Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства лейкоцитарных интерферонов сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства лейкоцитарных интерферонов сельскохозяйственных животных"

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ-И ЗАКУПКАМ

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО^ОНТРОЛЬНЫЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

На правах рукописи

ДЬЯКОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

УДК 619:616.986:616.9-084

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛЕЙДОЩГАРНЫХ ИНТЕКЕРОНОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.06 -а вирусология

АВТОРЕФЕРАТ •

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990

. ■ Работа вшкшшна во Всесоюзной ордена Трудового Красного - • Зиаданк государатаяшети нартно-вззБгеролБЛои каататуте ватервиар-кшс'Ерваарагов

Hawaii щюваддтедь-гаэдэдва? вотеряиавшк нарт.старшй научный сотрудник Груздев К.Н.

Официальные оппоненты : Доктор биологических наук,профессор Воронин Е.С. Доктор медицинских наук,профессор Баринский И.Ф.

Ведущая организация - Всесоюзный научно-исследовательский;

ветс

институт экспериментальной ветеринарии и:.:.Я. ?. Коваленко

Защита состоится"/^ " г. в '' А^ " ч на за-

седании специализированного 'сове^Д>120.85.01 при Всесоюзном . ' Государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов Главного управления ветеринарии при Государственной / комиссии Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам по адресу:/123022,г.Москва,Звенигородское шоссе,5,ВГНКИ/■

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ взтпре-паратов ^г

Автореферат разослан "А_/^О^Й^ЙЭЭО г.

Ученый секретарь .

специализированного совета ^Т^* Ю.А.Козырев

«3м

ОБЩАЯ XAPAKTSRiGTim РАБОТЫ Актуальность проблемы Производство продуктов ¡животноводства сдергивается наличием я распространением инфекционная болезней сельскохозяйственных животных. Несмотря на эффективные средства специфической профилактики, они нанося? значительный ущерб на® • родному хозяйству. В комплексе ветеркнарно-санитарик мероприятий в настоящее время пошио вакцин, сывороток я других средств. . используется интерферон, который обладает противовирусным, ш® муноиодулирувдкм свойством, а TSES9 активно влияет на фагоцитоз, выработку антител, функцп».естественных аиллерных клеток. /Ершов З.И., НовохатсшШ" A.C., Соловьев В.Д.,- Бзхтимкров Т.А., 1931, Орлова Т.Г. с соавтор., 1931, Скородинцев A.A. с соазт.,'1997, Кувнецов В.П., 198?/ ' •' ,

Практическое применение интерферона в ветеринарии сяервива» ется недостаточной изученность») даккого вопроса применительно к . сельскохозяйственным вявоткш^ а тйняэ трудоемкость» яри производства интерфероковых препаратов.

Предложенные йарченно В.И. с сотр.1959 г. лейкоцитарные интерферона свинзй и крупного рогатого скота готовятся из маток крови по весьма сложной технологии, поэтому масштабы производства их ограничены. Однако, есть возможность использовать а другие хлетки-продуцзнты интерферона. Проблемными вопросами являются поиск источников-продуцентов интерферона, изучение биологачзских свойств, интерферонов и методов стандартизации препарата. /Ост-зо Д.й., Селиванов A.B., Гунзнкоа В.В., и др., 1985, Груздев К.Н., 1989/

Настоящая работа выполнена з плане научно-исследовательских

разработок БГНКИ ветпрепаратов / Задание 02.13 Д / к служит со. ставной- частью Всесоюзной {«»ведомственной программы "Интерфе*-

pou".

Цел» данной саботи: Дать сравнительную оценку биологических свойств лейкоцитарных антерферонов свиней к крупного рогатого скота, полученных из клеток-продуцентов различного происхождения, . Для достижения отой цели бнлв поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние возраста ааюотных на шторферонлродуцпрувдую способность свиней и .крупного рогатого скота.

2. Определить биологические свойства и ввдозу» спенифяшость лейковдясарних мнтерфвронов свиней,крупного рогатого скота и разработать стандарт сенного лейкоцитарного интерферона.

Научная новизна 33 результате проведенных исследований нами определен витерЁеровошй статус свиней к крупного рогатого скота различного возраста.Дана сравнительная характеристика биологических свойств лейкоцитарных икторферойов сеидеЗ и крупного рогатого-'. скога,¡юлучешшх из лейкоцитов кровк,клеток селезенки и костного иозга, Доказана противовирусная гетсроакгаввость данных кнтерферо-нов. Разработала методика получения споцнфзческой аятисыворотки к двйкоцитарнн;,! интерфероном,ре^ерснс-препарат свиного лейкоцитарно- • го.нвтзрфзрона.

иеидость На основании результатов исследований

разработаны:

Наставление по применению интерферона свиного лейкоцитарного сухого с аоаншшшаровашшм индукторам JS432-3D.Утверждено ГУБ Ibcarponjwa СССР 33 шт 193$ т. ■ - йэвёйзккв й 1 о дополнении Технических условий /ТУ 10.07.118-89/ на сояонсцихарний ккгерфорои сршей.Утверядено 1УВ Госкошссик Совета министров СССР по продовольствии к закупкам октябрь 1990 г.

- Извещение № 1 о дополнении Технических условий/ТУ 10.07.117-89/ на спленоцитарный интерферон крупного рогатого скота. Утв^ряце-но ГУБ Госкомиссии Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам октябрь 1930 г.

- Извещение .'а 1 о дополнении Инструкции по изготовлению и контролю интерферона спленоцитарного свиней,Утверздено ГУВ Госкомиссии Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам октябрь 1990 г.

-Извещение № 1 о дополнении Инструкции по изготовлению и контролю интерферона спленоцитарного крупного рогатого охота.Утверадено 173 Госкомиссия. Совета Министров СССР по продовольствиэ и закупкам октябрь.1990 г. •

- Инструкция по изготовлении стандартного образца,сзиного лейкоцитарного интерферона.Утвврздена ВГНКИ вэтпрепаратов 25.10.1990г.

- Инструкция по применении'стандартного образца свиного лейкоцитарного интерферона.Утверздена ВГНКИ вэтпрепаратов 25.10.1990 г.

„Апробация'полученных результатов: Основные положения диссертации доложены и получили положительную оценку на заседаниях Ученого Совета ВГНКИ вэтпрепаратов в составе годовых отчетов по науч-но-иоследоватайьской работе эа 1987,1988,1989 гг,на заседаниях методических комиссий ВГНКИ вэтпрепаратов. -Х.ХП-Научянх конференциях молодых ученых ВГНКИ ветпрепаратов /г.Москва/1933,1939 гг.

- Х-Региональном симпозиуме социалистических стран по интерферону /Юрмала, 1988/.

- Всесоюзном симпозиуме"Б;;охшя1я сельскохозяйстзенннх животных и Продовольственная прогрвмиТ/Киев,1989/.

- Республиканском семинаре"Использование ннтерферонов в ватершга-;} рии"Диев,1989/. ..........

Публикашга По материалам диссертации опубликовано 3 статья, . 4 - сданы в печать.

Объем к структура диссертации Диссертация изложена на страницах машинописного текста и включает введение,обзор литературы ,собственные исследования,список литература,прило&впие. Работа. иллюстрирована 21 таблицей,9 рисунками.Библиографический список включает 211 наименований.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ■ Материалы ж метода Работа выполнена в иаучко-месгюришнташгой лаборатория ВГНКИ..;. взтпрапаратов,институте микробиологии и вирусологии АН УССР. им. Д.К.Заболотного в течение 1986-1389 гг . ^

Культур» кдеток.питательные среды 1 В работе 'были использованы." слэдущие культуры клеток: диплоидные клетки человеческого проке-хоздения М-19,полученные из института полиомиелита и вирусных аа-_^вфаяятов,п0рвично-тршюини8яровант1о культуры:почка эмбрионов • свенье/ПЭС/,почка поросвнка/ППЛпочка эмбрионов гсоров/ПЭКЛ ночка телзнко/ПТ/.тзстикулы &пгков/ТБ/,клотхи фибробластов эмбрионов кур/§ЭК/,перовиваег,шэ культуры :СПЭВ,ВДВК, Х-929.

Получение и культивирование клеточных культур проводила согласно методикам,рекомендованным в руководствах /Осидзе Д.Ф. ,1975, Голубев Д.Б. и др.1976,Дьяконов Л.П. и др.1980/.

" Прн культЕвировшш меток использовала среда Игла, 199,«ГКО, 0,5? ГЛА;растворы Хенкса,Эрла.При культивировании бактаоий прпиэ-Iшли среда ША.ШБ.МППБ.

Втгрусг! а бактеркя:вирус в£^ккулярного стоттата/ВВС/,итпйЦ®-' вка",прЕмвяяешй 1т тест-вирус при титровании внтерферова,вирус б&лезнЕ Ньвкасла/ВЩ/ вт.*Н" .используемый в к. ;естве индуктора интерферона,вирус-болезни Ауос1щ/ВБЛ/,ит.яВШа1*,вв$акщ1онпого ршзо7рах91ГГв/12Т/,пт."0рзнбур? 1/70",Ш¡¿гршша-З КРС.вт.-ЗКСМ".

Из бактерий использовали ШТ." Staphylococcus aureus 209 п.

Препарата интерферона Свиной лейкоцитарный интерферон с неи-нактнвировандам индуктором .института иммунологии,сери» 42. Свиной лейкоцитарный интерферон с кеинактивярованным индуктором.института иммунологии и ВИКИ ветпрепаратов,серии 17,24,14,1088.

Животные:куриные эмбрионы 9-II дн.возраста,в количества 1000 шт.,белые беспородные мыши в количестве 50 гол,кролики порода'Шин- • гшша",весом 2,5-3 кг,30 гол..поросята I—10 дн.возраста-35 гол.,1-3-Х мес.возраста-35 гол. .телята 1-10 дн.возраста-35 гол.,1-3-х из с. возраста-35 гол.

При выполнения работы использовали вирус ологике окне,фззяко-хл-шпэсгае.биожзшпескиэ.гшкробиологические.корфологическЕв метода.

Вирусологические:культивирование первичных и перевиваемых культур клеток, титрование вирусов в культурах клеток по 1Щ,получение, титрование лейкоцитарных гнтэрферонов животных.

Продукция, интврфаронов.Интерферон'получали индукцией шт."Н"з культурах клеток различного происхождения. Определение антивирусной активности интерфэронов проводили методом титрования в культуре клеток против вируса /ВС/пт. "Индиана"-,ВЕА шт."ВГНКИ".Титром интерферона считали число,обратное наибольшему разведении,вызывавшему, задержку ЦПД в 50^ культур клеток. Интерфероноэуя реакция лейко-цитоэ/КРЛ/ проводили по методу Соловьева В.Д. .Бектшшрова T.A./I97Q/

Биохимические метода:электрофорез,гель-фильтрация,афинная хроматография.

Морфологические ¡исследование аизнеспособностз клеток методом световой микроскопии.

Физико-химические:чувствительность к различным фдрмвнт&ч,механическим воздействиям в нуттель-аппарате при 90-120 ход/мин, стабильность к различным значениям рН среды в течение 3-5 суток,па-греваняи 45-800(^/30 мин/.

■ , ' -.8

Микробиологические:- антибактериальное действие штерфоронов „ определив по методика Манчинн Д / 1935/.

йшупно-модулЕрущаэ действие интерферовов/НСТ-тэст/опраделя- . дзг согласно методике Грачевой М.П./Х984/.

Для определения достоверности результатов исследований исполь- . зовалн X2- критерий сопряженности признаков / Поляков, 1975/.Оценку достоверности статистических показателей выборок проводили по кри-ториэ Стыодента.Антивирусную активность истерлоронов оценивали по колотило средне-геометрической/ Малета С.С.,1982/. ' РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

меток.свиной и крупного .

того скота Прг вндеяенш лшфоидшя меток бало апробзроваво не- . > сколько методов:меха:шческого внишшяя.ферлеатативзоа• обработки' версеаоц.тригояном.Наийашшй выход клеток.даблвдался нрз нсполь-зовакпз 0,25? раствора трипсина.Трехкратная дробная тридсвнизация . сологеночноЗ таааи позволила получить 6,5*10® кл на I гр ткани.. ■ Однако.«азнеспсобкооть клеток бала существенно виаз/р<:0(05/ чей у влеток, получение при других способах. Обработка аерсевоа такта • ■ способствовала авачетеяьноау выходу кквток.Рй8Шща в эначевшпс с ыатадом гршхоЕзизацкз била порядка 1,08-дяя свиней и 1Д2 для , крупного рогатого екота.Часдо жизнеспособна* меток при отоа достоверно отличалось / Г<0,05/ от колзчоства клеток,получешшх путей кахаяЕческого шшшагшя.

Катод Ьзхакаческого шдаанея позволял получить 5,38* 10® -аз ца I гр с&казезочной тканг.юдагсбстго газиэслособаых клеток а дш-вси случае бадо иадспгалышц/ су. Табл.1 / " Повтоау.в вешаоЯввх всслздоаавак прз вздолзная лаафэдшх вгэтог ьа вссоль80£аяз кэтод шгалнчэсхого' ваш»аная.

Ексд блохой йоойгог» тэта,подвергнув» механической обрабоя-аэ соотазди 2,7#ХоР па I гр губчатого везестБй.Есзпеспособвость

клеток костного мозга составляла 92,8 + 4,31? дли свинзй и 93,4 + 3,11% для крупного рогатого скота.

Таблица I

Показатели жизнеспособности теток,полученных различными способами ■ .

Способ ! КДвотные г Кол-во проб Живые клетки 7 м + м / ! Мертвые клетка 1 / М+ м /

Механич. вымывание ! Свинья ! КРС 24 ' 16 96.2 + 1,02 94.3 + 2,03 ! 3,1 + 0,04 ! 5,2 + 0,06

Трипсин ! Свинья ! КРС 24 16 81,4 + 2.16 83,7 ± 4,83 ? 20,0 +0,94 ! 16,0 +2,13

Версен ! Свинья ? КРС . 24 16 86,5 + 3,44 86,7 £ 3,92 ! 13,4 +1,91 ? 14,2 +1,67

" Р= 0,05

Число лейкоцитоз крови .после соответствующей механической об-' работка у данных животных было равно 4,б'10акл на I см3.При атом, количество кизнеспособяыя клеток у свиней было равно-93,крупного рогатого скота-92,1%

Опыты-по,изучению тгтерферонпродуцзругаей способности лкмфонд-ных клеток селезенка,осуществленной различными способами,показали, что она оказалась неодинаковой. Клетки селезенка,обработанные раствором трипсина,оказались неспособными продуцировать интерферон

з ответ на вируснун индукции.Ира использовании раствора версена,.. Ентерфзронпродуцирузсщая способность клеток выявлялась на незначительном уровне 1,09'Ю2ед-у свиней и 1,42'Ю2ед -КРС.

Метод механического вымывания,как наиболее ¡чадящий,позволил максимально сохранить интерферонпродутарупцую функцию лимфоидных клеток селезенки/ 3,62*Ю2ед и 3,57,102ед/.В связи с этим,метод рекомендован при производстве интерферона.

'. Фактото. влияшта на продутого интетДеронов

Множественность заражения Установлано.что наибольшее количество интерферона продуцировалось при множественности 10-100 ТЦД50.

• - ю -

Увеличение дозы вируса до IООО ТЦДдд не приводило к повшеншо гп~ , тров интэрфоронов,/ Табл 2 /,

Таблнца 2

Зависимость продукции кнтврфзрока от заракаицей дозы вкруса-шдуктора

Животные ! Клетки- !__Титр •пнтв'аТю'Рона / ед/см3/

! продуценты i^íTXTÍ^prTüW^

Свинья ! Лейкоциты ! 101,6 258 1024 ! 64

! Спленоциты ! 101,6 512 2580 ! 64

КРС ! Лейкоциты ! 101,6 322,5 1024 ! 32

! Сплоноцитн ! 101,6 ! 512 ! 2580 ! S4

Из данных Табл.2 следует,что при оятшгальиом способе заражения клетка селезенки оказалась лучвшмз продуцентами интерферона в ответ на индукция ВШ.Средне геоматрдческая величина титра ннтерфо- • рона в стационарных культурах клеток селезенка составляла при этом -512-2580 ед/см3,достигая максимума в интервале 12-18 ч посла внесения вируса,с восяедуЕвщм сшосенвем через 24 ч.

Коггцентгаиня клеток Определение заввсЕКОста продукции ийтер--фвронг от когщентхедзш клеток проводилось в суспензиях с концентрацией 105,Ю6,Ю7,108кл/см3 ,пра мкшзствонноста I и 10 ТНД50

вт."И" ВШ на клетку. Из результатов гсоледований следовало,что уровень продзгхциа кятерферона бая вакменьош при юхокоствонностя I TLUIgQ г концентрата Ю5кл/см3-32 ед/см3.Этот показатель не зависел от вде аввояшх.Уваа2ченао «овпектрацав до к'кд/см^оопровоя-дслось Ео&кбшюн продукции штерфорона,среда9-геометри«чская величина которого достигала в культуре лейкоцитов крове- 256 ед/ск", стглоноцстоЕ-322,5 од/см3.Статаотгчаска вкачжмой разница в продук-пи! хгягерфорога клетками,в завгсгаоств от вида яввотпаг ,из обнаружено. Концентрация глоток I(Aia I см5не обоспь-швалп иовагеиаэ лаодь гйтерфсронй.Тзтр при дашоЕ концватрацгя баз равен -54 од/с: Уггжчгкго дозц варуса до 10 ТЦД^способегаогохо по-

susm» левак вра£ущ:р7с:.:ого sreoplopoaa кдат^аиг сспнтуеах

суспензий.В данном случав,клеткл селезенки вырабатывали интерферон в болызем количество в сравнения с лейкоцитами крови.Средне-гео-¡гетрпческая величина титра интерферона оказалась наибольшей-812,7-1682,2 ед/см3 в культурах с исходной концентрацией 1071м/см3.

Температура инкубирования Результатами исследований показано, что оптимальной является температура 37°С.При указанной теиперату-ре лейкоциты крови,клетки селезенки и костного мозга свиней и кру- . иного рогатого скота синтезировали наибольшее количество интер^е-рона-128-512 ед/см3.Повнивнкв температуры инкубирования до 40°С вызывало снижение интерферошгродуцсругачей способности у клеток костного мозга и лейкоцитов крова.Показатели интерферонообразования клетками селезенки при 40°С сравнимы с данными активности интерферона эродируемого всследушами клетками при 37°С.

Высокая ннтерферояпродуцзрукцая способность меток селезенки, сохраняющаяся в различных температурных режимах,позволила рекомендовать их для крупкокасотабного производства ннтерферонов лпвотных.

Состав питательной срета Наибольшая продукция интерферона отмщалась при использовании сред Угла и 199.Независима от вида животных кааткн синтезировала штер$ероя,срвдне-гвомэтрнческая величина которого составляла-1290 ед/с.мэ-у свиней на срадэ 199 с добавлением 2% сыворотка КРС.пря использовании сзленоцитов и 812,7-лейко» цатов крови.На среде Игла,в аналогичных условиях,показателя антивирусной активности интерферона на сшгешщптах состазлядя-2580,3 ед/см3,лейкоцитов крови-1290,2 ед/см?С добавлением 5% сыворотки КРС уровни антивирусной активности интер$оронов из спленошхтоз па среде 199 составляли-1625,5 ед/см3.лейкоцитов крови-1290,2 ед/см3, на'среда Игла соответственно,2580,3 од/см3з 1290,2 ед/см3.

У КРС данные показатели интерферона из спленоцитоз на среде 199+ 2$ сыворотки КРС составляли-1625,5 ед/см3,леЯкогсггоз крови-

812,7 ад/см3.ца среде Игла,в таких .та условиях,значения били равна

- 2580,3 я 812,7 ед/сы3.Прн использовании сред ФГМС.ГЛА уровни антивирусной активности оказались несколько нижа.Наименьших значений титри ннтерферонов достигали при использования растворов Хенкса и Эрга:у свиней-161,3 од/см3,101,6 ед/см3,соответственно у КРС -161,3 эд/см5и 80Д ед/ш3. Полученные данные показали,что для продукции ннтерферонов более приеншшыми оказались обогащенные питательные срс 'да с добавленном 2-5% сыворотки КРС,что необходимо учитывать при . производстве интерферона»

Возраст дптаоттах Установлено величие определенной возрастной зависимости в продукции интерферона клетками селезенка,костного ыозга к лейкоцитов крови у свикей и крупного рогатого 'скота. -

.Клетки поросят и телят одного месячного возраста продуцировали штерфэроЕ в ваштьвш количестве.Титр интерферона,продуцируемого лейкоцитами крови поросят' в этом возрасте составляет 16-128 од/си3 /67,2+13,9/.Менее выраженная способность ютер§ероногекеза отмечалась у клеток селезенки 8-32 ед/см3/17,6+4,4/,клеток костного коз-га 4-8 £д/см3/4,8+Г,б/.11оказатолЕ интерфероногенеза у поросят стабилизируется к 8 мес.возрасту, Прз втоы,лейкоциты кровн вырабатываю? 128-512 ед/см3/217,6+36,4/.Наивысшей кнтерфороногэнной способ-посты) в етом вовраств обладает клетки селезешш.Средае-геоштрЕ-чеокая кышчява титра которых составляла-307,2+37,1 од/си3.

Б отаячиз от поросят,телята шзла более растянутый по врешзв период стабилизации показателей продукции интерферона,В перше да-сяау у ве» чеххв наиболее активными продуцентам внтерфёрова являются лейкоциты кровя.Повшаание ¿штерфорокяродуцирувдей способности кдвтоз аабладаяось в 8-12 мо^.возрасте.Стабилизация похазате-«02 прозеходоа .ешь к 38-24 пвс.Активность меток в &тоы возрасте

Втегдекае возрастные бавогокорвося» становления сяотека ев-. терфорою у сьгаеН и Зфряого рогатого скота,позволяв? рзз:сг:эпяо-

еть в качестве доноров-селезенки поросят 8-12 мес. а телят 18-нес.

"-^Дгтамгта, образоваяия интерферона Определение динамики продукта интерферона клетками селезенки,костного мозга,лейкоцитами крови ;венэй и телят через 2,4,6,8,12,18,24,48 ч досле внесения внруса-ндуктора показало определенную закономерность.Независимо от кле-;ок-зродуцонтов у свиней минимальные количества интерферона обна->ужквалнсь узе через 2 ч после кндукцзти.Незначительный подъем тк-•ра интерферона к 4 ч культивирования сменялся разил«! увеличением . >брагования интерферона лейкоцитами крови до 54 ед/см3 к 6 ч.Ная-шсешй ваа продукции интерферона лейкоцитами крови достигался к .'2-18 ч,после чего титр его э культуральной жидкости снижался.Би- . »синтез интерферона клетками селезенки носил аналогичный характер. 1ттсо,скорость продукции з первые 6 ч была несколько вате,чем у тейкоютгоз кровя.Клетки костного мозга свиней вырабатывали интерферона в, начале процесса биосинтеза значительно меньше чем лейхо-штн кровя ж вкетая селезенка.

Продукция интерферона лейкоцитами крови,хлеткгмз селезенки,косного мозга крупного рогатого скота проходила аналогичным образом.'

Приведенные данные свидетельствует - о наличии определенной ста-.

хяВносяа'а продунаяя интерферона.Она проявляется в .том,что в пер-

(

зие 8-12 ч нарастание татра интерферона носят линейные характер, затеи кастуягга? стадия каксикаяьного накопления пнтерферона-12-18 ч. 1ссл5 24 -I содержание интерферона снагается.Этз закономерности об-разоваавя хетер^орона дм данных видов яивотеш: оказались сходает, Заявленная стадии каод&швдого пахоплензагатерферона для разного вида якетоя позволила прогнозировать время заверееная процесса • эго Ззосгятеза. . .

свойства. татврферояов_ йеследоваштз уста-поагено:кояв5тя»т»"»я касса елгеноцатарного етгер^эреза озгней

составляла - 23000 д,соответственно.крупного рогатого скота-21500 д.

Исследуемые препараты чувствительны к трипсину/1 мкг/см3 в тс чение 30 мин/ снижал титр от 1024 ед/см3 до 78,76 ед/см3 у.спленс цитарного интерферона свиней и до 68,26 ед/см3 у КРС .Данные интерферона оказались не чувствительны к липазе,нейраминидазе,рибо-•нуклеазе.что такке подтверждало белковузо природу интерферонов.

При изучении устойчивости интерферонов к механически.", воздействии,! было установлено снижение титров исследуемых интерферонов в 6 раз,что свидетельстзлвало о лабильности данных образцов.

Определение чувствительности интерферонов свиней и крупного рогатого скота к разным значениям pH показало,что в пределах 4,58 интерферона сохраняли свою исходную активность в течение 3-5 су ток.Выдерживание проб при pH -2 s рН-10 в эти хе сроки приводило к синению противовирусной активности/от 1024 до 445 ед/см3/-спле ноцитарного интерферона свиней,соответственно /от 1024 до 22S ед/ спленоцитарного интерферона КРС.

Исследуемые образцы интерферонов свиней и КРС оказались чувствительны к температурному фактору.Антивирусная активность после одночаоового прогревания при 80°С не выявлялась.При 56°С препараты снижали свой исходный титр в 1,8 раза.Инкубирование интерферонов в течение 1 ч при 30-45°С не влияло на исходные титры противовирусной активности. - ■ .

Антивирусная активность интерФаррнов Изучение антивирусной активности интерферонов свиней и крупного рогатого скота проводили в культуре гомо и готерологичннх клеток.В качестве тест-системь использовала диплоидную линиз М-19,перевиваемые клетки СПЭВ.ШШК, L -929,первичпо-тр2ясйниэкрованные:ПЭК,11Т,1Ш,ПЭС.Индикаторным вирусом пр;; титровании служил ВВС.Уровень антивирусной активности KKTepfepoHo» в культуре ПЭС для свиней бил какоиха>авим,СЛ>1-2048

ед/см3,спленошгарного интерферона свиней-1024 ед/см3.Аналогичные значения титра интерферона КРС получены в культуре ПЭК./см.Табл д/

Таблица 3

Показатели антивирусной активности дативны* интерферонов к ВВС

Культуры клеток

Т л т р ь и н т 9 эфаронов /ед/см3/

свино) ! КРС

лейкоцитарц !спленоцитарн лейкоцзтарн!спленоцитарн

ПЭС Ш

спэв

М-19 L-929 ПТ ПЭК

ВДБК !

2048

819,20 ■Э1.Б6

1024

663,64 ! 329,03

232/

>34 >,32

652,22

#05

163á,4

2048

1024

326,11 167,04 512

112,52 819,20 1024 512

3 первичных клетках ПП показатели противовирусной активности • у янтерферонов свиней были в 2,5 раза нгяе.чем а культуре ПЭС.Пе-

ревиваемые культуры СПЭВ.МДБК оказались менее чувствительна к кн-тор:Т;ерона:л свиной з сравнения с первютниа клвткамя.Интерферокы

евшей обладали гетероактпвяоетью в культуре клеток ПЭК-839,34ед/с:.? и 419,6? ед/см3,в клетках ПТ у СЛИ-731,42,силеноцйтарного-365,71едЬ?

"iHTop-JopoiíH КРС также проявляли выраяенну» антийируснуэ актав-ность в гомо и гетерологлчннх клетках.Перевиваемая культура ?Д£ЗК оказалась менее чувствателькоа к интерферона',! КРС в сравнения с культурой ПЭК,на метках которой значения были какспмалькк-2048 и 1024 ед/см9.Обнаружена гетероактпвность иятер1вроноз КРС на клетках ПЭС.Ш.ГОЭБ.Нлнвысеих показателей последуемте образца интер-$оровоз достигала на клетках ПЭС-666,64 ед/са3-у лейкоцитарного интерферона,329,03-спленоцитарного интерферона К?С.Перевиваемая хавгя ь-929 прояз.гтла низкуа чувствительность к интерферона» спи-

ной, а КРС.Показатели антивирусной активности янте^Ьронсэ свиней

яа данной культуре яюге максим?"^ нкх - 8,8 рлз,соответствию ■

-9,1 раз,что обменяется видоспеци?ичностьв янтерферонов.

' • . , - 16 -

Вирусы БА,ИРТ,ПГ-3 также проявляли чувствительность к исследуемым препаратам.Однако,показатели антивирусной активности интерферонов. к данным вирусам оказались ниже,чем к вирусу ЕС/с:.:.Табл.4/.

Таблица 4

Показатели антивирусной активности нативных интерферонов к вирусам БА,ИРТ,ПГ-3

Культуры клеток ! Титры интерферонов /ед/см3/ ! свиней к ¿¡НА ! KPß к "ИРГ" Г""КРДОГТ-^ !лейкоц. .'спленоц!лейкой. ! спленоц. !лейкоц. ¡спленбц.

Ш ! 580,5 ! 460,7 ! 215 ! 135,4 ! 45,75 ! 37,25

ПЭС ! 1024 ! 812,7 ! 341,3! 216,7 ! 54,9 ! 44,7

СПЭВ ! 430,6 ! 341 3 ! 67^73! 53,73 ! 67,73 ! 53,92

' ЭДДЖ ! 430,06! 341,3 ! 8lé,7! 64&Д ! 67.73 i 53,92.

ПЭК ! 322,09! 203,1 ! 1024 ! 812,7 ! 101,5 ! 80,6

ПТ ! 101,6 ! 80,6 ! 812,7! 645,1 ! 84,6 ! 67,16

Из данных Табл.4 видно,что наивысиий титр интерферона свиней по отношении к ВБА был в клеточной культуре ДЭС-1024 ед/см3. На клетках СПЭВ.ВДВК их показатели были ниже-430,06 ед/см3-лейкоцитар ного интерферона,341,13 ед/см3-спленоцитарного.Титр спленоцитарно-го интерферона КРС к вирусу ИРГ в культуре ВДВК.СПЭВ шел незначительные отличия от показателей лейкоцитарного интерферона в культуре ПТ.На клетках ПЭК показатели антивирусной активности интерферонов КРС максимальны-1024 ед/см3 и 812,7 ед/см3.Вирус ЛГ-З проявил меньшую чувствительность к препаратам интерферонов КРС,чем БА и ИРГ,достигая наивысших показателей в культуре ПЗК-101,6 ед/см -лейкоцитарного и 80,6 ед/см3-спленоцитарного интерферонов.Титры антивирусной активности препаратов в культуре СЛЭВ и Щ8К имели аналогичные значенкя-67,73 и 53,92 ед/см3.В клетках ПП уровень антивирусной активности был наименьший.

При изучении антивирусной активности интерферонов учитывали влияние.температуры и различных сроков хранения на изменение данного показателя.Для этого образцы нативных интерферонов,полученных из клеток селезенки «лейкоцитов крови. свиней к. крупного рогатого.,, скота,я также образцы этих интерферонов на полимерной"основе;изго-

товленныэ Ю.В.Фоминым.хранили при температуре -20°С,+4-6°С и 37°С в течение 12 мео.Противовирусную активность испытуемых образцов 'проверяли через 1,3,6,9,12 мес. Нативные образцы интерферонов оказались чувствительными к действию температуры и срокам хранения ■независимо от клеток-продуцентов.

. .- При -20°С исходные показатели противовирусной активности данных образцов не изменялись в течение 6-9 мес.7 лейкоцитарных интерферонов свиней и КРС при -20°С исходные титры сохранялись в течение 9-12 мае.,а при 4-6°С-3 глее в пределах 512-645,1 ед/см3.При 37°С полностью утрачивалась исходная противовирусная активность исследуемых дативных образцов к первому месяцу хранения.Большая ■ стабильность выявлена у полимерных образцов интерферонсв в различных; температурных режимах.Противовирусная активность лейкоцитарных, 'сшгепоцитаривх интерферонов свиней и КРС на полимерной основе при . -20°С сохранялась без изменений в течение одного года/срок наблюдения/.Титра испытуемых препаратов были на .исходном уровне в температурном рз.ижо 4-6°С в течение 6 мес.Протектийное действие полимера отмечалось и при 37°С. '

Таким образом,полученные результаты показали стабильность ин-. терфэронов при оптимальных режимах храненяя/4-6°С/ в течение длительных сроков хранения.

Сравнительное изучение антивирусной активности натаэннх и полимерных'образцов'-при различных тегаературах показало, что стабилизация интерферона полимером позволила сохранить исходную актав-ность-1024 ед/см3при -20°С в течение одного года/срок набдаденяя/, при 4-6°С - 9 мес,что было не характерно для нативных образцов интерферонов. •

Результаты проведенных исседовагчй по изучен!® антивирусной активности препаратов интерферонов показали,что 'наряду с'лгруссч ВС,вирус болезни Ауескя таклее моает использоваться пра тятрзвздяе'

■■■■■■■.■•:• - 18 - ' V

антивирусной активности.

В связи с ветеринарно-санитарнчми требованиями и сложностью

работы с ВВС,письмо ГУБ от 12.03.90 г считаем возможным замену индикаторного вируса ВС на вирус БА,вакцинный штиВГНКИ".

• Антибактериальное действие интерферонов Исследование антибактериального действия препаратов интерферонов приобретает, особую актуальность валедотвю! селекции и появления антибиотико-устойчи-вых форм бактерий.Антибактериальное действие снленоцитарных интерферонов свиней и К?С изучалось по тест-бактериальной культуре star phyioooocus aureus методом диффузии в. агаре. Были взяты спленоци-тарные кнтерферонк свиней и КРС с активностью 1024 ед/см3.Контролем служил "ложный интерферон",индуктором которого являлась среда 199.;Двукратные разведения/1:32/препаратов со средой вносили в небольшие стеклянные цилиндры по 0,2 см3,установленные^в чашках Петри с посевами St.aureus .Через 24 ч инкубирования при 37°С на поверхности агара вырастали колонии'бактерий.Зоны подавления были максимальными в разведении 1:2,составляя в диаметре 63,5 m у сшн ноцитарного интерферона свиней,60,72 мм-КРС. Уровни антибактериальной активности по мере разбавления препарата.снижались и при 1:8 диаметр активной зоны составлял-30,36 мм-у спленоцитарного интерферона свиней, соответственно КРС-22,7 мм. В разведении 1:32 данные показатели проявлялись слабо-9 мм у спленоцитарного интерферона свиней,у КРС-7 мм. .

Проведенные исследовшшя показали.что препараты спленоцитарны: интерферонов обладают выраженной антибактериальной, активностью,которая. зависит от степени разведения и концентрации,препарата. > ' '"Иммунно-модулирушие двойства интерферонов Влияние "лейкоци-' тарных интерферонов на функциональную активность различных зффек-торных клеток иммунной системы изучали у спленоцитарных инторферЬ-нов свиней и крупного рогатого скота.В качестве модели были испол! зованы мейтрофилы,и моноциты .поросят и-телят 1-3-х дн.й 2-х мое.; ;

■' ■ '. - 19 -

ЬЗзраста.Оценка действия интерферонов проводилась по измерению Поглотительной и бактериальной,способности нейтрофилов и коноцктоа. . Установлено,что■интерферона свиней и КРС повышают функциональную активность как нейтрофилов ,так и моноцитов.Фагоцитарное чис- ., Ira и фагоцитарный индекс в опытах in vitro повышался у исследова-«шх клеток под воздействием гомологичных интерферонов в 1,5-2,0 заза по сравнении с илтактными клетками.Эти клеточные элементы эт.поросят и телят 1-3-х дн.возраста после обработки интерфероном . ¿мели фагоцитарную активность,сравнимую с таковой 2-х мес.живот-" ; шх.При введения гомологичного спленоцитарного интерферона in vivo, активность нейтрофилов и моноцитов поросят и телят также ув'елкчи- . залась.Бактерицидная активность существенно возрастала и при об- / заботке гомологичным спленоцитарным интерфероном моноцитов и ней-'рофклов.В данном случав,отмечалось повышение как спонтанного,так i.стимулированного НСГ-теста.Стимулированные моноциты и нейтрофи- -ш телят и поросят в.сравнении со спонтанным ЯСТ-тестом,имели бо-шшуп -1,2-2,2 раза бактерицидную активность,что свидетельствовало i значительном функциональном резерве фагоцитов,в'особенности мо- / юдптоз. _ -'..-■*'".■

■ -'Внутримышечное введение спленоцитарного интерферона животным.; >азлачного возраста способствовало-повышении показателей КСТ-тес-'а у моноцитов и нейтрофилов периферической крови.У животных'стар-v (его возраста спонтанная и стимулированная активность возрастала i большей степени."

,Антигенные свойства Для проведения анализа антигенностл лей-' юцитарннх интерферонов свиней и крупного рогатого скота,их видо-иецифичностн.бшш получены антиинтерфероновые сыворотки.Испита-, . :ы 2 схемы получения актиантерфероновнх сывороток к лейкоцхтаряни'.' лтерферонам свиней и КРС на х;злаках,которые позволила.получать ' • ывороткл с титрами 1:16334 и 1:8192 в течения 2,5

перекрестной реакции нейтрализации интерферона КРС и гетеролоют-ной антиинтерфероновой сыворотки свиней позволили получить титры 1:8192 при исходном значении этого показателя 1:16384.Аналогичный! образом проводили реакцию нейтрализации со свиным лейкоцитарным; . интерфероном,титры которого снижались от 8192 до 1024 ед/см3.Это дало возможность установить существование антигенного родства меду лейкоцитарным интерфероном свиней и КРС. ■•'..■'

Учитывая данные РаисотЦег /1969/ об использовании антиинтерфероновой сыворотки для нейтрализации интерферона в ауто-ингиби-руадей вирус-клеточной системе,было изучено влияние полученной ги-перк.мунной сыворотки к лейкоцитарному интерферону свиней на накопление вируса БА шт"БГНЮГ в культуре клеток СПЭВ.

Результаты исследований показали,что добавление данной сыворотки в количестве 2-4? в культуру клеток увеличивало титр вируса на 1-1,5 1е

^нтерфероновнй статус.Оценка интерферонового статуса проводилась по количеству циркулирующего интерферона в крови кивотных/сы-вороточный интерферон/,уровню продукции¿^-интерферона лейкоцитами при индукции вирусом/ИРЛ/. •

Наличие сывороточного интерферона и ИРЛ изучалось у 60 свиней крупно-белой породы в возрасте 3,30 да,4,6,12 ыес и 50 телят черно-пестрой породы 1,4,6,8,12 мес возраста.Опытами установлено,что интерферон в сыворотке крови отсутствовал у 75-80/3 новоровденных поросят и 70-60Я телят,независимо от пола.У 20-255? оставшихся поросята телят 3-х дн возраста фоновые показатели сывороточного интерферона составили 4-8 ед/см3¡соответственно,у 20-30^ телят-2-16 ед/с.\!3.!!РЛ у животных усиливалась и достигала максимума у поросят к 8-12 ыес,у телят к 18-24 мес.Отсутствовала зависимость мезду наличием сывороточного интерферона и интер].ероновоЯ реакцией лейко~

ц.1тов. •...'..'

Тшш образом .проведенные "исследования по изучения кнтерфероново-

го статуса могут бить попользованы для подбора .тавотных с повышенной способностью к интерферонообразованяэ.

В Ы В О Д К _

1.7становдоно,что клетки селезенки и костного мозга свиней и крупного рогатого скота являются активными продуцентами лейкоцитарного интерферона. Раз работал метод механического вамшшяя опле-ноцитов из селезенки,позволяющий получить 5,33*108кл .на 1 гр.

2,ИбксазальямЯ уровень продукции интерферона лимфсиднимн кдеткака' свиней и крупного рогатого скота наблюдался при¡концентрации кле-

7 о -

тон 10 на 1 см .множественности 10-100 ТЦДду^ ВЕН шт"П",те;л- -пературе инкубирования 37°С,иа средах Игла,199 с добавлением 25$ сыворотка КРС.Средняя геометрическая величина титра интерферона, полученного из клеток селезенка при дашшх условиях составляет 2580 ед/см3.

3.Интерферону,полученные из клеток селезенки и костного мозга свиней и крупного рогатого скота в ответ на вирусную аддукция ВЕН шт"Н"по свогм фкзшсо-хвшческш параметрам являнтся ¿л-интер;;е~ роиаш.

4,Лейкоцитарные ннтерферошх свиней проявляет1 антивирусную активность к ВВС,ЕЕА.Екультура клеток ПЯ,ПЭС,СПЭВ средне -геометрическая величина тктра которых составляс-т;соответственно,401,5- . £048 ед/см3 и 430,6-1024 ед/см3.

о.ЛеЬ-ацятершю кктэрфороки КРС активны в отношении ВВС,'Д?Т, 11Г—3 з культуре клеток ПТ,ПЭК,ЩВХ.Сроднв-Гбомотр;«ес:«ич величина тетра' интерферона составляет при этом:1024-2048 ед/см3,312,7-

■ 1024 ед/са3,67,7-101,6 ед/са3. .

5.Противовирусная активность сояенсыитаркшс гнтвр$орон0з ськяйй 'КРС s перветно-трапскназаровашшх культурах ЕЗО.ПЗ.ПЗХ.ЯГ а 2,5

раз вило по сразяенгэ с вэровиваемаз культурен»

■-22-,

7. Устаяо&тена гетерогенная активность интерферонов свиней и КРС в первично-трипсинизированных,перевиваемых, диплоидных культурах-клеток:ПЭС,ПЭК,СПЭВ, Ь-929,ВДВК,Ч-19. 8 . Гипериммунизация'кроликов массой 3 кг по схеме:3 внутривенные инъекции интерферона в течение 7 дн и 5 инъекций с.интервалом 14 дн в область паховых,предлопаточных лимфатических узлов и

с

• внутривенно в дозе 2*10 ед позволяет получить в течение 2,5 мес антиинтерфероновую сыворотку к свиному лейкоцитарному интерферону с титром 1:16384,интерферону КРС -1:8192.

9. Добавление 2-4,? антиинтерфероновой сыворотки в поддерживающую среду при культивировании ВБА шт"ВШКИ" в культуру клеток СПЭВ способствует повышенно тигра вируса на 1,0-1,5 1в.

10. Выявлены изменения интерферонового статуса свиней и КРС,характеризующиеся отсутствием или низким титром интерферона з сыворотке крови и повышением интерфероновой реакции лейкоцитов с увеличением возраста животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРВДОШШ Наставление по применению интерферона свгаого лейкоцитарного сухого № 432-30,утвержденное ГУВ Госагропрома СССР 30 июня 1989г., методика получения специфических антисывороток к лейкоцитарным интерферона^ свиней и крупного рогатого скота/проект/;Дополнзние к нормативно-технической документации на приготовление,контроль у. применение спленоцитарного интерферона свиней и крупного рогатого скота; Инструкции по изготовлению и применения стандартного образца свиного лейкоцитарного интерферона,- ■

. Документация утперздена БПЮ! ветпрепаратов и.Главным, управлением ветеринарии Госкомиссии Совета !&нлстров СССР по продовольствия и закупкам; октябрь 1990 г. ! . .

;(Ш PiEOT,ОПШПйШВЛННЫХ ПО TES даСШЗДИИ ' ¿Груздев К.II. .Дьякова И.0. .Освдзе Д.О. Иятерфзроновый статус у сникай к крушого рогатого скота.//Х~региональный симпозиум со-оталисмргескях стрел т. йнтврфврону:Тез.до1исРига.-1988-С.71-72. "^Груэдвз К.Н.,Дьякова И.Н.,Освдзе Гетерогенные свойства лей-гзгщгаарянх иятврфероквя свиней и крупного рогатого скота//Био-'ааия с/х животных и Продовольственная программа:Тез.докл.Всес. сикп.Киев.УСХ.-1989 .-С.94. т«Влияние интерферона на функциональную активность фагоцнтов/Спи-вак Н.Я.Дазарэико Л.Н.,Иваненко В.К. .Дьякова И.Н.//Использование интерферонов в ветеринарии.:Тез.докл.Респ.семин.Киев.-1989.-

Подписано в печать 29.10.90г. Заказ 672 Формат • 60x90/16 Тираг. 100

Москва. Типография ШЖК