Исследование структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов крови человека при модификации α-интерфероном и в условиях УФ-облучения

Колтаков, Игорь Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов крови человека при модификации α-интерфероном и в условиях УФ-облучения
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов крови человека при модификации α-интерфероном и в условиях УФ-облучения"

□□3177316

На правах рукописи

Колтаков Игорь Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ МОДИФИКАЦИИ а-ИНТЕРФЕРОНОМ И В УСЛОВИЯХ УФ-ОБЛУЧЕНИЯ

Специальность 03 00 02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 6 ¿¡ЕН 2007

Воронеж 2007

003177316

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» на кафедре биофизики и биотехнологии биолого-почвенного факультета

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Артюхов Валерий Григорьевич

доктор биологических наук, профессор Попова Татьяна Николаевна,

Ведущая организация:

кандидат биологических наук, доцент Дмитриев Евгений Владиславович

Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии

Защита состоится 14 декабря 2007 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212 038 03 при Воронежском государственном университете по адресу 394006 Воронеж, Университетская пл , 1, ауд 59 e-mail avg@main vsu ru, koltakov@bio vsu ru

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета

Автореферат разослан «13» ноября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Грабович М Ю

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время внимание исследователей направлено на изучение молекулярно-клеточных механизмов функционирования иммунной системы Это связано с тем, что факторы иммунитета являются основными элементами поддержания гомеостаза организма человека (Дранник Г Н , 2003)

Высокая чувствительность иммунокомпетентных клеток к действию разнообразных химических агентов обеспечивает тонкую регуляцию иммунной системы т vivo, а также возможность разработки новых способов лечения патологических состояний (Ершов Ф И, 1998) Однако наибольший интерес представляет выяснение механизмов саморегуляции, поскольку большое разнообразие естественных иммуномодуляторов (цитокины, гормоны, неспецифические регуляторы) и разнонаправленный эффект их влияния открывают широкие перспективы для иммунокорригирующей терапии (Дейл ММ, 1998)

В современной медицине получили широкое распространение естественные и генно-инженерные препараты интерферонов, применяемые не только для лечения и профилактики вирусных заболеваний (грипп, вирусный гепатит, герпес), бактериальных и протозойных инфекций, аллергозов, аутоиммунных заболеваний (ревматоидный артрит, гломерулонефрит и др) и онкологических патологий, но и как иммуномодуляторы широкого спектра действия (Ершов Ф И, 1998, Ершов Ф И, Киселев О И, 2005, Киселев О И и др , 2000, Кузнецов В П , 1987, Кульберг А Я , 1986)

Тем не менее, несмотря на большие перспективы использования a-интерферона в клинической практике, необходимо решить проблемы, связанные с трудностью подбора максимально эффективных для каждого пациента концентраций, контроля реакции организма на введение цитокина и прогнозирования результатов лечения на ранних этапах

Главным сдерживающим фактором широкого распространения интерферонотера-пии при лечении различных патологий являются побочные эффекты, развивающиеся при использовании высоких концентраций цитокина гриппоподобный синдром, артрал-гии, миалгии, лейко- и тромбоцитопении, галлюцинации, расстройства периферической нервной системы (Волкова М А , 1999, Дранник Г Н , 2003, Ершов Ф И , 1998, Гаврило-ва А Ф , 1986) В связи с этим определенный практический интерес представляет разработка схем комбинированного использования интерферонов с другими лекарственными препаратами (Киселев О И и др , 2000) или иммуномодуляторами физической природы (УФ-свет, лазерное излучение), позволяющими повысить биологическую эффективность его малых концентраций

К настоящему времени накоплен значительный экспериментальный материал о влиянии на биообъекты различных диапазонов длин волн электромагнитных излучений, особое место среди которых занимает УФ-свет (Синотова О А и др, 2002, Волгарева ЕВ и др , 1990, Волгарева ЕВ, 1991, Наквасина МА, 2006, Крыленков ВАи др , 1983) Большое количество работ, посвященных исследованию действия УФ-радиации, обусловлено широким внедрением в клиническую практику метода аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК-терапии) Установлено, что воздействие малых доз УФ-излучения на компоненты крови оказывает дезинтоксикационный и антивоспалительный эффекты (Самойлова КА, 1986), способствует модуляции уровня цитокинов (Kulms D , Schwarz Т , 2001), поверхностных антигенов (Obolenskaya KD et al, 1991), сывороточных иммуноглобулинов (Жосанов В Ю , 2001)

Исследование механизмов, лежащих в основе действия УФ-света и а-интерферона, позволит расширить общие представления о строении и функционировании лимфоци-тарных мембран в физиологических условиях и при экзогенных воздействиях

Цель и задачи диссертационной работы Целью настоящей работы явилось изучение структурно-функционального состояния мембран Т-лимфоцитов, модифицированных а-интерфероном, УФ-светом и их комбинированным действием

В связи с этим перед нами стояли следующие задачи

1 Изучить влияние препарата человеческого лейкоцитарного а-интерферона в диапазоне концентраций 0,01 - 100 МЕ/мл на экспрессию ряда антигенных детерминант на поверхности мембран Т-лимфоцитов

2 Оценить уровень интенсивности протекания процессов ПОЛ в мембранах Т-лимфоцитов в нативном состоянии и при модификации а-интерфероном

3 Исследовать каталитическую активность ферментов антиоксидантной системы (супероксиддисмутазы и каталазы) лимфоцитов, инкубированных с а-интерфероном

4 Изучить индивидуальное и комбинированное с а-интерфероном (0,01 - 100 МЕ/мл) влияние УФ-света (151 - 1359 Дж/м2) на экспрессию СБ 3 комплексов и СО 4 маркеров на мембранах Т-лимфоцитов крови человека

Научная новизна Работа является комплексным исследованием, посвященным изучению структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов крови человека, показателем которого служило изменение уровня экспрессии ключевых мембранных маркеров СО 2, СО 3, СО 4, СО 7, СО 8, РсЯ, активности некоторых ферментов антиоксидантной защиты после воздействия а-интерферона

Установлена связь между уровнем антигенных детерминант модифицированных интерфероном Т-лимфоцитов и протеканием процессов пероксидного окисления липи-дов их мембран Показано значительное усиление СОД-активности и снижение активности цитозольной каталазы при инкубировании Т-клеток с а-интерфероном, что свидетельствует о разобщении функционирования ферментативного звена антиоксидантной защиты и повышении интенсивности ПОЛ в клеточных мембранах под действием цито-кина

Впервые был изучен характер изменения уровня экспрессии СО 3 комплексов и СО 4 маркеров на поверхности мембран Т-лимфоцитов крови человека в условиях комбинированного действия УФ-излучения и а-интерферона и выявлены основные закономерности изменения антигенраспознающей способности Т-клеток

Представлена схема событий, реализующихся при действии а-интерферона на Т-лимфоциты, раскрывающая совокупность процессов, инициированных цитокином и приводящих к изменению их структурно-функционального состояния, что может быть полезно для понимания молекулярных аспектов иммуномодулируюшего действия данного цитокина

Практическая значимость Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления об особенностях изменения структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов в условиях УФ-облучения и воздействия а-интерферона

Изучение индуцированных а-интерфероном изменений уровня экспрессии СО 3 комплексов, СО 4 и СО 8 маркеров, за счет которых реализуется способность Т-лимфоцитов распознавать чужеродные антигены, важно при рассмотрении вопросов, связанных с вкладом отдельных субпопуляций клеток в реализацию иммунного ответа на чужеродное воздействие

Исследование влияния препарата человеческого лейкоцитарного а-интерферона на иммунокомпетентные клетки позволит разработать новые подходы к иммунокоррекции различных патологических состояний при проведении фармакотерапии заболеваний

Данные, полученные при исследовании интенсивности протекания ПОЛ и активности некоторых ферментов антиоксидантной защиты в присутствие а-интерферона, могут

быть использованы для оценки вклада деструктивных процессов в изменение антигенного профиля лимфоцитарных мембран

Проведена оценка возможности совместного использования АУФОК-терапии и цитокинотерапии для лечения ряда патологических состояний

Материалы работы могут быть использованы в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Иммунология», а также спецкурсов по фотохимии, фотофизике и фотоиммунологии компонентов крови Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами ВГУ

Апробация работы Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Междисциплинарной конференции с международным участием «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека» (Петрозаводск, 2003), на VII Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), на Международной конференции «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and Human health» (Смоленск, 2003), на VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2004), на III Международной конференции «Электромагнитные излучения в биологии» (Калуга, 2005), IV Съезде фотобиологов России (Саратов, 2005), на XX Съезде физиологического общества имени И П Павлова (Москва, 2007), на Научных сессиях сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2006, 2007)

Публикации По теме диссертации опубликовано б статей и 6 тезисов, в том числе 2 статьи в печатных изданиях РАН и РАМН, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ

На защиту выносятся следующие положения.

1 a-интерферон оказывает существенное влияние на формирование поверхностного фенотипа лимфоцитарной клетки, тем самым принимая участие в регуляции ее функциональной активности

2 a-интерферон вызывает разобщение функционирования ферментативного звена антиоксидантной защиты, способствуя усилению процессов ПОЛ в мембранах Т-лимфоцитов крови доноров

3 УФ-излучение в дозах 151 - 1359 Дж/м2 и a-интерферон в концентрациях 0,01 -100 МЕ/мл индуцируют значительные изменения уровня экспрессии CD 3 - комплексов и CD 4 маркеров Т-лимфоцитами крови человека, что отражается на антигенраспознаю-щей способности субпопуляции Т- клеток

4 Схема регуляторных процессов, приводящих к изменению структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов в присутствии а-интерферона

Структура и объем работы Диссертационная работа включает 130 страниц машинописного текста, состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка использованных источников и «Приложения» Иллюстративный материал включает 31 рисунок и 4 таблицы В «Приложении» - 7 таблиц

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе представлен свод основных современных работ, посвященных механизмам противовирусного и модулирующего действия a-интерферона, а так же анализу фотоин-

дуцированных изменений компонентов мембран иммунокомпетентных клеток ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Объектами исследования служили Т-лимфоциты периферической крови доноров

Выделение лимфоцитов Т-субпопуляции. Лимфоциты выделяли из крови доноров методом седиментации на градиенте плотности фиколл-урографина (Воуш А, 1974) Центрифугирование осуществляли на центрифуге типа МР\У-340 в течение 15 мин при 300 g Полученную суспензию лимфоцитов разделяли на фракции Т- и В-клегок, используя колонки с синтетической ватой по методу Р Тегахак! (Зарецкая Ю М , 1983)

Определение чистоты клеточных суспензий Чистоту клеточных суспензий проверяли методом окрашивания мазков клеточных суспензий по Романовскому (Земсков А М и др , 1998) Морфологическую идентификацию клеток крови осуществляли методом иммерсионной микроскопии, базируясь на литературных данных (Кост Е А , 1968)

Определение жизнеспособности лимфоидных клеток. Жизнеспособность лимфоцитов определяли в тесте с трипановым синим Этот краситель не проникает через мембраны живых клеток, но при их повреждении способен окрашивать клеточное ядро (Новиков Д К , Новикова В И , 1996) В работе использовались суспензии клеток с жизнеспособностью не менее 95%

Модификация лимфоцитов препаратом а-интерферона. Т-лимфоциты модифицировали растворами человеческого лейкоцитарного а-интерферона («Иммунопрепарат», Уфа) по следующей схеме К 0,2 мл суспензии Т-клеток (1*105 клеток/мл) добавляли 0,2 мл цитокина в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 или 1000 МЕ/мл, доводили объем образца до 2 мл и инкубировали при температуре 37 °С в термостате ТС-80М в течение 24 часов Конечная концентрация модификатора в инкубационной среде составляла 0,01, 0,1, 1, 10 и 100 МЕ/мл

Облучение суспензии Т-лимфоцитов Полученные суспензии Т-лимфоцитов в объеме 3 мл облучали с помощью ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240-390 нм в термостатированной кювете (37°С) при постоянном перемешивании магнитной мешалкой типа ММ6 Интенсивность облучения составляла 151 Джхм 2хмин 1 на расстоянии 0,23 м до объекта Образцы суспензий клеток облучали в течение 1, 3, 6 и 9 мин, что соответствовало дозам 151, 453, 906 и 1359 Джхм2

Комбинированное воздействие УФ-излучения и цитокинов на Т-лимфоциты.

Для изучения совместного действия УФ-излучения и а-интерферона на лимфоциты модификацию клеток проводили по следующей схеме

1) лимфоциты, облученные УФ-светом в дозах 151 - 1359 Дж/м2, инкубировали в течение 24 ч с препаратом а-интерферона в концентрациях 0,01 - 100 МЕ/мл,

2) лимфоциты инкубировали в течение 24 ч с препаратом а-интерферона, облученным УФ-светом в дозах 151 - 1359 Дж/м2,

3) фотомодифицированные в дозах 151 - 1359 Дж/м2 лимфоциты инкубировали в течение 24 ч с а-интерфероном, облученным УФ-светом в тех же дозах

Метод иммуноферментного анализа Иммуноферментный анализ был использован нами для определения уровня экспрессии СБ 2, СБ 3, СИ 4, СБ 7, СБ 8 и РсЯ на поверхности мембран нативных и модифицированных препаратом а-интерферона и УФ-светом Т- лимфоцитов крови человека Он относится к простым, чувствительным, быстрым и хорошо воспроизводимым методам (Егоров В А , 1991)

Для определения экспрессии CD 2, CD 3, CD 4, CD 7 и CD 8 маркеров использовали моноклональные антитела LT2, LT3, LT4, LT7 и LT8 и конъюгат к ним - козьи антитела против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена ("Сорбент", Москва)

Для определении суммарного уровня Fc-рецепторов на поверхности лимфоцитов применяли конъюгат белок А - пероксидаза хрена

Результаты экспериментов учитывали спектрофотометрически на вертикальном фотометре АИФР-01 "Униплан" при длине волны л=492 нм (в случае применения о-фенилендиамина дигидрохлорида - ОФД) и Х=450 нм (в случае применения 3,3,5,5-тетраметил бензидина - ТМБ) и выражали в единицах оптической плотности

Метод регистраци люминолзависимой хемилюминесценции Для исследования свободнорадикальных процессов в мембранах Т-лимфоцитов оценивали их спонтанную хемилюминесценцию в присутствии зонда 3-амино-фталевого гидрозида - люминола В результате окисления люминола образуется 3-аминофталат в возбужденном электронном состоянии, переход которого в основное состояние сопровождается испусканием кванта света с длиной волны около 425 нм (Владимиров Ю А , Потапенко А Я , 1989)

В качестве параметров хемилюминесценции (ХЛ) используют следующие характеристики сигнала светосумма - S [мВ с], максимальная интенсивность сигнала - Imax [мВ] и время ее достижения -1 [с] Однако, поскольку кривая ХЛ лимфоцитов не обладает выраженными пиками, величина t [s] не является информативным параметром и в качестве объективного критерия уровня ХЛ мы рассматривали только максимальную интенсивность сигнала и светосумму

Получение супернатанта лимфоцитарных лизатов Нативные и модифицированные лимфоциты (2 105 клеток/мл) суспендировали в питательной среде RPMI-1640, содержащей 1%-ный раствор L-глутамина, 5 105 моль/л раствор р-меркаптоэтанола (производство «Sigma», США), 10 % эмбриональную телячью сыворотку, и инкубировали в СОг-инкубаторе в пластмассовых пробирках в течение 1 и 24 ч при 37 °С с 5 % содержанием СОг в атмосфере Лизаты иммуноцитов получали путем смешивания 1 мл суспензии лимфоцитов с 1 мл дистилированной воды, охлажденной до +4 °С Смесь оставляли в холодильнике на 10 мин, затем проводили центрифугирование в течение 10 мин при 15000 об/мин на центрифуге MPW-300 В работе использовался супернатант лизатов Т-лимфоцитов

Метод определения активности цитозольной каталазы лимфоцитов. Метод определения активности каталазы основан на способности пероксида водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс с максимумом поглощения при X — 410 нм (Королюк МА и др , 1988) Активность каталазы выражали в мкмоль /л мин

Метод определения активности супероксиддисмутазы в лизатах Т-лимфоцитов. Метод определения активности супероксиддисмутазы основан на способности фермента конкурировать с нитросиним тетразолиевым (НСТ) за супероксиданион-радикалы, генерируемые фотоокислением рибофлавина в присутствии ТЕМЕД (Чумаков В Н , Осинская Л Ф , 1977) В результате происходит восстановление НСТ до гидразин-тетразолия, имеющего максимум поглощения Хта< - 540 нм В присутствии фермента происходит уменьшение степени восстановления НСТ

За единицу активности принимали такое количество фермента, которое обеспечивает ингибирование скорости восстановления нитросинего тетразолиевого на 50%

Статистическая обработка экспериментальных данных Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью прикладных программ "STATISTICA 6 0" Достоверность отличий контрольных и опытных значений сравни-

ваемых показателей определяли с помощью критерия Стьюдента. При этом рассчитывали варьирование показателя при повторных определениях внутри опыта, а также достоверность различий показателя внутри отдельных групп.

Для определения характера зависимости изменения уровня экспрессии СО 3 и СО 4 маркеров на поверхности мембран Т-лимфоцитов в условиях УФ-облучения и действия а-интерферона производился расчет коэффициентов корреляции.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА НА АНТИГЕННЫЙ ПРОФИЛЬ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Первым этапом нашей работы было изучение влияния препарата человеческого лейкоцитарного интерферона на функциональную активность Т-клеточного звена иммунитета, показателем которой служили изменения экспрессии поверхностных антигенов, отвечающих за взаимодействие Т-клеток с другими иммунокомпетентными клетками (СО 2 рецептор), за распознавание антигенного сигнала различными субпопуляциями лимфоцитов (ТСЯ, СО 4, СО 8 маркеры) и С07 рецептора, отвечающего за активацию синтеза 1Ь-2 и рецептора к нему.

Уровень экспрессии СО 2 маркеров на поверхности мембран интактных Т-лимфоцитов колебался в пределах от 0,201 ±0,012 ед. опт. пл. до 0,272 ± 0,01 ед. опт. пл. и в среднем составила 0,239 ± 0,028 ед. опт. пл.

Ответная реакция лимфоцитов на внесение различных концентраций модификатора зависела от величины исходного уровня СО 2. В зависимости от количества центров связывания конъюгата на мембранах Т-клеток доноры были разделены на 2 группы (рис. 1, 2).

Было установлено, что исследуемый цитокин во всем используемом диапазоне концентраций оказывает иммунокорригирующее действие на экспрессию исследуе-О О

0,280

0.280

контроль 0,01 0,1 I 10 100 [интерферон], МЕ/мд

Рис. 1. Динамика экспрессии СО 2 рецепторов на поверхности мембран Т- лимфоцитов доноров 1 группы в нативном состоянии и при модификации а - интерфероном

контроль 0,01 0,1 1 10 100 [интерферон],МЕ/мл

Рис. 2. Динамика экспрессии СО 2 рецепторов на поверхности мембран Т- лимфоцитов доноров 2 группы в нативном состоянии и при модификации различными концентрациями а - интерферона

мых маркеров, проявляющееся в увеличении данного показателя у образцов с исходно низкими значениями и, наоборот, снижении исследуемого параметра у образцов клеток с исходно высоким уровнем изучаемого антигена, тем самым внося существенный вклад в интенсивность протекания иммунных процессов в организме человека вследствие изменения адгезионных свойств исследуемых иммунокомпетентных клеток.

Уровень экспрессии СО 3 маркеров на мембранах нативньгх Т-клеток варьировал в очень широких пределах от 0,135 ± 0,012 ед. опт. пл. до 0,354 ± 0,022 ед. опт. пл. и в среднем составил 0,226 ± 0,079 ед. опт. пл. Нами было установлено, что ответная реакция лимфоцитов на внесение различных концентраций модификатора зависела от величины исходного уровня СБ 3, поэтому все доноры были разделены на 3 группы (рис. 3 - 5).

0.180

0.170

0.160

0.150

0.140

0.130

0,120

гЬ

контроль 0,01 0,1

I 10 100 [интерферон),МЕ/мл

0,350 0.330 0.310 0.290 0,270 0,250 0,230 0.210 0,190

Т|

Т1

-г

гЬ

Рис. 3. Динамика экспрессии СЕ) 3 комплексов Т-лимфоцитами доноров 1 группы в нативном состоянии и при модификации а-интерфероном

контроль 0.01 0,1 1 10 100 [интерферон!,МЕ/мд

Рис. 4. Динамика экспрессии СО 3 комплексов Т-лимфоцитами доноров 2 группы в нативном состоянии и при модификации а-интерфероном

Анализ полученных результатов не позволил выявить столь четкую закономерность, как в случае СО 2 маркеров. Так модификация клеток цитокином в концентрациях 0,01 и 0,1 МЕ/мл вызывала повышение количества исследуемых антигенных детерминант на поверхности мембран клеток всех обследованных доноров. Увеличение содержания иммуномодулятора в инкубационной среде до 1 МЕ/мл приводило к подобному эффекту только у допоров 2 и 3 групп. Максимальные концентрации а-интерферона 10 и 100 МЕ/мл оказывали иммунокорригирующее действие на экспрессию СО 3 маркеров Т-лимфоцитами доноров 2 и 3 группы.

Уровень данных антигенов на поверхности мембран нативных лимфоцитов составил 0,318 ± 0,023 ед. опт. пл. (рис. 6) и 0,300 ±0,018 ед. опт. пл. (рис.7) соответственно.

Использование цитокина в малых концентрациях (0,01, 0,1 и 1 МЕ/мл) повышало уровень экспрессии СО 4 маркеров на 19 - 32 % относительно контроля. В случае СО 8 маркеров подобный характер ответной реакции на внесение цитокина наблюдался при его концентрации 0,1 и 1 МЕ/мл.

Модификация клеток иммуномодулятором в больших концентрациях (10 и 100 МЕ/мл)

0,410 0,390 0,370 0,350 0,330 0.310 0,290 0.270 0,250 0,230

Г)

контроль 0,01 0.1 1 10 100 [интерферон], МЕ/мл

Рис. 5. Динамика экспрессии СО 3 комплексов Т-лимфоцитами доноров 3 группы в нативном состоянии и при модификации а-интерфероном 13

0.460

0.420 0,380 0,340 0,300 0,260 0,220 0.180

-ь

-А

приводила к снижению количества СО 4 антиенных детерминант на мембранах тестируемых клеток на 7 и 29 % соответственно и СБ 8 детерминант на 20 % (только при концентрации цитокина 100 МЕ/мл).

Исследовано влияние а-интерферона в диапазоне концентраций 0,01 100 МЕ/мл на экспрессию СО 7 рецептора Т-лим-фоцитами периферической крови доноров. Величина регистрируемого параметра для интактных Т-лимфоцитов составила 0,214 ± 0,012 ед. опт. пл. (рис. 8).

Модификация Т-клеток интерфероном в концентрациях 0,1 - 10 МЕ/мл приводила к увеличению экспрессии данного антигена на поверхности их мембран на 27 - 61 %, а в концентрации 100 МЕ/мл - снижала до0,177±0,014ед. опт. пл.

Анализ индивидуальной интерферон-чувствительности Т-лимфоцитов показал, что чем ниже исходный уровень РсЯ на

контроль 0,01 0,1 I 10 100 [и гггерферон ],МЕ/мл

Рис. 6. Динамика экспрессии СО 4 рецепторов на поверхности мембран нативных и модифицированных а-интерфероном Т-лимфоцитов крови человека

0,400 0.380 0.360 0,340 0,320 0,300 0,280 0,260 0,240 0,220 0.200

контроль 0,01

0,1 I 10 100 I интерферон],МЕ/мл

Рис. 7. Динамика экспрессии СО 8 рецепторов на поверхности мембран нативных и модифицированных а-интерфероном Т-лимфоцитов крови человека

мембранах Т-клеток, тем большие концентрации исследуемого цитокина необходимы для достижения максимальной экспрессии данного рецептора (рис. 9). Таким образом, использование в качестве модели клеточно-молекулярной системы, включающей в себя Т-лимфоциты, белок A St. aureus и человеческий а-интерферон, и выявленные нами раз-

0,380 0,360 0,340 0.320 0,300 0,280 0,260 0,240 0,220 0.200 0,180 0.160

1г

контроль 0,01

0,1 1 10 100 [шггерферон].МЕ/мл

Рис. 8. Динамика экспрессии СО 7 рецепторов на поверхности мембран нативных и модифицированных а-интерфероиом Т-лимфоцитов

нонаправленные изменения конъюгатсвязы-вающей способности Т-лимфоцитов в присутствии разных концентраций человеческого a-IFN (0,01 - ЮОМЕ/мл) свидетельствуют о влиянии цитокина на суммарное содержание FcR на поверхности обследованных лимфоидных клеток. Последнее, вероятно, может повлечь за собой не только возрастание или ослабление реакции взаимодействия FcR с протеином A St. aureus, но и отразиться на других функциях этого мембранного иммунорецептора: специфическом связывании иммуноглобулинов; антителоза-висимой цитотоксичности и др.

Проведенные нами исследования показали, что препарат человеческого лейкоцитарного а-интерферона оказывает значительное влияние на антигенный профиль Т-лимфоцитов посредством изменения уровня экспрессии CD 2, CD3, CD4, CD8, CD7 маркеров и Fc-рецепторов, принимает участие в изменении поверхностного фенотипа клеток и регуляции иммунных реакций, зависимых от данных мембранных маркеров. Это по-

: ;

Рис. 9. Динамика экспрессии Рс-рецепторов на поверхности мембран Т-лимфоцитов доноров 1 (а), 2 (б), 3 (в), 4 (г) и 5 (д) групп в нативном состоянии и при модификации а-интерфероном

зволяет рассматривать исследуемый цитокин как высокоэффективный иммуномодуля-тор и более корректно оценить его действие на иммунокомпетентные клетки

ГЛАВА 4 ВЛИЯНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ПЕРОКСИДНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА Т-ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Для выяснения влияния активных форм кислорода и интенсивности протекания ПОЛ на изменение антигенного профиля биомембран иммунокомпетентных клеток нами был осуществлен анализ свободнорадикальных процессов в мембранах Т-лимфоцитов, инкубированных с препаратом а-интерферона в диапазоне концентраций 0,01 - 100 МЕ/мл в течение 1 и 24 часов

Максимальная интенсивность ЛЗХЛ контрольных образцов Т-лимфоцитов составила в среднем 0,034±0,006 мВ, а светосумма - 11,9 ± 2,1 мВхс (табл 1) Термостатиро-вание клеток с а-интерфероном в концентрациях 0,01 и 0,1 МЕ/мл в течение 1 ч приводило к усилению 1тах на 67 и 88 %, а в - на 71 и 88 % соответственно При увеличении содержания цитокина в инкубационной среде до 1 и 10 МЕ/мл не было выявлено статистически достоверных отличий основных параметров хемилюминесценции от контроля Модификация клеток максимальной из используемых нами концентраций цитокина -100 МЕ/мл, инициировала снижение регистрируемых показателей на 44 и 41 %

При увеличении времени термостатирования Т-лимфоцитов до 24 часов нами было установлено повышение максимальной интенсивности 1т„ более чем в 2 раза до

Таблица 1

Динамика изменения параметров ЛЗХЛ Т-лимфоцитов в контроле и после их инкубации с различными концентрациями а-интерферона

время инкубации, ч концентрация интерферона, МЕ/мл Гщах, МВ Б, мВхс

контроль 0,034 ± 0,006 11,9 ±2,1

0,01 0,057 ± 0,006* 20,4 ± 2,0*

1 0,1 0,064 ± 0,007* 22,4 ±2,5*

1 0,038 ± 0,007 13,3 ±2,6

10 0,031 ±0,005 10,9 ± 1,8

100 0,019 ±0,008* 7,0 ± 0,8*

контроль 0,083 ± 0,008 15,0 ±3,6

0,01 0,248 ±0,012* 68,0 ±3,3*

24 0,1 0,324 ±0,017* 121,0 ±6,4*

1 0,399 ±0,018* 156,0 ±6,7*

10 0,543 ± 0,038* 236,0 ± 16,5*

100 0,701 ±0,042* 249,0 ± 14,9*

0,083 ± 0,008 мВ и незначительное возрастание светосуммы S до 15 ± 3,6 мВ с, однако, ее величина статистически достоверно не отличалась от таковой для часовой экспозиции Инкубация клеток с интерфероном в концентрации 0,01 ME/мл приводила к повышению исследуемой величины на 226 % (0,248 ± 0,012 мВ) Внесение в культуральную среду интерферона в дозе 0,1 ME/мл повышало уровень регистрируемого показателя на 326 % (0,324 ±0,017 мВ) Модификация Т-лимфоцитов цитокином в концентрации 1 МЕ/ мл способствовала росту интенсивности JI3XJ1 на 425 % (0,399 ± 0,018 мВ) При термо-статировании клеток с а-интерфероном в концентрациях 10 и 100 ME/мл наблюдалось увеличение регистрируемого показателя на 614 и 822 % (0,543 ± 0,038 и 0,701 ± 0,042 мВ соответственно)

Установлено, что светосумма JIX3JI образцов Т-лимфоцитов после их модификации а-интерфероном (0,01 - 100 ME/мл) увеличивалась пропорционально концентрации цитокина от 68,0 ± 3,3 до 249,0 ± 14,9 мВ с

Поскольку образование АФК в живых организмах находится в постоянном равновесии с их дезактивацией антиоксидантами (Артюхов В Г , Наквасина М А , 2000), нами была проведена серия экспериментов по изучению каталитической активности каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) в лизатах нативных и инкубированных с препаратом а-интерферона в течение 1 и 24 ч Т-лимфоцитов Исследования были проведены на изолированных Т-клетках крови 25 доноров

Величина каталазной активности лизатов суспензий нативных Т-клеток, термостатированных при 37 °С в течение 1 ч, составила 23,4 ± 0,6 мкмоль/лхмин (рис 10)

Инкубация Т-лимфоцитов с а-интерфероном в концентрации 0,01 ME/мл в течение 1 ч вызывала снижение активности исследуемого фермента до 20,9 ± 0,5 мкмоль/лхмин, а в концентрациях 0,1, 1, 10и ЮОМЕ/мл - повышение до величин 27,5 ± 0,6, 27,2 ± 0,5,27,0 ± 0,8 и 37,7 ± 0,6 мкмолъ/л*мин соответственно

При увеличении времени инкубации Т-лимфоцитов с исследуемым цитокином до 24 ч ферментативная активность цитозольной каталазы снижалась до величины 12,0 ± 0,6 мкмоль/лхмин

Нами было обнаружено, что а-интерферон во всем используемом диапазоне концентраций вызывает значительное снижение активности каталазы в лимфоцитарных лизатах на 73 - 81% относительно интактных образцов (рис 11)

Таким образом, увеличение времени термостатирования образцов Т-клеток до 24 ч снижает активность фермента в 1,95 раза Внесение в реакционную смесь цитокина способствует еще большему падению регистрируемого показателя В результате в клетках будет накапливаться стабильная и токсичная форма АФК - пероксид водорода (Артюхов В Г , Наквасина М А , 2000), являющаяся субстратом для каталазы В свою очередь, это приведет к интенсификации процессов ПОЛ в мембранах Т-лимфоцитов

Следующим этапом нашей работы стала оценка влияния 1 и 24 ч инкубации Т-лимфоцитов крови человека с препаратом а-интерферона (0,01 - 100 ME/мл) на активность супероксиддисмутазы в их лизатах

В нативном состоянии СОД-активность лимфоцитарных клеток составила 0,55 ± 0,05 отн ед (рис 12)

Модификация Т-лимфоцитов исследуемым иммуномодулятором в концентрациях 0,1 - 100 ME/мл в течение 1 ч приводила к повышению активности супероксиддисмутазы на 94 - 137 % относительно контроля (1,06 ± 0,04, 0,71 ± 0,09, 0,86 ± 0,09 и 1,30 ± 0,19 отн ед соответственно)

При увеличении времени термостатирования образцов до 24 ч активность исследуемого фермента снижалась до 0,39 ±0,18 отн ед , однако, ее отличие от таковой для

Л, МКМОЛЬ/Л -мин

40,0 36,0 32,0 28,0 24,0 20,0

НИ

Рис. 10. Активность каталазы в лизатах нативных и инкубированных с а-интерферо-ном в течение 1 ч Т-лим-фоцитов

щь 0,01

А. мкмоль/л-мпн

100 [интерферон],

МЕ/мл

14,00 12,00 10,00 8.00 6,00 4,00 2,00 0.00

Рис. 11. Активность каталазы в лизатах нативных и инкубированных с а-интерферо-ном в течение 24 ч Т-лим-фоцитов

контроль 0,01

0,1

Л, отн. ед. 1.60 г-

100 [интерферон], МЕ/мл

1,20

0,40

Рис. 12. СОД-активность лизатов нативных и инкубированных в течение 1 ч с а-интерфероном Т-лимфоцитов

контроль 0.01

0,1

100 [интерферон], МЕ/мл

клеток, проинкубированных при 37 °С в течение 1 часа, было статистически не достоверно (рис 13). Инкубирование клеток с цитокином в концентрациях 10 и 100 МЕ/мл приводило к увеличению регистрируемого показателя до величин 0,88 ± 0,04 и 1,38 ± 0,09 отн. ед. соответственно.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что продолжительное воздействие а-интерферона на Т-лимфоциты (24 ч термостатирование) способствует снижению активности каталазы, сопровождающемуся повышением активности СОД. Значительное увеличение каталитической активности последней вызовет накопление в лимфоцитах гидропероксидов, которые, в свою очередь, будут активировать ПОЛ в клеточных мембранах, что мы и наблюдали при регистрации ЛЗХЛ Т-лимфоцитов после воздействия на них а-интерферона.

А, отн. сл. 1,60|-

1,21)

0,80

0,40

0,00

Рис. 13. СОД-активность лизатов нативных и инкубированных в течение 24 ч с а-интерфероном Т-лимфоцитов

100 ¡шперферон], МЕ/мл

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА И УФ-ИЗЛУЧЕНИЯ НА УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ СО 3 КОМПОНЕНТА Т-КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА И СО 4 МАРКЕРА НА ПОВЕРХНОСТИ МЕМБРАН Т-ЛИМФОЦИТОВ

С целью исследования возможности совместного применения АУФОК- и цитоки-нотерапии нами были проведены модельные эксперименты по изучению влияния натив-ного и УФ-облученного интерферона на экспрессию СО 3 комплексов и СО 4 маркеров нативными и фотомодифицированньши лимфоцитами крови человека

Опыты были проведены на Т-лимфоцитах крови 15 доноров, которые по характеру изменения уровня экспрессии СО 3 комплексов в ответ на воздействие а-интерферона были отнесены нами ранее ко второй группе доноров (см. главу 3).

Уровень экспрессии СОЗ комплексов на поверхности мембран нативных Т-клеток составил 0,203 ± 0,003 ед. опт. пл.

Термостатирование клеток с а-интерфероном в диапазоне концентраций 0,01 т 100 МЕ/мл увеличивало уровень ИФА-сигнала на 16-76 % относительно контроля во всем диапазоне используемых концентраций цитокина.

Облучение Т-лимфоцитов УФ-светом в терапевтической дозе (151 Дж/м2) повышало количество изучаемых антигенов на мембранах Т-клеток до величины 0,235 ± 0,005 ед. опт. пл. (рис. 14) Последующая инкубация фотомодифицированных лимфоцитов с а-интерфероном в концентрациях I и 10 МЕ/мл способствовала снижению уровня экспрессии СОЗ комплексов на 15 и 20 % , а в концентрации 100 МЕ/мл - увеличению количества данного антигена на 26 % по сравнению с облученными Т-лимфоцитами. Модификация УФ-облученных клеток цитокипом в концентрациях 0,01 и 0,1 МЕ/мл не приводила к статистически достоверным отличиям по сравнению с облученными образцами.

Поскольку в молекулах всех подтипов а-интерферона на долю ароматических и серосодержищих аминокислотных остатков, которые могут выступать в качестве потенциальных акцепторов УФ-излучения, приходится от 1 1 до 14%, то в процессе проведения АУФОК-терапии эти белки претерпевают цепь сложных фотохимических превращений, затрагивающих все уровни пространственной организации белковой глобулы и изменяющих их конформацию и способность взаимодействовать с мембранными структурами иммунокомпетентных клеток. В связи с этим нами было исследовано влияние УФ-облученного в дозах 151 + 1359 Дж/м* а-интерферона на уровень экспрессии СО 3 комплексов Т-лимфоцитами крови.

Количество исследуемых антигенных детерминант на поверхности мембран натив-ных 1-клеток равнялось 0,203 ± 0.003 ед. опт. пл.

Инкубация Т-клеток с нативным интерфероном во всем диапазоне концентраций приводила к увеличению уровня экспрессии СОЗ комплексов на поверхности мембран от 0.236 ± 0.002 сд. опт. пл. до 0,358 ± 0,009 ед. опт. пл.

Было установлено, что внесение в суспензию лимфоцитов облученного УФ-свегом в дозе 151 Дж/м2 а-интерферона в концентрациях 0.01 - 10 МЕ/мл вызывало повышение экспрессии СИЗ комплексов от 10 до 25 % по сравнению с лимфоцитами, модифицированными нативным а-интерфероном в тех же концентрациях (рис. 15).

Следующим этапом работы явилось исследование влияния фотомодифицирован-ного а-интерферона на экспрессию СО 3 комплексов УФ-облученными Т-лимфоцитами крови человека. Результаты проведенных экспериментов представлены на рис. 16.

Рис. 14. Динамика изменения уровня экспрессии СО 3 маркеров нативными и фо-томодифицированными Т-лимфоцитами крови человека, инкубированными с а-иитерфероном

Рис. 15. Динамика изменения уровня экспрессии СО 3 маркеров Т-лимфоцитами крови человека, инкубированными с УФ-облученным а-интерфероном

Уровень экспрессии СОЗ комплексов на поверхности мембран нативных Т-клеток составил 0.203 ± 0.003 сд. опт. пл.

Было установлено, что термостатирование лимфоцитов, модифицированных малой дозой УФ-света (151 Дж/м2) с интерфероном (0.01; 10 и 100 МЕ/мл), облученным той же дозой, снижало уровень экспрессии СОЗ комплексов на 13, 22 и 7 % соответственно по сравнению с облученными клетками.

Для расширения представлений о совместном влиянии УФ-излучения и а-интсрферона на механизмы регуляции протекания иммунных реакций нами была проведена оценка количественного содержания молекул СО 4 антигенов, экспрессированных на поверхности мембран субпопуляции 'Г-хелперов, и выполняющих функцию корецеп-тора Т-клеточного рецептора для ан тигена.

Уровень экспрессии СО 4 маркеров на поверхности мембран нативных Т-клеток составил 0,203 ± 0,008 ед. опт. пл. Инкубация Т-клеток с а-интерфероном в диапазоне концентраций 0,01 - 1 МЕ/мл вызывала повышение оптической плотности исследуемых образцов на 17 - 22 % относительно контроля. Максимальная, из используемых нами концентраций интерферона - 100 МЕ/мл, снижала уровень экспрессии С04 антигенов на 23 %. При модификации клеток цитокином в концентрации 10 МЕ/мл не было выявлено статистически достоверных отличий (рис. 17).

При облучении Т-лимфоцитов УФ-светом в дозе 151 Дж/м количество изучаемых

антигенов на мембранах Т-клеток повышалось на 22 % и составило 0,247 ±0.012 ед. опт. пл. Последующая инкубация фотомодифицированных Г-лимфоцитов с интерфероном в концентрациях 0.1 и 1 МЕ/мл приводила к повышению уровня экспрессии С04 антиге-

Рис. 16. Динамика изменения уровня экспрессии СО 3 маркеров нативными и фо-томодифинированными Т-лимфоцитами крови человека, инкубированными с УФ-облученным и-иптерфероном

Рис. 17. Динамика изменения уровня экспрессии СО 4 маркеров нативными и фо-томодифицированными Т-лимфоцитами крови человека, инкубированными с а-интерфероном

нов на 21 и 12 % соответственно. Модификация УФ-облученных клеток цитокином в концентрациях 0.01: 10 и 100 МЕ/мл не вызывала статистически достоверных отличий исследуемого показателя от такового у облученных Т-клеток.

Аналогично исследованиям с СОЗ комплексами, нами была проведена серия экспериментов по изучению влияния препарата человеческого лейкоцитарного интерферона, облученного УФ-светом (240-390 им) в дозах 151, 453. 906 и 1359 Дж/м2. на уровень экспрессии С04 антигенов на поверхности нативных Т-лимфоцитов крови человека.

Было выявлено, что облученный малой дозой УФ-света(151 Дж/м") интерферон в концентрациях 0.01-10 МЕ/мл снижает на 18-19 %, а в концентрации 100 МЕ/мл - па-оборот, повышает экспрессию С134 антигенов по сравнению с лимфоцитами, модифицированными нативным а-интсрфероном на 24 % (рис. 18).

Завершающим этапом нашего исследования было изучение уровня экспрессии СО 4 комплексов на поверхности мембран фотомодифицированных Т-лимфоцигов крови человека, инкубированных с УФ-облученным в тех же дозах а-интерфероном.

Было установлено, что взаимодействие лимфоцитов, модифицированных УФ-свегом в дозе 151 Дж/м2, с интерфероном (0.01. 1 100 МЕ/мл), облученным такой же дозой, сопровождалось снижением уровня экспрессии С04 антигенов на поверхности I -клеток от 12 до 41 % (рис. 19).

Для сопоставления характера изменения уровня экспрессии СО 3 и СО 4 маркеров на поверхности мембран УФ- и цигокинмодифицированных лимфоцитов нами были рассчитаны коэффициенты корреляции. Положительные значения коэффициента корреляции при взаимодействии УФ-облученны\ в дозах 453 и 906 Дж/м2 клеток с цитокином (0.889 и 0.480 соответственно) указывают на высокую и среднюю степень прямой зависимости между исследуемыми параметрами. 11одобную картину мы наблюдали и при действии подвергнутого УФ-облучению в дозах 453 и 906 Дж/м2 препарата и-интерферона на нативиые лимфоциты (0.536 и 0.642).

В случае инкубации лимфоцитов с а-интерфероном после их фотомодификации одинаковыми дозами УФ-света положительная корреляция изменения уровня экспрес-

Рис. 18. Динамика изменения уровня экспрессии СО 4 маркеров Т-лимфоцитами крови человека, инкубированными с УФ-облученным а-интерфероном

Рис. 19. Динамика изменения уровня экспрессии СО 4 маркеров нативными и фо-томодифицированными Т-лимфоцитами крови человека, инкубированными с УФ-облуче! I ] 1ым а-и Iггерфероном

сии исследуемых маркеров равная 0,605 была выявлена при использовании дозы УФ-света, равной 151 Дж/м2. В остальных случаях имеет место отрицательная обратная зависимость между числом СО 3 и СО 4 молекул на поверхности мембран Т-лимфоцитов, свидетельствующая о частичной компенсации повышения или снижения активности ТСЯ за счет вспомогательной корецепторной молекулы СО 4. которая регулирует пороговое значение количества антигена, необходимого для успешной активации Т-клеток и запуска иммунных процессов, направленных на его элиминацию из организма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью методов непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, лю-минолзависимой хемилюмипесцепции, определения каталитической активности некоторых ферментов антиоксидантной защиты (СОД и каталаза) исследовано влияние препарата человеческого лейкоцитарного а-интерферона (0,01 100 МЕ/мл) на структурно-функциональное состояние Т-лимфоцитов крови человека.

В ходе работы была установлена концентрационная зависимость изменения уровня экспрессии некоторых антигенных детерминант на поверхности мембран Т-лимфоцитов от содержания а-интерферона в инкубационной среде.

Показано, что исследуемый цитокин в диапазоне концентраций 0,01 -ь 100 МЕ/ мл оказывает иммунокорригирующее действие на экспрессию СО 2 маркеров Т-клетками. проявляющееся в увеличении данного показателя у образцов с исходно низкими значениями и. наоборот, снижении исследуемого параметра у образцов клеток с исходно высоким уровнем изучаемого антигена, тем самым внося существенный вклад в интенсивность протекания иммунных процессов в организме человека вследствие изменения адгезионных свойств молекул СО 2 исследуемых иммунокомнетентных клеток.

При изучении экспрессии СЭ 3 маркеров Т-лимфоцитами крови человека в присутствии а-интерферона были выявлены иные закономерности. Так, применение ци-токина в концентрациях 0,01 и 0,1 МЕ/мл вызывало повышение количества исследуемых антигенных детерминант на поверхности мембран Т-клеток всех обследованных доноров. Увеличение содержания иммуномодулятора в инкубационной среде до 1 МЕ/мл

приводило к подобному эффекту только у доноров 2 и 3 групп с исходно средним и высоким показателями уровня CD 3-экспрессии Максимальные, из используемых нами, концентрации а-интерферона (10 и 100 ME/мл) оказывали иммунокорригирую-щее действие на уровень CD 3 маркеров на мембранах Т-лимфоцитов доноров этих двух групп

Выявлено, что малые концентрации модификатора (0,1-1 ME/мл) способствовали повышению экспрессии CD 4 и CD 8 маркеров Т-лимфоцитами, что, по-видимому, повысит эффективность функционирования Т-клеточного рецептора для антигена Увеличение содержания а-интерферона в инкубационной среде до 100МЕ/мл вызывало обратный эффект количество вспомогательных корецепторных молекул на поверхности иммуно-компетентных клеток снижалось Согласно данным литературы (Ярилин А А, 1999), это будет способствовать росту пороговой концентрации антигена, необходимой для активации TCR

Однонаправленные изменения в сторону возрастания уровня экспрессии изучаемого антигена были установлены нами при определении количества CD 7 маркеров на мембранах Т-лимфоцитов, модифицированных цитокином в концентрациях 0,1 -10 МЕ/мл

Анализ изменения уровня экспрессии Fc-рецепторов на мембранах Т-клеток под действием а-интерферона выявил схожесть характера ответной реакции клеток на внесение различных концентраций модификатора, определяющегося исходным уровнем данного мембранного маркера

Таким образом, проведенные нами исследования свидетельствуют о влиянии цито-кина на изменение содержания ключевых мембранных маркеров (CD 2, CD 3, CD 4, CD 7, CD 8 и FcR) на поверхности обследованных лимфоидных клеток Последнее, вероятно, найдет отражение в изменении функциональной активности Т-клеток специфическом распознавании чужеродных антигенов Т-лимфоцитами, процессов межклеточного взаимодействия, связывании иммуноглобулиноподобных рецепторов и антителозависи-мой цитотоксичности

Причиной изменения экспрессии антигенных детерминант на поверхности мембран Т-лимфоцитов при взаимодействии молекулы интерферона с рецептором может выступить возникновение транскрипционного сигнала в клетке (активация цитоплазматических факторов STATla/b и STAT2, образование транскрипционного фактора ISGF3, активация ти-розинкиназ Jak 1 и Тук 2) Это будет вызывать усиление синтеза ряда белков в клетке, в том числе, вероятно, и исследуемых нами трансмембранных белков За периодом активации транскрипции следует резкое угнетение биосинтетической активности, вызванное активацией эндорибонуклеаз и сопровождающееся снижением содержания суммарной мРНК

Данные, полученные при исследовании активности каталазы и супероксиддисму-тазы Т-клеток после их модификации а-интерфероном, позволяют предположить, что при длительных инкубациях Т-лимфоцитов с цитокином в диапазоне концентраций 0,01 - 100 ME/мл происходит разобщение ферментативного звена антиоксидантной защиты, способствующее накоплению в клетке АФК и активации процессов ПОЛ Об усилении интенсивности протекания этих процессов в клетках свидетельствует возрастание значений максимальной интенсивности и светосуммы, обнаруженное нами при регистрации хемилюминесцентных свойств Т-лимфоцитов крови человека после их инкубации с цитокином Следует учитывать, что активация свободнорадикальных процессов в мембранах может способствовать изменению сродства рецепторных молекул к их лигандам вследствие нарушения баланса связей, поддерживающих нативную конформацию макромолекулы, обусловленного изменением их локального микроокружения, вызванного

окислительной деструкцией липидов, образованием ковалентных сшивок соседних липид-ных молекул и модификацией липидного состава мембран

На основании литературных и собственных экспериментальных данных нами была предложена схема возможных механизмов действия а- интерферона на структурно-функциональное состояние Т-лимфоцитов крови человека (рис 20)

Исследование комбинированного воздействия препарата человеческого лейкоцитарного а-интерферона (0,01 - 100 МЕ/мл) и УФ-излучения (240-390 нм) в дозах 151 -1359 Дж/м2 на экспрессию СБ 3 и СБ 4 маркеров Т-лимфоцитами крови человека позволило установить следующее

Облучение Т-клеток УФ-светом в малых и средних дозах (151 - 906 Дж/м2) индуцирует возрастание, а в большой дозе 1359 Дж/м2 - снижение количества СБЗ комплексов на их поверхности Введение а-интерферона (0,01 - 100 МЕ/мл) в суспензии фотомо-дифицированных в дозе 1359 Дж/м2 лимфоцитов нивелирует иммунодепрессивное действие этой дозы УФ-излучения и вызывает увеличение уровня экспрессии СБ 3 комплексов на поверхности мембран облученных Т-лимфоцитов, тем самым способствуя восстановлению и многократному повышению их функциональной активности

Несмотря на то, что индивидуальное использование для модификации иммуноком-петентных клеток УФ-света или лекарственного препарата (человеческий лейкоцитарный а-интерферон) оказывает иммуностимулирующее влияние на экспрессию СБ 3 комплексов Т-лимфоцитами, их сочетанное воздействие может нивелировать действие друг друга Это необходимо учитывать в клинической практике при назначении больным цитокинов группы интерферонов после проведения сеансов АУФОК-терапии

Изучение влияния фотомодифицированного интерферона на антигекраспознаю-щую функцию нативных и фотомодифицированных в тех же дозах Т-лимфоцитов выявило, что ответная реакция СБ 3 комплексов и СБ 4 корецептора на воздействие фотомодифицированного интерферона (0,01 - 10 МЕ/мл) противоположна Так, облученные малой дозой УФ-света (151 Дж/м2) молекулы интерферона оказывают разнонаправленное действие на мембраны Т-лимфоцитов происходит увеличение уровня экспрессии СБЗ комплексов и снижение экспрессии С'04 антигенов Инкубация лимфоцитов с ци-токином в концентрациях 1 и 10 МЕ/мл, модифицированным УФ-светом в дозах 453 и 906 Дж/м2, приводит к снижению экспрессии СИЗ комплексов и увеличению экспрессии СБ 4 антигенов Таким образом, УФ-облученный а-интерферон в концентрациях 1 и 10 МЕ/мл оказывает иммуномодулирующее действие на уровень экспрессии изучаемых антигенов

После инкубации интерферона (0,01 МЕ/мл), облученного УФ-светом в дозах 151 и 453 Дж/м2, с фотомодифицированными теми же дозами Т-лимфоцитами количество СБ 3 комплексов на поверхности иммунокомпетентных клеток снижалось до контрольных показателей, т е воздействие вышеуказанной концентрации цитокина полностью нивелировало иммуностимулирующий эффект УФ-излучения

Инкубация лимфоцитов, модифицированных большими дозами УФ-света (906 и 1359 Дж/м2), с интерфероном, облученным теми же дозами ультрафиолета во всем используемом диапазоне концентраций (0,01 - 100 МЕ/мл), приводила к увеличению уровня экспрессии СБЗ комплексов по сравнению с таковыми для облученных без цитокина Т-клетками

Наблюдаемый эффект определяется концентрацией фотомодифицированного а-интерферона, поэтому при проведении АУФОК-терапии необходимо учитывать уровень цитокинов, находящихся в сыворотке крови больных, т к от их концентрации зависит конечный результат воздействия квантов УФ-света на состояние мембран иммунокомпе-

Рис 20 Схема процессов, протекающих при действии а-интерферона на Т-лимфоциты крови человека Обозначения ИКК - иммунокомпетентные клетки, АОС - антиоксидантная система, СОД - супероксиддисмутаза

тентных клеток, а, следовательно, и их способность выполнять свои иммунологические функции

Основным механизмом, приводящим к фотоиндуцируемым перестройкам рецеп-торного материала, являются процессы ПОЛ и ПФОЛ, накопление АФК и токсичных продуктов, что способствует частичной деструкции биомембраны и фотоапьтерации гликокаликса, то есть десорбции антигенных детерминант с клеточной поверхности и демаскировке предсуществующих в толще мембраны антигенных структур, ранее не доступных для определения

Таким образом, уровень экспрессии изучаемых рецепторов на мембранах Т-лимфоцитов в условиях проведенных экспериментов находится в сложной зависимости от применяемых модификаторов Он определяется как дозой УФ-света, так и концентрацией а-интерферона

Изменение состояния компонентов иммунной системы вследствие УФ-модификации неизбежно будет отражаться на их функциональной активности (степень ответа на чужеродный антиген, дифференцировка и пролиферация лимфоцитов, кооперативные взаимодействия иммунокомпетентных клеток, процессы антителозависимой клеточной цитотоксичности и др )

В связи с этим открываются широкие перспективы для регуляции активности Т-клеточного звена иммунитета комбинированным действием УФ-излучения и естественных модуляторов (а-интерферон), так как фотомодификация крови может способствовать повышению эффективности цитокинотерапии при лечении патологий различной степени тяжести и снижению вероятности развития отрицательных побочных эффектов

Полученные нами данные о влиянии УФ-света и а-интерферона на уровень экспрессии СОЗ комплексов и С04 антигенов, отражающих антигенраспознающую способность Т-лимфоцитов крови человека, имеют важное значение в клинической практике для прогноза ожидаемых эффектов при совместном проведении АУФОК- и цитокинотерапии у больных с различной патологией

ВЫВОДЫ

1 Обнаружено иммунокорригирующее действие различных концентраций а-интерферона на экспрессию СО 2 маркеров (0,01 - 100 МЕ/мл) и на экспрессию СО 3 комплексов (10 - 100 МЕ/мл) на поверхности мембран Т-лимфоцитов

2 Показано иммуностимулирующее действие исследуемого цитокина на экспрессию СО 4 (0,01 - 1 МЕ/мл), СО 8 (0,1 - 1 МЕ/мл) и СО 7 маркеров (0,1 - 10 МЕ/мл) Т-лимфоцитами, эффект которого зависит от используемой концентрации а-интерферона

3 Характер зависимости изменения экспрессии РсЯ на мембранах Т-клеток под действием а-интерферона определяется исходным уровнем данного антигена чем меньше количество этих рецепторов располагается на Т-лимфоцитах, тем большие концентрации а-интерферона необходимы для достижения максимальной экспрессии данных рецепторов

4 Увеличение интенсивности ЛЗХЛ Т-лимфоцитов после 24 ч инкубации с а-интерфероном в диапазоне концентраций 0,01 - 100 МЕ/мл свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ и накоплении АФК в клетке

5 Установлена активация цитозольной супероксиддисмутазы после 1- и 24-часовой инкубации Т-лимфоцитов крови человека с препаратом а-интерферона (0,01 - 100 МЕ/мл)

6 Обнаружено значительное снижение активности каталазы в лизатах Т-лимфоцитов после суточной инкубации клеток с цитокином во всем используемом диапазоне концентраций (0,01 - 100 МЕ/мл)

7 Выявлено иммуностимулирующее действие УФ-излучения (240-390 нм) в дозах 151 - 906 Дж/м2 на экспрессию СО 3 комплексов и в дозах 151 - 1359 Дж/м2 на экспрессию СО 4 маркеров Т-лимфоцитами крови человека

8 Обнаружен эффект компенсирования уровня экспрессии СО 3 маркеров изменением количества корецепторных молекул СО 4 на поверхности мембран Т-клеток в условиях УФ-облучения (453 - 906 Дж/м2) и воздействия а-интерферона (0,01 -100 МЕ/мл)

9 Добавление а-интерферона (0,01, 1 - 100 МЕ/мл), облученного УФ-светом в дозе 151 Дж/м2, к фотомодифицированным в той же дозе Т-лимфоцитам снижает уровень экспрессии СО 3 комплексов и СО 4 маркеров

10 Проанализированные эффекты действия а-интерферона и УФ-света свидетельствуют о роли изучаемого цитокина и иммуномодулятора физической природы в формировании поверхностного фенотипа лимфоцитарной клетки, а, следовательно, и в регуляции ее функциональной активности

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1 * Путинцева О В , Колтаков И А , Артюхов В Г Изучение влияния человеческого лейкоцитарного интерферона на экспрессию CD 3 комплекса Т-лимфоцитами крови человека // Медицинская иммунология -2003 -Т 5, №3-4 - С 214

2 Артюхов В Г , Путинцева О В , Колтаков И А , Вдовина В А Иммуномодулирую-щее действие а-интерферона на экспрессию CD 3 комплексов Т-лимфоцитами крови человека // Материалы междисциплинарной (медицина, биология, физика, информатика, педагогика ) конференции с международным участием «Новые биокибернетические и телемеханические технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека» (23-25 июня 2003) - Петрозаводск, 2003 - С 49

3 Artukhov V G , Putintseva О V , Koltakov I A Effect of a-interferon on the chemolumi-nescence characteristic of T and В lymphocytes of human blood // Internation conference "Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health" (22-25 September 2003) - Smolensk, 2003 -P 94-95

4 Артюхов В Г , Путинцева О В , Колтаков И А Определение интерферон - чувствительности клеток иммунной системы человека методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа //Физиология и психофизиология мотиваций - Воронеж, 2003 -С 130-134

5 Артюхов В Г , Путинцева О В , Колтаков И А , Вдовина В А Изучение влияния человеческого лейкоцитарного интерферона на функциональную активность т-лимфоцитов крови человека // III Съезд биофизиков России (24 - 29 июня 2004) -Воронеж, 2003 -С 180-181

6 В Г Артюхов, О В Путинцева, И А Колтаков, В А Вдовина Модуляция а-интерфероном экспрессии некоторых CD - маркеров на поверхности мембран Т-лимфоцитов крови доноров // «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (6 - 8 октября 2004) - Минск, 2004 - С 132-134

7 Путинцева О В , Артюхов В Г, Колтаков И А , Вдовина В А Влияние УФ-

облученного a-интерферона на экспрессию CD 3 комплексов нативных т-лимфоцитов крови человека // IV Съезд фотобиологов России (26 - 30 сентября 2005) - Саратов, 2005 - С 165-166

8 Артюхов В Г, Путинцева О В , Колтаков И А, Вдовина В А Влияние УФ-иалучения на экспрессию CD3 комплексов мембранами Т-лимфоцитов // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов - Воронеж, 2005 -С 19-21

9 Артюхов В Г, Путинцева О В , Колтаков И А , Вдовина BAO влиянии препаратов лейкоцитарного интерферона на экспрессию CD 3 комплексов УФ-облученными Т-лимфоцитами крови человека // «Электромагнитные излучения в биологии» (октябрь 2005) - Калуга, 2005 - С 8-12

10 * Артюхов В Г , Путинцева О В , Колтаков И А , Вдовина В А Анализ влияния препарата человеческого лейкоцитарного a-интерферона на экспрессию некоторых CD-молекул Т-лимфоцитами // Гематология и трансфузиология - 2006 - Т 51,№3 -С 24-27

11 Колтаков И А , Артюхов В Г , Путинцева О В Экспрессия CD 3 маркеров на поверхности мембран Т-лимфоцитов в условиях их УФ-облучения// XX Съезд физиологического общества имени И П Павлова (4-8 июня 2007) Тезисы докладов - Москва, 2007 - С 273

12 Колтаков И А , Вдовина В А , Путинцева О В, Артюхов В Г Экспрессия CD 4 маркеров на поверхности мембран Т-лимфоцитов крови человека, модифицированных УФ-светом, a-интерфероном и их совместным воздействием // Материалы международной научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» Ростов-на-Дону (10-12 октября 2007) - Ростов-на-Дону, 2007 -С 120-122

Статьи № 1, 10 опубликованы в изданиях, соответствующих списку ВАК РФ

Подписано в печать 12 11 07 Формат 60*84'/|6 Уел печ л 1,4 Тираж 100 экз Заказ 2353

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издатетьско-полиграфического центра Воронежского государственного университета 394000, Воронеж, ул Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колтаков, Игорь Александрович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика лимфоцитов Т-популяции

1.1.1. Морфологические и функциональные особенности лимфоцитов

1.1.2. Особенности строения мембран лимфоцитов

1.1.3. Строение и функции некоторых мембранных маркеров лимфоцитов

1.2. Характеристика интерферонов

1.2.1. История открытия, современная классификация и данные о ^ структуре интерферонов

1.2.2. Молекулярные механизмы противовирусного действия ин-терферонов

1.2.3. Модулирующее действие интерферонов на функциональные свойства иммунокомпетентных клеток

1.3. Краткая характеристика УФ-излучения и его влияние на компоненты мембран клеток крови

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Выделение лимфоцитов Т- субпопуляции

2.2.2. Определение чистоты клеточных суспензий

2.2.3. Определение жизнеспособности лимфоидных клеток

2.2.4. Модификация лимфоцитов препаратом а-интерферона

2.2.5. Облучение суспензии Т-лимфоцитов

2.2.6. Комбинированное воздействие УФ-излучения и цитокинов ^ на Т-лимфоциты

2.2.7. Использование метода иммуноферментного анализа для определения экспрессии некоторых рецепторов на мембранах 44 Т-лимфоцитов

2.2.8. Регистрация люминолзависимой спонтанной хемилюминесценции Т-лимфоцитов крови человека

2.2.9. Получение супернатанта лимфоцитарных лизатов

2.2.10. Определение активности цитозольной каталазы лимфоци

2.2.11 Определение активности супероксиддисмутазы в лизатах

Т-лимфоцитов

2.2.12. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА НА АНТИГЕННЫЙ ПРОФИЛЬ ЛИМФОЦИТОВ КРО- 51 ВИ ЧЕЛОВЕКА

3.1. Исследование уровня экспрессии CD 2 рецепторов Т-лимфоцитов при действии а-интерферона

3.2. Исследование уровня экспрессии CD 3 комплексов Т-лимфоцитов при действии а-интерферона

3.3. Исследование уровня экспрессии CD 4 маркеров Т-лимфоцитов при действии а-интерферона

3.4. Исследование уровня экспрессии CD 8 маркеров Т-лимфоцитов при действии а-интерферона

3.5. Модуляция а-интерфероном экспрессии CD 7 маркеров на поверхности мембран Т-лимфоцитов крови человека

3.6. Влияние а-интерферона на экспрессию Fc-рецепторов Тлимфоцитами крови человека

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ПОЛ И НЕКОТОРЫЕ ПОКА

ЗАТЕЛИ АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА Т-ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

4.1. Исследование хемилюминесцентных свойств нативных и модифицированных а-интерфероном Т-лимфоцитов крови человека

4.2. Исследование активности цитозольной каталазы в лизатах нативных и модифицированных а-интерфероном Т-лимфоцитов

4.3. Исследование активности супероксиддисмутазы в лизатах нативных и модифицированных а-интерфероном Т-лимфоцитов

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА И УФ-ИЗЛУЧЕНИЯ НА УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ CD 3 КОМПОНЕНТА Т- 80 КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА И CD 4 МАРКЕРА НА ПОВЕРХНОСТИ МЕМБРАН Т-ЛИМФОЦИТОВ

5.1. Исследование уровня экспрессии CD3 комплексов на поверхности мембран нативных и УФ-облученных Т-лимфоцитов, инкубированных 81 с различными концентрациями а-интерферона

5.2. Исследование влияния УФ-облученных препаратов а-интерферона на экспрессию CD3 комплексов на поверхности мембран Т- 83 лимфоцитов

5.3. Исследование уровня экспрессии CD3 комплексов на поверхности мембран УФ-модифицированных Т-лимфоцитов крови человека, ин- 85 кубированных с УФ-облученным а-интерфероном

5.4. Исследование уровня экспрессии CD 4 антигенов на поверхности мембран нативных и УФ-модифицированных Т-лимфоцитов крови че- 87 ловека в присутствии различных концентраций а-интерферона

5.5. Исследование влияния УФ-облученного а-интерферона на экспрессию CD4 антигенов на поверхности мембран Т-лимфоцитов

5.6. Изменение уровня экспрессии CD4 антигенов на поверхности мембран УФ-модифицированных Т-лимфоцитов крови человека, инку- 91 бированных с УФ-облученным а-интерфероном

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов крови человека при модификации α-интерфероном и в условиях УФ-облучения"

Актуальность проблемы. В последнее время внимание исследователей направлено на изучение молекулярно-клеточных механизмов функционирования иммунной системы. Это связано с тем, что факторы иммунитета являются основными элементами поддержания гомеостаза организма человека [25].

Высокая чувствительность иммунокомпетентных клеток к действию разнообразных химических агентов обеспечивает тонкую регуляцию иммунной системы in vivo, а также возможность разработки новых способов лечения патологических состояний [26]. Однако наибольший интерес представляет выяснение механизмов саморегуляции, поскольку большое разнообразие естественных иммуномодуляторов (цитокины, гормоны, неспецифические регуляторы) и разнонаправленный эффект их влияния открывают широкие перспективы для иммунокорригирующей терапии [64].

В современной медицине получили широкое распространение естественные и генно-инженерные препараты интерферонов, применяемые не только для лечения и профилактики вирусных заболеваний (грипп, вирусный гепатит, герпес), бактериальных и протозойных инфекций, аллергозов, аутоиммунных заболеваний (ревматоидный артрит, гломерулонефрит и др.) и онкологических патологий, но и как иммуномодуляторы широкого спектра действия [26, 27, 37,44,45].

Тем не менее, несмотря на большие перспективы использования а-интерферона в клинической практике, необходимо решить проблемы, связанные с трудностью подбора максимально эффективных для каждого пациента концентраций, контроля реакции организма на введение цитокина и прогнозирования результатов лечения на ранних этапах.

Главным сдерживающим фактором широкого распространения интер-феронотерапии при лечении различных патологий являются побочные эффекты, развивающиеся при использовании высоких концентраций цитокина: гриппоподобный синдром, артралгии, миалгии, лейко- и тромбоцитопении, галлюцинации, расстройства периферической нервной системы [22, 25, 26, 38]. В связи с этим определенный практический интерес представляет разработка схем комбинированного использования интерферонов с другими лекарственными препаратами [37] или иммуномодуляторами физической природы (УФ-свет, лазерное излучение), позволяющими повысить биологическую эффективность его малых концентраций.

К настоящему времени накоплен значительный экспериментальный материал о влиянии на биообъекты различных диапазонов длин волн электромагнитных излучений, особое место среди которых занимает УФ-свет [18, 20, 21, 56, 58]. Большое количество работ, посвященных исследованию действия УФ-радиации, обусловлено широким внедрением в клиническую практику метода аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК-терапии). Установлено, что воздействие малых доз УФ-излучения на компоненты крови оказывает дезинтоксикационный и антивоспалительный эффекты [74], способствует модуляции уровня цитокинов [134], поверхностных антигенов [53, 145], сывороточных иммуноглобулинов [73].

Исследование механизмов, лежащих в основе действия УФ-света и а-интерферона, позволит расширить общие представления о строении и функционировании лимфоцитарных мембран в физиологических условиях и при экзогенных воздействиях.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось изучение структурно-функционального состояния мембран Т-лимфоцитов модифицированных а-интерфероном, УФ-светом и их комбинированным действием.

Изучение механизмов индивидуального и комбинированного действия а-интерферона и УФ света на структурно-функциональное состояние мембран Т-лимфоцитов.)

В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:

1. Изучить влияние препарата человеческого лейкоцитарного а-интерферона в диапазоне концентраций 0,01 -f 100 МЕ/мл на экспрессию ряда антигенных детерминант на поверхности мембран Т-лимфоцитов.

2. Оценить уровень интенсивности протекания процессов ПОЛ в мембранах Т-лимфоцитов в нативном состоянии и при модификации а-интерфероном.

3. Исследовать каталитическую активность ферментов антиоксидант-ной системы (супероксиддисмутазы и каталазы) лимфоцитов, инкубированных с а-интерфероном.

4. Изучить индивидуальное и комбинированное с а-интерфероном (0,01 -т-100 МЕ/мл) влияние УФ-света (151 -s- 1359 Дж/м ) на экспрессию CD 3 комплексов и CD 4 маркеров на мембранах Т-лимфоцитов крови человека.

Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным изучению структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов крови человека, показателем которого служило изменение уровня экспрессии ключевых мембранных маркеров CD 2, CD 3, CD 4, CD 7, CD 8, FcR, активности некоторых ферментов антиоксидантной защиты после воздействия а-интерферона.

Установлена связь между уровнем антигенных детерминант модифицированных интерфероном Т-лимфоцитов и протеканием процессов перок-сидного окисления липидов их мембран. Показано значительное усиление СОД-активности и снижение активности цитозольной каталазы при инкубировании Т-клеток с а-интерфероном, что свидетельствует о разобщении функционирования ферментативного звена антиоксидантной защиты и повышении интенсивности ПОЛ в клеточных мембранах под действием цито-кина.

Впервые был изучен характер изменения уровня экспрессии CD 3 комплексов и CD 4 маркеров на поверхности мембран Т-лимфоцитов крови человека в условиях комбинированного действия УФ-излучения и а-интерферона и выявлены основные закономерности изменения антигенрас-познающей способности Т-клеток.

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления об особенностях изменения структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов в условиях УФ-облучения и воздействия а-интерферона.

Изучение индуцированных а-интерфероном изменений уровня экспрессии CD 3 комплексов, CD 4 и CD 8 маркеров, за счет которых реализуется способность Т-лимфоцитов распознавать чужеродные антигены, важно при рассмотрении вопросов, связанных с вкладом отдельных субпопуляций клеток в реализацию иммунного ответа на чужеродное воздействие.

Данные, полученные при исследовании интенсивности протекания ПОЛ и активности некоторых ферментов антиоксидантной защиты в присутствие а-интерферона, могут быть использованы для оценки вклада деструктивных процессов в изменение антигенного профиля лимфоцитарных мембран.

Проведена оценка возможности совместного использования АУФОК-терапии и цитокинотерапии для лечения ряда патологических состояний.

Материалы работы могут быть использованы в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Иммунология», а также спецкурсов по фотохимии, фотофизике и фотоиммунологии компонентов крови. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами ВГУ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Междисциплинарной конференции с международным участием «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека» (Петрозаводск, 2003), на VII Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), на Международной конференции «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and Human health» (Смоленск, 2003), на VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004),> III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2004), на III Международной конференции «Электромагнитные излучения в биологии» (Калуга, 2005), IV Съезде фотобиологов России (Саратов, 2005), на XX Съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 2007), на Научных сессиях сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2006, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей и 6 тезисов, в том числе 2 статьи в печатных изданиях РАН и РАМН, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

На защиту выносятся следующие положения:

1. а-интерферон оказывает существенное влияние на формирование поверхностного фенотипа лимфоцитарной клетки, тем самым, принимая участие в регуляции ее функциональной активности.

2. а-интерферон вызывает разобщение функционирования ферментативного звена антиоксидантной защиты, способствуя усилению процессов ПОЛ в мембранах Т-лимфоцитов.

3. УФ-излучение в дозах 151 4- 1359 Дж/м и а-интерферон в концентрациях 0,01 100 МЕ/мл индуцируют значительные изменения уровня экспрессии CD 3 - комплексов и CD 4 маркеров Т-лимфоцитами крови человека, что существенным образом отражается на антигенраспознающей способности субпопуляции Т- клеток.

4. Схема регуляторных процессов, приводящих к изменению структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов в присутствии «-интерферона.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает 130 страниц машинописного текста, состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка использованных источников и приложения. Иллюстративный материал включает 31 рисунок и 4 таблицы. В «Приложении» - 7 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Колтаков, Игорь Александрович

101 выводы

1. Обнаружено иммунокоррнгнрующее действие различных концентраций а-интерферона на экспрессию CD 2 маркеров (0,01 ч- 100 МЕ/мл) и на экспрессию CD 3 комплексов (10 ч- 100 МЕ/мл) на поверхности мембран Т-лимфоцитов.

2. Показано иммуностимулирующее действие исследуемого цитокина на экспрессию CD 4 (0,01 ч- 1 МЕ/мл), CD 8 (0,1 ч- 1 МЕ/мл) и CD 7 маркеров (0,1 ч- 10 МЕ/мл) Т-лимфоцитами, эффект которого зависит от используемой концентрации а-интерферона.

3. Характер зависимости изменения экспрессии FcR на мембранах Т-клеток под действием а-интерферона определяется исходным уровнем данного антигена: чем меньше количество этих рецепторов располагается на Т-лимфоцитах, тем большие концентрации а-интерферона необходимы для достижения максимальной экспрессии данных рецепторов.

4. Увеличение интенсивности ЛЗХЛ Т-лимфоцитов после 24 ч инкубации с а-интерфероном в диапазоне концентраций 0,01 ч- 100 МЕ/мл свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ и накоплении АФК в клетке.

5. Установлена активация цитозольной супероксиддисмутазы после 1-й 24-часовой инкубации Т-лимфоцитов крови человека с препаратом а-интерферона (0,01 ч-100 МЕ/мл).

6. Обнаружено значительное снижение активности каталазы в лизатах Т-лимфоцитов после суточной инкубации клеток с цитокином во всем используемом диапазоне концентраций (0,01 ч-100 МЕ/мл).

7. Выявлено иммуностимулирующее действие УФ-излучения (240 -390 нм) в дозах 151ч- 906 Дж/м2 на экспрессию CD 3 комплексов и в дозах 151ч- 1359 Дж/м на экспрессию CD 4 маркеров Т-лимфоцитами крови человека

8. Обнаружен эффект компенсирования уровня экспрессии CD 3 маркеров изменением количества корецепторных молекул CD 4 на поверхности мембран Т-клеток в условиях УФ-облучения (453 906 Дж/м ) и воздействия а-интерферона (0,01 -г 100 МЕ/мл).

9. Добавление а-интерферона (0,01; 1 -f 100 МЕ/мл), облученного УФ-светом в дозе 151 Дж/м , к фотомодифицированным в той же дозе Т-лимфоцитам снижает уровень экспрессии CD 3 комплексов и CD 4 маркеров.

10. Проанализированные эффекты действия а-интерферона и УФ-света свидетельствуют о роли изучаемого цитокина и иммуномодулятора физической природы в формировании поверхностного фенотипа лимфоцитарной клетки, а, следовательно, и в регуляции ее функциональной активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью методов непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, люминолзависимой хемилюминесценции, определения каталитической активности некоторых ферментов антиоксидантной защиты (СОД и ка-талаза) исследовано влияние препарата человеческого лейкоцитарного а-интерферона (0,01 ч- 100 МЕ/мл) на структурно-функциональное состояние Т-лимфоцитов крови человека.

Показано, что исследуемый цитокин в диапазоне концентраций 0,01 ч-100 МЕ/мл оказывает иммунокорригирующее действие на экспрессию CD 2 маркеров Т-клетками, проявляющееся в увеличении данного показателя у образцов с исходно низкими значениями и, наоборот, снижении исследуемого параметра у образцов клеток с исходно высоким уровнем изучаемого антигена, тем самым, внося существенный вклад в интенсивность протекания иммунных процессов в организме человека, вследствие изменения адгезионных свойств молекул CD 2 исследуемых иммунокомпетентных клеток.

При изучении экспрессии CD 3 маркеров Т-лимфоцитами крови человека в присутствии си-интерферона были выявлены иные закономерности. Так, применение цитокина в концентрациях 0,01 и 0,1 МЕ/мл вызывало повышение количества исследуемых антигенных детерминант на поверхности мембран Т-клеток всех обследованных доноров. Увеличение содержания иммуномодулятора в инкубационной среде до 1 МЕ/мл приводило к подобному эффекту только у доноров 2 и 3 групп с исходно средним и высоким показателями уровня CD 3-экспрессии. Максимальные, из используемых нами, концентрации а-интерферона (10 и 100 МЕ/мл) оказывали иммунокорригирующее действие на уровень CD 3 маркеров на мембранах Т-лимфоцитов доноров этих двух групп.

Выявлено, что малые концентрации модификатора (0,1 - 1 МЕ/мл) способствовали повышению экспрессии CD 4 и CD 8 маркеров Т-лимфоцитами, что, по-видимому, повысит эффективность функционирования Т-клеточного рецептора для антигена. Увеличение содержания а-интерферона в инкубационной среде до 100 МЕ/мл вызывало обратный эффект: количество вспомогательных корецепторных молекул на поверхности иммунокомпетентных клеток снижалось. Согласно данным литературы [95], это будет способствовать росту пороговой концентрации антигена, необходимой для активации TCR.

Однонаправленные изменения в сторону возрастания уровня экспрессии изучаемого антигена было установлено нами при определении количества CD 7 маркеров на мембранах Т-лимфоцитов, модифицированных цито-кином в концентрациях 0,1-10 МЕ/мл.

Анализ изменения уровня экспрессии Fc-рецепторов на мембранах Т-клеток под действием а-интерферона показал наличие сложного характера ответной реакции клеток на внесение различных концентраций модификатора, определяющегося исходным уровнем данного мембранного маркера.

Таким образом, проведенные нами исследования свидетельствуют о влиянии цитокина на изменение содержания ключевых мембранных маркеров (CD 2, CD 3, CD 4, CD 7, CD 8 и FcR) на поверхности обследованных лимфоидных клеток. Последнее, вероятно, найдет отражение в изменении функциональной активности Т-клеток: специфическом распознавании чужеродных антигенов Т-лимфоцитами, процессов межклеточного взаимодействия, связывании иммуноглобулиноподобных рецепторов и антителозависи-мой цитотоксичности.

Причиной изменения экспрессии антигенных детерминант на поверхности мембран Т-лимфоцитов при взаимодействии молекулы интерферона с рецептором может выступить возникновение транскрипционного сигнала в клетке (активация цитоплазматических факторов STATla/p и STAT2, образование транскрипционного фактора ISGF3, активация тирозинкиназ Jak 1 и Тук 2). Это будет вызывать усиление синтеза ряда белков в клетке, в том числе, вероятно, и исследуемых нами трансмембранных белков. За периодом активации транскрипции следует резкое угнетение биосинтетической активности, вызванное активацией эндорибонуклеаз и сопровождающееся снижением содержания суммарной иРНК [7].

Данные, полученные при исследовании активности каталазы и супер-оксиддисмутазы Т-клеток после их модификации а-интерфероном, позволяют предположить, что при длительных инкубациях Т-лимфоцитов с цитоки-ном в диапазоне концентраций 0,01 ч- 100 МЕ/мл происходит разобщение ферментативного звена антиоксидантной защиты, способствующее накоплению в клетке АФК и активации процессов ПОЛ. Об усилении интенсивности протекания этих процессов в клетках свидетельствует возрастание значений максимальной интенсивности и светосуммы, обнаруженное нами при регистрации хемилюминесцентных свойств Т-лимфоцитов крови человека после их инкубации с цитокином. Следует учитывать, что активация свободноради-кальных процессов в мембранах может способствовать изменению сродства рецепторных молекул к их лигандам вследствие нарушения баланса связей, поддерживающих нативную конформацию макромолекулы, обусловленного изменением их локального микроокружения, вызванного окислительной деструкцией липидов, образованием ковалентных сшивок соседних липидных молекул и модификацией липидного состава мембран.

Рис. 31. Схема процессов, протекающих при действии а-интерферона на Т-лимфоциты крови человека. Обозначения: ИКК — иммунекомпетентные клетки; АОС — антиоксидантная система; СОД - супероксиддисмутаза

Исследование комбинированного воздействия препарата человеческого лейкоцитарного а-интерферона (0,01 ч- 100 МЕ/мл) и УФ-излучения (240-390 нм) в дозах 151 ч- 1359 Дж/м2 на экспрессию CD 3 и CD 4 маркеров Т-лимфоцитами крови человека позволило установить следующее.

Облучение Т-клеток УФ-светом в малых и средних дозах (151 ч- 906

2 2 Дж/м ) индуцирует возрастание, а в большой дозе 1359 Дж/м - снижение количества CD3 комплексов на их поверхности. Введение а-интерферона (0,01-100 МЕ/мл) в суспензии фотомодифицированных в дозе 1359 Дж/м лимфоцитов нивелирует иммунодепрессивное действие этой дозы УФ-излучения и вызывает увеличение уровня экспрессии CD3 комплексов на поверхности мембран облученных Т-лимфоцитов, тем самым способствуя восстановлению и многократному повышению их функциональной активности.

Несмотря на то, что индивидуальное использование для модификации иммунокомпетентных клеток УФ-света или лекарственного препарата (человеческий лейкоцитарный а-интерферон) оказывает иммуностимулирующее влияние на экспрессию CD3 комплексов Т-лимфоцитами, их сочетанное воздействие может нивелировать действие друг друга. Это необходимо учитывать в клинической практике при назначении больным цитокинов группы интерферонов после проведения сеансов АУФОК-терапии.

Изучение влияния фотомодифицированного интерферона на антиген-распознающую функцию нативных и фотомодифицированных в тех же дозах Т-лимфоцитов выявило, что ответная реакция CD 3 комплексов и CD 4 коре-цептора на воздействие фотомодифицированного интерферона (0,01 - 10 МЕ/мл) противоположна. Так, облученные малой дозой УФ-света (151 Дж/м) молекулы интерферона оказывают разнонаправленное действие на мембраны Т-лимфоцитов: происходит увеличение уровня экспрессии CD3 комплексов и снижение экспрессии CD4 антигенов. Инкубация лимфоцитов с цитокином в концентрациях 1 и 10 МЕ/мл, модифицированным УФ-светом в дозах 453 и 906 Дж/м2, приводит к снижению экспрессии CD3 комплексов и увеличению экспрессии CD 4 антигенов. Таким образом, УФ-облученный а-интерферон в концентрациях 1 и 10 МЕ/мл оказывает иммуномодулиующее действие на уровень экспрессии изучаемых антигенов.

После инкубации интерферона (0,01 МЕ/мл), облученного УФ-светом в дозах 151 и 453 Дж/м2, с фотомодифицированными теми же дозами Т-лимфоцитами, количество CD 3 комплексов на поверхности иммунокомпе-тентных клеток снижалось до контрольных показателей, т.е. воздействие вышеуказанной концентрации цитокина полностью нивелировало иммуностимулирующий эффект УФ-излучения.

Инкубация лимфоцитов, модифицированных большими дозами УФ-света (906 и 1359 Дж/м2), с интерфероном, облученным теми же дозами ультрафиолета во всем используемом диапазоне концентраций (0,01-100 МЕ/мл) приводила к увеличению уровня экспрессии CD3 комплексов по сравнению с таковыми для облученных без цитокина Т-клетками.

Наблюдаемый эффект определяется концентрацией фотомодифициро-ванного а-интерферона, поэтому при проведении АУФОК-терапии необходимо учитывать уровень цитокинов, находящихся в сыворотке крови больных, т.к. от их концентрации зависит конечный результат воздействия квантов УФ-света на состояние мембран иммунокомпетентных клеток, а, следовательно, и их способность выполнять свои иммунологические функции.

Основным механизмом, приводящим к фотоиндуцируемым перестройкам рецепторного материала, являются процессы ПОЛ и ПФОЛ, накопление АФК и токсичных продуктов, что способствует частичной деструкции биомембраны и фотоальтерации гликокаликса, то есть десорбции антигенных детерминант с клеточной поверхности и демаскировки предсуществующих в толще мембраны антигенных структур, ранее не доступных для определения [125].

Таким образом, уровень экспрессии изучаемых рецепторов на мембранах Т-лимфоцитов в условиях проведенных экспериментов находится в сложной зависимости от применяемых модификаторов. Он определяется как дозой УФ-света, так и концентрацией а-интерферона.

Изменение состояния компонентов иммунной системы, вследствие УФ-модификации, неизбежно будет отражаться на их функциональной активности (степень ответа на чужеродный антиген, дифференцировка и пролиферация лимфоцитов, кооперативные взаимодействия иммунокомпетент-ных клеток, процессы антителозависимой клеточной цитотоксичности и др.).

В связи с этим открываются широкие перспективы для регуляции активности Т-клеточного звена иммунитета комбинированным действием УФ-излучения и естественных модуляторов (а-интерферон), так как использование фотомодификации крови может способствовать повышению эффективности цитокинотерапии при лечении патологий различной степени тяжести и снижению вероятности развития отрицательных побочных эффектов.

Полученные нами данные о влиянии УФ-света и а-интерферона на уровень экспрессии CD3 комплексов и CD4 антигенов, отражающих анти-генраспознающую способность Т-лимфоцитов крови человека, имеют важное значение в клинической практике для прогноза ожидаемых эффектов при совместном проведении АУФОК- и цитокинотерапии у больных с различной патологией.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колтаков, Игорь Александрович, Воронеж

1. Алферов В.П. Система интерферона и интерферонотерапия: новые возможности и перспективы / В.П. Алферов, Р.Ю. Ариненко, В.Б. Аникин // Рос. сем. врач. 1998. -№1. - С. 35-41.

2. Антитела. Методы / под ред. Д. Кэтти: В 2-х кн. М.: Мир, 1991. -Кн. 2.-380 с.

3. Артюхов В.Г. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина. Воронеж, Изд-во ВГУ, 2000. - 296 с.

4. Артюхов В.Г. Биофизика / В.Г. Артюхов, Т.А. Ковалева, В.П. Шмелев. -Воронеж: Изд-во ВГУ, 1994. 336 с.

5. Афанасьев Ю.И. Гистология / под ред. Ю.И. Афанасьева, И.А. Юриной. -М.: Медицина, 1999. 744 с.

6. Бажан С.И. Молекулярно-генетические аспекты индукции противовирусного действия интерферонов / С.И. Бажан, О.Е. Белова // Вестник РАМН. 1998. -№3.~ С. 18-24.

7. Безвершенко И.А. Рецептор тимоцитов, взаимодействующий с эритроцитами и Fc-фрагментами IgG / И.А. Безвершенко, Л.М. Быкова, А.Л. Синельникова // Бюлл. эксперимент, биологии и медицины. 1980. -№10.-С. 451-453.

8. Борисов Jl.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л.Б. Борисов. М.: ООО "Мед. информ. агенство", 2001. - 736 с.

9. Бородин Ю.И. Функциональная морфология иммунной системы / Ю.И. Бородин, В.Н. Григорьев, А.Ю. Летягин. Новосибирск: Наука, 1987. -235 с.

10. Бохонько А.И. Индукция интерферонообразования: интерферон как возможный репрессор / А.И. Бохонько, Т.В. Мамонтова, Т.Г. Орлова // Вопр. вирусол. 1988. - № 6. - С. 745-747.

11. Быков В.П. Цитология и общая гистология / В.П. Быков. СПб.: СиТис, 1998.-520 с.

12. Васильев Р.Ф. Механизмы химического возбуждения в жидкофазных реакциях органических соединений / Р.Ф. Васильев // Хемилюминесценция: тезисы докл. Всесоюзного совещания по хемилюминесценции. Запорожье, 1976.-С.4-6.

13. Вершигора А.Е. Общая иммунология / А.Е. Вершигора. Киев: Вища школа, 1990.-736 с.

14. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. М.: Наука, 1972. -252 с.

15. Владимиров Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко. М.: Высш. шк., 1989. -199 с.

16. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в первичных фотобиологических процессах / Ю.А. Владимиров // Биологические мембраны. 1998. -№5.-С. 517-529.

17. Влияние электромагнитных волн сантиметрового диапазона на продукцию фактора некроза опухолей и интерлейкина-3 иммунизированных мышей / О.Д. Синотова и др. // Биофизика. 2002. - №1. - С. 78-82.

18. Влияние рекомбинантного интерферона альфа и обработанных ими мо-нонуклеарных клеток на синтез IgE in vitro лимфоцитами периферической крови человека / Н.С. Прозоровский и др. // Иммунология. -1992.-№2.-С. 19-21.

19. Волгарева Е.В. Влияние УФ-облучения в терапевтической дозе и УФ-облученной крови на пролиферативную и рецепторную активность ау-тологичных лимфоцитов / Е.В. Волгарева // Цитология. 1991. - № 9. -С. 59.

20. Волгарева Е.В. Влияние УФ-облучения и УФ-облученной аутологичной крови на функциональное состояние лимфоцитов периферической крови человека / Е.В. Волгарева, А.П. Волгарев, К.А. Самойлова // Цитология. 1990.-№12.-С. 1217-1223.

21. Волкова М.А. Основные представления об интерферонах / М.А. Волкова // Гематология и трансфузиология . 1999. - №4. - С. 32-36.

22. Галактионов В.Г. Иммунология / В.Г. Галактионов. М.: Изд-во МГУ, 1998.-480 с.

23. Данилова Т.А. Изучение Fc-рецепторов фибробластов клапанов сердца и поиски подобных рецепторов в других тканях/ Т.А. Данилова, Е.В. Кочеткова, И.М. Лямперт // Бюлл. эксперимент, биологии и медицины. 1980.-№8.-С. 186-189.

24. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология / Г.Н. Дра-нник. М.: Мед. информ. агенство, 2003. - 604 с.

25. Ершов Ф.И. Интерфероны / Ф.И. Ершов // Вопр. вирусологии. 1998. -№6. - С. 247-252.

26. Ершов Ф.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств) / Ф.И. Ершов, О.И. Киселев -М.: Гэотар-Медиа, 2005. 368 с.

27. Журавлев А.И. Сверхслабое свечение сыворотки крови и его значение в комплексной диагностике / А.И. Журавлев, А.И. Журавлева. М.: Медицина, 1975. - 126 с.

28. Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика / Ю.М. Зарецкая М.: Медицина, 1983.-208 с.

29. Земсков А.М. Иммунологический статус, критерии его оценки, принципы назначения иммунокорригирующих препаратов: Методические указания / А.М. Земсков, Е.Б. Войтекунас, А.В. Никитин. Воронеж, 1988. - С. 11-26.

30. Зенков Н.К. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах / Н.К. Зенков, Е.Б. Меньшикова // Успехи соврем, биологии. 1993. - №3. - С. 286-296.

31. Иммунная реактивность и генетические маркеры крови / А.М Земсков и др. М., 1999. -310с.

32. Иммунология: справочник / под ред. Г. Бундшу. Киев: Наук, думка, 1981.-480 с.

33. Интерферон специфические клеточные рецепторы в культурах человеческих клеток различных по чувствительности к а-интерферону / А.Н. Наровлянский и др.// Мол. генетика, микробиология и вирусология. -1989.- №5. -С. 38-41.

34. Каральник Б.В. Влияние подвижности Fc-рецепторов и Fc-лигандов в мембране на адгезивные взаимодействия лимфоцитов и эритроцитов / Б.В. Каральник, М.М. Югай // Биологические мембраны. 1995. -Т. 12, №2. - С. 147-156.

35. Киселев О.И. Антивирусные препараты для лечения гриппа и ОРЗ. Дизайн препаратов на основе полимерных носителей / О.И. Киселев, Э.Г. Деева, А.В. Слита, В.Г. Платонов. СПб.: Время, 2000. - 125с.

36. Клинико-иммунологические параллели при лечении больных ауто-трансфузией УФ-облученной крови / А.Ф. Гаврилова и др. // Механизмы влияния облученной ультрафиолетовыми лучами крови на организм человека и животных. Л., 1986. - С. 74-79.

37. Клиническая иммунология и аллергология / под ред. Л. Йегера. М.: Медицина, 1994. - Т. 3. - 470 с.

38. Клиническая иммунология / под ред. А.В. Караулова. М.: Мед. ин-форм. агенство, 1999. - 604 с.

39. Королюк М.А. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк А.И. Иванова, И.Г. Майорова, В.Е. Токарев // Лаб. Дело. 1988. - № 1. -С. 16-19.

40. Красновский А.А. Механизм образования и роль синглетного кислорода в фотобиологических процессах / А.А. Красновский // Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения. М., 1988.-С. 23-41.

41. Кремлев С.Г. Иммуноферментный анализ изменения экспрессии антигенов II класса главного комплекса гистосовместимости под влиянием препаратов интерферона / С.Г. Кремлев, Н.В. Медуницын // Бюлл. экс-перим. биол. и мед. 1989. -№11. - С. 577-580.

42. Кузнецов В.П. Интерфероны как средство иммуномодуляции// Иммунология. 1987. - №4. - С. 30-34.

43. Кульберг А.Я. Регуляция иммунного ответа / А.Я. Кульберг. М.: Медицина, 1986.-224 с.

44. Лямперт И.М. Роль Fc-рецепторов лимфоцитов, макрофагов и других клеток млекопитающих при иммунных процессах / И.М. Лямперт // Усп. совр. биол. 1982. - Т.94, №4. - С. 67-82.

45. Лимфоциты: методы / под ред. Дж. Клауса. М.: Мир, 1990. - 396 с.

46. Малашенкова И.К. Интерфероны и индукторы их синтеза / И.К. Мала-шенкова, Э.Б. Талазухова, Н.А. Дидковский // Терапевт, архив. 1998. -№11.-С. 35-39.

47. Мамонтова Н.С. Активность каталазы при хроническом алкоголизме / Н.С. Мамонтова, Э.Н. Белобородова, Л.Н. Тюкалова // Клиническая и лабораторная диагностика. 1994. - №1. - С. 27-28.

48. Меньшикова Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи современной биологии. 1993. - №4. - С. 442-454.

49. Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи соврем, биологии. 1997. - №2. - С. 155-170.

50. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк и др. // Лабораторное дело. 1988. - N 1. - С. 16-19.

51. Механизм фотолиза SH-групп в клеточных мембранах при УФ-облучении / М.Ю. Писцов и др. // Фотобиология животной клетки. -Л., 1979.-С. 55-58.

52. Михилева Е. А. Модуляция физико-химическими агентами структурно-функционального состояния нейтрофилов крови человека: диссертация . канд. биол. наук : 03.00.02 / Е.А. Михилева Воронеж, 2006. - 201 с.

53. Новиков Д.К. Оценка иммунного статуса / Д.К. Новиков, В.И. Новикова. Витебск, М.: Медицина, 1996. - 282 с.

54. Облученная ультрафиолетовым светом кровь: фотохимия, иммунологическое действие / В.А. Крыленков и др. // ДАН СССР. 1983. - №5. -С. 242-246.

55. Петров Р.В. Иммунология / Р.В. Петров. М.: Медицина, 1987. - 416 с.

56. Пол У. Иммунология: В 3-х т./ У. Пол. -М.: Мир, 1987. Т.1. - 476 с.

57. Робинсон М.В. Морфология и метаболизм лимфоцитов / М.В. Робинсон, Л.Б. Топоркова, В.А. Труфакин. Новосибирск: Наука, 1986. - 128 с.

58. Ройт А. Основы иммунологии / А. Ройт. М.: Мир, 1991. - 328 с.

59. Рощупкин Д.И. Основы фотобиофизики / Д.И. Рощупкин, В.Г. Артюхов. -Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1997. 116 с.

60. Руководство по иммунофармакологии / под ред. М.М. Дейла. М.: Медицина, 1998.-332 с.

61. Савостина И.Е. Исследование влияния УФ-света и иммуномодуляторов на антиоксидантный статус и состояние мембран лейкоцитов: диссертация канд. биол. наук : 03.00.02/ И.Е. Савостина. Воронеж, 2005. - 202 с.

62. Сапежинский И.И. Сенсибилизированное фотоокисление белков и других веществ. Возможное значение этих процессов в фотобиологии / И.И. Сапежинский // Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения. М., 1988. - С. 92-101.

63. Свободные радикалы в биологии / под ред. У.Прайора: В 2-х т. М.: Мир, 1979.-Т.1.-320 с.

64. Смит К. Молекулярная фотобиология / К. Смит, Ф. Хэнеуолт. М.: Мир, 1972.-272 с.

65. Смородинцев А.А. Интерферон настоящее и будущее / А.А. Сморо-динцев. - JL: Наука, 1985. - 23 с.

66. Соловьев В.Д. Интерфероны в теории и практике медицины / В.Д. Соловьев, Т.А. Бектемиров. М.: Медицина, 1981. - 400 с.

67. Сорокина A.M. Генетические аспекты иммуномодулирующего действия интерферонов / A.M. Сорокина, JI.M. Черменева, Г.В. Шурина // Бюл. эксперим. мед. 1988. - №4. - С. 459-461.

68. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / под ред. Е.А. Кост. М.: Медицина, 1968. - С. 70-73.

69. Стимулирующее действие УФ-излучения на активность антител и комплемента крови человека / К.А. Самойлова и др. // Механизмы влияния облученной ультрафиолетовыми лучами крови на организм человека и животных. Л., 1986. - С. 226-237.

70. Теория и практика иммуноферментного анализа / под ред. В.А. Егорова -М.: Высш. шк., 1991. 288 с.

71. Труфакин В.А. Иммуноморфологические аспекты аутоиммунных процессов / В.А. Труфакин. Новосибирск: Наука, 1983. - 178 с.

72. Физиология лейкоцитов человека / под ред. В.А. Алмазова Л.: Наука, 1979.-231 с.

73. Фотомодификация иммунокомпетентных клеток крови человека / В.А. Крыленков и др. // Бюллетень эксперим. биол. и мед. 1987. - №5. -С. 600-603.

74. Фотопревращение мембранных липидов и его роль в изменении функций биомембран под действием УФ-излучения / Д.И. Рощупкин и др. // Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения. М., 1988. - С. 79-92.

75. Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы / И.С. Фрейдлин, А.А. Тото-лян. СПб.: Наука, 2001. - 390 с.

76. Фримель X. Основы иммунологии / X. Фримель, Й. Брок. М.: Мир, 1986.-254 с.

77. Фукс Б.Б. Регуляторное действие липидов на образование естественных киллеров и их взаимодействие с клетками мишенями /Б.Б. Фукс // Современные методы иммунотерапии. - Москва-Ташкент, 1984. - С. 283.

78. Функциональные и структурные изменения поверхности эритроцитов человека после облучения УФ лучами разной длины волны. I. Экспрессия антигенов систем AB0 и резус / К.А. Самойлова и др. // Цитология. 1983. -№12. - С. 1378-1385.

79. Хаитов P.M. Иммунология / P.M. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидоро-вич. М.: Медицина, 2000. - 432 с.

80. Чумаков В.Н. Количественный метод определения активности цинк-медь-зависимой супероксиддисмутазы в биологическом материале /

81. B.Н. Чумаков, Л.Ф. Осинская // Вопр. мед.химии. 1977. - Т. 27, №51. C.712-715.

82. Чучалин А.Г. Терапия / А.Г. Чучалин. М.: ГЭОТАР Медицина, 1997. -1024 с.

83. Шабалина Р.И. Интерфероновая система человека: биологическая роль и взаимосвязь с иммунной системой / Р.И. Шабалина, В.В. Длин, В.В. Малиновская // Рос. вестн. перинатологии и педиатрии. 1995. -Т. 40, №5. - С. 29-35.

84. Экспрессия антигенов ГКГС II класса на клетках крови больных псориазом и ее изменения под влиянием препаратов интерферона / Н.В. Медуницын и др. // Вестн. дерматологии и венерологии. 1989. -№4.- С. 10-14.

85. Экспрессия антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса на клетках крови больных псориазом и ее изменение под влиянием препаратов интерферона / Н.В. Медуницын и др. // Вестник дерматол. и венерологии. 1989.- №4.- С. 10-14.

86. Экспрессия рецепторов для человеческих а- и у-интерферонов на поверхности мононуклеарных клеток периферической крови при вирусных инфекциях / Е.П. Баркова, Ф.Г. Нагиева, В.П. Кузнецов // Вопр. ви-русол. 1999. - № 1. - С. 16-18.

87. Элементарный учебник физики / под ред. Г.С. Ландсберга: В 3-х т. М.: Наука, 1970.-Т.З.-С. 161-164.

88. Югай М.М. Fc-рецепторы: Новые данные о структуре и функции/ М.М. Югай, Б.В. Каральник // Иммунология. 1992. - №3. - С. 7-11.

89. Ярилин А.А. Основы иммунологии/ А.А. Ярилин. М.: Медицина, 1999.-608 с.

90. A defective retroviral vector encoding human interferon alpha 2 can transduce human leukemic cell lines / E. Austruy, C. Bagnis, N. Carbuccia et al. // Cancer Gene Ther. 1998. - Vol. 5. P. 247-256.

91. A new type of leukocytic interferon / E.Y. Gren, V.M. Berzin, A.Y. Tsimanis et al. // Dokl. Biochem. 1983. - Vol. 269. - P. 91-95.

92. Abbas A. Functional diversity of helper T lymphocytes / A. Abbas, K. Murphy, A. Sher // Nature. 1996. - V. 383. - P. 787-793.

93. Amdjadi K. Ultraviolet light-induced stimulation of the JNK mitogen-activated protein kinase in the abcence of Src family tirosine kinase activation / K. Amdjadi, B. Sefton // J. Biol. Chem. 2000. - Vol.275. - P. 2252022525.

94. Antiadhesive function of 130-kd glycoform of CD43 expressed in CD4 T-lymphocyte clones and transfectant cell lines / M. Fukuoka, K. Fukudome, Y. Yamashita et al. // Blood. 2000. - Vol. 96. - P. 4267-4275.

95. Atomic structure of a fragment of human CD4 containing two immunoglobu-lin-like domains / J. Wang, Y. Yan, T.P. Garrett et al. // Nature. 1990. -Vol. 348.-P. 411-418.

96. Bacterial synthesis of a novel human leukocyte interferon / E. Yelverton, D. Leung, P. Week et al. // Nucleic Acids Res. 1981. - Vol. 9. - P. 731-741.

97. Bakhid M. Potential role of autoantibodies in the regulation of cytokine responses during bacterial infections / M. Bakhid, A. Diab, G. Monamustafa // Infect. Immunol. 1997. - V. 65. - P. 3300-3303.

98. Basu-Modak S. Singlet oxygen: a primary effector in the ultraviolet A/near-visible light induction of the human heme oxygenase gene // S. Basu-Modak, R.M. Tyrrell // Cancer Res. 1993. -V 53. - P. 4510-4550.

99. Boym A. Separation of blood leukocytes, granulocytes and lymphocytes / A. Boym // Tissue antigens. 1974. - № 4. - P. 269-274.

100. Bradley J. E. Processed MHC class I alloantigen as the stimulus for CD4+ T-cell depent antibody-mediated graft rejection /J. Bradley, A. Mowat, E. Bolton // Immunology Today. 1992. - Vol. 13. - P. 3434-3438

101. Bronte V. Identification of a CDllb+/Gr-l+/CD31+ myeloid progenitor capable of activating or suppressing CD8+ T / V. Bronte, E. Apolloni, A. Cabrelle // Blood. 2000. - Vol. 96. - P. 3838 - 3846.

102. Characterization of the surface topography and putative tertiary structure of the human CD7 molecule / R.E. Ware, R.M. Scearce, M.A. Dietz et al. // The Journal of Immunology Vol. 143, Issue 11. - P. 3632-3640.

103. Chuck R. Effect of CD4 Engagement on CD4-T cell receptor complexes / R. Chuck, C. Cantor, B. Doris // Cellular Immunology. 1993. - Vol. 152. -P. 2110-2119.

104. Cloning of eukaryotic genes in single-strand phage vectors: the human interferon genes / D.W. Bowden, J. Mao, T. Gill et al. // Gene. 1984. - Vol. 27.-P. 87-99.

105. Cloning of human leukocyte interferon cDNA and a strategy for its production in E. coli / G. Oliver, P. Balbas, F. Valle et al. // Rev. Latinoam. Microbiol. 1985. - Vol. 27. - P. 141-150.

106. Clydesdale G. Ultraviolet light induced injury: immunological and inflammatory effects / G. Clydesdale, G.W. Dandie, H.K. Muller // Immunol. Cell. Biol. 2001. - V. 79. - P. 547-568.

107. Copeland K.T. T helper cell activation and human retroviral pathogenesis / K.T. Copeland, J.L. Heeney // Microbiol. Rev. 1996. - V. 60. - P. 724742.

108. Crise B. Identification of palmitoylation sites on CD4, the human immunodeficiency vims receptor / B. Crise, J.K. Rose // J. Biol. Chem. 1992. -Vol. 267.-P. 13593-13597.

109. Deshpande R. Calpain expression in lymphoid cells. Increased mRNA and protein levels after cell activation / R. Deshpande, J. Goust, A. Chakrabarti et al. // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - P. 2497-2505.

110. Discrete generation of superoxide and hydrogen peroxide by T-cell receptor stimulation: selective regulation of mitogen-activated protein kinase activation and fas ligand expression / S. Devadas et al. // J. Exp. Med. 2002. -Vol. 195.-P. 59-70.

111. DNA sequence of a major human leukocyte interferon gene / R.M. Lawn, M. Gross, C.M. Houck et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1981. - Vol. 78. -P. 5435-5439.

112. Endogenous oxygen radicals modulate protein tyrosine phosphorylation and JNK-1 activation in lectin-stimulated thymocytes / G. Pani et al. // Bio-chem. J.-2000.-V. 347.-P. 173-181.

113. Evidence that singlet oxygen-induced human T-helper cell apoptosis is the basic mechanism of ultraviolet-A radiation phototherapy / A. Morita et al. // J. Exp. Med.-1997.-V. 186.-P. 1763-1768.

114. Exon-intron organization and sequence comparison of human and murine T11 (CD2) genes / D.J. Diamond, L.K. Clayton, P.H. Sayre et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988.-Vol. 85.-P. 1615-1619.

115. Fanton I.C. Role of oxygen derived free radicals and metabolites in leukocyte - dependet inflammatory reaction/ I.C. Fanton, P. F. Ward// AM. J. Pathol. - 1982. - Vol. 107. - P.397-418.

116. Fantone J.C. Role of oxygen-derived free radicals and metabolites in leukocyte-dependent inflammatory reactions / J.C. Fantone, P.A. Ward // Am. J. Phatol. 1982. - Vol. 107. - P. 397-418.

117. Finkel T. Oxygen radicals and signaling / T. Finkel // Curr. Opin. Cell Biol. 1998. -№ 10. - P. 248-253.

118. Frick G. Fibel der Ultraviolettbestrahlung des Blutes / G. Frick. Munchen : Hans Muller Verlag, 1993. - S. 89.

119. Fridman W. Fc receptors and immunoglobulin binding factors / W. Fridman // FASEB J. 1991. - Vol. 5. - P. 2684-2689.

120. Gamaley I.A. Roles of reactive oxygen species: signaling and regulation of cellular function /1.A. Gamaley, I.V. Klyubin // Int. Review. Cytol. 1999. -№ 188.-P. 203-255.

121. Gleichmann E. T-lymphocyte subpopulation in immunotoxicology / E. Gleichmann // Immunol. Today. 1998. - V. 19. - P. 586.

122. Godar D. Special dependence of UV-induced immediate and delayed apop-tosis: the role of membrane and DNA damage / D. Godar, A.D. Lucas // Photochem. Photobiol.- 1995.- V. 62.-P. 108-113.

123. Hussain M. Identification of interferon-alpha 7, -alpha 14, and -alpha 21 variants in the genome of a large human population / M. Hussain, D.S. Gill, M.-J. Liao // J. Interferon Cytokine Res. 1996. - Vol. 16. - P. 853-859.

124. Identification of nine interferon-alpha subtypes produced by Sendai virus-induced human peripheral blood leucocytes / T.A. Nyman, H. Toeloe, J. Parkkinen et al. // Biochem. J. 1998. - Vol. 329. - P.295-302.

125. Isaacs A., Lindenmann J. Virus interference. I. The interferon // Proceedings of the Royal Society of London. Series В Biological sciences. - 1957 - Vol 147, №927. -P. 258-267

126. Isolation and characterization of the genomic human CD7 gene: structural similarity with the murine Thy-1 gene / L.E. Schanberg D.E. Fleenor, J. Kurtzberg // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol 88, №2. - P. 603-607.

127. Kulms D. Ultraviolet radiation inhibits IL-2-induced tyrocine phosphorylation and the activation of STAT5 in T lymphocytes / D. Kulms, T. Schwarz // J. Biol. Chem. 2001. - Vol.276. - P. 12849-12855.

128. Kulms D. Ultraviolet radiation-indused IL-6 release in HeLa cells is mediated via membrane events in a DNA damage independent way / D. Kulms, B. Poppelman, T. Schwarz // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol.275. - P. 1506015066.

129. Littman D.R. Corrected CD4 sequence / D.R. Littman, P.J. Maddon, R. Axel // Cell. 1988. - Vol. 55. - P. 541-546.

130. Loor F. Plasma membrane and cell cortex interactions in lymphocyte functions / F. Loor // Adv. Immunol. 1980. - Vol. 30. - P. 1-120.

131. Lyman S.D. Identification of CD7 as a Cognate of the Human K12 (SECTM1) Protein / S.D. Lyman , S. Escobar, A.-M. Rousseau, A. Armstrong, W.C. Fanslow // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275, Issue 5. -P. 3431-3437.

132. Mechanism of lymphocyte function-associated molecule 3-Ig fusion proteins inhibition of T cell responses: structure/function analysis in vitro and in human CD2 transgenic mice / G.R. Majeau et al. // J. Immunol. 1994. - Vol. 152.-P. 2753-2767.

133. Miley G.P. Ultraviolet blood irradiation. A history and guide to clinical application (1933-1997) / G.P. Miley, R.C. Olney, H.T. Lewis // The Foundation for blood irradiation Inc. Silver Spring, 1997. - 253 p.

134. Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology / K.K. Griendling et al. // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. -2000.-V. 20.-P. 2175-2185.

135. Modulation of T-helper cell responses: in vitro competition between Thl and Th2 clones / T. Orris et al. // Lymphocyte activation. Keystone Symp., 1996.-P. 145.

136. Nohmi M. Ultraviolet light activates blocking actions of dantrolene on intraIcellular Ca release in bullfrog sympathetic neurones / M. Nohmi, K. Kuba, S. Hua // J. Biol. Chem. 1991. - Vol.266. - P. 22254-22259.

137. Nyman T.A. Identification of nine interferon-alpha subtypes produced by Sendai virus-induced human peripheral blood leucocytes / T.A. Nyman, H. Toeloe, J. Parkkinen et al. // Biochem. J. 1998 - Vol. 329. - P. 295-302.

138. Peterson A. Monoclonal antibody and ligand binding sites of the T cell erythrocyte receptor (CD2) / A. Peterson, B. Seed // Nature. 1987. - Vol. 329. -P. 842 - 846.

139. Protein and carbohydrate structural analysis of a recombinant soluble CD4 receptor by mass spectrometry / S.A. Carr, M.E. Hemling, G. Folena-Wasserman et al. //J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264. - P. 21286-21295.

140. Rabinowitz J. Kinetic discrimination in T-cell activation / J. Rabinowitz, C.Beeson, D. Lyons // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. - Vol. 93. -P. 1401-1405.

141. Ress R.C. Cytokines: their role in regulation immunity and the response to infection / R.C. Ress // Rev. Med. Microbiol. 1992. - V. 3. - P. 9-14.

142. Robbins R. Inducible nitric oxid synthase is increased in murine lung epithelial cells by cytokine stimulation / R. Robbins, D. Springall, J. Warren // Bio-chem. Biophys. Res. Comm. 1994. - Vol. 198. - P. 835-843.

143. Rothbard J. Interaction between immunogenic peptides and MHC proteins / J. Rothbard, M. Gefter // Annu. Rev. Immunol. 1991. - Vol. 9. - P. 527535.

144. Ryter S.W. Singlet molecular oxygen ('Ог): a possible effector of eukariotic gene expression / S.W. Ryter, R.M. Tyrrell // Free Radic. Biol. Med. 1998. -№24.-P. 1520-1534.

145. Samoilova K.A. Ultraviolet irradiation of blood: mechanisms of wide therapeutic effect / K.A. Samoilova, S.A. Snopov, K.D. Obolenskaya // Biological effects of light. Berlin, New York : Walter de Gruyter, 1996. - P. 199-203.

146. Sauer H. Reactive oxygen species as intracellular messenger during cell growth and differentiation / H. Sauer, M. Wartenberg, J. Hescheler // Cell. Physiol. Biochem. 2001. - V. 11, № 4. - P. 173-186.

147. Streuli M. At least three human type alpha interferons: structure of alpha 2 / M. Streuli, S. Nagata, C. Weissmann // Science. 1980. - Vol. 209. - P. 1343 -1347.

148. Structural relationship of human interferon alpha genes and pseudogenes / K. Henco, J. Brosius, A. Fujisawa et al. // J. Mol. Biol. 1985. - Vol. 185. -P. 227-260.

149. Sutton H.S. Peroxidase and catalase / H.S. Sutton, N.H. Becker // New York. Acad. Scien. 1969. - V. 159. - P. 497-502.

150. Taylor S. Thrombosis and shock induced by activating antiplatelet antibodies in human Fc-gammaRIIA transgenic mice: the interplay among antibody, spleen, and Fc receptor / S. Taylor, M. Reilly, A. Schreiber // Blood. 2000. -Vol. 96.-P. 4254-4260.

151. The structure of eight distinct cloned human leukocyte interferon cDNAs / D.V. Goeddel, D.W. Leung, T.J. Dull et al. // Nature. 1981. - Vol. 290. -P. 20-26.

152. The three-dimensional high resolution structure of human interferon alpha-2a determined by heteronuclear NMR spectroscopy in solution / W. Klaus et al. / J. Mol. Biol. 1997. - Vol. 274, № 4. - P. 661-675.

153. Trams E.G. On the sidedness of plasma membranen enzymes / E.G. Trams, C.J. Lanter // Tissue antigens. 1974. - Vol. 345, №2. - P. 181-197.

154. Unkless J.C. Function and heterogeneity of human Fc receptors for immunoglobulin G / J.C. Unkless // J. Clin. Invest. 1989. - Vol. 83. - P. 355361.

155. Van der Winkel J. Biology of human immunoglobulin G Fc receptors / J. Van der Winkel, C.L. Anderson // J. Leukoc. Biol. 1991. - Vol. 49. -P. 511-524.

156. Van der Winkel J. Human IgG Fc receptor geterogeneity: molecular aspects and clinical implications / J. Van der Winkel, P. Capel // Immunol. Today. -1993.-Vol. 14.-P. 215-220.

157. Wetzel R. Assignment of the disulphide bonds of leukocyte interferon/ R. Wetzel//Nature. 1981.-Vol. 289.-P. 606-607.

158. Wiseman H. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer / H. Wiseman, B. Halli-well // Biochem. J. 1996. - Vol 313. Pt 1. - P. 17-29.

Информация о работе

Колтаков, Игорь Александрович
кандидата биологических наук
Воронеж, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов крови человека при модификации α-интерфероном и в условиях УФ-облучения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы