Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологические свойства вируса гриппа птиц подтипа H5, выделенного на территории Российской Федерации

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства вируса гриппа птиц подтипа H5, выделенного на территории Российской Федерации"

На правах рукописи

«БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ ПОДТИПА Н5, ВЫДЕЛЕННОГО НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ»

06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Покров - 2011

з 1 [.;др ¿ом

4841783

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВВиМ).

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник (ГНУ ВНИИВВиМ)

Кушнир Анатолий Тимофеевич

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор (ГНУ ВНИИВВиМ)

Балышев Владимир Михайлович

кандидат ветеринарных наук, старший

научный сотрудник (ФГУ ВГНКИ) Зуев Юрий Владиславович

Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно - иисследовательский ветеринарный иинститут птицеводства» (ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии) г. Ломоносов.

Защита диссертации состоится «25» марта 2011 г. в «10—» ч. на заседании диссертационного совета Д.006.003.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская обл., Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тел/факс: (49243)62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «21 » февраля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ГНУ ВНИИВВИМ Россельхозакадемии

кандидат биологических наук

Е.А. Балашова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы.

Грипп птиц относится к числу особо опасных болезней, наносящих большой экономический ущерб птицеводству и представляет определённую опасность для людей [Кильбурна Э.Д., 1978; Сюрин В.Н., и соавт., 1998; Каверин Н.В., Смирнов Ю.А., 2003]. Вирус имеет множественность серотипов, отличающихся между собой по геммаглютинину и нейраминидазе, что существенно затрудняет проведение диагностических исследований и организацию профилактических мероприятий. Известно 16 серотипов, отличающихся между собой по гемагглютинину, и 9 подтипов, отличающихся по нейраминидазе [Сюрин В.Н., и соавт., 1998, 1984;]. При одновременной циркуляции в организме нескольких серотипов вируса возможны генетические изменения в структуре его генома, что периодически приводит к возникновению новых вариантов возбудителя и вспышкам широкомасштабных эпизоотий [Покровский В.И., 2005; Джавадов З.Д., Придывайло Н.Д., 2006; Липатов А.С., и соавт., 2005]. Эпизоотии гриппа птиц 2005 - 2008 годов в основном были обусловлены высоковирулентными штаммами вируса гриппа 5 и 7 подтипов. Мониторинг подтиповой принадлежности вируса гриппа птиц проводится постоянно, так как факты выделения возбудителя болезни от птиц различных видов регистрируются ежегодно во всех регионах земного шара. Выделяемые из очагов вирусы гриппа, в обязательном порядке, оцениваются по патогенности, характеристике генома и другим биологическим свойствам, что необходимо при разработке средств диагностики специфической профилактики и противоэпизоотических мероприятий [Сафонов Г.А., 1984]. В связи с вышеизложенным, изучение биологических свойств, выделяемого вируса гриппа птиц в межэпизоотический и эпизоотический периоды, является весьма актуальным.

1.2. Степень разработанности проблемы.

Изучение изолятов вируса гриппа А птиц, выделенных на территории Российской Федерации с начала эпизоотии в 2005 году, проведено в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Львов Д.К., Щелканов М.Ю. и др. 2005 - 2009), ФГУ ВНИИЗЖ (Чвала И.А. и др. 2005 - 2008), ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии (Шаршов. К.А., 2010); за рубежом: М. Terrence, L. David, 2002;. Swayne; Kuiken Т., 2004; Sturm-Ramirez. K.M. 2004 и др.

В работах ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН изучены

вопросы культивирования вирусов на перевиваемых культурах клеток, определена подтиповая принадлежность, проведены молекулярно генетические исследования полного генома вируса. Вместе с тем, выделенные штаммы не были охарактеризованы по патогенности для кур и куриных эмбрионов и некоторым другим показателям. Использованные в наших исследованиях штаммы вируса гриппа А птиц, выделенные в различных регионах Российской Федерации, другими авторами не изучались, за исключением, штамма А^геЬе/Тууа/ Ту\'0б-1/06, который изучался Шаршовым К.А., (2010).

1.3. Цель и задачи исследований.

В соответствии с вышеизложенным, целью работы явилось изучение биологических свойств штаммов гриппа А птиц подтипа Н5, выделенного от диких и домашних птиц на территории России в 2005-2008 годах. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Определить инфекционную и гемагглютинирующую активность вируса гриппа А птиц, выделенного в эпизоотических очагах в различных регионах Российской Федерации (Новосибирской, Московской, Курганской, Ростовской областях, Краснодарском и Приморском краях, Республике Тыва);

• Оценить патогенность выделенного вируса гриппа А для птиц и куриных эмбрионов и изучить клинические и патологоанатомические проявления болезни;

• Изучить культуральные свойства штаммов вируса гриппа А птиц;

• Изучить устойчивость вируса гриппа к воздействию различных температур;

• Провести электронно - микроскопическое исследование вируса гриппа;

• Привести молекулярно - генетические исследования гемагглютинина штамма вируса гриппа А птиц;

• Отработать методику получения специфической сыворотки к подтипу Н5 вируса гриппа А птиц;

1.4. Научная новизна.

• Нами установлено, что штаммы вируса гриппа А птиц, выделенные от диких и домашних птиц на территории России в 2005 - 2008 г.г., относятся к числу высокопатогенных, но различаются по уровню вирулентности для кур и куриных эмбрионов;

• С использованием штаммов вируса гриппа А птиц A/duck/Novosibirsk/56/05 и A/chicken/Kurgan/5/05 получены антигены и специфические сыворотки от коз и кур;

• Установлена чувствительность утят и устойчивость голубей к выделенным в 2005 - 2008 годах штаммам вируса гриппа А птиц;

1.5. Практическая значимость.

• Паспортизированы и заложены в коллекцию ГНУ ВНИИВВиМ новые штаммы вируса гриппа А птиц (A/duck/Novosibirsk/56/05, А/grebe/Tyva/ TyvOó-1/06, A/chicken/Moseow/2/07, A/rook/Rostov-on-Don/26/07, A/chicken/Rostov-on-Don/33/07, A/chicken/Krasnodar/300/07, A/chicken/Primorje/1/08) и специфические сыворотки, которые используются в НИР института при проведении фундаментальных и прикладных исследований.

• Разработаны «Методические рекомендации по отбору материала от птиц для вирусологических и серологических исследований», которые утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ 28. 10. 2010 г.

1.6. Апробация и публикация результатов исследований.

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на

заседаниях Учёного совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии в 2005-2009 годах; международных научно-производственных конференциях: «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2007 г.; «Новое в диагностике и профилактике болезней птиц», Санкт - Петербург., Г.Ломоносов, 2008.; «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных», г.Покров, 2008; «Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству», Москва, 2008.

1.7. Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в т.ч. 3 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

1.8. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 114 листах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, собственные исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы (138 источников, в том числе 69 - иностранных авторов), приложение на 2-х листах. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 22 рисунками.

1.9. Основные положения, выносимые на защиту.

Биологические, морфологические, молекулярно - генетические свойства высокопатогенных штаммов вируса гриппа А птиц, выделенных на территории РФ в период 2005 - 2008 г.г.

Оптимизация методов культивирования вируса гриппа А птиц и методы получения высоко активных специфических сывороток крови кур и коз.

1.10. Личный вклад автора в выполнение работы.

Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно в лаборатории

«Индикации микроорганизмов» ГНУ ВНИИВВиМ в рамках задания 08.01. Отдельные этапы исследований выполнены при консультативной и методической помощи сотрудников Научно - экспериментального отдела, лаборатории Электронной микроскопии и Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ; ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам, оказавших методическую и консультативную помощь при выполнении отдельных разделов диссертационной работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследования. 2.1.1. Материалы:

Вирусы: В работе использовали частично охарактеризованные по принадлежности к подтипу H5N1 штаммы вируса гриппа А птиц, полученные из ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва: A/duck/Novosibirsk/56/05 (домашняя утка), А/grebe/Tyva/ Tyv06-l/06 (большая поганка), A/chicken/Moscow/2/07 (курица), A/rook/Rostov-on-Don/26/07 (грач), A/chicken/Rostov-on-Don/33/07 (курица), A/chicken/Krasnodar/300/07 (курица), A/chicken/Primoije/1/08, охарактеризованные по принадлежности к подтипу H5N1 и по накоплению в культуре клеток СПЭВ и MDCK.

Штаммы вируса гриппа A H5N1 A/chicken/Kurgan/5/05 (курица) и H7N1 A/PR-/34+A/Seal/Massachusets/l/80, полученные из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ.

Специфические сыворотки:

к вирусу инфекционной бурсальной болезни с титром в РЗГА 1:512-1:1024, в РДП- 1:32;

к вирусу ньюкаслской болезни с титром в РЗГА 1:512-1:1024, в РДП - 1:32;

к вирусу синдрома снижения яйценоскости с титром в РЗГА 1:512-1:1024, в РДП- 1:32;

к гриппу А птиц подтипа Н5 с титром в РЗГА 1:256 и 1:512. Сыворотки получены из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ.

Клеточные культуры: Для культивирования вирусов использовали: перевиваемые линии клеток тестикул поросёнка (ПТП), почки сибирского горного козерога (ПСГК), сублинию клеток почки свиньи (БК-б), а также первично трипсинизированную культуру фибробластов эмбрионов кур (ФЭК).

Животные: Дикие утята 2-х месячного возраста и взрослые дикие утки, утиные эмбрионы 13 - 14 дневного возраста, полученные из Государственного комплекса «Завидово»; петухи породы Леггорн массой 2,5-3 кг; цыплята -бройлеры 25-35 - дневного возраста; СПФ эмбрионы кур 9-11-дневного возраста; обычные куриные эмбрионы 9-11 дневного возраста, полученные из птицефабрик Владимирской области; голуби взрослые беспородные, полученные от владельцев частного сектора. 2.1.2. Методы исследования: 2.1.2.1. Отбор и подготовка проб к анализу.

Пробы отбирали с соблюдением правил асептики в стерильные стеклянные флаконы и пробирки. От живых птиц отбирали пробы крови, носоглоточные смывы и пробы со слизистой клоаки, а от павших - печень, селезёнку, лёгкие, кишечник и мозг. Пробы со слизистой клоаки и носоглоточные смывы отбирали стерильными тампонами. Тампоны помещали в пробирку со стерильным физиологическим раствором. Пробы крови отбирали в пробирки, увлажнённые физиологическим раствором. Кровь выдерживали до образования сгустка в термостате при 37°С в течение 30-60 минут, затем осторожно обводили иглой и оставляли на 16-18 часов в холодильнике при температуре 2-4°С. Образовавшуюся сыворотку переносили в стерильные пробирки и использовали в исследованиях.

Патологический материал (печень, селезенка, легкие, кишечник, мозг) трёхкратно промывали стерильным физиологическим раствором с антибиотиками и размельчали в ступке с кварцевым стеклом. Гомогенат органов центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 минут. Содержимое пробирок со смывами центрифугировали при 2000 об/мин в течении 10 минут.

Для исследований использовали надосадочную жидкость, которую помещали в холодильник и хранили при температуре минус 40°С (±0,5°С).

2.1.2.2. Выделение вируса гриппа А птиц и его идентификация.

С надосадочной жидкостью, полученной после центрифугирования проб патологического материала (п. 2.1.2.1.), ставили реакцию гемагглютинации (РГА). Пробы патологического материала, получившие положительный результат в РГА, исследовали в реакции задержки гемагглютинации (РЗГА). Надосадочной жидкостью патологического материала, получившего отрицательный результат в РГА, заражали КЭ. При отсутствии гибели КЭ (в течение 72 часа) проводили три последовательных пассажа. Экстра эмбриональную жидкость (ЭЭЖ) каждого пассажа проверяли в РГА.

РГА и РЗГА ставили по общепринятой методике (Методические указания по лабораторной диагностике Ныокаслской болезни и гриппа птиц. 1972 г.). При постановке РГА использовали эритроциты петуха и барана и двукратные разведения испытуемых материалов (от 1:2 до 1:4096).

2.1.2.3. Культивирование вируса гриппа А птиц на куриных и утиных эмбрионах.

Для культивирования и титрования вируса гриппа птиц использовали СПФ и обычные куриные 9-11 дневные и 13-14 - дневные утиные эмбрионы. Перед заражением эмбрионы просматривали под овоскопом и удаляли павшие. На остальных эмбрионах отмечали границу пуги. Поверхность скорлупы эмбрионов в месте введения материала дезинфицировали 70%-ным раствором этанола, затем 1%-ным раствором йода на 96% - ном этаноле и фламбировали спиртовым факелом. В скорлупе над воздушной камерой на высоте 0,5 см от границы пуги металлическим пробойником пробивали отверстие для выхода воздуха. Отверстие для заражения эмбрионов делали на участке безсосудистой зоны хориоаллантоисной оболочки (ХАО) ниже линии пуги на 0,3 - 0,5 см. При заражении эмбрионы фиксировали вертикально тупым концом (пугой) вверх. Материал вводили иглой в объёме по 0,1 см3 на глубину не более 0,2-0,3 см. После этого отверстия герметизировали расплавленным парафином. Заражённые эмбрионы инкубировали в течение трёх суток при 37°С и относительной влажности 60 - 70%. Овоскопирование проводили ежедневно. Гибель эмбрионов в первые сутки после заражения считали неспецифической. Эмбрионы, павшие в последующие сроки, помещали в холодильник при 4 - 6°С.

Оставшиеся живые эмбрионы охлаждали в течение 12-24 часов при 4 - 6° С, затем проводили их вскрытие и определяли гемагглютинирующую активность аллантоисной жидкости с 1% суспензией эритроцитов петуха или барана капельным методом на покровных стеклах или микро методом в 96-ти луночных пластиковых планшетах с и образным дном.

Для выделения вируса и получения вируссодержащего материала СПФ куриные эмбрионы заражали вируссодержащей аллантоисной жидкостью в разведении 1:10 на физиологическом растворе (рН 7.2-7.4). На каждое разведение брали по 4 куриных эмбриона.

Титрование вируссодержащей жидкости проводили в разведениях с 10"1 по " Ю"10. На каждое разведение брали не менее 4-х куриных эмбрионов. Расчёт летальной дозы (ЬО50) проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина и Воробьёва (1962).

2.1.2.4. Культивирование вируса гриппа А птиц в первичных и перевиваемых культурах клеток.

Выбор чувствительной клеточной системы и оценку её пригодности для проведения вирусологических исследований осуществляли экспериментально по накоплению вируса в культурах клеток.

С этой целью использовали первичную культуру клеток ФЭК и перевиваемые клеточные линии ПТП, БК-б, ПСГК. Для заражения использовали вируссодержащую аллантоисную жидкость эмбрионов от 8РР кур в разведениях с 10'1 по 10~4.

Первичную культуру клеток ФЭК выращивали в пробирках Лейтона. На каждое разведение использовали по 4 пробирки с монослоем культуры клеток. Через 24-48 часов культивирования (при образовании клеточного монослоя в пробирках), поддерживающую среду сливали и в пробирки вносили вируссодержащий материал в объеме по 1,0 см3. Для контроля использовали не менее 4 пробирок с клеточным монослоем, в которые вносили ЗФР. Зараженные культуры клеток ставили на контакт с вирусом в течение 60 - 90 минут при 37° С. Затем вируссодержащую жидкость сливали и во все пробирки добавляли по 3,0 см3 поддерживающей среды. Инфицированные культуры клеток инкубировали при температуре 37° С в течение 7 суток, проверяя каждые 24 часа наличие ЦПД. При обнаружении ЦПД на 50 - 75% площади монослоя культуры клеток пробирки п замораживали при минус

40°С, затем оттаивали (процедуру замораживания и оттаивания повторяли три раза). Наличие в культуральной среде гемагглютинирующего агента определяли в РГА. Вирус типировали в РЗГА.

Для титрования вируса гриппа А птиц использовали вируссодержащую жидкость в разведениях с 10"1 по Ю"10. На каждое разведение использовали по 4 пробирки Лейтона с монослоем соответствующей культуры клеток.

2.1.2.5. Культивирование вируса гриппа А птиц в перевиваемых культурах клеток в присутствии трипсина.

Культивирование вируса на перевиваемых линиях культур клеток в присутствии трипсина проводили по выше описанной методике (пункт 2.1.2.4.). Отличие заключалось только в том, что клеточный монослой после контакта с вируссодержащим материалом три раза промывали поддерживающей средой, содержащей 0,25 % трипсина.

2.1.2.6. Оценка патогенности вируса гриппа А птиц для кур, голубей и диких утят.

Летальную дозу (ЛД50) вируса определяли для взрослых кур и цыплят -бройлеров 30 - 35 дневного возраста, которых получали с птицефабрики «Юрьевецкая» Владимирской области. Цыплят и кур содержали в клетках, кормление проводили полноценным комбикормом согласно принятым нормам. Предварительно у 30% цыплят и кур в каждом опыте брали кровь, получали сыворотку, которую исследовали на наличие специфических антигемагглютининов (АГА) к вирусу гриппа А птиц подтипа Н5 в РЗГА.

Цыплят и кур заражали вируссодержащим материалом в разведениях с 10"3 -по Ю"10, на каждое разведение брали по 4 головы птиц. Десятикратные разведения вируса готовили на забуференном физиологическом растворе рН 7,2-7,4 и вводили в мышцу бедра по 1,0 см3. По 4 головы интактных кур и цыплят оставляли для контроля.

Наблюдение за цыплятами и курами проводили в течение 21 суток, учитывали общее клиническое состояние и их гибель.

ЛД50 рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина по результатам гибели животных.

Чувствительность голубей к вирусу гриппа птиц определяли путём заражения их испытуемыми материалами интраназально в дозе 5,0 1§ ЭИД50. Через 24 часа после инфицирования к ним подсаживали интактных голубей и

цыплят 35 дневного возраста. Ежедневно в течение 4-х суток от опытных и интактных птиц брали интраназальные смывы. Клиническое наблюдение за птицей вели в течении 10 дней.

Чувствительность диких утят к вирусу гриппа А птиц определяли по результатам внутривенного заражения. Утят 4-х недельного возраста заражали вируссодержащей ЭЭЖ в дозе 5,0 lg ЭИД50. Клиническое наблюдение за дикими утятами вели в течение 10 дней.

2.1.2.7. Определение интравенозного индекса патогенности.

Определение интравенозного индекса патогенности (IVPI - intra-venous

pathogenic index) проводили в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здоровья (ВОЗ). Для этого, 10-ти цыплятам 4-8 - ми недельного возраста внутривенно вводили по 0,2 см3 вируссодержащей ЭЭЖ (в разведении 10"1 на ЗФР, рН 7.2-7.4) с соблюдением асептики и антисептики. Наблюдение за цыплятами вели в течении 10 суток.

2.1.2.8. Получение специфической сыворотки к вирусу гриппа А птиц.

Для получения специфической сыворотки использовали взрослых кур в возрасте 180 дней и коз в возрасте четырёх месяцев. Для иммунизации использовали очищенный и концентрированный вирус гриппа А птиц подтипа H5N1 с гемагглютинирующей активностью 1:1024. При первой иммунизации антиген вводили из расчета 512 ГАЕ/кг массы тела, а при последующих - 1600 ГАЕ/кг массы тела. Первую прививку коз проводили внутривенно, а кур -внутримышечно. Последующие прививки коз проводили подкожно в несколько точек. Кур прививали внутримышечно.

2.1.2.9. Электронная и иммунноэлектронная микроскопия.

Электронную и иммунноэлектронную микроскопию материалов проводили

с использованием электронного микроскопа фирмы Jeol - Jem 100S при инструментальном увеличении 15000-40000 х.

Исследования проводили под методическим руководством доктора биологических наук В.Н. Пономарёвым.

2.1.2.10. Полимеразная цепная реакция с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР).

С целью изучения гена гемагглютинина вируса гриппа А птиц использовали полимеразную цепную реакцию с этапом обратной транскрипции. Материалами для исследований являлись штаммы вируса гриппа А птиц прошедшие 3

пассажа на куриных эмбрионах. Выделение вирусной РНК проводили с использованием набора реагентов «Рибо-сорб Б» (ЦНИИ Эпидемиологии, г. Москва). Этап обратной транскрипции осуществляли при помощи набора «Реверта-L» производства ЦНИИ Эпидемиологии, г. Москва, согласно инструкции производителя.

Амплификацию проводили на ДНК-амплификаторе «Терцик МС-2» (ДНК-Технология, Россия). Постановка ПЦР включала следующие этапы: 94°С - 2 мин.; 30 циклов 94 °С - 15 сек., 62°С - 35 сек.; и 72°С - 2 мин. Учет результатов проводили при помощи электрофореза в 1,5 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия при стандартных условиях.

Нуклеотидное секвенирование ПЦР продуктов полного гена гемагглютинина вируса гриппа А птиц проводили с использованием набора «BigDye v. 3.1. Terminator» (Applied Biosystems, США) при помощи генетического анализатора ABI PRISM 3130 XL. Анализ и множественное выравнивание полноразмерных генов гемагглютинина вируса гриппа А птиц проводили по методу Clustaw X «BioEdit 6.0».

Исследования проводили при методической консультативной помощи к.в.н. Малоголовкина A.C.

2.1.2.11. Изучение устойчивости вируса гриппа А птиц к воздействию различных температур. Чувствительность штаммов вируса гриппа А птиц изучали к различным температурам: 100°С, 56°С, 18 - 20°С, ± 4 °С, минус 20°С. В опытах использовали вируссодержащую экстраэмбриональную жидкость с активностью 7,5 lg ИД50. Все исследуемые образцы проб были внесены в равном количественном объёме (по 1,0 см3) в стеклянные флоконы. 3. Результаты собственных исследований 3.1. Оценка гемагглютинирующей активности.

Определение гемагглютинирующей активность вируса гриппа А птиц проводили с 1,0 % взвесью эритроцитов петуха и барана. Полученные результаты представлены в табл. № 1.

Из приведённых в табл. №1 данных видно, что все изучаемые штаммы вируса гриппа А птиц обладают гамагглютинирующей активностью в титре от 1:16 и выше. Наивысшей гемагглютинирующей активностью с эритроцитами петуха (1:512) и эритроцитами барана (1:128-1:256) обладают штаммы

А/с1иск/Моуо51Ыг5к/56/05, А/§геЬе/Тууа/ Туу06-1/06, A/chicken/Moscow/2/07 А/сЫскеп/Кгазпос1аг/300/07. Более низкой гемагглютинирующей активностью (1:128) с эритроцитами крови петуха, и с эритроцитами крови барана (1:32 -1:64) обладали штаммы А/гоок/Ко51оу-оп-Ооп/26/()7, А/сЫсксп/КозЮУ-оп-0оп/33/07 А/сЫскеп/Кш^ап/05/05. Эти данные свидетельствуют, что с эритроцитами кур гемагглютинирующая активность вируса гриппа А птиц выше, чем с эритроцитами барана. Не отмечено существенной разницы в гемагглютинирующей активности штаммов, выделенных от домашних и диких водоплавающих, синантропных птиц и домашних кур. Штаммы с высоким уровнем гемагглютинирующей активности могут быть использованы для наработки специфической сыворотки.

Таблица №1

Гемагглютинирующая активность изучаемых штаммов вируса гриппа А

птиц. п=3

№ Наименование штаммов ВГП Титры в РГА

с эритроцитами петуха с эритроцитами барана

1 А/ёиск/Ыоуоз1Ыг5к/56/05 1 512 1:128

2 А^геЬе/Тууа/ Туу06-1/06 1 512 1:256

3 А/сЫскеп/Мозсо\у/2/07 1 512 1:256

4 АУгоок/Яо5Юу-оп-Ооп/26/07 1 128 1:16

5 А/сЫскеп/11о51оу-оп-Ооп/33/07 1 128 1:128

6 А/сЫскеп/Кга5пос1аг/3 00/07 1 512 1:128

7 А/сЬюкеп/Рптоце/1/08 1 256 1:32

8 А/сЫскеп/Ки^ап/05/05 1 128 1:64

3.2. Инфекционная активность и вирулентность вируса гриппа А птиц для куриных и утиных эмбрионов.

Вирулентность вируса гриппа А птиц для куриных и утиных эмбрионов оценивали по величине минимальной летальной дозы (ЛД50).

Опыты с каждым штаммом проводили на 36 куриных эмбрионах 9-11 дневного возраста. Штамм А/с1иск/Моуоз1Ыг5к/56/05 был изучен на утиных эмбрионах 13 -14 дневного возраста.

Данные этих исследований представлены в табл. №2

Таблица №2

Инфекционная активность и вирулентность штаммов вируса гриппа А

для эмбрионов.

п=3

№ Наименование штаммов Инфекционная активность, ^ ЭИДго/см3 Вирулентность (ЛДзо)

Для куриных эмбрионов

1 А/с1иск/Моуо51Ыг5к/56/05 7,00±0,12 3,18±0,48

2 А/егеЬе/Тууа/ Туу06-1/06 8,00±0,18 1,70±0,18

3 А/сЫскеп/Мо5со\у/2/07 6,75±0,25 2,24±0,16

4 А/гоок/Ко5Юу-оп-Ооп/26/07 7,5±0,16 3,72±0,53

5 А/сЫскеп/Кх^о у-оп-Боп/З 3/07 7,75±0,13 2,12±0,16

6 А/сЫскеп/Кгавпоскг/З 00/07 7,00±0,12 2,57±0,08

7 А/сЫскеп/Рптог| е/1 /08 7,75±0,12 1,27±0,18

8 А/сЫскеп/Ки^ап/05/05 7,25±0,25 не исслед.

Для утиных эмбрионов

АЛ1иск/№уо51Ыг5к/56/05 6,5±0,25 0,66±0,11

Данные табл. №2 свидетельствуют, что наиболее высокой инфекционной активностью обладают штаммы вируса Л/§гсЬс/Ту\'а/ Ту\'06-1/06 (большая поганка), А/сЫскеп/Рпто1]е/1/08 (курица), А/гоок/Иоэиэу-оп-Ооп /33/07 (курица), которые накапливаются в титрах от 7,75 до 8.00 ^ ЭИД50/см3, а наиболее низкой инфекционной активностью обладает штамм вируса А/с!иск/Мо уоб ¡Ь¡гек/56/05 (курица) - 6,75 ^ ЭИД50/СМ3.

Вирулентность этих штаммов вируса гриппа птиц для КЭ колеблется в пределах от 1,27 до 3,72 ДД50. Наиболее вирулентными являются штаммы вируса А/сЫскеп/Рптоде/1/08 (1,27±0,18) и А^геЬе/Тууа/ Ту\'06-1/06 (ЛД50-1,70±0,18). Менее патогенными являются штаммы вируса А/гоок/ЯоБЮУ-оп-0оп/26/07 (ЛД5о-3,72±0,53) и А/с1иск/МоУО$1Ыгек/56/05 (ЛД50-3,18±0,48). Остальные штаммы вируса по этому показателю занимают среднее положение. Установлена корреляция между инфекционной активностью и вирулентностью штаммов вируса гриппа птиц. С увеличением инфекционной активности

повышается их вирулентность для КЭ. Наибольшей инфекционной активностью и вирулентностью для КЭ обладает штамм вируса, выделенного от большой поганки, а наименьшей - выделенного от грача. Из штаммов вирусов, выделенных от кур, наибольшей вирулентностью отличается штамм вируса А/сЫскеп/Рптог]е/1/08, который представляет большую опасность для домашних птиц.

Штамм вируса АМиск/Ыоуоз1Ыг5к/56/05 в утиных эмбрионах накапливается в титре 6,5 ^ ЭИД50/см3, а его вирулентность составляет 0,66±0,11 ЛД50, что в пять раз ниже, чем для эмбрионов кур.

3.3. Инфекционная активность и вирулентность вируса гриппа А птиц для кур.

В опытах использовали три штамма вируса гриппа А птиц, выделенные от домашней утки (АА1иск/МоуО51Ыг5к/56/05), большой поганки (А/§геЬе/Тууа/ Туу06-1/06) и курицы (А/сЫскеп/Мозсо\у/2/07), которые обладают различной гемагглютинирующей активностью и вирулентностью для КЭ.

Сравнительную оценку вирулентности штаммов вируса проводили по величине минимальной летальной дозы (ЛД50). Результаты экспериментов представлены в табл. №3

Таблица №3

Инфекционная активность и вирулентность штаммов вируса гриппа А

птиц для кур

п=3

№ Наименование штаммов Инфекционная активность, ^ ЛД50/СМ3 Вирулентность ЛД50

1 А/с!иск/Моуо51Ыг5к/56/05 6,75±0,25 4,78±0,3

2 А^геЬе/Тууа/ Туу06-1/06 7,75±0,12 3,16±0,53

3 А/сЬюкеп/Мо5СО«72/07 7,25±0,13 10±0,6

Данные приведенные в табл. №3 показывают, что вирус гриппа птиц штамма Н5Ы1А/£геЬс/Ту\'а/ Ту\06-1 /06 обладает более высокой инфекционной активностью (7,75±0,12 ^ ЛД50/СМ3) и вирулентностью (3,16±0,53 ЛД50) для цыплят - бройлеров 35 дневного возраста. Вируса гриппа птиц штамм А/ёиск/№уо51Ыг8к/56/05, выделенный от домашней утки, имеет несколько

15

меньшую инфекционную активность (6,75±0,25 ^ ЛД50/см3) и вирулентность (4,78±0,3 ЛД50). Вирус гриппа А птиц Н5Ы1 штамма А/сЫскеп/Мо5СО-№/2/07, выделенный от домашней курицы, характеризуется наименьшей вирулентностью 10±0,6 ЛД50, но его инфекционная активность составляет 7,25±0,13 ^ЛД50/см3.

В результате экспериментов нами были зафиксированы характерные клинические признаки и патологоанатомические изменения при заболевании и гибели подопытных птиц.

Клинические признаки заболевания птиц

Клинические признаки болезни гриппа у экспериментально заражённых кур соответствовали острому течению болезни с высокой смертностью и с быстрым летальным исходом. Для острого течения были характерны следующие признаки: короткий скрытый период (1-3 дня), повышенная температура (43° С), малоподвижность, угнетение, взъерошенность перьев. Гибель птицы наступала на 2 - 4 сутки.

При продолжительности болезни до 5 дней птица была угнетена, отказывалась от корма, выделяла кал зелёно - коричневого цвета.

Патологоанатомические изменения

Патологоанатомическая картина зависела и варьировала от тяжести переболевания болезни. При внешнем осмотре трупов птиц отмечали цианоз и отёк гребня и серёжек, а также цианоз и отёк лап, конъюнктивиты. При вскрытии отмечали обильное скопление в подкожной клетчатке и в полостях тела серозной жидкости, отёчность прилегающих тканей. Часто регистрировали катарально-геморрагическое воспаление слизистых оболочек пищеварительного тракта. Слизистая оболочка кишечника была гиперемирована, утолщена, местами с точечными или пятнистыми кровоизлияниями, кровоизлияния так же наблюдались на слизистой трахеи, тонкого и толстого отделов кишечника.

3.4. Интравенозный индекс патогенности.

Расчёт интавенозного индекса патогенности проводили по формуле:

1УР1= —-, где

10».\"

Б,-число больных в сутки; ТБ;-число тяжелобольных в сутки;

Пг число погибших о сутки; Ы-общее число птиц в эксперименте.

Клиническое состояние каждой птицы оценивали при помощи коэффициентов:

0 - птица клинически здорова;

1 - птица клинически больная (угнетение, отказ от корма и воды, цианоз кожи или её производных, нарушения со стороны респираторного или пищеварительного тракта, нервные явления);

2 - птица клинически тяжело больная (проявление одновременно несколько ярких клинических признаков инфекции);

3 - погибшая птица.

Индекс 1УР1 может принимать значение от 0,00 до 3,00; при значении 1УР1 = 1,2 и выше штаммы вируса гриппа птиц считаются высокопатогенными.

Результаты определения интравенозного индекса патогенности изучаемых штаммов на 4-8 -недельных цыплятах бройлерах представлены на рис. 2

изучаемые штаммы вируса гртша птиц

контроль

Рисунок 2. Значения индексов интравенозной патогенности

Из представленных на рис. 2 данных следует, что на основании величины интравенозного индекса патогенности все изученные штаммы вируса гриппа А птиц относятся к числу высокопатогенных. Их интравенозный индекс превышает стандарт ВОЗ (1,2) в 1,5-2 раза. Более высоким индексом интравенозной патогенности характеризуется штамм вируса гриппа птиц А/с1иск/Шуо$1Ыг$к/5б/05, выделенный от домашней утки, а наименьшим -

штамм вируса А/ chicken /Rostov-on-Don/33/07 выделенный от курицы. Вирус гриппа А кур штамм A/PR-/34+A/Seal/Massachusets/l/80 (H7N1), который был взят для сравнительной оценки, являлся слабо патогенным, так как его индекс интравенозной патогенности составлял 0,3.

3.5. Инфекционность штаммов вируса гриппа птиц для голубей и диких

утят.

Домашние беспородные голуби не заболевали при экспериментальном назальном и внутримышечном заражении вирусом гриппа А птиц штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 в дозе 5,0 и 6,0 lg ЭЛД50 соответственно. Из назальных и клоакальных смывов в течение всего периода наблюдения вирус не был выделен, что свидетельствует об отсутствии вирусоносительства у голубей.

Дикие утята заболевали гриппом А птиц при внутривенном заражении штаммами A/duck/Novosibirsk/56/05 и A/grebe/Tyva/Tyv06-l/06 в дозе 6,0 lg ЭЛД50. В результате опыта установлено, что из 15 зараженных утят заболело и пало 5 голов (33%). Клинические признаки у заболевших утят характеризовались слабым угнетением, отказом от корма, жаждой, конъюнктивитами. Заболевшие утята погибли на 5 -7 сутки после заражения. Из органов павших утят был выделен вирус гриппа А птиц подтипа Н5. От не заболевших утят вирус гриппа не выделили.

3.6. Культуральные свойства изучаемых штаммов вируса гриппа А птиц.

Исследования проводили на первичной (ФЭК) и перевиваемых культурах

клеток (ПТП, SK-6, ПСГК).

Было испытано два метода культивирования вируса гриппа А птиц на культурах клеток обычным способом и в присутствии трипсина. Результаты исследований представлены в табл. №4.

Данные табл. №4 свидетельствуют, что изучаемые штаммы вируса гриппа А птиц различаются по накоплению, как в первично трипсинизированной культуре ФЭК, так и в перевиваемых культурах клеток ПСГК, ПТП и SK-6. Все штаммы вируса гриппа А птиц репродуцировались в более высоких титрах в перевиваемой культуре клеток ПТП, как при культивировании обычным способом (4,50-5,25 lg ТЦД50/см3), так и в присутствии трипсина (5,25-6,75 lg ТЦД50/СМ3). В других перевиваемых культурах клеток титры вируса составляли 2,5 - 4,5 lg ТЦД50/см3 (без трипсина) и до 5,5 lg ТЦД50/см3 (в присутствии трипсина).

На первично трипсинизированной культуре клеток ФЭК титр составляет от 6,75 до 7,25 ^ ТЦД50/см3. Таким образом, для выделения вируса гриппа рекомендуется использовать первично трипсинизированную культуру клеток фибробластов эмбрионов кур и перевиваемую линию клеток ПТП с культивированием в присутствии трипсина. Следует так же отметить, что вирус гриппа А птиц подтипа Н5 хорошо репродуцируется в свиных культурах клеток ПТП и БК-6, что свидетельствует возможности его размножения в организме свиней.

Таблица №4

Уровень накопления вируса гриппа А птиц в различных культурах клеток

п = 3

№ Наименование Культура Биологическая активность

штаммов клеток Уровень накопления вируса в

культурах клеток

не обработанных обработанных

трипсином ^ трипсином ^

ТЦДзо/см3 ТЦДзо/см3

ГА ГА

1 А/с1иск/Моуоз1Ыг5к/5 ПТП 4,5±0,10 1:32 6,75±0,25 1:64

6/05 вК-6 3,25±0,12 1:32 4,75±0,17 1:32

ПСГК 2,75±0,12 1:16 не.иссл. -

ФЭК 7,25±0,15 1:32

2 А/§геЬе/Тууа/ ТууОб- ПТП 4,5±0,12 1:16 5,5±0,12 1:16

1/06 БК-6 3,5±0,17 1:8 4,5±0,12 1:16

ПСГК 4,5±0,25 1:16 не.иссл. -

ФЭК 7,5±0,10 1:32

3 А/сЫскеп/Мо8со\у/2/ ПТП 5,25±0,17 1:32 5,25±0,10 1:32

07 БК-6 2,5±0,25 1:16 5,5±0,12 1:32

ПСГК 2,5±0,25 1:16 не.иссл. -

ФЭК 6,75±0,10 1:32

Примечание: ГА- гемагглютинация.

3.7. Изучение устойчивости вируса гриппа А птиц к воздействию различных температур.

В результате исследований установлено, что все штаммы вируса гриппа А птиц, выделенные на территории Российской Федерации, одинаковы по чувствительности к воздействию положительных температур. При температуре 100°С вирус инактивируется в течение одной минуты, при 56°С -через 8 минут, при комнатной температуре активность вируса сохраняется до 35 дней, а при 4°С - более 6 месяцев.

3.8, Получение специфической сыворотки.

С целью изучения возможности использования штаммов в диагностических целях были проведены исследования по получению типоспецифической сыворотки к вирусу гриппа А птиц подтипа Н5. Для этого приготовили инактивированный антиген вируса гриппа птиц штаммов А/с1иск/Моуо51Ыг5к/56/05 и А/сЫскеп/Кш^ап/05/05, который использовали для иммунизации кур и коз (п. 2.1.2.8).

Серологическими исследованиями подтверждена специфичность полученных сывороток от кур и коз к вирусу гриппа А птиц ко всем изученным штаммам вируса гриппа А птиц подтипа Н5 (АЛ1иск/ЫоуО8а)Ыс/56/05, А^геЬе/Тууа/ Ту\'06-1/06, А/сЫскеп/Мо5со\у/2/07, А/гоок/КозЮу-оп-Ооп/26/07, А/сЫскеп/Яо51оу-оп-Ооп/33/07,

А/сЫскеп/Кга5пос1аг/300/07, А/сЫскеп/Рптоце/1/08, А/сЫскеп/Киг§ап/05/05). Специфические сыворотки к вирусу гриппа А птиц были использованы для исследований в РЗГА и иммуной электронной микроскопии. Титр типоспецифической лиофилизированной сыворотки, полученной от кур и коз, в РЗГА составил 1:256,1:512 соответственно.

3.9. Электронная микроскопия

В для исследований использовали концентрированный и очищенный вирус гриппа А птиц (ВГП) штамма А^геЬе/Тууа/ Туу06-1/06 (Н5М1), полученный на конечном этапе очистки центрифугированием в градиенте плотности сахарозы 20 - 60%. Препарат наносили на медную сеточку с нитроцеллюлозой, напылённой углеродом, контрастировали 3 - 4% фосфорно-вольфрамовой кислотой (ФВК) рН 7,0 и просматривали при инструментальном увеличении 15000-40000 х.

Показано, что вирионы гриппа А птиц представляют собой полиморфные частицы размером 80-120 нм (рис.3-4). По размеру вирионы соответствуют таковым вирусу гриппа А птиц.

Рис. 3. ВГП в электронном Рис. 4. ВГП в электронном микроскопе при негативном микроскопе при контрастировании. инструментальном увеличении

150000 х.

3.10. Иммунная электронная микроскопия.

Иммунную электронную микроскопию проводили по методу М.Б. Королёва (1989 г.). На медную сеточку наносили по 5 - 10 мкл очищенного вируса гриппа А птиц, выдерживали до почти полного испарения жидкости (30-40 мин), затем наносили 10 мкл специфической сыворотки козы к вирусу ГП подтипа Н5 с активностью в РЗГА 1:256. Сыворотку разбавляли 1:100 забуференным физиологическим раствором. Сеточку помещали во влажную камеру при 37° С на 30 минут, избыток влаги удаляли фильтровальной бумагой и наносили 5 мкл белка А, меченного коллоидным золотом, в разведении от 1:50 до 1:100 на забуференном физиологическом растворе. Через 15-30 минут препарат промывали дистиллированной водой и контрастировали 3 - 4% ФВК. Приготовленный препарат просматривали под электронном микроскопом фирмы Jeol - Jem 100S при инструментальном увеличении от 15000-40000х.

Данные исследования проводили с использованием специфической сыворотки козы к вирусу гриппа А подтипа Н5с целью подтверждения наличия вируса гриппа и отношения его к подтипу Н5.

В результате взаимодействия специфической козьей сыворотки с белком А, меченным коллоидным золотом, под электронным микроскопом метку обнаруживали на поверхности вирусных частиц или вблизи их в виде чёрных точек. Отдельные вирусные частицы связывались с несколькими гранулами коллоидного золота, а иммунный комплекс - с большим количеством частиц золота, что значительно облегчало их визуализацию (рис.5). Специфические

L.

комплексы антиген-антитело выявлялись за счёт связывания белка А стафилококка, меченного золотом, с Ис фрагментами антител специфической сыворотки, полученной от коз.

В качестве контроля аналогичные исследования проводили с вирусом гриппа А птиц подтипа Н1. На рис. 6 видно, что иммунный комплекс с вирусом гриппа подтипа Н1 не образовывался.

Рис. 5. Результат взаимодействия специфической сыворотки с гомологичным вирусом гриппа А подтипа Н5.

Рис. 6. Результат взаимодействия специфической сыворотки гетерологичиым вирусом гриппа А подтипа Н1.

Таким образом, полученные результаты подтверждают принадлежность изученных штаммов к вирусу гриппа А птиц подтипа Н5 и возможности использования этого метода для идентификации вируса гриппа.

3.11. Молекулярно-генетические исследования.

С целью установления различий между депонированными в коллекции микроорганизмов ГУ ВНИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН штаммами и использованными в нашей работе вирусами гриппа А птиц, проведено нуклеотидное секвенирование полного гена их гемагглютинина. Анализ нуклеотидных последовательностей показал идентичность гена гемагглютинина изучаемых штаммов (прошедших 1 пассаж на взрослой птице и 3 пассажа на куриных эмбрионах) с последовательностями гена гемагглютинина использованных в исследованиях культуральных штаммов ГУ ВНИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, опубликованных в базе данных ОепВапк.

4. ВЫВОДЫ

1. Изученные штаммы вируса гриппа А птиц подтипа Н5 (АЛ1иск/МоуО51Ыг5к/56/05, А/§геЬе/Тууа/ Туу06-1/06, А/сЫскеп/Мозсош/2/07, А/гоок/ЛоБЮ у-оп-0оп/26/07, А/сЫскеп/11о51оу-оп-Ооп/33/07, А/сЫскеп/Кгазпос1аг/300/07, А/с1мскеп/Рптог]е/1/08) являются высокопатогенными для всех возрастов кур и вызывают их гибель через 72 - 96 часов после внутримышечного заражения, их интравенозный индекс патогенности превышает стандарт ВОЗ (1,2) в 1,5 раза. У кур заболевание гриппом протекает в острой форме. Дикие утята были восприимчивы к гриппу при внутривенном заражении. Голуби были не восприимчивы к вирусу гриппа при внутримышечном, назальном и контактном заражении.

2. Вирулентность штаммов А/сЫскеп/Рптог]е/1/08 и А^геЬе/Туыа/ ТууОб-1/06 для куриных эмбрионов составила 1,27±0,18 и 1,70±0,18 ЛД50, а штаммов А/сЫскеп/Мо5соУ!/2/07, А/гоок/Яо5Ш-оп-Ооп/2б/07 и А/Мскеп/Кга$пос1аг/300/07

- 2,24±0,16; 3,72±0,53 и 2,57±0,08 ЛД50 соответственно. Штамм А/с1иск/Ыоуо$Шг$к/56/05 обладал высокой вирулентностью для утиных эмбрионов, его ЛД50 составила 0,66±0,11 что почти в пять раз ниже по сравнению с его ЛД50 для куриных эмбрионов.

3. Гемагглютинирующая активность изучаемых штаммов вируса гриппа А птиц с эритроцитами крови петуха составила 1:128 - 1:512, а с эритроцитами крови барана - 1:32 - 1:256, что указывает на целесообразность использования в серологических реакциях эритроцитов крови петуха.

4. В первично-трипсинизированной культуре клеток ФЭК и перевиваемой культуре клеток ПТП вирус гриппа А накапливается в титрах 6,75 - 7,50 и 4,50

- 5,25 ТЦД50/СМ3 соответственно. В присутствии трипсина накопление вируса в культурах клеток ПТП и 8К-6 было выше на 1- 2,25 1е ТЦД50/см3.

5. Изученные штаммы вируса гриппа птиц (А/с1иск/ЫоУоз1Ь1г5кУ56/05, А^геЬе/Тууа/ Туу06-1/06, А/сЫскеп/Мозсо\у/2/07, А/гоокЛ1оз1оу-оп-Ооп/26/07, А/сЫскеп/Ио5Юу-оп-Ооп/33/07, А/сЬюкеп/Кга5пос1аг/3 00/07, А/сЫскеп/Рптог]е/1/08) обладают высокой чувствительностью к положительным температурам. При температуре 100°С вирус гриппа инактивируется в течение минуты, при температуре 56°С - инактивируется через 8 минут, при комнатной температуре вирус сохраняется до 35 дней, а при 4°С - в течение 6 месяцев.

6. Штаммы вируса гриппа птиц А/сЫскеп/Курган/5/05 и A/duck/Novosibirsk/56/05 могут быть использованы для получения высоко активных специфических сывороток на козах и курах.

7. Молекулярно - генетические исследования последовательности гена гемагглютинина изученных штаммов вируса гриппа подтверждают их принадлежность к подтипу Н5.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

• Паспортизированные штаммы вируса гриппа А птиц (A/duck/Novosibirsk/56/05, А/grebe/Tyva/ Tyv06-l/06, A/chicken/Moscow/2/07, A/rook/Rostov-on-Don/26/07, A/chicken/Rostov-on-Don/33/07, A/chicken/Krasnodar/3 00/07, A/chicken/Primorje/1/08) используются в ГНУ ВНИИВВиМ для проведения НИР, диагностики и идентификации возбудителя болезни.

• Разработанные «Методические рекомендации по отбору материала от птиц для вирусологических и серологических исследований» применяются при диагностических исследованиях.

• Результаты изучения биологических свойств (вирулентность для кур, КЭ и устойчивость во внешней среде при положительных температурах) изученных штаммов вируса гриппа А птиц рекомендуются использовать при уточнении вирулентности выделенного возбудителя болезни и организации противоэпизоотических мероприятий.

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Изоляция штаммов вируса гриппа A/H5N1 от домашних и диких птиц в

период эпизоотии в Западной Сибири и их депонирование в Государственную Коллекцию вирусов РФ / Д.К. Львов, М.Ю. Щелканов, П.Г. Дерябин, Т.В. Гребенникова, А.Г. Прилипов, Е.А. Непоклонов, Г.Г. Онищенко, H.A. Власов, Т.И. Алипер, А.Д. Забережный, Д.Е. Киреев, О.П. Крашенинников, С.Т. Кирюхин, Е.И. Бурцева, А.Н. Слепушкин // Вопросы вирусологии. - 2006. - Т. 51,№ 1.-С. 11-14.

2. Молекулярно-генетический анализ биологических свойств высокопатогенных штаммов вируса гриппа А / H5N1, изолированных от диких и домашних птиц в период эпизоотии в Западной Сибири. Д.К. Львов, А.Г.

Прилинов, М.Ю. Щелканов, П.Г. Дерябин, A.A. Шилов, Т.В. Гребенникова, Г.К. Садыкова, О.В. Ляпина// Вопросы вирусологии. - 2006. - Т. 51, № 2. - С. 15-19.

3. Чвала И.А. Биологические свойства изолятов вируса гриппа А птиц, выделенных в Российской Федерации: автореферат дис... канд. вет. наук / Чвала И.А. - Владимир, 2008.

4. Шаршов K.P. Биологические свойства штаммов вируса гриппа H5N-субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в различных регионах России: автореферат дис... канд. биол. наук / Шаршов K.P. - Новосибирск, 2010.

5. Avian H5N1 influenza in cats / T. Kuiken, G. Rimmelzwaan, D. van Riel, G. van Amerongen, M. Baars, R. Fouchier, A. Osterhaus // Science.- 2004,- Vol. 306.- P. 241.

6. Characterization of a Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Virus Isolated from Duck Meat / M. Terrence, Tumpey, L. David, Suarez, E. L. Laura, Perkins, A. Dennis, Senne, Lee Jae-gil, Lee Youn-Jeong, Mo In-Pil, Haan-Woo Sung, and E. David. Swayne// Journal of Virology. - 2002. - Vol. 76, №12. - P. 6344-6355.

7. Reemerging H5N1 influenza viruses in Hong Kong in 2002 are highly pathogenic to ducks / K.M. Sturm-Ramirez, T. Ellis, B. Bousfield, L. Bissett, K. Dyrting, J.E. Rehg, L. Poon, Y. Guan, M. Peiris, R.G. Webster // Virology.- 2004,-Vol. 78, №9,- P. 4892-4901.

7. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Казарян, A.C. К вопросу индикации и идентификации вируса гриппа птиц / A.C. Казарян // Научные основы производства ветеринарных биологических препоратов: Материалы международного научно - практической конференции Щелково,-2007.-С.57-63.

2. Казарян, A.C.«Оценка биологических характеристик изолятов вируса гриппа птиц, выделенных на территории России в 2005 - 2007 г.г.» / A.C.

Казарян, А.Т. Кушнир // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: Труды муждународной научно практической конференции посвященной 50 летаю ВНИИВВиМ. Покров 2008,- Т.1.- С.-166-169.

3. Казарян, A.C. «Некоторые биологических свойства изолята вируса гриппа, выделенного на территории Курганской области H5N1-КурицаЖурган.)> / A.C. Казарян. // Ветеринария в птицеводстве 2008. - №2. - С.-8-9.

4. Казарян, A.C. «Вирулентность прототипных штаммов вируса гриппа.» / A.C. Казарян, А.Т. Кушнир, М.Ю. Щелканов, Д.К. Львов. //Ветеринария 2009.№7. С- 24-26.

5. Казарян, A.C. «Изучение некоторых биологических свойств изолятов вируса гриппа птиц, выделенных в Московской области и на Республике Тыва». / A.C. Казарян, A.B. Луницин, А.Т. Кушнир, М.Ю. Щелканов. // 4-й Международный ветеринарный конгресс по птицеводству. Москва 2008г. - С. -105-109

6. Казарян, A.C.«Некоторые биологических свойства изолята вируса гриппа, выделенного на территории Курганской области.». / A.C. Казарян // Новое в диагностике и профилактике болезней птиц: Материалы научно-практической конференции С-П. Ломоносово 2008г. - С. -34 - 37.

7. Щелканов, М.Ю. Динамика вирулентности штаммов высоковирулентного вируса гриппа A/H5N1 генотипа 2.2, изолированных на территории РФ 2005-2007гг. / М.Ю. Щелканов, А.Г. Прилипов, Д.К. Львов, И.Т. Федякина, A.C. Казарян, И.В. Галкина, Т.Н. Морозова, А.Т. Кушнир, H.A. Власов, П.Г. Дерябин // Вопросы Вирусологии 2008г. -№2. - С.- 8 -17.

8. Казарян, A.C. // «Первый прорыв нового для России генотипа 2.3.2 высоковирулентного вируса гриппа A/H5N1 на Дальнем Востоке».! Д.К. Львов., М.Ю. Щелканов, H.A. Власов и другие // Вопросы Вирусологии 2008 г. - №5. - С. -4 - 9.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области. Тираж 80 экз

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Казарян, Аркадий Сасунович

Список сокращений.

1. Введение.

1.1. Актуальность темы.

1.2. Степень разработанности проблемы.

1.3. Цель и задачи исследований.

1.4. Научная новизна.

1.5. Практическая значимость.

1.6. Апробация и публикации результатов исследований.

1.7. Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1.8. Личный вклад автора в выполнение работы.

2. Обзор литературы.

2.1. Грипп птиц.

2.1.1. Общая характеристика болезни.

2.1.2. Эпизоотическая ситуация по гриппу птиц в Российской Федерации и в мире.

2.1.3. Характеристика возбудителя.

2.1.4. Диагностика заболевания.

2.1.5. Меры профилактики и борьбы.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Биологические свойства вируса гриппа птиц подтипа H5, выделенного на территории Российской Федерации"

1.1. Актуальность темы.

Грипп птиц относится к числу особо опасных болезней, наносящих большой экономический ущерб птицеводству и представляет определённую опасность для людей [Кильбурна Э:Д., 1978; Сюрин В.Н., и соавт., 1998; Каверин Н.В., Смирнов Ю.А., 2003]. Вирус имеет множественность серотипов, отличающихся между собой по геммаглютинину и нейраминидазе, что существенно затрудняет проведение диагностических исследований и организацию профилактических мероприятий. Известно 16 серотипов, отличающихся между собой по гемагглютинину, и 9 подтипов, отличающихся по нейраминидазе [Сюрин В.Н., и соавт., 1998, 1984;]. При одновременной циркуляции в организме нескольких серотипов вируса возможны генетические изменения в структуре его генома, что периодически приводит к возникновению новых вариантов возбудителя и вспышкам широкомасштабных эпизоотий [Покровский В.И., 2005; Джавадов Э.Д., Придыбайло Н.Д., 2006; Липатов A.C., и соавт., 2005]. Эпизоотии гриппа птиц 2005 - 2008 годов в основном были обусловлены высоковирулентными штаммами вируса гриппа 5 и 7 подтипов. Мониторинг подтиповой принадлежности вируса гриппа птиц проводится постоянно, так как факты выделения возбудителя болезни от птиц различных видов регистрируются ежегодно во всех регионах земного шара. Выделяемые из очагов вирусы гриппа, в обязательном порядке, оцениваются по патогенности, характеристике генома и другим биологическим свойствам, что необходимо при разработке средств диагностики специфической профилактики и противоэпизоотических мероприятий [Сафонов Г.А., 1984]. В связи с вышеизложенным, изучение биологических свойств выделяемого вируса гриппа птиц в межэпизоотический и эпизоотический периоды является весьма актуальным.

1.2. Степень разработанности проблемы.

Изучение изолятов вируса гриппа А птиц, выделенных на территории

Российской Федерации с начала эпизоотии в 2005 году, проведено в ГУ НИИ; вирусологии им. Д.Й. Ивановского РАМН'(Львов?ДЖ., Щелканов M.IO. и др. 2005 - 2009), ФГУ ВНИИЗЖ (ЧвалаИ.А. и др. 2005 - 2008), ГНУ ИЭВСиДВ, СО Россельхозакадемии (Шаршов. К.А., 2010); 3aiрубежом:: М. Terrence, Ь. David, 2002;. SwaynerKúikemT:,.2004;;.SttorRam^éz:.K

• В работах ГУ НИН вирусологии им. Д.И: Ивановского РАМН изучены вопросы; культивирования вирусов на перевиваемых культурах клеток, определена подтиповая принадлежность,, проведеньт молекулярно генетические исследования полного генома вируса. Вместе с тем выделенные штаммы не были охарактеризованы по патогенности для- кур и куриных эмбрионов, и некоторым другим показателям. Использованные в наших исследованиях* штаммы вируса гриппа А птиц, выделенные в различных-регионах Российской« Федерации, другими- авторами не изучались за исключением, штамма А/grebe/Tyva/ Tyv06-l/06, который- изучался Шаршовым К.А., (2010).

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Казарян, Аркадий Сасунович

5. Выводы.

1. Изученные штаммы вируса гриппа А птиц подтипа Н5 (А/ёиск/№м)81Ыг8к/56/05, А^геЬе/Тууа/ Туу06-1/06, А/сЫскеп/Мо8соду/2/07, А/гоок/Ко8Юу-оп-Воп/26/07, А/сЫскеп/Яоз1оу-оп-Воп/33/07, А/сЫскеп/Кга8пос1аг/300/07, А/сЫскеп/Рптоце/1/08) являются высокопатогенными для всех возрастов кур и вызывают их гибель через 72 — 96 часов после внутримышечного заражения, их интравенозный индекс патогенности превышает стандарт ВОЗ (1,2) в 1,5 раза. У кур заболевание гриппом протекает в острой форме. Дикие утята были восприимчивы к гриппу при внутривенном заражении. Голуби были не восприимчивы к вирусу гриппа при внутримышечном, назальном и контактном заражении.

2. Вирулентность вируса гриппа птиц штаммов А/сЫскеп/Рптог]е/ 1/08 и А^геЬе/Тууа/ Туу06-1/06 для куриных эмбрионов составила 1,27±0,18 и 1,70±0,18 ЛД50, а штаммов А/сЫскеп/Мо$сом>/2/07, А/гоок/Яоз^-оп-Ооп/2б/07 и А/сЬ1скеп/Кга$пос1аг/300/07 - 2,24±0,16; 3,72±0,53 и 2,57±0,08 ЛД50 соответственно. Вируса гриппа штамма А/с1иск/МоуоБШг8к/56/05 обладал высокой вирулентностью для утиных эмбрионов, его ЛД50 составила 0,66±0,11 что почти в пять раз ниже по сравнению с его ЛД5о для куриных эмбрионов.

3. Гемагглютинирующая активность изучаемых штаммов вируса гриппа А- птиц с эритроцитами крови петуха составила. 1:128 - 1:512, а с эритроцитами крови барана - 1:32 — 1:256, что указывает па целесообразность использования в серологических реакциях эритроцитов крови петуха.

4. В первичио-триисинизированной культуре клеток ФЭК и перевиваемой культуре клеток ПТП вирус гриппа А накапливается- в титрах 6,75 - 7,50 и 4,50 - 5,25 % ТЦДзо/см? соответственно. В присутствии трипсина накопление вируса в культурах клеток ПТП и БК-б было выше на 1- 2,25 ^ ТЦД50/см3.

5:' Изученные штаммы вируса гриппа птиц (А/ёиск/7Чоуоз1Ыг8к/56/05, A/grebe/Tyva/ Туу06-1706, . A/chicken/Moscow/2/07, А/гоок/Их^оу-оп-Боп/26/07, А/сЫ скепЛ1о зШ у-оп-Боп/З 3/07, А/сЫскеп/Кгазпоёаг/З 00/07, А/сЫскеп/Ргт1оце/1/08) обладают высокой чувствительностью к положительным температурам. При температуре 100°С вирус гриппа инактивируется в течение минуты, при температуре 5б°С - через 8 минут, при комнатной-температуре вирус сохраняется до 35 дней, а при 4°С - в течение 6 месяцев.

6., Штаммы . вируса гриппа птиц А/сЫскеп/Курган/5/05и ЛМиск/Моуоя 1Ъ¿гя к/5 6/0 5 могут быть использованы для получения высоко: активных специфических сывороток на козах и курах.

7. Молекулярно - генетические исследования последовательности'гена гемагглютинина изученных штаммов вируса гриппа подтверждают их принадлежность к подтипу Н5.

6. Практические предложения.

• Паспортизированные штаммы вируса гриппа А птиц (А/ёискЛЧоУоз1Ыгзк/56/05, А/§геЬе/Тууа/ Туу06-1/06, А/сЫскеп/Мозсо\у/2/07, А/гооШозШу-оп-Воп/26/07, А/сЫскеп/КозЮу-оп-Воп/33/07,

А/сЫскеп/Кгазпос1аг/300/07, А/с1пскеп/Рптог|е/1/08) используются в ГНУ ВНИИВВиМ для проведения: НИР, диагностики и идентификации возбудителя болезни.,

• Разработанные «Методические рекомендации по отбору материала от птиц для вирусологических и серологических исследований» предлагаются для применения при диагностических исследованиях.

• Результаты изучения биологических свойств (вирулентность для кур, КЭ и устойчивость во внешней среде при положительных температурах) изученных штаммов вируса гриппа А птиц рекомендуются для использования при уточнении вирулентности выделенного возбудителя болезни и организации противоэпизоотических мероприятий

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Казарян, Аркадий Сасунович, Покров

1. Анализ потенциальных участков рекомбинации в генах гемагглютинина вирусов гриппа животных в отношении их адаптации к новому хозяину человеку/ В. М. Блинов, О.И. Киселев, С. М. Ресенчук и др. Вопросы вирусологии. 1993. т. 38, С.263-268.

2. Болезни сельскохозяйственных птиц: справочник / сост. A.A. Лимаренко, И. С. Дубров, А. А. Таймасулов, С. Н. Забашта. СПб.: Издательство «Лань», 2005. — 448.

3. Венгеренко, Л.А. / Защита птицеводческих хозяйств от заноса возбудителей заразных болезней // Птица и птицепродукты. 2006. № 3. С. 34 -37.

4. Вирусология / Б.Н. Филдс и др. Т. 1-3.-М.: Мир, 1989.- 295с.

5. Вирусология: Методы / Т. Баррет и др. М.:- Мир, 1988,- 344с.

6. Вирусы гриппа и грипп / Э. Д. Кильбурна.- М.: Медицина 1978, 585 е., ил.

7. Вирусные болезни животных/ В.Н. Сюрин, А .Я. Самуйленко, Б. В. Соловьев, Н.В. Фомина.- М.: ВНИИТИБП. 1998. - 928с.

8. Виткова, О.Н. Эпизоотическая ситуация по гриппу птиц и лабораторная диагностика гриппа птиц /О.Н. Виткова // Актуальныепроблемы промышленного птицеводства грипп птиц. — СПб.: ЛЕНЭКСПО, 2005. - С.17-19.

9. Гендон Ю.З. Пандемия гриппа: можно ли с ней бороться? // Вопросы вирусологии.- 1998.-№1.

10. Генетика вируса гриппа/ под редакцией П. Пейлиза, Д. У. Кингсбери.-М.: Медицина, 1986.11. «Грипп птиц: происхождение инфекционных биокатастроф». Сб. научных статей / под ред. В.И. Покровского. М.;- СПб.: Росток, 2005. - 269 с.

11. Грипп птиц. Стратегия противодействия трагедии пандемии // Э.Д. Джавадов и др. // Ветеринария в птицеводстве. 2005. № 3/6. С. 4 9.

12. Джавадов, Э.Д., Придыбайло Н.Д. / Актуальные проблемы эпизоотологии, диагностики и профилактики гриппа птиц // Ветеринария в птицеводстве. 2006. № 3. С. 4 — 12.

13. Дорошенко Е.М. «Этот непонятный птичий грипп»/Е.М. Дорошенко. 2-е изд., перераб. и доп.— М.: ВЕДИ, 2006. — 56 с.

14. Дифференциальная диагностика гриппа птиц методом ПЦР / И.М. Обухов, Г.А. Шипулин, С.Б. Яцышина и соавт. // БИО. 2006. №4. - С. 14-15.

15. Ершов Ф.И., Интерфероны и их индукторы. Ф. И. Ершов, О. И. Киселев.- М.: Геота, 2005.

16. Жданов, В.М. Вирусология / В.М. Жданов, С .Я. Гайдамович.-М.: Медицина. 1966, - 480с.

17. Жилинская, И.Н. Структура вируса гриппа / И.Н. Жилинская // Успехи современной биологии.- 1983.- Т.95, Вып.З.- С.373-382.

18. Ибрагимов А. Особенности течения, клиники и патоморфологии гриппа птиц // Птицеводство. 2006. № 4. С. 42-44.

19. Изоляты вируса гриппа А подтипа Н5Ш, выделенные от домашней птицы в Курганской области в 2005 году: молекулярно-генетическая характеристика. О.И. Киселёв, В.М. Блинов, М.М. Писарева, В.А. Терновой,

20. А.П. Агафонов, Д.В.Сараев, М.Ю. Еропкин, Т.Г. Лобова, В.А. Григорьева, М.П. Грудинин // Молекулярная биология. 2008. - Т. 42. - № 1. - С. 78-87.

21. Каверин Н.В. Межвидовая трансмиссия вирусов гриппа А и проблема пандемий / Н.В. Каверин, Ю.А. Смирнов // Вопросы вирусологии. -2003.-№3.-С. 4-10.

22. Кадомников, Ю.П. Применение меченных коллоидным золотом антител для индикации вирусных антигенов / Ю.П Кадомников, В.Б. Григорьев, Е.И. Исаев и др // Вопросы Вирусологии, 1982. №2. С. 225 - 230

23. Казарян, A.C. «Вирулентность прототипных штаммов вируса гриппа.» / A.C. Казарян, А.Т. Кушнир, М.Ю. Щелканов, Д.К. Львов. //Ветеринария 2009.Ж7. С- 24-26.

24. Карпухин, Г.И. Грипп: Руководство / под ред. Г.И.Карпухина Л.: Медицина, 1986.-352с.

25. Кильбурн, Э.Д. Вирусы гриппа и грипп / Под ред. Э.Д. Кильбурна, Д.К.Львова.- М.: Медицина, 1978.- 585с.: ил.

26. Коренберг Э.И. Что такое природный очаг. М., 1983.

27. Коровин, Р. Н. Лабораторная диагностика болезней птиц. Справочник / Р. Н. Коровин., В. П. Зеленский., Г.А Грошева М.: Агропромиздат, 1989.

28. Королёв М.Б. // Итоги науки и техники: Вирусология. — М., 1986, Т. 12.-С 142-177.

29. Лагуткин, H.A., Лутовинов. В. / Непредсказуемость гриппа1 А // Птицеводство. 2001. №6. С. 27 - 30.

30. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин.- М.: Высшая школа, 1990. -352с.

31. Лобанова Т.П., Кихтенко Н.В. Отдел научно-технической информации ГНЦ ВБ "Вектор", Кольцово, Новосибирской обл. 2004 г.

32. Лурия, С. Общая вирусология / С. Лурия, Дж. Дарнелл. М.: - Мир, 1970.-423с.

33. Львов, Д. К. Комплексные исследования по экологии вирусов / Д.К. Львов // Экология вирусов. М., 1982. - С. 5-9.

34. Львов, Д. К. Популяционные взаимодействия в биологической системе: вирусы гриппа А дикие и домашние животные - человек / Д.К. Львов // БИО. - 2005. - №6. - С.2-6.

35. Львов, Д. К., Забережный А.Д., Алипер Т.И. Вирусы гриппа: события и прогнозы / Д.К. Львов, А.Д. Забережный, Т.И. Алипер // Природа. 2006. -№6.-С. 3-13.

36. Лярски, 3; Диагностика вирусных болезнешживотных / пер. с пол. Т. Г. Орловского, Я. С. Ляндесберга; под ред. В.Н. Сюрина. — М.: Колос, 1980. — 400 с., пл. ' \ ; •

37. Медицинская »вирусология. Руководство под редакцией Д.К. Львова. -М.:МИА, 2008.-656 с.

38. Медицинская микробиология (под ред. В.И. Покровского и O.K. Поздеева). М.: Гэотар Медицина, 1999.

39. Методы, лабораторной диагностики вирусных болезней; животных: справочник / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Б.В; Соловьев, В.Н. Фомина. М.: Агропромиздат, 1986. - 351с.

40. Suarez // Вопросы вирусологии. 2007. - Т: 52, № 6. - С. 40-47. .

41. Осидзе, Н.Г. Грипп птиц: этиология, патогенез^ диагностики, специфическая профилактика, меры борьбы: автореф.* Дис. д-ра. биол.наук / Н.Г. Осидзе. М.,- 1980.- 32 с.

42. Покровский, В;И, Киселёв О.И, Цыбалова JIM. Взаимосвязь эпидемиологических и эпизоотических аспектов при решении проблемы высокопатогенного гриппа птиц (H5N1) / Ветеринария в птицеводстве. 2006. №3. С. 13-31.

43. Птичий грипп. // Научно производственный справочник. М., 2007. -5-21.

44. Разработка средств молекулярной диагностики гриппа А // Т.В. Гребенщикова, Д.Е. Киреев, А.Д. Забережный, Т.И. Алипер //БИО март 2006 - С.23-24.

45. Разработка тест-систем для выявления и типирования вируса гриппа А на основе полимеразной цепной реакции / Д.Е. Киреев, Д.С. Аканина^ Т.В.

46. Гребенникова, А.Д. Забережный, М.Ю. Щелканов, Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. 2007. - Т. 52. № 4. - С. 17-22.

47. Сафонов, Г. А. Разработка и усовершенствование средств диагностики и специфической профилактики Ньюкаслской болезни и гриппа птиц: дис. д-ра. биол. наук. / Сафонов Георгий Анатольевич.- Покров, 1984.33 с.

48. Сергеев, В. А. Репродукция и выращивание вирусов животных / В.А. Сергеев,-М.:-Колос, 1976.-303 с.

49. Сургучева, И .М. Анализ глипопротеидов вируса гриппа А птиц и усовершенствование средств диагностики: автореферат дис. канд. вет. наук / Сургучёва И.М. Покров, 1994.

50. Сургучева, И. М. Анализ глипопротеидов вируса гриппа А птиц и усовершенствование средств диагностики: дис. канд. вет. наук Сургучевой И.М. Покров, 1994. - 142с.

51. Сюрин, В. Н. Диагностика вирусных болезней животных. Справочник / В.Н Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина.-М.: Агропромиздат, 1991.- 166-195 с.

52. Сюрин, В. Н. Ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина.- М.- Колос, 1984.-376 с.

53. Чвала И.А. Биологические свойства изолятов вируса гриппа А птиц, выделенных в Российской Федерации: автореферат дис. канд. вет. наук / Чвала И.А. Владимир, 2008.

54. Alexander, D.J. A review of avian influenza in different bird spicies / DJ. Alexander // Veterinary Microbiology.- 2000.- Vol. 74, №>1-2.- P. 3-13.

55. An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibody against avian influenza virus / D.B. Snyder, W.W. Marquardt, F.S. Yancey, P.K. Savage // Avian Diseases. 1985:- Vol.29, №1.- P. 136-144.

56. Assessment of the pathogenicity of an emerging influenza A H5 virus in ostriches (Struthio camelus) / A. Clavijo, J. Riva, J. Copps, Y. Robinson, E.-M. Zhou // Avian Pathology.- 2001,- Vol. 30, № 1.- P. 83-89.

57. Avian H5N1 influenza in cats / T. Kuiken, G. Rimmelzwaan, D. van Riel, G. van Amerongen, M. Baars, R. Fouchier, A. Osterhaus // Science.- 2004.- Vol. 306.- P. 241.

58. Avian influenza virus (H7 serotype) in a saker falcon in Italy / S. Magnino M. Fabbi, A. Moreno, G. Sala, A. Lavazza, E. Ghelfi, L. Gandolfl, G. Pirovano, F. Gasperi // Vet. Rec.- 2000.- Vol. 146, № 25.- P. 740.

59. Avian Flu Virus Linked'to Human Conjunctivitis and.Fatal ARDS Case / Proc. Natl. Acad. Sci. 2004. - Vol. -P. 101:1356-1361.

60. Avian paramyxoviruses and influenza viruses isolated from mallard ducks (Anas platyrhynchos) in New Zealand / W.L. Stanislawek, C.R. Wilks, J. Meers,

61. G.W. Homer, D.J. Alexander, RJ. Manvell, J.A. Kattenbelt, A.R. Gould // Archives of Virology.- 2002.- Vol. 147.- P. 1287-1302.

62. Biancifiori F. An occurence of newcastle disease in pigeons: virological and serological studies of the isolates. / F. Biancifiori, A. Fiorini // Comp. Immunology Microbiology Infected Diseases.- 1983.- Vol.6.- P.247-252.

63. Bregman D.,Kurland L., Nathanson N. / Epidemiological and clinical evaluation of Guillain-Barre syndrom reported in association with the administration of swine influenza vaccine. Am. // J. Epidemiol. 1984. P. 119, 841-845.

64. Brownlee, G. G. The predicted antigenicity of the haemagglutinin of the 1918 Spanish influenza pandemic suggests an avian origin / G. G. Brownlee, and E. Fodor // Phil.Trans. R. Soc.-2001. Vol.-P. 356, 1871-1876.

65. Capua, I. The avian influenza epidemic in Italy, 1999-2000 a review / I. Capua, S. Marangon// Avian Pathology.- 2000.- Vol. 29, №4.- P. 289-294 (89)

66. Characterization of a Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Virus Isolated from Duck Meat / M. Terrence, Tumpey, L. David, Suarez, E. L. Laura, Perkins, A. Dennis, Senne, Lee Jae-gil, Lee Youn-Jeong, Mo In-Pil, Haan-Woo

67. Sung, and E. David. Swayne // Journal of Virology. 2002. - Vol. 76, №12. - P. 6344-6355.

68. Characterization of a new avian-like influenza A virus from horses in China / Y. Guo, Wang , Y. Kawaoka, O. Gorman, T. Ito, T. Saito, R. G. Webster, Virology. 1992. - Vol. 188 №1. - P. 245-255.

69. Characterization of two influenza A viruses from a pilot whale. V. S. Hinshaw, W.J. Bean, J. R. Geraci, P. Fiorelli, G. Early, R. G. Webster // J. Virology. 1986. - Vol. 58. - P. 655-6.

70. Characterization of virulent and avirulent AJ Chicken/Pensylvania/83 influenza A viruses: potential role of defective interfering RNAs in nature / W.J. Bean, Y. Kawaoka,.M. Wood J et al. J. Virol. 1985, Vol. 54, P. 151-160.

71. Coinfection of wild ducks by influenza A viruses distribution patterns and biological significance / G.B. Sharp, Y. Kawaoka, D.J. Jones, W.B. Bean, S.P. Pryor, V. Hinshaw, R.G. Webster // Virology.- 1997,- Vol. 71, № 8.- P. 6128-6135

72. Continued Circulation in China of Highly Pathogenic Avian Influenza Viruses Encoding the Hemagglutinin Gene Associated with the 1997 H5N1

73. Outbreak in Poultry and» Humans / N. Angela, Cauthen, E. David, Swayne, Stacey Schultz-Cherry, L. Michael, Perdue, and David L. Suarez //Journal of Virology. 2000, Vol. 74, No. 14. - P. 6592-6599.

74. David L. Suarez, Evolution of avian influenza viruses // Veterinary Microbiology. 2000. - Vol. 74. - P. 15-27.

75. Emma Hitt, PhD, Avian Flu: What Clinicians Need to Know ,

76. Englund, L. Avian influenza A; virus causing an outbreak of contagious interstitial pneumonia in mink / Ь Englund, В Klingeborn, T. Mejerland // Acta Vet. Scand. 1986. - Vol. 27, №4.- P. 497-504.

77. Eric, G. Pandemic influenza is a zoonosis, as it requires introduction of avian-like gene segments in the human population / C. Eric, J. Claas // Veterinary Microbiology. 2000. Vol. 74. - P. 133-139.

78. Evolution and ecology of influenza A viruses / ILG. Webster, W. Y. Bean, О. T. Corman ct al. //Micro-biol.Rev. -1992. Vol. 56. - P. 152-179.

79. Genetic relatedness of hemagglutinins of the HI subtype of influenza A viruses isolated from swine and birds / G. Scholtissek, H. Burger, P.A. Bachmann,

80. C. Hannoun//Virology. 1983. - Vol. 129. - P. 521-533.

81. Generation of a Highly Pathogenic Avian Influenza A Virus from an Avirulent Field Isolate by Passaging in Chickens / Toshihiro Ito, Hideo Goto, Eiji Yamamoto, Hiroko Tanaka, Mutsuko Takeuchi, Masaru Kuwayama, Yoshihiro

82. Hirst, G.K. The quantitative determination of influenza virus and antibodies by means of red cell agglutination / G.K. Hirst // Experimental Medicine- 1942.- Vol.75, №.1.- P.47-64.

83. Immunity and Protection of Chickens from Lethal H5N1 Influenza Virus Infection in Hong Kong Poultry Markets / Sang Heui Seo and Robert G. Webster, Cross-Reactive, Cell-Mediated // Journal of Virology. 2001. - Vol. 75, No. 6. - P. 2516-2525.

84. Influenza A virus protein prevents activation of NFk-B and induction of alpha/bets interferon X. / Wang, M. Zheng, H. Muster, et al. // Journal of Virology. 2000. - Vol. 74, P. 11566-11573.

85. Influenza Epidemic of 1918 Linked With Avian Virus.

86. Isolation and identification of swine influenza recombinant A/Swine/Shandong/1/2003(H9N2) virus / C. Xu, W. Fan, R. Wei, H. Zhao// Microbes and Infection.- 2004.-Vol. 6, № 10.- P. 919-925.

87. Is the gene pool of influenza viruses in shorebirds and gulls different from that in wild ducks? / Y. Kawaoka, T.M. Chambers, W.L. Sladen, R.G. Webster // Virology.- 1988.- Vol.163, № 1.- P. 247-250.

88. Intestinal influenza: replication and characterization of influenza viruses in ducks / R.G. Webster, M.A. Yakhno, V.S. Hinshaw et al. // Virology. 1978. Vol. 84.-P. 268-278.

89. Kawaoka Y., Naeve C, Webster R. / Is virulence of H5N2 influenza virus in chickens- associated with loss of carbohydrate from the hemagglutinin. // Virology. 1984. Vol. 139.-P. 303 316.

90. Lipkind, M. Further characterization of H7N7 avian influenza virus isolated from migrating starlings wintering in Israel / M. Lipkind, E. Shihmanter, D. Shoham // Zentrall Vetennarmed B.- 1982.- Vol. 29, № 7.- P. 566-572 (156)

91. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals / OIE.-6nded. Paris, 2008 - Vol.1 Chap. 2.3.4. - P. 465-481 электронный ресурс. -Режим доступа: http://www.oie.int/eng/enindex.htm. - загол. с экрана.

92. New avian influenza A virus subtype combination H5N7 identified in Danish mallard ducks / K. Bragstad, P.H. Jorgensen, K.J. Handberg, S. Mellergaard, S. Corbet, A. Fomsgaard // Virus Research.- 2005.- Vol. 109,- № 2.-P. 181-190.

93. Nicholson K.G., Wood J.M., Zambon M. Influenza / K.G. Nicholson, J.M. Wood, M. Zambon//Lancet. -2003. Vol. 362, P. 1733-1745.

94. Nopporn Wong-Anan, Human Avian Influenza Cases Confirmed in Thailand.

95. Pathogenesis of avian,Influenza A (H5N1) viruses in ferrets / L.A. Zitzow et al. // Journal of Virology. 2002. Vol: 76, №9. P. 4420-4429.

96. Perkins, E.E.L. Varied pathogenicity of a Hong Kong-origin H5N1 avian influenza vims in four passerine species and budgerigars / L.E.L., Perkins,. D.E. Swayne // Veterinary Pathology.- 2003 .-Vol. 40, № 1.- P. 14-24.

97. Rapid Evolution of H5N1 Influenza Viruses in Chickens in Hong; Kong. Nan Nan Zhou, Kennedy F. Shortridge, Eric C. J. Claas, Scott L. Krauss, and Robert G. Webster // Journal ofVirology. 1999. - Vol. 73, №4. - P. 3366-3374.

98. Sockett, P. Avian influenza'// Can. Med. Assoc. J FEB. - 1998: Vol. -10. 158 (3) 369.

99. The continued^ pandemic threat posed by avian influenza vimses in Hong Kong / Hatta Masato and Kawaoka Yoshihiro // Trends in Microbiology. 2002. -Vol.10, №7.-P. 340-345.

100. Stallknecht, E.D. Ecology and epidemiology of avian influenza viruses in wild bird populations: waterfowl, shorebirds, pelicans, cormorants, etc., // Proc. 4th International Symp. on Avian Influenza, May 29-31, 1997, Athens, USA. P. 61-67.

101. Tan Ее Lyn, Avian Influenza Virus H5N1 May Have Become More Virulent.

102. Webster, R. G. Influenza: An Emerging Disease // Emerging Infectious Diseases. 1998. - Vol. 4, № 3. -P. 436-441.

103. Webster, R.G. Influenza: an emerging disease электронный ресурс. -режим доступа. http.7 www. cdc.ncidod /eid/vo!4no3/ Webster. Html. - загл. с экрана.