С. 577-579.

11. Потапова О.В. Молекулярно-клеточные основы пагоморфогенеза гриппа птиц субтипа H5N I у млекопитающих в эксперименте / О.В. Потапова, В.А. Шкурупий, A.M. Шестопалов, Т В. Шар-кова // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск, 2009.-С. 192.

12. Регенераторно-пластические процессы в печени млекопитающих при гриппе птиц A/H5N1 и его профилактике модифицированным декстраном / Т В. Шаркова, О.В. Потапова, В.А. Шкурупий,

A.M. Шестопалов // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск, 2009. - С. 289.

13. Потапова О.В. Структурные изменения в головном мозге мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 / О.В. Потапова, Т В. Шаркова, В.А. Шкурупий, A.M. Шестопалов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. —2009. - №12 — 3 С. 53-55. (Из списка ВАК).

14. Потапова О.В. Исследование профилактической эффективности окисленного декстрана и патоморфологических процессов в легких мышей при гриппе птиц A/H5N1 / О.В. Потапова,

B.А. Шкурупий, Т В. Шаркова, A.B. Троицкий, Н.Г. Лузгина, A M. Шестопалов // Бюллетень экспериментальной биологии имедицины. -2010.-Т.150.-№12.-С. 650-653. (Из списка ВАК).

15. Потапова О.В. Морфофункциональные особенности легочных макрофагов у мышей оппо-зитных линий СВА и C57Bl/6g / О.В. Потапова, Л.А. Черданцева, Т В. Шаркова, В.А. Шкурупий, Н.Г Лузгина, A.B. Ковнер // Фундаментальные исследования. - 2010. - № 10. - С. 34—39. (Из списка ВАК).

16. Morphofimctional Characteristics of the Immune System in CBA and C57Bl/6g Mice/ V.A. Shkurupiy, V.O. Tkachev, O.V. Polapova, N.G.Luzgina, J.S. Bugrimova, K S. Obedinskaya, N.S. Zaiceva, A.V. Chechushkov // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2010. - Vol.150. - N 6. - P. 725-728. (Из списка ВАК).

17. Функциональная активность легочных макрофагов мышей, инфицированных вирусом гриппа А/ H5N1 / А.В Ковнер, О.В. Потапова // Студент и научно-технический прогресс: XLIX Международная научная студенческая конференция. - 2011. - С. 28.

18. Особенности фибропластических процессов в легких мышей оппозитных линий СВА и C57Bl/6g при гриппе A/H5N1/ А.Г. Аникина, О.В. Потапова, В.А Шкурупий, A.M. Шестопалов // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: Материалы V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск, 2011. — С. 11-12.

19. Потапова О.В. Механизмы клеточной гибели в морфогенезе пзиппа A/H5N1 у млекопитающих/ О.В. Потапова, Т В Шаркова, В.А. Шкурупий, Л А. Черданцева, A.M. Шестопалов // Фундамен-

тальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: Материалы V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск, 2011. - С. 181 -182.

20. Структурные изменения в головном мозге мышей при гриппе А / Т В. Шаркова, О.В, Потапова, В. А.Шкурупий, A.M. Шестопалов // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: Материалы V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск, 2011. — С. 245-246.

21. Морфофункциональные изменения эндотелноцитов сосудов легких при гриппе A/H5N1 у млекопитающих / А.В Ковнер, А Г Аникина, О.В. Потапова // Клииические и теоретические аспекты современной медицины: Материалы IV Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - Москва. - 2012. - С. 49-50.

22. Структурно-функциональные изменения легочных макрофагов и легких мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 / A.B. Ковнер, А.Г. Аникина, О.В. Потапова, Т.В. Шаркова, J1.A. Черданцева, В.А. Шкурупий, A.M. Шестопалов II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - № 2. - С. 196-199, (Из списка ВАК).

23. Морфофункциональная характеристика фибробластов и особенности фиброгенеза в легких мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05/ А.Г. Аникина, О.В. Потапова, В.А. Шкурупий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. -Т .154.- №9.-С. 346-349. (Из списка ВАК).

24. Морфофункциональные изменения эндотелиоцитов сосудов легких при гриппе A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 у мышей / A.B. Ковнер, О.В. Потапова, В.А. Шкурупий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - № Т. 154. - №10. - С.472-475. (Из списка ВАК).

Патенты

25. Способ получения диальдегиддекстрана / В.А. Шкурупий, A.B. Троицкий, О.В. Потапова, Н.Г. Лузгина // Евразийский патент №011717 (№ 200801376,) ЕАПВ 28.04.2009.

Автор благодарит сотрудников лаборатории отдела зоонозных инфекций и гриппа (руководитель д.б.н. Шестопалов A.M.) ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (НСО, п. Кольцове) за ведение совместного эксперимента.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Cathepsin - катепсин

CD - кластер дифференцировки

DAB - 3,3 - диаминобенэядвн

eNOS - эндотелиальная синтаза оксида азота

IFN - интерферон

IL- иягерлейкин

Inf А - антитело к антигену вируса гриппа А

iNOS - индуцибельная синтеза оксида азота

Lysozyme - лизоцим

MMPs - матриксные мегаллопротеиназы

Myeloperoxidase - миелопероксидаза

PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток

TIMP-2 - тканевой ингибитор металлопротеиназ

TNF- фактор некроза опухолей

TRAIL — TNF-related apoptosis-inducing ligand (ФНО - связанный апогтгоз индуцирующий лиганд)

ВГ-вирус гриппа

ДАД - диальдегиддекстран

ИГХ- иммуногисто химический

ИФА - иммуноферментный анализ

МЛДи - мышиная летальная доза, при применении которой погибает 50% мышей СПЖ - средняя продолжительность жизни

Соискатель ✓ -— Потапова О.В.

2-21673

2012351082

Подписано к печати 11.10.2012 формат • 60x84 1/8, Усл. печ. л 2 Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа № 536 Типография ООО "Типография ЮГУС", ИНН 5402548639, г. Новосибирск, ул. Эалесского, 4, тел.: (383) 226-14-56,225-04-47

2012351082

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора медицинских наук, Потапова, Оксана Валентиновна, Новосибирск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР КЛИНИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ» СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАМН

05^01дЬ0м65 на правах рукописи

ПОТАПОВА ОКСАНА ВАЛЕНТИНОВНА

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ, МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ ОСНОВЫ ПАТОГЕНЕЗА ГРИППА А/Н5№ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ОСОБЕННОСТИ ЕГО РАЗВИТИЯ ПРИ ПРОФИЛАКТИКЕ МОДИФИЦИРОВАННЫМ ДЕКСТРАНОМ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.03.02 - патологическая анатомия

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Шкурупий Вячеслав Алексеевич

Новосибирск - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ............................................................................6

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................................................8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................19

1.1 Классификация вирусов гриппа..................................................................................................................19

1.2 История возникновения и распространения вирусов гриппа А/Н51ч[1......................20

1.3 Общие сведения о вирусах гриппа типа А..........................................................................................23

1.3.1 Строение и химический состав вириона..........................................................................................23

1.3.2 Факторы патогенности вирусов гриппа А......................................................................................26

1.3.3 Проникновение вируса в клетку и его репродукция............................................................29

1.3.4 Роль изменчивости в патогенности вирусов гриппа А......................................................31

1.4 Вирулентность вирусов гриппа А/Н5М1 для млекопитающих и человека............33

1.5 Патогенез гриппа А/Н5№ у млекопитающих животных и человека........................35

1.5.1 Морфогенез гриппа А на моделях млекопитающих............................................................36

1.5.2 Клинико-морфологическая картина заболевания у человека......................................38

1.5.3 Противовирусный иммунитет и особенности иммунного ответа при гриппе А/Н51Ч1......................................................................................................................................................................42

1.5.4 Особенности фиброгенеза при гриппе А/Н5]ЧГ1 и его регуляция..............................51

1.6 Вопросы лечения и профилактики гриппа А..................................................................................55

1.6.1 Вакцины........................................................................................................................................................................55

1.6.2 Противовирусные препараты....................................................................................................................58

1.6.3 Применение иммуномодулирующих препаратов при вирусных инфекциях 60

1.6.4 Влияние декстранов на иммунный ответ........................................................................................62

1.6.5 Биологические свойства окисленных декстранов..................................................................67

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................................................................70

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ................................................................................80

3.1 Исследование патогенности для млекопитающих (по показателю летальности и средней продолжительности жизни) штамма вируса гриппа A/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoy е/627/05................................................... 80

3.2 Исследование топологии вируса гриппа A/H-5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в органах мышей в динамике инфекционного процесса........................................................................................... 81

3.3 Патоморфологические особенности развития инфекционного процесса в органах млекопитающих, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.............................................................. 92

3.3.1 Структурные изменения в органах дыхательной системы мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1................................................ 92

3.3.2 Структурные изменения в печени мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05......................................... 104

3.3.3 Структурные изменения в паренхиме почек мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.............................. 108

3.3.4 Структурные изменения в головном мозге мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 ............................. 112

3.3.5 Структурные изменения в органах иммуногенеза мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05...... 117

3.3.6 Морфогенез инфекционного процесса, индуцированного вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.................................................. 125

3.4 Молекулярно-клеточные основы патогенеза гриппа A/H5N1 у млекопитающих................................................................................. 126

3.4.1 Исследование роли про- и противовспалительных цитокинов в проявлениях патогенности вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05............................................................. 126

3.4.2 Исследование кислород-независимых факторов защиты клеток органов мышей после инфицирования вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.............................................................. 140

3.4.3 Исследование кислород-зависимых факторов защиты клеток органов мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н51Ч1 А/^оо8е/Кга8поогег8коуе/627/05.............................................................. 154

3.4.4 Пути реализации гибели клеток в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1 А^оозе/КгаБпоо2ег8коуе/627/05, и их роль в морфогенезе инфекционного процесса..................................................... 164

3.4.5 Особенности фиброгенеза в органах мышей в динамике развития гриппа А/Н5Ш............................................................................................. 173

3.4.6 Патогенетические аспекты гриппа А/Н5Ы1 А/§ооБе/Кга8поо2ег8коуе/627/05. 189

3.5 Патогенетическое обоснование профилактики гриппа А/Н51Ч1 у млекопитающих с применением модифицированного полисахарида

(диал ьдегиддекстрана)......................................................................... 192

3.5.1 Исследование профилактической эффективности диальдегиддекстрана у мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5М1 А/§оо8е/Кга8поогег8коуе/627/05, выбор оптимальной дозы............................ 194

3.6 Молекулярно-клеточные особенности гриппа А/Н5ТЧ1 у мышей при профилактическом внутривенном введении диальдегиддекстрана.................. 195

3.6.1 Исследование топологии вируса гриппа А/Н5Ы1 А/§оо8е/Кгазпоо2ег8коуе/627/05 в органах мышей после профилактического введения ДАД....................................................................................... 195

3.6.2 Структурные изменения в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н51Ч1 А^оо8е/Кга8поогег8коуе/627/05 после профилактического введения ДАД.................................................................................... 201

3.6.3 Структурные изменения в органах иммуногенеза мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1 А/§оо8е/Кга8поогег8коуе/627/05 после профилактического введения ДАД.................................................. 213

3.6.4 Исследование цитокинового профиля мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н51ЧГ1 А^оо8е/Кга8поо2ег8коуе/627/05 после профилактического введения ДАД.................................................................................... 217

3.6.5 Исследование кислород-независимых факторов защиты клеток органов мышей при инфицировании вирусом гриппа А/Н5№ А/§оо8е/Кгазпоо2ег8коуе/627/05 после профилактического введения ДАД........ 224

3.6.6 Исследование кислород-зависимых факторов защиты в органах мышей при инфицировании вирусом гриппа А/Н5Ы1 А/§оозе/Кга8поогегБкоуе/627/05 после профилактического введения ДАД.................................................. 229

3.6.7 Особенности фиброгенеза в легких мышей при инфицировании вирусом гриппа А/Н51М1 А/^оо8е/Кга8поогег8коуе/627/05 после профилактического введения ДАД.................................................................................... 235

3.6.8 Профилактические эффекты диальдегиддекстрана при экспериментальной инфекции, индуцированной вирусом гриппа А/Н51чП

А/^оо8е/Кга8поогег8коуе/627/05.............................................................. 240

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................. 245

ВЫВОДЫ.......................................................................................... 251

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................... 255

ПРИЛОЖЕНИЕ.................................................................................. 305

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Cathepsin D - катепсин Д

CD - кластер дифференцировки

eNOS - эндотелиальная синтаза оксида азота

FGF - фактор роста фибробластов

FGFR - рецептор к фактору роста фибробластов

НА - гемагглютинин

IFN - интерферон (interferon)

IL - интерлейкин (interleukin)

InfA - антиген вируса гриппа А

iNOS - индуцибельная синтаза оксида азота

Lysozym - лизоцим

MDCK - Madin-Darby canine kidney

MMPs - матриксные металлопротеиназы

Myeloperoxidase - миелопероксидаза

NA — нейраминидаза

NO - оксид азота

OIE - Office International des Epizzoties

PCNA - proliferating cell nuclear antigen (ядерный антиген пролиферирующих клеток)

TGF - transforming growth factor (трансформирующий ростовой фактор) TIMP - тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ TNF-a - tumor necrosis factor а (фактор некроза опухоли a)

TRAIL - TNF-a-related apoptosis-inducing ligand (ФНО-связанный апоптоз индуцирующий лиганд)

VEGFR - рецептор к сосудистому фактору роста

WHO - World Health Organization (ВОЗ - Всемирная организация

здравоохранения)

ВКМ - внеклеточный матрикс

ДАБ - диаминобензидин ДАД - диальдегиддекстран

ДВС - диссеменированное внутрисосудистое свертывание ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИГХ - иммуногистохимия

МИД50 - мышиная инфекционная доза, при применении которой инфицируется 50% мышей

МЛД5о - мышиная летальная доза, при применении которой погибает 50% мышей

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота РЭС - ретикуло-эндотелиальная система СМФ - система мононуклеарных фагоцитов СПЖ - средняя продолжительность жизни

ЭИД50 - эмбриональная инфекционная доза, при применении которой

инфицируется 50% эмбрионов ЭПС - эндоплазматическая сеть

ВВЕДЕНИЕ

Грипп занимает особое место в инфекционной патологии человека, не имея себе равных по распространенности и частоте заболеваний. Из известных в настоящее время родов вирусов гриппа типов А, В и С, значимое эпидемическое значение имеют вирусы типа А, обладающие наибольшим количеством антигенных вариантов, большой вирулентностью и контагиозностью и являющиеся причиной крупных эпидемий и пандемий гриппа (Korteweg С., Gu J., 2008; Taubenberger J.К., Morens D.M., 2006).

Среди многообразия штаммов вируса гриппа А выраженной патогенностью обладают субтипы Н5, Н7 и Н9 (Subbarao К. et al. 2000; Webby R., Webster R., 2001). Особый интерес представляет возбудитель гриппа A/H5N1, характерными особенностями которого является широкая географическая распространенность, высокая патогенность для человека, приводящая к тяжелому заболеванию с высокой смертностью при отсутствии специфического иммунитета в человеческой популяции (То K.F. et al., 2001; Pei F. et al., 2005; Suzuki Y., 2005). По пандемическим потенциям высокопатогенный вирус гриппа A/H5N1 в течение последних лет, с момента его первого выделения от гуся в 1996 году, а затем от погибшего человека в 1997 году в Китае (Murphy B.R., Webster R.G., 1996) фактически не изменился. По данным ВОЗ на 10 августа 2012 года заболеваемость человека гриппом A/H5N1 зарегистрирована в 62 странах мира, а общее количество вирусологически подтверждённых случаев заболевания людей, вызванного штаммами гриппа A/H5N1, составило 608, из которых 359 (60%) закончились летальным исходом. При этом среди детей до 15 лет летальность при гриппе A/H5N1 достигает 89% (www.who.int/ru/, 2012).

По оценке ВОЗ благодаря постоянной эволюции вирусов гриппа А, высокой плотности населения в местах активной циркуляции вируса гриппа A/H5N1, его способностью к прямой передаче от птиц к человеку, возможности реассортации с адаптировавшимися в человеческой популяции вирусами,

существует постоянная угроза возникновения пандемии (Шварсалон Н.К. и др., 2009; Shortridge K.F. et al., 1998; www.who.int/ru/, 2012).

В 2005 году произошла экспансия гриппа на территорию России. В 2005 году в с. Суздалка Новосибирской области Российской Федерации был впервые зафиксирован падеж домашней птицы, который был вызван вирусом гриппа А/ H5N1. Данные филогенетического анализа изолятов, выделенных на территории Новосибирской области, показали их высокую патогенность для млекопитающих (Evseenko V.A. et al., 2007), что позволяют говорить об исключительно важном значении юга Западной Сибири в распространении высокопатогенных вирусов A/H5N1 в Евразии (Онищенко Г.Г. и др., 2004; Онищенко Г.Г. и др., 2006).

Несмотря на многочисленные исследования, проведенные за последние 10 лет, механизмы высокой вирулентности новых рекомбинантных высокопатогенных штаммов вируса гриппа A/H5N1 остаются малоизученными. Имеющиеся в современной литературе данные не дают полноценного представления о механизмах развития заболевания и его осложнений, что диктует необходимость дальнейшего изучения патогенетических аспектов, особенно для новых, ранее неисследованных штаммов, в частности, выделенных на территории Российской Федерации.

Комплексное исследование на молекулярно-клеточном уровне структурно-функциональных особенностей клеток органов-мишеней у млекопитающих при гриппе A/H5N1 является необходимым условием для понимания основных механизмов развития вирусной инфекции и важнейших ее проявлений, обусловливающих высокую летальность у людей и животных. Это позволит улучшить проспективное прогнозирование исходов инфекционного заболевания и разработать принципиально новые патогенетически обоснованные подходы к профилактике и лечению гриппа A/H5N1 у людей.

Известные современные специфические вакцины и отдельные противогриппозные препараты оказались малоэффективными для лечения и

профилактики инфекции, вызванной высокопатогенными вирусами гриппа A/H5N1. Высокая антигенная вариабельность, свойственная вирусам гриппа А, отсутствие специфических вакцин, нерациональная фармакотерапия приводят к быстрому развитию лекарственноустойчивых циркулирующих штаммов и появлению новых штаммов, резистентных к основным противовирусным препаратам (Desheva J.A. et al., 2004; Cheung C.L. et al., 2006; Ilyushina N.A. et al., 2010). Все это определяет особую значимость разработок по созданию новых эффективных средств неспецифической профилактики гриппа А, не оказывающих прямого действия на вирус, что исключало бы возможность возникновения лекарственной резистентности.

С этой целью в современные схемы терапии и профилактики гриппа и ОРВИ включают интерфероны (Watowich S.J. et al., 1994; Cauthen A.N. et al., 2000; Randall R.E., Goodbourn S., 2008) и их индукторы (Ершов Ф.И., Киселев О.И., 2007). Но при их применении не исключены побочные эффекты и развитие гипореактивности при повторном введении (Ершов Ф.И., Киселев О.И., 2005). Следовательно, перспективными для профилактики и лечения гриппа у млекопитающих и человека могли бы стать препараты, способные одновременно индуцировать выработку эндогенных интерферонов и активировать клетки системы мононуклеарных фагоцитов.

Такими средствами являются иммуномодуляторы микробного происхождения, в частности, модифицированные полисахариды (окисленные декстраны), которые способны повышать функциональную активность клеток моноцитарно-макрофагальной системы (Шкурупий В. А., 2007). Однако, исследований, направленных на изучение эффективности этих веществ при вирусных инфекциях и, в частности, при гриппе A/H5N1 у млекопитающих и человека не проводили.

На основании вышеизложенного были сформулированы цель и задачи данного исследования.

Цель исследования: изучить патоморфогенез гриппа А/Н5Ш А^оо8е/Кга8поо2ег8коуе/627/05 у мышей и его молекулярно-клеточные проявления при профилактике модифицированным декстраном.

Задачи исследования:

1. Исследовать патогенность вируса гриппа А/Н5Ы1 А/§оозе/Кга8поо2егзкоуе/627/05 для млекопитающих на мышиной модели.

2. Исследовать топологию вируса в клетках легких, печени, почек, селезенки, головного мозга мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1 А/§оо8е/Кга8поогег8коуе/627/05, на разных сроках заболевания методом иммуногистохимии.

3. Исследовать морфофункциональные изменения в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5№ А/§оо8е/Кгазпоо2ег8коуе/627/05, и особенности морфогенеза вирусной инфекции.

4. Исследовать роль про- и противовоспалительных цитокинов в патогенезе гриппа А/Н51чГ1 по цитокиновому профилю инфицированных мышей в сыворотке крови и в клетках органов в динамике развития вирусной инфекции.

5. Исследовать молекулярно-клеточные пути реализации клеточной гибели в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1 А^оо8е/Кга8поогег8коуе/627/05.

6. Изучить динамику фибротических проявлений в органах инфицированных мышей и молекулярно-клеточные механизмы их регуляции при гриппе А/Н5М1.

7. Сформулировать патогенетическое обоснование профилактики гриппа А/Н5Ы1 модифицированным декстраном (диальдегиддекстраном) на основе полученных данных о патогенезе вирусной инфекции, изучить его профилактическую эффективность для мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1 А^оозе/Кга8поо2ег8коуе/627/05.

8. Исследовать особенности иммунологических реакций у мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ы1 А^оозе/Кга8поо2ег8коуе/627/05, при профилактике диальдегиддекстраном.

9. Изучить структурно-функциональные проявления гриппа А/Н5И1 в органах инфицированных животных после профилактического введения им диальдегиддекстрана.

Научная новизна. В ходе эксперимента впервые методом иммуногистохимии выявлены особенности топологии вируса гриппа А/Н51Ч1 А/§оо8е/Кга8поогег8коуе/627/05 в динамике развития вирусной инфекции. Показана пролонгированная пе

Информация о работе

Потапова, Оксана Валентиновна
доктора медицинских наук
Новосибирск, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Патоморфологические, молекулярно-клеточные основы патогенеза гриппа A/H5N1 у млекопитающих и особенности его развития при профилактике модифицированным декстраном - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы