Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы модуляции эффекта антидиуретического гормона в осморегулирующем эпителии

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы модуляции эффекта антидиуретического гормона в осморегулирующем эпителии"

-ТА

• ; российская академия наук

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

ПАРНОВА Римма Германовна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ МОДУЛЯЦИИ ЭФФЕКТА АНТИДИУРЕТИЧЕСКОГО ГОРМОНА В ОСМОРЕГУЛИРУЮЩЕМ ЭПИТЕЛИИ

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.13 ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена в лаборатории физиологии почки и водно-солевого обмена Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Научный консультант — академик Ю. В. НАТОЧИН

Официальные оппоненты: член-корр. РАН, профессор Л. Н. ИВАНОВА член-корр. РАМН, профессор В. А. ТКАЧУК доктор биол. наук. II. Ф. АВРОВА

Ведущее учреждение—Институт цитологии РАН.

Защита состоится 16 января 1997 года в « ¿0 » часов на заседании специализированного совега Д002.89.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М, Сеченова РАН.

Адрес Института: 194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭФиБ им. И. М.Сеченова РАН.

Автореферат разослан 15 декабря 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета/

докт. биол. наук, проф. /^ МАСЛОВА

Введение

Актуальность проблемы. Необходимым условием существования всех живых существ является обеспечение водно-солевого гомсостаза. Его основными параметрами, на которые направлена физиологическая регуляция, являются обеспечение постоянства концентрации ионов, осмотического давления и объемов жидкостей внутренней среды (Smith, 1959; Гинецинский, 1963,- Наточим, 1983). У наземных позвоночных особенно остро стоит проблема сохранения воды в организме, для решения которой в процессе эволюции возникли механизмы точного контроля количества реабеорбируемой воды и способности к осмотическому концентрированию выводимой жидкости, У всех наземных позвоночных регуляции процесса реабсорбции воды осуществляется в почке, а у наземных амфибий эту функцию выполняют также кожа и мочевой пузырь.

Возможность регуляции реабсорбции и способность к осмотическому концентрированию выводимой жидкости обусловлена наличием барьеров для движения осмотически свободной воды и выработкой гормонов, регулирующих проницаемость этих барьеров. Таким барьером является специализированный плотный эпителий, присутствующий в дистальпых отделах пефрона наземных позвоночных, в коже и мочевом пузыре амфибий, и характеризующийся чрезвычайно низким уровнем осмотической проницаемости. Транспорт воды в этих эпителиях регулируется измеиением свойств апикальной мембраны клеток, которые обеспечивают осмотическую проницаемость или непроницаемость эпителия. Регуляция транспорта воды по осмотическому градиенту в осморегулирующих органах осуществляется антидиуретическим гормоном, представленным у млекопитающим аргинин-вазопрессином (АВП)1, а у остальных позвоночных - аргинин-вазотоцином.

Изменения свойств апикальной мембраны при действии АДГ, которые приводят к увеличению ее осмотической проницаемости, являются результатом действия сложного многокомпонентного каскада молекулярных событий, начинающихся со взаимодействия гормона с различным)! типами рецепторов на базола-тералыюй мембране клетки, накоплением цАМФ и заканчивающиеся встраиванием Структур, содержащих водные каналы, в апикальную мембрану (см. Иванова, Наточин, 1987; Abramow et al., 1987; Bourguet et al., 1989; Scorecki et al., 1992). Многие основополагающие открытия в механизме действия АДГ, такие как выявление роли цАМФ (Orloff & Handler, 1962), обнаружение в апикальной мембране внутримембранных агрегатов частиц (Chevalier et al., 1974), были выполнены па изолированном мочевом пузыре амфибий - замечательной экспериментальной

1 Сокращения, употребляемые в тексте: АВП - аргинин-вазопрессин, АДГ - антидиуретический гормон, АК - арахидоновая кислота, БСА - бычий сывороточный альбумин, ВМЧ - внутримембранные частицы, ДАГ - диацилглицерин, ДМСО - диметилсульфоксид, ИБМК - З-изобутил-1-метилксантин, ИТФ - инозиг-трифосфат, КТ - коклюшный токсин, ПГЕ2 - простагландин Ег, ПКС - протеинкиназа С, СЖК - свободные жирные кислоты, ТСХ - тонкослойная хроматография, ФИ - фосфатидплинозит, ФИФ - фосфа-тидилинозит-4-фосфат, ФИФг - фосфатидилинозит-4,5-дифосфат, ФЛАг - фосфолилаза А2, ФМА - форбол-12-миристат, 13-ацетат, ФС - фосфатидисерин, ФХ - фосфатидилхо-лин, ФЭА - фосфатидилэтаноламин.

модели осморегулирующего эпителия. Принципиальное сходство молекулярной и структурной организации реализации эффекта АДГ в гранулярных клетках мочевого пузыря амфибий и основных клетках собирательных трубок почки млекопитающих, значительно более труднодоступных для исследований, обеспечило этому объекту успех и популярность в изучении процессов транспорта воды и ионов.

В любой клетке основными событиями преобразования внеклеточного сигнала являются изменение свойств протеинкиназ, уровня свободного [Са2+| и экспрессии генов. Однако, количественный эффект реализации действия гормонов связан с активацией системы огромного числа внутриклеточных модуляторов, локально и обратимо изменяющих передачу наружного сигнала. Как правило, регуляция наиболее важных физиологических параметров контролируется по крайней мере двумя системными факторами, например, уровень глюкозы - инсулином н глюкаго-ном, баланс кальция - кальцитонином, паратгормоном и активными формами витамина D3 , натрия - альдостероиом и натрийуретическим фактором и т.д. Поскольку АДГ является единственным гормоном, способным увеличивать осмотическую проницаемость осморегулирующего эпителия, и, по-видимому, отсутствует гормон противоположного эффекта - диуретический, потребность в точной регуляции количества рсабсорбируемой воды создает необходимость в механизмах модуляции гормонального сигнала, локализованных в самой клетке-мишени. В основе этих механизмов лежит перекрестное влияние и взаимодействие систем вторичных посредников и их эффекторов, которое обеспечивает как тонкую регуляцию эффекта самого АДГ, так и модулирующее действие других биологически активных веществ (стероидов, простагландипов, катехоламииов и др.).

В последние годы была получена детальная информация о тонкой химической структуре начальных и конечных звеньев развития гидроосмотической реакции -были клонированы рецепторы АВП и белки, образующие водные каналы (Morel et al., 1992', Birntaetner et al., 1992; Agre -et -al., 1993). Однако, несмотря на ошеломляющие успехи молекулярной биологии, прекративших многолетние дискуссии о природе транспорта воды, сложность физиологической регуляции на уровне клетки определяется всем тем каскадом взаимосвязанных молекулярных событий, которые происходят между "входом" и "выходом" сигнала. Наглядным подтверждением этому служит огромная индивидуальная вариабельность, обнаруживаемая в экспериментах на изолированных осморегулирукмцих органах, при которой на одну и ту же дозу АДГ реакция может отличаться в десятки раз, следовательно, сама тслстка, транспортирующая воду, заключает в себе те свойства, которые определяют ее функциональную реакцию на гормон.

Для того, чтобы попять, какие молекулярные механизмы лежат в основе модуляции гормонального сигнала на уровне клетки, необходимо исследовать системы различных вторичных посредников в передаче внешнего сигнала, понять их функциональную роль и механизмы перекрестного влияния, выявить внутриклеточные и аутокринные регуляторы, от которых зависит количественная реализация эффекта гормона. Исследование этих вопросов, которому посвящена настоящая работа, представляется необходимым в связи с важнейшей ролью процесса реабсорбции воды и его регуляции в обеспечении водно-солевого гомеостаза, и огромным функциональным значением молекулярных механизмов модуляции сигнала в осморегулирующем эпителии, от которых зависит реализации функционального эффекта гормона.

Цель и задачи неследования. Целью данной работы послужило исследование молекулярных механизмов модуляции эффекта антидиуретического гормона в регуляции транспорта воды в изолированном мочевом пузыре лягушки Rana temporaria L. Основное внимание было сосредоточено на изучении системы вторичных посредников, и их функциональной роли в реализации эффекта антидиуретического гормона, поиску внутриклеточных и ауто- , паракринных регуляторов действия гормона. Соответственно, были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать возможность участия Са2+ /фосфоинозитвдной системы передачи сигнала и выявить ее функциональную роль в механизме действия АДГ на увеличение осмотической проницаемости.

2. Исследовать роль свободных жирных кислот как модуляторов годроосмотиче-ского действия АДГ , выявить возможные способы осуществления этой модуляции и ее локализацию, а также источники и механизмы высвобождения свободных жирных кислот.

3. В связи с обнаруженным нами феноменом увеличения осмотической проницаемости в отсутствии АДГ, выявить молекулярные механизмы его осуществления и исследовать роль аутакоидов в регуляции проницаемости эпителия мочевого пузыря лягушки.

Научная новизна работы. Впервые была показана активация гидролиза фосфатиди-линозит-4,5-дифосфата, образования инозитгрисфосфата, 1,2-днацнлглицерина и высвобождения свободной арахидоновой кислоты при стимуляции АДГ осморегу-лирующего эпителия. Использование специфических антагонистов вазопрессино-вых рецепторов и применение ингибиторов фосфоинозитид-специфичнон фосфоли-пазы С показало, что образующиеся молекулы выполняют функцию негативных модуляторов осмотической проницаемости, действие которых локализуется, главным образом, на этапах, предшествующих образованию цАМФ. С действием фосфоинозитвдной системы передачи сигнала в значительно степени связана наблюдаемая при действии АДГ активация биосинтеза простаглапдппа Е. Выявлено, что свободная арахидоновой кислоты, повышение уровня которой происходит при действии АДГ, происходит главным образом, из фосфатидилэтаноламин и 1,2-диацилглицерина, что является результатом активации фосфолипазы Аз и фосфо-липазы С/ДАГ-липазы, соответствеино. Впервые показано, что арахидоновая кислота является не только предшественником биосинтеза простагландинов, по и обладает функциональными эффектами как самостоятельный модулятор действия АДГ, помимо этого, выявлено действие жирных кислот иной структуры.

Впервые обнаружен факт повышения осмотической проницаемости эпителия изолированного мочевого пузыря лягушки в отсутствии нейрогнпофизарного контроля в условиях смены серозного раствора Рянгера. Показано, что рост водной проницаемости в этом случае обусловлен теми же молекулярными механизмами, что и при действии АДГ - активацией аденилатциклазы, накоплением цАМФ и появлением в апикальной мембране агрегатов внутримембранных частиц. В работе представлены доказательства, что в отсутствии гормона свойства эпителия в отношении его осмотической проницаемости зависят от уровня синтеза и секреции нростаглаидина Ег.

Практическое значение работы. Использование в качестве объекта мочевого пузыря лягушки позволяет экстраполировать полученные данные иа проблему

молекулярных механизмов осморегуляции в диетальных отделах нефрона почки человека. Одним из наиболее частых и тяжелых поражений функции почки является нарушение осмотического концентрирования мочи. Известно, что в основе этой патологии лежат процессы нарушения молекулярного действия антидиуретического гормона на разных этапах его реализации. Полученные результаты, касающиеся различной роли систем вторичных посредников в функциональном эффекте вазо-прессина, и выявление модуляторов его действия дают возможность поиска новых подходов в изучении патологии почки и способов коррекции наблюдаемых нарушений. Данные о различной роли полиненасыщенных жирных кислот в реализации антидиуретического эффекта вазопрессина являются перспективными с точки зрения влияния липидных диет с различным жирнокислотным составом на водно-солевой обмен у человека.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Всесоюзной конференции "Механизмы действия гормонов" (Суздаль, 1989), VIII Всесоюзной конференции по физиологии почки и водно-солевого обмена (Харьков, 1989), заседании Ленинградского общества физиологов, биохимиков и фармакологов им.И.М.Сеченова (Ленинград, 1990), Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов" (Москва, 1990), на сателлитном симпозиуме 11-го Межд. конгресса нефрологов "Тубуло-интерстициальные расстройства" (Иркутск, 1990), Международном конгрессе по патофизиологии (Москва, 1991), Собрании физиологического общества Бельгии (Гент, Бельгия, 1990), 7-ом Европейском коллоквиуме по физиологии почки (Неаполь, Италия, 1992), Европейском почечном форуме (Эрлаиген, Германия, 1994), Совещании стран СНГ по внутриклеточной сигнализации (Звенигород, 1993), VI Симпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 1994), Симпозиуме "Физиология почки и водно-солевого обмена", посвященного 100-летию со дня рожд.А.Г.Гинецинского (Новосибирск, 1995), заседании Отдела молекулярных основ эволюции функций ИЭФиБ им.И.М.Сеченова (Санкт-Петербург, 1996).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на /20 страницах, содержит 39 рисунков, 7 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования и результаты), обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, который включает в себя ZÍ6 литературных источников.

Материалы и методы исследования

В работе использовали самцов травяной лягушки Rana temporaria L., которых отлавливали в естественных местах обитания в период с октября по март и содержали в виварии в ваннах, дно которых заполняли водой, при t" +6-8° С. Эксперименты проводили на изолированных парных мочевых пузырях, помещенных в раствор Рингера следующего состава (в мМ): NaCl, 111; CaCh ,0.8; КС1, 3.4; NaHCOî 2.4; глюкоза, 5.5 (рН 8.0 в условиях активной аэрации, осмоляльность 220 мосм/кг НгО), и заполненных гипоосмотическим (1:10) раствором того же состава (Наточин, 1963). Измерение потока воды по осмотическому градиенту проводили гравиметрически (Bentley, 1958).

Определения количества цАМФ в стенке мочевого пузыря ткань проводили с помощью радиоиммунного набора Cyclic AMP [ -'Н| assay system (Amersham). Активность адсиилатциклазы юмеряли во фракции изолированных плазматических мембран согласно модифицированному методу (Salomon et al., 1974)2. Реакцию АДФ-рибозилнрования проводили в 200 мкл буфера 50 мМ Tris/HCI (рН 7.8), содержащем 2 мМ MgCh, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТТ, 0.1 мМ НАД, 1 иМ НАДФ, 0.1 мМ ГТФ, 1 мМ АТФ, 10 мМ тнмидина в течение 45 мин при t 28"С в присутствии или отсутствии 10 мкг/мл коклюшного токсина. Реакцию начинали добавлением суспензии мембран (200 мкг белка). КТ активировали в присутствии ДТТ и АТФ в течение 15 мин при t 37° С.

Включение радиоактивных предшественников в фосфоинозитиды проводили в процессе 1-часовой инкубации изолированных мочевых пузырей в растворе Рингера с 200 цСл/мл иио-|2-3Н|-инозита (Amersham) или 10 цСУмл I11!'! К1Ь POj (в/о"Изотоп'\ Санкт-Петербург) при комнатной t". Включение рН]-арахидоновой кислоты (Институт изотопов, Венгрия) проводили, инкубируя выделенные пузыри 1 час в темноте в аэрируемом растворе Рингера, содержащем 0.05% БСА и 2.5 цкО/мл изотопа. Липиды экстрагировали смесью хлороформ-метанола 2-1 (v/v) и промывали 0,75% КС1 (Folch-Pi et al., 1957). Экстракцию ФИФ и ФИФ2 проводили смесью хлороформ-метанол-НС1 конц. (200-100-1, v/v).

Экстрагированные фосфолипиды разделяли на классы двумерной ТСХ на силикагеле КСК 20-40 микрон (Воскресенский химкомбинат) в системах растворителей: в 1-ом направлении - хлороформ-метанол-28% аммиак (65-25-5, по объему), во 2-ом - хлороформ-ацетон-метанол-уксусная кислота-вода (50-20-10-10-5, по объему) (Rouser et al., 1966). Пятна фосфолипидов проявляли в УФ свете после опрыскивания 0.04% спиртовым раствором 2'-7'-дихлорфлуоресцеина. Для исследования метаболизма фосфолипидов, меченых |311|-ЛК, использовали двумерную микроТСХ (Svetashev, Vaskovsky, 1972), 1,2-ДАГ и СЖК получали ТСХ в системе гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (55-19-1.5, по объему).

Экстракт, содержащий смесь |33Р1-меченых ФИ, ФИФ и ФИФг, разделяли одномерной микроТСХ в системе растворителей н-пропанол-4 н аммиак (2-1, по объему) на пластинках 6 х 6 см с силикагелем КСК (4-5 микрон) или на алюминиевой фольге DC-AltirolIe Kieselgel 60 (Merck), предварительно mirrротированных 1% оксалатом калия. В качестве стандартов использовали инозит-содержащие фосфолипиды, выделенные и очищенные нами из мозга крысы (Шрагин и др., 1988).

Разделение (3Н|-шюзитфосфатов проводили методом анионо-обмеиной хроматографии (Berridge, 1983); абсолютное содержание инозит-1,4,5-трисфосфата определяли радиоиммунным методом с по мощью набора D-myo-inositoI 1,4,5-trisphosphate j 3Н| assay system (Amersham).

Метиловые эфиры жирных кислот ФХ, ФЭА, ФС , ФИ и 1,2-ДАГ получали 1-часовым метанолизом в смеси хлороформ-0.21 н метилат натрия (2-1, по объему). Метиловые эфиры СЖК получали в процессе кислого метилирования. Для этого слой силикагеля, содержащий СЖК, обрабатывали в течение ночи в запаянных стеклянных ампулах 1-2 мл 6% НС1 на метаноле при температуре 80° С. Газожидкостную хроматографию метиловых эфиров жирных кислот проводили па

: Эта часть работы проведена совместно с канд.биол.наук С.А.Плесневой

хроматографе PYE-104 (24) (Англия) с пламенно-ионизационным детектором 3 . Колонка имела полярную фазу - 15% диэтиленгликольсукцннат полиэфир (ФРГ) на хромосорбе W с размером частиц 80-100 меш. Газом-носителем служил аргон, скорость подачи газа составляла 50 мл/мин, 200° С. Количественный состав жирных кислот определяли сравнением площадей пика соответствующей кислоты и внутреннего стандарта, в качестве которого использовался но пол.

Содержание ПГЕ (или £2 в ряде опытов) определяли в серозном растворе или гомогснате ткани в фосфатном буфере (0.01 М фосфата, 0.15 М NaCl, pH 7.4), предварительно экстрагируя ПГЕ 3 объемами смеси этилацетат-изопропанол-0.2 н HCl (3-3-1, по объему). Уровень суммарных ПГЕ измеряли с помощью радиоиммунного набора фирмы Dade (Baxter Travenol Diagnostics, США), а ПГЕ2 аналогичными наборами фирмы Amcrsham (Prostaglandin Ei [125I] scintillation proximity assay system). Разделение ПГЕг и AK проводили ТСХ этилацетатного экстракта серозного раствора на пластинках Kieselgel 60 (Merck). Использовали систему растворителей, которую получали как верхнюю фазу при смешивании этилацетата, уксусной кислоты, 2,2,4-триметилпентана и воды (11-2-5-10, по обьему) (Herman et al., 1981).

Содержание белка в ткани определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951) или Бредфорд (Bradford, 1976). Определение липидиого фосфора в высушенных аликвотах липидиого экстракта проводили спектрофотометрически (Böttcher et al., 1961). Результаты измерений во всех экспериментах выражали как среднее значение ± среднеквадратичная ошибка; для нахождения достоверности различий использовали парный и непарный методы построения доверительных интервалов Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Роль различных систем вторичных посредников в механизме гидроосмотического эффекта аргинин-вазопрессина

Как известно, цАМФ является триггером гидроосмотической реакции, обеспечивающим встраивание водных каналов в апикальную мембрану клетки, что и приводит к резкому усилению транспорта воды по осмотическому градиенту при действии АДГ (Ог1оИ М а1,, 1965). Для установления того, на каком этапе реализации эффекта АДГ возможно осуществление модуляции гормонального сигнала, при действии одной и той же дозы АВП было определено количественное соотношение между содержанием цАМФ в ткани, количеством ультраструктурных эквивалентов повышенной водной проницаемости и самим уровнем осмотической проницаемости. Оказалось, что величина потока воды по осмотическому градиенту в присутствии гормона прямо коррелирует с величиной уровня цАМФ, а анализ количества агрегатов ВМЧ, выявляемых на апикальной мембране при электронно-микроскопическом исследовании методом замораживания-скалывания4, выявил прямую количественную корреляцию с концентрацией цАМФ (ркс.1, А, Б). Таким

3 Автор выражает благодарность канд. биол. наук С.А.Забелинскому за предоставленную возможность работы на газо-жидкостном хроматографе.

4 Эта часть работы проведена совместно с канд.биол.наук В.И.Романовым (Институт цитологии РАН)

обнаружение прямой количественной зависимости при действии гормона: цАМФ -»количество агрегатов частиц-» гидроосмотический эффект свидетельствует о том, что величина развиваемой гидроосмотической реакции определяется уровнем цАМФ, следовательно, модулирующие эффекты должны быть локализованы на этапах, ответственных за его образование или разрушение. Поскольку активность ФДЭ цАМФ достоверно не изменяется при действии АВП (№а(осЫп е! а!., 1989), очевидно, что аденилатциклаза является тем ключевым ферментом в регуляции осмотической проницаемости, на которой сходятся различные модулирующие влияния систем передачи гормонального сигнала.

Н30 (мкл/мии см-) площадь агрегатов ВМЧ

Рис. 1. А. Корреляция между величиной осмотической проницаемости (мкл/см2 мин) и содержанием цАМФ (пмоль/мг белка) в ткани мочевого пузыря при действии 12 пМ АВП. Б. Корреляция между содержанием цАМФ (пмоль/мг белка) и площадью поверхности апикальной мембраны, запятой агрегатами ВМЧ (%) при действии 12 нМ АВП.Темные кружки - в присутствии осмотического градиента, светлые - без него.

Через 20 сек после добавления 4 нМ АВП в эпителии мочевого пузыря лягушки наблюдается усиление распада рР)-ФИФг, увеличивается уровень |3Н|-инозиттрифосфата и 1,2-ДАГа, меченого [ 3Н|-АК (рис.2, А, Б, В). Наблюдаемые синхронные изменеиия указывают на то, что в ткани мочевого пузыря лягушки при действии АВП активируется фосфоииозитидная система передачи сигнала, связанная с активацией фосфолипазы С. Согласно общепринятым представлениям, ИТФ в клетке усиливает мобилизацию внутриклеточного Са2+ (Berridge, 1984), а 1,2-ДАГ является мощным эндогенным активатором протеинкиназы С (Nishizuka, 1986). Временные и количественные зависимости высвобождающихся посредников оказались подобными другим типам клеток, в которых осуществляется передача сигнала через Vi-рецепторы (Pfeilschifter étal-, 1984; Thomas et al., 1984).

Для выяснения возможной роли этой сигнальной системы в реализации эффекта АВП нами были использованы два подхода: (1) блокирование фосфолипазы С неомнципои и (2) использование специфических аитагонистов Vi -рецепторов, с которыми связана активация фосфоинозитидиого ответа в тех

Время (сек ) Время (сек)

10 16 Время ( сек)

-л- глицерофосфоинозит

инозитмонофосфат -а- инозитдифосфат -V- инозиттрифосфат

Рис.2.Изменения уровня /3 Ч'/<1>11<1>2 (А), (3Н]1,2-ДАГ(Б) и [41 ¡ииозитфосфатов и (В) и через 20, 40 и 60 сек после добавления 4 пМ АВП. Уровень радиоактивности этих веществ в контроле принят за 1. Результаты - среднее ±т (п =4-6).

клетках, где он обнаружен. Предварительная проверка показала, что 30-мииутная прсдинкубация мочевых пузырей с 10 мкМ неомицина действительно полностью блокирует АВП-стимулированиое накопление ИТФ и усиление гидролиза ФИФг . В присутствии. 10-100 мкМ неомицина наблюдается усиление гидроосмотического действия АВП более чем на 30% (р < 0.05) по сравнению с контролем, где действовал только АВП. Таким образом, блокада фосфоинозитидного ответа приводит к усилению действия АВП.

Использованный нами специфический антагонист VI рецепторов млекопитающих - |1-(Р-меркапто-3,[3-циклопентаметиле1шропионовая кислота), 2-1)-фенилаланин, 7-саркозин,8-аргииин)-вазопрессин - сам по себе не влиял на базаль-ный уровень водной проницаемости. При применении высоких доз антагониста (от 10 до 1000 нМ) наблюдалось иигнбирование гид роосмотичес кого эффекта 5 нМ АВП (рис. 3), что можно объяснить частичным вытеснением АВП при неспецифи-

ческой взаимодействии антагониста с рецензорами типа \г • Более низкие концентрации (от 0.5 до 5 нМ), при которых агонист взаимодействует преимущественно с \'!-гипом рецепторов, достоверно стимулировали действие АВП. Эти данные свидетельствуют о том, что фосфоинозитидная система передачи сигнала, запускаемая АВП наряду с активацией процесса синтеза цАМФ, выступает в роли механизма, обеспечивающего негативную модуляцию гормонального эффекта.

Данные о динамике образования вторичных посредников показывают, что активация системы негативной модуляции начинается задолго до того, как содержание цАМФ достигнет максимума. В этом случае можно полагать, что, в отличие от запускания торможения по принципу обратной связи, включение модулирующих механизмов не зависит от величины развивающейся гндроосмотической реакции, а регулируется концентрацией АДГ. Так, быстрое высвобождение [Са2+| в клетках собирательных трубок кролика вызывалось только высокими концентрациями АВП (23 нМ), при которых уровень функциональной реакции был ниже, чем при действии меньших доз гормона (230 рМ) (Вгеуег, 1991).

А-

Рис.3. Влияние V/ -антагониста на гидроослютический эффект 5 иМ АВП. По оси абсцисс - концентрация антагониста, по оси ординат - разница в абсолютных значения между потоком воды, стимулируемым Л ВП в присутствии или отсутствии антагониста.

Пути осуществления негативной модуляции действия АВП

Взаимосвязь активации фосфоинозитидной сигнальной системы и изменения уровня простагландина Е . Поскольку хорошо известно, что негативным модулирующим эффектом на гидроосмотическое действие АВП обладают ПГЕ (Orloff et al., 1965; Handler, 1981) синтез которых усиливается в присутствии гормона (Zusman et al., 1978; Burch et al., 1980), нами было проверено предположение о возможной взаимосвязи активации фосфоинозитидной сигнальной системы и биосинтеза ПГЕ. Для этого было проведено измерение уровня ПГЕ (суммарно Е i и Ег ) в ткани мочевого пузыря и окружающем серозном растворе при действии АВП в присутствии Ю-5 М неомицина, блокирующего на нашей модели фосфоинозитидный ответ.

Табл. I. Влияние неомицина на стимуляцию аргинии-вазопрессипом синтеза ПГЕ в ткани .мочевого пузыря и окружающем серозном растворе (п=8-12).

ПГЕ (пкмоль/мг белка мин)

Опыт ткань пузыря серозный раствор*

Контроль 4.83 ± 0.49 3.78 + 0.82

Неомицин(10-5 М) • 4.79 ± 0.93

АВП (4 нМ, 5 мин) 4.78 ± 0.41 13.72 ± 2.50 -v.

р<0.05

Неомицнн + АВП 3.88 ± 0.63 8.59 ± 0.93

Содержание ПГЕ в серозном растворе рассчитывалось на количество белка ткани пузырей, инкубируе.чых в данном растворе.

АВП вызывает значительное (в 3.5 раза) увеличение концентрации ПГЕ в серозном растворе, тогда как в стенке мочевого пузыря достоверных изменений не обнаружено (табл.1). Прединкубация мочевых пузырей в Ю-5 М неомицина в течение

30 мин слабо повышает уровень ПГЕ в серозном растворе (различия недостоверны), однако, значительно (на 55%) ингибирует эффект гормона на биосинтез или высвобождение ПГЕ. Таким образом, в условиях блокады фосфоинозитидного ответа неомицином резко снижается уровень накопления ПГЕ , стимулированного АВП. Это свидетельствует о том, что одним из механизмов осуществления негативной модуляции при активации фосфоинозитидной сигнальной системы в мочевом пузыре лягушки является усиление биосинтеза и секреции ПГЕ.

Роль прогеинкиназы С в модуляции гидроосмотического эффекта АВП. Известно, что в изолированном мочевом пузыре жабы Bufo marinus классические активаторы протеиикиназы С - форболовые эфиры - угнетают действие АВП, на основании чего считается, что ПКС негативно модулирует действие АВП (Schlondorff, Levine, 1985; Yorio et al., 1985). Мы проверили эффект форболовых эфиров на нашей модели,

прединкубируя мочевые пузыри в течение 30 мин в растворе Рингера, содержащем 1 мкМ ФМА. Этот агент слабо увеличивал базальный поток воды, но резко тормозил гидроосмотический эффект 10 пМ АВП (рис. 4, А). Аналогичным эффектом обладал ФМА на водный поток, вызванный добавлением 1 мМ цАМФ и 50 мкМ ИБМК (рис.4, Б).

ФМА АВП

Z5 SO TS

Время (мин)

Время (мин)

Время (мин)

Рис.4. А.Эффект 1 мкМ ФМА на гидроосмотическое действие 10 нМ АВП; Б. Эффект 1 мкМ ФМА на поток воды, стимулированный 1мМ цАМФ + 50 мкМ ИБМК; В. Влияние 10 мкМ сангивамицина, добавленного с серозной стороны, на гидроосмотический эффект 10 нМ АВП; Г - эффект 10 мкМ сангивамицина на поток воды, стимулированный 1мМ цАМФ + 50 мкМ ИБМК, через 15 я 30 минут после добавления ИБМК (прозрачные столбика - в отсутствии, а заштрихованные в присутствии сангивамицина). Пунктирные линии - обработка форболовъм эфиром или сангыва. миципом. Результаты являются средним значением ±т (п - Н -10).

В качестве специфического ингибитора ПКС мы использовали антибиотик сангивамицин (Loomis, Bell, 1988), добавляя его с серозной стороны в концентрациях

1-100 мкМ. Не влияя на базальный поток воды, ингибитор дозо-зависимо стимулировал гидроосмотическое действие Л IUI (рис. 4, В). Сангивамицин не влиял на величину транспорта воды, стимулированного цАМФ в присутствии ИБМК (рис.4, Г), и был неэффективен при его добавлении с мукозной стороны. Форболовый эфир, напротив, ингибировал действие не только АВП, но и цАМФ.

Эти факты убедительно свидетельствуют о том, что в мочевом пузыре лягушки активация ПКС является одним нз наиболее важных механизмов модуляции эффекта АДГ. Можно предположить существование в гранулярной клетке эпителия различных пулов Г1КС, модулирующих гидроосмотическое действие гормона. Первый из них осуществляет негативную модуляцию эффекта АДГ на этапах, предшествующих образованию цАМФ - он является мишенью действия и форболо-вых эфиров и сангивамицина и связан с плазматической мембраной. Имеющиеся в литературе данные по действию ПКС в клетках собирательных трубок внутреннего мозгового вещества почки крысы позволяют предположить, что ПКС может ингибировать активность аденилатциклазы, фосфорилируя а-субъединицу Gi-белка (Teitelbaum, 1993) или каталитическую субъединицу аденилатциклазы (Dixon et al., 1988). Второй пул ПКС модулирует эффект АДГ на этапах дистальиее образования цАМФ ((например, выступая конкурентом цАМФ-зависимого фосфорилирования) и не связан с базолатералышй плазматической мембраной; этот пул обнаруживается действием форболовых эфиров на поток, стимулированный цАМФ. Для действия сангивамицина этот пул фермента является, вероятно, малодоступным из-за слабого прохождения сангивамицина в цитоплазму.

Влияние вазонрессина на уровень свободных жирных кислот в ткани мочевого пузыря. Через 10 мин после добавления 23 нМ АВП в ткани мочевого пузыря наблюдается увеличение содержания арахидоновой, арахиновой и стеариновой кислот, а также некоторое снижение количества эйкозатетраеновой кислоты (табл.2). Уровень АК увеличивался почти в 2 раза - с 18.6 до 33.3 нг/мг белка.

Усиление выхода АК в окружающий серозный раствор при действии АВП было продемонстирировано также в экспериментах с предварительным включением [ 3Hj-AK в ткань мочевого пузыря. Уже через 5 мин после добавления гормона наблюдается стимуляция выхода 13П|-АК в окружающий раствор, скорость которого продолжает нарастать примерно до 30-й минуты и далее существенно не изменяется.

Источники высвобождения свободной арахидоновой кислоты при действии аргинин-вазопрессина. Исследование жирнокнелотного состава основных в количественном отношении фосфолипидов мочевого пузыря лягушки - ФЭА, ФХ,ФС, ФИ, а также 1,2-ДАГ в контроле и при действии в течении 10 мин 23 иМ АВП выявило достоверное уменьшение уровня АК при действии гормона в ФЭА и 1,2-ДАГ (табл.3). Несмотря на незначительное по абсолютному количеству уменьшение АК в ДАГ, в процентном отношении оно является самым высоким (на 44.1 ± 10.5%, р < 0.05).

Табл. 2. Влияние АВП (23 нМ, 10 мин) на содержание свободных жирных кислот в ткани, -иочевого пузыря лягушки (внг/мг белка, п-5). 1Щ - различия недостоверны.

Жирная кислота Контроль АВП Р

пентадекановая (15:0) 19.9 ± 0.7 19.1 ± 1.2 НД

пальмитиновая (16:0) 211.9 ± 12.6 244.1 + 37.3 нд

пальмитоолеиновая (16:1 ) 35.8 ± 5.6 26.3 ± 3.0 НД

гептадекановая (17:0) 14.4 ± 1.6 16.5 + 1.6 НД

стеариновая (18:0) 93.3 ± 2.6 158.7 + 22.0 <0.05

олеиновая (18:1) 87.6 ± 15.3 73.2 ± 3.5 НД

линолевая (18:2) 53.7 ± 15.5 57.5 ± 6.2 НД

арахиновая (20:0) 11.9 ± 1.5 25.4 ± 3.3 <0.01

эйкозеновая (20:1) 15.7 ±2.6 5.7 + 2.7 НД

арахидоновая (20:4 в 6) 18.6 ± 1.2 3.3 + 3.9 <0.01

эйкозатетраеиовая (20:4 и 3) 13.5 ± 2.2 6.2 + 1.6 <0.05

эйкозапентаеновая (20:5 о 3) 6.8 + 1.0 8.3 + 1.1 НД

докозатетраеновая (22:4 о 6) 23.4 ± 4.8 21.7 + 5.9 НД

докозапентаеновая (22:5 а 6) 19.7 + 8.1 21.1 + 3.0 НД

Табл.3. Содержание АК в фосфолипидах и 1,2-ДАГ ткани мочевого пузыря лягушки в контроле и при действии в течение 10 мин 23 нМ АВП (а нг/мг белка, п~ 8).

Липид Контроль АВП Д Р

Фосфатидилэтаноламин 2119 + 201 1783 + 89 336 <0.05

Фосфатидилхолин 1083 ± 49 1032 ±32 51 НД

Фосфатидилсерин 400 + 34 347 + 42 53 НД

Фосфатиднлинозит 408 ± 16 372 + 19 36 НД

1,2-Диацилглицерин 3.4 + 0.4 1.9 + 0.3 1.5 <0.05

Аналогичный результат был получен при исследовании радиоактивно-меченых липидов ткани мочевого пузыря лягушки, полученных в результате часовой прединкубации изолированных мочевых пузырей с 2.5 рСУмл |'Н]АК (табл. 4). Достоверное уменьшение содержания меченой АК через 5 мин после добавления АВП наблюдалось в ФЭА и в 1,2-ДАГ. Значительное увеличение радиоактивности было выявлено в 1,2-ДАГ через 20 сек после действия АВП (+37 +

6%), что очевидно связано с увеличением абсолютного количества ДАГ за счет гормон-опосредованной активацией распада ФИФ:.

Падение содержания АК в ФЭА и снижение количества самого фосфолипида в целом, а также увеличение свободной АК предполагают участие ФЛАг в механизме действия АДГ. В пользу этого предположения свидетельствуют данные об относительном уровне лизоФЭА, который является одним из продуктов действия ФЛАг на ФЭА. Через 10 мин после добавления 23 нМ АВП соотношение |33Р|лизоФЭА/ |МР]ФЭА в ткани пузыря увеличивается с 2.57 ± 0.4 до 4.23 ± 0.88 {р < 0.05), что прямо указывает на активацию ФЛАг аргинин-вазопрессином. Таким образом, основными источниками свободной АК, высвобождающейся при действии АВП в мочевом пузыре лягушки, являются ФЭА и 1,2-ДАГ, которые служат субстратами для действия ФЛАг и ДАГ-липазы, соответственно. По сравнению с ФЭА, вклад 1,2-ДАГ в пул высвобождаемой А К незначителен, однако, его эффект может быть локализован в компартменте, где небольшие с точки зрения целой клетки изменения в уровне свободной АК могут иметь большое значение. Таким образом, 1,2-ДАГ выполняет как минимум две функции в модуляции гидроосмотического эффекта АВП: активирует ПКС и является источником свободной АК.

Табл. 4. Изменение радиоактивности меченых [ *Н]арахидоновой кислотой фос-фолипидов и 1.2-ДАГ стенки мочевого пузыря лягушки при различных временах воздействия 10 нМ АВП (%от контроля; а =8-10).

Липвд % изменения

20 сек 40 сек 60 сек 5 мин 10 мин 30 мин

ФХ -3± 2 -1 ± 3 +5 ±2 +4±3 -3±2 -3+ 1

ФЭА (д) 0+4 +6 + 5 -3 ±2 -7 + 2* -2 ±4 -4+5

ФЭА (п) +5± 5 - +4 ±5 +4 ±4 +5 ±4 +5 ±4

ФИ +15+10 +1 + 7 -4 + 6 -2 ± 3 +17 +4* +7+7

ФС - - +5 ±9 -2 ±9 - -13 + 9

1.2-ДАГ +37 ± 6* -2 + 7 +3+4 -15 ± 5* - -

ФЭА (д) - диацильпая форма ФЭА, ФЭА (п) - плахмалогениая. *-р<0.05.

Наиболее вероятным механизмом активации ФЛАг при действии АВП на нашей модели нам представляется увеличение внутриклеточной концентрации |Са2+| за счет усиления его входа и мобилизации из внутриклеточных резервов, активатором которых может служить высвобождающийся при действии АВП ИТФ. Это предположение связано с тем, что большинство изоформ ФЛАг в почке чувствительны к концентрации Са-+ (ВопуспКс, 1992). Кроме того, установлена взаимосвязь биосинтеза простагландинов, скорость которого зависит от активности ФЛАг, и уровня внутриклеточного Са2+ на собирательных трубках почки кролика, где ингибирующее действие кальциевого ионофора А23187 на гидроосмотический

эффект АВП и накопление цЛМФ снималось добавлением иидометаципа (Teitelbaum & Berl, 1986; Ando et al., 1988). Сходный результат был получен с другой парой веществ подобного действия - иономицина и ибупрофена (Joncs et al., 1987).

Однако, можно предположить существование и других механизмов активации ФЛЛг вазопрессином в мочевом пузыре лягушки, например, фоефорилирование фермента активируемой гормоном ПКС, которое, как известно, приводит к увеличению чувствительности фермента к Са2+ (Bonventre & Swidlcr, 1988). В этом случае схема внутриклеточной модуляции гормонального сигнала может выглядеть следующим образом: АВП-» фосфолипаза С -> ДАГ -> ПКС -» ФЛАг -> АК ПГЕ.

Действие свободной арахидоновой кислоты на гидроосмотнческпй эффект АВП. Поскольку АВП стимулировал высвобождение свободной АК из ФЭА и 1.2-ДАГ, необходимо было выяснить функциональное значение этого процесса. Для этого были проведены эксперименты с добавлением АК со стороны серозной оболочки мочевого пузыря. Как показали предварительные эксперименты, базальный поток воды по осмотическому градиенту не менялся в присутствии даже высоких доз жирной кислоты, поэтому АК добавлялась за 1 мин до введения АВП. Добавление 2 мкМ АК резко ингибировало гидроосмотическое действие 23 нМ АВП (рис.5, А), повышение концентрации жирной кислоты до 10 мкМ практически полностью блокировало стимулированный гормоном поток воды (рис.5, Б). При добавлении с мукозной стороны эффект АК отсутствовал. Наблюдаемое действие АК было обратимо и устранялось добавлением очищенного от жирных кислот БСА на пике ингибирующего эффекта.

При добавлении в серозный раствор мепакрина - специфического блокатора фосфолипазы А2 (1.арс1та с1 а!., 1981; ¡\fcGivncy с( а1., 1981) гидроосмотическое действие 5 иМ АВП значительно усиливалось. Максимальный стимулирующий эффект проявлялся при использовании 25 мкМ (на 219 + 43%), дальнейшее увеличение концентрации приводило к ослаблению стимулирующего влияния. Эти данные свидетельствуют об участии эндогенной АК в негативной модуляции гидроосмотического действия АВП.

Для проверки того, что АК оказывает свое влияние как самостоятельный эффектор, а не действует посредством увеличения биосинтеза эйкозаноидов, нами были использованы специфические блокаторы окислительного превращения АК. Индометацин - ингибитор цнклоксигеназы - в концентрации 1 мкМ усиливал действие АВП, в его присутствии эффект АК был менее выражен, что указывает на то, что часть АК используется на синтез ПГ и они выступают как ингибирующие агенты, однако, эффект АК устранялся лишь частично. В присутствии 1 мкМ иордигидрогиуаретиковой кислогы - ингибитора лнпоксигеназы, или 100 мкМ кетоконазола - ингибитора превращения АК по пути НАДФ-зависимого окисления системой цитохрома Р-450, ингибирующий эффект АК сохранялся (рис. 6). Инги-бирующим эффектом обладал и неметаболизируемый аналог АК - 5,8,11,14 -эйкозатетраиновая кислота. Эти факты свидетельствуют о самостоятельной роли АК в модулировании эффекта АВП.

Рис.5. А - Эффект 2 мкМ арахидоновой кислоты па гидроосмотическое действие 23 нМ АВП. Пунктирная линия - АВП + А К, сплошная - АВП. Б - Дозозависимость зффекта АК на действие АВП (зффект АВП принят за 100%). По оси абсцисс -концентрация АК. Результаты являются средним значением ± т 10 экспериментов.

12 О г

1 2 3 4 5 6

Рис.6. Действие 2 .чкМ АК на гидроосмотический эффект 23 нМ АВП в присутствии ингибиторов ее окислительного превращения (в % от действия АВП, которое принято за 100%). 1 - АВП, 2 - АВП + АК, 3 - АВП + АК + индометации (1 мкМ), 4 - АВП + А К + нордигидрогуаретиковая кислота (1 мкМ), 5 - АВП + А К + кетокопазол (100 мкМ), 6 - АВП + зйкозатетраиновая кислота (1 мкМ). Результаты являются средним значением ±т (п = 10-12).

Оставалось неясным, однако, на каком этапе в цепи передачи гормонального сигнала оказывает свое влияние АК. Как показали полученные данные, АК не влияла на поток воды, вызванный 2 мМ цАМФ+50 мкМ ИБМК или различными концентрациями проникающего аналога цАМФ - дибутирил-цАМФ. Было обнару-

жеио небольшое ингибирование гидроосмотимеекого эффекта 20 мкМ форсколина при добавлении АК, однако, различия были статистически недостоверными. Аналогичный результат был получен при использовании 10 мкМ АК - 84.0 ± 5.4 при действии форсколина и 75.0 ± 6.3 мкл/см2 30 мни при действии форсколина + АК (л=6, различия недостоверны).

В свете этих данных очевидно, что мишень действия АК локализована на этапах передачи гормонального сигнала, предшествующих активации аденилат-циклазы, вероятнее всего, на участках связывания АДГ с рецептором и сопряжения последнего с комплексом С-белок - аденилатциклаза. Впоследствии эта работа была продолжена Фирсовым и соавт. на толстом восходящем отделе петли Генле почкн крысы, где АК в тех же концентрациях, что и на мочевом пузыре лягушки, ингибировала АВП-зависимое накопление цАМФ (Пгеоу с! аЬ, 1995). В этом сегменте нефрона АК оказывала аналогичный эффект на действие других гормонов, вызывающих увеличение цАМФ - глгокагона и кальцнтоиина, следовательно, ее действие не является специфичным по отношению к рецептору гормона. Снятие ингибирующего эффекта АК достигалось в результате предобработки ткани коклюшным токсином. Это не проясняет до конца мишень действия АК в ингибирова-нии действия АВП, однако, позволяет локализовать эффект на уровне ее взаимодействия с С| -белком, связанного с ингибированием аденилатциклазы.

Действие других жирных кислот на гидроосмотический эффект АВП. В связи с обнаруженным эффектом АК представляло интерес выяснить обладают ли действием другие жирные кислоты, или наблюдаемый эффект АК является уникальным и обусловлен особенностью ее химической структуры. Для этой цели было исследовано действие различных жирных кислот в концентрации 5 мкМ при добавлении 5 мкл раствора жирной кислоты в смеси метанол-гексан (5:1, по объему) в раствор Рингера со стороны серозной поверхности мочевого пузыря за 1 мин до введения АВП.

Оказалось, что исследованные насыщенные и моиоеновые жирные кислоты (18:0, 20:0 и 20:1) не влияли на гидроосмотический эффект АВП. Все полиеновые кислоты обладали выраженным действием, однако, их эффект значительно отличался не только по величине, но и по знаку (табл. 5). Нами были предприняты различные попытки связать особенности химической структуры жирной кислоты с оказываемым эффектом. Очевидно, что знак эффекта не был связан только с длиной цепи или с количеством двойных связей. Расчет индекса неиасыщенностк также не выявил корреляции с оказываемым действием. Определенная закономерность была выявлена при анализе длины фрагментов молекулы жирной кислоты, образующих насыщенные участки со стороны метилыюго и карбоксильного концов до первого атома углерода, образующего двойную связь. Оказалось, что для жирных кислот, которые стимулируют действие АДГ, длина таких насыщенных фрагментов молекулы составляет от 9 до 13 С1Ь -групп (табл.5); более короткие насыщенные участки (от 3 до 8 СНг -групп) присущи жирным кислотам ингибирующего ряда. Удлинение насыщенных участков при одинаковой длине ненасыщенных ведет к потенцированию эффекта (например, 18:3 и Зн 20:3 со 3); увеличение числа двойных связей в цепях одинаковой длины и, таким образом, уменьшение

зоны насыщенности ведет к ингибирующему эффекту (например, 20:2 га 6 и 20:4 <о 6).

Поскольку насыщенные кислоты, а также моноеновые не имели эффекта на действие АДГ, можно полагать, что ненасыщенный фрагмент молекулы необходим для связывания жирной кислоты с ее эффектором, в то время как знак эффекта и его величина определяются длиной насыщенной части углеводородной молекулы. Необходимую роль в действии жирной кислоты играет, очевидно, свободная карбоксильная группа, поскольку метиловый эфир АК не имел эффекта на действие АДГ.

При исследовании состава СЖК в мочевом пузыре лягушки достоверное увеличение содержания при действии АВП было выявлено только для стеариновой и арахидоновой жирных кислот (табл.2). Поэтому, вероятно, данные об эф-

Табл. 5. Эффект полиненасыщеиных жирных кислот (5 мкМ) на гидроосмотическое действие АВП (% от эффекта, вызываемого только гормоном); в скобках -число экспериментов. Ид - различия недостоверны.

Жирная кислота

% эффекта

Длина насыщенных фрагментов молекулы (количество -Oh -групп)

Стимулирующие действие АВП

20 : 2 и 6 133.6+13.2 (п=12) <0.05 13

20:3 гаЗ 129.1 + 10.5 (п =15) <0.05 10

22:3 шЗ 140.0 ±20.0 (п=10) < 0.05 12

22:4 тб 127.9 + 9.0 (п = 18) < 0.002 9

Иштюнт кшше действие АВП

18:3 шЗ 67.4 ±10.0 (п = 10) <0.002 8

20:4 ш 6 35.1 ± 4.3 (п = 12) < 0.001 7

20:5 шЗ 68.6+7.7 (в =15) <0.001 4

22:6 шЗ 60.2 + 10.6 (п = 8) <0.01 3

фектах других жирных кислот носят скорее теоретический характер и свидетельствуют о том, что в механизме антидиуретического эффекта АДГ на уровне клетки осморегулирующего эпителия существуют мншени, чувствительные к действию полиненасыщенных жирных кислот разнообразной структуры. Этот факт может представлять интерес в связи с проблемой влияния липидных диет с различным жирнокислотным составом на обеспечение водно-солевого гомеостаза.

АВП-независимое увеличение осмотической проницаемости: роль простагландина Е2

Активация транспорта воды по осмотическому градиенту сиеной серозного раствора Рипгера. Обычно базальный уровень осмотической проницаемости изолированного мочевого пузыря сохраняется очень низким в течение всего времеии ведения эксперимента. Мы обратили внимание на тот факт, что если пузыри переносили в свежий раствор Рмигера, то это всегда приводило к небольшому росту осмотической проницаемости. Повторив эту процедуру 3-4 раза, то есть перенося пузыри через каждые 15 мин в свежий раствор, мы увидели значительное нарастание осмотической проницаемости, которое по величине можно было сравнить с действием средних или высоких доз АВП (рис. 7). Этот процесс был обратимым: проницаемость пузыря немедленно восстанавливалась до низких базальных значений при помещении его в 1-ую ("отработанную") среду. Мы предположили, что во внешний раствор из ткани пузыря выделяется какой-то фактор (или факторы), концентрация которого при нескольких последовательных сменах раствора Рингера уменьшается, что и вызывает рост осмотической проницаемости. Высокий уровень этого фактора в первом (исходном) растворе обеспечивает непроницаемость эпителия.

40 «0 80

Время (мин)

Рис.7. Увеличение осмотической проницаемости мочевого пузыря лягушки в результате нескольких смен серозного раствора. Пунктирная линия - контроль. Стрелки указывают моменты смены раствора. Каждая точка - среднее ± т (п- 10).

Влияние смены серозного раствора на содержание цАМФ в ткани пузыря и количество агрегатов ВМЧ в апикальной мембране. Каков же механизм увеличения осмотической проницаемости в отсутствии гормона при смене серозного раствора? Измерение уровня цАМФ в гомогеиате пузырей с высоким уровнем проницаемости, вызванной 3-4-х кратной сменой окружающего раствора показало, что уровень

цАМФ в них был достоверно выше, чем в контроле (44.7 ± 7.2 пмоль/мг белка уя. 31.5 ± 3.2, р < 0.01). Уровень цА1У1Ф в пузырях, стимулированных 5 нМ аргинин-вазотоцина, составил 58.4 + 8.3 пмоль/мг белка. В этих же пузырях измеряли величину гидроосмотнческого ответа. Если сопоставить индивидуальные значения гидроосмотической реакции в каждом случае с соответствующим ему уровнем цАМФ, то между этими величинами наблюдается одна и та же корреляционная зависимость, независимо от того, каким способом вызван поток воды - добавлением гормона или сменой окружающего раствора (рис. 8).

НгО (мкл/мин см2)

Рис.8. Корреляция между содержанием цАМФ в ткани мочевого пузыря (в % от контроля) и величины осмотической проницаемости (мкл/см мии), стимулированной 5 иМ аргинии-вазотоцина (светлые кружки) или 4-х кратной сменой окружающего раствора (темные кружки).

Поскольку наблюдаемое увеличение уровня цАМФ могло быть связано и с торможением фосфодиэстеразы цАМФ, была измерена "базалыгая" и стимулированная 10 мкМ форсколина активность аденилатцикдазы в мембранной фракции, выделенной из пузырей с низким и высоким уровнем осмотической проницаемости. Оказалось, что активность фермента в пузырях, поток воды в которых был активирован сменой Рингера, была на 109% выше ф<0.05), чем в контрольных пузырях (рис.9), форсколин-стимулированная - на 74% выше (/><0.001).

р -с 0.001

30 |-1

нп вп

Рие.9. Активность мембранной аденилатциклазы, выделенной из пузырей с низкой (НП) и высокой (ВП) осмотической проницаемостью, достигнутой сменой серозного раствора. Открытые столбики - вязальная активность; заштрихованные - в присутствии 10 мкМ форсколина. Кшкдое значение - среднее ± т 3-х определений.

Исследование ультраструкгуры апикальной мембраны методом замораживания-скалывания5 выявило наличие на РГ-поверхности мембраны пузырей, поток воды в которых был активирован сменой Рингера, агрегатов ВМЧ, типичных для АВП-активированного водного транспорта. Никаких видимых отличий в структуре агрегатов частиц в пузырях, подвергнутых действию АВП или смене Рингера, выявлено не было. Эти данные в совокупности с результатами измерения тканевого уровня цАМФ и активности аденилатциклазы свидетельствуют о том, что осмотический транспорт воды, вызванный сменой окружающего раствора, осуществляется тем же путем, что и при действии гормона. Какой же фактор в отсутствии гормона запускает цепочку его внутриклеточного действия?

Действие ИГЕ; на поток воды, стимулированный сменой серозного раствора. Очевидно, что фактор(ы), о котором идет речь, находился в окружающем растворе и что его концентрация должна была последовательно убывать по мере смены этих растворов. В качестве такого фактора, поддерживающего низкий уровень осмотической проницаемости, могло рассматриваться вещество, которое при добавлении на пике потока резко тормозило бы поток воды, возвращая величину проницаемости к исходному уровню. Таким эффектом обладала сыворотка крови лягушек (10 мкл/мл) и ее хлороформ-метанолов ый экстракт, однако, их эффект практически полностью снимался при добавлении 10 мкМ ипдометацина.

Аналогичным действием обладала АК в концентрации 5 мкМ, и ее эффект также в значительной степени устранялся в присутствии иидометацина. Эти факты

5 Эта часть работы была выполнена совместно с докт.биол.наук Я.Ю.Комиссарчиком и его коллегами (Институт цитологии РАН).

позволили предположить, что причиной, сдерживающей увеличение осмотической проницаемости, является наличие определенной концентрации простагландинов. Действительно, через 15 мин после добавления 10 нМ ПГЕг на пике потока воды осмотическая проницаемость снижалась на 81%, а еще через 15 мин ее уровень возв-

0.00

40 66 »0

Время (мин)

100 120

-» -» -7

!д[М]

Рис.10. А. Влияние 10 нМ ПГЕг на поток воды, стимулированный сменой серозного раствора. Пунктирная линия - добавление ПГЕг , сплошная - контроль (в отсутствии ПГЕг )■ Стрелками обозначены моменты смены серозного раствора. Б. Эффект различных концентраций ПГЕг на поток воды, вызванный сменой серозного раствора. Сплошная линия - действие ПГЕг за 15 мин, пунктирная - за 30 мин. Поток воды в контроле (без добавления ПГЕг) принят за 100%. По оси ординат -% ингибирования, по оси абсцисс - логарифм концентрации ПГЕг . Каждая точка -среднее +т (н = 10-12).

ращался к исходному значению (рис. 10, Л). Исследование действия различных доз ПГЕг показало, что максимальным ингибирующим эффектом обладали 10 и 100 нМ; более низкие (1 иМ), а также более высокие концентрации (1 и 10 мкМ) обладали меньшим эффектом (рис. 10, Б).

Содержание эндогенного ПГЕг в серозном растворе и ткани пузыря. Представляло интерес сопоставить концентрацию эндогенного ПГЕг в серозном растворе с уровнем осмотической проницаемости, которой обладает эпителий пузыря в данной среде. Для этого парные пузыри сразу после извлечения промывались дважды по 10 сек в растворе Риигера и помещались раздельно в 5 мл свежего раствора. Через 20 мин инкубационная среда заменялась на свежий раствор, эта процедура повторялась 4 раза. Аликвоты из каждого раствора брались для определения уровня ПГЕг, параллельно измеряли уровень осмотической проницаемости. Контрольный пузырь в течение всего эксперимента находился в одном и том же растворе. В конце опыта уровень ПГЕз определяли также в гомогенате стенки мочевых пузырей.

Табл. 6. Количество ПГЕ} (в нг/мг белка ткани) в серозных растворах (объемом 5 мл ) и в ткани нузыреа, находящихся в течение опыта в одной среде (контроль) и подвергнутых 4-кратной смене серозного раствора (жсперимент). В скобках - % ПГЕ2 от суммарного ПГЕ г, содержащегося в 1-5 растворах.

порядковый

номер контроль эксперимент

среды

1 67.1 ±7.6 (59.6%)

2 - 24.5 ±7.2 (21.8%)

3 - 10.1 ±4.3 (9.0%)

4 - 7.4 ± 3.4 ( 6.6 %)

5 - 3.4 ±1.7 (3.0%)

Сумма 80.4 ±7.8 112.5 ± 16.4 *

Ткань пузыря 76.2 ± 19.4 57.5+ 8.5 **

Среда+ткань 156.6 ± 11.8 168.3 ± 9.6 «

Результаты являются средним ±т (п=4). *р<0.02, **различия недостоверны.

Общее количество ПГЕг в окружающей инкубационной среде падает с 67.1 нг/мг тканевого белка в 1-ом растворе до 3.4 в 5-ом (табл. 6). Более 80% количества всего выделяемого ПГЕг приходится на 1-й и 2-ой растворы. Измерение уровня осмотической проницаемости пузырей, находящихся в каждом из этих

растворов, показало, что она возрастает в результате 4-х смен с 0.08 ± 0.01 до 1.28 ± 0.2 мкл/см2 мин; это сопровождается падением концентрации ПГЕг с 15 нМ до 0.6 нМ. Таким образом, между этими величинами существует обратная зависимость.

Интересно было выяснить не изменяется ли в условиях смены окружающего раствора и усиления осмотической проницаемости скорость синтеза ПГЕг и общее количество выработанного простагландина. Для этого мы проанализировали количество ПГЕг как в наружных растворах, так и самой ткани контрольного и опытного пузыря (табл. 6). Оказалось, что общее количество ПГЕг , выделяющегося наружу, было достоверно выше в случае смены Рингера (112.5 vs. 80.4 нг/мг белка, /><0.02), однако, сумма ПГЕг в наружных растворах и ткани не отличалась в опыте и контроле. Следовательно, смена серозного раствора стимулирует выход ПГЕг наружу, которому, вероятно, способствует поток воды, проходящей через эпителий, но не влияет на скорость их синтеза.

Влияние ПГЕг на активность аденилатциклазы в мембранной фракции мочевого пузыря. Для того, чтобы выяснить как различные дозы ПГЕг влияют на активность аденилатциклазы мембранной фракции, выделенной из пузырей с высоким потоком воды, его добавляли в реакционный буфер в концентрациях от 10 рМ до 1 мкМ. Самая низкая из использованных доз - 1 рМ не имела выраженного эффекта (рис. 11). Концентрации свыше 1 нМ слабо ингибировали активность фермента, а 1мкМ вызывал достоверное угнетение активности (на 33.4%, р < 0.02). Значительное увеличение активности фермента было получено при использовании 10-" М - на 196% (р < 0.01). Таким образом, высокие дозы ПГЕг (от UY9 М до 10-6 М) ингиби-руют активность аденилатциклазы in vitro, а низкие дозы (10-10 М) стимулируют

lg I ПГЕг I

Рис.11. Влияние различных концентраций ПГЕг на активность аденилатциклазы (АЦ) в мембранной фракции мочевых пузырей, подвергнутых смене серозного раствора. По оси ординат - активность фермента, % от базального уровня), по оси абсцисс - логарифм концентрации ПГЕг. Каисдое значение • среднее ± т 3-определений. *р < 0.05..

ее. Это даш(ые хорошо согласуются с кривой дозо-зависимости эффекта добавления ПГЕ2 на величииу потока воды, стимулированного сменой раствора Рингера (рис.10, Б), и позволяют предположить, что триггером, увеличивающим уровень осмотической проницаемости, может являться низкая (порядка 10-'° \1) концентрация ПГЕг, уровень которой достигается в ходе последовательных смен серозных растворов.

Известно существование по крайней мере двух механизмов снижения активности аденилатциклазы при действии ПГЕг - прямое ингибирование через С| -белок-связанные рецепторы типа ЕРз (Sugiпloto е( а!., 1992, 1994; 1пе а!., 1994), и косвенное, вызываемое активацией входа Са2+" в клетку, опосредованное рецепторами типа ЕР1 (\Vatabe с( а1., 1993; 8и^!шо1о е( а!., 1994). Устранить ингибирующий эффект 1 мкМ ПГЕ^иа адепилатцнклазу, если он действует первым способом, можно было бы коклюшным токсином, который вызывает АДФ-рибозилирование С| -белка, что приводит к его необратимой инактивации. Для этой цели была проведена 45-минутная предиикубацня с 10 мкг/мл КТ. Сам по себе токсин не изменял уровень активности аденилатциклазы, однако, в его присутствии не только полностью устранялся ингибирующий эффект 1 мкМ ПГЕг, но наблюдалась значительная стимуляция активности аденилатциклазы (па 149%, р < 0.001) (рис. 12). Таким образом, в присутствии коклюшного токсина ингибирующее действие ПГЕг на активность аденилатциклазы блокируется, что свидетельствует о вовлечении в его эффект рецепторов типа ЕРз .

300

^ 250

< 200 л

Ш 150 а

= 100

5

4 50

КТ

+ КТ

Рис.12. Эффект предобработки коклюшным токсином (КТ; 45 мин при 280 С, 10 мкг/мл)) на ингибирующий эффект 1 мкМ ПГЕг на активность мембранной аденилатциклазы (АЦ) (% от базальиого уровня). Белые столбики - без ПГЕг, заштрихованные - в присутствии 1 мкМ ПГЕг. Казкдое значение - среднее + т 3-х определений. *р< 0.05, **р< 0.001.

Еще одним доказательством вовлечения G¡ -белка в действие ПГЕг в мочевом пузыре лягушки является снятие ингибирующего эффекта ПГЕг на поток воды, стимулированный сменой серозных растворов, в присутствии 100 мкМ N-этилмалеимида - сульфгидрильного алкилирующего агента, который способен специфично модифицировать G¡ -белок, делая его неактивным.

Поскольку ИГЕ: способен в зависимости от концентрации ингибировать или стимулировать аденилатциклазу, можно полагать, что ПГЕг участвует в регуляции осмотической проницаемости эпителия мочевого пузыря лягушки взаимодействуя по крайней мере с 2 типами рецепторов, опосредующих ингибирование или активацию аденилатциклазы. Тот факт, что высокие концентрации ПГЕг ингибируют активность фермента, а низкие - стимулируют, свидетельствует о том, что в мочевом пузыре лягушки G¡ -связанный рецептор являете» значительно менее аффинным. Осмотическая непроницаемость эпителия, вероятно, не является его непреложным свойством в отсутствии АДГ как некое состояние "гормонального покоя" -для поддержания непроницаемости необходим простагландин Ез , действующий как ауто- или паракринный регулятор осмотической проницаемости, мишенью действия которого является уровень активности аденилатциклазы. В условиях in vivo существование подобной регуляции, вероятно, может обеспечиваться изменением скорости почечного кровотока, от которой зависит концентрация аутакоидов во внеклеточной жидкости.

Заключение

Рассмотрение молекулярных механизмов регуляции транспорта воды в осморегулирующем эпителии демонстрирует чрезвычайную сложность внутриклеточной организации обеспечения функционального ответа на аргинин-вазопрессин. Эта сложность обеспечивается наличием, по крайней мере, двух типов рецепторов АВП на одной клетке, сопряженных с различными системами вторичных посредников - аденилатциклазной и Са2+ /фосфоинозитцдной, и существованием механизмов, контролирующих уровень осмотической проницаемости в отсутствии гормона.

Связывание АДГ с рецептором типа \г опосредованно через -белок приводит к активации аденилатциклазы и увеличению уровня цАМФ в клетке. цАМФ-зависимая лротеинкиназа А обеспечивает экзоцитоз агрефоров, содержащих водные каналы типа аквапорина 2, с апикачьной мембраной, что приводит к усилению осмотической проницаемости и активации водного транспорта. В первые секунды действия гормона включается система негативной модуляции, осуществляемая через рецепторы типа VI и приводящая к образованию инозит-трисфосфата и 1,2-диацилглицерина. Основные события модуляции гормонального сигнала, очевидно, разворачиваются на стадии регуляции активности аденилатциклазы. Главными участниками негативной модуляции являются Са2+, протеин-киназа С и фосфолипаза Аг , в функционировании этого ансамбля прослеживается наиболее сложная система взаимной регуляции. Свободная АЕС, являющаяся продуктом действия фосфолкпазы А? или фосфолипазы С/ДАГ-лнпазы, может действовать как самостоятельный негативный модулятор действия АДГ и является источником для синтеза простагландинов. ПГЕг действует на клетку снаружи по

принципу аутакринной (или па^акринной) регуляции, осуществляя свой негативный эффект через чувствительное к действию коклюшного токсина ингибирование аденилатциклазы, опосредованное рецептором типа ЕРз . По всей вероятности, АК действует на этот же рецептор (по нашим данным константа ингибироваиия, определяемая как концентрация вещества, вызывающая 50% ингибирование эффекта, для арахидоновой кислоты составляет 7.5-10-7 М, а для ПГЕг - 510-1П М, то есть они отличаются на 3 порядка. В свете этих различий данная гипотеза кажется вполне правомерной). С возможным существованием в эпителии мочевого пузыря лягушки рецептора типа ЕРг, активирующего через Огбелок адеиилатциклазу, связано предположение о способности низких доз ПГЕг увеличивать осмотическую проницаемость, что позволяет рассматривать ПГЕг не только как антагонист, но и как миметик антидиуретического действия АДГ.

Полученные данные позволяют заключить, что регуляция осмотической проницаемости осморегулирующего эпителия при действии АДГ включает в себя прямое действия гормона на системы, обеспечивающие встраивание водных каналов в апикальную мембрану клетки и увеличение осмотической проницаемости, систему негативной модуляции действия гормона и систему, регулирующую проницаемость эпителия в отсутствии пейрогипофизарного контроля.

Выводы

1. При действии аргинин-вазопрессииа в эпителии мочевого пузыря лягушки Rana temporaria L. наряду с аденилатциклазиой активируется фосфоинозитцдяая сигнальная система, функциональное значение которой связано с осуществлением негативной модуляции гидроосмотического эффекта АВП. Обнаруженный эффект гормона опосредован рецепторами типа Vi.

2. Под влиянием АВП в стенке мочевого пузыря и окружающем серозном растворе увеличивается содержание свободной арахидоновой кислоты, высвобождающейся из фосфатидилэтаноламина и 1,2-диацнлглицерина. Основными механизмами усиления высвобождения арахидоновой кислоты при действии АВП являются активация фосфолипазы Аг и фосфолипазы СУДАГ-липазы.

3. Арахидоновая кислота в физиологических концентрациях дозо-зависимо обратимо ингибируст гидроосмотическое действие АВП. Обнаруженный эффект не связан с усилением продукции эйкозаноидов. В мочевом пузыре лягушки арахидоиовая кислота действует как самостоятельный модулятор гидроосмотического действия АВП, оказывая свое действие на этапах предшествующих образованию цАМФ.

4. Добавление жирных кислот другой структуры оказывает различный эффект на гидроосмотическое действие АВП. Насыщенные и моноеновые не имеют эффекта, тогда как линолеиовая, эйкозанентаеновая и докозагексаеновая кислоты иигиби-руют действие АВП, а эйкозадиеновая, эйкозатриеновая, докозатриеиовая и доко-затетраеновая его стимулируют. Найдена корреляция между знаком оказываемого

эффекта и длиной насыщенных фрагментов углеводородной цепи, располагающихся с обоих концов молекулы.

5. Одним из механизмов осуществления негативной модуляции действия АВП является активация лротеинкиназы С. Полученные данные позволяют предположить наличие 2-х пулов фермента, осуществляющих модуляцию гормонального сигнала на стадиях предшествующих и последующих образованию цАМФ.

6. Увеличение осмотической проницаемости эпителия изолированного мочевого пузыря лягушки может быть вызвано в отсутствии гормона последовательной 4-5-кратпой сменой серозного раствора. Показано, что рост водной проницаемости в этом случае обусловлен теми асе молекулярными механизмами, что и при действии АВП - активацией аденилатциклазы, накоплением цАМФ и встраиванием водных каналов в апикальную мембрану клетки.

7. Увеличение осмотической проницаемости, вызванное сменой серозного раствора, ингибируется простагландином Е2 в концентрации 0.001-10 мкМ. Этот эффект основан на ингкбкровании аденилатциклазы через О^-белок-связанные рецепторы (типа ЕРз) и обеспечивает осмотическую непроницаемость эпителия в отсутствии гормона. Обнаружена значительная активация мембранной аденилатциклазы при действии низких доз ПГЕг (0,1 нМ), что позволяет предположить существование триггерного эффекта низких доз ПГЕг в увеличении осмотической проницаемости.

8. Сделано заключение, что регуляция осмотической проницаемости осморегули-рующего эпителия при действии АВП включает в себя прямое действия гормона, обеспечивающее увеличение осмотической проницемости, систему негативной модуляции действия гормона и систему, регулирующую проницаемость эпителия в отсутствии иейрогипофизарного контроля с помощью механизмов ауто- и пара-крииной регуляции.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Шрагин A.C., Париова Р.Г., Селищева A.A., Бермап AJI., Клящицкий Б.А., Швец В.И. (1988) Препаративное получение мио-инозиттрифосфата. Укр. биохим. журнал, т.60, с.72-77.

2. Фирсов Д.Л., Парнова Р.Г., Берман А.Л. (1989) Участие фосфоинозитидов в клеточном механизме антидиуретического действия вазопрессииа. Всес. конф. "Механизмы действия гормонов", Суздаль, 1989, Тез. докл., с.198.

3. Парнова Р.Г., Наточин Ю.В., Резник Л.В., Сааков B.C., Фирсов Д.Л., Шахматова Ё.И. (1989) Вторичные мессецджеры в механизме увеличения проницаемости для воды под влиянием вазопрессииа. VIII Всес. конф. по физиологии почек и водно-солевого обмена, Харьков, 1989, Тез.докл., с.142-143.

4. Наточин Ю.В., Парнова Р.Г., Резник Л.В., Наточин М.Ю., Фирсов ДЛ., Шахматова Е.И. (1989) Влияние вазопрессииа на осмотическую проницаемость

стенки мочевого пузыря лягушки и содержание в ней цАМФ, цГМФ и инозиттри-фосфата. Физиол. журнал СССР, т.75, с.702-708.

5. Наточин Ю.В., Парнова Р.Г., Фирсов Д.Л., Шахматова Е.И., Каминский ЮЛ., Акулов Г.П., Патокииа Н.А. (1989) Зависимость между внутриклеточным содержанием 1-метил-З-нзобутилксантина и проницаемостью для воды стенки мочевого пузыря лягушки. Физиол. журнал СССР, т.75, с.1766-1771.

6. Natochin Yu.V., Parnova R.G., Reznik L.V., Firsov D.L., Shakhmatova E.I. (1989) Vasopressin action and cAMP, cGMP and inositol triphosphate contents in amphibian urinary bladder. XXXI Congress of IUPS, Helsinki, Abstracts, p,493.

7. Парнова Р.Г., Фирсов Д.Л. (1990) Инозиттрифосфат и диацилглицерин как вторичные посредники в механизме увеличения осмотической проницаемости под влиянием вазопрессина. 5 Всес. коиф. "Физиология и биохимия медиаторных процессов", Москва, Тез. сообщ., с.221.

8. Наточин Ю.В., Парнова Р.Г., Фирсов Д.Л., Шахматова Е.И. (1990) Вторичные мессенджеры и простагландипы в механизме антидиуретического действия вазопрессина. Сателлитный симпозиум Н-го Межд. конгресса нефрологов "Тубуло-интерстициальные расстройства", Иркутск, 1990, Тез докл., с.63.

9. Парнова Р.Г., Фирсов Д.Л. (1990) Увеличение гидроосмотического эффекта вазопрессина при угнетении неомицивом пиролиза фосфатндилинозит-4,5-дифосфата. Докл. АН СССР, т.ЗЮ, с.1013-1015.

10. Парнова Р.Г., Фирсов Д.Л. (1991) Стимуляция вазопресеином гидролиза фосфатидилннозит-4,5-дифосфата и его связь с биосинтезом простаглавдинов. Бюлл. эксп. биол. мед., t.CXI, с.5-7.

11. Parnova R.G., Firsov D.L. (1991) ADH-dependent phosphoinositide signalling system and prostaglandin E production in the frog urinary bladder. Cell. Signalling, v.3, p.135-143.

12. Natochin Yo. V., Parnova R.G., Firsov D.L., Schakhmatova E.I. (1991) Intracellular signalling system in the mechanism of vasopressin action and its modulation/ Const. Congress of Internat. Soc. for Pathophysiology, Moscow, May 28-June 1, 1991, Abstracts, p.221-222.

13. Наточин Ю.В., Парнова Р.Г., Фирсов Д.Л., Шахматова Е.И. (1991) Внутриклеточные сигнальные системы в механизме ацдидиуретического действия вазопрессина. Биол. мембраны, т.8, с.1215-1216.

14. Natochin Yu. V., Parnova R.G. (1991) The role of secondary messengers in mechanism of antidiuretic action of vasopressin. Arch. Intern. Physiol. Biochem. Biophys., v.99, p.P19.

15. Natochin Yu. V., Grigoriev A.I., Noskov V.B., Parnova R.G., Sukhanov Yu.V., Firsov D.L., Schakhmatova E.I. (1991) Mechanism of postflight decline in osmotic concentration of urine in cosmonauts. Aviation, Space and Environ. Med., v.62, p.1037-1043.

16. Parnova R.G., Firsov D.L. (1992) Contribution of phospholipid-derived messengers in the regulation of osmotic water permeability by ADH. Renal Physiol. Biochem., v. 15, p.3-4.

17. Natochin Yu.V., Shakhmatova E.I., Firsov D.L., Parnova R.G., Reznik L.V., Natochin M.Yu., Romanov V.I. (1992) Does the gradual hydroosmotic response to ADH depend on intracellular cAMP accumulation or on the formation of intramembrane particle aggregates? Pflugers Arch., v.422, p.3-8.

18. Фирсов Д.Л., Парнова Р.Г., Наточин Ю.В. (1992) Свободная арахидоно-вая кислота как мессевджер и модулятор в механизме гидроосмотического эффекта вазопрессина. Докл. АН, т.325, с.1252-1254.

19. Firsov D.L., Parnova R.G. (1994) The effect of arachidonic acid on the hydroosmotic action of vasopressin in frog urinary bladder. Biochim. Biophys. Acta, v.1220, p.305-309.

20. Parnova R., Koroleva Т., Shakhmatova E. (1994) Polyunsaturated free fatty acids modulate the antidiuretic effect of vasopressin. Kidney Int., v.47, N2, p.687.

21. Парнова Р.Г., Шахматова Е.И., Королева T.A., Наточин Ю.В. (1994) Длинноцепочечные свободные жирные кислоты как модуляторы гидроосмотического действия вазопрессина. Докл. АН, т.337, с.690-692.

22. Парнова Р.Г. (1995) Роль регуляторных липидов в механизме гидроосмотического действия вазопрессина."Физиология почки и водно-солевого обмена". Симп., посвящ. 100-летию со дня рожд.А.Г.Гинецинского, Новосибирск, 13-15 июня 1995 г., Тез.докл., с.бб.

23. Комиссарчик Я.Ю., Наточин Ю.В., Шахматова Е.И., Снигиревская Е.С., Парнова Р.Г., Королев Е.В. (1995) Ультраструктура эпителиальных клеток мочевого пузыря лягушки при действии вазопрессина и вазолрессин-независимом увеличении проницаемости. Там же, с.44.

24. Парнова Р.Г. (1995) Свободные жирные кислоты как эндогенные модуляторы действия вазопрессина в осморегулирующем эпителии. VI Симп. по биохимии липидов, Санкт-Петербург, З-б октября 1995 г. Тез. докл., с.80-81.

25. Комиссарчик Я.Ю., Наточин Ю.В., Шахматова Е.И., Брудная М.С., Снигиревская Е.С., Королев Е.В., Парнова Р.Г. (1996) Особенности ультраструктуры клеток эпителия мочевого пузыря лягушки при действии вазопрессина и вазо-прессин-иезависимом увеличении проницаемости для воды. Цитология, т.38, N1, е.14-21.

26. Natochin Yu.V., Parnova R.G., Scbakhmatova E.I., Komissarchik Y.Y., Brudnaya M.S., Snigirevskaya E.S. (1996) A VP-independent high osmotic water permeability of frog urinary bladder and autacoids. Pflugers Arch., in press.

27. Parnova R.G., Scbakhmatova E.I., Plesneva S.A., Getmanova E.V., Korolev E.V., Komissarchik Y.Y., Natochin Y.V. (1997) Role of prostaglandin E2 in regulation of low and high water osmotic permeability in frog urinary bladder. Biochim. Biophys. Acta, in press.