Анализ действия УФ-излучения и некоторых индукторов интерферона на состояние Т-лимфоцитов крови человека

Дубова, Светлана Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ действия УФ-излучения и некоторых индукторов интерферона на состояние Т-лимфоцитов крови человека
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Анализ действия УФ-излучения и некоторых индукторов интерферона на состояние Т-лимфоцитов крови человека"

На правах рукописи

ИИ*ти * *

Дубова Светлана Михайловна

АНАЛИЗ ДЕЙСТВИЯ УФ-ИЗЛУЧЕНИЯ И НЕКОТОРЫХ ИНДУКТОРОВ ИНТЕРФЕРОНА НА СОСТОЯНИЕ Т-ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

03.01.02. - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 ДЕК 2010

Воронеж 2010

004618935

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

доктор биологических наук, профессор Артюхов Валерий Григорьевич

доктор биологических наук,

профессор Епринцев Александр Трофимович

кандидат биологических наук,

доцент Дмитриев Евгений Владиславович

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» РАСХН

Защита состоится 28 декабря 2010 года в 13:30 на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006 Воронеж, Университетская пл., 1, биолого-почвенный факультет, ауд. 59.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан ноября 2010 года

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета

Грабович М.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время пристальное внимание исследователей направлено на изучение и анализ механизмов трансформации энергии УФ-излучения, поглощенной живыми системами различных уровней организации. Это в первую очередь связано с тем, что УФ-свет выступает в качестве тонкого регуляторного агента, позволяющего исследовать биофизические основы взаимосвязей сетей, обеспечивающих поддержание различных типов гомеостатических процессов организма. Так, иммунная система, ответственная за поддержание антигенного постоянства, включает большое количество составляющих, одно из центральных мест среди которых занимают Т-клетки. При облучении крови УФ-светом протекающие процессы модификации поверхности иммуноцитов существенно отражаются на структурно-функциональном состоянии рецепторного аппарата и антигенного профиля клеточных мембран (К.А. Самойлова, 1991; К.Д. Оболенская и др., 1991; И.А. Колтаков, 2007; Е.А. Двурекова, 2005; Е.А. Михилева, 2006).

Согласно современным представлениям, молекулы клеточной адгезии являются одними из ключевых звеньев в регуляции межклеточных взаимодействий. Они играют важную роль в различных физиологических и патологических процессах таких, как эмбриогенез, рост тканей, регенерация, иммунологические реакции, атерогенез, метастазирование опухолей и т.д. (K.L. Crossin et al„ 1985; Е.С. Butcher, 1990; L. Osborn, 1990; T.A. Springer, 1990). T-лимфоциты, как составляющие иммунной системы, обеспечивают клеточные формы иммунного ответа. На их мембранах экспрессируются разнообразные адгезивные молекулы, в том числе CD2, LFA-1 (CD 11 a/CD 18) и VLA (CD49/CD29) рецепторы, которые являются вспомогательными молекулами, опосредующими выполнение иммуноцитами специфических функций. Данные адгезивные молекулы, работая в комплексе, и, включаясь последовательно в процессы иммунного распознавания, тем самым опосредуют успешное протекание иммунного ответа - осуществляют взаимодействия клеток, связанные с презентацией антигена, кооперацией и миграцией в очаги воспаления лимфоцитов в ходе развития иммунного ответа и др. (В.А. Боценовский, А.Ю. Барышников, 1994; M.L. Dustin et al., 1996; P.A. Van der Merwe, 1999; M.K. Wild et al., 1999; P.A. Van der Merwe et al., 2000; A.A. Ярилин, 1999; A.A. Ярилин, 2003).

содержание внутриклеточных мессенджеров, активность дыхательных ферментов и транспортных белков митохондрий и др. (W. Roemer, W. Schulze, 1983; W. Roemer et al., 1986; W. Oettmeier et al„ 1994; W. Oettmeier et al„ 1995; А.Л. Коваленко и др., 2000). В связи с вышеизложенным вопрос о первичных процессах действия данных модификаторов на клетки представляется очень актуальным.

Исследование механизмов, лежащих в основе действия УФ-света и циклоферона на молекулы клеточной адгезии лимфоцитарных клеток человека, позволит расширить и углубить представления о путях регулирования Т-лимфоцитами состояния рецепторного пула молекул адгезии их мембран в ответ на влияние различного рода экзогенных стимулов.

Цели и задачи диссертационной работы. Целью работы явилось исследование путей модуляции рецепторного аппарата адгезии мембран Т-лимфоцитов периферической крови человека в условиях одиночного и сочетанного воздействия УФ-излучения (240-390 нм) и препарата «Циклоферон».

Задачи работы предусматривали:

1. Исследование изменений уровня экспрессии адгезивных CD2, CD11а и CD29 молекул Т-лимфоцитами человека в условиях одиночного и сочетанного воздействия УФ-света и циклоферона.

2. Изучение влияния циклогексимида и анизомицина на уровень экспрессии CD2, CD 11а и CD29 маркеров в условиях моно- и комплексного воздействия УФ-излучения и циклоферона.

3. Изучение структурного состояния мембран Т-лимфоцитов в условиях одиночного и сочетанного воздействия УФ-света и блокаторов синтеза белка -циклогексимида и анизомицина.

4. Исследование интенсивности процессов кэппинга CD2 и LFA-1 (CDlla/CD18) рецепторов мембран Т-лимфоцитов в условиях моно- и комплексного воздействия УФ-излучения и циклоферона.

5. Исследование изменения спонтанной и митогениндуцированной продукции а-ИФН, ß-ИФН и у-ИФН Т-лимфоцитами в условиях одиночного и сочетанного воздействия УФ-света и циклоферона.

Научная новизна. Впервые исследованы изменения уровня экспрессии CD2, CDlla и CD29 маркеров, интенсивности процессов кэппинга CD2 и CDlla/CD18 рецепторов, спонтанной и митогениндуцированной продукции а-ИФН, ß-ИФН и у-ИФН и структурного состояния мембран Т-лимфоцитов крови человека в условиях комплексного воздействия УФ-излучения (240-390 нм) в дозах 151, 453, 906 и 1359 Дж/м2, препарата «Циклоферон» (0,2 мг/мл) и блокаторов синтеза белка - циклогексимида и анизомицина. Установлено, что УФ-свет (1359 Дж/м2) оказывает иммунодепрессивное действие на уровень экспрессии CD2 и CDlla маркеров и иммуномодулирующее (151-И359 Дж/м2) влияние на экспрессию CD29 молекул Т-лимфоцитами человека. Использование циклогексимида и анизомицина позволило выявить активацию УФ-излучением в дозах 151-906 Дж/м2 синтеза рецепторных молекул CD2 и CD29 I группы доноров и CDlla маркеров - в дозах 151-453 Дж/м2. Показана возможность образования новых молекул CD2, CDlla и CD29 маркеров

I группы лиц под действием циклоферона интактными Т-лимфоцитами, а также СШ 1а молекул и СЭ29 антигенов II группы доноров -клетками, фотомодифицированными соответственно в дозах 151 Дж/м2 и 151-5-1359 Дж/м2. Выявлены существенные структурные перестройки лимфоцитарных мембран в условиях одиночного и сочетанного воздействия УФ-излучения (151-4359 Дж/м2), циклогексимида (151 Дж/м2) и анизомицина (151-453 Дж/м2). Показано повышение подвижности мембранных С02 и С011а/Сй18 рецепторов иммуноцитов под влиянием УФ-излучения в дозе 1359 Дж/м2, что проявлялось в виде усиления кэппинга исследуемых маркеров. Обнаружено усиление процесов образования а-ИФН и р-ИФН Т-лимфоцитами, УФ-облученными в дозе 151 Дж/м2. Показано дозозависимое падение концентраций а/р-ИФН и у-ИФН при спонтанной и митогениндуцированной индукции данных цитокинов в супернатантах фотомодифицированных клеток. Установлено, что циклоферон способствует активации продукции Т-лимфоцитами р-ИФН в большей степени, чем а-ИФН, а синтез у-ИФН осуществлялся только фитогемагглютинин-стимулированными лимфоцитами. Предложена схема процессов изменений состояния рецепторного аппарата адгезии мембран Т-лимфоцитов крови человека в условиях сочетанного воздействия УФ-излучения и препарата «Циклоферон».

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления об особенностях модуляции рецепторного аппарата адгезии мембран Т-лимфоцитов крови в условиях комплексного воздействия различных физико-химических агентов. Они могут быть использованы для разработки способов регулирования межклеточных взаимодействий иммунных клеток организма человека. Управление данными процессами является необходимым условием для прогнозирования течения и коррекции патологических состояний у больных с заболеваниями различной этиологии в клинике. Результаты работы используются в учебном процессе Воронежского государственного университета при проведении занятий по дисциплинам «Биофизика», «Биофизика мембран», «Физико-химические основы межклеточных взаимодействий», «Медицинская биохимия и биофизика», а также в ходе выполнения магистерских и дипломных работ студентами кафедры биофизики и биотехнологии.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 4-ом съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); Международной научной конференции «Биология: теория, практика, эксперимент» (Саранск, 2008); 8-ом съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2008); 4-ой Международной научной конференции «Электромагнитные излучения в биологии» (Калуга, 2008); 5-ом съезде Российского фотобиологического общества «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2008); 2-ом Международном форуме «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, 2008); 2-ом съезде физиологов СНГ (Кишинев, 2008); Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2009); Международной научной школе для молодежи

«Инновационные технологии в здравоохранении: молекулярная медицина, клеточная терапия, трансплантология, реаниматология, нанотехнологии», Международной научной конференции «Инновационные технологии в реальном секторе экономики», Заседании Экспертного совета по программе «УМНИК» (Екатеринбург, 2009); 22-ой зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010); Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 1000-летию г. Ярославля «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010); Международной научной конференции «Современные проблемы радиобиологии» (Минск, 2010); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 статей и 11 тезисов, в том числе 2 статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Т-лимфоциты способны поддерживать экспрессию С02 и С011а рецепторов на постоянном уровне при действии широкого диапазона доз УФ-света (151-906 Дж/м2); УФ-излучение в дозе 1359 Дж/м2 индуцирует уменьшение их экспрессии с параллельным усилением процессов кэппинга белковых молекул.

2. В условиях воздействия циклоферона уровень экспрессии адгезивных молекул СЭ2 и СО 11а увеличивается после облучения Т-лимфоцитов УФ-светом в дозе 151 Дж/м2 и уменьшается - в дозах 453-906 Дж/м2.

3. Одиночное и сочетанное воздействие УФ-света и циклоферона оказывает иммунокорригирующее влияние на уровень экспрессии С029 маркеров Т-лимфоцитов.

4. УФ-излучение в дозе 151 Дж/м2 активирует, а в дозах 453-1359 Дж/м2 ингибирует синтез а-интерферона и р-интерферона Т-лимфоцитами человека и оказывает депрессивное действие на продукцию у-интерферона Т-клетками в условиях его спонтанного, митогениндуцированного и циклоферонобусловлен-ного фитогемагглютинин-стимулированного образования.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает 167 страниц машинописного текста: состоит из «Введения», 6 глав, «Заключения», «Выводов» и «Приложения». Список литературы содержит 187 источников. Иллюстративный материал включает 23 рисунка и 10 таблиц в основном тексте и 10 таблиц в «Приложении».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе изложены современные данные, посвященные характеристике Т-лимфоцитов крови человека и их субпопуляций. Рассмотрены структурные и функциональные особенности мембранных молекул клеточной адгезии. Представлен свод основных работ, касающихся вопросов исследования влияния УФ-излучения и препарата «Циклоферон» на состояние иммуноцитов.

Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явились Т-лимфоциты крови доноров, полученные путем центрифугирования гепаринизированной крови в градиенте плотности фиколл-урографина (Д. Кэтти, 1991) и последующего разделения на волокнах синтетической нейлоновой ваты (Ю.М. Зарецкая, 1983).

Суспензии Т-лимфоцитов в объеме 1 мл облучали в термостатируемой (при 20 ± 1° С) стеклянной кювете с помощью ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240-390 нм. Интенсивность облучения составляла 151 Дж/м2-мин на расстоянии от оси лампы до объекта 0,23 м. Дозы облучения клеточных суспензий - 151, 453, 906 и 1359 Дж/м2.

Для модификации суспензий Т-лимфоцитов применяли препарат «Циклоферон» (НТФФ «Полисан», Санкт-Петербург), фитогемагглютинин, блокаторы синтеза белка - циклогексимид и анизомицин (все «Sigma», США), конечная концентрация которых в суспензиях клеток составляла 0,2 мг/мл, 0,1 мг/мл, 10"3 моль/л и 10~6 моль/л соответственно.

Для изучения изменений уровня экспрессии CD2, CDlla и CD29 маркеров на поверхности мембран нативных и модифицированных Т-лимфоцитов применяли методы твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и проточной цитофлуориметрии.

При проведении ИФА использовали моноклональные антитела серии LT2, LTlla и LT29 соответственно к CD2 маркеру, CDlla субъединице LFA-1 и CD29 субъединице VLA рецепторов человека («Сорбент», Москва) (В.А. Егоров, 1991).

Цитометрические исследования проводились на базе ГУЗ «Воронежский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» с применением проточного цитометра EPICS XL-MCL (Becman Coulter, США). В работе использовали моноклональные антитела -CD2-FITC (IgG2a), CDlla-FITC (IgGl), CD29-FITC (IgGl), CD3-PE (IgGl) и соответствующие изотипические контроли (все Becman Coulter, США).

Исследование изменений структурного состояния мембран Т-лимфоцитов осуществляли при помощи флуоресцентного зонда 1-анилинонафталин-8-сульфоната.

Определение концентраций а- ИФН, у-ИФН и ß-ИФН в супернатантах нативных и модифицированных клеток осуществляли с помощью тест-систем альфа-ИНТЕРФЕРОН-ИФА-БЕСТ, гамма-ИНТЕРФЕРОН-ИФА-БЕСТ (обе ЗАО «ВЕКТОР-БЕСТ», Новосибирск) и Human Interferon-ß (h IFN-ß) EASIA™ ELISA Kit («Fujirebio», Япония).

Локализацию CD2 и CD 11 a/CD 18 маркеров на поверхности мембран Т-лимфоцитов определяли с помощью метода люминесцентной микроскопии с использованием микроскопа МИКМЕД-2 (ЕС ЛЮМАМ РПО-11, Россия). В работе применяли моноклональные антитела серии LT2 и LTlla к CD2 молекуле и CDlla субъединице LFA-1 (CD 11 a/CD 18) рецептора человека соответственно и Р(аЬ')2-фрагменты овечьих антител к Ig мыши, меченных FITC («Сорбент», Москва).

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью прикладных программ «Statistica 6.0». Достоверность различий контрольных и опытных значений сравниваемых показателей определяли с помощью t-критерия Стьюдента.

Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ МОДУЛЯЦИИ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛ АДГЕЗИИ МЕМБРАН Т-ЛИМФОЦИТАМИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ АГЕНТОВ

С целью выяснения первичных процессов, приводящих к изменениям ответной реакции Т-лимфоцитов в виде изменения экспрессии адгезивных CD2, CD11а и CD29 маркеров на различные физико-химические стимулы, нами были проведены серии экспериментов по исследованию возможных путей регуляции Т-лимфоцитами крови человека состояния антигенного профиля их мембран.

Показано, что Т-лимфоциты в условиях воздействия широкого диапазона доз (151^906 Дж/м2) УФ-света способны сохранять на постоянном уровне экспрессию CD2 и CD11а маркеров посредством активации синтеза их молекул de novo (рис. 1.). При этом только наибольшая из используемых нами доз УФ-света (1359 Дж/м2) оказывает депрессивное (понижающее) действие на уровень экспрессии CD2 и CD11а молекул.

Показана зависимость между исходным уровнем экспрессии CD29 маркеров и ответной реакцией их молекул на воздействие УФ-излучения (15Н1359 Дж/м2)". тестируемый показатель возрастает после УФ-облучения Т-лимфоцитов у доноров с исходно низкими и снижается - у лиц с исходно высокими его значениями, т.е. облучение Т-лимфоцитов УФ-светом в дозах 151-4359 Дж/м2 оказывает иммуномодулирующее влияние на экспрессию CD29 молекул на поверхности мембран исследуемых клеток.

Проанализирована первичная структура исследуемых маркеров и выявлена зависимость степени ответной реакции CD2, CDlla и CD29 молекул на воздействие УФ-света (151-Н359 Дж/м2) от содержания потенциальных акцепторов УФ-излучения в их полипептидных цепях (ПП). Выявлено, что высокая фоточувствительность CD29 маркеров, по-видимому, обусловлена наибольшим числом дисульфидных связей и самым высоким содержанием

хромофоров УФ-света в СБ29 молекулах по сравнению с другими исследованными нами маркерами.

Установлено, что циклоферон способствует увеличению уровня экспрессии СВ2 рецепторов нативных Т-клеток и СЭ11а маркеров интактных и модифицированных «терапевтической» (151 Дж/м2) дозой УФ-излучения иммуноцитов посредством активации процессов синтеза новых молекул адгезии (рис. 1).

В присутствии иммуномодулятора наблюдается уменьшение ИФА-сигнала от СШ и С011а маркеров Т-лимфоцитов, облученных УФ-светом в дозах 453906 Дж/м2 и 906 Дж/м2 соответственно.

Доза облучения,

Дж/м"

1359 Доза

облучения Дж/м"

453 906 " ¡359 Д*» 0 "ЧТ™ "45? "9оГ1з59 Д»

облучения, облучения

Дж/м' .Дж/м3

Рисг К Изменение уровня экспрессии С02 рецепторов (А), СО 11 а маркеров (Б) и СБ29 молекул (I группа - В, II группа - Г) Т-лимфоцитами крови человека в условиях комплексного воздействия УФ-света, циклоферона и блокаторов синтеза белка - циклогексимида и анизомицина: 1 - нативные Т-лимфоциты после УФ-облучения; 2 - Т-лимфоциты, модифицированные циклофероном; 3 - Т-лимфоциты, модифицированные циклогексимидом;

4 - Т-лимфоциты, модифицированные циклофероном и циклогексимидом;

5 - Т-лимфоциты, модифицированные анизомицином; 6 - Т-лимфоциты, модифицированные циклофероном и анизомицином

Циклоферон оказывает разнонаправленное действие на уровень экспрессии СШ9 антигенов. Так, на поверхности мембран нативных клеток (I группа доноров) с изначально низкими значениями экспрессии изучаемых молекул циклоферон способствует возрастанию, а на лимфоцитах с высокими -падению данного показателя (II группа доноров). В каждой из описанных групп внесение иммуномодулятора в суспензии фотомодифицированных

Т-лимфоцитов (151+1359 Дж/м2) «возвращает» величину показателя экспрессии С029 молекул, измененную действием УФ-света, до значений уровня контрольных образцов, т.е. снижает в I группе и увеличивает - во II группе. Таким образом наблюдается иммунокорригирующее действие циклоферона на экспрессию С029 молекул как нативными, так и фотомодифицированными (151+1359 Дж/м2) Т-клетками.

Наряду с «классическим» методом твердофазного неконкурентного иммуноферментного анализа одним из современных методов оценки состояния мембранного рецепторного аппарата клеток является проточная цитофлуориметрия. Для уточнения динамики тестируемых нами ранее с помощью ИФА изменений уровня экспрессии С02, СОПа и С029 рецепторов, была проведена серия экспериментов с использованием метода проточной цитофлуориметрии по исследованию модуляции экспрессии адгезивных маркеров Т-лимфоцитами в условиях воздействия широкого диапазона доз УФ-излучения (151+1359 Дж/м2).

Воздействие на Т-лимфоциты УФ-света в дозах 151+1359 Дж/м2 не приводило к достоверному изменению процентного содержания исследуемых дубль-позитивных С03+С02+, СОЗ+СШ 1а+ и С03+С029+ клеток (рис. 2).

Из всего использованного в работе диапазона доз (151-5-1359 Дж/м2) УФ-света только УФ-излучение в дозе 1359 Дж/м2 способствует статистически достоверному снижению значений средней интенсивности флуоресценции (СИФ) антител против СБ2 и С011а антигенов.

На основании значений экспрессии СЭ29 молекул Т-лимфоцитами и последующей ответной реакции на воздействие широкого диапазона доз УФ-света исследуемые доноры были отнесены в две группы. У доноров I группы изначально плотность экспрессии исследуемых антигенов на поверхности мембран лимфоцитов была ниже, по сравнению с лицами II группы. Облучение Т-лимфоцитов УФ-светом в дозах 151+1359 Дж/м2 способствовало возрастанию тестируемого показателя у лиц I группы и падению - у доноров II группы. Это подтверждает иммуномодулирующее влияние УФ-света на уровень экспрессии СБ29 маркеров мембранами Т-лимфоцитов крови доноров.

Результаты по исследованию экспрессии адгезивных С02, СОПа и С029 маркеров на поверхности мембран Т-лимфоцитов человека методом проточной цитофлуориметрии позволили выявить сходные тенденции изменения их экспрессии, полученные нами ранее методом ИФА, что позволяет с большей убедительностью говорить о наблюдаемых нами эффектах. Однако применение проточного цитофлуориметра позволило выявить ряд особенностей исследуемых параметров: оценить уровень экспрессии адгезивных СЭ2, С011а и СБ29 рецепторов мембран только Т-лимфоцитов; показать отсутствие колебаний процентного содержания С03+С02+, СОЗ+СБ11а+ и С03 С029 лимфоцитов, а, соответственно, и их вклада в модуляцию экспрессии адгезивных рецепторов мембран иммуноцитов после воздействия широкого диапазона доз УФ-света (151+1359 Дж/м2) в условиях последующей суточной инкубации; выявить более четкую динамику изменения уровня экспрессии С02, С011а и СЭ29 маркеров на поверхности мембран лимфоцитарных клеток.

Таким образом, УФ-излучение и циклоферон существенно влияют на антигенный профиль лимфоцитарных мембран, вызывая разнонаправленные изменения его состояния в зависимости от типа рецептора и индивидуальных особенностей Т-лимфоцитов доноров. Основными путями регуляции иммунофенотипа клеточных мембран, по-видимому, является активация синтеза молекул рецепторов de novo, изменение конформации исследуемых антигенов в результате поглощения квантов света хромофорами их белковых

А «мЭд % 1 Б m.HS.I s s § г

t 2 i 1 1 2 s I 2

! О о' ¡0 К D 9 u D

| Г , -1 i 4 4 -3 !

Д.....I......

i 2

I ОМ IK

СШ-НТС

CD2-FITC '

|Ж.....1.......«¿a? % s В ¿3,1 4»*

jf i 2 В 1: 2

s| ! Щ %: D "

л [в I

4 3 4

,1 i i'jy ■V, SiXS

CDila-FtTC

1Г............

Ш ¡1

Cblla-Fr'rC

.1 ! ¡0 its CP2-F1TC

Д 54,3*4,9 %

8 2

' й D«l

r-\- *

В.............lii i Г ЩМ-V ,4 Si jj

m D ' 9. Ш D

3 4 3 1

47,ls42%

| A 1 21 D

CD29-HTC

СШ9-ЯТС

biwrrc * CT»HTC

............ашщ §r~T~#bSBT".

i 4 I

Bli)06 СШМТГС

A 47,9*48

P f

-Ш

О X

Рис. 2. Двухпараметрические гистограммы распределения лимфоцитов периферической крови, модифицированных УФ-светом, с использованием моноклональных антител против CD3 и CD2 (I), CDlla (II), CD29 (I группа -III, II группа - IV), меченных Phycoerythrin (РЕ) и Fluorescein Isothiocyanate (FITC). По осям ОХ и OY отражена интенсивность флуоресценции соответствующих антител: А) интактные Т-лимфоциты; Б) Т-лимфоциты, облученные УФ-светом в дозе 151 Дж/м2; В) Т-лимфоциты, облученные УФ-светом в дозе 453 Дж/м2; Г) Т-лимфоциты, облученные УФ-светом в дозе 906 Дж/м2; Д) Т-лимфоциты, облученные УФ-светом в дозе 1359 Дж/м2. Квадранты: D1 - СБЗ+С02"лимфоциты; D2 - СОЗ+С02+лимфоциты; D3 - CD3 CD2" лимфоциты; D4 - СОЗ"С02+лимфоциты; в % указано содержание клеток в квадранте дубль-позитивных клеток

молекул и/или взаимодействие с молекулами циклоферона, а также опосредованное действие исследуемых физико-химических агентов путем изменения микроокружения исследуемых рецепторов (в результате активации процессов ПОЛ и/или ПФОЛ мембраны лимфоцитов).

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНОГО СОСТОЯНИЯ МЕМБРАН Т-ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ В УСЛОВИЯХ КОМПЛЕКСНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ АГЕНТОВ

С целью выяснения вклада в изменение экспрессии исследуемых адгезивных рецепторов процессов структурных перестроек мембран Т-лимфоцитов в условиях одиночного и сочетанного воздействия УФ-излучения и блокаторов синтеза белка - циклогексимида и анизомицина, был использован метод флуоресцентных зондов с применением зонда 1-анилинонафталин-8-сульфонат (1,8-АНС).

Выявлено снижение интенсивности флуоресценции зонда 1,8-АНС при связывании с мембранами Т-лимфоцитов, УФ-облученных широким диапазоном доз (151-4359 Дж/м) УФ-света (рис. 3). Данные изменения сопровождаются сдвигом максимума флуоресценции зонда 1,8-АНС в коротковолновую область, что характерно для его комплексов с гидрофобными

Рис. 3. Изменение интенсивности флуоресценции зонда 1,8-АНС при связывании с мембранами нативных и модифицированных Т-лимфоцитов: 1 - нативные Т-лимфоциты + 1,8-АНС; 2 — Т-лимфоциты, модифицированные циклогексимидом + 1,8-АНС; 3 - Т-лимфоциты, модифицированные анизомицином + 1,8-АНС

Полученные результаты свидетельствуют о протекании процессов структурной модификации компонентов мембран лимфоцитарных клеток в условиях их УФ-облучения. По-видимому, индуцированные УФ-светом процессы ПФОЛ способствуют повышению микровязкости липидного бислоя, снижению общего содержания белковых молекул и делают доступными для зонда более глубокие и гидрофобные слои мембраны (Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко 2006; В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина, 2008).

Влияние блокаторов синтеза белка на структурное состояние мембран фотомодифицированных лимфоцитов, предположительно, осуществляется опосредованно, за счет ингибирования процессов тотального синтеза белка клетки. Уменьшение общего пула белковых молекул в мембранах лимфоцитарных клеток, по-видимому, вызывает уменьшение сорбции зонда на

группами белков (Г.Е. Добрецов, 1989).

1фл, отн.сд.

0 151 453 906 1359 Доза

облучения, Дж/м'

внешней поверхности Т-лимфоцитов и, соответственно, снижение интенсивности флуоресценции 1,8-АНС.

Таким образом, выявленные модификации состояния мембран иммуноцитов будут вносить вклад в процессы модуляции экспрессии адгезивных рецепторов Т-лимфоцитов.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ПРОЦЕССОВ КЭППИНГА АДГЕЗИВНЫХ CD2 И CD1 la/CD 18 РЕЦЕПТОРОВ Т-ЛИМФОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ УФ-СВЕТА И ЦИКЛОФЕРОНА

С целью выяснения возможного вклада в модификацию экспрессии адгезивных рецепторов мембран Т-лимфоцитов процессов их кэппинга в условиях воздействия УФ-излучения и циклоферона нами был использован метод люминесцентной микроскопии.

На рис. 4 представлены типы флуоресцирующих комплексов, характерных для нативных и фотомодифицированных лимфоцитов. CD2 и CD1 la/CD18 рецепторов с FlTC-меченными лигандами.

Рис. 4. Типы распределения флуоресцирующих комплексов CD2 и CD 11 a/CD 18 рецепторов с FlTC-меченными лигандами, характерных для нативных и модифицированных лимфоцитов: а) периферическое; б) «кэп '/г»; в) «кэп Ул»; г) амебовидное

Установлено, что в суспензиях интактных Т-клеток соотношение лимфоцитов с периферическим типом свечения и клеток, кэппирующих CD2 маркеры, равно 63 : 37, a CDlla/CD18 рецепторы - 5 : 95, т.е. нативные Т-лимфоциты характеризуются способностью в большей степени кэпппировать CDlla/CD18 рецепторы, чем CD2 маркеры. Это, вероятно, обусловлено тем, что ведущая роль в процессе обеспечения контакта между реагирующими клетками отводится именно интегрину LFA-1 (M.L. Dustin et al., 1996; P.A. Van der Merwe, 1999; M.K. Wild et ab, 1999; P.A. Van der Merwe et al., 2000; A.A. Ярилин, 2001; A.A. Ярилин, 2003).

Из всего используемого в работе диапазона доз УФ-света только облучение Т-лимфоцитов УФ-светом в дозе 1359 Дж/м2 способствует увеличению доли клеток с амебовидным и «кэп 'А» типом свечения CD2 рецепторов на фоне падения числа иммуноцитов, находящихся на стадии «кэп Vi» и периферическим типом свечения. При этом возрастает количество иммуноцитов, несущих FlTC-меченные антитела против CDlla антигенов, в

состояние амебовидный «кэп» и уменьшается - на стадии «кэп %». Следовательно, УФ-излучение (1359 Дж/м2) вызывает увеличение подвижности адгезивных рецепторов, с преимущественной их локализацией на одном полюсе клетки (амебовидный тип).

Установлено, что циклоферон не оказывает статистически достоверного влияния на подвижность адгезивных CD2 и CD 11 a/CD 18 рецепторов мембран иммуноцитов, по-видимому, вызывая изменение их уровня экспрессии посредством протекания ряда реакций, не связанных с модуляцией интенсивности процессов кэппинга исследуемых мембранных структур.

Глава 6. ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ ЦИТОКИНПРОДУЦИРУЮЩЕЙ

СПОСОБНОСТИ НАТИВНЫХ И ФОТОМОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ КОМПЛЕКСНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ИНДУКТОРА ИНТЕРФЕРОНА «ЦИКЛОФЕРОН» И ФИТОГЕМАГГЛЮТИНИНА

С целью выяснения вклада в модуляцию экспрессии адгезивных рецепторов мембран Т-лимфоцитов интерференовой сети регуляции были проведены эксперименты по исследованию влияния УФ-излучения и циклоферона на способность лимфоцитарных клеток спонтанно и в условиях ФГА-стимуляции продуцировать интерфероны I и II типа.

Исходя из анализа данных литературы, 1 ME ИФН I типа примерно соответствует 1 пг белка (В.А. Шмелев, 2008), следовательно, можно говорить о том, что интактные лимфоциты in vitro спонтанно синтезируют а-, у- и ß-ИФН, причем в меньшей степени последний (рис. 5). Из всего использованного в работе диапазона доз только воздействие УФ-излучения в «терапевтической» дозе (151 Дж/м2) выступает в роли активатора спонтанного синтеза а-ИФН, а в дозах 453-1359 Дж/м2 и 151-Н359 Дж/м - ингибитора синтеза а-ИФН и у-ИФН соответственно. Негативное воздействие «малых» доз УФ-света лимфоцитарные клетки, по-видимому, пытаются нивелировать путем запуска синтеза и замены недостающего уровня одного из типов ИФН другим (вероятно, менее чувствительных к данному физическому агенту). Однако с увеличением дозы УФ-излучения вышеописанный механизм не реализуется, предположительно, из-за сильного депрессивного влияния УФ-света на звенья интерферонсинтезирующих систем.

Сочетанное влияние циклоферона и митогена на интактные и фотомодифицированные в дозе 151 Дж/м2 иммунокомпетентные клетки приводит к продукции у-ИНФ в концентрациях, больших по абсолютному значению, чем при индукции только ФГА. Интенсивность процесса митогеииндуцнрованного синтеза у-ИНФ лимфоцитами падает с увеличением дозы УФ-излучения, т.е. имеет динамику, сходную со спонтанной продукцией у-ИФН УФ-облученными лимфоцитами. Это, вероятно, свидетельствует о существовании перекрестных звеньев путей действия данных модификаторов на лимфоцитарные клетки.

Путем повышения митогенчувствительности клеток циклоферон способен активировать синтез у-ИФН лимфоцитами (W. Roemer, W. Schulze, 1983; W. Roemer et al., 1986).

Механизм интерферониндуцирующей активности циклоферона, вероятно, в большей степени опосредован его взаимодействием со специфическим рецептором на поверхности мембран клеток, участием в качестве одного из звеньев в сигналпроводящих путяхответственных за синтез ИФН, влиянием на содержание вторичных внутриклеточных посредников, а

[бета-ИФН], МЕ/мл 120:......

100:

60;

40!

1359Доза облучения, Дж/м;

[аяьфа-ИФН]. пг/мл бОг

1359 Доза облучения. Дж/м3 ]

[гамма-ИФН 300:

250

1359 Доза облучения. Дж/м"

Рис. 5. Продукция Р-ИФН (А), а-ИФН (Б) и у-ИФН (В) Т-лимфоцитами человека в условиях комплексного воздействия УФ-света, препарата «Циклоферон» и ФГА: 1 - нативные Т-лимфоциты;

2 - Т-лимфоциты,

модифицированные циклофероном;

3 - лимфоциты, модифицированные ФГА; 4 - лимфоциты, модифицированные ФГА и циклофероном;

также способностью усиливать продукцию клетками активных форм кислорода (АФК), и, в меньшей степени, непосредственным связыванием с ДНК и запуском синтеза молекул ИФН (W. Roemer, W. Schulze, 1983; Е. Piasecki et al., 1985; W. Roemer et al., 1986; А. Альберт, 1989; С.Г. Суркова и др.,

1996; А.Л. Коваленко и др., 20006; Ф.И. Ершов, О.И. Киселев, 2005; И.Е. Савостина, 2005; П.А. Заколяпин и др., 2007).

Таким образом, чувствительность процессов спонтанного и ФГА-индуцированного синтеза ИФН клетками определяется природой воздействующего агента (УФ-свет и циклоферон) и первоначальным состоянием клетки (присутствие или отсутствие митогена). Физико-химические агенты, использованные нами в работе, по-видимому, имеют общие мишени воздействия на процессы синтеза ИФН и/или их регуляции лимфоцитарными клетками.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При помощи методов твердофазного иммуноферментного анализа, проточной цитофлуориметрии, флуоресцентных зондов и люминесцентной микроскопии исследованы пути модуляции адгезивного рецепторного аппарата мембран Т-лимфоцитов крови человека в условиях воздействия УФ-излучения (240-390 нм) в дозах 151+1359 Дж/м2, медицинского препарата «Циклоферон» (0,2 мг/мл), митогена - фитогемагглютинина и блокаторов белкового синтеза -циклогексимида и анизомицина.

Полученные данные по исследованию влияния УФ-света на экспрессию комплекса адгезивных CD2, CDlla и CD29 маркеров Т-лимфоцитами крови доноров, суммарное представление которых отражено на рис. 21, позволили нам констатировать следующее. По-видимому, под действием УФ-света в мембранах Т-лимфоцитов, в первую очередь, активируются процессы, сопровождающиеся структурными перестройками лимфоцитарных мембран, результатом протекания которых является снижение уровня экспрессии рецепторных молекул и, в частности, CD2, CDlla и CD29 маркеров (шеддинг рецепторов, интернализация в более глубокие слои гликокаликса, изменение конформации молекулы маркеров в результате прямого или опосредованного действия УФ-света на клетку). В дальнейшем в ходе суточной инкубации УФ-облученные лимфоциты путем запуска процессов синтеза de novo молекул адгезии «пытаются» нивелировать воздействие УФ-света, «вернув» значения уровня экспрессии исследуемых антигенов до контрольных показателей. Предположительно, в зависимости от индивидуальных особенностей доноров, а также от фоточувствительности систем, ответственных за образование и экспрессию на поверхность мембраны новых CD2, CDlla и CD29 молекул, в целом зависит успешность протекания данных реакций. Итогом последних может являться возврат показателей до уровня интактных клеток (CD2 и CD11а антигенов), уменьшение (CD29 маркеров у I группы лиц) или же увеличение в большей, по сравнению с контролем, экспрессии данных рецепторов (CD29 маркеров у II группы доноров).

Известно, что составляющие лимфоцитарного гликокаликса, играющего важнейшую роль в процессах межклеточных взаимодействий, обладают высокой лабильностью (легко десорбируются и переходят в раствор). Вероятно, результатом протекания вышеописанных УФ-индуцированных процессов, является уменьшение общего содержания белковых молекул во внешнем примембранном слое Т-лимфоцитов. По-видимому, именно этим обусловлено

снижение флуоресценции зонда 1,8- АНС в связанном с мембранами фотомодифицированных клеток состоянии.

Предположительно, увеличение образования АФК клеткой в условиях УФ-облучения открывает возможность для протекания с их участием реакций, способствующих активации факторов транскрипции, которые обеспечивают ускорение процессов синтеза молекул CD2, CDlla и CD29 маркеров Т-лимфоцитов.

Воздействие «большой» дозы УФ-излучения (1359 Дж/м3), вероятно, оказывает сильное ингибирующее действие на экспрессию исследуемых молекул адгезии, что сопровождается падением экспрессии последних и практически полным отсутствием активации их синтеза de novo. Одновременно под действием УФ-света в дозе 1359 Дж/м2 наблюдается усиление кэппинга мембранных CD2 и CD 11 a/CD 18 рецепторов, вероятно, опосредованное фотомодификацией кэппирующих белков цитоскелета клеток. Это также свидетельствует об изменении структурных свойств мембраны и, по-видимому, функциональных характеристик исследуемых рецепторов, поскольку шеддинг и кэппинг - процессы, позволяющие клетке регулировать необходимую физиологическую плотность рецепторов на поверхности мембраны и, тем самым, обеспечивать необходимое для иммунного ответа их количество.

Таким образом, предположительно, итогом протекания вышеописанных процессов, индуцированных УФ-излучением, в клетках крови является изменение антителосвязывающей способности адгезивных CD2, CD11а и CD29 маркеров мембран Т-лимфоцитов.

Процессы синтеза ИФН в ряду их фоточувствительности от менее к более фоторезистентной, располагаются следующим образом: Р-ИФН —» у-ИФН —* а-ИФН. Вероятно, благодаря различной фотолабильности звеньев цепей реакций синтеза ИФН, и в первую очередь генов, кодирующих молекулы ИФН, и их генов-регуляторов, реализуется возможность компенсации недостатка образования у-ИФН увеличением продукции а/р-ИФН в суспензиях иммуноцитов, фотомодифицированных в дозе 151 Дж/м2. Хотя реакции образования Р-ИФН Т-лимфоцитами подвержены большему ингибирующему действию УФ-излучения, по-видимому, за счет тесной взаимосвязи путей синтеза и биологического действия а-ИФН и Р-ИФН наблюдается сходная динамика их продукции фотомодифицированными (151 Дж/м2) клетками.

Анализ общей схемы реакций нативных и фотомодифицированных Т-лимфоцитов (151-И359 Дж/м2) на воздействие циклоферона (0,2 мг/мл), представленной на рис. 22, позволил выявить следующее. Увеличение экспрессии CD2, CD11а и CD29 маркеров в условиях воздействия циклоферона интактными и фотомодифицированными Т-лимфоцитами было обусловлено, в первую очередь, усилением синтеза de novo молекул рецепторов. По-видимому, его реализация достигается посредством одиночного и/или сочетанного с УФ-излучением усиления процессов образования клетками АФК. Они активируют факторы транскрипции NF-кВ и АР-1, которые, в свою очередь, инициируют процессы трансляции белков адгезии. Кроме того, взаимодействия циклоферона с ДНК могут обеспечивать запуск транскрипции генов CD2, CDlla и CD29 маркеров. Однако нельзя исключать возможность изменения

антителосвязывающей способности исследуемых рецепторов

посредством изменения их конформации в результате взаимодействия с молекулами АУК.

Разнонаправленное действие (увеличение или уменьшение) циклоферона на уровень экспрессии CD2, CDlla и CD29 маркеров, по-видимому, может также достигаться посредством активации синтеза ИФН I типа Т-лимфоцитами. Это подтверждается зарегистрированным нами ростом концентрации данных цитокинов на фоне увеличения уровня экспрессии молекул клеточной адгезии и падением - в условиях пониженного содержания a/ß-ИФН. Так, известно, что ИФН I типа способны усиливать экспрессию клетками ряда мембранных молекул, в том числе и молекул адгезии (A.A. Ярилин, 1999).

Увеличение циклофероном спонтанного образования лимфоцитами человека в большей степени ß-ИФН и в меньшей - a-ИФН и отсутствие влияния на синтез у-ИФН согласуется с данными литературы и свидетельствует в пользу широко обсуждаемой «рецепторной» теории синтеза ИФН клеткой под воздействием циклоферона (Е. Piasecki et al., 1995; С.Г. Суркова и др., 1996; М.Г. Романцов, Ю.В. Аспель, 2000; A.J1. Коваленко и др., 2000). Увеличение продукции ФГА-стимулированными лимфоцитами у-ИФН под действием интерфероногена, по-видимому, подтверждает установленную ранее возможность повышения циклофероном чувствительности клеток к действию митогенов, за счет снижения содержания внутриклеточного cAMP (W. Roemer, W. Schulze, 1983; W. Roemer et al., 1986; А.Л. Коваленко и др., 2000).

Вышесказанное свидетельствует о существенной модуляции структурного состояния и экспрессии адгезивных рецепторов мембран Т-лимфоцитов, а также их интерферонпродуцирующей способности в условиях комплексного воздействия различных физико-химических агентов. По-видимому, в зависимости от типа рецепторной молекулы и ИФН, индивидуальных особенностей клеток доноров и свойств используемых модификаторов, последние оказывают разнонаправленные и различной силы воздействия на уровень экспрессии CD2, CDlla и CD29 маркеров и процессы синтеза ИФН клетками.

CD2 и CDlla/CD18 рецепторы, являясь представителями различных семейств молекул клеточной адгезии - суперсемейства иммуноглобулинов и ß2-семейства интегринов, обеспечивающих начальный контакт клеток и дальнейшую стабильную сигнализацию между ними, обладают сходными типами ответной реакции на исследуемые физико-химические агенты. Так, Т-лимфоциты способны в ответ на воздействие широкого диапазона доз (151-906 Дж/м2) УФ-света сохранять уровень экспрессии CD2 и CD1 la/CD18 рецепторов неизменным. Это, по-видимому, обусловлено, в первую очередь, сходным процентным содержанием потенциальных акцепторов УФ-излучения в молекулах данных рецепторов. Кроме того, поддержание постоянства экспрессии этих маркеров позволяет клетке в условиях воздействия агентов различной природы обеспечивать высокую готовность Т-лимфоцитов к распознаванию антигена, активации и дальнейшей дифференцировке в клетки-эффекторы. Сходство реакций данных молекул на воздействие циклоферона также свидетельствует в пользу тождественного типа регулирования

УФ-свег (1359 Л;ж/мг)

Поглощение ?нс|>1 ми киатом хромофорами УФ-нал умения

НшибнроЕШше

<:ггиге{:» «-НФН.р-ИФН

у-ИФН *

Фтомодификацк*

КОМИ 1)11СНТОВ

цигоскелста

Лктиаация процессов СИНТСЗД ЛФК И ПОЛ

Увеличение полмшности адгошшых СШ иСГЛ1а.-С018 реиепторо»

>-кегштпгг*'-х|н]к"кт

Струиггуртас I Ьжнгяис модификации конформашш мембраны алкчнашах репетиров и их лктншшх нет ров

ЦнКЛОфсрОИ

В пшмодежпвне с молекулами с т. СШ 1а и С:02У маркеров

Ншененпе конформашш

ЛАГСИГАИМХ рецензоров н их ;шн»нмх центров

Лктшшм факторов ТрШ ес к рш щи и Мг-к:В.Л!Ч

ШмеНОШС

" мнкршкружетгя молекул <гт'.шн

Изменение >роиня эксиресснн адгезивных (1)2, СО) 1а и С 02 9 маркеров

Модуляция реца норного аппарата алгечии меморан Т-;шмфиц«кт человека

Рис. 6а. Схема процессов, способствующих модуляции адгезивного рецепторного аппарата мембран Т-лимфоцитов крови человека, в условиях комплексного воздействия УФ-света в дозе 1359 Дж/м2 и циклоферона (0,2 мг/мл)

УФ-и'пучшж' (151 Дж/м?

Циклоферон

Имдошеиие оперши Х(.ч>«офорами УФч~нгг?

Н»{!ч;Гиф1»«»иис спитс г* у-ИФН

Актн^аии* сшпеча л-ИФП.(ИМ>1! •у-ИФН

Шзммодсйствне < мембранными рецепторами

Нлмеж-ние кок(|ч>рмаии» ада'итяшч реиепшрон и и.\ активных «строк

■ Итенет!? уровня гжеярессш? ааге.иишых СО 2, СОИ и иС0-1> маркеров

Молуляшн реиепториоп-» аппарату адгечин мембран Т-лимфоцитов человека

Рис. 66. Схема процессов, способствующих модуляции адгезивного рецепторного аппарата мембран Т-лимфоцитов крови человека, в условиях комплексного воздействия «терапевтической» дозы (151 Дж/м2) УФ-света и циклоферона (0,2 мг/мл)

функционального состояния данных рецепторов Т-лимфоцитами, в том числе и на интерфероновую сигнализацию.

Представители pi-семейства интегринов - CD49/CD29 рецепторы -являются более лабильными молекулами, что, по-видимому, связано с большим содержанием хромофоров УФ-излучения. Экспрессия данных молекул более чувствительна к воздействию циклоферона. Вероятно, посредством быстрого изменения экспрессии CD49/CD29 маркеров, в ответ на экзо- и эндогенные стимулы, Т-лимфоциты регулируют свою миграцию в эффекторные зоны иммунной системы для выполнения специфических функций.

Таким образом, предположительно, регистрируемые нами изменения будут вносить существенный вклад в модификацию функциональной активности молекул клеточной адгезии человека и, соответственно, путей сигнализации с ними связанных. Это необходимо учитывать при прогнозировании эффектов АУФОК и ЭИФТ-терапии в клинике лечения заболеваний, сопровождающихся дефектами протекания процессов межклеточных взаимодействий различной этиологии.

На основании анализа результатов проведенных экспериментов и данных литературы предложена схема процессов модификации состояния адгезивного аппарата мембран Т-лимфоцитов крови человека в условиях сочетанного воздействия УФ-излучения и препарата «Циклоферон» (рис. 6а, б).

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что после суточной инкубации УФ-облученных Т-лимфоцитов нормализуются значения показателей экспрессии CD2 рецепторов (151-906 Дж/м2) и CDlla маркеров (151-453 Дж/м2) за счет активации процессов синтеза их de novo.

2. Выявлено, что УФ-излучение в дозе 1359 Дж/м2 индуцирует уменьшение уровня экспрессии CD2 и CDlla маркеров Т-лимфоцитами на фоне усиления кэппинга данных молекул.

3. Обнаружено иммунокорригирующее действие УФ-излучения (151-Н359 Дж/м2) на экспрессию CD29 маркеров Т-клетками.

4. Изменений процентного содержания CD3+CD2+, CD3+CDlla+ и СОЗ+С029+лимфоцитов после суточной инкубации УФ-облученных (151-4359 Дж/м2) суспензий Т-клеток не происходит.

5. Выявлено, что воздействие на Т-лимфоциты УФ-излучения в дозах 151-И359 Дж/м2 сопровождается снижением интенсивности флуоресценции зонда 1,8-АНС и смещением его максимума флуоресценции в коротковолновую область, что свидетельствует о протекании процессов структурной фотомодификации мембран названных клеток.

6. Обнаружено, что блокаторы синтеза белка (циклогексимид и анизомицин) вызывают уменьшение интенсивности и смещение максимума флуоресценции в более коротковолновую область зонда 1,8-АНС при взаимодействии его с УФ-облученными Т-лимфоцитами.

7. Установлено, что воздействие УФ-излучения в дозе 151 Дж/м2 усиливает продукцию Т-клетками a/p-интерферонов, а в дозах 453-1359 Дж/м2 - угнетает синтез указанных цитокинов, при этом УФ-свет (151-И359 Дж/м2) выступает в

качестве ингибитора спонтанного и фитогемагглютинин-индуцированного синтеза у-интерферона.

8. Показано, что циклоферон - индуктор интерферона - увеличивает за счет образования новых молекул адгезии экспрессию CD2 рецепторов нативными Т-лимфоцитами, CDlla маркеров - интактными и УФ-облученными в дозе 151 Дж/м2 клетками, при этом наблюдается угнетение экспрессии CD2 и CDlla рецепторов Т-лимфоцитами, УФ-модифицированными в дозе 906 Дж/м2.

9. Циклоферон оказывает иммунокорригирующее влияние на экспрессию CD29 молекул нативными Т-лимфоцитами и фотомодифицированными (151-4359 Дж/м2) клетками.

10. Обнаружено, что циклоферон индуцирует увеличение продукции а- и ß-интерферона Т-лимфоцитами, предварительно облученными УФ-светом соответственно в дозах 151-453 Дж/м2и 151-906 Дж/м2.

11. Циклоферон не оказывает влияния на спонтанную продукцию Т-клетками у-интерферона, активируя процессы его образования только в присутствии фитогемагтлютинина.

12. Сочетанное воздействие УФ-излучения и циклоферона оказывает существенное влияние на формирование иммунофенотипа Т-лимфоцитов посредством модуляции экспрессии молекул клеточной адгезии, сопровождающейся структурными перестройками лимфоцитарных мембран и включением в данные процессы интерфероновой сети регуляции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.06 уровне CD2 рецепторов на мембранах УФ-облученных Т-лимфоцитов крови человека / В.Г. Артюхов, О.В. Путинцева, И.А. Колтаков, С.М. Дубова // IV съезд фотобиологов России: материалы съезда, Саратов, 26-30 сентября 2005. - Саратов, 2005.-С. 13.

2. Исследование адгезивной способности Т-лимфоцитов крови здоровых доноров, модифицированных воздействием больших доз УФ-света / О.В. Путинцева, С.М. Дубова. И.А. Колтаков, В.Г. Артюхов // Владикавказский медико-биологический вестник: материалы конференции. - 2007. - Т. VII, Вып. 13. - С. 295-296.

3. Уровень экспрессии трансмембранных CD2 рецепторов нативными и УФ-облученными Т-лимфоцитами человека и их способность вступать в реакции розеткообразования с эритроцитами барана / Артюхов В.Г., Путинцева О.В., Колтаков И.А., Дубова С.М. // - Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2008. - №1. - С. 74-79.

4. Исследование функциональной активности CD2 рецепторов мембран Т-лимфоцитов в условиях УФ-облучения и воздействия циклоферона / В.Г. Артюхов, О.В. Путинцева, С.М. Дубова // Биология: теория, практика, эксперимент: сборник материалов международной научной конференции, Саранск, 2008. - Саранск, 2008. - С. 242-243.

5. Влияние "Циклоферона" на уровень экспрессии и функциональную активность CD2 рецепторов мембран Т-лимфоцитов крови человека / В.Г. Артюхов, О.В. Путинцева, С.М. Дубова // Производственная, клиническая и

транспортная трансфузиология: этапы реформирования, инфекционная и иммунологическая безопасность, критерии качества: сборник научно-практических работ №2. - Воронеж, 2008. - С. 161-166.

6. Влияние препарата «Циклоферон» на уровень экспрессии иА-1 рецепторов на поверхности мембран нативных и фотомодифицированных Т - лимфоцитов крови человека / О.В. Путинцёва, С.М. Дубова. В.Г. Артюхов // Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: сборник статей восьмого съезда белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков, Минск, 25-27 июня, 2008 г. - Минск, 2008. - С. 257-259.

7. Исследование фотоиндуцированных изменений уровня экспрессии некоторых мембранных маркеров Т-лимфоцитов крови человека / В.Г. Артюхов, О.В. Путинцёва, И.А. Колтаков, В.А. Вдовина, С.М. Дубова // Электромагнитные излучения в природе БИО-ЭМИ-2008: труды четвертой международной научной конференции, Калуга, 21-23 октября, 2008 г. — Калуга, 2008.-С. 17-23.

8. Снижение экспрессии ЬРА-1 молекул Т-лимфоцитов человека, индуцированное УФ-светом в дозе 1359 Дж/м2 / С.М. Дубова. В.Г. Артюхов, О.В. Путинцёва // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов, Воронеж. - 2008. - Вып. 10. - С. 86-88.

9. Влияние УФ-облучения на экспрессию ЬРА-1 молекул Т-лимфоцитами крови доноров / С.М. Дубова. В.Г. Артюхов, О.В. Путинцёва // V Съезд Российского фотобиологического общества: тезисы докладов, Пущино, 8-13 июня 2008 г. - Пущино, 2008. - С. 166.

10. Иммуноферментное определение адгезивной способности фотомодифицированных лимфоцитов человека / В.Г. Артюхов, О.В. Путинцёва, С.М. Дубова // Второй международный форум «Аналитика и Аналитики»: рефераты докладов, Воронеж, 22-26 сентября, 2008 г. - Т. 2. - С. 514.

11. Поверхностный фенотип Т-лимфоцитов крови человека в условиях их УФ-облучения / В.Г. Артюхов, О.В. Путинцёва, В.А. Вдовина, С.М. Дубова. И.А. Колтаков // Научные труды II съезда физиологов СНГ, Молдавия, Кишенев 29-31 октября, 2008 г. - Молдавия, 2008. - С. 157.

12. Сочетанное влияние иммуномодулятора «Циклоферон» и УФ-света на уровень экспрессии некоторых адгезивных молекул Т-лимфоцитами крови человека / Дубова С.М. // «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы»: сборник тезисов Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых, Белгород, 14-17 октября, 2009 г. - Белгород, 2009. - С. 18-21.

13. Уровень экспрессии некоторых адгезивных молекул интактными и УФ-облученными Т-лимфоцитами крови человека / В.Г. Артюхов, О.В. Путинцёва, С.М. Дубова // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11.-№ 1.-С. 79-84.

14. Влияние «Циклоферона» на экспрессию адгезивных С029 молекул мембранами нативных и УФ-облученных Т-лимфоцитов человека / С.М. Дубова // Тезисы Международной научной школы для молодежи «Инновационные технологии в здравоохранении: молекулярная медицина, клеточная терапия, трансплантология, реаниматология, нанотехнологии», Международной научной конференции «Инновационные технологии в

реальном секторе экономики», Заседания Экспертного Совета по программе «УМНИК», Екатеринбург, 9-12 ноября 2009 г, Уральская государственная медицинская академия, Екатеринбург, 2009. - С. 75-77.

15. Экспрессия СВ2 рецепторов на мембранах Т-лимфоцитов человека в условиях воздействия УФ-света и циклоферона / С.М. Дубова. О.В. Путинцева, В.Г. Артюхов // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва 8-11 февраля 2010 г., Москва 2010. - С. 83.

16. Изменение уровня экспрессии СВ2 и С011а антигенов Т-лимфоцитами крови человека в условиях одиночного и сочетанного воздействия УФ-света и препарата «Циклоферон» / С.М. Дубова // Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 1000-летию г. Ярославля «Актуальные вопросы медицинской науки»: тезисы докладов, Ярославль, 22 апреля 2010 г. - Ярославль, 2010. - С. 59.

17.0 механизме модулирующего действия УФ-света на состояние антигенного профиля мембран Т-лимфоцитов крови человека / С.М. Дубова. О.В. Путинцева, В.Г. Артюхов // Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация. -2010,- № 1. - С. 76-81.

18. Иммуномодулирующее влияние УФ-света на экспрессию УЬА рецепторов Т-лимфоцитами человека / О.В. Путинцева, С.М. Дубова. В.Г. Артюхов // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов, Воронеж. -2010.-Вып. 12.-С. 179-182.

19. Модуляция антигенного профиля мембран Т-лимфоцитов крови человека в условиях их УФ-облучения / В.Г. Артюхов, О.В. Путинцева, С.М. Дубова // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования», Уфа, февраль 2010 г. - Т. 2. - С. 211-215.

20. Влияние УФ-излучения на процесс синтеза у-интерферона лимфоцитами крови человека / О.В. Путинцева, В.Г. Артюхов, В.А. Вдовина, С.М. Дубова // Материалы международной научной конференции «Современные проблемы радиобиологии», Гомель 14-15 октября 2010 г. - Минск, 2010. - С. 96-97.

Статьи № 13 и 17 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Подписано в печать 24.11.10. Формат 60*84 1/|6. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 1486.

Отпечатано с готового оригинал-макега в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дубова, Светлана Михайловна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ

ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика Т-лимфоцитов и их субпопуляций.

1.1.1. Формирование Т-клеток.

1.1.2. Функциональные особенности субпопуляций Т-лимфоцитов.

1.1.3. Особенности строения лимфоцитов и их мембран.

1.2. Молекулы клеточной адгезии.

1.2.1. Структура и функции СБ2 рецептора.

1.2.2. Структура и функции СВ11а/СБ18 рецептора.

1.2.3. Структура и функции СБ49/С029 рецепторов.

1.3. Структурно-функциональная УФ-модификация клеток крови.

1.4. Особенности влияния препарата «Циклоферон» на структурно-функциональное состояние иммуноцитов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение лимфоцитов из крови доноров.

2.2.2. Определение жизнеспособности клеток.

2.2.3. Получение популяции Т-лимфоцитов.

2.2.4. Облучение Т-лимфоцитов УФ-светом.

2.2.5. Модификация Т-лимфоцитов препаратом «Циклоферон», фитогемагглютинином и блокаторами синтеза белка.

2.2.6. Использование метода иммуноферментного анализа для определения экспрессии СВ2, СБ11а и СБ29 антигенов Т-лимфоцитами человека.

2.2.7. Определение концентрации а-ИФН в супернатанте Т-лимфоцитов при помощи метода твердофазного иммуноферментного анализа.

2.2.8. Определение концентрации у-ИФН в супернатанте Т-лимфоцитов при помощи метода твердофазного иммуноферментного анализа.

2.2.9. Определение концентрации (3-ИФН в супернатанте Т-лимфоцитов при помощи метода твердофазного иммуноферментного анализа.

2.2.10. Исследование структурного состояния лимфоцитарных мембран при помощи флуоресцентного зонда 1,8-АНС.

2.2.11. Использование метода проточной цитофлуориметрии для оценки экспрессии адгезивных молекул мембран Т-лимфоцитов.

2.2.12. Определение изменения локализации CD2 и CD 11 a/CD 18 рецепторов на мембранах Т-лимфоцитов с помощью метода люминесцентной микроскопии.

2.2.13. Статистическая обработка результатов.

3.1. Исследование влияния УФ-света на уровень экспрессии CD2, CD 11а и CD29 маркеров Т-лимфоцитами.

3.2. Изучение влияния медицинского препарата «Циклоферон» на уровень экспрессии адгезивных CD2, CDlla и CD29 маркеров нативными и УФ-облученными Т-лимфоцитами.

3.3. Изучение влияния блокаторов синтеза белка на уровень экспрессии CD2, CDlla и CD29 антигенов Т-лимфоцитами в условиях воздействия УФ-излучения и циклоферона.

3.3.1. Изучение влияния циклогексимида на уровень экспрессии CD2, CDlla и CD29 маркеров Т-лимфоцитами в условиях воздействия УФ-излучения

3.3.2. Изучение влияния циклогексимида на уровень экспрессии CD2, CDlla и CD29 маркеров Т-лимфоцитами в условиях сочетанного воздействия УФ-излучения и циклоферона.

3.3.3. Изучение влияния анизомицина на уровень экспрессии CD2, CD11а и CD29 маркеров нативными и УФ-облученными Т-лимфоцитами.

3.3.4. Изучение влияния анизомицина на уровень экспрессии CD2, CD11а и CD29 маркеров Т-лимфоцитами в условиях сочетанного воздействия УФ-излучения и циклоферона.

3.4. Использование метода проточной цитофлуориметрии для оценки влияния УФ-излучения на экспрессию CD2, CD 11 а и CD29 маркеров Тлимфоцитами.

4.1. Исследование влияния УФ-излучения на структурное состояние мембран Т-лимфоцитов методом флуоресцентных зондов.

4.2. Исследование влияния циклогексимида на структурное состояние лимфоцитарных мембран в условиях воздействия УФ-света методом флуоресцентных зондов.

4.3. Исследование влияния анизомицина на структурное состояние лимфоцитарных мембран в условиях воздействия УФ-света методом флуоресцентных зондов.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ПРОЦЕССОВ КЭППИНГА АДГЕЗИВНЫХ CD2 И CDlla/CD18 РЕЦЕПТОРОВ Т-ЛИМФОЦИТОВ В

УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ УФ-СВЕТА И ЦИКЛОФЕРОНА.

5.1. Исследование влияния УФ-излучения на локализацию CD2 и CD1 la/CD 18 рецепторов на поверхности мембран Т-лимфоцитов.

5.2. Исследование влияния циклоферона на локализацию CD2 и CD 11 a/CD 18 рецепторов на поверхности мембран Т-лимфоцитов в условиях воздействия УФ-света.

Глава 6. ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ ЦИТОКРШПРОДУЦИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ НАТИВНЫХ И ФОТОМОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ КОМПЛЕКСНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ИНДУКТОРА ИНТЕРФЕРОНА «ЦИКЛОФЕРОН» И ФИТОГЕМАГГЛЮТИНИНА.

6.1. Влияние УФ-излучения на продукцию а-ИФН, ß-ИФН и у-ИФН Т-лимфоцитами крови доноров.

6.2. Влияние циклоферона на продукцию а-ИФН, ß-ИФН и у-ИФН нативными и фотомодифицированными Т-лимфоцитами крови доноров

6.3. Изменение митогениндуцированной продукции у-ИФН нативными и фотомодифицированными Т-лимфоцитами крови доноров в условиях воздействия циклоферона.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ действия УФ-излучения и некоторых индукторов интерферона на состояние Т-лимфоцитов крови человека"

Актуальность проблемы. В настоящее время пристальное внимание исследователей направлено на изучение и анализ механизмов трансформации энергии УФ-излучения, поглощенной живыми системами различных уровней организации. Это в первую очередь связано с тем, что УФ-свет выступает в качестве тонкого регуляторного агента, позволяющего исследовать биофизические основы взаимосвязей сетей, обеспечивающих поддержание различных типов гомеостатических процессов организма. Так, иммунная система, ответственная за поддержание антигенного постоянства, включает большое количество составляющих, одно из центральных мест среди которых занимают Т-клетки. При облучении крови УФ-светом протекающие процессы модификации поверхности иммуноцитов существенно отражаются на структурно-функциональном состоянии рецепторного аппарата и антигенного профиля клеточных мембран, (К. А. Самойлова, 1991; К.Д. Оболенская и др., 1991; Е.А. Двурекова, 2005; Е.А. Михилева, 2006; И.А. Колтаков, 2007).

Согласно современным представлениям, молекулы клеточной адгезии являются одними из ключевых звеньев в регуляции межклеточных взаимодействий. Они играют важную роль в различных физиологических и патологических процессах таких, как эмбриогенез, рост тканей, регенерация, иммунологические реакции, атерогенез, метастазирование опухолей и т.д. (K.L. Crossin et al., 1985; Е.С. Butcher, 1990; L. Osborn, 1990; T.A. Springer, 1990). Т-лимфоциты, как составляющие иммунной системы, обеспечивают клеточные формы иммунного ответа. На их мембранах экспрессируются разнообразные адгезивные молекулы, в том числе CD2, LFA-1 (CD 1 la/CD 18) и VLA (CD49/CD29) рецепторы, которые являются вспомогательными молекулами, опосредующими выполнение иммуноцитами специфических функций. Данные адгезивные молекулы, работая в комплексе, и, включаясь последовательно в процессы иммунного распознавания, тем самым опосредуют успешное протекание иммунного ответа - осуществляют взаимодействия клеток, связанные с презентацией антигена, кооперацией и миграцией в очаги воспаления лимфоцитов в ходе развития иммунного ответа и др. (В.А. Боценовский, А.Ю. Барышников, 1994; M.L. Dustin et al., 1996; P.A. Van der Merwe, 1999; M.K. Wild et al., 1999; P.A. Van der Merwe et al., 2000; A.A. Ярилин, 1999; A.A. Ярилин, 2003).

Кроме того, в современной медицинской практике нашло как одиночное, так и совместное применение методов аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК) и экстракорпоральной иммунной фармакотерапии (ЭИФТ). Комплексное использование данных методов позволяет снизить дозы используемых лекарств и добиться более выраженного терапевтического эффекта, чем при моновоздействии каждого из агентов (В.М. Земсков, 1993; И.Е. Савостина, 2005). Среди последних большой интерес вызывают производные акридонов, в частности низкомолекулярный индуктор синтеза интерферона - циклоферон. Терапевтическое действие циклоферона на клетки реализуется за счет (помимо активации образования клетками цитокинов) влияния на различного рода клеточные реакции и их составляющие: мембранные молекулы клеток, содержание внутриклеточных мессенджеров, активность дыхательных ферментов и транспортных белков митохондрий и др. (W. Roemer, W. Schulze, 1983; W. Roemer et al., 1986; W. Oettmeier et al., 1994; W. Oettmeier et al., 1995; A.JI. Коваленко и др., 20006). В связи с вышеизложенным вопрос о первичных процессах действия данных модификаторов на клетки представляется очень актуальным.

Задачи работы предусматривали:

1. Исследование изменений уровня экспрессии адгезивных CD2, CDlla и CD29 молекул Т-лимфоцитами человека в условиях одиночного и сочетанного воздействия УФ-света и циклоферона.

2. Изучение влияния циклогексимида и анизомицина на уровень экспрессии CD2, CDlla и CD29 маркеров в.условиях моно- и комплексного воздействия УФ-излучения и циклоферона.

3. Изучение структурного состояния мембран Т-лимфоцитов в условиях одиночного и сочетанного воздействия УФ-света и блокаторов синтеза белка - циклогексимида и анизомицина.

4. Исследование интенсивности процессов кэппинга CD2 и LFA-1 (CDlla/CD18) рецепторов мембран- Т-лимфоцитов в условиях моно- и комплексного воздействия УФ-излучения и циклоферона.

5. Исследование изменения спонтанной и митогениндуцированной продукции а-ИФН, Р-ИФН и у-ИФН Т-лимфоцитами в условиях одиночного и сочетанного воздействия УФ-света и циклоферона.

Научная новизна. Впервые исследованы изменения уровня экспрессии CD2, CDlla и CD29 маркеров, интенсивности процессов кэппинга CD2 и CD 11 a/CD 18 рецепторов, спонтанной и митогениндуцированной продукции а-ИФН, Р-ИФН и у-ИФН и структурного состояния мембран Т-лимфоцитов крови человека в условиях комплексного воздействия^ УФ-излучения (240390 нм) в дозах 151, 453, 906 и 1359 Дж/м2, препарата «Циклоферон» (0,2 мг/мл) и блокаторов синтеза белка - циклогексимида и анизомицина. -i Установлено, что УФ-свет (1359 Дж/м ) оказывает иммунодепрессивное действие на уровень экспрессии CD2 и CDlla маркеров и л иммуномодулирующее (151-4359 Дж/м ) влияние на экспрессию CD29 молекул Т-лимфоцитами человека. Использование циклогексимида и анизомицина позволило-выявить активацию УФ-излучением в дозах 151-906л

Дж/м синтеза рецепторных молекул CD2 и CD29 I группы доноров и CDlla маркеров - в дозах 151-453 Дж/м . Показана возможность образования новых молекул CD2, CDlla и CD29 маркеров1 I группы лиц под действием циклоферона интактными Т-лимфоцитами, а также CD lia молекул и CD29 антигенов II группы доноров — клетками, фотомодифицированными 2 соответственно в дозах 151 Дж/м и 151-Н359 Дж/м". Выявлены существенные структурные перестройки лимфоцитарных мембран в условиях одиночного и сочетанного воздействия УФ-излучения (151-^-1359

О 9 л

Дж/м ), циклогексимида (151 Дж/м ) и анизомицина (151-453 Дж/м ). Показано повышение подвижности мембранных CD2 и CDlla/CD18 рецепторов иммуноцитов под влиянием УФ-излучения в дозе 1359 Дж/м , что проявлялось в виде усиления кэппинга исследуемых маркеров. Обнаружено усиление процесов- образования- а-ИФН и р-ИФН* Т-лимфоцитами, УФ-облученными в дозе 151 Дж/м . Показано дозозависимое падение концентраций а/(3-ИФН и у-ИФН при спонтанной и митогениндуцированной индукции данных цитокинов в супернатантах фотомодифицированных клеток. Установлено, что циклоферон способствует активации продукции^ Т-лимфоцитами Р-ИФН в. большей степени, чем а-ИФН, a синтез. у-ИФН1 осуществлялся* только ФГА-стимулированными лимфоцитами. Предложена, сх.ема процессов изменений состояния рецепторного аппарата адгезии- мембран Т-лимфоцитов« крови человека в условиях сочетанного» • воздействия УФ-излучения и препарата «Циклоферон».

Практическая< значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления об- особенностях модуляции рецепторного^ аппарата адгезии мембран Т-лимфоцитов крови в условиях комплексного' воздействия различных физико-химических агентов.

Они могут быть использованы для разработки способов регулирования межклеточных взаимодействий иммунных клеток организма человека. Управление данными процессами является необходимым условием для прогнозирования течения и коррекции патологических состояний у больных с заболеваниями различной этиологии в клинике. Результаты работы используются в учебном процессе Воронежского государственного университета при проведении занятий по дисциплинам «Биофизика», «Биофизика мембран», «Физико-химические основы межклеточных взаимодействий», «Медицинская биохимия и биофизика», а также в ходе выполнения магистерских и дипломных работ студентами кафедры биофизики и биотехнологии.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на IV съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); Международной научной конференции «Биология: теория, практика, эксперимент» (Саранск, 2008); 8-ом съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2008); 4-ой Международной научной конференции «Электромагнитные излучения в биологии» (Калуга, 2008); 5-ом съезде Российского фотобиологического общества «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2008); 2-ом Международном форуме «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, 2008); 2-ом съезде физиологов СНГ (Кишинев, 2008); Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2009); Международной научной школе для молодежи «Инновационные технологии в здравоохранении: молекулярная медицина, клеточная терапия, трансплантология, реаниматология, нанотехнологии», Международной научной конференции «Инновационные технологии в реальном секторе экономики», Заседании Экспертного совета по программе «УМНИК» (Екатеринбург, 2009); 22-ой зимней молодежной научной школе

Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010); Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 1000-летию г. Ярославля «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010); Международной научной конференции «Современные проблемы радиобиологии» (Минск, 2010); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 статей и 11 тезисов, в том числе 2 статьи в журналах из Перечня ВАК РФ. На защиту выносятся следующие положения:

1. Т-лимфоциты способны поддерживать экспрессию СБ2 и СБ11а рецепторов на постоянном уровне при действии широкого диапазона доз УФ-света (151-906 Дж/м ); УФ-излучение в дозе 1359 Дж/м индуцирует уменьшение их экспрессии с параллельным усилением процессов кэппинга белковых молекул.

2. В условиях воздействия циклоферона уровень экспрессии адгезивных молекул СВ2 и СИПа увеличивается после облучения Т-лимфоцитов УФ-светом в дозе 151 Дж/м и уменьшается - в дозах 453-906 Дж/м2.

3. Одиночное и сочетанное воздействие УФ-света и циклоферона оказывает иммунокорригирующее влияние на уровень экспрессии СБ29 маркеров Т-лимфоцитов.

4. УФ-излучение в дозе 151 Дж/м2 активирует, а в дозах 453-1359 Дж/м2 ингибирует синтез а-интерферона и (З-интерферона Т-лимфоцитами человека и оказывает депрессивное действие на продукцию у-интерферона Т-клетками в условиях его спонтанного, митогениндуцированного и циклоферонобусловленного фитогемагглютинин-стимулированного образования.

5. Схема процессов, приводящих к модуляции адгезивного рецепторного аппарата мембран Т-лимфоцитов крови человека в условиях комплексного воздействия УФ-света и препарата «Циклоферон». Структура и объем работы. Диссертационная работа включает 167 страниц машинописного текста: состоит из «Введения», 6 глав, «Заключения», «Выводов» и «Приложения». Список литературы содержит 187 источников. Иллюстративный материал включает 23 рисунка и 10 таблиц в основном тексте и 10 таблиц в «Приложении».

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Дубова, Светлана Михайловна

ВЫВОДЫ

2. Выявлено, что УФ-излучение в дозе 1359 Дж/м индуцирует уменьшение уровня экспрессии CD2 и CDlla маркеров Т-лимфоцитами на фоне усиления кэппинга данных молекул.

3. Обнаружено иммунокорригирующее действие УФ-излучения (151-1359 Дж/м ) на экспрессию CD29 маркеров Т-клетками.

4. Изменений процентного содержания CD3+CD2+, CD3+CDlla+ и СБЗ'СБ29+лимфоцитов после суточной инкубации УФ-облученных (151—1359 Дж/м") суспензий Т-клеток не происходит.

5. Выявлено, что воздействие на Т-лимфоциты УФ-излучения в дозах 151-4359 Дж/м" сопровождается снижением интенсивности I флуоресценции зонда 1,8-АНС и смещением его максимума флуоресценции в коротковолновую область, что свидетельствует о протекании процессов структурной фотомодификации мембран названных клеток.

7. Установлено, что воздействие УФ-излучения в дозе 151 Дж/м усиливает продукцию Т-клетками а/(3-интерферонов, а в дозах 4531359 Дж/м - угнетает синтез указанных цитокинов, при этом УФ-свет (151-1359 Дж/м ) выступает в качестве ингибитора спонтанного и фитогемагглютинин-индуцированного синтеза у-интерферона.

8. Показано, что циклоферон - индуктор интерферона - увеличивает за счет образования новых молекул адгезии экспрессию CD2 рецепторов нативными Т-лимфоцитами, СШ 1а маркеров - интактными и УФ-облученными в дозе 151 Дж/м клетками, при этом наблюдается угнетение экспрессии СБ2 и СБ11а рецепторов Т-лимфоцитами, УФ-модифицированными в дозе 906 Дж/м .

9. Циклоферон оказывает иммунокорригирующее влияние на экспрессию СБ29 молекул нативными Т-лимфоцитами и фотомодифицированными (151+1359 Дж/м ) клетками.

10. Обнаружено, что циклоферон индуцирует увеличение продукции а- и Р-интерферона Т-лимфоцитами, предварительно облученными

1 О

УФ-светом соответственно в дозах 151-453 Дж/м и 151-906 Дж/м .

11. Циклоферон не оказывает влияния на спонтанную продукцию Т-клетками у-интерферона, активируя процессы его образования только в присутствии фитогемагглютинина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дубова, Светлана Михайловна, Воронеж

1. Адельман Д. Введение в иммунологию / Д. Адельман, X. Кесарвал, Т. Фишер. М. : Наука, 1998.-341 с.

2. Альберт А. Избирательная токсичность / А. Альберт. М. : «Медицина». - 1989.-Т. 1,2.-400,432 с.

3. Артюхов В.Г. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 2000. - 296 с.

4. Артюхов В.Г. Структурно-функциональное состояние биомембран и межклеточные взаимодействия / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина. -Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 2008. 156 с.

5. Арцишевская P.A. Десорбция гликопротеинов с поверхности лимфоцитов периферической крови человека после облучения коротковолновыми УФ лучами / P.A. Арцишевская, А.П. Миронова, К.А. Самойлова // Цитология. 1984. - Т. 26, № 2. - С. 209-214.

6. Ашмарин И.П. Ингибиторы синтеза белка / И.П. Ашмарин, Л.А. Ключарев. Ленинград: Изд-во «Медицина», 1975. - 208 с.

7. Биофизика: Учебник для вузов / Под ред. В.Г. Артюхова. М: . Академический Проект: Екатеринбург: Деловая книга, 2009. - 294 с.

8. Борисов Л.Б. Медицинская микробиологи, вирусология, иммунология / Л.Б. Борисов. М. : ООО «Медицинское информационное агентство», 2001.-736 с.

9. Бородин Ю.И. Функциональная морфология иммунной системы / Ю.И. Бородин, В.Н. Григорьев, А.Ю. Летягин. Новосибирск : Наука, 1987.-235 с.

10. Боценовский В.А. Молекулы клеточной адгезии / В.А. Боценовский, А.Ю. Барышников // Успехи современной биологии. 1994. - Т. 114, № 6. -С. 741-752.

11. Васильева Г.И. Цитокины — общая система гомеостатической регуляции клеточных функций / Г.И. Васильева, И.А. Иванова, С.Ю. Тюкавкина//Цитология.-2001.-Т. 43, № 12.-С. 1101-1111.

12. Вершигора А.Е. Общая иммунология / А.Е. Вершигора. Киев : Вища школа, 1990.-736 с.

13. Владимиров Ю.А. Лекции по медицинской биофизике / Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурина. М.: Изд-во Моск. ун-та: Академкнига. - 2007. — 432 с.

14. Владимиров Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко. М.: Дрофа, 2006. - 286 с.

15. Волгарева Е.В. Влияние УФ-облучения и УФ-облученной аутологичной крови на функциональное состояние лимфоцитов периферической крови человека / Е.В. Волгарева, А.П. Волгарев, К.А. Самойлова//Цитология. 1990. -№ 12. - С. 1217-1223.

16. Волгарева Е.В. Влияние УФ-обучения в терапевтической дозе и УФ-облученной крови на пролиферативную и рецепторную активность аутологичных лимфоцитов / Е.В. Волгарева // Цитология. 1991. - № 9. -С. 59.

17. Галактионов В.Г. Иммунология / В.Г. Галактионов. М. : Академия, 2004. - 522 с.

18. Гамов И.М. Изменение экспрессии мембранных рецепторов иммунокомпетентных клеток крови, индуцированные различными методами фотомодификации крови / И.М. Гамов, К.Д. Оболенская, К.А. Самойлова // Цитология. 1991. - Т. 33, № 9. - С. 63.

19. Двурекова Е.А. Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы в условиях УФ-облучения: дис. . канд. биол. наук / Е.А. Двурекова. -Воронеж, 2005. 208 с.

20. Дидковский H.A. Индукторы интерферона новый перспективный класс иммуномодуляторов / H.A. Дидковский, И.К. Малашенкова, Э.Б. Тазулахова // Аллергология. - 1999. - № 4. - С. 26-32.

21. Дмитриев Е.В. Модуляция структурно-функциональных изменений мембран Т- и B-лимфоцитов крови человека некоторыми химическими и физическими агентами: дис. канд. биол. наук / Е.В. Дмитриев. -Воронеж. 2003. 161 с.

22. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липидов / Г.Е. Добрецов. М. : Наука, 1989. — 277 с.

23. Дранник Г.Н. Иммунотропные препараты / Г.Н. Дранник, Ю.А. Гриневич, Г.М. Дизик. Киев : Здоровье, 1994. - С. 105-113.

24. Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состоянии окислительного стресса / Е.Е. Дубинина // Вопросы медицинской химии. — 2001. Т. 47, № 6. -С. 561-581.

25. Егоров В.А. Теория и практика иммуноферментного анализа / В.А. Егоров.-М. : Высш. шк., 1991.-288 с.

26. Ершов Ф.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств) / Ф.И. Ершов, О.И. Киселев. М. : ГЭОТАР - Медиа, 2005. - 368 с.

27. Ершов Ф.И. Применение Циклоферона в клинике инфекционных болезней / Ф.И. Ершов, М.Г. Романцов, A.JI. Коваленко // Антибиотики и химиотерапия . 2008. - № 53. - С. 36-45.

28. Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика / Ю.М. Зарецкая. М.: Медицина, 1983.-208 с.

29. Земсков В.М. Особенности коррекции иммунологических расстройств при различных патологических состояниях / В.М. Земсков, A.M. Земсков,

30. B.И. Золоедов // Успехи современной биологии. 1993. - Т. 113, Вып. 4.1. C. 433-441.

31. Змушко Е.И. Клиническая иммунология / Е.И. Змушко, Е.С. Белозеров, Ю.А. Митин СПб : Питер, 2001. - 278 с.

32. Изучение про- и антиоксидантного действия различных иммуномодуляторов на хемилюминесценцию нейтрофилов / П.А. Заколяпин и др. // Медицинская иммунология. 2007. - Т. 9, № 2-3. -С. 139.

33. Иммунология / У. Пол и др., М.: Мир, 1987-1988. Т. 1. - 476 с.

34. Индивидуальные изменения экспрессии генов системы интерферона в клетках крови человека под влиянием амиксина и циклоферона / Т.М. Соколова и др. // Вопросы вирусологии 2005. - № 2. - С. 32-36.

35. Исследование внутриклеточной локализации циклоферона, связывания его с ДНК и стимуляция экспрессии цитокинов в клетках при воздействии циклоферона / A.JI. Коваленко и др. // Цитология. — 2000а. — Т. 42, № 7. -С. 659-664.

36. Коваленко A.JI. Акридонуксусная кислота: фармакологические свойства и результаты клинического применения / A.JI. Коваленко, М.Г. Романцов, Ф.И. Ершов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 20006. № 5. - С. 103—108.

37. Ковальчук JI.B. CD4+, CD25+ иммунорегуляторные (супрессорные?) Т-лимфоциты человека ex vivo и in vitro в норме и при паталогии / JI.B. Ковальчук, A.C. Павлюк // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2002. - № 5. - С. 40^45.

38. Колтаков И.А. Исследование структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов крови человека при модификации a-интерфероном и в условиях УФ-облучения: дис. . канд. биол. наук / И.А. Колтаков; Воронеж, гос. ун-т. Воронеж, 2007. - 130 с.

39. Конев C.B. Фотобиология / C.B. Конев, И.Д. Волотовский. Минск. : Изд-во БГУ, 1979.-383 с.

40. Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Е.А. Кост М. : Медицина, 1968. - С. 70-73.

41. Костанян И.А. STAT1 — многоликий фактор транскрипции / И.А. Костанян, A.B. Вонаршенко, В.М. Липкин // Биоорганическая химия. -2010.-Т. 36, № 1.-С. 15-28.

42. Крыленков В.А. Электронно-микроскопическое исследование поверхности необлученных и УФ-облученных лимфоцитов крови человека / В.А. Крыленков, М.С. Брудная, Я.Ю. Комиссарчик // Цитология. 1983. -Т. 25, № 4. - С. 476-479.

43. Кэтти Д. Антитела. Методы. / Д. Кэтти : В 2-х кн. — М. : Мир. — кн. 2. -1991.-380 с.

44. Михилева Е.А. Модуляция физико-химическими агентами структурно-функционального состояния нейтрофилов крови человека: дис. . канд. биол. наук / Е.А. Михилева. Воронеж, 2006. - 201 с.

45. Мушкамбаров H.H. Молекулярная биология / H.H. Мушкамбаров, С.Л. Кузнецов. М. : ООО «Медицинское информационное агентство», 2003.-544 с.

46. Новиков Д.К. Оценка иммунного статуса / Д.К. Новиков,

47. B.И. Новикова. Витебск, М.: Медицина, 1996. - 282 с.

48. Оценка интерферонового статуса людей по пробам цельной крови /

49. C.С. Григорян и др. // Вопросы вирусологии. 1988. - № 4. - С. 433-436.

50. Петров Р.В. Иммунология / Р.В. Петров. М. : Медицина, 1987. - 416 с.

51. Робинсон М.В. Морфология и метаболизм лимфоцитов / М.В. Робинсон, Л.Б. Топоркова, В.А. Труфакин. Новосибирск : Наука, 1986.-128 с.

52. Рубин А.Б. Биофизика: В 2-х т. Т. 2 : Биофизика клеточных процессов.- М. : Изд-во Моск. ун-та : Наука, 2004 469 с.

53. Савостина И.Е. Исследование влияния УФ-света и иммуномодуляторов на антиоксидантный статус и состояние мембран лейкоцитов: дис. . канд. биол. наук / И.Е. Савостина; Воронеж, гос. ун-т.- Воронеж, 2005. 202 с.

54. Самойлова К.А. Действие ультрафиолетовой радиации на клетку / К.А. Самойлова. Изд-во: Наука, 1967. - 148 с.

55. Самойлова К.А. Триггерные механизмы лечебного эффекта облучения крови УФ лучами / К.А. Самойлова // Цитология. 1991. - Т. 33, № 9. -С. 101-102.

56. Сейц И.Ф. Некоторые аспекты химизма и обмена лейкозных и раковых клеток / И.Ф. Сейц // Вестн. АМН СССР. 1965. - № 4. - С. 10-22.

57. Система интерферона и интерферонотерапия: новые возможности и перспективы / В.П. Алферов и др. // Российский семейный врач. 1998. -№ 1.-С. 35-41.

58. Сравнительное экспериментальное изучение различных способов фотомодификации крови / В.А. Крыленков и др. // Вестник хирургии. -1989,-№6.-С. 100-103.

59. Стимулирующее действие УФ-излучения на активность антител и комплемента крови человека / К.А. Самойлова и др. // Механизмы влияния облученной ультрафиолетовыми лучами крови на организм человека и животных. Л., 1986.-С. 226-237.

60. Трубицына М.С. Исследование путей реализации апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием УФ-света и активных форм кислорода: дис. . канд. биол. наук / М.С. Трубицына. -Воронеж, 2009.- 172 с.

61. Труфакин В.А. Иммуноморфологические аспекты аутоиммунных процессов / В.А. Труфакин. Новосибирск : Наука, 1983. - 178 с.

62. Увеличение экспрессии мембранных маркеров иммунокомпетентных клеток после УФ-облучения крови в терапевтической дозе и ретрансфузии УФ-облученной крови / К.Д. Оболенская и др. // Цитология. 1991. -Т. 33, № 9. - С. 92.

63. Участие иммуноцитов в продукции интерферона в ответ на индукцию ароматическими углеводородами / Э.Б. Тазулахова и др. // Антибиотики и химиотерапия. 1991. — Т. 36. -№ 10.-С. 28-31.

64. Фрейдлин И.С. Интерлейкин-12 ключевой цитокин иммунорегуляции / И.С. Фрейдлин // Иммунология. - 1999. - № 4. - С. 5-9.

65. Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы / И.С. Фрейдлин, A.A. Тотолян. СПб. : Наука, 2001. - 390 с.

66. Хаитов P.M. Иммунология / P.M. Хаитов, Г. А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. М. : Медицина, 2000. - 432 с.

67. Хайдуков C.B. Подходы к стандартизации метода проточной цитометрии для иммунофенотипирования. Настройка цитометров и подготовка протоколов для анализа / C.B. Хайдуков // Медицинская иммунология. -2007. Т. 9, № 6. - С. 569-574.

68. Хайдуков C.B. Проточная цитометрия как современный метод анализа в биологии и медицине / C.B. Хайдуков, A.B. Зурочка // Медицинская иммунология. 2007. - Т. 9, № 4-5. - С. 373-378.

69. Хомутовский O.JI. Структура и функция примембранных слоев клеток (гликокаликс) / O.JI. Хомутовский. Киев : Наука. Думка, 1984. - 160 с.

70. Циклоферон новый отечественный препарат для профилактики гриппа и других ОРВИ / Ф.И. Ершов и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2004. - № 6. - С. 47-51.

71. Циклоферон (таблетированная форма) в клинической практике : Методические рекомендации для врачей / НИИ эпидемиологии имикробиологии им. Н.Ф. Гамалеи; НИИЭиМ им. Пастера; под ред. М.Г. Романцова, Ю.В. Аспеля — СПб., 2000. — 92 с.

72. Цитокининдуцирующая и противовирусная активность циклоферона при экспериментальной герпетической инфекции / Е.И. Змушко и др. // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунобиологии. — № 4. — 2003. — С. 105-107.

73. Чекнев С.В. Зависимость праймирующего эффекта интерферона от функциональной активности клеток крови человека / С.В. Чекнев, A.M. Амченкова, А.Н. Наровлянский // Вопросы вирусологии. 2002. - № 2. -С. 40-42.

74. Шмелев В.А. Интерферон-гамма, фактор некроза опухолей, тимозин-альфа1 противоинфекционные и противоопухолевые цитокины и препараты / В.А. Шмелев. - М. : ИД «Медпрактика-М», 2008. - 536 с.

75. Ярилин А.А. Иммунный синапс как структурная основа презентации антигена / А.А. Ярилин // Иммунология. 2003. - № 6. - С. 347-350.

76. Ярилин А.А. Основы иммунологии / А.А. Ярилин. М>. : Медицина, 1999.-608 с.

77. Ярилин А.А. Симбиотические взаимоотношения клеток иммунной системы / А.А. Ярилин // Иммунология. 2001. - № 4. - С. 16-20.

78. A Carbohydrate Domain Common to Both Sialyl Lea and Sialyl Lex Is Recognized by the Endothelial Cell Leukocyte Adhesion Molecule ELAM-1 / E.L. Berg et al. // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266, N 23. - P. 14869-14872.

79. A human intercellular adhesion molecule (ICAM-1) distinct from LFA-1 / R. Rothlein et al. // J. Immunol. 1986. - Vol. 137. - P. 1270-1274.

80. A human T lymphocyte differentiation marker defined by monoclonal antibodies that block E-rosette formation / F.D. Howard et al. // J. Immunol. -1981.-Vol. 126.-P. 2117-2122.

81. Acridones and quinolones as inhibitors of ubiquinone functions in the mitochondrial respiratory chain / W. Oettmeier et al. // Biochemical Society transactions. 1994. - Vol. 22, N 1. - P. 213-216.

82. Activation of cultured human endothelial cells by recombinant lymphotoxin: comparison with tumor necrosis factor and interleukin 1 species / J.S.Pober et al.//J. Immunol. 1987.-Vol. 138.-P. 3319-3324.

83. Adhesion of T lymphoblasts to epidermal keratinocytes is regulated by interferon gamma and is mediated by intercellular adhesion molecule-I (ICAM-1) / M.L. Dustin et al. // J. Exp. Med. 1988. - Vol. 167. - P. 13231340.

84. Amino acid sequence of the alpha subunit of human leukocyte adhesion receptor Mol (complement receptor type 3) / M.A. Arnaout et al. // J. Cell Biol. 1988. - Vol. 106. - P. 2153-2158.

85. Amino Acid Sequence of the Human Fibronectin Receptor / W.S. Argraves et al. //J. Cell Biol. 1987.-Vol. 105.-P. 1183-1190.

86. Analisi delle proteine acide dei limfocite timice e bursale di Galleus galleus / A. Facchini et al. // Boll. Soc. Ital. Biol. 1975. - Vol. 50, № 18. - P. 14801486.

87. Anderson D.C. Leukocyte adhesion deficiency: an inherited defect in the Mac-1, LFA-I, and pi50,95 glycoproteins / D.C. Anderson, T.A. Springer // Ann. Rev. Med. 1987. - Vol. 38. - P. 175-194.

88. Anergic T-cells as suppressor cells in vitro / G. Lombardi et al. // Science. 1994.-Vol. 264.-P. 1587-1589.

89. Antiadhesive function of 130-kd glycoform of CD43 expressed in CD4 T-lymphocyte clones and transfectant cell lines / M. Fukuolca et al. // Blood. -2000. Vol. 96. - P. 4267-4275.

90. Association with FcR gamma is essential for activation signal through NKR-Pl (CD161) in natural killer (NK) cells and NK1.1+ T cells / N. Arase et al. // J. Exp. Med.- 1997.-Vol. 186.-P. 1957-1963.

91. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes / B. Solomon et al. // Immunity. 2000. - Vol. 12. - P. 431-440.

92. Biologicaly active acridine derivatives. Unexpected preparation of lO-carboxymethylacridine-9-one methyl ester / S.A. Lyakhov et al. // Pharmazie. 1994. - Bd. 49, N. 5. - S. 367-368.

93. Blomstrand R. Fatty acid synthesis in human lymphocytes / R. Blomstrand // Acta Chem. Scand. 1966. - Vol. 20, № 1. - P. 1122-1124.

94. Blomstrand R. Observations on the acceleration of fatty acid synthesis in PHA treated lymphocytes and thymocytes / R. Blomstrand, L. Lijeqvist // Acta Chem. Scand. 1972. - Vol. 26, № 2. - P. 256-259.

95. Bouteiller P. Ultrastructure des lyphocytes d'aspect thymique et d'aspect medullaire chez la souris: identificstion par marquage immunoenzymatique / P. Bouteiller, N. Vujanovie, H.T. Due // Ann. Immunol. 1974. - Vol. 125, № 3. - P. 445-450.

96. Bradley J.E. Processed MHC class I alloantigen as the stimulus for CD4+ T-cell depent antibody-mediated graft rejection / J.E. Bradley, A. Mowat, E. Bolton // Immunol. Today. 1992. - Vol. 13. - P. 3434-3438.

97. Bronte V. Identification of a CDllb+/Gr-l+/CD31+ myeloid progenitor capable of activating or suppressing CD8+T / V. Bronte, E. Apolloni, A. Cabrelle // Blood. 2000. - Vol. 96. - P. 3838-3846.

98. Butcher E.C. Cellular and molecular mechanisms that direct leukocyte traffic / E.C. Butcher // The American Journal of Pathology. 1990. - Vol. 136. -P. 3-11.

99. CD25+CD4+T cells regulate the expansion of peripheral CD4 T cells through the production of IL-10 / O. Annacker et al. // J. Immunol. 2001. -Vol. 166.-P. 3008-3018.

100. Chromosomal location of the genes encoding the leukocyte adhesion receptors LFA-1, Mac-1 and pi50,95. Identification of a gene cluster involved in cell adhesion / A.L. Corbi et al. // J. Exp. Med. 1988. - Vol. 167. -P. 1597-1607.

101. Control of intracellular pH and growth by fibronectin in capillary endothelial cells / D.E. Ingber et al. // J. Cell Biol. 1990. - Vol. 110. -P. 1803-1811.

102. Crystal structure of the extracellular region of the human cell adhesion molecule CD2 at 2.5-A resolution / D.L. Bodian et al. // Structure. 1994. -Vol. 2. - P. 755-766.

103. Cytosceletal polarization and redistribution of cell-surface molecules during T cell antigen recognition / P.A. Van der Merwe et al. // Semin. Immunol. 2000. - Vol. 12. - P. 5-12.

104. Dahms N.M. Lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1) contains sulfated N-linked oligosaccharides / N.M. Dahms, G.W. Hart // J. Immunol. -1985. Vol. 134. - P. 3978-3986.

105. Dependence of T cell antigen recognition on the dimensions of an accessory receptor-ligand complex / M.K. Wild et al. // J. Exp. Med. 1999. - Vol. 190. -P. 31-41.

106. Developmental and maturational changes in human blood lymphocyte subpopulations / I. Hannet et al. // Immunol. Today. 1992. - Vol. 13. -P. 215.

107. Differential role of distinct determinants of intercellular adhesion molecule-1 in immunologic phenomena / M. Maio et al. // J. Immunol. 1989. -Vol. 143.-P. 181-188.

108. Down-regulation of interferon y-activated STAT1 by UV light / Y. Aragane et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. - Vol. 94. - P. 11490-11495.

109. Dustin M.L. T-cell receptor cross-linking transiently stimulates adhesiveness through LFA-1 /M.L. Dustin, T.A. Springer // Nature. 1989. -Vol. 341.-P. 619-624.

110. Exon-intron organization and sequence comparison of human and murine Til (CD2) genes / D.J. Diamond et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1988. -Vol. 85.-P. 1615-1619.

111. Expression of functional CD32 molecules on human NK cells is determined by an allelic polymorphism of the Fc gamma RIIC gene / D. Metes et al. // Blood. 1998. - Vol. 91. - P. 2369-2380.

112. Expression sequences of cell adhesion molecules / K.L. Crossin et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1985. - Vol. 82. - P. 6942-6946.

113. Fischer D.B. Studies on the mechanisms by which PHA rapidly stimulates phospholipids metabolism of human lymphocytes / D.B. Fischer, G.C. Mueller // Biochem. Biophis. Acta. 1972. - Vol. 248. - P. 434-436.

114. Freund M. N-Dihpenylglycine-ocarboxylic acid and its derivatives / M. Freund, A. Schawartz// Chem. Ber. 1923. -Bd. 56. - S. 1828-1831.

115. Giese M. Blocking of interferon synthesis in murine macrophages by pretreatment with interferon / M. Giese, H. Kirchner // Immunology Letters. -1988. Vol. 18.-N2.-P. 109-113.

116. Grollman A.P. Inhibitors of Protein Biosynthesis. II. MODE OF ACTION OF ANISOMYCIN / A.P. Grollman // Biol. Chem. 1967. - Vol. 242, N. 13. -P. 3226-3233.

117. Hemler M.E. VLA Proteins in the Integrin Family: Structures, Functions, and Their Role on Leukocytes / M.E. Hemler // Ann. Rev. Immunol. 1990. -Vol. 8.-P. 365-400.

118. Heterogenous mutations in the beta subunit common to the LFA-I, Mac-1, and pi 50,95 glycoproteins cause leukocyte adhesion deficiency / T.K. Kishimoto et al. // Cell. 1987. - Vol. 50. - P. 193-202.

119. Hynes R.O. Integrins: Versatility, modulation, and signaling in cell adhesion / R.O. Hynes // Cell. 1992. - Vol. 69. - P. 11-25.

120. Identification of a human T lymphocyte surface protein associated with the E-rosette receptor / M. Kamoun et al. // J. Exp. Med. 1981. - Vol. 153. -P. 207-212.

121. Integrin modulating factor-1: A lipid that alters the function of leukocyte integrins / A. Hermanowski-Vosatka et al. // Cell. 1992. - Vol. 68. - P. 341352.

122. Interleukin-10 induced a long-ferm antigen-specific state in human CD4 T-cell / H. Groux et al. // J. Exp. Med. 1996. - Vol. 184. - P. 19-29.

123. Janssen-Heininger Y.M.W. Recent advances forwards understanding redox mechanisms in the activation of nuclear factor Kb / Y.M. W. Janssen-Heininger, M.E. Poynter, P.A. Baeuerle // Free Radic. Biol. Med. 2000. - Vol. 28. -P.1317-1327.

124. Kiirzinger K. Purification and structural characterization of LFA-1, a lymphocyte function-associated antigen, and Mac-1, a related macrophage differentiation antigen / K. Kiirzinger, T.A. Springer // J. Biol. Chem. 1982. -Vol. 257.-P. 12412-12418.

125. Lafrenie R.M. Integrin-dependent signal transduction / R.M. Lafrenie, K.M. Yamada // J. Cell Biochem. 1995. - Vol. 61. - P. 543-553.

126. Ligands "activate" integrin ailbp3 (platelet GPIIb-IIIa) // X. Du et al. / Cell. 1991. - Vol. 65. - P. 409-416.

127. Loor F. Plasma Membrane and Cell Cortex Interactions in Lymphocyte Functions / F. Loor // Adv. Immunol. 1980. - Vol. 30. - P. 1-120.

128. Lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1): a surface antigen distinct from Lyt-2,3 that participates in T lymphocyte-mediated killing / D. Davignon et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1981. - Vol. 78. -P.4535-4539.

129. Marlin S.D. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1) / S.D. Marlin, T.A. Springer//Cell. 1987.-Vol. 51.-P. 813-819.

130. Matter A. Mouse thymus independent and thymus derived lymphoid cells / A. Matter, B. Lisowska-Bernstein, J.E. Ryser // J. Exp. Med. 1972. - Vol. 136, №5.-P. 1008-1030.

131. Mechanism of lymphocyte function-associated molecule 3-Ig fusion proteins inhibition of T cell responses: structure/function analysis in vitro and in human CD2 transgenic mice / G.R. Majeau et al. // J. Immunol. 1994. -Vol. 152.-P. 2753-2767.

132. Miller L.J. Biosynthesis and glycosylation of pi50,95 and related leukocyte adhesion proteins / L.J. Miller, T.A. Springer // J. Immunol. 1987. -Vol. 139.-P. 842-847.

133. Miller L.J. Regulated expression of the Mac-1, LFA-1, pi50,95 glycoprotein family during leukocyte differentiation / L.J. Miller, R. Schwarting, T.A. Springer // J. Immunol. 1986. - Vol. 137. - P. 2891-2900.

134. Miosda N. Chemical-analitical characterization and determination of 10-carboxymethyl-9-acridanone / N. Miosda, W. Roemer // Pharmazie. 1986. -Bd. 41. -N. 5. - S. 326-328.

135. Molecular cloning of the human T lymphocyte surface CD2 (Til) antigen / W.A. Sewell et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1986. - Vol. 83. -P. 8718-8722.

136. Monoclonal antibodies OKT 11 and OKT 11A have pan-T reactivity and block sheep erythrocyte "receptors" / W. Verbi et al. // Eur. J. Immunol. -1982.-Vol. 7.-P. 81-86.

137. Mozes L.W. Interferon Induction in Rabbit Cells Irradiated with UV Light / L.W. Mozes, J. Vilcek // Virology. 1974. - Vol. 13, N 3. - P. 646-651.

138. Nemr A. New Developments in the Synthesis of Anisomycin and Its Analogues / A. Nemr, E.S.H. Ashry // Heterocycl. Chem. 2007. - Vol. 7. -P. 249-285.

139. Neugebauer K.M. Cell-surface regulation of |3i-integral activity on developing retinal neurons / K.M. Neugebauer, L.F. Rekhardt // Nature. 1991. -Vol. 350.-P. 68-71.

140. NF-kB: an important transcription factor in photobiology / S. Legraund -Poels et al. // J. Photochem. Photobiol. 1998. - Vol. 45. - P. 1-8.

141. Oettmeier W. 3H.7-Azido-4-isopropylacridone labels Cysl59 of the bovine mitochondrial ADP/ATP-carrier protein / W. Oettmeier, K. Masson, S. Kalinna // Eur. J. Biochem. 1995. - Vol. 227. - P. 730-733.

142. On the species specificity of the interaction of LFA-1 with intercellular adhesion molecules / S.C. Johnston et al. // J. Immunol. 1990. - Vol. 145. -P.1181-1187.

143. Osborn L. Leukocyte adhesion to endothelium in inflammation / L. Osborn // Cell. 1990. - Vol. 62. - P. 3-6.

144. Pardi R. Regulatory mechanisms in leukocyte adhesion: flexible receptors for sophisticated travelers / R. Pardi, L. Inverardi, J.R. Bender // Immunol. Today. 1992. - Vol. 13. - P. 224-230.

145. Patarroyo M. Leukocyte adhesion in host defense and tissue injury / M. Patarroyo // Clinical Immunology and Immunopathology. 1991. - Vol. 60. -P. 333-348.

146. Peterson A. Monoclonal antibody and ligand binding sites of the T cell erythrocyte receptor (CD2) / A. Peterson, B. Seed // Nature. 1987. - Vol. 329. - P. 842-846.

147. Primary structure of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) demonstrates interaction between members of the immunoglobulin and integrin supergene families / D.E. Staunton et al. // Cell. 1988. - Vol. 52. -P. 925-933.

148. Primary Structure of the Leukocyte Function-associated Molecule-1 a Subunit: an Integrin with an Embedded Domain Defining a Protein Superfamily / R.S. Larson et al. // J. Cell Biol. 1989. - Vol. 108. - P. 703-712.

149. Production of interferon-ß murine T-cell lines Induced by 10-carboxymethyl-9-acridanone / E. Storch et al. // Scand. J. Immunol. 1986. -Vol. 23.-P. 195-199.

150. Pullman W.E. Cloning and characterization of a gene that regulates cell adhesion/ W.E. Pullman, W.F. Bodmer // Nature. 1992. - Vol. 356. -P. 529-532.

151. Pytela R. Amino acid sequence of the murine Mac-1 alpha chain reveals homology with the integrin family and an additional domain related to von Willebrand factor / R. Pytela, F. Powrie // J. EMBO. 1988. - Vol. 7. -P. 1371-1378.

152. Read S. CD4+ regulatory T cells / S. Read, F. Powrie // Curr. Opin. Immunol. 2001. - Vol. 13. - P. 644-649.

153. Read S. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential pole in function of CD25+CD4+ regulatory cells that control intestinal inflammation / S. Read, V. Malmstrom, F. Powrie // J. Exp. Med. 2000. - Vol. 192.-P. 295-302.

154. Regulatory T-cell clones induced by oral tolerance: suppression of autoimmune encephalomyelitis / Y. Chen et al. // Science. 1994. - Vol. 256. -P. 1237-1240.

155. Roemer W. 10-Carboxymethyl-9-acridanone as an inhibitor of c-AMP phosphodiesterase / W. Roemer, W. Schulze // Pharmazie. 1983. - Vol. 38. -P. 495-^-96.

156. Roemer W. Cyclic AMP metabolism and interferon induction in mice after treatment with 10-Carboxymethyl-9-acridanone / W. Roemer, E. Tonew, W. Schulze // Acta Virologica. 1986. - Vol. 30. - P. 411-417.

157. Role of pi50,95 in adhesion, migration, Chemotaxis and phagocytosis of human monocytes / G.D. Keizer et al. // Eur. J. Immunol. 1987. - Vol. 17. -P. 1317-1322.

158. Roncarolo M.-G. The role of different subsets of T regulatory cells in controlling autoimmunity / M.-G. Roncarolo, M. Levings // Curr. Opin. Immunol. 2000. - Vol. 12. - P. 676-683.

159. Schulze-Osthoff K. Redox signaling by transcription factors NF-kB and AP-1 in lymphocytes / K. Schulze-Osthoff, M. Los, P. Baeuerle // Biochem. Pharmacol. 1995. - Vol. 50. - P. 735-741.

160. Schwartz M.A. Insoluble fibronectin activates the Na/H antiporter by clustering and immobilizing integrin a5(3i, independent of cell shape / M.A. Schwartz, C. Lechene, D.E. Ingber // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991. -Vol. 88.-P. 7849-7853.

161. Seed B. Molecular cloning of the CD2 antigen, the T-cell erythrocyte receptor, by a rapid immunoselection procedure / B. Seed, A. Aruffo // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987. - Vol. 84. - P. 3365-3369.

162. Shevach E. Regulatory T cells in autoimmunity / E. Shevach // Ann. Rev. Immunol. 2000. - Vol. 18. - P. 423-449.

163. Shimizu J. Induction of tumor immunity by removing CD25+ CD4+ T cells: a common basis between tumor immunity and autoimmunity / J. Shimizu, S. Yamazaki, S. Sakaguchi // J. Immunol. 1999. - Vol. 163. - P. 5211-5218.

164. Simmons D. ICAM, an adhesion ligand of LFA-1, is homologous to the neural cell adhesion molecule NCAM / D. Simmons, M.W. Makgoba, B. Seed // Nature.- 1988,-Vol. 331.-P. 624-627.

165. Springer T.A. Adhesion receptors of the immune system / T.A. Springer // Nature. 1990. - Vol. 346. - P. 425-434.

166. Storch E. Induction of interferon in murine bone marrow-derived macrophage 'cultures by 10-carboxymethyl-9-acridanone/ E. Storch, H. Kirchner // Eur. J. Immunol. 1982. - Vol. 12. - N. 9. - P. 793-796.

167. Szulk Z. Synthesis of the choline ester of 9-oxo-10-acridinoacetic acid and of congeners as potential interferone inducers / Z. Szulk, J. Miochowski // Polish Jour. Chem. 1986. - Vol. 60, N. 15. - P. 143-170.

168. T lymphocyte adhesion to endothelial cells: mechanisms demonstrated by anti-LFA-1 monoclonal antibodies / D. Haskard et al. // J. Immunol. 1986. -Vol. 137.-P. 2901-2906.

169. TCR-mediated adhesion of T cell hybridomas to planar bilayers containing purified MHC class II/peptide complexes and receptor shedding during detachment / M.L. Dustin et al. // J. Immunol. 1996. - Vol. 157. - P. 2014 -2021.

170. The lymphocyte function-associated LFA-1, CD2, and LFA-3 molecules: cell adhesion receptors of the immune system / T.A. Springer et al. // Ann. Rev. Immunol. 1987. - Vol. 5. - P. 223-252.

171. The structure of the human CD2 gene and its expression in transgenic mice / G. Lang et al. / J. EMBO. 1988. - Vol. 7. - P. 1675-1682.

172. Thornton A. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting inteurleukin 2 production / A. Thornton, E. Shevach // J. Exp. Med. 1998. - Vol. 188. - P. 287-296.

173. Thornton A. Suppressor effector function of CD4+CD25+ immunoregulatory T cells is antigen nonspecific / A. Thornton, E. Shevach // J. Immunol. 2000. - Vol. 164. - P. 183-190.

174. Three distinct antigens associated with human T-lymphocyte-mediated cytolysis: LFA-1, LFA-2, and LFA-3 / F. Sanchez-Madrid et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1982. - Vol. 79. - P. 7489-7493.

175. Toshitani K. Expression of single-chain HLA class I molecule in a human cell line: Presentation of exogenous peptide and processed antigen to cytotoxic

176. T lymphocytes / K. Toshitani, V. Braud, M. Browning // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. - Vol. 93. - P. 236-240.

177. Two leukocyte receptors (CD 11 a/CD 18 and CD1 lb/CD 18) mediate transient adhesion to endothelium by binding to different ligands / S.K. Lo et al. // J. Immunol. 1989. - Vol. 143. - P. 3325-3329.

178. Ultraviolet Radiation-induced Apoptosis Is Mediated by Activation of CD-95 (Fas/APO-1) / A. Rehemtulla et al. // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272, N. 41. - P. 25783-25786.

179. Van der Merwe P.A. A Subtle Role for CD2 in T Cell Antigen Recognition / P.A. Van der Merwe // J. Exp. Med. 1999. - Vol. 190. - N 10. -P.1371-1374.

180. VCAM-1 on activated endothelium interacts with the leukocyte integral VLA-4 at a site distinct from the VLA-4/Fibronectin binding site / M.J. Elices et al. // Cell. 1990. - Vol. 60. - P. 577-584:

181. VLA-1: a T cell surface antigen which defines a novel late stage of human T cell activation / M.E. Hemler et al. // Eur. J. Immunol. 1984. - Vol. 15. -P. 502-508.

182. Vujanovie N. Morphological differences between thymus and bone marrow derived lymphocytes. I. A light microscopic and experimental study in unstimulated mice / N. Vujanovie, R. Kinsley, H.T. Due // Differentiation. -1974. - Vol. 2, № 2. - P. 107-117.

183. Wacholtz M.C. Leukocyte function-associated antigen 1 is an activation molecule for human T cells / M.C. Wacholtz, S.S. Patel, P.E. Lipsky // J. Exp. Med. 1989. - Vol. 170. - P. 431-448.

184. Zucker-Franklin D. Characterization of glycoprotein Ilb/IIIa-positive cells in human umbilical cord blood: their potential usefulness as megakaryocyte progenitors / D. Zucker-Franklin, J.S. Yang, G. Grasky // Blood. 1992. - Vol. 79.-P. 347-355.

Информация о работе

Дубова, Светлана Михайловна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Анализ действия УФ-излучения и некоторых индукторов интерферона на состояние Т-лимфоцитов крови человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы