Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование процессов модуляции структурно-функциональных свойств лимфоцитов человека в условиях воздействия УФ-света и активных форм кислорода: роль ионов кальция, цАМФ и NO

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование процессов модуляции структурно-функциональных свойств лимфоцитов человека в условиях воздействия УФ-света и активных форм кислорода: роль ионов кальция, цАМФ и NO"

На /травах рукописи

Лидохова Олеся Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ МОДУЛЯЦИИ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ УФ-СВЕТА И АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА: РОЛЬ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ, цАМФ и N0

Специальность 03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 НОЯ 2013

Воронеж-2013

005537223

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФПБОУ ВПО «ВГУ»)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Наквасина Марина Александровна

Попова Татьяна Николаевна

доктор биологических наук, профессор. Воронежский государственный университет, заведующая кафедрой медицинской биохимии и микробиологии

Дмитриев Евгений Владиславович

кандидат биологических наук, доцент, Воронежская государственная медицинская академия им. H.H. Бурденко, заведующий кафедрой физики, математики и медицинской информатики

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии (г. Воронеж)

Защита состоится 29 ноября 2013 года в 13 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 212.038.03. при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Ведущая организация:

Автореферат разослан 23 октября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Грабович Маргарита Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из центральных проблем биофизики клетки является изучение механизмов действия физико-химических агентов (УФ-света, ионизирующей радиации, активных форм кислорода) на структурно-функциональное состояние компонентов иммунной системы, являющихся основными элементами поддержания гомеостаза организма.

Накоплены обширные сведения о структурно-функциональных модификациях лимфоцитов человека и животных в условиях воздействия УФ-света и активных форм кислорода (И.Е. Ганелина, К.А. Самойлова, 1986; В.И. Карандашов, Е.Б. Петухов, 1997; A.A. Ярилин, 1999; I.A. Gamaley, I.V. Klyubin, 1999). Действие УФ-света и активных форм кислорода на лимфоциты человека проявляется в изменениях процессов их пролиферации и дифференцировки (Е.В. Волгарева и др., 1990; Е.В. Волгарева, 1991), клеточной цитотоксичности (Л.И. Попова, 2008), уровня экспрессии поверхностных рецепторов и антигенов (В.А. Крыленков, 1982; Е.В. Дмитриев, 2003; И.А. Колтаков, 2007; Л.И. Попова, 2008; О .В. Земченкова, 2012), активности ферментов (О.В. Земченкова, 2012), синтеза цитокинов (D. Kulms, Т. Schwarz, 2001; Е.А. Двурекова, 2005; И.Е. Савостина, 2005), интенсификации пероксидного фотоокисления липидов (Д.И. Рощупкин, 1993; Е.В. Дмитриев, 2003), усилении спонтанного и митогениндуцированного синтеза ДНК (Е.В. Волгарева, 1991), индукции апоптоза (И.А. Донская, 1997; М.С. Трубицына, 2009). В реализации модифицирующих клеточных эффектов ультрафиолетового излучения и АФК могут участвовать сигналтрансдукторные системы (G.L. Schieven, J.A. Ledbetter, 1993; В .А. Ткачук, 2012), к числу которых относят системы регуляции внутриклеточного кальция, цАМФ, оксида азота. В то же время отсутствуют исчерпывающие данные о взаимосвязи структурно-функциональных модификаций лимфоцитов с изменением уровня внутриклеточных вторичных мессенджеров. Исследования, посвященные изучению процессов модулирования уровня вторичных мессенджеров в лимфоцитах человека, не носят систематического характера. Требуют уточнения и детализации многие вопросы, касающиеся выявления роли экзогенного кальция в процессах функционирования иммуноцитов в условиях воздействия физико-химических факторов.

В этой связи исследование особенностей трансдукции внешнего сигнала в лимфоцитарные клетки позволит выяснить механизмы функционирования иммунокомпетентных клеток человека и разработать способы управления программами жизнедеятельности клеток в норме, при действии внешних факторов и в условиях патологии.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью работы явилось выявление роли отдельных сигнальных путей и вторичных посредников в процессах модуляции структурно-функциональных свойств лимфоцитов периферической крови доноров в условиях воздействия УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 4530 и 9060 Дж/м2 и активных форм кислорода (пероксида водорода, гидроксильного радикала, сииглетного кислорода).

Задачи работы предусматривали:

1. Исследование изменений внутриклеточной концентрации Са2+ в лимфоцитах после воздействия УФ-света и активных форм кислорода (АФК).

2. Исследование изменении уровня цАМФ в цитозоле интактных и УФ-облученных лимфоцитов человека.

3. Выявление возможной роли УФ-света и активных форм кислорода в активации индуцибельной NO-синтазы лимфоцитов и образовании в них N0-радикалов.

4. Исследование структурно-функциональных модификаций плазматических мембран лимфоцитов после УФ-облучения и генерации АФК.

5. Выяснение возможной роли экзогенного кальция в процессах гибели лимфоцитов, индуцированной воздействием УФ-света и активных форм кислорода.

Научная новизна. Изучены изменения уровня вторичных мессенджеров - ионов кальция, цАМФ и оксида азота, в лимфоцитарных клетках человека в условиях воздействия УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 4530, 9060 Дж/м2 и активных форм кислорода (пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода). Установлено участие аденилатциклазного и фосфоинозитидного путей передачи сигнала в процессах модулирования структурно-функционального состояния лимфоцитов человека после воздействия УФ-света и АФК. Исследованы возможные механизмы изменений уровня цитозолыюго кальция в лимфоцитах, суспендированных в кальцийсодержащей и бескальциевой средах, индуцированных УФ-облучением и активными кислородными метаболитами.

Практическая значимость. Результаты данной работы расширяют современные представления о механизмах внутриклеточной передачи сигнала в иммунокомпетентных клетках после воздействия УФ-света и активных форм кислорода. Их необходимо учитывать при обсуждении вопросов, касающихся выявления молекулярно-клеточных механизмов лечебно-профилактического действия метода аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК).

Результаты работы используются в учебном процессе Воронежского государственного университета при проведении занятий по дисциплинам «Биофизика», «Биофизика мембран», «Физико-химические основы межклеточных взаимодействий», «Медицинская биохимия и биофизика», а также в ходе выполнения выпускных квалификационных работ студентами кафедры биофизики и биотехнологии.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 3-й Международной конференции ИНТЕРНАС-2007 «Актуальные проблемы современного естествознания» (Калуга, 2007); 15-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008); Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Беларусь, Минск, 2008); 5-ом съезде Российского фотобиологического общества, международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2008); 6-ом Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); II съезде физиологов СНГ (Кишинэу, Молдова, 2008); Международной конференции студентов,

аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009); VI съезде Российского фотобиологического общества (пос. Шепси. 2011); VI Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2012); IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012); Международной научно-методической конференции «Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы» (Воронеж, 2013); Научных отчетных конференциях преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2009, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 статей и 12 тезисов, в том числе 5 статей в журналах из «Перечня ВАК РФ».

На защиту выносятся следующие положения:

1. Воздействие УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 4530 и 9060 Дж/м2 и активных форм кислорода (пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода) на лимфоциты человека индуцирует изменения уровня внутриклеточных мессенджеров - Са2+, цАМФ, N0.

2. В процессы модулирования уровня цитозольного кальция в лимфоцитах человека после воздействия УФ-света и АФК вносят вклад Са2+-депо клетки, Са2+-каналы и Са2+-АТФаза плазматических мембран, нарушения структурного состояния лимфоцитарных мембран вследствие интенсификации свободнорадикальных процессов.

3. Экзогенный кальций в среде суспендирования лимфоцитов в условиях их УФ-облучения и воздействия АФК определяет направленность изменений уровня внутриклеточного кальция, активности Са2+-АТФазы, структурного состояния плазматических мембран и процессы гибели исследуемых клеток.

4. Схема процессов взаимодействия компонентов отдельных сигналтрансдукторных систем лимфоцитов в условиях их УФ-облучения.

Струюура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 162 страницы машинописного текста, 2 таблицы, 35 рисунков. Состоит из «Введения», 6 глав, «Заключения», «Выводов». Список литературы содержит 247 источников, из них 136 - отечественных и 111 - зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Структурно-функциональные свойства лимфоцитов

В главе изложены современные воззрения о структурно-функциональных свойствах лимфоцитов человека и их субпопуляций.

1.2. Современные представления о механизмах передачи внешнего сигнала

в клетку

Описаны основные пути передачи внешнего сигнала в клетку. Рассмотрена роль оксида азота, арахидоновой кислоты, активных форм кислорода в процессах трансдукции внешнего сигнала в клетку.

1.3. УФ-индуцированные изменения структурно-функциональных свойств

лимфоцитов

Рассмотрены изменения структурно-функциональных свойств лимфоцитарных клеток крови доноров в условиях их УФ-облучения в

различных дозах: цитотоксической активности, антителопродуцирующей способности, уровня экспрессии поверхностных рецепторов, синтеза цитокинов, активности ферментов, фрагментации и степени повреждения ДНК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования

Объектом исследования явились лимфоцитарные клетки, выделенные из гепаринизированной крови доноров. Лимфоциты получали путем центрифугирования донорской крови в градиенте плотности фиколл-урографина (Дж. Клаус, 1990).

УФ-облучение суспензии лимфоцитарных клеток осуществляли при их перемешивании в термостатируемой (при 20 ± ГС) кювете полусферической формы с помощью ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240 - 390 им. Интенсивность излучения - 151 Дж/м2 в мин с учетом расстояния до облучаемого объекта 0,23 м. Объем вносимого в кювету образца составил 1 мл. Дозы облучения клеточных суспензий 151; 1510, 4530 и 9060 Дж/м2.

В экспериментах по изучению структурно-функциональных свойств лимфоцитов применяли следующие системы генерации активных форм кислорода: 1) образование гидроксильных радикалов (ОН') в системе унивалентного восстановления пероксида водорода ионами металлов (S. Goldstein, G. Czapski, 1984); 2) пероксид водорода в конечной концентрации 10"6 моль/л; 3) генерация синглетного кислорода ('02) в присутствии метиленового голубого в условиях облучения красным светом с помощью устройства «Улокс», длина волны максимума излучения — 665±15 нм, диапазон излучения -630-700 нм, выходная интенсивность излучения - 20 мВт/см2.

Внутриклеточный уровень свободных ионов кальция определяли с помощью флуоресцентного зонда Fura-2AM («Sigma», США) на спектрофлуориметре Shimadzu RF-1501 (С.Н. Орлов, Ю.А. Лабас, 1989).

Уровень цАМФ в цитозоле нативных и УФ-модифицированных лимфоцитов регистрировали радиоиммунным методом при помощи стандартного набора РИА цАМФ-I125 фирмы Immunotech (Чехия) и у-счетчика.

Об интенсивности процессов пероксидного окисления липидов судили по уровню спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции на биохемилюминометре-07 М (Ю.А. Владимиров и др., 2011).

Для количественной оценки продукции оксида азота использовали колориметрический метод определения уровня нитритов в цитозоле лимфоцитов с помощью реактива Грисса (Г.Н. Близнецова и др., 2002).

Исследование изменений структурного состояния мембран лимфоцитов осуществляли при помощи флуоресцентного зонда 1-анилинонафталин-8-сульфоната на спектрофлуориметре Shimadzu RF-1501 (Ю.А. Владимиров, Г.Е. Добрецов, 1980).

Активность Са2+-АТФазы плазматических мембран определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре Shimadzu UF-2401 PC по количеству продукта гидролиза АТФ - фосфата (Г.Н. Никулин, 1995).

Для определения количества апоптотических клеток в суспензии лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии использовали проточный цитометр CyFlow Space (Partee, Германия) и тест-систему для детекции апоптоза Annexin V-FITC Kit (BeckmanCoulter, Франция).

Обработку результатов экспериментов проводили с помощью пакета статистических программ «Statgraphics». Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0,05.

ГЛАВА 3. Исследование изменений уровня некоторых вторичных мессенджеров в лимфоцитарных клетках человека в условиях воздействия

УФ-света

С целью установления взаимосвязи между направленностью изменений функциональных свойств лимфоцитов и уровнем внутриклеточных мессенджеров в исследуемых клетках в условиях УФ-облучения нами были изучены изменения концентрации цАМФ в лимфоцитах, модифицированных воздействием УФ-света в дозах 151, 1510, 9060 Дж/м".

Обнаружено значительное снижение уровня цАМФ в лимфоцитах сразу после их облучения в дозах 151,1510, 9060 Дж/м2 соответственно на 65, 62 и 40 % по сравнению с таковым для нативных клеток (100 %) (рис. 1). Можно предположить, что УФ-свет ингибирует активность аденилатциклазы либо активирует каскад: ингибирующий рецептор R, -> ингибирующий аденилатциклазу Gj -белок -> снижение активности аденилатциклазы. Не исключена возможность активации фосфодиэстеразы. Рост концентрации внутриклеточного цАМФ сопровождается существенным изменением функциональной активности Т-клеток: угнетением пролиферации, подавлением антигензависимого цитолиза, модуляцией синтеза и секреции цитокинов (Е.М. Куклина, C.B. Ширшев, 2000).

Уровень цАМФ, % 120

151

1510 9060

Доза облучения, Дж/м"

Рис. 1. Изменение уровня цАМФ после УФ-облучения лимфоцитов

Известно (Е.М. Куклина. C.B. Ширшев, 2000; C.B. Ширшев, 2011), что в клетке осуществляется взаимодействие различных систем транедукции сигнала посредством изменения и взаиморегулирования уровня вторичных мессенджеров. В связи с этим представлялось необходимым исследовать

уровень внутриклеточного кальция в лимфоцитах человека после их УФ-облучения в различных дозах.

При исследовании величины внутриклеточной концентрации кальция в лимфоцитах, УФ-модифицированных в дозе 151 Дж/м2, были выявлены 3 группы доноров, различающихся по исходным (до УФ-облучения) величинам изучаемого параметра и по характеру их изменений после воздействия УФ-света.

Для первой группы доноров (п=9) уровень Са2+ в нативных лимфоцитах составил 266,7±26,9 нмоль/л (рис. 2, а). После облучения клеток обнаружено статистически достоверное снижение концентрации Са2+ до величины 135,8±27,0 нмоль/л в цитозоле по сравнению с таковым для интактных клеток.

Для второй группы доноров (п=14) уровень кальция составил 87,0±16,6 нмоль/л. а после воздействия УФ-света - 149,0±15,5 нмоль/л (рис. 2, б). Для третьей группы доноров (п=11) уровень кальция в необлученных клетках составил 140,4±16,0 нмоль/л и статистически достоверно не изменялся (169,2±54,2 нмоль/л) после воздействия на лимфоциты УФ-света по сравнению с контролем (рис. 2. в). Таким образом, облучение в дозе 151 Дж/м2 лимфоцитов доноров с исходно повышенным и исходно сниженным уровнем Са2+ приводит к нормализации значений изучаемого показателя.

[Са" ]|, нмоль/л 350 300 250 200 150 100 50 0

[Са ],, нмоль/л 200

150

100

50 0

контроль

[Са ]|, нмоль/л 250

200

150

100

50

0

а)

151 Дж/м"

контроль

151 Дж/м

б)

Рис. 2. Изменение уровня кальция в цитозоле лимфоцитов после воздействия УФ-света в дозе 151 Дж/м2:

а) 1-я группа доноров,

б) 2-я группа доноров,

в) 3-я группа доноров

контроль

151 Дж/м" в)

С целью выявления причин модуляции уровня цитозольного Са2т в лимфоцитах после воздействия УФ-света нами были изучены изменения концентрации этого внутриклеточного мессенджера после УФ-облучения (151 Дж/м2) иммуноцитов, суспендированных в бескальциевой среде - растворе Хенкса, не содержащем ионов Са2+ (рис. 3).

Для первой группы доноров (п=14) исходный уровень кальция составил 252,7+48,3 нмоль/л (рис. 3, а). Воздействие УФ-света на лимфоциты индуцировало статистически достоверное снижение внутриклеточной концентрации Са2+ до величины 113,7+26,3 нмоль/л по отношению к таковому для необлученных клеток.

Для второй группы доноров (п=7) уровень кальция в нативных лимфоцитах составил 78,6+26,9 нмоль/л (рис. 3, б). После облучения клеток обнаружено повышение концентрации Са2+ до 245,3±14,7 нмоль/л в цитозоле по сравнению с таковым для интактных клеток.

Для третьей группы доноров (п=9) уровень кальция в интактных клетках составлял 142.2+7,3 нмоль/л (рис. 3, в). После воздействия УФ-света на лимфоциты уровень исследуемого параметра повышался до 290,3+80,1 нмоль/л по сравнению с необлученными клетками.

2+

[Са , нмоль/л

350 300 250 200 150 100 50 0

2+

[Са ]|, нмоль/л

300 250 200 150 100 50 - 0

контроль

151 Дж/м"

а)

контроль

б)

151 Дж/м"

2+

[Са" , нмоль/л 400 300 200 100

0

контроль

151 Дж/м

Рис. 3. Изменение уровня кальция в цитозоле лимфоцитов, суспендированных в бескальциевой среде, после воздействия УФ-света в дозе 151 Дж/м2:

а) 1-я группа доноров,

б) 2-я группа доноров,

в) 3-я группа доноров

в)

В связи с тем, что клетки находились в бескальциевой среде, повышение величины исследуемого параметра преимущественно обусловлено выходом ионов Са2+ в цитозоль из внутриклеточных депо (пузырьков эндоплазматической сети, митохондрий, ядра).

Эти данные указывают на участие фосфоинозитидного механизма передачи сигнала в лимфоцитах в процессах модификации их структурно-функционального состояния в условиях воздействия на лимфоциты человека УФ-излучения.

После воздействия УФ-света в дозах 1510 и 4530 Дж/м2 на лимфоциты, суспендированные в среде, содержащей кальций, и в бескальциевой среде, наблюдается статистически достоверное повышение внутриклеточной концентрации кальция по сравнению с таковой для интактньгх клеток. Уровень Са21 в клетках в Са2+-содержащей и в бескальциевой среде после облучения в дозе 1510 Дж/м2 составил соответственно 298,7+109,1 нмоль/л и 314,2+105.9 нмоль/л, а после облучения в дозе 4530 Дж/м2 - 271,6±64,1 нмоль/л и 337,4+64.8 нмоль/л. Полученные результаты свидетельствуют в пользу представления об участии кальциевых депо клетки в изменениях уровня цитозольного кальция в лимфоцитах человека в условиях их УФ-модификации.

Таким образом, нами подтверждены экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу представлений о корригирующем влиянии УФ-света в малых «терапевтических» дозах на уровень внутриклеточного кальция в цитозоле лимфоцитов, суспендированных в Са2+-содержащей среде. Установлено, что модулирование внутриклеточной концентрации Са2+ в УФ-облученных клетках осуществляется с участием компонентов фосфоинозитидного механизма передачи сигнала, а также, вероятно. Са2+-АТФаз плазматических и внутриклеточных мембран лимфоцитов.

С использованием методов спектрофотометрии, люминолзависимой хемилюминесценции и флуоресцентного зонда 1-анилинонафталин-8-сульфоната (АНС) установлено, что одной из причин модуляции уровня внутриклеточного кальция в условиях УФ-облучения является интенсификация свободнорадикальных процессов на поверхности фотомодифицированных клеток и направленность изменений функциональной активности Са2+-АТФазы облученных лимфоцитов, зависящая от наличия экзогенного кальция в среде суспендирования клеток.

Полагают (С.Я. Проскуряков и др., 1999), что ионы Са2+ могут выступать в роли активаторов 1ЧО-синтазы, образующей N0. С целью выявления возможности индукции МО-синтазы в лимфоцитах человека под влиянием УФ-света нами были изучены изменения уровня нитритов в цитозоле исследуемых клеток, модифицированных воздействием УФ-излучения.

Установлено, что через 24 часа после УФ-облучения лимфоцитов наблюдается повышение уровня нитритов в цитозоле иммуноцитов по отношению к контролю (рис. 4). Следовательно, УФ-свет в используемых дозах выступает в качестве индуктора индуцибельной ЫО-синтазы и образования оксида азота.

Вероятно, изменение уровня внутриклеточных мессенджеров - цАМФ, Са2+, N0 - и их взаимовлияние и обусловливают модуляцию функциональных свойств лимфоцитов в условиях воздействия УФ-света.

[N0 2]>мкмоль/л

0,07

0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00

Рис. 4. Изменение уровня N0 2 в лимфоцитах после воздействия УФ - света

0

151

1510

4530 Дж/м"

ГЛАВА 4. Исследование изменений уровня некоторых вторичных мессенджеров в лимфоцитарных клетках человека в условиях воздействия активных форм кислорода

С целью выявления взаимосвязи между направленностью изменений структурно-функциональных свойств лимфоцитов человека и уровнем вторичных мессенджеров в цигозоле исследуемых клеток нами были определены величины внутриклеточной концентрации свободного кальция в норме и после генерации АФК (рис. 5).

После добавления к суспензии клеток в Са "-содержащей среде пероксида водорода (10~6 моль/л) концентрация внутриклеточного Са" статистически достоверно увеличилась до 260,0±43,1 нмоль/л по отношению к контролю (121,9±15,8).

После генерации синглетного кислорода величина параметра лимфоцитарных клеток повысилась по сравнению немодифицированных клеток и составила 521,2+61,2 нмоль/л.

Воздействие гидроксильных радикалов на лимфоциты индуцировало статистически достоверное повышение уровня цигозольного кальция до 436,3±48,0 нмоль/л по отношению к контролю. +

С целью выявления роли внутриклеточных депо Са + в процессах изменения (повышения) уровня цитозольного кальция лимфоцитов после генерации АФК нами были проведены эксперименты на клетках, суспендированных в бескальциевой среде (рис. 5).

Уровень кальция в цигозоле интактных лимфоцитов составил 114,6±32,7 нмоль/л. После добавления к суспензии клеток пероксида водорода (10"

исследуемого с таковой для

моль/л) концентрация внутриклеточного нмоль/л по отношению к контролю.

Са2+ увеличилась до 241,2+71,8

После генерации синглетного кислорода величина исследуемого параметра лимфоцитарных клеток повысилась по сравнению с таковой для немодифицированных клеток и составила 275,0±77,5 нмоль/л.

Воздействие гидроксильных радикалов на лимфоциты индуцировало статистически значимое повышение уровня цитозольного кальция до 226,2±20,9 нмоль/л по отношению к контролю.

Таким образом, нами установлено, что АФК (пероксид водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород) вызывают повышение внутриклеточной концентрации кальция в лимфоцитах человека, суспендированных в Са2+-содержащей и в бескальциевой средах, по отношению к таковой для нативных клеток.

Причем эффект повышения уровня цитозольного кальция в лимфоцитах, суспендированных в Са24-содержащей среде, после воздействия '02 и ОН' выше по сравнению с таковым для клеток в бескальциевой среде.

[Са 700 600 500 400 300 200 100 0

, нмоль/л

Рис. 5. Изменение уровня ка1ьция в цитозоле лимфоцитов, модифицированных воздействием АФК: О-в кальцийсодержащей среде,

| ]- в бескальциевой среде

контроль Н202

О,

ОН

Следовательно, модуляция уровня цитозольного кальция в условиях генерации этих АФК в Са2+-содержащей среде связана не только с активацией фосфоинозитидной сигналтрансдукторной системы, но и со входом кальция в клетку из среды через каналы и за счет нарушения целостности плазматической мембраны клетки.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу представления об участии фосфоинозитидного механизма передачи сигнала в процессах изменения уровня внутриклеточного кальция и структурно-функциональных свойств лимфоцитов после воздействия на них АФК.

В присутствии верапамила - блокатора кальциевых каналов плазматических мембран - в кальциевой среде наблюдается статистически достоверное снижение концентрации кальция в модифицированных воздействием Ч)2 и ОН' клетках по сравнению с таковым для лимфоцитов после генерации данных АФК в отсутствие верапамила. Полученные данные свидетельствуют о том, что повышение концентрации кальция в лимфоцитарных клетках после воздействия вышеуказанных АФК происходит с

участием Са2+-каналов плазматических мембран, по которым Са~ транспортируется из среды в цитозоль. Однако нельзя исключить и возможность проникновения ионов кальция внутрь лимфоцитарных клеток через «дефекты» в плазматической мембране, образующиеся в результате её оксидативной модификации под влиянием АФК, а также выхода Са+ из внутриклеточных депо.

С целью выявления механизмов взаимодействия различных путей регулирования уровня кальция в клетках нами были исследованы изменения внутриклеточной концентрации Са2+ модифицированных воздействием АФК, тирозинкиназ - генистейна (рис. 6).

Нами обнаружено, что генистейн в бескальциевой среде блокирует выход Са2+ из кальциевых депо в цитоплазму. По-видимому, в присутствии генистейна происходит ингибирование тирозиновых киназ, фосфорилирующих 1Р3-рецепторы Са2+-депо, которые участвуют в открывании Са2 ^каналов внутриклеточных депо кальция.

в лимфоцитах человека, в присутствии ингибитора

[Са

700 600 500 400 300 200 100 0

, нмоль/л

^ т

¿1

к

контроль генистеин

н2о2

О-,

он

Рис. 6. Уровень Са+ в цитозоле лимфоцитов, суспендированных в кальциевой и бескальциевой средах, после воздействия АФК в присутствии генистейна:

□ - в среде, содержащей кальций, ¡—] - в бескальциевой среде

Итак, нами выявлена взаимосвязь между функционированием гирозинкиназной и фосфоинозитидной систем передачи внешнего сигнала в лимфоциты человека в условиях экзогенной генерации АФК.

Обнаружено статистически значимое повышение по отношению к контролю уровня нитритов в лимфоцитах человека в 1,9; 3,3 и 2,1 раз через 24 ч после экзогенной генерации ОН', Н202 и '02 соответственно.

Выявлено статистически значимое снижение уровня интенсивности флуоресценции зонда АНС в комплексе с лимфоцитами, модифицированными воздействием ОН', Н202, '02. по отношению к таковому для интактных клеток, свидетельствующее об интенсификации процессов пероксидного окисления липидов на поверхности иммуноцитов.

При исследовании уровня люминолзависимой хемилюминесценции лимфоцитов выявлено, что в кальцийсодержащей среде модификация мембран лимфоцитов в условиях генерации гидроксильного радикала и добавления пероксида водорода связана с интенсификацией свободнорадикальных процессов на поверхности исследуемых клеток.

В условиях экзогенной генерации синглетного кислорода и гидроксильного радикала зарегистрировано повышение активности Са2+-АТФазы лимфоцитов, суспендированных в кальциевой среде. По-видимому, повышение активности Са2+-АТФазы происходит за счет повышения уровня ПОЛ и, следовательно, повышения неспецифической проницаемости мембраны для ионов Са2+, которые, связываясь с кальмодулином, активируют фермент.

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что повышение уровня кальция в цитозоле лимфоцитарных клеток после генерации АФК обусловлено наряду с активацией кальциевых каналов и выходом кальция из внутриклеточных депо нарушением структурного состояния плазматических мембран иммуноцитов, модифицированных воздействием активированных кислородных метаболитов, в результате чего ионы Са2+ проникают в клетку из среды.

ГЛАВА 5. Исследование изменений уровня кальция и структурного состояния мембран лимфоцитов в присутствии фосфолипазы А2 и простагландина Е2

При УФ-облучении лимфоцитов происходит активация фосфолипаз А, и А2, приводящая к высвобождению лизофосфолипидов и арахидоновой кислоты (Д.И. Рощупкин, М.А. Мурина, 1993). Из арахидоновой кислоты образуются простагландины (ПГ), которые являются как внутриклеточными мессенджерами, так и межклеточными сигнальными молекулами. Согласно современным представлениям, физиологические эффекты ПГЕ обеспечиваются их связыванием со специфическими простаноидными рецепторами плазматических мембран, ассоциированными с G-белками и инициацией соответствующих систем сигнальной трансдукции: аденилатциклазной. фосфоинозитидной и кальциевой (R.A. Coleman, 2001).

Представлялось необходимым провести модельные исследования, направленные на определение уровня внутриклеточного кальция при воздействии на лимфоциты фосфолипазы А2 и простагландина Е2.

При исследовании уровня цитозольного кальция в лимфоцитах после воздействия на клетки фосфолипазы А2 (10~8 моль/л) было обнаружено статистически достоверное повышение величины изучаемого параметра по отношению к таковому для немодифицированных иммуноцитов (рис. 7).

[Са~ ]j, нмоль/л

Рис. 7. Изменение уровня кальция в цитозоле лимфоцитов после модификации их мембран фосфолипазой А2

Нами обнаружено повышение по йййй сравнению с контролем уровня кальция 4— (рис. 8, а) после модификации клеток простагландином Е2 (Ю 7 моль/л) в Са2+-: _> содержащей среде. В бескальциевой

троль ФЛА2

500

400 •

300 •

200 ■

100 ■

среде зарегистрировано статистически достоверное снижение по отношению к контролю уровня кальция (рис. 8, б) после модификации клеток ПГЕ2.

После модификации клеток ПГЕ2 в Са2+-содержащей среде зарегистрировано статистически достоверное повышение по сравнению с контролем активности Са2+-АТФазы. В бескальциевой среде активность Са" -

АТФазы снижается. 2+

Следовательно, выявлена сходная направленность изменений уровня Са и активности Са2+-АТФазы лимфоцитов в Са2+-содержащей и бескальциевой средах, модифицированных воздействием ПГЕ2.

Возможно, что наблюдаемые нами эффекты воздействия простагландина Е2 в бескальциевой среде на лимфоциты (снижение уровня Са2+ и активности Са2+-АТФазы) связаны с интенсификацией свободнорадикальных процессов на поверхности клеток и образованием АФК, что приводит к нарушению структурного состояния плазматических мембран лимфоцитов.

[Са 600 500 400 300 200 100 0

2+.

2+

|;, нмоль/л

[Са" ];, нмоль/л

140 120 100 80 60 40 20 . 0

+

контроль

ПГЕ,

контроль

ПГЕ,

а)

б)

Рис. 8. Изменение уровня кальция в Са2+-содержащей (а) и бескальциевой (б) средах, модифицированных воздействием ПГЕ2

Полученные нами результаты показывают, что фосфолипаза А2 и простагландин Е2, могут вносить вклад в процессы изменения уровня кальция в цитозоле клеток и структурно-функционального состояния плазматических мембран лимфоцитов после их УФ-облучения.

ГЛАВА 6. Исследование роли экзогенного кальция в реализации клеточной гибели лимфоцитов, модифицированных воздействием физико-

химических факторов

В настоящее время кальций относят к числу эндогенных медиаторов проведения апоптотического сигнала в клетках. Однако роль экзогенного кальция в реализации процессов клеточной гибели не ясна. В связи с этим мы провели проточно-цитометрический анализ лимфоцитов человека, суспендированных в Са2+-содержащей и бескальциевой средах, после воздействия УФ-света и АФК. Результаты экспериментов показаны на рисунках 9, 10, 11.

Облучение лимфоцитов в дозе 1510 Дж/м2 с их последующей инкубацией в течение 1 часа индуцировало незначительное повышение количества клеток на ранней стадии апоптоза и поздней стадии апоптоза или некроза по сравнению с таковым для интактных клеток. Отсутствие кальция в среде суспендирования клеток практически не влияло на уровень погибших и вступающих в апоптоз лимфоцитов.

Выявлено (рис. 9), что через 3 ч после облучения лимфоцитов в бескальциевой среде происходит повышение количества клеток на ранней стадии апоптоза (6,37 %) по отношению к таковому для нативных образцов (1,10%).

УФ-облучение лимфоцитов в кальцийсодержащей среде и их инкубация в течение 6 ч индуцировали значительный рост количества клеток, находящихся на поздней стадии апоптоза или некроза (66,26 %) по сравнению с таковым для контрольных образцов (1,56 %) (рис. 10). Количество ранних апоптотических лимфоцитов возрастало с 7,90 % до 17.84 %. Следовательно, при наличии кальция в среде суспендирования клеток через 6 ч после облучения преобладали погибшие клетки (клетки с поврежденной мембраной).

1000

100 ? 10

4

ц ]

0,1

0,34 %

* 1.10%

а)

0,1 1 10 100 1000 И,-1/ Аннексии \'-Р1ТС

Рис. 9. Проточно-цито-метрический анализ лимфоцитов через 3 б) часа после УФ-модификации:

а - контроль в

________ __ бескальциевой среде,

М 1 "10.....1"00 ГЬОО б - 1510 Дж/м2 в

РЬ1 / Аннексии У-НТС бескальциевой среде

юоо 100 ю 1

о,)

1,56%

7,9 %

РЬ-1/Аннексии У-ИТС

1000 100

I Ю "Г

ь 1

0,1

66,26 %

17,84%

в) ^ "Г и.

0,1 1 10 100 1000 РЫ/ Аннексии У-Р1ТС

1000 100 ; ю 1 0,1

4,67 %

6)

2,35 %

0,1 1 10 100 1000 РЬ-1/ Аннексии У-Р1ТС

1000 100 10 1

0.1

35,15%

.0 57,66 %

Рис. 10. Проточно-ци-тометрический анализ лимфоцитов через 6 часов после УФ-модификации: а - контроль в Са2+-содержащей среде,

б - контроль в бескальциевой среде, в - 1510 Дж/м2 в Са2+-г) содержащей среде, г - 1510 Дж/м2 в бескальциевой среде

0,1 1 10 100 юоо

РЫ/ Аннексии У-Р1ТС

В отсутствие экзогенного кальция через 6 ч после воздействия УФ-света на лимфоциты в образце преобладали клетки на ранней стадии апоптоза (57,66 %). Количество лимфоцитов на поздней стадии апоптоза или некроза составило 35,15 %.

0.1 1 10 100 1000 0,1 1 10 100 1000 РЫ/ Аннексии У-ИГТС Аннексии У-ПТС

Рис. И. Проточно-цитометрический анализ лимфоцитов через 6 часов после модификации: а - контроль в Са2+-содержащей среде, б - контроль в бескальциевой среде, в - Н202 в Са2+-содержащей среде, г - '02 в Са2+-содержащей среде

При проведении проточно-цитометрического анализа лимфоцитов, модифицированных воздействием Н202 и '02, через 6 ч инкубации в Са" -содержащей среде преобладали клетки на ранней стадии апоптоза (соответственно 9,08 и 20.87 %) (рис. 11). В бескальциевой среде количество вступивших в апоптоз и погибших клеток существенно не отличалось от контроля.

Полученные данные свидетельствуют в пользу представления о важной роли внеклеточного кальция в реализации апоптотической гибели лимфоцитов после их УФ-облучения и воздействия АФК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При помощи методов радиоиммунного анализа, флуоресцентных зондов, спектрофотометрии, хемилюминесценции исследованы процессы модулирования уровня вторичных мессенджеров в лимфоцитах периферической

крови доноров, индуцированные воздействием УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 4530, 9060 Дж/м2 и активных форм кислорода (пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода).

Выявлено, что воздействие УФ-света в дозах 151, 1510, 9060 Дж/м2 на лимфоциты человека индуцирует статистически достоверное снижение по отношению к контролю уровня цАМФ в цитозоле клеток соответственно на 65, 62 и 40 %.

Установлено корригирующее воздействие УФ-света в дозе 151 Дж/м2 на уровень Са2+ в цитозоле лимфоцитов, суспендированных в Са2+-содержащей среде, для доноров с исходно повышенной и исходно пониженной величиной изучаемого параметра. Модулирование уровня цитоплазматического Са2+ в лимфоцитах, УФ-облученных в данной дозе, в кальцийсодержащей среде, связано с высвобождением кальция из внутриклеточных депо (эндоплазматический ретикулум, митохондрии), входом Са2+ из среды и активацией Са2+-АТФазы плазматических мембран.

После УФ-облучения в дозе 151 Дж/м2 иммуноцитов, суспендированных в бескальциевой среде, обнаружено статистически достоверное повышение по сравнению с контролем концентрации Са2+ в клетках доноров с исходно нормальным и исходно сниженным уровнем этого вторичного мессенджера. В лимфоцитах с исходно повышенной величиной изучаемого параметра зарегистрировано снижение концентрации цитоплазматического кальция до ее средних значений. Изменения уровня Са2+ в лимфоцитах, УФ-модифицированных в дозе 151 Дж/м2 и суспендированных в бескальциевой среде, обусловлены преимущественно выходом Са2+ в цитозоль из внутриклеточных депо.

Установлено, что модулирование внутриклеточной концентрации Са2+ в УФ-облученных клетках осуществляется с участием компонентов фосфоинозитидного механизма передачи сигнала, а также Са2+-АТФаз плазматических мембран лимфоцитов.

УФ-облучение в дозах 1510 и 4530 Дж/м2 лимфоцитов, суспендированных в Са2+-содержащей и бескальциевой средах, индуцирует статистически значимое повышение уровня Са2+ по сравнению с таковым для немодифицированных клеток. Облучение клеток в указанных дозах в Са2+-содержащей среде приводит к повышению проницаемости плазматической мембраны (вследствие повышения интенсивности свободнорадикальных процессов) для ионов Са2+ и возрастанию их уровня в цитозоле клеток.

Увеличение концентрации Са2+ в цитозоле лимфоцитов, суспендированных в бескальциевой среде, после воздействия УФ-света в дозах 1510 и 4530 Дж/м2 обусловлено выходом кальция из внутриклеточных депо и инактивацией Са2+-АТФазы.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу представления об участии кальциевых депо клетки в изменениях уровня цитозольного кальция в лимфоцитах человека в условиях их УФ-модификации.

Установлено, что через 24 ч после УФ-облучения в дозах 151, 1510, 4530 Дж/м2 и воздействия АФК (ОН', Н202, '02) на лимфоциты, суспендированные в Са2+ -содержащей среде, наблюдается повышение уровня нитритов в цитозоле

по сравнению с таковым для необлученных клеток. Это указывает на возможность активации индуцибелыюй ЫО-синтазы и образования оксида азота

в исследуемых клетках.

^ В условиях воздействия Н202, '02 и ОН' на лимфоциты, суспендированные в Са2+-содержащей и бескальциевой средах, происходит повышение уровня внутриклеточного кальция по сравнению с таковым для интактных клеток. Модуляция уровня цитозолыюго кальция в условиях генерации данных АФК в Са2+-содержащей среде связана не только с активацией фосфоинозитидной сигналтрансдукторной системы, но и со входом кальция в клетку из среды через кальциевые каналы, ингибируемые верапамилом, и за счет нарушения целостности плазматической мембраны клетки.

Показано, что после воздействия АФК в присутствии генистеина на лимфоциты, суспендированные в бескальциевой среде, происходит статистически достоверное снижение уровня цитозольного кальция по отношению к таковому как для клеток, модифицированных АФК в кальциевой среде, так и для интактных клеток.

Выявлена взаимосвязь между функционированием тирозинкиназной и фосфоинозитидной систем передачи внешнего сигнала в лимфоциты человека в условиях экзогенной генерации активных форм кислорода

Через 6 ч после воздействия УФ-света в дозе 1510 Дж/м и АФК (Н202, '02) для лимфоцитов, суспендированных в Са2+-содержащей среде, обнаружено значительное повышение количества клеток, находящихся на ранней и поздней стадиях апоптоза. В отсутствие экзогенного кальция через 6 ч после воздействия УФ-света на лимфоциты в образце преобладали клетки на ранней стадии апоптоза. Установлена роль экзогенного кальция в процессе реализации апоптоза лимфоцитарных клеток человека, индуцированного УФ-светом и

АФК. _

Установлено, что после воздействия ПГЕ2 и ФЛА2 на лимфоциты, суспендированные в Са2+-содержащей среде, происходит увеличение уровня цитоплазматического кальция и активности Са2+-АТФазы. Отсутствие кальция в среде суспендирования клеток приводило к снижению величин изучаемых параметров.

По нашим данным, модулирование структурно-функционального состояния лимфоцитов в условиях воздействия УФ-света и АФК связано с взаимодействием таких внутриклеточных эффекторов передачи сигнала, как Са2+, цАМФ, N0, фосфолипаза А2, простагландин Е2 (рис. 12).

' Ответная реакция лимфоцитов (активация Т-клеток, апоптоз) на воздействие этих факторов будет зависеть от уровня экзогенного кальция. Наличие экзогенного кальция в суспензии лимфоцитов в условиях их УФ-облучения и генерации АФК определяет направленность изменений уровня внутриклеточного кальция, активности Са2+-АТФазы, структурное состояние плазматических мембран и тип гибели исследуемых клеток.

Внеклеточная среда

/ \ кальмодулин стимуляция каЛьцинейрин А X ■ ФЛА2 |

клеточный ответ

/ \

№АТ

Образование N0

арахидоновая кислота

ПГ

J

образование лизофосфолипидов

вход Са2+ из среды в цитозоль

Рис. 12. Схема процессов взаимодействия компонентов отдельных сигналтрансдукторных систем лимфоцитов в условиях УФ-облучения (151 Дж/м2): АЦ-аденилатциклаза, АР-1 - активирующий протеин-1. ДАГ -диацилглицерол, ИФ3- инозитол-1,4,5-трифосфат, ЖкВ - ядерный фактор кВ, М^АТ - ядерный фактор активированных Т-клеток, ПКС - протеинкиназа С, ПГ - простагландины, К^ и — соответственно стимулирующие и ингибирующие рецепторы, и в; - соответственно стимулирующие и ингибирующие С-белки, ЖК - с^ип-Ы-терминальная протеинкиназа, ПКА - протеинкиназа А, ФЛС -фосфолипаза С, ФИФ2 - фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат, ФДЭ -фосфодиэстераза, ЭПР - эндоплазматический ретикулум, «+» - активация, «-» -ингибирование

ВЫВОДЫ

1. Воздействие УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 9060 Дж/м2 на лимфоциты человека индуцирует статистически значимое снижение по отношению к контролю уровня цАМФ в цитозоле соответственно на 65, 62 и 40%. 2

2. УФ-облучение лимфоцитов в Са2+-содержащей среде в дозе 151 Дж/м оказывает корригирующее воздействие на уровень Са2+ в цитоплазме клеток доноров с исходно повышенной и исходно пониженной величиной исследуемого показателя.

3. Воздействие УФ-излучения в дозе 151 Дж/м2 на лимфоциты в бескальциевой среде вызывает статистически достоверное повышение по сравнению с контролем концентрации Са2+ в клетках доноров с исходно нормальным и исходно сниженным уровнем этого вторичного мессенджера. Облучение в тех же условиях лимфоцитов доноров с исходно повышенной величиной изучаемого параметра индуцирует снижение концентрации кальция до его средних значений.

4. УФ-облучение в дозах 1510 и 4530 Дж/м2 лимфоцитов, суспендированных в Са2+-содержащей и бескальциевой средах, индуцирует статистически достоверное повышение уровня Са2+ в цитозоле по сравнению с таковым для немодифицированных клеток.

5. Модулирование уровня цитоплазматического Са2+ в лимфоцитах, УФ-облученных в дозе 151 Дж/м2 в присутствии экзогенного кальция, связано с высвобождением кальция из внутриклеточных кальциевых депо, входом Са из среды в цитоплазму через рецепторзависимые и депозависимые Са +-каналы в условиях активации Са2+-АТФазы плазматических мембран.

6. Изменения уровня Са2+ в лимфоцитах, УФ-модифицированных в дозе 151 Дж/м2 в отсутствие экзогенного кальция, обусловлены преимущественно выходом Са2+ в цитозоль из внутриклеточных депо и инактивацией плазматической Са2+-АТФазы.

7. При облучении лимфоцитов в Са2+-содержащей среде (в дозах 1510 и 4530 Дж/м2) в уровень повышения цитоплазматического кальция существенный вклад вносит вход Са2+ в клетку через «дефекты» плазматической мембраны, связанные с образованием активных форм кислорода и интенсификацией пероксидного окисления липидов.

8. Через 24 ч после УФ-облучения в дозах 151, 1510, 4530 Дж/м в Са содержащей среде смеси лимфоцитов и Т-клеток, а также после воздействия на них ОН', Н202, '02 наблюдается повышение уровня нитритов в цитозоле по сравнению с таковым для необлученных клеток, что указывает на возможность активации индуцибельной >Ю-синтазы и образования оксида азота в исследуемых клетках.

9. Установлено, что в условиях воздействия Н202 (10" моль/л), 02 и ОН* на лимфоциты, суспендированные в Са2+-содержащей и бескальциевой средах, происходит повышение уровня внутриклеточного кальция по сравнению с таковым для интактных клеток.

10. Повышение уровня цитозольного кальция в условиях воздействия АФК на лимфоциты связано с освобождением Са2+ из внутриклеточных депо, входом Са2+ из среды через Са2+-каналы, ингибируемые верапамилом, функционированием тирозинкиназ, фосфорилирующих 1Р3-рецепторы Са2+-депо, нарушением структурного состояния плазматических мембран вследствие интенсификации ПОЛ в условиях сохранения (или повышения) каталитической активности Са2+-АТФазы.

11. Наличие экзогенного кальция в среде суспендирования лимфоцитов индуцирует повышение количества клеток на ранней и поздней стадиях апоптоза через 6 ч после воздействия УФ-света в дозе 1510 Дж/м2 и АФК (Н202, 102) по сравнению с таковым для лимфоцитов, модифицированных в бескальциевой среде.

12. В процессы модулирования уровня внутриклеточного кальция в лимфоцитах человека в условиях УФ-облучения вносят вклад активация фосфолипазы А2 и образование простагландинов в ходе циклооксигеназного ПОЛ в фотомодифицированных клетках.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Анализ механизмов действия УФ-света на лимфоцитарные клетки человека / В.Г. Ар-лохов, М.А. Наквасина, О.В. Лидохова. М.С. Трубицына, Л.И. Попова // Вестник Калужского университета. - Калуга, 2007. - № 1. - С. 56-63.

2. The modification of structural-fùnctional properties of human blood lymphocytes in conditions of superoxide anion-radical génération / V.G. Artyukhov, M.A. Nakvasina, O.V. Lidokhova. M.S. Trubicina, L.I. Popova // 3rd International Conférence INTERNAS'2007; Kaluga, Russia, 22-25 may 2007 r. - Kaluga, 2007. -P. 48 - 49.

3. Лидохова О.В. Изменения уровня кальция в лимфоцитах человека в условиях воздействия активных форм кислорода / О.В. Лидохова. В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина // Физиология и психофизиология мотиваций: межрегиональный сборник научных работ. - Воронеж: ВГУ, 2007. - Вып. 8. -С. 37-38.

4. Лидохова О.В. Взаимосвязь уровня экспрессии мембранных рецепторов и цАМФ лимфоцитов человека в условиях УФ-облучения / О.В. Лидохова. М.С. Трубицына, Л.И. Попова // Труды молодых ученых. - 2007. - № 1-2. - С. 75-77.

5. Структурно-функциональные модификации лимфоцитов человека, индуцированные воздействием УФ-света / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина, О.В. Лидохова. М.С. Трубицына, Л.С. Свекло // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2008. - Т. 48, № 6. - С. 741-747.

6. О механизмах модулирующего действия УФ-света на структурно-функциональные свойства лимфоцитов человека / В.Г. Артюхов, Л.С. Свекло, М.С. Трубицына, Л.И. Попова, О.В. Лидохова. М.А. Наквасина // Производственная, клиническая и транспортная трансфузиология: этапы реформирования, инфекционная и иммунологическая безопасность, критерии качества: Сборник научно-практических работ. - 2008. - № 2. - С. 128-141.

7. Лидохова О.В. Биофизические аспекты апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием активных форм кислорода / О.В. Лидохова, М.С. Трубицына // Ломоносов-2008: тезисы докладов 15 Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, Москва, 8-11 апреля 2008. - Москва, 2008. - С. 14.

8. О взаимосвязи структурно-функциональных модификаций и уровня вторичных мессенджеров лимфоцитов человека в условиях УФ-облучения / М.А. Наквасина, О.В. Лидохова, М.С. Трубицына, Л.И. Попова, В.Г. Артюхов // Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: международная научная конференция: Минск, Беларусь, 25-27 июня 2008. - Минск, 2008. - Ч. 1. - С. 242-244.

9. Лидохова О.В. УФ-индуцированные изменения уровня вторичных мессенджеров лимфоцитарных клеток человека / О.В. Лидохова, М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов // 6-й Сибирский физиологический съезд, Барнаул, 2527 июня 2008: тезисы докладов, Т. 1. - Барнаул, 2008. - С. 237.

10. Структурно-функциональные модификации лимфоцитов человека, индуцированные воздействием активных форм кислорода / О.В. Лидохова, М.С. Трубицына, В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегиональный сборник научных работ. - Воронеж, 2008. - Вып. 10. - С. 142-148. -

11. УФ-свет и активные формы кислорода как модуляторы структурно-функционального состояния лимфоцитов человека / М.А. Наквасина, ОВ. Лидохова. М.С. Трубицына, Л.И. Попова, В.Г. Артюхов, // Преобразование энергии света при фотосинтезе: тезисы докладов международной конференции 5-го съезда Российского фотобиологического общества, Пущино, 8-13 июня

2008. - Пущино, 2008. - С. 142.

12. Исследование механизмов апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного УФ-светом / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина, О.В. Лидохова, М.С. Трубицына // Преобразование энергии света при фотосинтезе: тезисы докладов международной конференции 5-го съезда Российского фотобиологического общества, Пущино, 8-13 июня 2008. - Пущино, 2008. - С. 159.

13. Лидохова О.В. Изменения уровня вторичных мессенджеров в лимфоцитах человека после воздействия УФ-света / М.А. Наквасина, OjL Лидохова, В.Г. Артюхов // Электромагнитные излучения в биологии (БИО-ЭМИ-2008): Труды 4-й международной научной конференции, Калуга, 21-23

октября 2008. - Калуга, 2008. - С. 216-222 .

14. Об индукции рецепторопосредованного пути реализации апоптоза в условиях генерации активных форм кислорода / М.А, Наквасина, ОВ. Лидохова, М.С. Трубицына, В.Г. Артюхов // Научные труды II съезда физиологов СНГ « Физиология и здоровье человека»: тезисы докладов, Кишинев, 29 - 31 октября, 2008. - Кишинев, Молдова. - 2008. - С. 39.

15. Вторичные мессенджеры - цАМФ, Са\ NO - модулируют функциональные свойства лимфоцитов человека в условиях их УФ-облучения / М.А. Наквасина, О.В. Лидохова, Л.И. Попова, М.С. Трубицына, В.Г. Артюхов //

Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - № 12. - С. 637641.

16. Механизмы реализации апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием УФ-света / М.С. Трубицына, О.В. Лидохова. М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов // Материалы VI Съезда Российского фотобиологического общества. Пос. Шепси, 15-22 сентября 2011. - Москва. - С. 140.

17. Пути реализации апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного УФ-светом и активными формами кислорода / В.Г. Артюхов, М.С. Трубицына, М.А. Наквасина, Е.В. Соловьева, О.В. Лидохова // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2011. - Т. 51, № 4. - С. 425-443.

18. Исследование роли ионов кальция в модификации структурно-функционального состояния лимфоцитов человека в условиях УФ-облучения / M.À. Наквасина, О.В. Лидохова. Я.Н. Жестовских, В.Г. Артюхов // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегиональный сборник научных работ. - Воронеж, 2012. - Вып. 14, С. 135-141.

19. Механизмы УФ-индуцированного апоптоза лимфоцитов человека / М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов, М.С. Трубицына, О.В. Лидохова // VI Международный конгресс «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 2-6 июля 2012. - Санкт-Петербург, 2012. - С. 238.

20. Механизмы апоптоза лимфоцитов человека в условиях воздействия УФ-света и активных форм кислорода / М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов, М.С. Трубицына, О.В. Лидохова // IV съезд биофизиков России, Нижний Новгород, 20-26 августа 2012: материалы докладов. - Н. Новгород, 2012. - С. 208.

21. Механизмы клеточной гибели и пути передачи информации в лимфоцитах человека в условиях воздействия физико-химических агентов / М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов, М.С. Трубицына, О.В. Лидохова // Международная научно-методическая конференция «Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы», Воронеж, ВГУ, 24-27 июня 2013. - Воронеж, 2013. - С. 61.

22. Пути реализации апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного пероксидом водорода / В. Г. Артюхов, М. С. Трубицына, М. А. Наквасина, О.В. Лидохова C.B. Рязанцев// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2013. - № 7. - С. 7-16.

23. Изменение уровня вторичных мессенджеров — Са2+ и NO - в лимфоцитах человека в условиях генерирования активных форм кислорода / М.А. Наквасина, О.В. Лидохова. В.Г. Артюхов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2013. - № 7. - С. 17-23.

Статьи № 5, 15, 17, 22, 23 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Подписано в печать 17.10.2013. Формат 60x84 1/16 . Бумага офисная. Усл. печ. л. 1,4 Тираж 100 экз. Заказ №2692

Отпечатано в типографии Воронежский ЦНТИ - филиал ФГБУ «РЭА» Минэнерго России 394036, г. Воронеж, пр. Революции, 30

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лидохова, Олеся Владимировна, Воронеж

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

На правах рукописи

04201365545 Лидохова Олеся Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ МОДУЛЯЦИИ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ УФ-СВЕТА И АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА: РОЛЬ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ, цАМФ и N0

Специальность 03.01.02 - Биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук, доцент М.А. Наквасина

Воронеж - 2013

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

1,8-АНС - 1-анилинонафталин-8-сульфонат

АФК - активные формы кислорода

ДАГ - диацилглицерол

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФ3 - инозитол-1,4,5-трифосфат

ПГЕ2 - простагландин Е2

ПОЛ - пероксидное окисление липидов

УФ-облучение - ультрафиолетовое облучение

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ФИФ2 - фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат

ФЛА2 - фосфолипаза А2

ФЛС - фосфолипаза С

[Са ]1 - цитоплазматический кальций

'02 - синглетный кислород

01 - супероксидный анион-радикал Н202 - пероксид водорода ОН' - гидроксильный радикал N0 - оксид азота

ИР-АТ - ядерный фактор активированных Т-клеток №-кВ - ядерный фактор кВ

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................12

1Л. Структурно-функциональные свойства лимфоцитов.........................12

1.2. Современные представления о механизмах передачи внешнего сигнала в клетку..........................................................................................19

1.2.1. Общая характеристика процессов передачи внешнего сигнала в клетку.........................................................................................19

1.2.2. Аденилатциклазный путь передачи информации в клетку................21

1.2.3. Фосфоинозитидный путь передачи сигнала в клетку.......................23

1.2.4. Са -транспортирующие системы клетки......................................25

1.2.5. Роль N0 в процессах трансдукции сигнала...................................29

1.2.6. Участие арахидоновой кислоты и продуктов ее метаболизма

в процессах передачи информации в клетку........................................33

1.2.7.Роль активных форм кислорода в процессах трансдукции

внешнего сигнала в клетку..............................................................35

1.3. УФ-индуцированные изменения структурно-функциональных

свойств лимфоцитов......................................................................43

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...................................................48

ГЛАВА 2. Объект и методы исследования............................................48

2.1. Объект исследования.................................................................48

2.2. Методы исследования...............................................................48

2.2.1. Выделение лимфоцитов из крови доноров....................................48

2.2.2. Определение жизнеспособности лимфоцитарных клеток.................48

2.2.3. Разделение лимфоцитов на Т- и В-популяции..............................49

2.2.4. Системы генерации активных форм кислорода..............................50

2.2.5. УФ-облучение исследуемых образцов........................................50

2.2.6. Определение концентрации кальция в цитплазме лимфоцитов..........51

2.2.7. Определение уровня цАМФ в цитозоле иммуноцитов.....................52

2.2.8. Определение уровня N02 в лимфоцитах......................................53

2.2.9. Исследование изменений структурного состояния лимфоцитарных мембран при помощи метода флуоресцентных зондов...........................55

2.2.10. Исследование люминолзависимой хемилюминесценции

лимфоцитов.................................................................................56

2+

2.2.11. Определение функциональной активности Са -АТФазы лимфоцитов.................................................................................58

2.2.12. Исследование апоптоза лимфоцитарных клеток человека с помощью проточной цитофлуориметрии.........................................................59

2.2.13. Статистическая обработка результатов экспериментов..................62

ГЛАВА 3. Исследование изменений уровня некоторых вторичных мессенджеров в лимфоцитарных клетках человека в условиях воздействия УФ-света....................................................................................63

3.1. Изменение уровня цАМФ в лимфоцитарных клетках человека после воздействия УФ-света....................................................................63

3.2. Изменение уровня цитозольного кальция в лимфоцитах человека после их УФ-облучения..........................................................................67

3.3. Изменение уровня оксида азота в лимфоцитах человека после воздействия УФ-света....................................................................76

3.4. Структурные модификации лимфоцитарных мембран после воздействия УФ-света.....................................................................................78

3.4.1. Исследование изменений структурного состояния лимфоцитарных мембран после воздействия УФ-света при помощи флуоресцентного зонда 1 -анилинонафталин 8-сульфоната.......................................................78

3.4.2. Исследование люминолзависимой хемилюминесценции лимфоцитов человека после УФ-облучения.........................................................81

3.4.3. Исследование изменений функциональной активности Са2+ -АТФазы лимфоцитов человека после воздействия УФ-света...............................83

ГЛАВА 4. Исследование изменений уровня некоторых вторичных мессенджеров в лимфоцитарных клетках человека в условиях воздействия

активных форм кислорода...............................................................86

4Л. Изменение уровня цитозольного кальция в лимфоцитарных клетках человека после воздействия активных форм кислорода..........................86

4.2. Изменение уровня оксида азота в лимфоцитах человека после воздействия активных форм кислорода..............................................95

4.3. Структурные модификации лимфоцитарных мембран после воздействия активных форм кислорода...............................................................97

4.3.1. Исследование изменений структурного состояния лимфоцитарных мембран после генерации активных форм кислорода при помощи флуоресцентного зонда 1-анилинонафталин 8-сульфоната......................97

4.3.2. Исследование люминолзависимой хемилюминесценции лимфоцитов человека после генерации активных форм кислорода............................99

4.3.3. Исследование изменений функциональной активности Са -АТФазы

лимфоцитов человека после воздействия активных форм кислорода.......101

ГЛАВА 5. Исследование изменений уровня кальция и структурного состояния мембран лимфоцитов в присутствии фосфолипазы А2 и простагландина Е2........................................................................103

5.1. Исследование изменений уровня кальция и структурного состояния мембран лимфоцитов человека в присутствии фосфолипазы А2...............103

5.1.1. Изменение уровня кальция в цитозоле лимфоцитов после их модификации фосфолипазой А2......................................................103

5.1.2. Исследование изменений интенсивности флуоресценции 1,8-АНС в комплексе с лимфоцитами, модифицированными фосфолипазой А2..........................................................................106

5.2. Исследование изменений уровня кальция и структурного состояния мембран лимфоцитов человека в присутствии простагландина Е2........................................................................108

5.2.1. Исследование изменений уровня кальция и функциональной

2+

активности Са -АТФазы лимфоцитов человека в условиях воздействия простагландина Е2.......................................................................108

5.2.2. Исследование люминолзависимой хемилюминесценции лимфоцитов

человека после воздействия простагландина Е2..................................112

ГЛАВА 6. Исследование роли экзогенного кальция в реализации клеточной гибели лимфоцитов, модифицированных воздействием физико-химических факторов..................................................................................114

6.1. Проточно-цитометрический анализ лимфоцитов, модифицированных воздействием УФ-света................................................................116

6.2. Проточно-цитометрический анализ лимфоцитов, модифицированных

воздействием активных форм кислорода..........................................122

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................129

ВЫВОДЫ.................................................................................134

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................137

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одной из центральных проблем биофизики клетки является изучение механизмов действия физико-химических агентов (УФ-света, ионизирующей радиации, активных форм кислорода) на структурно-функциональное состояние компонентов иммунной системы, являющихся основными элементами поддержания гомеостаза организма.

Накоплены обширные сведения о структурно-функциональных модификациях лимфоцитов человека и животных в условиях воздействия УФ-света и активных форм кислорода (И.Е. Ганелина, К.А. Самойлова, 1986; В.И. Карандашов, Е.Б. Петухов, 1997; A.A. Ярилин, 1999; I.A. Gamaley, I.V. Klyubin, 1999). Действие УФ-света и активных форм кислорода на лимфоциты человека проявляется в изменениях процессов их пролиферации и дифференцировки (Е.В. Волгарева и др., 1990; Е.В. Волгарева, 1991), клеточной цитотоксичности (Л.И. Попова, 2008), уровня экспрессии поверхностных рецепторов и антигенов (В.А. Крыленков, 1982; Е.В. Дмитриев, 2003; И.А. Колтаков, 2007; Л.И. Попова, 2008; О.В. Земченкова, 2012), активности ферментов (О.В. Земченкова, 2012), синтеза цитокинов (D. Kulms, Т. Schwarz, 2001; Е.А. Двурекова, 2005; И.Е. Савостина, 2005), интенсификации пероксидного фотоокисления липидов (Д.И. Рощупкин, 1993; Е.В. Дмитриев, 2003), усилении спонтанного и митогениндуцированного синтеза ДНК (Е.В. Волгарева, 1991), индукции апоптоза (H.A. Лонская, 1997; М.С. Трубицына, 2009). В реализации модифицирующих клеточных эффектов ультрафиолетового излучения и АФК могут участвовать сигналтрансдукторные системы (G.L. Schieven, J.A. Ledbetter, 1993; В.А. Ткачук, 2012), к числу которых относят системы регуляции внутриклеточного кальция, цАМФ, оксида азота. В то же время отсутствуют исчерпывающие данные о взаимосвязи структурно-функциональных модификаций лимфоцитов с изменением уровня внутриклеточных вторичных мессенджеров. Исследования, посвященные

изучению процессов модулирования уровня вторичных мессенджеров в лимфоцитах человека, не носят систематического характера. Требуют уточнения и детализации многие вопросы, касающиеся выявления роли экзогенного кальция в процессах функционирования иммуноцитов в условиях воздействия физико-химических факторов.

В этой связи исследование особенностей трансдукции внешнего сигнала в лимфоцитарные клетки позволит выяснить механизмы функционирования иммунокомпетентных клеток человека и разработать способы управления программами жизнедеятельности клеток в норме, при действии внешних факторов и в условиях патологии.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью работы явилось выявление роли отдельных сигнальных путей и вторичных посредников в процессах модуляции структурно-функциональных свойств лимфоцитов периферической крови доноров в условиях воздействия УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 4530 и 9060 Дж/м и активных форм кислорода (пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода).

Задачи работы предусматривали:

2+

1. Исследование изменений внутриклеточной концентрации Са в лимфоцитах после воздействия УФ-света и активных форм кислорода (АФК).

2. Исследование изменений уровня цАМФ в цитозоле интактных и УФ-облученных лимфоцитов человека.

3. Выявление возможной роли УФ-света и активных форм кислорода в активации индуцибельной КЮ-синтазы лимфоцитов и образовании в них МО-радикалов.

4. Исследование структурно-функциональных модификаций плазматических мембран лимфоцитов после УФ-облучения и генерации АФК.

5. Выяснение возможной роли экзогенного кальция в процессах гибели

лимфоцитов, индуцированной воздействием УФ-света и активных форм кислорода.

Научная новизна. Изучены изменения уровня вторичных мессенджеров - ионов кальция, цАМФ и оксида азота, в лимфоцитарных клетках человека в условиях воздействия УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 4530, 9060 Дж/м и активных форм кислорода (пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода). Установлено участие аденилатциклазного и фосфоинозитидного путей передачи сигнала в процессах модулирования структурно-функционального состояния лимфоцитов человека после воздействия УФ-света и АФК. Исследованы возможные механизмы изменений уровня цитозольного кальция в лимфоцитах, суспендированных в кальцийсодержащей и бескальциевой средах, индуцированных УФ-облучением и активными кислородными метаболитами.

Практическая значимость. Результаты данной работы расширяют современные представления о механизмах внутриклеточной передачи сигнала в иммунокомпетентных клетках после воздействия УФ-света и активных форм кислорода. Их необходимо учитывать при обсуждении вопросов, касающихся выявления молекулярно-клеточных механизмов лечебно-профилактического действия метода аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК).

Результаты работы используются в учебном процессе Воронежского государственного университета при проведении занятий по дисциплинам «Биофизика», «Биофизика мембран», «Физико-химические основы межклеточных взаимодействий», «Медицинская биохимия и биофизика», а также в ходе выполнения выпускных квалификационных работ студентами кафедры биофизики и биотехнологии.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 3-й Международной конференции ИНТЕРНАС-2007 «Актуальные проблемы современного естествознания» (Калуга, 2007); 15-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008); Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Беларусь, Минск, 2008); 5-ом съезде Российского фотобиологического общества, международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2008); 6-ом Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); II съезде физиологов СНГ (Кишинэу, Молдова, 2008); Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009); VI съезде Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, 2011); VI Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2012); IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012); Международной научно-методической конференции «Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы» (Воронеж, 2013); Научных отчетных конференциях преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2009, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 статей и 12 тезисов, в том числе 5 статей в журналах из «Перечня ВАК РФ».

На защиту выносятся следующие положения: 1. Воздействие УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 4530 и 9060 Дж/м и активных форм кислорода (пероксида водорода, гидроксильного

радикала, синглетного кислорода) на лимфоциты человека индуцирует

2+

изменения уровня внутриклеточных мессенджеров - Са , цАМФ, N0.

2. В процессы модулирования уровня цитозольного кальция в лимфоцитах человека после воздействия УФ-света и АФК вносят вклад Са2+-депо клетки, Са2+-каналы и Са2+-АТФаза плазматических мембран, нарушения структурного состояния лимфоцитарных мембран вследствие интенсификации свободнорадикальных процессов.

3. Экзогенный кальций в среде суспендирования лимфоцитов в условиях

их УФ-облучения и воздействия АФК определяет направленность изменений

2+

уровня внутриклеточного кальция, активности Са -АТФазы, структурного состояния плазматических мембран и процессы гибели исследуемых клеток.

4. Схема процессов взаимодействия компонентов отдельных сигналтрансдукторных систем лимфоцитов в условиях их УФ-облучения.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 162 страницы машинописного текста, 2 таблицы, 35 рисунков. Состоит из «Введения», 6 глав, «Заключения», «Выводов». Список литературы содержит 247 источников, из них 136 - отечественных и 111 - зарубежных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Структурно-функциональные свойства лимфоцитов человека

Иммунная система обеспечивает защиту организма от инфекций, а также удаление поврежденных, состарившихся и генетически измененных клеток и молекул собственного организма. Она является одной из самых уникальных систем организма, обладающих свойствами саморегуляции, самоуправления и связанных с другими системами и органами.

Лимфоциты - иммунокомпетентные клетки, характеризующиеся уникальными свойствами: высокой изменчивостью, деформируемостью, инвазивностыо и способностью к рециркуляции, обеспечивающими возможность иммунологического надзора, распознавания и координацию работы лимфоидных органов. В то же время, лимфоциты, будучи мигрирующими клетками, способны отражать изменения, происходящие в организме (Б.Д. Брондз, О.В. Рохлин, 1978; М.В. Робинсон и др., 1986).

Лимфоциты развиваются из недифференцированных стволовых кроветворных клеток, которые находятся в кроветворных тканях - в печени (у плода) и в костном мозге (у взрослых) (O.K. Гаврилов и др., 1995). Дифференцировка лимфоцитов (иммунопоэз) происходит последовательно. В центральных органах иммунной системы осуществляется первичная, антигеннезависимая (в отсутствие антигена), дифференцировка так называемых нулевых лимфоцитов с превращением их в Т-лимфоциты (в тимусе) и В-лимфоциты (в костном мозге млекопитающих и в фаб�