Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка научных основ технологии крупномасштабного производства человеческого лейкоцитарного интерферона

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка научных основ технологии крупномасштабного производства человеческого лейкоцитарного интерферона"

л п

! л

Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" гл г 1МинКгт>;рство здравоохранения и медицинской промышленное™

Российской Федерации

Кулагин Валерий Федорович

РАЗРАБОТКА НАУЧНЫХ ОСНОВ ТЕХНОЛОГИИ КРУПНОМАСШТАБНОЮ ПРОИЗВОДСТВА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА

03.00.06 - вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Наутпо - производственное обьедипепие

Министерство здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации

lía hpseos rrr.iiüicií Для служебного пользования Экз. Я

УДК 576. 858. 095. 383: 615. 01Н: 542. 9

КУЛАГИН Валерий Федорович

РАЗРАБОТКА НАУЧНЫХ ОСНОВ ТЕХНОЛОГИЙ К Р 7 П Н О И А С I Т А Б Н О Г О ПРОИЗВОДСТВА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО Л Е а КО НИ ТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА

03. 00. 05 - ВИРУСОЛОГИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ к Ферме паучного доклада па соискание ученой степени доктора медицинскик наук

УФа - 1995

- г -

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАНН и академик РАЕН, доктор медицинских паук, профессор Ершов ф. и. доктор медицинских нале, профессор Фадеева Л. Л. доктор медицинских наук, профессор эльберт л. Е.

Ведтиая организация: ' Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов ин. Л. А. Тарасевича Госсанэпиднадзора Российской Федерации.

Зашита состоится " ^ ^ /1995 в ^ часов на заседании диссертационного совета Д. 001. 27. 01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАНН по адресу: 142782» Носковс-кая область, ленинский район, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией в виде научного доклада мохно ознакомиться в библиотеке института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Н. П. Чумакова РАНН.

.Диссертация е виде научного доклада разослана -" -*995

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук

О. А. НЕДВЕДЕИНА

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1, АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Несмотря на то, что интерферон был открыт более 35 лет тему назад, интерес к этой проблеме не только не ослаб, ко в последние годы значительно возрос.

Открытке явления интерференции и интерфоппипобг^ссга:-:;^ ¿ на вирусное гсздсйстви* оо?да-7"л i:~i;5 «рсдйС».;2Айкк в берьсе с инфекционными заболеваниями. Появилась перспектива поиска лечебно-профилактических средств, обвсяечававшшс усиление неспецифкческой резистентности путем включения эндогенного механизма защиты макроорганизма. К числу таких средств относятся интерферон и его индукторы.

Первые,представления об интерфероне как о монобелке, обладающем противовирусной активностью, в последние годы коренным образом пересмотрены. Сегодня понятием интерферона соединяются .комплекс биологически активных субстанции продуцируемых лейкоцитами s ответ нз воздействие индукторов рнгличной природы. 5тст комплекс может включать десятки подвидов молекул интерфероноЕ,лимфекинов .моноканов и биологически зктивныи белков (Hencc H. et al..1S85; 3abaír. A. et al.,lSS5). Б езею очередь подтипы интерферонсв, лимфо.кинэв .монокинов и биологически активны:-: белков вездействурт на клетки организма, выбывая в них синтез, как минимум двенадцати новых белков (Beresini M.H. et al., 198S). Таким образом запускается вся цепь защитных механизмов для ликвидации патологического процесса Б организме í Frí e-íear¡ R.U. et al.. 1966;Larner A.С.et al.,1985 ).

В настоящее время интерфероны рассматривается как основные клеточные регуляторы жизнедеятельности клетки и иммувой системы организма. Исходя из такого понимания об интерферона}: объясним и поликорфизм таких его биологических свойств ( Кузнецов В.П. и др., 1989; Das U.N. et al., 1986; Staeheli P. et al., 1985; Lin J.X., Vilcek J. 1987; Obert M.J. 1987;) как:

- противовирусная активность;

- подавление роста внутриклеточных инфекционных агентов невирусной природы (хламидии,риккетсии, бактерии,простеишие);

- антипролиферативная активность;

- противоопухолевый эффект;

- антитоксическое действие;

- радиозащитный эффект-,

- иммунодепрессивный аффект;

- стимуляция макрофагов-,

- усиление цитотоксичеекого действия лимфоцитов на клетки мишени;

- усиление формирования поверхностных антигенов;

- усиление и подавление ряда клеточных ферментов;

- усиление цитотоксического действия двункткевых РНК.

3 процессе интерфврокогенвза,кзк правило,оОрэзустся набор-штерферонсБ, отличающихся биологическими и физико-химическими свойствами. В настоящее время известно более 30 интерферэнов, большая часть которых выделена в микроколичествах и применяется только в исследовательских целях. Наибольшее практическое значение имеют человеческие интерфероны,которые в соответствии с международной номенклатурой (Stewart W. ЕЛ980), принятой з 1580г.,делятся на три основных вида:

й-интерферок (лейкоцитарный, I-типа);

¡З-интерферон (фибробластный, Др-типа);

Г-интерферон (иммуный, Tí-типа).

Такое разделение основано на различиях между ними по физико-химическим характеристикам и биологическим свойствам.

Первый тип интерферона продуцируется лейкоцитами и лим-фоблзстами человека при вирусной инфекции или в ответ на индукцию синтетически»,® полкрибонуклеотидами.

По источнику получения препараты «-интерферона классифицируют как лейкоцитарный и лимфобластоидный интерфероны ( Cantell К. et al., 1981; Finter N..Fantes К. 1S84 ).

Sa рубежом в основном выпускается генноинженерный сс-ЕА, а-2Е, й-2С интерфероны. Природный лимфоблаотойдный ce-интерферон выпускается в малом количестве ( Masgrave S.C. et

si.,iS3i;Doilenz R. et al.а лейкоцитарный интерферон выпускается на основе Фикляндокой модифицироззнной лаборзтоо-яой технологии(Cante11 К., Hirvcnen S.1978; Cantell К., et al.,198í). В России, з большем количеств®. выпускается природный сс-интерферон в основном для интранаазльного применения

( Регламент пппиавгтг>-рва ы onv-av ) г -гг иолмыышынт-

ЧНН ^—yAj " 7\. ДЛН Ч—НИ*4! ЛИЧНЫХ форм Ге~

патитов (Кокарева Л.Н. и др.,1994 ).

3-интерферон, получивший наименование фибробластного, образуется в культурах первичных фибробластах кожи эмбриона человека, в диплоидных или перевиваемых клетках человека при внесении в культуру вируса или полирибонуклеотидного индуктора поли(И)-пояи(Ц).Еыпуек этого препарата .как природного, так и реколбкнаятноге проигводится в США, Англии.Японии(Edv V.5. 1954; Sartor У, et si. j 1993)

> -интерферон, получивший наименование hí.'mvhhcto. вырабатывается з суспензиях лимфкштов при добавлении к ним мптоге-нсз,антигенов(CanteII К. 1380). За рубежом выпускается геннс-ннхенернып т-интерферсн с 1357 гезз.а природный, полученный в культуое JIIlí.ítpощiтС1 н. последит клинические 'л^^н^зни" Е. А. и др. , 1593).

-едпцпнекуь практику .можно разделить на ряд этапов.

Первый этап с 1957 по 1369 год. В конце 50-го начале 60-х годов одновременно несколькими группами исследователей был выделен «-интерфессн ¡'Соловьев В.Д. ,5екткмиров Т. А. 1965:Fal-coff Е. it al.,19£6; Grander H.,Canteli К.1966) и появились первые сообщения о т~кнтвифе~сне ÍWeelock Е.К.1966). Одновременно с поиском индукторов и разработкой лабораторных методов получения интерферона, учеными проводилось изучение свойств интерферонов и путей их возможного использования (Фадеева Л. Л..Еалезина Т.И.1953;Ермольева 3.В..Фадеева Л.Л., и др..1865; Соловьев В. д. 1959; Оганесян P.Z., Фадеева Л. Л., к др.,1970).

На втором зтапе с 1359-1983г.разрабатывались и совершенствовались технологии получения интерферона, а такие проводи-

лиеь дальнейшие клинические его испытания.В нашей стране с 19б9года было организовано производство человеческого лейкоцитарного интерферона (ЧЛИ) для интраназального применения.В Финляндии, при поддержке ВОЗ, было организовано получение инъекционного препарата человеческого лейкоцитарного интерферона для клинических испытаний.

Важнейшим достижением этого периода стало создание специалистами фирмы "Biegen"(Швейцария) препарата интерферона методами генной инженерш.

На третьем этапе.,продолжающегося и в настоящее время,усилия ученых направлены на оптимизацию технологии производства рекомбинантных и .природных интерферонов,на создание новых лекарственных форм с целью расширения их возможного применения.

Интерес к проблеме интерферона, как в области фундаментальных исследований,так и в создании новых и совершенствовании существующих технологий получения интерферонов и его различных лекарственных форм подтверждается ежегодным обилием научных статей,патентоЕ и монографий, выпуском специального журнала -J.interferon Res, ежегодным проведением в разных странах конференций, симпозиумов.

По оценке фирмы "Fharmaprogrects" (США), в конце ВО-годов на различных стадиях доклинических исследований, клинического изучения, регистрации и внедрения находилось около 130 препаратов «-, 3-, г-интерферонов, разработанных более чем 100 фармакологическими и технологическими фирмами, не считая институтов и других исследовательских организаций всех стран мира.

При зтом интерес к препаратам интерферонов определяется в основном их противовирусными, аятипролиферативными, и иммуно-маделирущими свойствами, а также возможностью их использования для лечения артритов и СПИДа.

За рубежом с 1В83 года большое внимание уделяется реком-бкнзнтным a-, в-. г-интерферонам. В этой области достигнуты значительные успехи, однако как показала практика, не все разработанные рекомбинантные интерферокы могут быть испсльзоеэ-ны в медицинской практике в свази с низкой эффективностью или

стрицзтельньея! воздействиями на организм больного, которые проявляются в виде повышения температуры тела, лейке- и тром-боцитопенш, кожных высыпаний. Креме того, установлено,что прстеазы, шеюаееся в кровяном русле и лрутих биологических лидксстях организма, достаточно быстро разрушает рекембпнавт-кый интерферон(Epstein D.А.1982).

¥ ггдк, з^л'ссайкв йсилёлокнтйли »»о«* 030?!

Егоры обратили на получение и использование природных a-, 0-, т-интерферонов, которые являются составной частью человеческого организма и физиологичны для него.В результате проведенных сравнительных исследований природного и рекомбинантного «-интерферонов, было выявлено большое различие между ними. Оказалось, что природные интерфероны по сравнению с рекомби-нзнтным содержат не только различные подтипы р-иктерфэрснов, но п большое колйч?ст2з лпкфоклнез, мекекпнов и биологически актйвнш белков f Бахромеева Н.С. и др.,1955; йугнецов В.П. и др.,1988; Sabin А. et ai.,1335; Wenco К. et al.,1985). Это и обуславливает более высокую эффективность природных интерфе-ронсв при широком спектре заболеваний. Предлагается создание лекарственных ферм препарата на сснсве комбинации природного интерферона с рекембикантным.

Ъ настоящее время препараты «-интерферона разрешены в ксполь гуктея в 45 страна:-: для лечения 15 болезней, в том числе, золосковоклеточной лейкемии, саркомы Калоши,карциномы клеток почечного эпителия,раковидных инфекций,метастатической злокачественней мелакомы, множественной меланомы,лямфш различной этиологии, рака мечевоге пузыря, рзка яичка, ювениль-ной папялсма гортани, острой кондиломы, хронических гепатитов. , заболевания, вызываемых вирусом герпеса и цитомегалови-русами и ряда бактериальных инфекций (Кирлов А.В.и др., 1985; Покровский В. И. и др., 1985; Еелоцкий С. М. и др., 1990; Kuznetsov V. Р. et al., 1991; Двсрецкая С. А., Кузнецов В. П. 1993; Голбан Т.Д., Чешик С.Г. и др., 1994; Lidman Ch. et al., 1993; Cunning'han M. etal., 1993; Mllella M. et al., 1993; Math!von F.1593).

Наряду с- использованием экзогенного интерферона б борьбе с вирусными инфекциями к другими заболеваниями развивается и другое направление - использование индукторов интерферона, как средств стимулирующих неспецифическую резистентность организма.

' В настоящее время наиболее перспективными для этих целей считаются природные и синтетические полинуклеотиды, декстран-сульфат, левамизол, госсипол и его аналоги,ларифан,ридостин (Ершов Ф.й. , Жданов В.М.1982; Еаринский й.Ф..ЛычэБа И. А. 1994;. Feldmane С. et. al., 1992). Они также постепенно внедряются в клиническую практику после полного изучения специфических и токсикологических свойств препаратов. Однако, дальнейшего изучения требуют вопросы зависимости целевого эффекта от типа индуктора, способов его введения, особенностей динамики ин-терфероногенеза и спектра генерируемых типов интерферонов, характера побочных явлений.

Накапливающиеся знания об интерферонах, как о комплексе биологически активных белков и их эффектах открывает новые перспективы в области терапии вирусных, ' бактерийных и неопластических заболеваний ( Далецкий С.Я. и др. ,1985; Мальцева Н.М. и др. ,1985; Кузнецов В.П. и др., 1989; Еобкова Е. В. и др.,1994; Finter N.B. 1987; Vilcek J. 1987; Milella M., et al.,1993 ).

В нзшви стране впервые з мире с- 1S6S года было организовано производство человеческого лейкоцитарного интерферона (ЧЛИ) в качестве средства профилактики и лечения гриппа. Первый Регламент производства ЧЛИ для интранаэзльного применения был разработан Соловьевым В.Д., БектимироЕым Т.Д., Кузнецовым В.П., Марченко В.А. и другими.

В 1975 году в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР была завершена разработка способа получения высококонцентрированного препарата ЧЛИ для инъекций и с 1978 года начато изучение его эффективности при различных тяжелых вирусных и онкологических заболеваниях.

Если до SD-x годов разрабатывали способы получения ЧЛИ

- s -

для инъекций с использованием методов глубокой очистки и получения высококонцэнтрированного, по противовирусной активности, препарата, то после 80-х годов усилил были сосредоточены на разработке новой стратегии очистки ЧЛИ, которая погвсляла бы сохранить в лекарственной форме весь спектр биологически активных белков. (Кузнецов В.П. и до.. к«-?ао_

цпи м.п. ä A.A. ¿i . iââi

Б начале 8ü-х годов под руководством проф. Кузнецова В. П. создается препарат - дейкинферон для инъекций. Лейкинферон -частично очищенный интерферон от аллантоиеных белков и вируса - индуктора с сохранением биологически активных белков.

С учетом знаний об интерферонах, на сегодняшний день при-емущество имеют лекарственные Форш 4M которые содержат весь комплекс биологически активных белков с молекулярной массой so ICO ООО дальтсн, а з будущем, по нашему мнению, целесообразно сконструировать препарат содержащей определенные подвиды иятерфероноз, л»4окшов, мсвокинс-й и других биологически активных белков.

Е настоящее время производство и использование ЧЛИ все более четко разделяется на два направления. Первое - производство инъекционных лекарственных форм интерферона для лече-истрых и хронических форм гепатитов, ряда онкологических, генерализованных вирусных и бактериальных инфекций ( Еоувалеэ Э.Ш., Кузнецов В.П. и др., 1591; Торрес Э. М. и др., 1991; Дворецкая С.А-., Кузнецов В.П. 1993; Кокорева Л.Н. и др., 1994; Oser H. 1990; Celle M. et al. ,1993; MilellaM., et.al., 1993).

Второе - производство интерферона для наружного и внутреннего применения в виде капель, мазей, свечей, таблеток, капсул Г Барсуков А.Е.. Шимченко П. Я. 1ЭВ5; ФС 42 - 247 БС-91;Еобкова Е.В. и др.,1994; Flelsíraann W.R., et al.,1991).

В России наибольший объем производства составляет ЧЛИ для интраназального применения. Ежегодный объем выпуска такого интерферона составляет 40-50 млн. доз. Некоторые предприятия выпускают в год более 10 млн. доз интерферона, что соответствует уже промышленным объемам производства.

' - 10 -

Препарат выпускается по Регламенту производства человеческого лейкоцитарного интерферона N ЗОЕ-82 и ряда изменений к нему. В качестве клеток-продуцентов интерферона используются лейкоциты человека, выделенные из донорской крови, лейкоцитарной или эритроаитарной массы. Для индукции интерферона используется вирус болезни Ньюкасла, вакцинный штамм "Н", в виде неочищенной вируссодержащей аллантоиеной жидкости. Весь технологический процесс проводят в колбах, матрацах или бутылях. Регламентом не предусмотрена очистка интерферона от балластных белков. Как показывает практика работы объединений и предприятий с большими объемами выпуска'препарата, действующий Регламент более приемлем при производстве интерферона в малых объемах.

Именно предприятия, которым приходится в день перерабатывать от 30 до 100 литров донорской крови и работать с такими же объемами суспензии лейкоцитов на остальных этапах технологического процесса, первыми выявили отрицательные моменты получения интерферона в матрацах, колбах или бутылях. Эта очень большая трудоемкость, многостадийность технологии и ее много-зтапнссть, болызой объем ручного труда, отсутствие возможности автоматизации отдельных технологических процессов.

При ведении в матрацах или бутылях стадии прайминга, индукции и биосинтеза интерферона , на фоне отсутствия возможности автоматического контроля' и поддержания температурных параметров суспензии, приводит к получению интерферона с различной противовирусной активностью, что е свою очередь отражается на показателях себестоимости и рентабельности препарата.

Другим недостатком технологии производства интерферона по Регламенту N 302-82 это отсутствие стадии очистки интерферона от чужеродных антигенов, ( вирусного индуктора, белков аллантоиеной жидкости, в том числе и овальбуминз) , Присутствие чужеродных антигенов в интерфероне для интраназального применения может вызвать сенсибилизацию организма к зтим антигенам, особенно к овальбумину (Бобкова Е.В., и др.,1865; Николаева Е.И., Варданян Н.В., и др., 1991).

- Í1 -

В начале 90-х годов требования к качеству ЧЛИ были значительно повышены. Согласна ФС 42-S47BC-91 ЧЛИ для интраназаль-ного применения должен содержать овальбумин не более 0.05 мкг 'мл..противовирусная активность интерферона должна быть не ниже 1000 МЕ в ампуле и препарат не должен содержать HEs-ан-тйгйя 'R ог.тггг с i-icinn «.-япжчее получать xsu& ¿«кии

ь соответствии с w042-247BC91 по действующему

Регламенту производства ЧЛЙ N 302-82 и изменениях к нему, где не предусмотрены стадии очистки вируса-индуктора и интерферона , а технология получения интерферона в матрацах , бутылях не обеспечивает стабильное накопление интерферона в питательной среде. Так с целью снижения количества овальбумина в препарате, после окончания стадии индукции интерферона и удаления вируса-индуктора, начали вводить процесс отмывки осадка лейкоцитов ог остаточной примеси аллантононых белков. Есе это привело к дополнительной трудоемкости производства и потеря?/! до 10-15 клеток-продуцентов интерферона, к дополнительной гравматизашш лейкоцитов.

■открытие в 80-л год?,м лимфооропнн:: вирусов, 5 тек числе :: впруоа иммунодефицита человека (ЕйЧ), ныаывакндего синдром приобретенного тл^гнодефицг!^- человека ¡"oíSw и ногмодзосг.: гаражендя жлей инфицированной кровью или препаратами, приготовленными из такой крови (Бюлл. ВС8, 1990, 1991), остро поставили вопрос о введении стадии очистки и дополнительных методов инактивации возможных вирусое-контаминантоЕ в нативном ЧЛИ для кнтранагального применения.

Существующие методы счистки интерферона весьма трудоемки к мало пригодны для очистки большее объемов интерферона. Так,например,а технологии изготовления инъекционных препаратов интерферона (Cantell К., Hirvonen S. 1981) используют многоэтапную процедуру осаждения белков роданистым калием с последующем их зтаноловым фракционированием под контролем рп. Метод при 1000-кратном концентрировании ЧЛИ позволяет a ICO раз его очищать с 60% -ным выходом конечного продукта.

' Другой известный метод очистки интерферона от примесных

белков -использование иммуносорбции (Qgburn O.A. et al.,1973; Torrn E. T.,Faucker K.1976). Интерферон специфически адсорбировали из снеси белков на иммукосорбенте, с иммобшшзирован-нш антшштерфероновыш иммуноглобулинами, е последующей его элщией. Описан способ очистки интерферона (Пивоваров A.M. и др.Д932)путем его осаждения сульфатом аммония с последующим растворением осадка в 2-8 М мочевине и далее гельфильтрацией на колонке с гелем Акрилекс П -60.

Другие исследователи (Rubinstein М.,Psstka 5.1981) осаждали интерферон трихлоруксусной кислотой и проводили хроматографию растворенного осадка на колонке с сефадексом Q-100.

Описан метод ' очистки интерферона на колонках с отечественными кремнеземными сорбентами (макропористое стекло МПС-200 и склохром С-80) с последующей элюцией интерферона (Синева O.A. с соавт.,1985).

Однако,все выше перечисленные способы позволяли получать высокоочищенные препараты интерферона с достаточно высоким еыходом по противовирусной активности .но с потерей других биологически активных белков,которые продуцируют лейкоциты на стадии биосинтеза интерферона. '

Другим недстатком этих и других методов является то , что достаточно сложно в производственных условиях проводить работы с хроматографическнм оборудованием при больших объемах производства интерферона.

В 1379 году В.П.Кузнецоз с'соавторами предложили удалять ашханюисные белки и вирус-индуктор методом н&гзтивнои имму-носорбции при получении инъекционного интерферона. Антитела против аллзнтоисных белков и вируса -индуктора иммобилизовали на BrCN -активированной сефарозе фирмы "Pharmacia" (Швеция). Метод обеспечивает достаточно полное удаление посторонних антигенов при сохранении противовирусной активности интерферона и других биологически активных белков. Однако легкая сжимаемость сефарозы значительно ограничивает скорость шмуноаффинкой хроматографии и затрудняет применение большие объемов колонок.

- 13 -

В работе Гариясвой к.К. о соавторами(199Э) предложено антитела против аллантоксных белков и вируса-индуктора ге.з,мобилизовать на матрице , полученной на основе поливинилового спирта. £ целом это предложение несколько повышает устойчивость хроматографшесккх '»тлгл^ « процгсс^ от^муат?.!^!». од нзко. пая йг-Ах.та"-"го и^улоа^ншых хромзтсграфий, характерно загрязнение препаратов интерферона фрагментами кроличьих иммуноглобулинов за счет действия на них разнообразных протеаз в полуфабрикате интерферона, выделяющихся при аутоли-зе клеток-продуцентов.

Тагам образом, традиционный путь очистки интерферона от контамкнирующих примесей, в том числе и аллантоиснкх белков, удаляемых на стадии готового препарата, представляется достаточно трудоемким, технически слезным . продолжительным и неприемлемым для крупномасштабного производства.

В начале 90-х годов в производств природного «-интерферона создалась ситуация, когда по действующему Регламенту производства N302-52 и изменениям у. нему стало проблематично получать все серии ЧЛЙ для интраназадьного применения в полком соответствии с ФС 42-247 ЕС- 91.

К в тему времени накопились данные с наличии клеточных медиаторов в препаратах интерферона и о важности их сохранения в процессе очистки.( Вахромеева Н.С., Авдеева Ж. И., Кузнецов В.П.1986; Кузнецов В.П. и др..1988; Голбан Т.Я. .Чешик О.Г. ,Кузнецов В.П. и др.,'1594;.

В эти же годы показана возможность использования интерферона в медицинской практике в виде различных его лекарственных форм ; Барсуков А.Е., Шпаченко П.Я. 1965; Кузнецов В.П.' к др., 1988; ЕобковаЕ.В., и др. ,1994; Голбзн Т.Д., и др. ,1994).

Все выше перечисленное - перспективы использования различных лекарственных форм интерферона в медицинской практике, возрастающие требования к качеству препарата и его безопасности, отсутствие промышленной технологии производства счищенного интерферона с сохранением клеточных медиаторов, обос-

новывают целесообразность активизации усилии по разработке технологии крупномасштабного производства человеческого лейкоцитарного интерферона для различных лекарственных форм. Эта технология, с учетом современных знаний о интерфероне, должна базироваться,по нашему мнению, на следующих принципах:

1.Получение интерферона одномоментно в больших объемах, должно проводиться в биореакторах ' управляемых компьютером.

2. Для снижения трудоемкости и упрощения производства интерферона, технологический процесс стадии индукции и биосинтеза должен быть одностадийным за счет соединения стадии индукции и биосинтеза в единый процесс.

3. Для индукции интерферона в клетках-продуцентах необходило использовать очищенный гирус- индуктор.

4. С целью получения интерферона, содержащего максимальное количество биологически активных белков, суспензия лейкоцитов, должна содержать набор форменных элементов белого ростка крови близкий к физиологическому сочетанию в донорской крови.

5. В технологических процессах для очистки интерферона и вируса-индуктора должны использоваться методы микро и ультрафильтрации.

6 .Среда для культивирования лейкоцитов должна содержать очищенные и простые составные компоненты.

При разработке технологии крупномасштабного производства человеческого лейкоцитарного . интерферона мы использовали и предыдущие наши разработки, которые отражены в виде изменений к Регламентам производства человеческого лейкоцитарного интерферона N 134-69 , N 302-82 и в авторских свидетельствах на изобретения.

1.2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель - разработать компьютеризованную, автоматизированную технологию крупномасштабного производства человеческого лейкоцитарного интерферона, очищенного от балластных и аллергизирующих примесей.

Для достижения этой цели намечено решение следующих задач:

- 15 -

- Разработка компьютераозэнной конструкции основных к вспомогательных элементов биореактора , обеспечивающих оптимальные условия для продукция интерферона лейкоцитами. в больших объмах;

- Изучение закономерностей биосинтеза интерферона » f-реакторе пои ¿елитг ** yzzza*iax , z г.ч. плп "C"5£;lv,r>jii-M лраиминга;

- Разработка способа выделения чистых лейкоцитов из боль-'ших объемов и различных источников сырья с полным сохранением .их интерферонопродуцирувщей активности;

- Изучение закономерностей мембранного, разделения при 'очистке интерферона и его индуктора, к разработка на их основе оптимальных режимов очнегки ;

- Изучение зсгмакзогтеЗ использования радиационной обработки для шактивэши вкрус-св-кснтзминантов з ЧЛК .

1.5. ЯАУЧШЯ НСЗНЗНА. 1.Разработана технология крулнс-мзсатабного производства человеческого лейкоцитарного интерферона с зл®«гн?змв автскатиэчцвк и кгнкятерного управления.

5. С истол> еовы1лви методов мембранного разделения получен высокоактивный. очищен™"": ?гяластных :: зллергивирукетх примесей г.нтерферон для различны;; его лекарственных форм.

3. газработаны инженерные конструкции, обеспечивающие жизнеспособность лейкоцитов при культивировании их в суспензии большего объема.

4. Разреботан универсальный способ выделения чистых лек-y.оцитое не различных объемов и истсчнжов сырья - донорская кревь, лейкоцитарная и эритроцитарнзя масса.

5. Впервые разработан двухэтапный режим праймирования клеток-продуцентов в условиях биореактора с целью интенсификации продукции интерферона на стадии биосинтеза.

5. Впервые разработан способ очистки индуктора на микрофильтрационных и интерферона на улътрзфшштрационных мембранах .

".Впервые показана возможность оптимизации среды культп-

вирования лейкоцитов путем добавления перекиси водорода, цитрата натрия, донорского альбумина.

7.Впервые неучено влияние радиационной обработки на противовирусную активность интерферона и определены оптимальные параметры инактивации т -лучами вирусов - коятамшантов в 4JM.

Основные положения научной новизны проведенных исследований подтверждены авторскими свидетельствами Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий.

1.4, ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Е ПРАКТИКУ.

Разработан универсальный способ выделения чистых лейкоцитов из различных объемов и источников сырья, обеспечивающий выход лейкоцитов до 90-951.

Разработана конструкция перемешивающего устройства и вспомогательных элементов, позволяющих культивировать лейкоциты в суспензии больших объемов.

Разработан температурный режим стадии прайминга в условиях биореактора, способствующий получению интерферона с высокой противовирусной активностью.

Разработаны оптимальные режимы получения интерферона в биореакторе с управлением этого процесса по программе с помощью компьютера.

Разработаны оптимальные режимы процессов микро- и ультрафильтрации при очистке индуктора и интерферона.

л На основе проведенных исследований разработана технология крупномасштабного производства человеческого лейкоцит-арного интерферона для различных его лекарственных форм с элементами автоматизации и компьютерного управления.

Разработан к утвержден 30.11.1990года Комитетом медицинских иммунобиологических препаратов новый Регламент производства ЧЛй - Регламент производства N £81-90. Интерферон лейкоцитарный человеческий сухой . Авторы : Кулагин В.Ф., Юсупов Б.Г., Бобкова Е.В. , Загидуллин Н.В., Хафиэова Л.Г.

- 17 -

Созданная технология позволяет получать интерферон в больших объемах, а методы очистки интерферона обеспечивают получение препарата высокой степени чистоты при сохранении биологически активны:-: белков в диапазоне до 100000 даль тон.

Технология освсена и вкедсена в пппия.впттптлп 5

БнёЛОвЬИй НинОИ '."н»нл11пг'тга "Р'^ИГТОДОТРП ПНТОрфсрОПи »¡1/с1-

волило значительно снизить трудоемкость на всех этапах работы, уменьшить количество ручного труда, обеспечить стабильный процесс биосинтеза интерферона.

Полученный интерферон по многим качественным показателям значительно превосходит препарат, получаемый по Регламенту производства N 302-82.

Результаты выполненных исследований явились таете основой для внесения изменений в 1994 году в Регламент производства ЧЛ1 N 281-90.

1.5. ШРСБАЯИЯ РАБОТЫ.

■¿-дельные фрагменты работы доложены:

- на республиканских научных конференциях" Вопросы производства бактерийных и вирусных препаратов" ¿г. Уфа.,1974г.), "Иммунобиологические препараты" (г.Уфа.. 1925г.. 1996г. '1.

- на пленуме отраслевого координационного Ооветз по интерферону '„ г. Уфа., 1388г.).

- на пленуме отраслевого координационого Совета по мембранным технологиям (г. Уфа., 1957г.).

1.6. ПУБЛИКАЦИИ. Материалы диссертации отрэлень; в 5-ти авторских свидетельствах на изобретение, в 4-х изменениях к Регламентам производства интерферона N 154-69; N ЗОЯ-52; N 281-90 , в Регламенте производства интерферона N 281-90.

Остальные разделы диссертации по которым не было запрета на публикацию Государственны}/! комитетом СССР по делам изобретений и не содержащих технологических сведений ноу-хау изложены в 12 печатных работах.

1.7. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Способ выделения чистых лейкоцитов с помощью БМЦ-100, позволяющий получать из различных объемов и источников сырья,

до 30-951 клеток - продуцентов интерферона.

2. Способ очистки вируса-индуктора на мембранах и модулях отечественного производства, обеспечивающий очистку индуктора интерферона от балластных примесей более 99,98%.

3. Конструктивные элементы сместителя и вспомогательных элементов биореактора, позволяющих культивировать лейкоциты в суспензии больших объемов.

4. Двухэтапный режим прайминга, обеспечивающий в условиях биореактора, интенсивную продукцию интерферона лейкоцитами.

5. Способ получения интерферона в биореакторе.

6. Способ очистки интерферона от НВз-Ай1, антигенов вируса -индуктора на мембранах и модулях отечественного производства.

7. Применение дробного т~облучения в суммарной дозе 20-25 кГр для инактивации вирус а-индуктора и возможных вирусных контаминантов в ЧЛй.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В качестве объектов исследований избраны:

-лейкоциты человека, донорская кровь, лейкоцитарная и эритроцитарная массы;

-водорастворимая мэтилцеллюлоза с молекулярной массой 100 :<Б, 65 "КО, 35 кБ (ВМД-100,ЕМЦ-65 ,ЕЩ-35);

-вакцинный штамм "Н" вируса болезни Ньюкасла (ЕБН);

-клеточные культуры - клеточная линия СПЗВ, однослойные культуры фибробластов человек и куриных эмбрионов;

-среды 199, гидролиэат лактальбумина, плазма донорской крови, антибиотики, гепарин, инсулин и другие компоненты, используемые в Регламенте производства человеческого лейкоцитарного интерферона N Э02-82;

-биореакторы, центрифуги отечественного и импортного производства;

-микро- ультрафильтрационные установки отечественного производства;

-микро-ультрафильтрационные мембраны отечественного и им-

- ly -

портного производства.;

-лммунсфермектные т^ст^системы для определения овэл^:-на, HEs-Ag;

- ЗН?ИСЫВОрОТ'-"И ГИСТ^СОВМ^С ТИМОСТИ;

-гемагглютинирухяцую сыворотку человека ^рунх: С Га * ■ • -зритрп!П"г,г «^лекл ггуппь: AB;

— пя^''1""- HbU'i i ci ~ С Г f р IUI И 8 ВТ С Ü РГО-150.

В работе с клеточными культурами и при получении ЧЛИ использовали среду 199, гидролизат дактальбумина, плазму донорской крови, антибиотики, гепарин, инсулин и другие компоненты, используемые в Регламенте производства человеческого лейкоцитарного интерферона N 302-82. В работе были использованы: Вирусологические методы:

-культивирование вируса - индуктора интерферона ¡,ВЕН: и индикаторного вируса - вируса вес,пкт7'ляриого о,Т1омат11та (ВВС? на 9" 10 дневных куопных ?мбсионах;

-титрование ЕБН и ВЕС на фибробяаетзх куринмх эмбрионов а г^стсчнск линии СПсЬ:

-определение противовирусной активности интерЛерст на 4 суточных пеоевиряежх клетках почек. вмбрисна г-винья пгь'-тнв 100 ijiui '"50 ■■ мл вир**сз к?вик?лярнощ? стоматита согласно ФС 42-247ВС-31. В качестве стандарта использовали интерферон для интраназального применения с противовирусной активностью 15DQ МЕ/мл.

С е с о л о г ич еские м е с о л ъп

-определение гемагглютинируюаей активности ВЕН по Реглэ-jii^u^v производства N GC'S-62.

-определение HBs-Ag с помощью иммуноферментной тест-системы, изготовленной на предприятии по производству бактерийных препаратов (г.Нижний Новгород ), согласно прилагаемой инструкции.

-определение овальбумина с помощь» иммуноферментной тест-системы производства НПО Иммунопрепарат г.Уфа, ВФС 42 -325-ВС -92 и согласно прилагаемой инструкции по применению. Чуветви-

- го -

тельность тест-системы до 1 нг/мл.

-выявление изоантигенов АВ ( аритроцитарных ) групповой совместимости в препаратах интерферона в реакции гемагглюти-нации (Ж.ДоссеДЭБЭ) после истощения стандартной гемагглюти-нирующей сыворотки человека группы О(сШ) сериями интерферона. Таким образом, реакцию переводили в вариант РТГА. Титрование проводили микровариантным методом, а титры выражали в Log .Наличие АВ - изоантигенов в препаратах интерферона фиксировали по разнице в (Log ) титра в сравнении с контролем.

-индикация антигенов гистосовмеетимости (лкмфсцитарных) системы HLA-DR з препарата:! интерферона с использованием классического варианта реакции микролимфотоксичеекого феноти-нированик (Зарецкая Ю.М.»Абрамов В.Ю., 1986). Использовали для этого стандартные панели С.- Петербургского НИК гематологии и траксфугйологкк с набором антисывороток для 72 антигенов гистосовмееткмос-тк, последовательно истощая эти антисыворотки вносимым в реакцию интерфероном с последующем добавлением лимфоцитов фенотшируемого донора и комплемента. В случае наличия в составе интерферона антигенов главного комплекса гистооовместимости последние связывают лимфоцитотоксичес-кие антитела панели и реакция становится отрицательной. Микробиологические методы :

-определение бактериологической стерильности чистых лейкоцитоз, вируса-индуктора (ВЕН), индикаторного вируса (ВЕС), питательных сред, интерферона и других компонентов, использовании х в работе, проводили по ФС 42-247В0-91. Биохимические методы:

-определение остаточного формальдегида по ФС 42-344BC-9Q. -определение общего белка методом Лоури (1955), Хроматографические методы исследования: Аналитическую гель-хроматографию выполняли, придерживаясь общепринятых принципов , описанных в кн. "Гель-Хроматография" Г.Остермана, "Мир",М.,1970 г.

Для сопоставительного анализа препаратов интерферона, полученных по старой и новой технологии, использовали разде-

лит?льhi^ хроматографию.

Хромзтографическое разделение проводили на установке FFL0 фирмы фармация (Швеция) используя колонку Superóse 12 10x30.

Сухие препараты интерферона (готовая форма) разводили в

2 раза 0,01М Трис-HCL буфером с 0,2М хлорида натпия пд **. ?.цтт "рооодпл;; /*е пу.ьог^м < Сельов i элкате осуществляли при 2S0 нм.Регистрацию белковых пиков и расчет относительного содержания различных белкоьых компонентов осуществляли с помощью прибора LCC-500.входящего

3 состав установки FFLC-Для калибровки колонки использовали стандартный набор белков с известной молекулярной массой фирмы "Sigma".

Физические методы исследования.

При разработке способа очистки интерферона и впруса-ин-терферокогена использовали способ ультрафильтрацпи и микрофильтрации з тангенциальном потоке и режиме диа-ф;!льтрацкн на -лоскокаыернкх разделительных аппарата" т "Ei:cTé£H¿5ca" при НПО !1йммуяопрвпарат" г.Уфы.Площадь фильтрующей поверхности отставляла 0,6 й аппаратах попользоэели отечественные микрсфидьтраиионные мембраны ná-ü,¿ (полиамидные с размером пор 0,2 мкм) - мембраны Владипор, Ш5Ц N 2 и MOA-А N 1 (размер пор 0,2 мкм) - Казанское ПО "Тасма" . йа ультрафильтрационных мембран с порогом задержания веществ 100 кП были испытаны мембраны N 153 (полипропиленовые) , N 72 (лавсановые ). УПМ-ЮО (полисульфонэмидные) и мембраны ПСУ-120 (полипропиленовые), ЛШ-ЭЭО (полисульфонамидные) с порогом задержания веществ 130 kD и 200 kD.

В работе использовали микрофильтрационные мембраны VVPP , SVPP, HVPP с размером пор 0,1, 0,22 и 0,45 мкм соответственно и ультрафильтрационные мембраны РТНК и РТМК с порогом задержания веществ 100 и 300 kD (фирма "ißüLffiSIOP" США).

Для проведения осветляющей фильтрации вируса-индуктора использовали модификацию фильтра, который был разработан нами

для очистки вируссодержащей жидкости ( A.c.N 854980 ) и металлические погружные фильтры П-40 производства НТК "КОНТУР" г.Санкт- Петербург.

Радиационную обработку интерферона и вируса-интерфероно-гена проводили на установке РГС - 160 з НПО "Биотехнология" г. Москва.

Культивирование лейкоцитов проводили в бкорвакторе, в котором конструкция перемешивающего устройства и другш: вспомогательных элементов разработана нами с созет. (А.с. N 1459229 от 15 октября 1988 года).

Методы статистической обработки полученных данных.

В материалах исследований приведены значения средних величин и доверительных интервалов при значениях Р< 0,05.

2.1.1. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ источнике® СЫРЬЯ.

'2.-1. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Современное производство ЧЛИ основано на использовании в качестве клеток-продуцентов чистых лейкоцитов крови человека.

Среди многих методов выделения чистых лейкоцитов на практике используют двухэтапный метод (Регламент производства N ЗОЕ -82), как наиболее приемлемый и позволяющий добиваться выхода до 40 л. лейкоцитов от;общего их количества в исходном сырье. Этот метод предусматривает на первом этапе разделение лейкоцитов от основной массы эритроцитов в стабилизирующем растворе смесью декстрана и поливинилового спирта и на втором этапе - к полученному лейкоконцентрату, содержащему примесь эритроцитов, добавляют 0.83 %-ный хлористый аммоний для лизиса эритроцитов. После центрифугирования осадок чистых лейкоцитов, с незначительной примесью эритроцитов (до 15 эритроцитов на один лейкоцит), используют в работе. Данный метод практичен при малых объемах производства ЧЛИ и при выделении чистых лейкоцитов из лейкоцитарной массы.Однако, предприятия,

выпускающие ЧЛЛ 2 больших объемах, работают в основном с донорской кровью ~л перерабатывают ее в год до 10 тонн. Практика показывает, что применение двухэтапясго метода на предприятиях о большим производством экономически не выгодно в силу своей трудоемкости и малого процента да^

ТПП

С учетом острого дефицита донорской крови для производства ЧЛИ и недостатков способа выделения чистых лейкоцитов по Регламенту производства N 302-32, нами были проведены исследования по разработке более простого и экономически выгодного для производства одностадийного способа выделения чистых лейкоцитов с сохранением в клеточном пуле большинства типов лейкоцитов крови человека. Прк этом способ должен быть эффективным при выделении чистых лейкоцитов из "гех источников сырья - донорская кровь, лейкоцитарная к зритроцитгрная масса,

5 предварительны:-: исследованиях до псиоку ое-адителей эритроцитов. которые обеспечивали бы быстрое я полное осаждение, кале внимание привлекла вэдсраствсрккзя метидцедлюлоза (ЕЩ), которая широко попользуете?, в фармацевтической промышленности в качестве наполнителя таблеток.порошков, мазей.

Нямм /ли*"** едед";сдне ее ^а^ки: ВМУ-ЗБ 'моле-

кулярная мэеез .?п кЕ';, БМЦ-55 ;У.м.65 КО) ,БЩ-100(м.м. 100КБ).

Первые опыты показали, что ЕМЦ-100 осаждает эритроциты аффективнее, чем остальные марки - ЕМЦ-65 и ЕМИ-35. Поэтому все исследования в дальнейшем, проводились о БМц-лоО.

Опыты проводились с форменными элементами донорской крови, после отсоса плазмы. Различные концентрации ЭЩ-1С»3 готовились на 0.6? % НзС1.

При выборе методов стерилизации растворов ВМЦ-100 предпочтение было отдано тепловому воздействию, а из температурных режимов был выбран наиболее щадящий - тепловая стерилизация растворов под давлением в автоклаве при 0.05 Нпз в течение 30 мин. Однако оказалось, что после тепловой стерилизации способность ЕМЦ-100 к агрегации эритроцитов ухудшается в 1.2В раза по сравнению с ВМЦ-100, которая не была подверг-

нута стерилизации (табл. 1).

Таблица 1

Влияние кратности тепловой стерилизации растворов ЕМЦ-100 на выход чистых лейкоцитов

¡Кратность тепловой ! | стерилизации ! | растворов ВЫЦ-100 | 1 1 Вязкость в мПа-с ' при +25°С 1 Выход ЧИСТЫХ 1 ] лейкоцитов | ! (%) ! 1 1

1 ! |о : . | 1 ; 4.32 ± 0,12 ! 1 1 72+4 | 1 1

! ! 11 ! 1 I 4,06 ± 0,10 ! ! ! 52 ± 3,5 | 1 ;

| ! ¡ 2 1 1 1 4,20 ± 0,12 1 1 | 51+4 | 1 |

1 I 13 | 1 1 4,50 ± 0,13 | 73 ± 3 ! 1 1

1 ' ! 4 | ! ! 4,68 ± 0,12 1 1 1 72+3 | 1 !

1 I 1 5 | 1 ! 5,75 ± 0,14 1 1 1 54+3 . |

I | ! 6 ! 6,43 ± 0,14 ! 46 + 4,5 | I |

1 1 1 ! Р=0,01 1 1 ! РяО,05 1

- - использовали 0.3 % ЕМЦ-100 в 0.87 % растворе ЫаС1. Для фракционирования использовали осадок форменных элементов донорской крови.

С целью выяснения причины уменьшения выхода чистых лейкоцитов нами были изучены показатели вязкости растворов ВМЦ-100 и процент выхода чистых лейкоцитов в зависимости от краткости тепловой стерилизации. Оказалось, что однократная тепловая стерилизация приводят к снижению показателя вязкости с 4.32 ±

и.12 до 4,05 = 0.1С' , з процент выхода чистых лейкоцитов ени-лаетсл до 49-55 % (табл.!) однако с увеличением краткости тепловой стерилизации возрастают :: показатели вягкости 'табл. 1). не увеличение выхода чистых лейкоцитов нарастает до 4-ой тепловой стерилизации, я эа«ли г.роц=К1 ьылол* и^тат ^йзхл-

Е дальнейшем для отработки оптимальных параметров выделения чистых лейкоцитов из осадка донорской крози,лейкоцитарной и зритроцитарной массы использовали 0.15 % раствор ЕЩ-100 после трехкратной тепловой стерилизации. Исследования показали, что оптимальная температура суспензии - форменные элементы донорской крози + ВМЦ-ЮО, при которой происходит фракционирование с максимальным выходом чистых лейкоцитов, должна Сык в пределах + 20°С - + ЗС-°0 (табл.2).

Необходимо отметить, что важную роль в процессе фракционирования с помощью ВЩ-100 играет конечная ее концентрация з суспензии, которая находится в пределах 0.1-0.2

Нля производства наиболее приемлемы объемы соотношения осадка донорской крови и раствора ШЦ-100 - 1:2 - 1:3 (табл.2),так как увеличение объема ВЩ-100 дс 4 - о ~гк и «да? не влияет на гыход чистых лейкоцитов, однако значите л?, не вограетают объемы суспензии для центрифугирования.

При изучении оптимальных условий выделения чистых лейкоцитов из лейкоцитарной или зритроцитарной массы было выявлено, что при кспольговажга этого вида сырья условия должны быть такие же, что к при работе о осадком донорской крови.

Яс-с-ледованиями установлено . что центрифугирование кадо-сагачвой яцркоетн, оодераащей чистые лейкоцита, при температуре в камере ротора + 2 - +4°С, приводит к 78-92% потерям чистых лейкоцитов (табл.3). Это связано с тем, что при такой температуре значительно увеличивается вязкость ВМЦ-100 (табл. 3) и лейкоциты под действием центробежных сил не способны преодолеть вязкость раствора и осесть на дно центрифужного флакона.

Таблица 2

Влияние различных соотношений осадков донорской крови с ВЩ-100 и температуры суспензии, при фракционировании, на выход чистых лейкоцитов

! Соотношение Температура i Еыхсд (Число приходящих)

! объема осадка суспензии чистых [ эритроцитов '1

1 донорской крови при фракцио- i лейкоцитов | на i

! к 0.15 % раст- . нировании, 1 ! лейкоцит i

I вору ЕМЦ 1 (+°С) CS) 1 1

1 1 1 : \ 25 52+4 1 зз + з ! 1 1

1 ! 1 : 1 2 25 68 ± 5 I 1 | 12 + 1 | ( 1

1 1 1 : 1 3 25 71+4 ! S I 10 + 1,5 | 1 I

1 ! - 1 : 3 30 70 + 5 ! 1 ! 9 + 1,5 |

1 i 1 : 1 з 35 71 + 4 ! 1 1 s ± 0,6 I i [

I ! 1 : t 5 25 71 ± 4 ! ! | 8 + 1 j 1 i

! 1- 1 : 1 г> 1 25 70 + 5 1 i 1 3 - 0,7 J i 1

1 i 1 " 1 3 20 69 + 4 ! ! j 12 + 1 ! i (

1 1 : 1 о 15 47 + 5 1 I | 46+4 i I i

1 i 1 : 3 10 10+1 ! 1 s H.K. !

-в таблице приведены значения средних Ееличин и доверительных интервалов при Р а 0,05.

Оптимальными условиям!* при центрифугировании надосадочной жидкости, после окончания фракционирования, были следующими -температура в камере ротора додана быть не ниже * 1б°0, скорость вращения ротора 1500-1600 об/мин, в течеиио ¡л,ш.

Вьппопп«^«»;^ TT^ZZZHül ЙНЛвЛ!*?;- до 75 "о чиоткх

лейкоцитов, при зтом соотношение лейкоцитов с эритроцитами было в пределах 1:6 - 1:13.

Нами показано, что если осадок эритроцитов с примесьи лейкоцитов, после первого фракционирования, вновь обработать раствором ВМЦ-100 в соотношении 1:1 - 1:2 яри конечной концентрации ВМЦ-100 в суспензии 0.1 - 0.2 %>, то можно дополнительно еще выделить до 15 - 20% чистых лейкоцитов. Обший процент выделения из исходного сырья может достигнуть до 90-953= t а процент жизнеспособных лейкоцитов составляет 85 - 90%.

Таблица 3

Влияние температуры в камере ротора на осаждение чистых лейкоцитов из 0,15 \ раствора ВМЦ-100

! Температура! Вязкость ¡Скорость Содержание чистых лейкоцитоь

; е камере - суспензии оо-нлл ротора \----

1 ротора i | | з осадке j в надосадочной ! (+°с ) | (мПа-с) ! ( об./шт.) ! (%) j жидкости Ш

1 ; 2 - 4 ! 5, , 25±0,25 : 1500 - I 1500 ! ! 15 ± 2 S i 35 ± 7

! ; Й - ; 10 1 1 4, : ! .65±0.25 | i : ; 1500 -i i 1500 i 1 35 : ± ! 5 S t 65 ± 5

! 15 - 18 1 ! з, 1 59+0,17 ! ! ! 1500 - ! 1600 | ! ! 86 + ) 8 ] 14 ± 1

- в таблице приведены значения средних величин и доверительных интервалов при В = 0,05.

После отработки оптимального режима фракционирования осадка донорской крови, лейкоцитарной или эритроцитарной мае-

еы с помощью ВМЦ-100, была изучена возможность использования трилока Б в смеси с исходным сырьем с целью увеличения Еыхода чистых лейкоцитов при фракционировании. При этом мы исходили из того, что 25-30 Х-ные потери лейкоцитов на стадии фракционирования связаны с тем, что в исходном сырье, а оно используется через 20-22 ч. после отбора крови у доноров, при хранении происходит агрегация части лейкоцитов и они при фракционировании вместе с агрегированными эритроцитами оседают на дно сосуда. Добавление трилона Е к исходному сырью должно приводить к распаду агрегатов из лейкоцитов, что в свою очередь повысит процент выхода чистых лейкоцитов при их фракционировании.. Действительно, в опытах с использованием трилона Б нагл удалось повысить выход чистых лейкоцитов до 9095?«, при этом конечная концентрация трилона Б в суспензии -исходное сырье + трилон Б+ БМЦ-100 должна быть в пределах 0.1 - 0.5 %. Увеличение концентрации трилона Б в конечной суспензии выше 0.5 % приводит к снижению выхода количества чистых лейкоцитов.

При изучении состава пула чистых лейкоцитов,полученного с помощью трилон Е+ВМЦ-100 было выявлено близкое соответствие в процентном соотношении к клеточному осади;/ форменных элементов донорской крови (табл. 4).

Состав клеточного пула чистых лейкоцитов, полученного по Регламенту производства N 302-82, характеризуется более низки)«! показателем соотношения лейкоциты/лимфоциты и этот показатель находится в пределах 0,45 - 0,73.Для пула чистых лейкоцитов, выделенных с использованием трилона Е+ЕЩ-100, этот показатель составляет 1,00 - 1,63, а в осадке донорской крови соотношение лейкоциты /лимфоциты составляет 1,04 - 1,85.

Исходя иг последних данных об интерфероне, как о комплексе биологически активных белков и вероятности участия всех форменных элементов белого ростка крови в их продукции (Kazuko U. et al., 1991 ), необходимо чтобы клеточный пул чистых лейкоцитов был представлен всеми форменными элементами белого ростка крови человека, при этом их количество должно

быть близка к физиологическому сочетанию в донорской крови.

Как видно из таблицы 4 яолее полный состав форменных элементов белого ростка крови и по физиологическому сочетанию характерен для пула чистых- лейкоцитов, выделенных с трилоя Б + БМЦ-100.

Пр,, составе т-п^' л-дкицитов можно получать интер-

ферон, о осльшей долей вероятности, с более полным по составу комплексом биологически активных белков.

Таблица 4

Состав клеточного пула чистых лейкоцитов, полученного различными методами.

: Состав клеточного пула в X на гСС» клеток осади

Способ выделе- ;Выход ; Езго-1 Эоги- I Нейтрофилы 'Лимфоциты! Моноц»/'«

¡яия чистых 1 лейке-1 Филы ¡ими-!-- ■■ ---!

;.™ккспитг-в !цгего* 1 ; ян 'палоч- 'сегмент-1

! 1 ! ! ксчлер. | ночлер. ; !

: 1 . 1 \ | 1 ! % | х ! Я

¡Регламент 40 :

,\.5! 2 ¿и, 5

I

■Осадок донор- |90-95 |

ской крови + < ! Трилон 5*1

1С-О • 1

10,5± | 0.5+ | 52 ± 5 1 44 ± 5 ! 3 ±С4? >0,15 I ил? - !

Осадок донор- ¡100 : 0,5± ¡0,6г ! 0,5 ± | 53 ± 6 | 42 ± 7 I 3,4±0,6 ской крови | | 0.14 10,16 | 0,1 | ! |

- в таблице приведены средние величины и доверительные нтервалы при Р= 0.05.

Способ по авторскому свидетельству £ 1361767

Цо Регламенту производства ЧЯИ $ 302-82

Донорская кровь

лейкомасса

обработка л-массы Декстран + ПВС

стадия обработки Л'/Д суспензии лейкоциты + эритроцит'

суспензия чистых лейкоцитов

.Еис.1. Схема технологического процесса выделения чистых лейкоцитов

Оравнитегьвыв отличия получения чистых лейкоците* ло Регламенту производства ЧЛИ Н 502-ё2 и не новому способу приведены на рис. 1.

Таким образом разработан универсальный способ выделения чистых лейкоцитов иг различных источников сырья - осадка форменных элементов донызскпй « т»рясй массы, л.-.йи<1ля!™ц;т:": псвы^ич. выход до 90-952 форменных элементов белого ростка крови с сохранением интерферонопроду-цирующих свойств. Этот способ включает в себя добавление к исходному сырью трилона Е в количестве, чтобы концентрация .трилона Б в суспензии с исходным сырьем была в пределах 0.1-0,5 %. После 5-10 мин. контакта добавляется раствор 0.150.3% БМЦ-100 в количестве 2-3 объема.Добавляемый раствор ВМЦ-1CD обязательно подвергается три раза тепловой стэрклизащк: при 0.05 Мпа по 30 минут с последующим выдерживанием при температуре +4 - +биС в течении 15 - 2С ч. после каждой отерпли*-гации. Полученная суспензия, с температурой +20 - +80сС) тщательно перемешивается. Время фракционирования £0-45 мин. Далее еуспенгнн ЗМЦ-IGG с я*йчоциташ оггзеыва^тся и центрифугируется при 1500 -15СС сб 'мин. в теченаа 2C-SG мин. при температуре в камере ротора в пределах +1В - Пх-л* отсоса Нац-_-;-адочнои жидкости . к осадку лейкоцитов добавляется питательная среда.

Разработанный способ выделения чистых лейкоцитов (рис. 1) прост в исполнении при крупномасштабном производстве человеческого лейкоцитарного интерферона.Способ внедрен в цехе интерферона НПО "Иммунопрэпарат".Разработка выполнена на уровне изобретения - A.c. 1S61757.

2.1.2. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ОЧИСТКИ БИРУСА-ИНДУКТОРА ИНТЕРФЕРОНА ОТ БАЛЛАСТНЫХ БЕЛКОВ ДЛЯ КРУПНОМАСШТАБНОГО ПРОИЗВОДСТВА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА.

Широкое использование ЧЛИ для лечения и профилактики вирусных заболеваний как у взрослого, так и детского населения настоятельно требует решения вопроса о максимальном исклзоче-

нии чужеродных .белков в готовом препарате. Особенно остро возникла эта проблема в связи с ухудшением экологической обстановки, что в свою очередь весьма повысила чувствительность человеческого организма к антигенам растительного и животного происхождения.

В производстве ЧЛИ используется в качестве интерфероноге-на - вакцинный штамм "Н" вируса болезни Ньюкасла в виде неочищенной аллантоисной жидкости куриного эмбриона. Значительную опасность из аялантоисных белков представляет овальбумин (ОА), который попадает в препарат на стадии индукции интерферона. Исследованиями отечественных и зарубежных ученых было показано (Максимова Г.А., Лонская Н.И. 1981; Laus et al.,1988), что ОА обладает сенсибилизирующими свойствами не зависимо от пути его введения,в том числе и ОА в составе интерферона (Вобкова E.B. 199S ).

Проведенные исследования по определению ОА в коммерческих сериях интерферона (Вобкова Е.Е.и др. ,1985;Николаева Е.И., Еарданяк Н.В. и др., 1991) показали наличие его в исследованных сериях, а в некоторых сериях концентрации превышали дозы не обладающие сенсибилизирующей активностью . На основании этих исследований Г1ШЙСК им. Л. А. Тарасевича ввел показатель максимального содержания овальбумина з препарате ЧЛИ не более 0.05 мкг/мл. ( ФС 42-247 ЕС-91).

С введением этого .показателя остро встала задача разработки способа получения интерферона с минимальными показателями его присутствия в готовом препарате.

Использование в производстве интерферона вируса болезни Ньюкасла (Регламент производства ЧЖ N 302-82) в виде неочищенной вируссодержащей аллантоисной жидкости, обуславливает, даже при удалении питательной среды с вирусом-индуктором, после окончания стадии индукции, наличия овальбумина в готовом препарате.

Известные технологии получения ЧЛИ для инъекционных лекарственных форм (Кузнецов В.П.и др.,1981; Oantell К.,et al., 1981; Gante11 К. ,Hlrvonen S.1981) также предусматривают ис-

пользование вируса-индуктора в виде неочищенной вируссолер*а-'дей аллантоисной лидкоств с последующей очисткой интерферона от аллактсисных белков и вируса -индуктора.

Не нашему мнению, наиболее технологично, экономично и рационально вести процесс получения интерферона для различных лекарственных форм с очищенным чс;.:

инторфорсь wi кингаминип1ппгтуггт "prcrcos;":.

С целью исключения чужеродных белков з препаратах интерферона необходимо использование на всех этапах производства ЧШ максимально очищенных компонентов, в том числе и вируса-индуктора. Е связи с этим остро встает задача по разработке простого и экономичного способа очистки вируса-индуктора.Известные методы очистки и концентрации вируса с помогаю ионно-обмекной хроматографии, гельфильтрации , спиртового и солевого осаждения, разделения в двухфазных полимерных системах, ультрацентрифугирования, (, Красильнпков К,В, к др., 1983 '.Грк-горапева И.Н.и др.,19&G ;НопьеЕ В.П. и др.,1990: Архипов Б. К. л др.. 1991 : Муотафпн К.Г. и др., 1991; Борисов Е.В. и др., 199Й I, процессов мембранного разделения в комбинации с гель-фхлырэцкел ^Мчедлтп^цдп В. Б, и др. ,1934 ;Клхц:кпк -J.K, ц др., 1985 .) неприемлем при крупномасштабном производстве интерферона, вследствпи больших потерь вируса ¡'60-30?,), многеэтап-ностп. длительности процесса очистки, необходимости наличия дорогостоящего оборудования. Такие методы очистки и концентрации вируса-индуктора экономически не выгодны в производс-

Наиболее перспективны}.! является использование мембранной технологии для очистки и концентрации вируссодержааей жидкости, в том числе и БЕК < Гомслипкий 0.3. и др., 1983; Гвоздева И. Г., Еобкова Е, В. 1935; Иванов Н. Б. и др., 1985;Лукьянова Э.Г. и др., 1989;Клхлпник С. 50. и др., 1991; Wolf R. I960).

В проведенных исследованиях (Хафизова Л.Г., Еобкова Е.В. 1993 ) с ББН была разработана технология счистки и концентрации вируса-индуктора , которая включала в себя стадию осветляющей фильтрации ЕАН з тангенциальном потоке на разделитель-

ных аппаратах с использованием плоских мембран с размерами пор 0,2 --0,45 мкм. и стадию очистки и концентрации ВЕН на ультрафильтрационных мембранах с размерами пор 100-300 kD с диафильграцией . Однако этот метод в условиях крупномасштабного производства оказался трудоемким и менее экономичным.За 7-8 ч. непрерывной работы удавалось счистить и сконцентрировать не более 6-7 л. ВАЖ .При этом выход вируса по ГАЕ состз-вил 50-60%.

С учетом вышеизложенного нами были проведены исследования по разработке способа концентрации и очистки больших объемов вщ>уеа-нндуктора от балластных белков и овальбумина.

В основy выбора направления по разработке способа концентрации и очистки вируса-индуктора от балластных белков на микрофильтрационных мембранах было положено наблюдение, суть которого состояла в том, что чем дольше вирус хранится при температуре +2 - + Б°С, тем больше его обнаруживается в жидкости над мембраной.Дальнейшее изучение этого явления позволило разработать технологию концентрации и очистки НЕН в joo-бых объемах на микрофильтрационных мембранах с размером пор 0,2-0,45 мкм.

Первый этап исследований предусматривал поиск простых и удобных в производстве методов осветляющей фильтрации ЕАЖ. Использование для этих целей префильтров АР-20 (Миллипор) и фильтрокартона Косинской бумажной фабрики марки Ш ВО ТУОП 13 -63-72- 82 в проточном режиме показала бесперспективность этого метода, так как префильтр быстро забивался , падала скорость фильтрации. Через одну пластину можно пропускать не более 2,5 л. вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ).Наиболее приемлемыми и простыми в работе для проведения осветляющей фильтрации BAI в условиях производства оказались модифицированный фильтр ..который был разработан нами для очисти! вируссодержащей жидкости ( A.c. N 854980 ), а также металлические погружные фильтры (П-40)многоразового использования. При проведении осветляющей фильтрации не отмечено сорбции вируса на фильтрах. С помощью одного такого фильтра , содержа-

¡цего 5 металлических пластин, можно га 15-Еи мин. профильтровать до 12 - 15 л. Б AI, с различными сроками хранения при +2-+ 6°С.

Следующий этап исследований предусматривал разработку оптимальных условий концентрации и очистки ВАЖ, содержащей ВЕН. ка -«ewH^uav

Hr"""-- граций и очистки ВЕН проводили в закрытой

системе с использованием плоских отечественных и импортных мембран с размерами пор 0,1 -• 0,45 мкм. Мембраны заправляли в плоскокамерные разделительные■аппараты . (ПРА - 0,5). Площадь фильтрующей поверхности составляла 0,5 м2. '

Плоскокамерный разделительный аппарат стерилизовали с помощью 6 % раствора формалина. После отмывки аппарата от остаточного формалина, проводили концентрацию и очистку БЕН в тангенциальном потоке с диафильтрацией.Рабочее давление внутри аппарата было в пределах 0.03-0,04 Мпа. ВВН в объеме 6 л., после осветлявшей фильтрации, концентрировали до 500 мл и далее проводили процесс дкзфидьтрацгш физиологическим раствором в объеме 2.5 л. На этапе диафилътрации объем концентрата в?г-руснсй су"спензи;: доводили до 0,14 л. и далее сливали в стерильную емкость.

и исследованиях была нс-польгоЕзаа БАЕ о звдерякок np;i ^ 2 - + б°С в течение 30,45,60,90 дней, после отбора из куриных эмбрионов.

Изучение вопроса о влиянии длительности выдерживания ВМ при + 4 - + •5сС на эффективность концентрации ВБН на микро-фкльтрацконных мембранах показало, что потери вируса составляют менее £0*1. если БАЖ берется з работа через 90 дней,после отбора ее из куриных эмбрионоз^Табл.Б).

Исследования показали, что концентрация и очистка вируса -индуктора как на импортных, так и на отечественных микрофильтрационных мембранах, в тангенциальном потоке с диафиль-трацией, обеспечивает очистку вируса от овальбумина не менее чем в 1000 раз, от аллантоисных белков на 99,8 - 99,9 Х,а по-

Таблица 5

Влияние срока хранения ВАЖ на выход ЕБН при его концентрации и очистки на микрофильтрационных мембранах ПА - 0,2

I Сроки |хранения | ВАЖ 1 (ДНИ) 1 1 1 |Обьем | ВАЖ 1 00 I Исходная 1 ГАЕ /мл Очищенный | концентрат | ВБН | Фильтрат после концентрации и диафильтрации

Обьем (л) |ГАЕ/0,1мл ( 1 I 1 | Обьем ( (л) 1 1 ГАЕ/мл

1 ......... | 30 1 1 1 5,5 I 275 1(239-315) 0,130 1 1 I 275 | |(223-338) | 1 1 1 7,8 | 1 1 91 (74-138:

1 Г 45 I 1 ! 5,5 | 275 |(239-315) 0,130 1 1 1 479 | ¡(447-549) | 1 | 1 7,8 | 1 1 79 (49-120)

1 | 60 1 1 1 5,5 | 275 |(239-315)' 0,130 1 1 | 779 ! ¡(722-835) | 1 1 1 7,8 1 1 I 21 (13-34 :

1 \ 90 ! 1 5,5 ! 275 I (239-315) 0,130 1 1 1 958 1 ¡(779-1100)! 1 7,8 | 1 6 (4 - э ;

-приведены средние величины с нижними и верхними границами при доверительных интервалах Р-0,01.

тери вируса по ГАЕ составили не более 20% от исходного количества (табл.6).

Из отечественных мембран наиболее устойчивой , в процессе эксплуатации , была только мембрана.ПА -0,2, которая сохраняла свои исходные свойства после 10 операций по концентрации вируса.Повышенная устойчивость мембраны ПА-0,2 связана с тем, что в отличии от других испытанных отечественных мембран, эта мембрана имеет подложку, которая удерживает мембрану от сильной деформации во время работы и таким образом предох-

таблица б

Качественная характеристика очищенного концентрата вш. полпеп-ченного методом мембранного разделения на чикро 5>кльтлпиотшх ненбранах отечественного и инпортного производства

Тип мембраны Размер ПОР в МРИ Исходная &Х Очипегаай концентрат вируса

Объем (л) ГАЕ в 1 МП Содержание Объем (Л) ГАЕ в 0.1 т сояерхаяие

оваль-бумина МКГ/МЛ общего белка мг/кл оваль-бумина мкг/кп общего белка мг/кп

WPP о. 1 6 294 ; 256-та; 420t 520 1. 8+, 0 2 0. 14 1175 ! 953-1270! 0.40 + о. е? 4,1 + 0, 53

GVFF о. гг 6 294 (256-336) 420+ 120 l.T&i 0, 15 0, 14 1024 (891-1175) 0. 30i о, се 3, fit 0,41

HVPP G. 45 б 294 (256-338) 400+ 115 i. 9± 0. 28 0. 14 953 (779-1100) 0, 20t 0,05 3. 15t 0, 34~

па-о, г о. г 6 294 (256-338) 400' 115 2. lt. 0, 33 0. 14 1024 (891-1175) 0, 3t 0,06 3,73+ 0,44

»ш -кг _ 0.2 6 294 1 Р^-З'-в) 415s 106 1, 7 4- о! ! 9 С. ¡4 958 ' 77;J- i 100) 0.28 с 0, 07 3. 52+ 0, ¿2."

Ь'тттгуч— Г. Р л РОД 4пП+ 1. ft + 0. 14 958 0. 32+ 3,63+

, Ii-.: ELP

- использовали ВАЖ со срокон выдержки при +4 - + б с не менее 90 дней.

- приведены средние величины ГАЕ с нижними и зерхниии границами г.ри доверительных интервалах Р Э.с--:-.

- приведены средние величины количества овальбушша и общего бедка с доверительными интервалами при ?-0.01.

- 36 -

раняет ее от разрывов и необратимого забивания пор .

Концентрация и очистка ВЕН на микрофильтрационных мембранах стала возможной из-за того, что в ВАЖ при длительном сроке хранения, образуются как солевые конгломераты вирусов, так и труднораспадаемые комплексы солевой "сварки" мелких клеточных обломков с вирусом-интерфероногеном, которые не способны пройти через поры микрофильтрационных мембран за счет больших своих размеров, что обуславливает задержку ЕЕН на мембрана;-: не менее 60% от общего его количества.

Изучение интерфероногенных свойств концентрированного, очищенного вируса-кнтерфероногена на микрофильтрационных мембранах в тангенциальном потоке с диафильграцией не выявило отличии от неочищенного вируса-индуктора (табл. 7).

Таблица 7

Характеристика интерферона полученного с использованием аялантоисного и концентрированного,очищенного ВЕН

¡Используемый ВЕН | Противовирусная актив-| Содержание овальСу-

| для индукции | ность интерферона ] мина в интерфероне

| интерферона [ ! | ('Ц^/мгЛ 1 | (мкг/мл)

! 1 ! ВАЖ I 1 3555 ! 2,7-5,3

I ! 1 ! (£896-4390) | ' 1

1 1 ¡Концентрат получен | ! 3600 ! < 0,001

!микро-диафильтраци-1 (2939-4231) |

|онным методом | 1

-приведены средние величины с нижними и верхними границами активности ЧЛИ при доверительных интервалах Р=0,05.

Данный метод более экономичен при крупномасштабном производстве ЧЛИ. Микро-диафильтрационный метод концентрации и

очкетки вируса-индуктора внедрен в производство НПО "йкцуно:т-репарат". Б условиях производства разработанным методом однс-моментно описается 30 - 32 л. БАЯ в течение с - 7 час.

2.1.3. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО

3 СППР - д :.:хро, « 1971. т-оду хохот; ..^о;-«*-

иппптъг* »>пт» --- .и; хранагаль него применения и оно началось на Уфимском предприятии по производству бактерийных и вирусных препаратов при Уфимском НИИЕС ¡сл.И. И.Мечникова по Регламенту производства N 134-69. Технология производства ЧЛИ для интрэ-назального применения была разработана в НШЭМ им.Н.Ф.Гамалеи советскими учеными - В.Д.Соловьев., Т.А.Еектимиров., В.П.Кузнецов, Марченко В. И. и др. Эта технология долгие годы была базовой в дальнейшем на ее основе происходило совершенствование технологии производства интерферона.

Регламент производства ЧШ ст 1959 года за Я 134-59 предусматривал использование в производстве неочищенного вируса-индуктора- БЕН и лейкоцитарной массы,где примесь эритроцитов на один лейкоцит была з предела" 1:1€€-1:250. Весь процесс индукции и биосинтеза интерферона проводился стационарно - з матрацах (Рис.2 ).

ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА В ЕИСРЕАКТОРЕ.

Рис.2.Стационарный метод получения интерферона.

- 40 -

Противовирусная активность интерферона,выпускаемого по Регламенту производства N134-69 должна быть ке ниже 32 ед/мл. Безусловно, это был, практически, лабораторный регламент.

Нами, с первого года выпуска препарата и в последующие годы, в условиях производства3 совместно с сотрудниками отделения по производству интерферона совершенствовалась технология производства ЧЛй для интраназавьного применения. За этот период нами были решены задачи по увеличению выхода лейкомас-сы при получении ее из донорской крови, вируесодержащэй жидкости с куриного эмбриона, были разработаны и Енедрены конструкции роллеркых установок одинарного и карусельного типа, разработана технология получения интерферона при ролдерном способе культивирования лейкоцитов (Изменение N 55/1 к Регламенту производства N 134-69), разработана конструкция фильтра

Рис.3.Роллерный метод получения интерферона

для очистки вируса-индуктора от клеточного дебриса (A.c. N 854980) и его модификация, разработан к внедрен интенсивный режим лкофильного высушивания интерферона,разработан и внедрен способ наполнения ампул е интерфероном - азотом и их запайка на автоматах, взамен ручной запайки ампул под вакуумом (Изменение N 92/2 к Регламенту производства N134 -S9 ). Далее нами были проведены исследования по получению интерферона на цельной донорской крови с использованием БШ,полученного на переживающей ткани куриного эмбриона ( A.c. N 636834., A.c.

м 5575га).

Бее зги разработки позволили значительно снизить долю ручного труда.повысить производительность, увеличить выход интерферона, снизить его себестоимость и увеличить выпуск препарата с 50 оксяч ампул в год в 19'-*1году до 5 млн. ампул £ год 5 1981 году.

В 1982 году утвепжяайтг,я дрспов^лихдА цоттю^г..

ткого ^л игхракггзльясго пркмене-

кил N 502-82, где предусматривается получение интерферона ка чистых лейкоцитах (регламент разработан в НИМЗМ им. Н. <5. Гамалеи -Кузнецовы».! Б.П. с соавторами.) с проведением стадии праймин-га, индукции и биосинтеза в матрацах (Бис. 2) или колбах (Рис. 4).

лучения интерферона

Р Регламенте лрог.еводстза И 2C2-6Z используется неочищенный ВЕН и полученный интерферон не оч:гда&тся. Этот регламент такие близок к лабораторному. Противовирусная активность ЧЛй для интрзназального пршенения и по этому регламенту должна быть не ниже 32 ед/мл.

Нами совместно со специалиста}.® отделения по производству интерферона был внесен ряд изменений в технологию производства интерферона и по этому регламенту - разработка спо-

соба получения интерферона с использованием чистых лейкоцитов на роллерных установках, разработка способа получения чистых лейкоцитов, изучена возможность замены гепарина на всех стадиях получения интерферона на цитрат натрия и внедрение его в производство (Изменение N 2 к Регламенту производства интерферона N 332-82 ).

Однако, несмотря на все эти новшества, специалисты предприятий, выпускающих ютерферон в больших объемах, видели недостатки самой технологии действующих Регламентов И 134-Б9 и N 302-82 - многоэтапность стадии биосинтеза интерферона, низкая производительность, не экономичность, много ручного труда, больше колебания в продукции интерферона лейкоцитами.

Хотя и внедрение роллерных установок и технологии получения интерферона в бутылях позволило производить его в большом количестве, однако получение интерферона с высокой противовирусной активностью таким способом не дает стабильных результатов. Это связано с тем ,что в условиях термальной комнаты весьма трудно получить быструю смену температуры суспензии е бутылях и мы на производстве часто сталкивались с таки-. ми неприятностями, когда при получении интерферона одновременно. например, в 10 бутылях в одной термальной комнате получали интерферон с различной активностью - 64';ед/млг 32-ёдА-

Б начале 90-х годов требования, к качеству ЧЛИ для интра-назального применения повышаются.'По ФС. 42-247ВС-91 препарат должен выпускаться с противовирусной активностью не ниже 1000 МЕ в ампуле, не должен содержать НВз-Ае, а содержание оваль-бумина должно быть не более 50нг/мл.

С учетом новых требований к качеству препарата стало проблематично получать все серии ЧМ для интраназального применения по Регламенту производства N 302-82 и изменениям к нему в полном соответствии с требованиями ФС 42-247ВС-91.

Кроме этого, крайне была необходима единая технология получения интерферона для различных его лекарственных форм.

Нужна была новая технология получения высокоактивного ин-

терферсна. технология которая позволяла бы поа^гчать интерферон одномоментно в болгших объемах, с ведением процесса пел контролем компьютера и автшатиеирсванкьк приборов, что по?-волило бы снять многие технологические трудности при гголучё-нии его в условиях производства.

При разработке способа получения интерферона в биореакторе нами были использованы пс82трг>*в»?:ж?~ . -;о

5 ¿¿^цмуютт :5рОИЗЗОЛС-ТВа Ч9Л0Б8-

чес-ксго лейкоцитарного интерферона N134-69,N332-82 и авторских свидетельствах на изобретение.

Регламентом производства ЧЛй N302-82 не предусмотрено получение интерферона одномоментно в большом объеме из-гэа отсутствия технического и технологического решения культивирования суспензии лейкоцитов в объеме 50 - '30 л. Для 'решения этой задачи нужно было разработать новый принцип Перемешивания , который не травмирует лейкоциты и способствует максимальной продукции интерферона кяэткамп-продуцентами.

Нами совместно со специалиста)® цеха интерферона и Уфимским зэизаисаяым институтом рзгработанк конструктивные элементы бпсоеактера, которые обеспечивают:

- перемешивание оуспенгки лейкоцитов больших сбъемсз;

- проведение паровой стерилизации биореактпрэ:

- с помоле ловушек влаги надежную работу вовдутных фильтров; - - - -

- подачу и отбор растворов в биореактор;

- управление с помогаю компьютера раеработанными температурными параметрами реяимз ступенчатого прайминга. стадии индукции п биосинтеза интерферона.

5 основе переыезовванпл был полежек принцип подге.мз части суопенгии в верхнюю накопителькук емкость -с помощью сжатого вовдуха с .последующим сбросом избыточного давления и отеканием суспензии в основную емкость. При таком перемешивании клетки - продуценты постоянно находятся во взвешенном состоянии ( рис. 5, 5а ).

На основе конструктивных элементов выше описанного биорэ-

актора,совместно со специалистами цеха интерферона предприятия НПО йммунопрепарат,была предложена конструкция перемешивающего устройства для получения интерферона е биореакторе с круговым принципом перемешивания клеток-продуцентов, (рис. 6, 6а ).

Рис.6.Биореактор для получения интерферона на производстве .

Рис.5а.Биореактор в разреза с вертикальным принципом перемешивания суспензии лейкоцитов.

Рис.6а. Биореактор в разрезе с круговым принципом перемешивания суспензии лейкоцитов.

Конструктивные элементы биореактора и принцип перемешивания защищены авторским свидетельством на изобретение >¡1459229.

Все исследования проводили на биореакторе объемом 60 л.

. Объем опытных серий был г пределах 10-20 л. В предварительных исследованиях по изучению возможности получения ЧЛИ в биореакторе использовал:! параметры индукции и биосинтеза интерферона Регламента производства нативного человеческого лейкоцитарного интерферона й 134-99.

Е качестзе клеток-продуцентов использовались чистые лейкоциты, выделенные из донорской крови п ттписщь.« тр:";:: Г

Изучение жизнеспособности лейкоцитов в условиях 24-х часового культивирования их в биореакторе позволило выявить оптимальный временной режим между подъемами суспензии лейкоцитов, который находился в диапазоне 3-5 мин. В дальнейшем все опыты по получению интерферона в биореакторе проводили в 4-х минутном интервальном режиме.

Исследования показали возможность получения ЧЛК е биореакторе по Регламенту производства N 134-69.

При отработке оптимального режима получения ЧЛИ по Регламенту производства .4 134-69, в биореакторе с использованием суспензий чистых лейкоплтов было выявлено ряд новых показателей. Оптимальное количество лейкоцитов на стадии биосинтеза интерферона должно Сыть не менее 1.5 ш. е 1 мл культурэль-нсй среды, а на стадии индукции интерферона нагрузка, вируса-индуктора на одйн лейкоцит з пределах Ю-ЗС ГШД-'Би. Концентрация гепарина г предела:-; 3-5 ед./мл. Максимальный объем суспензии чистых лейкоцитов в биореакторе не должен превышать 50 % его объема.

Полученный ЧЛИ по Регламент;.' производства N 134-69 в био-резкторе имел противовирусную активность в пределах 1350 (1175- 1560) М5/мл к соответствовал всем требованиям, предъявляемым к ЧЯИ для интранавзльнсго применения.

С целью снижения содержания балластных веществ в нативнсм интерфероне и экономических затрат в производстве, нами была изучена возможность замены в технологическом процессе' гепарина, антибиотиков, плазмы человека на более простые и безвредные компоненты. Исследованиями установлено ,что такая замена

возможна и она не влияет на биосинтез интерферона лейкоцитами (табл. 8),при этом существенно улучшаются качественные пока-

Таблица 8

Влияние замены ряда компонентов питательной среды на продукцию интерферона лейкоцитами в биореакторе

| Состав среда для культивирсвания лейкецшсе | то Регламенту произвсдаяа N 134-69 1 Предлагаемый оостев среды для ютьтизфсвгни ЛЕЙКОЦИТОВ

1 | Наименование имгиеягов | Количвсп» в 1 № Наименование контактов Кояичесга

1 ......... ¡1. Среда 199 по расчету 1. Среда 199 по расчет?

¡2. Гепарин 1 10 ед./ип 2. Друхэзмечвнный цигрэт натрия 0.2 - 0.2

¡3. Плазма или сыворсяка чзлзвека 5 - 10 I 3. Распар альбумма (дзюрский) 0,1 - 0,3

¡4. Стрепгоицин чжрольциевый \ моихпгкс 1 50 ед. /мл 4. Перекись всизюда 0.05 - о.г

1 |5. Вешилпвнициллин натриевая | сош, 1 100 ед./мп

(Противовирусная активность тошгиеюго интерферона | 1350 (1560-1175) Р=0,0б Противовирусная гкговнэсхь лвдучаемисо интерфе 1350 (1560-1275) Р=0,05

затели нативного интерферона, что значительно облегчает проведение процесса его очистки.

Кроме того, установлено, что использование упрощенной среды 199 (среда 199 разведенная раствором Хэнкса в соотноге-нии 1: 0.5 или 1 : 1) не влияет на продукцию интерферона в биореакторе.

Весьма большой интерес для производства представляет

проблеме упрощения технологии яроигзсдетвз человеческого лейкоцитарного интерферона. С этой целью была изучена возможность получения интерферона без удаления вируса-индуктора.

Исследования показали, что непрерываемый переход стадии индукции в стадию 5косизтееа, бее удаления вируса-индуктора, не отражается на продукции интерферона чистыми лейкоцитами. Однако, исследования покаяя/ги от "родугххх: лай-

ири способе с. о ямелз опре-

деленную зависимость.

Таблица 9

Влияние соотношения вирус/лейкоцит и конечной концентрации лейкоцитов на выход интерферона в условиях биореактора

1 Соотношение : í Концентрация | Противовирусная

• вирус/лейкоцит | лейкоцитоз з ¡ активность интер-

ГАЕ'ет i í мл ! ферона (ME/мл';

i стадия индукции ! стадия биосинтеза ;

Í1 . 1 С 00 ООО i 2 ООО ООО i 991 ^779rl024;

12 / 1 G00 000 ! г ооо ооо ! 1790 ;i5™0-?045:

1 ' 1 000 ООО ; £ ООО ООи | I ! 17 SO -(1670-1910)

14 / 1 ООО ООО i 2 ООО ООО Í 1780 (1670-2046;

! гг i . 1 ООО ООО : г ООО ООО | i ¡ 1850 í1270-1450)

je ! 1 ООО ООО ! 2 ООО ООО | 1 Í ! i 682 (512-779)

-в таблице приведены средние величины с нижними и верхними границами при доверительных интервалах Р=0,05.

Показано , что нагрузка вируса на лейкоцит должна быть в пределах 5-20 ЦПД/50. Уменьшение индуцирующей доаы от 1 ЩЩ/50 и ниже или увеличение дозы вируса от 30 ЦПД/50 и выше на лейкоцит приводит к снижению продукции интерферона лейкоцитами. Такую же закономерность наблюдали при использовании очищенного, концентрированного вируса-индуктора. Оптимальная индуцирующая доза, при использовании очищенного концентрата ВБН была в пределах 2-4 тысячи ГАЕ на 1 млрд. лейкоцитов, а при увеличении дозы более 6 тысяч ГАЕ или менее 2 тысяч на 1 млрд, лейкоцитов отмечали уменьшение продукции интерферона лейкоцитами (табл'. 9).

Противовирусная активность интерферона, полученного без удаления вируса-индуктора (одностадийная технология биосинтеза интерферона) была в пределах 1910(1780-2048)ЬЕ/мл(табл.10).

Таблица 10

Характеристика интерферона полученного с использованием различных способов индукции

1 Способ получения|Используемый | Противовирусная | Содержанке

| интерферона ! ВБК | активность ин- ( ональбумина

| | ! терферона ¡' в интерфероне

| г | (МЕ/мл) ! (мкг/мл)

! • 1 " ■ 1 |Двухстадийный* | 1 ВАШ 1270 " ' ' ..... ! " (1100-1450)| 1.3 ± 0. .42

■ 1 |Двухстаднйный | 1 1 ( Концентрат ( 1 1270 ! (1175-1350)1 < 0,001

! ( I Одностадийный** 1 1 ; ! Концентрат | 1 1910 < (1780-2048)1 1 0.003 ± о.оос

! 1 I Одностадийный***) ! 1 ! Концентрат | 1 1780 ! (1670-1910)! 1 0.2 ± 0. .06

- приведены средние величины с нижними и.верхними границами активности интерферона при доверительных интервалах Р»0,05.

- 49 -

- приведены средние величины содержания свальбумнна с доверительными интервалами при ?=0,01.

* - общепринятый метод с центрифугированием после индукции;

-** - разработанный одностадийный метод получения интерферона без удаления вируса-индуктора, полученного микро-диа-фильтр ацконным метод ом

■ - т? пг.дукт-прз ""торферсн^гне^а иипсльзозали

ВБК счищенный и концентрированный ка мембранах с порогом отсечения 300 кО. (Хафизова Л,Г., Еобкоза 3.2.1993),

Таким образом, показана возможность получения интерферона в биореакторе по упрощенной технологии, за счет объединения стадии индукции и биосинтеза в один процесс. Одностадийный способ получения интерферона более предпочтителен для производства, так как он более прост в исполнении, приводит к сокращению материальных и трудовых затрат, к экономии рабочего времени.

Нами также было изучено направление по поиску путей увеличение продукции интерферона лейкоцитами за счет повышения интерферсногенных свойств вируса-индуктора. 0 этой целью нами были изучены интерферонсгенные свойства ВБЕ в зависимости от дозы заражения а зллзнтоисную полость ктриного эмбриона, Исследования показали, что заражение куриных эмбрионов ВВН в дозе 5 млн. ШШ/50 и более обеспечивает получение вируса-индуктора с высокой индуцирующей способностью. Такой вирус в 3-3,5 раза аффективнее' по пкдунируюцей способности по сравнению с БЕН, полученным по Регламенту производства % 302-82, где доза заражения куриного эмбриона составляет £-10' - 2" 10" ЦГЩ/БО'.

При получении интерферона в условиях биореактора с использованием вируса-индуктора,полученного по разработанному нами способу, биологическая активность интерферона составила 4705 (3566-6208) МЕ/мл при концентрации лейкоцитов на стадии биосинтеза Змлн/мл, При этих же условиях получения интерферона, но о. использованием ВЕН, полученного по Регламенту прсиз-

водства N302-82 биологическая активность интерферона составила 1270(1170-1450)МЕ/мл. На способ получения вируса-индуктора интерферона подано заявление на выдачу патента Российской Федерации N 940011080 от 12 января 1994г. Л

В дальнейших исследованиях был проведен поиск путей увеличения продукции интерферона лейкоцитами за счет повышения их концентрации на стадии биосинтеза, а также поиск эффективных путей стимуляции интерферонообрззования в условиях биореактора.

На этом этапе исследования использовались чистые лейкоциты, выделенные с помощью трилон Е+ВМЦ-100, очищенный концентрат ВБН. Среда для культивирования содержала альбумин донорский, двухзамещенный цитрат натрия, антибиотики. Температурный режим в биореакторе поддерживался с помощью компьютера, согласно ваданной программе, а все опыты проводили без удаления вируса-индуктора иэ культурам ной среды.

Экспериментально установили, что максимальная продукция интерферона, в условиях биореактора, отмечалась при концентрации чистых лейкоцитов на стадии биосинтеза интерферона в пределах 4 -5 млн/мл культуральной среды (табл. 11).

В исследованиях по Поиску путей стимуляции образования интерферона в условиях биореактора, использовали концентрацию лейкоцитов в культуральной среде в.пределах 4-5 млн /мл.

Для стимуляции продукции интерферона в условиях биореактора был испытан метод прайминга по Регламенту производства человеческого лейкоцитарного интерферона М 302-82. Основная идея прайминга заключалась в культивировании лейкоцитов,перед стадией индукции интерферона, в культуральной среде, содержащей плазму человека, инсулин и человеческий лейкоцитарный интерферон, не менее двух часов при + 37.5°С.

Первые же опыты показали,. что воспроизведение режима праймиравания лейкоцитов, описанного в Регламенте производства N 302-82, в условиях биореактора не приводит к увеличению продукции интерферона лейкоцитами. Противовирусная активность интерферона, полученного в Биореакторе с использованием драй-

- - 51 -

минга п без праймингз была в пределах 3566 (2896-4095) МЕ/мл.

Таблица 11

Влияние различных концентраций чистых лейкоцитов в кгматурэльюи/

среде на продукт® интерферона г биореакторе

(Количество ! Доза ин- (Темпапя- ¡>«>-£»< ¡Гро^лзовиг.от-

дукс^м^ »тур?»-'* ; опытней! пая активность

1коцптоз в | в ГАЕ на |режим Iтехноло- |серии |интерферона

| куль тур зль| 1 млрд. |в биоре- (гического! (л) | (МЕ/мл)

¡ной среде | лейкоци- ¡акторе ¡процесса 1 |

1(млн/мл) ! тов I(+°С) ! (чае) | |

л б - 2 ЗОСС- ! З'7 ,-, о , — . х. ! 20 : 15

; : ;1100-1450^

о 5 - 2.5 3000 ! ОГ5 + 0,2! 20 ' 15 : 1780

1 : (1670-13Ю)

4 _ 5 3000 I 37 ± 0.21 VI" I 15 < ЗЕ66

1 | (2396-4290!

П _ ~7 3000 у'У 20 : 15 ! 3555

! ! ! '.£¿96-4096,/

- з таблице приведены средние величины с нижними и верхними границами активности интерферона при доверительных нн-тервалах 5=0,05.

5се дальнейшие попытки .модификации- стадии праймпнга ее счет увеличения пли уменьшения дегы интерферона. повышение температуры культуральной среды до + 3б°0 на стадии ерзкмин-га, увеличение времени праймирования до 5 ч. не способствовало увеличению продукции интерферона.

Проблему стимуляции кнтерфероносбразозания в условиях бкореактора удалось решить за счет разработки и использования двухэтапного праймкнга, включающего в себя ка первом этапе

праймировакие чистых лейкоцитов во временном ступенчатом подъеме температуры в биореакторе с +25°С до +35.8иС в течении 3 - 5-ти ч. с последующим на втором этапе лраймированием чистых лейкоцитов в диапазоне 36-36.5°С в течение 2-4- х ч. и далее ведением процесса по одностадийной технологии получения интерферона при + 36.8 ± ОЛ°С. Использование двухэтапно-го прайминга в условиях биореактора способствовало накоплению

Температура, +°С 40|- стадия прайминга стадия \ - индукции

стадия биосинтеза

30|-

25!-

351-

I-

1-й этап прайминга

11-и этап прайминга

стадия /

индукции

бИОСИНТбс

-1-,-!-,-.-

1-2 3 4 5

Рис. 7. Схема прайминга при различных способах получения

интерферона Обозначения:

- прайминг по регламенту производства N 303-82.

Оптимальная температура в культуральной среде +37.5°0

Вре] в ч<

.....1-й втап прайминга в диапазоне температур -25 - -S5,oJ|?;

при излучении интерферона в биореакторе

- - -П-f» этап прайминга в диапазоне температур *25-+3ô.5сС.

ЧШ в культурадьной среде с противовирусной активность*. 132С-7 (12417 - 14253; МЕ/мл.

йсоледоваяи« пок-??"--, -.¿¿w •»"««учет!:::; а

1',wr„4oaffr.^i?> -ц среды по скончании стадии био-

синтеза была в пределах 6.9 - 7.1 при исходном значении рН - 7.4 - 7.5.

Эксперта«ентально установили , что минимальная доза интерферона для прайминга должна быть не ниже 1300 ME на 100 млн. лейкоцитов. При использовании десяти минимальных доз интерферона для прайминга не было установлено ни угнетения, ни дальнейшего усиления продукции интерферона лейкоцитами.

Основные отличия дзухзталнсто прайминга от прайминга предусмотренного з Регламенте производства N Ю2-32,отражены на рис.7.

Процесс получения интерферона в биореакторе с использованием двухэтапнсго прайминга и бег удаления вируса-индуктора проводится под управлением компьютера, в автоматическом режиме по разработанной температурной прогрз««. Разработанная нами технология более проста в исполнении ^рис.З) по сравнение с технологией по Регламенту производства ЧЛИ N302-92.

i ! I-! I-! !

I стадия I | стадия i | стадия i ! стадия А. : прайминга i — ; индукции:—! удаления ;—1 биосинтеза '---—1 1-- i индуктосэ i L---

! двухэтапный ! ! В. | прайминг !—| стадия индукции и биосинтеза

Рис. 8.

А - стадии технологического процесса получения интерферо-

- 54 -

на по Регламенту производства N 202-82;

Е - стадии технологического процесса получения интерферона в биореакторе.

Разработанная технология получения интерферона в биореакторе более екеномичная и менее трудоемкая при крупномасштабном производстве по сравнению с технологией по Регламенту производства ЧШ N 302-82, где процесс получения интерферона псоеодят в матрацах, бутылях, колбах. Полученный в биореакторе ЧЛИ имеет противовирусную активность в пределах 13307 (12417-14253) МЕ/мл,а содержание овадьбумина находилось в диапазоне 2-5 нг/мл, что в 10-25 раз ниже допустимого уровня содержания этого белка в препаратах человеческого лейкоцитарного интерферона (ФС 42 - 247 ВС - 91).

На способ получения интерферона в бнореакторе подано заявление на выдачу патента Российской Федерации га N93057634.

Разработанная конструкция биореактора и способ получения интерферона в биореакторе внедрены на предприятии НПО "Имму-нопрепарат". Конструкция биореактора разработана на уровне изобретения - А.с.К 1459229.

2.1.4. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ОЧИСТКИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА ОТ ВИРУСА-ИНДУКТОРА И ДРУГИХ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПРИМЕСЕЙ.

Регламентом производства ЧЖ £02-82 не предусмотрена очистка нативного интерферона- от вируса-индуктора и других возможных инфекционных агентов, источником которых может служить кровь доноров, используемая в качестве сырья для получении интерферона. Вместо очистки предусмотрена стадия кислотной инактивации гируса-индуктора и других возможных инфекционных агентов. Однако, в связи с открытием возбудителя СПИДа и других лимфотропных вирусов, источником которых может служить кровь доноров, остро встал вопрос о разработке и внедрении в производство дополнительных методов очистки пли инактивации возможных вирусов-контаминантов.

Известен ряд физико-химических приемов, позволяющих инак-

- 55 -

тивировать возбудителей гепатита:

- обработка формалином (1 : 500> при ~Э7°С. в течении 4 дней (Scheiernann M et. al., 1284

- неконным детергентом и эфирси (Nar. J, 1985)-,

- пепсином и тзином-80 (Разов С. с еоавт., 15S5;:

- 1 X водным раствором глютарозого альдегида при +24°п а течение 5 и 'Kacor/x-^I К1»н->уо*<«1 ?т "1-, 13С4*<:

- "porpeiwr^e при Ю-80 а течение 5-20 ч. (ГаЬсг Е., et al-, 1984);

- последовательная обработка пепсином, 8 M мочевиной и формалином в разведении 1 : 4000 (Kew .M. 1984).

Предложен также ряд хроматографических методов, позволяющих фракционировать HBs-Ag на сефарозе-4В (Einarssop. M. et al.,1984), аффинном сорбенте антител Ole; из плазмы и сефзроаы iJasitt Y. et el. , 1ЭБ5).

Необходимо отметить, что при получении препаратов лейкоцитарного интерферона перечисленные способы инактивации и удаления контзьжнируюшх вирусов не могут быть применены либо в силу своей нетехнологичностк, либо возможности инактпвзппк самого интерферона ГФ.И.дрлоб, 19?2),

Производительность методов удаления инфекционных частиц с помогаю гельфильтрации, аффинной хроматографии и центрифуги-со'вания весьма незначительно!, з процедура очистки боньцих осгемов интерферона занимает длительный промежуток времени.

В связи с вышеизложенным надо признать, что наиболее технологична кислотная инактивашя вирусов в нативнем интерфероне - ори рН 2,5 - 4 з течение 15 - 20 дней, которая предусмотрена Регламентом производства интерферона. Для большей безопасности и чистоты препарата необходимо ввести в технологию производства интерферона стадию очистки его от виру-сов-контаминантов и других высокомолекулярных примесей.Эта процедура должна проводится перед стадией кислотной инактивации.

При разработке метода очистки интерферона мы исходили из того, что метод должен быть простым, технологичным,, высоко-

производительным, позволяющим сохранить набор белков а диапазоне до 100000 дальтон по молекулярной массе и без потерь противоЕируснок активности препарата.

С учетом этого, при разработке способа очистки наивного интерферона от высокомолекулярных примесей использовали метод ультрафильтрации на плоскокамерных разделительных аппаратах.

Е работе использовали мембраны РТНК, РТМК ("Миллипор" США), полисульфонамидные мембраны производства НПО "Пластмассы", опытные образцы лавсановых, полипропиленовых, полисуль-фовамидных и фенилоновых мембран с различным диаметром пор производства БНИИСС г. Владимир. После окончания стадии биосинтеза и отделения клеток-продуцентов интерферон брали в работу .Очистку проводили в тангенциальном потоке при давлении 0,03 -0,04 Мпа.Подкисленный и неподкисленный интерферон подавали на ультрафильтрационную установку и рециркулировали его до полной фильтрации.Очизценный интерферон подвергали стерилизующей фильтрации и исследовали на бактериологическую и вирусологическую стерильность, противовирусную активность и проводили аналитическую гельхроматографию на сефарозе - 6В.

Из данных таблицы 12 видно, что на выход интерферона влияли условия при которых проводили очистку, размер пор мембран и материал из которого они были изготовлены.

Исследования пока,вали отсутствие снижения противовирусной активности интерферона после очистки его на мембранах РТМК и УШ-300 при снижении концентрации общего белка более чем в 2 раза только в том случае, если перед очисткой интерферона рН его доводили до 2,2-2,4. Кзтивкый интерферон , пропущенный через эти мембраны, был вирусологически стерилен, тогда гак в исходном материале вирус определялся (табл. 12).

Из хроматограммы интерферона видно, что высокомолекулярная фракция с молекулярной массой выше 300 кВ содержавшаяся в исходном материале, после его очистки удалялась (рис.~9).

Табша I 12

шод immwa m его сдал ишси птттш ш ршиш nui шша

m ыкпи üóper PB Птрв птемеива К/и Шешонаа Tin

IM ttisiai ттш nrotmu та l-BI/SO/U

m во ерш laciiü ÏOCK MICTKi

MJ

MICTH iCIOUHl IKK 0ИС7П

I 15t fMÜMIUH !» :. г fi i 5 2 (1132-91101 2018 11350-3327) V 2 I 10 0

г. г J192 тзг-9110) 3821 12895-5012) 2 I 10 0

1 12 юса IM т. г >192 (7132-9410) 31И (2353-38221 2 I 10 0

г. г 1192 (7132-9110) 9390 (3505-5793) 2 i 10 0

m-loo nncmttt-шд 103 Т. 2 8192 (7132-9110) 3Î21 (2896-5012) 2 t 10 0

2,2 8192 17132-9110) 1705 (3565-6208) 2 I 10 0

ЮН 30 КЮШШ 130 т. г 8192 17132-9410) 1550 (1021-2352) 2 i 10 0

2.2 8192 17132-9110) 3566 (3101-4390) 2 1 10 0

га-зоо ШНШ1' au 300 Т. 2 8192 !71зг-;ш 4390 (3822-5043) 2 I 10 о

г. г 8192 17132-9110) 7613 (6654-1780) 2 i ¡0 1)

ГШ lomtotm-Hl 100 7.2 8192 ШЗИИО) 4096 154М-54М) г i lo 0

г. г 8192 (7132-9110) 4390 (3327-540î) 2 i 10 0 •

от КЛСШКЭ 300 1.2 8192 (7132-9110) 4390 (3566-5793) 2 I 10 0

2.2 8192 17132-91101 7643 (7132-1192) 2 i 10 0

-1 titan imems сите вешив с шпп i вшпп грш-un шпмсп rotptepm nu «кттвд nnnaui Р-0.05.

Рис. 9.Хроматография интерферона к& Оефарозв - 6В. А - исходный полуфабрикат интерферона. Б - полуфабрикат интерферона после ультрафильтрации на мембране с порогом отсечения по молекулярной массе 300 КО. .

I - частицы с молекулярной массой более 1ООО кО, элю-ируются е свободном объеме колонки.

II - частицы с молекулярной массой менее 100 кО, элюируются во внутреннем объеме колонки.

Для доказательства того, что мембраны РТМК и УШ-000 задерживает вирусные частицы, провели модельные опыты. На уль-трафильтрашюнкых установках, с кассетами этих мембран осуществляли ультрафильтрашзс среды 159 содержащей ВБН в дозе 1С? ЦОД-50 мл, а также раствора плазмы, содержащей НВз-Аг.

Полученные фильтсатм пр^гсргнь. ¿л чвдичит пнфсКцион«нх чч^ттг; в тесте стерильности для ББН и для

НВз-Ае в иммуноферментном анализе. Опыты показали, что после ультрафильтрации БЕК и НВз-.% в фильтратах отсутствовали (табл. 13).

Таблица "13

Ультрафильтрация растворов содержащих Е5Н и НВз-Ае1 на мембранах РТМК и 513.'-300

!Ткя ! Исследуемый ' ЗЕН-инфекционная ; НЕз-А^-йФА (?ди-;мембраны.; материал ! зктивнсс-ть з ■ ниц оптической ; 1 : 1 мл раствора ! плотности)

Исходный } Очишенный

! ! • ! ! ?7МК 1 В"ЕН ! : ю5 цпд.-во I дпд - нет

! ! ! 1 ЯЕз-Ае ! 1.00 о.П. 1 | 0.090 ! о.п.

! 1 ! ут<~зо~ ! 1 I ЕЕН ! 1 10б ЩД. 50 1 ! ! ППД -1 нет

1 ! НЕэ-Ае : 1.00 о.п. I 0.085 с. п.

- при учете результатов реакции в ИФА, оптическая плотность (0П) отрицательного контроля составляла 0.100, следовательно положительным считается образец ОП которого более 0.200.

- ЦПД определяли на фибробластах куриного эмбриона.

- 60 -

Таким образом, ультрафильтрация интерферона при рН 2,£ -2,4 с последующем проведением стадии кислотной инактивации способствует повышению качества интерферона и его безопасности в медицинской практике.

Необходимо отметить, что в работе Бобковой Е. В. с со-автр. (1993 ) было показано, что интерферон после ультрафильтрации в своем составе наряду с противовирусной активностью содержит и комплекс биологически активных белков- МИФ, МАФ антибактериальный фактор. Это свидетельствует о том , что разработанная нами промышленная технология получения очищенного интерферона обеспечивает в препарате сохранение белков с медизторкой активностью.

Способ очистки интерферона внедрен в производство ЧЛИ.

Разработанная технология получения интерферона в биореакторе и метод счистки его от контаминирующих примесей позволяют получать интерферон , который может использоваться для приготовления различных его лекарственных ферм - интерферон в свечах, маэезая форма интерферона, интерферон в таблетках,интерферон для инъекций.

2.2.4. ХАРАКТЕРИСТИКА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА , ПОЛУЧЕННОГО ПО РАЗЛИЧНЫМ ПРОИЗВОДСТВЕННЫМ ТЕХНОЛОГИЯМ

Были проведено сравнительное изучение 20 коммерческих серии ЧЛН выпущенных в.1989 году предприятием НПО йммунопрепа-рат по Регламенту производства ЧЛИ Н 502-82 и 20 коммерческих серий ЧЛИ, выпущенных этим же. предприятием, в 1993 г. по Регламенту производства ЧЛИ N 281-90.

Исследования показали , что коммерческие серии интерферона , полученные по Регламенту производства ЧЛИ Н 231-90 содержит в 10,5 раза меньше общего белка (табл.14 ) и в 10 раз меньше овальбумина. Противовирусная активность во всех изученных сериях находилась е пределах 1200 - 1500 МЕ в ампуле.

Проведенные исследования по определению зритроцитарных изоантигенов групповой совместимости в коммерческих сериях интерферона, полученных по различным технологиям, показало (табл.14) наличие их в препаратах, полученных по Регламенту

прспевсдехва N302-82 в 40%, а в 50% определялись следовые количества антигена и в 102 их обнаружено не было.

В коммерческих сериях интерферона,полученных пс Регламенту производства N£81-90, не было обнаружено зритроцитарных игознтигенов в 65*, а в обнаружены следовые количества.

Наличие ¿лип <; -т«=>—

;,1ь НЬа-г»* ""с:: ^¿^-доввнных сортах не обнаружено.

Б ряде коммерческих серий. ЧЛИ ( в 4 из 20 серий ), полученных по Регламенту производства N 231-90, нами было обнаружено наличие лимфоцитотоксического фактора.

Таблица 14

Сравнительная характеристика препаратов интерферона, полученных по различным технологиям

Препарат { Содержание в 1 мл препарата

интерферона |---

'коммерче- ¡Общего ; Оваль- |НВз-Ао-' Иаовнтигены с-кие серии-' I белка {бумага I ; лейксцитар-! зритроци-! (мг!1 : гн?; ; : ные ! тарные

Получен по ......-:

Регламент" с 4"= 34-1.?,? нет нет есть в 4'ГЛ;

прапазодства 1 С/ следы в 50%!

N302-82 нет в 1С"-: [

Получен пс

Регламенту 0, 53= 3±0,83 нет нет следы з 35%;

производства 0 05? нет а 65л *

н£51-5й !

- в таблице приведены значения средних величин с доверительными интервалами при Р»0,01.

- было изучено по 20 коммерческих серий ЧЛИ.

Для сопоставительного анализа препаратов интерферона, полученных по Регламенту производства ЧЛЙ N 202-8,2 и Регламенту

РЕйК ¡ш. .:

РЕЙК КОМ I ТОР 1 РЕГЕНТ ЮМ 7.01 ЗШнТЮН ЙРЕЙ

МОМГТОк 1 М0Г(1 ТОР 2

110.5 25.67 113.0 0.0 3.5

2 3 4 5 I

ГОР 1 гор 12. 1 'ОР I "ОР 1 ГОР I 'ОР 1

м 35 15. Л 15. й 2 * . ^ ; 25 . ми

- - 94 . £6 2 . с - 1. 2@ : 1 . 38 П1.

39. ¿5 92. 3 3 0 0. 53 13. 13 ■"• 33. 31 . 33

¡г! £6 24. зз 6, 04 . — 10. 6 . =л %ЙЙ

23 . 8 75 . 5 18 . 0 1 с 'Л *. с 5.8 •-.Р'З

а . В £ . в й . 0 О . 0 *; - л . £ 0.5

0 .5 0 а £ 3 .0 : 2 сг 3 о

Рис. Ю. хроматография ЧЛй, полученного по Регламенту производства н 302 - 62.

343 1-го

'. О 2

х

xi

РЕЙК НО. 3

РЕЙК НОГИ ТОР 1

РЕГЕНТ ЮН 12. 43 М1.

БиРЙТЮН 1. 53 И1.

йРЕй 61. 09

53. 3€ ;:йй

ИОН I ТОР 1 ?! .5

М0Н1Т0Р 2 б .в

-ЕМЕИНЕ 2 . с-

РЕЙК N0.

РЕЙК кон:ток

РЕТЕНТЮМ 13,

вирйтю.ч

йкЕй 24.

мот ток 1

МОИ ПОР 2 ВЙЗЕ1-1НЕ

4

1

31

Ж Г -С 3 о о сг т

о о

х

:г. ю 33 о ы 14 о ■

'Л,- 3

3. 70 21.0 0.5 -3.0

КО Пи

РЕЙК НО. рейс поп:: РЕГЕНТ ВиРнТЮ,-йкЕй

МО» ПО? 1

ЯОГИТОР 2

ЕйЗЕоГ^

0Р 1

20. 15 1.15 12. ;3 11. - э

1-.5

рис. 11. Хроматография чли. полученного по регламенту про-^

По по

.';нн

изводства н 2в1 - 90.

_ ко _

производства ЧЛИ 281-S0 нами была использована таете рас-деяительнзя хроматография на установке FFLC фирмы фармацл? ¡Швеция) с колонкой Superóse 12. Полученные данные { Рис. 10,, к 11 ' указывает не содержание до 7 фракций б препарата- , ясаучекнух по Регламенту производства ЧЛй N 802-82, основу котопыу 5ьм*пгода*«н<? "агкснкьь

""од: , белки гемоглобина.

Препарат получении!! по Регламенту производства интерферона М 281-90 содержит всего три фракции , которые находятся в диапазоне по м.м. от 10000 - 100000 дааьтон.

Данные хроматографического разделения также указывают на значительную чистоту получаемого препарата по разработанной нами технологии получения ЧЛй.

Таким образом, разработанная нами промышленная технология производства ЧШ обеспечивает получение интерферона в больших объемах, очищенного от балластных белков и аллергпэирухкдих примесей, с высокой противовирусной активностью и клеточными медиаторами, что позволяет использовать его для приготовления различных лекарственных форм.

2.2.4. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИНАКШЬАЩШ Ы1РУС0В-ЙШТАМИ-КАНТОВ В ПРЕПАРАТАХ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКСШТАРТТОГО «HTSFÍEFOHA О ПОМОНЬЮ РАДИАЦИОННОЙ ОБРАБОТКИ. возможность распространения ряда инфекций ¡ОШЩ, гепатит) препаратами, изготовляемы?® из донорской крови или ее компонентов, обуславливает высокие требования к технологии их производства, она должна включать в процесс изготовления надежные методы очистки и инактивации возможных вхрусов-контзмкнантсЕ. донорская кровь, иепслвзу»-мая е производстве интерферона,должка проходиоь обязательные кснтрсди на БИЧ, НВз-Ag, сифилис. На этапах производства ЧШ предусмотрен контроль полуфабриката и готового препарата на выше перечисленные инфекции.Однако возможные случайные ошибки персонала и отсутствие гарантии 100% выявляемости ВИЧ и НВз -Ag, из - за недостаточной чувствительности коммерческих тест-систем заставляют предусматривать инактивацию ноемозкных инфекционных- контаминантов и вируса-индуктора на дальнейших этапах производства ЧЛИ.

- 64 -

Технология производства интерферона предусматривает стадию мембранной очистки и стадию кислотной инактивации(рН 2,2-2j4)возможных вирусов-контаминантов в полуфабрикате интерферона (Регламент производства N281-90. Интерферон лейкоцитарный человеческий сухой).

Однако, поиск и ■ разработка дополнительных простых и надежных методов инактивации вирусов-контаминантов на технологических этапах производства интерферона, по - прежнему, весьма актуальны.

С этой целью нами была изучена возможность инактивации вирусов-контаминантов в экспериментальных препаратах интерферона с помошью радиационной обработки, которая используется в процессе производства ряда препаратов.

5 частности, показана возможность радиационной стерилизации, без потери биологической активности, ряда лекарственных препаратов - пантогама, аскорбиновой кислоты, пантотената кальция, перидоксаль -5 фосфата,гепарина,питательных сред, ряда антибиотиков.(Грачев С.А. и др.,1973; Львова М. III. и др., 1980: Зорина А.Я. и др., 1983; Гончаров А.А. и др., 1986;Зо-рина А.Я. и др.,1986; Почапинский В.К,, Трофимов В.И.1992).

Среди лекарственных препаратов, разрешенных в разных странах (США, Великобритания, Индия и др.) к применению после .радиационной стерилизации, находится ряд антибиотиков (неоми-цин, тетрациклин, бацитрацин и т.д.) и содержащие их маЕзи, стероидные препараты, глазные капли, лекарственное сырье -спорынья, белладонна и т.д.(Sepal N.3. et al..1938).

Фармакологический комитет Минздрава ССОР разрешил медицинское применение физиологического раствора, 40 %. раствора глюкозы, иэониаэида, растворов АТФ и инсулина для инъекций после их радиационной обработки.

Следует отметить, что еще в 1981 г. совместным решением BCG, ФАО и МАГАТЭ подтверждена безвредность радиационной обработки пищевых продуктов и рекомендовано применение любых облученных пищевых продуктов , если доза облучения не превышает 10 кГр.( Wid Kith Org. techn. Rep. Ser. N 65Э. Geneva, 1981). В облученных системах, в принципе, не появляется наведенной радиоактивности при использовании гамма - установок с

радгснукистыми источникам!: хзлученк?-кобальт-и цезий-1>~.

Достоинством радиационной стерилизации являются возможность обработки г конечной герметической упаковке в том числе и транспортной таре, универсальность, высокая надежность.

Пс прогнозам зарубежных специалистов, радиационный метод схершшвации и деконтаминации препаратов и различны:-: изделий

пля оаяИмй-!-» «ТГНСГ^еТНСв МвСлО »Н'>*ЙИ

тсдсв з бяииэйгке годы (Вг1пз1оп й.М. 1990).

Бактерицидная эффективность действия ионизирующих излучений хорошо изучена как на чистых культурах микроорганизмов, так и на реальной микрофлоре различных изделий и препаратов.

0 учетом вышеизложенного, нами были изучены возможности инактивации специально добавленных вирусов в ЧЖ для иятрзнз-зэльного применения.

При изучении отечественной и зарубежной литературы мы не нашли сведений о подобного рода исследованиях.

Первые исследования были проведены по изучению устойчивости вирусов к рздиацискному облучению в солевом растворе. Для этих целей были взяты вирус везикулярного стоматита -ггзим Индквчэ и вирус болезни Ньюкасла агтзмм "Н". Вирусы разводили а физиологическом растворе до инфекционного титра 104ЦПД /50/ мл.

Как видно из табл. 15 наиболее чувствительным к т-облучений бил ¿ЕС при дозе облучения 15 кГр, в то время как ВЕН сохранял остаточную инфекционную активность при такой дозе облучения. Однако при дозе облучения в ?5 кГр ЕЕК полнссть.ю пнактивпровзлс-л (табл. 15;.

В дальнейшем к очищенному интерферону добавляли ЕЕО и БЕК в дозе 1СП1 Ю^ШД-50-' мл. Интерферон далее разливали л г ампулам. Часть ампул были высушены в сублимационных установках.

Ампулы с сухим интерфероном подвергали радиационной обработке, а жидкие препараты интерферона обрабатывали криорадиа-циснным методом. Дозы радиационной обработки, которые были эффективны против вирусов в солевом растворе (табл.15) оказались не эффективными для вирусов ВВС и ЕЕН в ЧЖ, вследствии протективного действия белков альбумина человека (табл. 16).

Таблица • 15

Влияние тс-облучения на инфекционную активность ВВС и ВБН в 0.87 % растворе ЫаС1

¡1 мл раствора! Доза \содержит 1 г-облучения 1 |104ЦЦЦ/50 | (кГр) 1 вируса ! ! Пассажи на куриных эмбрионах

( 1 I 1 п ! I ш

| ЦПД/50/мл 1 ! ЦПД/50/мл 1 < I ШЩ/50/И

1 1 I ВВС 1 1 ! 1 5 1 I ! + 1 ! ! + 1 1 | 1 н.и. 1

1 | ВВС 1 1 1 10 1 1 1 1 ! ! + ! 1 1 + 1

1 ! ВВС 1 15 1 I 1 1 1 1 ! 1 1

« | ВВС 1 | 20 I | , | ~ I 1 1 1 1 1

1 1 БЕС 1 1 1 ( 1 + 1 1 + 1 ! Н.И. 1

1 | ВБН 1 ( I 10 1 1 1 с I т 1 1 ! + ( 1 + 1

1 ! ВБН 1 I 1 15 1 1 ! + 1 1 + 1

1 •! ВБН 1 ! . 25 1 \ 1 1 ! 1

1 ! ВБН 1 1 1 ч ! + 1 + ! | н.и.

- ЦОД вируса проверяли на шибробластах куриного эмбриона

- не исследовали (н.и.).

\

Как видно из табл. 16, наиболее устойчивым к радиационной обработке окагался вкруг болезни йьккасла. Даже при дозе облучения э 25 кГр не удалось достигнуть кнзктившзга.

ХаЛпи«"

Елияние r-n*zrzBiUiA ч» иг^вкцмо^нут хъ акрусов

2 оьс-1'-ерк.йитальныл сериях интерферона

; Интерферон Ц ш ЧШ ( Доза г- ! Пассажи на куриных эмбрионах'

I человеческий |содержал i облучения|-

(лейкоцитарный! ЗЕК ! (кГр) | I | II ! III

I 1 ю*щщ/5о | i-;-:---

{ ! ЕЕО ' 11!Т1д/50-'мл!Д1111/5С/мл!1ЩП'5й/мл

; i ЮгЩ15''50 ' i i

!

ЛИД кий | ВЕС 15 ! * ¡' Н.И.

жидкий i НЕС ■¿П, 1 - + !

.".ИД кик ! ЕВО Й5 1 - - :

жидкий i - | н.и.

КИЛ КИИ : ! - 1

сухой j EEG л с ; - т : н. и.

сулой 5 ВО ¿"j - 1 +

сухой i ВВС 25 | - !

сухой | ВВС i + + j н.и.

сухой I 1 - -

жидкий : ЕБЫ <5 - - 1 н.и.

•ИДКИЙ ВБК 35 I - + !

жидкпи ВЕК ; - X. | н.и.

жидкий * " ! - |

сухой j ЕБН 25 | + + ! н. к.

сухой i ЕБН 35 ] - + j 4-

сухой 1 ЕВН ! + + 1 н.и.

сухой !. ! - 1

- ;ЦПД вируса проверяли на фибробластах куриного эмбриона -.не исследовали (н.и.)

- 68 -

Необходимо отметить, что интерферон не терял противовирусную активность при радиационной обработке до 25 КГр (табл.17).

В предварительны;-: исследованиях было выявленос что в ВМ, содержащей ВБН, при однократной доае облучения в диапазоне от

Таблица 17

Влияние г-облучения на противовирусную активность человеческого лейкоцитарного интерферона

1 Человеческий I лейкоцитарный | интерферон 1 дога | т-облучения 1 (кГр) ! Противовирусная | активность интерферона ¡' (МЕ/мл)

| жидкий I 1 ............. | 20 1 | 3556 (2895-4390) 1

| жидкий 1 ( 25 1 ! I 3566 (2396-4390) 1

! | ЖИДКИЙ 1 1 ( 1 1 1 3556 (2895-4390)

1 | сухой ! 20 1 ) 3327 (2702-4096)

I ! сухой ! | 25 I 1 3327 (2702-4095) 1

1 I сухой 1 1 ~ ' ! I ! | 3327 (2702-4096) 1

- в таблице приведены средние величины с нижними и верхними границами активности интерферона при доверительных интервалах Рг0,05.

1 до 35 кГр не достигается полной инактивации ВБН , Однако , использование дробного г-облучения уже при дозах 10+ 10 кГр обеспечивает полную инактивацию ЕБН (табл.18 ).

Р.тлянп? газлкчннх доз **~об лучения на кнфякциснный тито ЕЕН

} иаит*гт з V ^ ц '

;ажи на куриных эмбрионах

п

III

Г I ' •

! 1+1

П. »1/ П1 1/И* |

лЩЦ/К-'.'МЛ

ЦДЦ/50/мл

н.и.

! 5 + 5

О + 10

- не исследовали (н.и.)

- использовали ЕЕН сухой, з ампуле сопержалссь Ю'ШЕ-би/мл;

~ Ц1К впг*.го? гл^эр^яли на т*'^гсбластчх "^ииногс эмбонсна

При ". солеожашег" БЕН в лозу 1СГ~'ПТШ0 50' ^

препарата, полная инактивация вируса достигалась при дробных дозах 10 + 10 кГр при сохранении противовирусной активности интерферона (табл. 19).

Таблица 19

Влияние различных доз г-облучения на противовирусную активность ЧЛИ и ББН в интерфероне

¡Доза г-облучения ЧЖ I (кГр)

1 + 1

5 + 5

! 10+10

10 + 15

О (контроль)

Пассажи на куриных эмбрионах

И

II]

|Противовиру< —¡ная активно!

| интерферон. —! (ЫЕ/мл)

ЦПД/50/.чл 1 ДЦД/50/мл I ЩЩ/Ю/ш.

I н.и.

н.и.

722 (779-632)

722 (779-632)

722 (779-63Й)

722 (779-632)

676 (779-588)

447 (512-388)

722 (779-632)

- не исследовали (н.и.). ■

- в опытах использовали сухой ЧЛИ, содержащий в 1 мл вирус-индуктор (ББН) в дозе 103ЦПД/50.

-приведены средние величины с нижними и верхними границами активности интерферона при доверительных интервалах Р-0,05,

Тагам образом, ЧЛИ после сублимационного высушивания в ампулах и их запайки может, без потери противовирусной активности, подвергаться дробной радиационной обработке в суммарной дозе 20-25 кГр для инактивации возможных вирусов-контами-нантов.После г-облучения ЧЛИ был безвреден нетоксичен и соответствовал всем требованиям к ЧЛК для интраназального

применения.

На способ инэктивапии вирусов-контэшнантоз в сухом человеческом лейкоцитарном интерфероне подано заявление на выдачу патента Российской федерации за Я34012у37.

В Ы В о- Л Ы

1. Впервые создана, компьютеризовать!! о авто мятияоцг^:, геля^оси» дрии^ь-дства человеке с:-::;: ^ лейкоцитарного интерферона очищенного от балластных л аллергизирующих примесей с противовирусной активностью 1200014000 МЕ/мл.

2. Разработан оригинальный способ выделения, с помощью трилонз Б и ВЩ -100, чистых лейкоцитов иг больших объемов и различных источников сырья, обеспечивающий выход лейкоцитов до 90-95 X.

3. Впервые разработан режим стерилизации Емц-100 обеспечивающий эффективное выделение чистых лейкоцитов.

4. Разработан способ концентрации и очистки, больших сбч-емсв вируса-индуктора от балластных белков в тангенциальном потоке с дмафгльтрацней на микрофильтрационккх мембранах о гэвиерсм пор 0,2 - 0,45 мкм с выходом вируса не менее З&а и счисткой от овальбуминз на 99,9%. Установлено, что для эффективной концентрации и очистки вдоусэ-индуктора необходимо выдерживают? его при - не менее 90 дней.

5. гзаработаны конструкции основных и вспомогательных элементов биореактора, позволяющие проводить з нем перемешивание различных объемов суспензии лейкоцитов с помощью сжатого воздуха, а также зэ счет эксцентричного вращения пе-ремедизэнцёго устройства.

6. Впервые показана возможность замены антибиотиков- пенициллина и стрептомицина перекисью водорода в составе питательной среды, для получения интерферона.

7. Установлено , что использование в составе питательной среды, для получения интерферона, цитрата натрия и донорского альбумина существенно повышает эффективность очистки интерферона от высокомолекулярных примесей. .

8. Впервые разработаны параметры одностадийной технологии получения интерферона в биореакторе за счет объединения ста-

дии индукции и биосинтеза в единый процесс к температурные режимы двухэтапного прайминга лейкоцитов для интенсификации продукции интерферона .

9. Разработаны оптимальные условия очистки интерферона на ультрафильтрационных мембранах позволяющие эффективно очищать интерферон з больших объемах от высокомолекулярных примесей с потерей интерферона не более 1-1,5?;.

10. При т-облучении, ВВС в солевом растворе инактивирует-ся - 15 кГр, а е образцах интерферона - 25 кГр. Инактивация ВЕН в солевом растворе достигается при дозе у-облучения 25 кГр, а в образцах интерферона вирус не инактивируется даже при дозе 35 кГр.

11. Человеческий лейкоцитарный интерферон устойчив к однократно^ у-облучению з дозе 25кГр. При дозе в 35 кГр снижается противовирусная активность интерферона на 40%.

При дробном г-облучении полная инактивация ЕБН в образцах интерферона, при сохранении его противовирусной активности, достигается при суммарной дозе 20-25 кГр.

12. Экспериментальные образцы ЧЛИ для интранаэаяьного применения после -т-облучения были безвредны, не токсичны и соотвествовали всем требованиям 'К 42-247ВС-91 на этот препарат .

4. СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Авторское свидетельство N 635834 с грифом "ДСП". Способ получения интерферона. Аетор - Кулагин В.Ф.

Авторское свидетельство N 587633 с грифом "ДСП". Способ получения интерферона. Автор - Кулагин Б.Ф.

Авторское свидетельство N 854980. Фильтр для очистки вируссодержакей жидкости. Автор - Кулагин В.Ф.

Авторское свидетельство N 1361757 о грифом "ДСП". Способ получения лейкоцитов из крови ( авторы: Кулагин В.Ф., Юсупов В.Г,,Галеева Э.Г.).

Авторское свидетельство N 1459229 с грифом "ДСП". Аппарат для биосинтеза интерферона. ( авторы:Кулагин В.Ф., Галеева Э.Г., Перминов Г.А., Юсупов В.Г., Еайрушин Ф. Т. .Гизат-уллнн М. К.,ШКПуЛлК Г.А., КрЮчКО А.А.).

ТГ/БЖНАШ^

1. Увеличен:™ выхода лейкоцитарной мес-оы в производстве человеческого интерферона /авторы; Галеева Э.Г., Егоров ILA,. Кулагин В.5.,Терновая Л.П., Лобанова A.M., йсупов Ф.Г./ в кя: Вакцины и сыворотки . Вкл. 19. г. Москва, 1975., стр. ";5-"*6.

"¿.Разработка рсллернсго м?тсла культивирования человеческих лейкоцитов - продуцентов интерферона в условиях поока-

erviinm» '---г р "..-.; галгтг'ь^ t b.w.. ¿kuvnl/ma л p

ö.C., глпкпльдика Л. А. / в кн: Научно-практические вопросы производства , контроля и стандартизации бактерийных и вирусных препаратов .г. Уфа, 1974 г., стр. 63-65.

3.Разработка метода деконтаминации препарата человеческого лейкоцитарного интерферона от аллантоисных белков и их индикация /авторы: Гвоздева И.Г., Еобкова S.E., Кузнецов В. П. :Иксанов S.O., Хзфизсвэ Л. Г. .Кулагин В.Ф. / в кн: Иммунс-бисл.препараты лля профилактики, диагностики и лечения инфек-плснньк заболеваний .г. Уфа, 1585 г., отр.131-134.

4.Пути совершенствования производства человеческого лейкоцитарного интерферона .'авторы:Кулагин Е.Ф..БоСкога S.S., Юсупов Б.Г., Кугкгцсв В.П./ в кн: Вопрооы медицинской биотехнологии иь-мукопрепарзтоз. г. Уфа.1088г. отр.87-88.

Создание технологии получения вирусологической питательной среды о основой и-о Силкового - .молочного гидролизатэ авторы: Поезжэлова Г.Н. Горбатова S.A..Кулагин В.Ф., Галеева Э.Г., Штритер H.A., Кадырматова Г.Х./ в кн: Вопросы медицинской биотехнологии иммунопрепаратов.г .Уфа, 1988 г.стр.57 -ЕЗ.

6.Применение мембранной технологии в производстве человеческого лейкоцитарного интерферона 'авторы: Сзгидуллнн Н.В., Бобкова Е. В. .Кулагин В.Ф. / в кк: Вирусные инфекции., г. Екатеринбург, 1998, 0.15G -155.

7.Изучение возможности инактивации вирусов- контаминантов в экспериментальных препарата:-: интерферона с помощью радиационной обработки /авторы: Кулагин В.Ф., Эзгидуллин Н.В., Ниг-матуллин Т.Г., Ивзадльдина Л.А., Трофимов В. Л./в кн: Актуальные вопросы медицинской вирусологии. . г.Екатеринбург,1994, стр. 246 - 251.

8.Разработка способа Еыделения чистых лейкоцитов с поме-

щью ЕМЦ - 100 /авторы: Кулагин В.Ф. .Юсупов В.Г.,Загидуллин Н.В., Галеева Э.Г., Ишкильдина Л, А., Иксанов З.С./ в сборнике докладов международного симпозиума, посвященного 150-летию со дня рождения И. И. Мечникова и 90-летию Уфимского НйИВО им. И.К. Мечникова, г. Уфа, 1995, стр. 110-114.

9.Разработка способа очистки вируса-индуктора интерферона от балластных белков /авторы: Кулагин В.Ф., Загидуллин Н.В.., Иксанов З.С./ в том же сборнике. г.Уфа.. 1995, стр. 114-117.

10.Изучение возможности получения человеческого лейкоцитарного интерферона в биореакторе/авторы: Кулагин В.Ф.,Юсупов В.Г., Загидуллин Н.В. , Галеева Э.Г., Ишкильдина Л.А., Иксанов Э.С./ в том же сборнике, г. Уфа, 1995, стр.117-122.

11.Изучение возможности инактивации вируса-индуктора в экспериментальных препаратах интерферона с помощью радиационной обработки /авторы:Кулагин В.Ф..Загидуллин Н.В., Нигматул-лин Т.Г., Ишкильдина Л.А., Трофимов В.И./ в том же сборнике. Уфа,1595л стр.122-127.

12.Характеристика человеческого лейкоцитарного интерферона, полученного по различным производственным технологиям/авторы: Кулагин В.Ф. , Смирнов Б.Д., Загидуллин Н.В., Сперанский В.В./ в том же сборнике. Уфа,1995. стр.128-131.