Разработка средств диагностики высоковирулентного штамма вируса гриппа A подтипа H5N1

Аканина, Дарья Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка средств диагностики высоковирулентного штамма вируса гриппа A подтипа H5N1
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка средств диагностики высоковирулентного штамма вируса гриппа A подтипа H5N1"

На правах рукописи

Аканина Дарья Сергеевна

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА Н5Ш

03.02.02 — вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

17 ДПР 2С1{

Москва - 2014 005547080

005547080

Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (РУДН)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Гребенникова Татьяна Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Глухов Александр Иванович,

заведующий лабораторией молекулярных основ онкогенеза НИЦ «Курчатовский Институт»

доктор биологических наук

Михайлович Владимир Михайлович,

ведущий научный сотрудник лаборатории

биологических микрочипов ФГБУ "Институт

молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта"

РАН

Ведущая организация:

ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ

Защита состоится «22» мая 2014 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова» Российской академии медицинских наук по адресу: 105064, г. Москва, пер. Малый Казенный, д.5А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан апреля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

<32

Яковлева Ирина Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Вирус гриппа А подтипа H5N1 - высоко патогенный вирус «птичьего гриппа» - впервые инфицировал человека в 1997 году во время вспышки болезни среди домашних птиц в Гонконге (Claas et.al.,1998; Shortridge et al.,1998). В 2003 и

2004 годах этот вирус распространился из Азии в Европу и Африку и циркулировал среди птиц во многих странах, что привело к сотням случаев заболевания людей, в том числе и со смертельным исходом (Guan et al., 2009). Вспышки болезни среди домашних птиц оказывают серьезное воздействие на экономику и международную торговлю в пораженных странах. Продолжающаяся циркуляция вирусов H5N1 среди домашних птиц, особенно там, где этот вирус является эндемическим, по-прежнему представляет угрозу для общественного здравоохранения (WHO, 2011), так как эти вирусы обладают не только способностью вызывать тяжелое заболевание у людей, но и преодолевать межвидовой барьер (Manz et al., 2013; Webster et al., 2007).

9 января 2014 года ВОЗ сообщила о подтверждённом случае заболевания гриппом, вызванным вирусом A/H5N1 в Канаде у человека, приехавшего из Пекина. Всего в мире с 1997 года зарегистрировано 649 случаев заболевания людей гриппом, вызванным вирусом H5N1, 385 из которых с летальным исходом. Таким образом, смертность от гриппа, вызванная вирусом H5N1, составляет почти 60% (WHO, 2014). В нашей стране пока не зарегистрировано ни одного случая заболевания человека гриппом, вызванным вирусом H5N1. Первая вспышка «птичьего гриппа» среди домашней птицы в России произошла в июле

2005 года в Новосибирской области (Львов и др., 2005) и была связана с миграцией водоплавающих птиц из стран Азии на территорию нашей страны.

ключевую роль в выявлении и типировании вирусов гриппа (Alexander, 2008, Thanh et al., 2010). Совокупность чувствительных и специфичных современных отечественных тест-систем для качественного и количественного выявления генома вируса гриппа H5N1 на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени, а также методов выявления антител к данному вирусу может существенно облегчить экологический мониторинг с целью предупреждения возможной пандемии.

Цель и задачи исследования

Целью исследования была разработка и усовершенствование методов лабораторного выявления вируса гриппа А подтипа H5N1 и антител к нему.

Задачи исследования:

1. Разработать и оптимизировать молекулярно-генетический метод обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР, проверить чувствительность и специфичность и на основании этих данных создать «Тест-систему для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР» и нормативную документацию к ней (СТО и Инструкцию по применению);

2. Разработать и оптимизировать молекулярно-генетический метод обнаружения и количественного определения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР в реальном времени, проверить его чувствительность и специфичность;

3. Разработать генно-инженерные положительные контроли на основе плазмиды pGEM-T Easy, содержащие клонированные участки генома вируса гриппа А подтипа H5N1;

4. Показать возможность использования метода количественного определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 для контроля на стадиях получения рекомбинантных вирусов гриппа методом обратной генетики.

5. Показать возможность использования разработанных тест-систем для обнаружения и дифференциации высоковирулентного вируса гриппа А подтипа H5N1 в биологических образцах от птиц, собранных в различных регионах РФ;

6. Получить рекомбинатный белок NS1 на основе вектора рЕТ32Ь+ с последующей химической трансформацией штамма Е. Coli BL21trxB(DE3)pLysS, накоплением и выделением методом метало-хелатной аффинной хроматографией с использованием Ni-NTA агарозы.

7. Разработать методику обнаружения антител к рекомбинантному неструктурному белку NS1 вируса гриппа А подтипа H5N1 на основе непрямого ИФА.

Научная новизна работы

Созданы отечественные тест-системы на основе ПЦР и ПТ TP-PR для диагностики вируса гриппа А подтипа H5N1 с учетом генотипов вируса, циркулирующих на территории Российской Федерации. Достигнута высокая эффективность применения молекулярно-генетических методик мониторинга вируса гриппа А подтипа H5N1 среди диких и домашних птиц в различных районах РФ. Разработанные тест-системы являются универсальными и позволяют детектировать все известные на сегодняшний день генотипы вируса гриппа А подтипа H5N1.

Получен Российский патент № 2361924 «Способ обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1».

Разработки могут быть использованы в лабораториях Научно-исследовательских институтов в целях изучения эволюции вируса гриппа А подтипа H5N1 для предупреждения возможной пандемии.

Впервые показана возможность использования метода количественного определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени для контроля получения рекомбинантного вируса гриппа H5N1 методом обратной генетики.

Показана возможность применения непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку NS1 вируса гриппа А подтипа H5N1 для

дифференциации инфицированных и вакцинированных инактивированной вакциной птиц.

Практическая значимость

Для «Тест-системы для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР» разработаны СТО 42418073-0001-2007 и Инструкция по применению от 21. 05. 2009 №1-4.7/02562, которые утверждены в Министерстве Сельского хозяйства РФ. Данная тест-система сертифицирована во Всероссийском Государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»), сертификат соответствия № РОСС 1Ш.ФВ01.Н26634.

Разработанные тест-система и методики на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени использованы при проведении Международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP) по молекулярной диагностике гриппа в 2007-2011 г.г. Получен международный сертификат от 31.10. 2011 г.

Сконструированные генно-инженерные положительные контроли, содержащие фрагменты генома вируса гриппа А подтипа H5N1, могут быть использованы в лабораторных и коммерческих тест-системах для качественного и количественного контроля определения генома высоковирулентного вируса гриппа А подтипа H5N1 в научных и клинических лабораториях.

Разработанные методики и «Тест-система для диагностики вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР» используются в региональных ветеринарных лабораториях, в диагностических лабораториях Роспотребнадзора и Минсельхоза РФ для проведения мониторинга вируса гриппа А подтипа H5N1. Тест-системы могут также быть использованы для проведения научно-практических занятий в Университетах и Институтах Минздрава РФ.

Методика обнаружения антител к рекомбинантному неструктурному белку вируса гриппа NSlra основе непрямого ИФА может быть использована

для дифференциального выявления вакцинированных инактивированной вакциной и инфицированных птиц.

Основные положения, выносимые на защиту

Создана и предложена в практику здравоохранения тест-система для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 («птичий грипп») и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР.

Разработан молекулярно-генетический метод обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

Выработана методика количественного определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР-РВ, которая может быть использована для контроля накопления рекомбинантного вируса гриппа A/H5N1, полученного методом обратной генетики.

Синтезирован рекомбинантный белок NS1 на основе вектора рЕТ32Ь+ с последующей химической трансформацией штамма Е. Coli BL21trxB(DE3)pLysS, очищенный метало-хелатной аффинной хроматографией с использованием Ni-NTA агарозы для использования его в качестве специфического компонента в ИФА.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006); итоговой конференции СНО медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты современной медицины (Москва, 2007); IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 2007); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Ю.М. Кубицкого «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и

химико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 2007); научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы инфекционной патологии человека» (Минск, 2012), на совместном заседании кафедры фармхимии медицинского факультета РУДН и отдела прикладной вирусологии ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского» МЗ РФ (Москва 2013)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ, в том числе 8 статей в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендуемых ВАК, 1 патент РФ.

Объём и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 160 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 148 источников, в том числе 112 иностранных, 4 приложений. Работа иллюстрирована 30 рисунками и 11 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. В качестве исследуемого материала были использованы эталонные штаммы вируса гриппа А, любезно предоставленные руководителем лаборатории физиологии вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава РФ, академиком РАМН, проф. Н.В. Кавериным (табл.1) и штаммы вируса гриппа В, любезно предоставленные руководителем лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава РФ, доктором биологических наук Е.И. Бурцевой (табл.1).

Таблица 1. Характеристика штаммов вируса гриппа А и В, использованных в данной работе___

JV« Тнп вируса Назвавие штамма

1 A(H3N2) А/Москва/54/89

2 А/Сичуань/2/87

3 А/СССР/382/86

4 А/Владимир/137/03

5 А/Владимир/34/05

б А/Томск/26/04

7 А/Москва/11/03

S А/Филиппины/2/82

9 A(H1N1) А/СССР/90/77

10 А/Пекин/262/95

11 А/Новая Каледония/20/99

12 А/Хабаровск/51/05

13 А/Ставрополь/5 6/05

14 В В/Виктория/2/87

15 В/Москва/1/04

16 A(H1N1) A/WSN/33

17 A(H2N3) А/Шилохвость/Приморье/695/76

18 A(H2N9) А/Черноголовый Хохотун/№/75/85

19 A(H3N8) А/Утка/У краина/1/63

20 A(H4N6) А/Утка/ЧССР/56

21 A(H5N2) A/Mallard/Pensy lvania/10218/84

22 A(H7N1) A/FPV/Росток

23 A(H9N2) A/Swine/Hong Kong/9/98

24 A(H10N7) А/Цыпленок/Германия/49

25 A(H13N2) А/Кит/Мэйн/328/84

26 A(H5N1) A/Grebe/Novosibirsk/29/05

27 A(H5N1) А/курица/Покров/09

Полевые образцы от птиц были собраны в Новосибирской, Астраханской, Ростовской областях; республиках Калмыкия, Бурятия, Тыва; Приморском и Краснодарском крае с середины 2005 по 2008 гг. Образцы представляли собой клоакальные и трахеальные смывы и 10%-ные суспензии внутренних органов (мозг, печень, селезенка), суспендированные в растворе гуанидинтиоцианата и замороженные в жидком азоте.

Сыворотки для исследования: референтные сыворотки от кур, инфицированных вирусом A/H5N1 (LPAI), были предоставленны др. Д. JI. Суарэсом (USDA Agricultural Research Service (USDA-ARS), South East Poultry Research Laboratory, Атенс, Джорджия, США), а также сыворотки были получены после вакцинации кур инактивированной эмульгированной вакциной против гриппа птиц типа А подтипа Н5 «Флупротект Н5» производства ФГУП «Ставропольская Биофабрика» (серия 040306).

Нуклеотидные последовательности генов гемагглютинина и нейраминидазы были получены из банков данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) и ISD (Influenza Sequence Database, www.flu.lanl.gov). Для подбора олигонуклеотидов (праймеров) использовали программы PrimerQuest (ШТ), Lasergene (версия 6.0), BioEdit (версия 7.00) и Amplify (версия 1.06 Univers, of Wisconsin, Genetics, Madison).

ПЦР проводили в объёме 25 мкл. Реакционная смесь содержала Юммоль Tris-HCl (pH 9.0), 50 ммоль KCl, 0.1% Triton Х-100, 1.5ммоль MgCl2, Юпмоль каждого праймера, 0.25ммоль каждого dNTP, 1.25ед. Taq-полимеразы и 5 мкл выделенной ДНК. Результаты ПЦР анализировали методом электрофореза в агарозном геле. Программа ПЦР: 1 цикл: 50°С-40 мин., 95°С-1 мин.; 30 циклов: 95°С-20 сек., 57°С-20сек., 72°С-20 сек.; 1 цикл: 72°С-5 мин.

ПИР-РВ проводили в объёме 25 мкл. Реакционная смесь содержала Юммоль Tris-HCl (pH 9.0), 50 ммоль KCl, 0.1% Triton Х-100, 1.5ммоль MgCl2, Юпмоль каждого праймера, 5пмоль зонда, 0.25ммоль каждого dNTP, 1.25ед. Taq-полимеразы и 5 мкл матрицы ДНК. Постановку ПЦР в реальном времени и учёт результатов проводили с использованием детектирующего амплификатора ДТ-96 (НПО «ДНК-Технология», Россия). Программа ПЦР-РВ: 1 цикл: 50°С-40 мин.,95°С-3 мин.; 40 циклов: 95°С-20 сек., 57°С-20 сек., 72°С-60 сек.

Конструирование рекомбинантных плазмид Матрицей для синтеза специфических фрагментов был референтный штамм вируса гриппа А подтипа H5N1 A/Grebe/Novosibirsk/29/05. Амплифицированные фрагменты ДНК выделяли из геля с использованием набора для очистки ПЦР-продуктов («Fermentas», Литва) согласно методике производителя. Для получения рекомбинантных плазмид использовали плазмидный вектор pGEM T-Easy («Promega», США). Для выделения плазмидной ДНК использовали набор фирмы «Promega», (США). Массовую концентрацию раствора рекомбинантной плазмиды определяли на спектрофотометре при длине волны А.=260 нм. Молекулярную концентрацию п (молекул/мкл) рассчитывали из массовой по формуле: П = (С * NA) / (Хп. О. х Ml П. О.), где п (молекул/мкл) - молекулярная

концентрация плазмиды; С (г/мкл) - массовая концентрация плазмиды в растворе; NA = число Авогадро; X п. о. = число пар нуклеотидных оснований (п. о.) в составе плазмиды; Ml п. о. = 660 (г/моль) - средняя молярная масса 1 п.о.

Получение рекомбинантного белка NS1. Продукт ПЦР встраивали в вектор pET32b+ ("Novagen", США) и использовали для химической трансформации штамма Е. Coli BL21trxB(DE3)pLysS. Рекомбинантный белок очищали из биомассы клеток Е. coli с использованием NI-NTA агарозы (Qiagen, США) в нативных и денатурирующих условиях. Наличие белка NS1 в каждой фракции определяли методом непрямого ИФА с МКА против гистидина. Степень чистоты полученных препаратов проверяли методом SDS-электрофореза в 12% полиакриламидном геле. Концентрацию белка в растворах определяли с использованием коммерческого набора "Micro ВСА Protein Assay Kit" фирмы "PIERCE" (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР

Основой для разработки молекулярно-генетического метода обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 стал поиск консервативных участков вирусного генома, специфичных вирусу гриппа А подтипа H5N1. Для этого использовали множественное выравнивание более 10000 нуклеотидных последовательностей генов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) из базы данных NCBI.

При выборе мест посадки праймеров учитывались следующие требования: специфичность праймеров для всех последовательностей вирусов подтипа H5N1, отсутствие перекрестной гибридизации с последовательностями генома вирусов других подтипов и родственных вирусов, отсутствие формирования дуплексов праймеров (табл. 2).

В результате совмещенной реакции обратной транскрипции и амплификации (ОТ-ПЦР) синтезируется фрагмент гена НА размером 184 пары нуклеотидов (п.н) и фрагмент reHaNA размером 213 п.н.

Таблица 2. Олигонукпеотидные последовательности праймеров для ОТ-ПЦР

Название праймера Последовательность олигонуклеотидов (5' - 3') Позиции в геноме

Для обнаружения РНК гена ЫА вируса гриппа А подтипа Н51М1

Р-Ж СЛСААСАТТЛАТОАСТГОТССТ 484-506

Я-Ы1 ТСТСАСТАТСТТОТТССТССАА 675-697

Для обнаружения РНК гена НА вируса гриппа А подтипа Н5М1

Р-Н5 АСААваТСССАСТАСАССТТ 1442-1462

Л-Н5 АТГСАТТССААТТТТАСТССАС 1605-1627

Эффективность и специфичность тест-системы проверена на референтных штаммах вируса гриппа (табл. 1).

Результаты исследования эпидемических штаммов вируса гриппа, выделенных от людей, показали, что с помощью разработанной тест-системы можно выявить геном вируса гриппа А подтипа N1. Специфичность тест-системы также была проверена с эпидемическими и эталонными штаммами вируса гриппа А, выделенными от животных, в том числе и от птиц. Показано наличие РНК вируса гриппа А подтипа Н5 в эталонных штаммах А/Ма11агс1/Реп8у1уаша/10218/84 и А/ОгеЬе/№>У081Ып>к/29/()5, а также РНК вируса гриппа А подтипа N1 в эталонных штаммах АЛУБЫ/ЗЗ, А/РРУ/Росток и А/0геЬе/К0У081Ыг8к/29/()5. При обнаружении РНК вируса гриппа А подтипа N1 положительные результаты были получены с эпидемическими штаммами А/СССР/90/77 (НШ1) и АЛУБШЗ (НШ1), хранившимися в замороженном состоянии длительное время (несколько лет при -70°С). Показано, что нет перекрестных реакций с вирусами других семейств (Рагатухомтйае, Corona.virid.ae, В1та Утс1ае).

Для определения аналитической чувствительности разработанного метода использовали образец вируса А/СгеЬе/Ноуо51Ыгек/29/05 с начальным титром 105 ЭИДо/мл. Готовили серию последовательных десятикратных разведений образца вируса (рис. 1).

Предел обнаружения РНК вируса гриппа подтипа Н5 составляет 102 ЭИД50/мл, а подтипа N1 - 103 ЭИД50/мл, соответственно.

3 4 •» ш

5 6

А Б

Рисунок - 1. Детекция РНК вируса гриппа А подтипа Н5 (А) и N1 (Б).

1.Исходный Вирус гриппа A/H5N1 (10s ЭИД5о/мл). 2-6 - разведения вируса гриппа A/H5NI от 104 ЭИД50/мл do 1 ЭИДя/мл.

При проведении диагностики с помощью ПЦР тест-систем важным

условием является наличие «положительного» и «отрицательного» контролей

(Kwok S., 1989). «Отрицательный» контроль подразумевает отсутствие

матрицы для наработки специфичного фрагмента кДНК и служит для проверки

аккуратности выполнения анализа и отсутствия контаминации, а

«положительный» контроль - для правильной интерпретации результатов ПЦР.

В качестве положительного контроля обычно используется референтный

штамм вируса. Наличие высоковирулентного вируса A/H5N1 в качестве

контроля недопустимо, поэтому был сконструирован генно-инженерный

«положительный» контроль - искусственный вектор (плазмида), с

клонированым участком гена, имеющим места посадки специфических

праймеров. Фрагмент гена НА вируса гриппа А подтипа H5N1 размером 184

п.н. и фрагмент гена NA вируса гриппа А подтипа H5N1 размером 213 п.н.

вируса A/Grebe/Novosibirsk/29/05 клонировали в плазмиду pGEM-T Easy и

получили 2 рекомбинантные плазмиды pGEM-H5 и pGEM-Nl соответственно.

После трансформации компетентных клеток E.coli провели скрининг клонов

методом ПЦР с последующим секвенированием полученных ПЦР-продуктов.

Массовую концентрацию плазмид определяли спектрофотометрически при

длине волны 1=260 нм. Среднее значение концентраций рассчитывали по

результатам 6-ти измерений (табл. 3). Плазмиды в десятикратных разведениях

использовались в качестве матрицы при постановке ОТ-ПЦР.

Таблица ¡.Массовые и молекулярные концентрации рекомбинантных плазмид

Исследуемый образец Массовая концентрация, мкг/мкл Средняя массовая концентрация, мкг/мкл Молекулярная концентрация, молекул/мкл

0,205

0.200

плазмида рвЕМ-Ш 0,195 0,198 0,203 0,201 0,2+0,005 5,7 х Ю7

0,207

0,203

плазмида рСЕМ-Ы1 0,202 0,205 0,208 0,204 0,205+0,003 5,8 х 10?

На основе представленных данных разработана «Тест-система для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипа Н5Ш методом ПЦР». Проведены испытания разработанной тест-системы, совместно с Всероссийским государственным Центром качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ») и разработан пакет разрешительных документов: СТО 42418073-0001-20076262199 и Инструкция по применению тест-системы, утвержденные в Министерстве Сельского хозяйства РФ. Данная тест-система запатентована и имеет сертификат соответствия № РОСС 1Ш.ФВ01.Н26634.

2. Разработка тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5Ш методом ПЦР в реальном времени Для проведения ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) подобраны олигонуклеотидные праймеры на основе сравнительного анализа геномов различных штаммов вируса гриппа А подтипа Н5№. При выборе оптимальных праймеров обращали внимание на то, чтобы их температуры плавления различались не более чем на 2°С, а Тш зонда была на 10°С выше Тт праймеров. Для системы детекции были использованы излучатель флуоресцентного сигнала БАМ и гаситель ВНСД.

В результате реакции обратной транскрипции и амплификации синтезировали отрезок генома гена ЫА размером 198 п.н. и гена НА размером 173 п.н.

Таблица 4,Олигонуклеотидные последовательности праймеров для ПЦР-РВ

Название праймера Последовательность олигонуклеотидов (5' - 3') Позиция в геноме

Для обнаружения РНК вируса гриппа А подтипа Н5 методом ПЦР-РВ

Н-И САССАТСаОАОААТОТСССААА 982-1004

Н-И ТАСССАТАССААСССТСТАССА 1134-1155

Н-РгоЬе Р АМ-АСОАСТСПТОСАСССАТАССАОСТТ-ВНО1 1084-1110

Для обнаружения РЖ вируса гриппа А подтипа N1 методом ПЦР-РВ

Ы-Р ООТТТОАСТСТСТТССТТССТС 538-560

ОСААОАСССАТТТАСАСАТОСАС 711-735

]\[-РгоЪе ГАМ-ТГОССАТОАТОССАССАОТГСОТТ-ВН(} 1 569-592

Эффективность и специфичность тест-системы была проверена на вирусах, полученных из коллекции ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава РФ (табл. 1). Результаты исследования различных штаммов вируса гриппа показали возможность определения РНК вируса гриппа А подтипа N1 и Н5 (рис. 2) и дифференциации её от РНК других типов и подтипов вируса гриппа.

1 2 Рисунок 2. Результаты обнаружения РНК вируса гриппа А подтипа N1 (1)и Н5 (2) методом ПЦР-РВ.

Кривые 9, 10, 11, 12, 13, 16, 22, 26 и 27, на рисунке 2(1), соответствуют образцам, содержащим вирусы гриппа А подтипа N1.

Кривые 21, 26 и 27, на рисунке 2(2), соответствуют образцам, содержащим вирусы гриппа А подтипа Н5.

Специфичность тест-системы проверена на эпидемических штаммах вируса гриппа А, выделенных от млекопитающих и от птиц. Показано наличие

РНК вируса гриппа А подтипа Н5 в эталонных штаммах A/Mallard/Pensylvania/10218/84, А/курица/Покров/09 и

A/Grebe/Novosibirsk/29/05 (табл. 1, рис. 2.2), а также РНК вируса гриппа А подтипа N1 в эталонных штаммах A/WSN/33, A/FPV/Poctok и A/Grebe/Novosibirsk/29/05 (табл. 1, рис. 2.1). Вирусы других семейств (Paramyxoviridae, Coronaviridae, Birna Viridae) не детектируются данной тест-системой. Таким образом, можно говорить о 100% специфичности тест-системы.

Для определения аналитической чувствительности разработанной тест-системы использован образец вируса A/Grebe/Novosibirsk/29/05 с начальным титром 105 ЭИД50/мл, последовательные разведения использовали в ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления РНК вируса гриппа А подтипа N1 и Н5.

Установлено, что предел обнаружения РНК вируса гриппа подтипа Н5 составляет 102 ЭИД50/мл, а подтипа N1-10 ЭИД50/мл, соответственно.

Для создания положительного контроля к разработанной тест-системе использовались специфические праймеры (табл. 4), для синтеза специфических фрагментов использовали референтный штамм вируса гриппа А подтипа H5N1 A/Grebe/Novosibirsk/29/05. Фрагменты генов НА и NA вируса гриппа А подтипа H5N1 клонировали в плазмиды pGEM-T Easy. Получены две плазмиды pGEM-H5-RT и pGEM-Nl-RT.После трансформации компетентных клеток E.coli проводили скрининг клонов методом ПЦР, с последующим секвенированием полученных вставок. Массовую концентрацию плазмид определяли спектрофотометрически при длине волны >..=260 нм. Среднее значение концентраций рассчитывали по результатам 6-ти измерений (табл. 5). Концентрация выделенных рекомбинантных плазмид pGEM-H5-RT и pGEM-N1-RT оказалась равна 0,192 мкг/мкл и 0,215 мкг/мкл соответственно. Данная концентрация соответствует количеству ДНК для плазмиды pGEM-H5-RT (5,5х107 молекул/мкл) и для плазмиды pGEM-Nl-RT (6ДхЮ7 молекул/мкл).

Таблица 5. Массовые и молекулярные концентрации рекомбинантных плазмид

0,188

0,196

плазмида pGEM-H5-RT 0.194 0,191 0,192+0,004 5,5 х 107

0,191

0,193

0,207

0,22

плазмида pGEM-Nl -RT 0,217 0,218 0,215+0,008 6,1 х Ю7

0,208

0,220

3. Разработка теста для количественного определения вируса гриппа А

подтипа Н5Ш

Для проведения количественного анализа строили калибровочный график зависимости значений порогового цикла С1 от десятичного логарифма концентрации ДНК. По значению порогового цикла, с помощью компьютерной программы, проводили расчёт концентрации РНК вируса гриппа А подтипа Н5Ш в положительных пробах от птиц.

В качестве стандартных растворов использовали разведения полученной ранее рекомбинантной плазмиды рОЕМ-Н5-ИТ с концентрацией 5,5x107 молекул/мкл. Для того, чтобы учесть потери при выделении, данные плазмиды добавляли в культуру клеток МДСК. Объем культуры клеток и анализируемого биологического образца был стандартизирован и составлял 200 мкл. Затем проводили ОТ-ПЦР в одной пробирке. При этом дополнительные исследования показали, что в данной постановке реакция обратной транскрипции (синтез кДНК на матрице исходной РНК) не вносит изменения в исходное количество РНК.

На рисунке 3 представлено определение концентраций РНК вируса гриппа А подтипа Н51Ч1 в анализируемых биологических образцах. Концентрации молекул РНК в исследуемых пробах составили (молекул/мкл): проба 1 - 2,4x106, проба 2 - 5,0х10б, проба 3 - 4,6хЮ5, проба 4 - 5,0х104 , проба

5 — 5,2х103, проба 6- 1,6х103, проба 7- 1,3х 102 , соответственно.

—1-1-I-Т---1—1-1-г—!-I-р-1-1-1-Г^-Т-Г-1-1-I—>'-I-Г-

0 2 4 6 8

1од10

Рисунок - 3. Определение количества вируса гриппа А подтипа Н5Ы1 (молекул/мкл) в пробах.

О - калибровочные растворы,

О - исследуемые образцы.

4. Использование количественного теста для определения накопления рекомбинантного вируса гриппа А/ Н5Ш, полученного методом обратной

генетики

Одним из самых современных подходов молекулярной вирусологии является метод обратной генетики, который можно определить как методический прием, посвященный воссозданию функционального генетического материала. Инфекционная копия вируса позволяет вносить изменения, как в генетический материал, так и в факторы, влияющие на его функции. Создание такой копии позволяет проводить как фундаментальные научные исследования, так и конструировать различные вакцинные препараты, обладающие заданными свойствами. В лаборатории молекулярной диагностики ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского» МЗ РФ методом обратной генетики на основе вируса гриппа А рК8 (НШ1) был получен рекомбинантный вирус гриппа А подтипа Н5М1. У одной из 8 плазмид инфекционного клона ген гемагглютинина Н1 был заменен на ген гемагглютинина вируса гриппа А/Курган/05/2005 (Н5№). После трансфекции клеток 293Т/МОСК 8-ю плазмидами инфекционного клона и пассирования в культуре клеток МДСК, а затем в куриных эмбрионах (КЭ) получен рекомбинантный вирус А/Н5№.

На рисунке 4 представлены результаты тестирования рекомбинантного вируса гриппа А/Н5№ на различных стадиях: в культуре клеток МДСК и в аллантоисной жидкости после первого и второго пассажей на куриных эмбрионах.

Рисунок 4. Накопление рекомбинантного вируса H5N1 в процессе пассирования и детекция плазмиды

инфекционного клона pHW 2000, со вставкой гена

гемагглютинина вируса гриппа А/Курган/05/2005 (H5N1).

Разработанная количественная тест-система позволяет следить за накоплением вирусных частиц и, наряду с вирусологическими характеристиками, проводить молекулярный анализ рекомбинантного вируса.

5. Участие в международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP)

Разработанные тест-системы были использованы для тестирования 9-й

панели, в ходе международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP) по молекулярной диагностике гриппа, проходившей в марте 2011. В таблице 6 представлены результаты молекулярного анализа, полученные в ходе лабораторного экзамена.

По результатам анализа получен Международный сертификат WHO об успешном прохождении теста и соответствии лаборатории международным стандартам по молекулярному анализу вируса гриппа.

Таблица 6. Результаты анализа образцов, полученных от ВОЗ.

Образец Штамм Субтип Генотип Копии/мкл

2011-01 A/Barn Swallow/Hong Kong/D 10-1161 /2010 A/H5N1 2.3.2. 7.972 x 102

2011-02 - - - -

2011-03 - - - -

2011-04 A/California/4/2009-like A/HlNlpdm - 6.892 x 102

2011-05 A/California/4/2009-like A/HlNlpdm - 8.110 x 10"'

2011-06 A/Turkey/12/06 A/H5N1 2.2 4.123 x 102

2011-07 A/Barn Swallow/Hong Kong/D10-1161/2010 A/H5N1 2.3.2. 8.323 x 102

2011-08 B/Brisbane/60/2008-like (Victoria lineage) - - 7.623 x lo'

2011-09 A/Perth/16/2009-like A/H3N2 - 1.346 x lo'

-рркомбинантьый

вирус нисходнал плазмидо

Культуральнзя Первый Второй пассаж жидкоиь пассаж на КЭ на КЗ после трансфекции

2011-10 А/Тигкеу/12/06 А/ЮГ« 2.2 1.358 х 103

2011-11 А/ ВпзЬапе/59/2007-Ике А/НШ1 - 3.237 х 102

2011-12 А/РеПЬ/16/2009-Нке А/Н3№ - 1.041 х 102

6. Использование разработанных тест-систем для выявления вируса

гриппа А подтипа Н5Ш

Разработанные тест-системы были применены для анализа 648 полевых проб от диких и домашних птиц, отобранных во время эпизоотий 2005-2008 г.г. (см. материалы и методы) (рис.5). Проведенное исследование показало, что разработанные тест-системы являются универсальными и позволяют выявлять высоковирулентный вирус гриппа А подтипа Н5М, Цинхай-Сибирского генотипа Н51 2.2 четырех генетических подгрупп (Цинхайской, Западносибирской, Тувинско-Сибирской и Ирано-Северокавказской), а также Уссурийского генотипа Н5.Г 2.3.2 двух генетических подгрупп (Дальневосточно-Южнокитайской и Западномонгольской).

□ положительные пробы

Ш положительные пробы птиц без клинических

признаков заболевания О отрицательные пробы

I »ч I I I

Ж ? ? ? ^ ?

^ .¿г Л? у ¿Г ¿Г

/У/////'///

Рисунок 5. Результаты исследования полевых образцов от птиц, отобранных во время эпизоотии 2005-2008 г.г.

Выявление вирусов молекулярными методами было подтверждено

классическими методами идентификации вирусов в лаборатории экологии

вирусов ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского» МЗ РФ (руководитель д.б.н. М. Ю. Щелканов). Установлено, что данные тест-системы применимы не только для диагностики вируса гриппа А подтипа Н5№ у погибших и больных птиц, но и у птиц без клинических признаков заболевания (рис.5).

7. Разработка теста на основе непрямого ИФА для обнаружения антител к

В геноме вируса гриппа А присутствует ген неструктурного белка NS1 (S.J.Flint, 2000.). Этот белок не пакуется в вирионы, таким образом, у инактивированного вируса этого белка практически нет. Существует гипотеза, что по уровню антител к неструктурному белку NS1, возможно различить живые и инактивированные вирусы (Tumpey Т.М., 2005).

Для наработки фрагмента гена NS1 вируса гриппа были разработаны специфические праймеры NS-F 5'-CACCATGGTAATGGATTCCAACACTG-J ' и NS-R 5'-TTGGATCCACTTTTGGCTCAATTGTTC-3 '. С помощью разработанных праймеров на матрице штамма вируса гриппа A/chicken/Kurgan/3/2005 был получен ПЦР фрагмент с генома вируса гриппа гена NS1.

Полученный участок был клонирован в экспрессионный вектор рЕТ32"

Рисунок 6. Схема получения рекомбинантной плазмиды рЕТ32Ь+, несущей ген NSI вируса гриппа

Полученная конструкция была трансформирована в экспрессионные

клетки E.coli штамма BL21(DE3)pLysS, и проведен синтез белка.

неструктурному белку вируса гриппа NS1.

(рисунок 6).

В экспрессионной плазмиде есть фрагмент, кодирующий 6 молекул гистидинов, которые транслируются на С-конец рекомбинантного белка NS1, что позволяет очистить его методом металло-хелатной аффинной хроматографии. Наличие продукта подтверждали методом ИФА с моноклональными антителами (МКА) против гистидина (рисунок 7).

Рисунок 7. Результаты анализа элюатов, полученных при очистке белка гЫ31 очистке его в нативных(А) и денатурирующих(Б) условиях методом ИФА.

А Б

Из рисунка 7 видно, что белок более эффективно выделяется в денатурирующих условиях, т.е. в буфере, содержащем 50 мМ имидазола и 6М мочевины. Это было подтверждено анализом рекомбинантного белка NS1 в методами электрофореза в 12% полиакриламидном геле и иммуноблоттинга с меченными пероксидазой хрена МКА против полигистидиновых групп и референтной положительной куриной сывороткой.

Проведение непрямого ИФА с рекомбинантным белком NS1. Рекомбинантный белок NS1 был использован для сенсибилизации планшетов в ИФА при определении антител к данному белку в сыворотках крови птиц. Предварительное шахматное титрование с референтными сыворотками показало, что оптимальная концентрация белка NS1 составляет 1 мкг/мл, а сыворотки следует разводить в 100 раз.

Были проверены 5 сывороток от кур, привитых «Флупротект Н5» инактивированной эмульгированной вакциной против гриппа птиц типа А подтипа Н5 производства ФГУП «Ставропольская Биофабрика» (серия 040306) и 3 референтные сыворотки от кур, инфицированных вирусом H5N1 (LPAI), предоставленные Др. Д. Л. Суарэсом (USDA Agricultural Research Service

(USDA-ARS), South East Poultry Research Laboratory, Атенс, Джорджия, США).

исходный фракция 1 фракция 2

фракция 1 фракция

+ 6М +6М

Мочевины Мочевинк

Как показали результаты эксперимента (рис. 8), уровень антител в референтных сыворотках от кур, инфицированных инактивированным вирусом [ 15 N1, значительно превышает таковой в сыворотках вакцинированных кур.

1 - референтные сыворотки от инфицированных кур

2 - сыворотки от вакцинированных кур

Рисунок 8. Результаты иммуноферментного анализа сывороток кур на наличие антител к белку Л/57.

Полученные результаты указывают на возможность применения разработанного метода для дифференциальной диагностики инфицированных птиц и привитых инактивированными вакцинами.

1. Разработана «Тест-система для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР» с аналитической чувствительностью 102 - 1 О3 ЭИД50/мл, специфичностью 100%, которая позволяет проводить дифференциальный анализ возбудителя в культурах, зараженных вирусом и в образцах биологического материала.

2. Разработан и оптимизирован молекулярно-генетический метод качественного и количественного обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР в реальном времени с аналитической чувствительностью 10 -102 ЭИД50/мл, специфичностью 100%, который позволяет выявлять патоген в культурах, зараженных вирусом и в образцах биологического материала.

3. Показана возможность использования генно-инженерных положительных контролей на основе плазмиды pGEM-T Easy и клонированных фрагментов генома вируса гриппа подтипа H5N1 для качественного и количественного

ВЫВОДЫ

контроля определения генома высоковирулентного вируса гриппа А подтипа H5N1.

4. Показано, что метод количественного определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени может быть использован для контроля накопления рекомбинантного вируса гриппа H5N1, полученного методом обратной генетики.

5. Показано, что разработанные тест-система и методики на основе ПЦР, ПЦР в реальном времени могут быть использованы при эпидемиологическом обследовании территорий с целью изучения циркуляции вируса гриппа А подтипа H5N1 среди диких и домашних птиц в различных районах РФ. Показана возможность определения вируса гриппа А подтипа H5N1 не только у погибших и больных птиц, но также и у птиц без клинических признаков заболевания.

6. Показано, что рекомбинантный белок NS1 на основе вектора рЕТ32Ь+ с последующей химической трансформацией штамма Е. Coli BL21trxB(DE3)pLysS, очищенный метало-хелатной аффинной хроматографией, может быть использован как специфический компонент в непрямом ИФА для выявления антител к белку вируса гриппа NS1.

7. Показан различный уровень антител к белку NSI у инфицированных и вакцинированных инактивированной вакциной птиц. Это позволит разработать тест-систему для дифференциального выявления вакцинированных инактивированной вакциной и инфицированных птиц на основе выявления антител к белку вируса гриппа NS1 методом непрямого ИФА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ На основании данных исследований разработаны и предложены для практического использования: 1. Тест-система для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипа H5N1 методом полимеразной цепной реакции. Стандарт организации (СТО) 42418073-0001-2007

2. Инструкция по применению тест-системы, утверждена в Министерстве Сельского хозяйства РФ от. 21. 05. 2009 №1-4.7/02562 .

3. Сертификат соответствия № РОСС 1Ш.ФВ01.Н26634, выдан во Всероссийском Государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хомик Д.С. Мониторинг полевых образцов методом ПЦР на наличие вируса гриппа А

подтипа Н5 / Хомик Д.С., Киреев Д.Е. // Материалы конференции «Клинические и теоретические аспекты современной медицины». - 2006. - С.93-94.

2.Трушакова C.B. Определение вирусов гриппа А в разных образцах с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) / Трушакова C.B., Хомик Д.С., Иванова В.Т., Гребенникова Т.В., Бурцева Е.И., Слепушкин А.Н. // Материалы международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных». — 2006. — С.256-260.

3. Аканина Д.С. Усовершенствование тест-системы для диагностики вируса гриппа А подтипа

H5N1 методом ПЦР / Аканина Д.С., Гребенникова Т.В., Плетенёва Т.В. // Сборник трудов 6-ой всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007». - 2007. - С. 195-196.

4. Львов Д.К. Расшифровка эпизоотической вспышки, вызванной высоковирулентным вирусом

гриппа A/H5N1 цинхай- сибирского генотипа, на птицеферме «Лебяжье-чепигинский» (Брюховецкий район Краснодарского края) в августе-сентябре 2007 г. / Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г., Фролов A.B., Федякина И.Т., Прилипов А.Г., Бурцева Е.И., Альховский C.B., Галкина И.В., Иголкин A.B., Аканина Д.С., Гребенникова Т.В., Киреев Д.Е., Варкетин A.B., Морозова Т.Н., Самохвалов Е.И., Литвин К.Е., Виткова О.Н., Щербакова Л.О., Ирза В.Н., Дрыгин В.В., Калмыков М.В., Фонтанецкий A.C., Забережный А.Д., Шевкопляс В.Н., Митенко Е.А., Щербина И.А., Алипер Т.И., Громашевский В.Л., Власов H.A., Непоклонов Е.А. // Сборник трудов 6-ой всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007». - 2007. - С. 204-208.

5. Львов Д.К. Причины и следствия проникновения высоковирулентного вируса гриппа А на

территорию северной Евразии: новые данные об эволюции вируса / Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г., Федякина И.Т., Прилипов А.Г., Бурцева Е.И., Альховский C.B., Галкина И.В., Аканина Д.С., Гребенникова Т.В., Киреев Д.Е., Самохвалов Е.И., Забережный А.Д., Алипер Т.Н., Власов H.A., Непоклонов Е.А., Громашевский В.Л. // Сборник трудов 6-ой всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007». - 2007. - С. 209-210.

6. Львов Д.К. Молекулярно-генетические особенности высоковирулентного варианта вируса

гриппа A/H5N1, вызвавшего локальную эпизоотическую вспышку в Подмосковье в феврале 2007 г. / Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Прилипов А.Г., Дерябин П.Г., Аканина Д.С., Громашевский В.Л., Гребенникова Т.В., Федякина И.Т., Галкина И.В., Альховский C.B., Усачева О.В., Киреев Д.Е., Самохвалов Е.И., Виткова О.Н., Щербакова Л.О., Забережный А.Д., Калмыков М.В., Алипер Т.Н., Власов H.A., Непоклонов Е.А. // Сборник трудов 6-ой всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007». - 2007. - С. 211-214.

7. Киреев Д.Е. Разработка тест-систем для выявления и типирования вируса гриппа А на основе

полимеразной цепной реакции / Киреев Д.Е., Аканина Д.С., Гребенникова Т.В., Забережный А.Д., Щелканов М.Ю., Львов Д.К. // Вопросы вирусологии. - 2007. - Т.52, №4. - С. 17-22

8.Щелканов М.Ю. Комплексный эколого-вирусологический мониторинг на территории Приморского края в 2003-2006 гг. / Щелканов М.Ю., Ананьев В.Ю., Львов Д.Н., Киреев Д.Е., Гурьев Е.Л., Аканина Д.С., Галкина И.В., Аристова В.А., Москвина Т.М., Чумаков В.М., Баранов Н.И., Гореликов В.Н., Усачев Е.В., Альховский C.B., Ляпина О.В., Поглазов А.Б., Шляпникова О.В., Бурухина Е.Г., Борисова О.Н., Федякина И.Т., Бурцева Е.И., Морозова Т.Н., Гренкова Е.П., Гребенникова Т.В., Прилипов А.Г., Самохвалов Е.И., Забережный А.Д., Коломеец С.А., Мирошников В.А., Оропай П.Л., Талонов В.В., Семенов В.И., Суслов И.О., Волков В.А., Ямникова С.С., Алипер Т.И., Дунаев В.Г., Громашевский В.Л., Маслов Д.В., Новиков Ф.Т., Власов H.A., Дерябин П.Г., Непоклонов Е.А., Злобин В.И., Львов Д.К. // Вопросы вирусологии. - 2007. - Т.52, №5. - С.37-48.

9. Львов Д.К. Молекулярно-генетическая характеристика штамма A/chickcn/Moscow/2/2007

(H5N1) из очага эпизоотии высокопатогенного гриппа А среди сельскохозяйственных птиц в Подмосковье (февраль 2007 г.) / Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Прилипов А.Г., Дерябин П.Г., Аканина Д.С., Галкина И.В., Гребенникова Т.В., Федякина И.Т., Альховский C.I3., Усачева О.В., Киреев Д.Е., Славский A.A., Стариков Н.С., Петренко М.С., Михайлова В.В., Усачев Е.В., Садыкова Г.К., Морозова Т.Н., Самохвалов Е.И., Юдин А.Н., Виткова О.Н., Щербакова Л.О., Забережный А.Д., Калмыков М.В., Громашевский В.Л., Алипер Т.И., Яковлев С.С., Власов H.A., Непоклонов Е.А., Suarez D. // Вопросы вирусологии. - 2007. - Т.52, №6. -С.40-47.

10. Аканина Д.С. Рекомбинантный неструктурный белок NS1 вируса гриппа А для дифференциальной диагностики / Аканина Д.С., Богданова B.C., Гребенникова Т.В., Плетенева Т.В. и др. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Ю.М. Кубицкого «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований». - 2007. - С. 186-189.

11. Гребенникова Т. В., Аканина Д. С., Киреев Д. Е. Львов Д. К., Забережный А. Д., Алипер Т. И. Способ обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1/ Патент № 2361924 от 23. 11.2007

12. Львов Д.К. Эпизоотия среди диких и домашних птиц, вызванная высоковирулентным вирусом гриппа A/H5N1 генотипа 2.2 (Цинхай-сибирский), на пути осенних миграций в северо-восточной части бассейна Азовского моря (краснодарский край) / Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г., Прилипов А.Г., Фролов A.B., Федякина И.Т., Бурцева Е.И., Шляпникова О.В., Поглазов А.Б., Альховский C.B., Галкина И.В., Иголкин A.B., Аканина Д.С., Гребенникова Т.В., Киреев Д.Е., Варкентин A.B., Славский A.A., Морозова Т.Н., Самохвалов Е.И., Литвин К.Е., Виткова О.Н., Щербакова Л.О., Ирза В.Н., Дрыгин В.В., Калмыков М.В., Фонтанецкий A.C., Забережный А.Д., Шевкопляс В.Н., Митенко Е.А., Щербина И.А., Алипер Т.И., Громашевский В.Л., Власов H.A., Непоклонов Е.А., Suarez D. // Вопросы вирусологии. - 2008. - Т.53, №2. - С. 14-19.

13.Яшкулов К.Б. Изоляция вирусов гриппа A (Orthomyxoviridae, Influenza A virus), Дхори (Orthomyxoviridae, Thogotovirus) и болезни Ньюкасла (Paramyxoviridae, Avulavirus) на острове Малый Жемчужный в северо-западной части акватории Каспийского моря / Яшкулов К.Б., Щелканов М.Ю., Львов С.С., Джамбинов С.Д., Галкина И.В., Федякина И.Т., Бушкиева Б.Ц., Морозова Т.Н., Киреев Д.Е., Аканина Д.С., Литвин К.Е., Усачев Е.В., Прилипов А.Г., Гребенникова Т.В., Громашевский В.Л., Ямникова С.С., Забережный А.Д., Львов Д.К. // Вопросы вирусологии. - 2008. - Т.53, №3. - С. 34-38.

14. Львов Д.К. Расшифровка эпизоотической вспышки среди диких и домашних птиц на юге европейской части России в декабре 2007 г. / Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Прилипов А.Г., Дерябин П.Г., Федякина И.Т., Галкина И.В., Киреев Д.Е., Фролов A.B., Аканина Д.С., Усачева О.В., Шляпникова О.В., Поглазов А.Б., Морозова Т.Н., Прошина Е.С., Гребенникова Т.В., Забережный А.Д., Яковлев С.С., Щебакова Л.О., Шаповалов A.B., Жалин М.В., Руденко В.П., Пичуев А.Е., Литвин К.Н., Варкентин A.B., Стешенко В.В., Харитонов С.П., Прошина Е.С., Самохвалов Е.И., Альховский C.B., Алипер Т.И., МАртыновченко В.В., Лысенко С.Н., Власов H.A., Непоклонов Е.А. // Вопросы вирусологии. - 2008. - Т.53, №4. - С. 18-23.

15. Львов Д.К. Первый прорыв нового для России генотипа 2.3.2 высоковирулентного вируса гриппа A/H5N1 на Дальнем Востоке / Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Власов H.A., Прилипов А.Г., Дерябин П.Г., Федякина И.Т., Галкина И.В., Забережный А.Д., Ляпина О.В., Шляпникова О.В., Киреев Д.Е., Фесенко Е.Е., Калмыков М.В., Виткова О.Н., Морозова Т.Н., Прошина Е.С., Гребенникова Т.В., Аканина Д.С., Самохвалов Е.И., Альховский C.B., Волков В .А., Семенов В.И., Гапонов В.В., Шмаков Н.И., Кушнир А.Т., Казарян A.C., Стариков Н.С., Петренко М.С., Славский A.A., Литвин К.Е., Щербакова Л.О., Фролов A.B., Манин Т.Б., Уманец O.A., Бандеев В.В., Хван А.М., Дунаев В.Г., Челедина Т.П., Абгарян С.Р., Михайлович В.М., Заседателев A.C., Любченко E.H., Флягин В.Н., Тихонова И.Ф., Маслов Д.В., Ананьев В.Ю., Баранов Н.И., Гореликов В.Н., Яковлев С.С., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А., Suarez D.//Войроем вирусологии, 2008. - Т.53, №5. - С.4-8.

16. Сыроешкин A.B. Вирус гриппа А в прибрежных биоценозах Западной Арктики /, Азова М.М., Гребенникова Т.В., Аканина Д.С., Колесников М.В., Лапшин В.Б.. // Вестник РУДН. Серия «Медицина». - 2008. - №6. - С. 619 -622.

17. Сыроешкин А. В. Вирус гриппа А в прибрежных биоценозах Западной Арктики / Сыроешкин А. В., Гребенникова Т. В., Азова M. М., Аканина Д. С., Колесников М. В., Лапшин В. Б. // Труды IX международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке». -27-30 ноября 2008 г. - с. 469.

18. Аканина Д.С. Разработка средств диагностики вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР и ПЦР в реальном времени / Аканина Д.С., Гребенникова Т.В., Плетенева Т.В. // Сборник научных трудов конференции «Современные проблемы инфекционной патологии человека». - 2012. - С.93-96.

Примечание: в 2006 году Хомик Д.С. сменила фамилию на Аканина Д.С.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность директору ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава РФ Академику РАН Д. К. Львову за возможность выполнения данной работы в лаборатории Молекулярной диагностики Института.

Автор выражает глубокую благодарность заместителю директора ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава РФ, Члену-корреспонденту РАМН Л. В. Урываеву за научные консультации в процессе написания работы.

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю доктору биологических наук, профессору, зав. Лабораторией молекулярной диагностики ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава РФ Гребенниковой Татьяне Владимировне за научное руководство, поддержку и консультации при выполнении и написании работы.

Автор выражает особую благодарность д.х.н. зав. кафедрой фармацевтической и токсикологической химии РУДН профессору Т.В. Плетенёвой за научные консультации и поддержку, и сотруднику кафедры к.б.н. Т. В. Максимовой.

Автор выражает особую благодарность зав. Лабораторией этиологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава РФ д.м.н., профессору Е.И. Бурцевой за предоставленные материалы и консультативную помощь, а также сотрудникам лаборатории д.б.н., ведущему научному сотруднику В.Т. Ивановой, к.б.н. C.B. Трушаковой за консультативную помощь.

Автор выражает глубокую благодарность зав. Лабораторией экологии вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава РФ д.б.н., доценту М.Ю. Щелканову за предоставленные материалы вирусологических исследований и научные консультации, к.б.н., ведущему научному сотруднику B.C. Богдановой за консультативную и практическую помощь в выполнении работы.

Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам лаборатории молекулярной диагностики к.б.н. Кирееву Д.Е., к.б.н. Южакову А.Г, к.б.н. Костиной Л.В., за оказанную помощь в выполнении работы. Автор глубоко признателен и благодарен своим соавторам за внимание и ценные консультации при выполнении работы.

Подписано в печать 07.04.2014 Формат 145x205 . Бумага „Mondi" Печать цифровая. Печ. л. 1,1. Тираж 100 экз. Заказ №25

Отпечатано в типографии „ВНИИСТРОМ" 140050, Моск. обл., Люберецкий р-н, п. Красково, ул. К Маркса 117. Тел.: 8(495) 557-30-81

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аканина, Дарья Сергеевна, Москва

РОССИИСКИИ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ Кафедра фармацевтической и токсикологической химии

На правах рукописи

04201457466

Аканина Дарья Сергеевна

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А

ПОДТИПА Н5Ш

Специальность 03.02.02 - вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель Д.б.н., профессор Гребенникова Т. В.

Москва 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список использованных сокращений.................................................................4

1. Введение...........................................................................................................5

2. Обзор литературы..........................................................................................12

2.1. Описание заболевания.............................................................................12

2.2. Общая характеристика вируса гриппа....................................................14

2.3. Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N1...................................20

Передача вируса....................................................................................20

Клинические проявления.....................................................................21

Патогенез...............................................................................................24

2.4. Способы диагностики вируса гриппа.....................................................28

2.4.3. Иммуноферментный анализ..............................................................31

2.4.4. Молекулярные методы......................................................................33

2.4.4.1. Полимеразная цепная реакция....................................................33

2.4.4.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени..................39

3. Материалы и методы......................................................................................45

3.1. Материалы................................................................................................45

3.2. Методы.....................................................................................................51

4. Результаты......................................................................................................61

4.1. Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР.............................................61

4.1.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР..........61

4.1.2. Определение специфичности ПЦР тест-системы............................63

4.1.3. Определение чувствительности ПЦР тест-системы........................67

4.1.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для ПЦР тест-системы.................................................................................69

4.2. Разработка тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени......................................................73

4.2.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР..........73

4.2.2. Определение специфичности тест-системы на основе ПЦР в реальном времени.......................................................................................76

4.2.3. Определение чувствительности разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени................................................................79

4.2.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени.............................82

4.3. Разработка теста для количественного определения вируса гриппа А подтипа H5N1.................................................................................................83

4.3.1. Использование количественного теста для определения накопления рекомбинантного вируса гриппа А/ H5N1, полученного методом обратной генетики.......................................................................................86

4.4. Участие в международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP)........................................................................88

4.5. Использование разработанных тест-систем для выявления вируса

гриппа А подтипа H5N1.................................................................................89

4.6. Разработка тест-системы на основе непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку вируса гриппа NS1...................................94

4.6.1. Создание рекомбинантного белка NS1 вируса гриппа....................94

4.6.2. Проведение непрямого ИФА с рекомбинантным белком NS1.......99

5. Обсуждение результатов.............................................................................102

6. Выводы.........................................................................................................112

7. Библиография...............................................................................................114

8. Приложения..................................................................................................130

Список использованных сокращений

ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота ИФА - иммуноферментный анализ НА - гемагглютинин NA - нейраминидаза КЭ - куриные эмбрионы АГ - антиген

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота РСК - реакция связывания комплемента РТГА - реакция торможения гемагглютинации ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат

ОТ/ПЦР - полимеразная цепная реакция с предшествующей реакцией обратной транскрипции

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени

кДНК - комплементарная дезиксирибонуклеиновая кислота

ЕФ - европейская фармакопея

ФСП - фармакопейная статья предприятия

СТО - стандарт организации

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭИД - эмбриональная инфекционная доза

п.н. - пара нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

мАТ - моноклональные антитела

ВЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ЯМР - ядерный магнитный резонанс ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

WHO - world health organization (всемирная организация здравоохранения)

1. Введение

Актуальность проблемы.

Вирус гриппа А подтипа H5N1 - высоко патогенный вирус «птичьего гриппа» - впервые инфицировал человека в 1997 году во время вспышки болезни среди птиц в Гонконге (Claas et.al.,1998; Shortridge et al.,1998). В 2003 и 2004 годах этот вирус распространился из Азии в Европу и Африку и циркулировал среди домашних птиц во многих странах, что привело к сотням случаев заболевания людей, в том числе и со смертельный исходом (Guan et al., 2009). Вспышки болезни среди домашних птиц оказывают серьезное воздействие на экономику и международную торговлю в пораженных странах. Продолжающаяся циркуляция вирусов H5N1 среди домашних птиц, особенно там, где этот вирус является эндемическим, по-прежнему представляет угрозу для общественного здравоохранения (Menno D. de Jong, 2006; WHO, 2011), так как эти вирусы обладают не только способностью вызывать тяжелое заболевание у людей, но и преодолевать межвидовой барьер (Каверин Н.В., 2003; Webster et al., 2007; Manz et al., 2013).

9 января 2014 года ВОЗ сообщила о подтверждённом случае заболевания гриппом, вызванным вирусом A/H5N1 в Канаде у человека, приехавшего из Пекина, Китай. Всего в мире с 1997 года зарегистрировано 649 случаев заболевания людей гриппом, вызванным вирусом H5N1, 385 из которых закончилось смертью. Таким образом, смертность от гриппа, вызванным вирусом H5N1 составляет почти 60% (WHO, 2014). В нашей стране пока не зарегистрировано ни одного случая заболевания человека гриппом, вызванным вирусом H5N1. Первая вспышка «птичьего гриппа» среди домашней птицы в России произошла в июле 2005 года в Новосибирской области (Львов и др., 2005) и была связана с миграцией водоплавающих птиц из Азиатских стран на территорию нашей страны.

Все вышесказанное указывает на необходимость быстрой идентификации и типирования вирусов гриппа А не только для облегчения наблюдения за пандемическим потенциалом вируса «птичьего гриппа», но и для улучшения контроля и лечения инфицированных пациентов (Sakurai, 2012). ). В последние годы, методы молекулярной диагностики, рекомендованные ВОЗ, играют ключевую роль в выявлении и типировании вирусов гриппа (Alexander, 2008, Thanh et al., 2010). Совокупность чувствительных и специфичных современных отечественных тест-систем для качественного и количественного выявления генома вируса гриппа H5N1 на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени, а также методов выявления антител к данному вирусу могут существенно облегчить экологический мониторинг с целью предупреждения возможной пандемии (С.А. Russell, 2012.).

Цели и задачи исследования

Научная новизна работы

Созданы отечественные тест-системы на основе ПЦР и ПЦР-РВ для диагностики вируса гриппа А подтипа H5N1 с учетом генотипов вируса, циркулирующих на территории Российской Федерации. Достигнута высокая эффективность применения молекулярно-генетических методик мониторинга вируса гриппа А подтипа H5N1 среди диких и домашних птиц в различных районах РФ. Разработанные тест-системы являются универсальными и позволяют детектировать все известные на сегодняшний день генотипы вируса гриппа А подтипа H5N1.

Получен Российский патент № 2361924 «Способ обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1».

Показана возможность применения непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку NS1 вируса гриппа А подтипа H5N1 для дифференциации инфицированных и вакцинированных инактивированной вакциной птиц.

Практическая значимость

Основные положения, выносимые на защиту.

Разработанный молекулярно-генетический метод обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР характеризуется аналитической чувствительностью 102 - 103 ЭИД50/мл, специфичностью 100% и позволяет определять возбудителя в биологическом материале.

Разработанный молекулярно-генетический метод обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР в реальном времени характеризуется аналитической чувствительностью 10 - 102 ЭИД50/мл, специфичностью 100% и позволяет определять возбудителя в биологическом материале.

Разработаны генно-инженерные положительные контроли на основе плазмиды pGEM-T Easy и клонированных фрагментов генома вируса гриппа А подтипа H5N1, которые могут быть использованы в тест-системах для качественного и количественного контроля определения генома высоковирулентного вируса гриппа А подтипа H5N1.

Разработанный метод количественного определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР-РВ может быть использован для контроля накопления рекомбинантного вируса гриппа A/H5N1, полученного методом обратной генетики.

Разработанные тест-системы на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени

могут быть использованы при эпидемиологическом обследовании

территорий с целью изучения циркуляции вируса гриппа А подтипа H5N1 среди диких и домашних птиц в различных районах РФ.

Методика обнаружения антител к рекомбинантному неструктурному белку вируса гриппа NSlHa основе непрямого ИФА может быть использована для дифференциального выявления вакцинированных инактивированной вакциной и инфицированных птиц.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях, конгрессах, съездах:

Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006); итоговой конференции СНО медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты современной медицины (Москва, 2007г); IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 2007); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Ю.М. Кубицкого «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 2007); научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы инфекционной патологии человека» (Минск, 2012).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ, в том числе 8 статей в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендуемых ВАК, 1 патент РФ.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 166 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 148 источников. Работа содержит 11 таблиц и 30 рисунков, 4 приложения.

2. Обзор литературы

2.1. Описание заболевания.

Вирус гриппа А широко распространен в природе и способен вызывать эпидемии, пандемии и эпизоотии (Слёпушкин А.Н., 2001). Вирус гриппа А отличается высокой степенью вариабельности, особенно это касается поверхностных гликопротеинов вириона: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Известно 15 антигенных подтипов гемагглютинина (HI-HI5) и 9 подтипов нейраминидазы (N1-N9). От диких птиц изолированы вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков, при этом инфекция у диких птиц протекает в виде энтерита, без видимых признаков заболевания. Это указывает на высокую степень адаптации вирусов гриппа А к диким птицам, которые являются естественными хозяевами вирусов гриппа (Zambón М. С., 1999). Вирус сохраняется в воде в течение длительного времени (6-8 месяцев), а водно-фекальный путь инфицирования является основным механизмом поддержания персистенции вируса гриппа в природе (WHO,2005).

В 20 веке отмечены четыре пандемии: 1918 (H1N1), 1957 (H2N2), 1968 (H3N2) и 1977 (H1N1), причем две (1957 и 1968 гг.) как и пандемия 20092010 годов вируса гриппа свиней H1N1 были обусловлены новыми реассортантными вирусами (ВОЗ, 2005; Львов Д.К., 2010; Даниленко Д.М., 2011; Игнатьева A.B., 2011).

За последние 45 лет описано свыше 50 эпизодов возникн

Информация о работе

Аканина, Дарья Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.02.02

Диссертация

Разработка средств диагностики высоковирулентного штамма вируса гриппа A подтипа H5N1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы