Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование рол вторичных месссенджеров в механизме увеличения осмотической проницаемости при действии вазопрессина

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование рол вторичных месссенджеров в механизме увеличения осмотической проницаемости при действии вазопрессина"

Л О 91г

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. If.М.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

ФИРСОВ Дмитрий Леонидович

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ВТОРИЧНЫХ МЕССЭЩЕРОВ В МЕХАНИЗМЕ УВЕЛИЧЕНИЯ ОСМОТИЧЕСКОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ ПРИ ДЕЙСТВИИ ВАЗОПРЕССША

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.13.-ФИЗИОДОГВД ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1991

Диссертационная работа выполнена в ласкэраторни физиологии

физиологии и биохимии им. И.М.Сеченов АН СССР-

Научные руководители -член-корреспондент АН СССР Ю.В.Наточин,' кандидат биологических наук Р.Г.Парнова.

Официальные оппоненты -

доктор биологических наук, профессор М.Н.Перцева; доктор медицинских наук, профессор В.Г.Шаляпина.

Ведущее учреадение - Институт цитологии АК СССР.

Защита состоится «(.$» ноября 1Э9Т года в «К » часов на заседании специализированного совета по . присуждению ученой степени кандидата биологических,наук (К.002.83.01) при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова АН СССР.

Адрес института: 194223, Санкт-Петербург, пр. М.Тореза, ..44.

почки и водно-солевого обмене Института эволюционной

1991 года.

Ученый секретарь специализированного созета кандидат биологических наук

Л.В.Зуева

< ХАРАКТЕР РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В реализации эффектов многих физиологи-Д&<?ки активных веществ (гормоны, не.Тротрансматтеры, факторы роста) на клетки-мишени принимают участие различные системы вторичных посредников, ответственные за осуществление функциональной реакции на внутриклеточном уровне. Известные в настоящее время системы посредников используют в качестве сигнальных молекул циклические нуклеотида (цШ>, цГМФ), инозиттрифосфат, даацилглицерин, Са2+, дростагландины и другие. При этом реакция клетки является результатом взаимодействия всех путей передачи сигнала, акишируемых при действии стимула. В некоторых случаях возбуждение одной из систем вторичных посредников мокет оказывать противоположный эффект на действие других, участвуя таким образом в механизмах обратной регуляции физиологического ответа [ТеЗЛе1Ъаш & ЗЪгаэЬей, 19903. Особенное значение подобное взаимодействие различных сигнальных систем может иметь, по-в1удамому, в осуществлении эффектов тех физиологически активных веществ, для которых нэ существует веществ - антагонистов их функционального действия. К числу таких гормонов относится ва-зопрессин (антидиуретический гормон).

Вазопрэссин в организме наземных позвоночных животных оказывает ряд физиологических эффектов, среди которых обеспечение водно-солевого гомеостаза находится под преимущественным контролем данного гормона. У бесхвостых амфибий, являющихся объектом настоящего исследования, к органам, участвующим в контроле водного баланса, относятся почки , коаа и мочевсй пузырь. В настоящее время изолированный мочевой пузырь амфибий, который может рассматриваться как функциональный аналог собирательных

Сокращения, используемые в тексте: АДГ - антидиуретический гормон (вазопрессин), ФИФ2 - фосфатидешшозитдафосфат, ИТФ - ино-зиттрифосфат, 1,2-ДАГ - I,2-диацилглицерин, ДАГ-липаза - ди-ацилглицерин-липаза, ФЛ - фосфолштады, НЛ - нейтральные липиды, АК (20:4ш6) - арахвдоновая кислота, ФХ - фосфатидклхолин, ФЭА -фссфатидилэтаноламин, МФИ - фосфатидилинозит, ФС - фосфатидил-серин, ФК - фосфатидаая кислота, СЖК - свободные жирные кислоты.

трубок почек млекопитающих, является одним п наиболее популярных объектов в исследованиях регуляции транспорта воды и ионов при действии вазопрессина.

• Физиологический ответ клеток эпителия мочевого пузыря лягушки на вазопрессин выражается в увеличении проницаемости для еоды их апикальной мембраны. Исследования механизма действия гормона, проводимые в течение последних тридцати лет, показали, что вторичным посредником, ответственным за увеличение осмотической проницаемости является цАМФ [Orloff & Handler, 1962]. Однако, вопрос об участии других систем вторичных посредников в действии вазопрессина, их вкладе в развитие функциональной реакции, проблема их взаимодействия оставались неизученным!. Мевду тем, участие сигнальных молекул, отличных от цАМФ, в реализации ответа на вазопрессин подтверждается рядом косвенных данных [Schlondorff & Satrlano, 1985; Yorio, '19891. Кроме того, в организме модуляция действия вазопрессина осуществляется и со стороны таких физиологически активных, веществ, как стероидные гормоны, простагландины, катехоламины, причем реализация их эффектов такке может осуществляться посредством. активации. иных систем вторичных посредников. Таким образом, исследование значения различных сигнальных систем в реализации реакции на вазопрессин позволило-бы расширить представления о механизмах антидиуретического эффекта этого гормона на клетки осморегулирукщего эпителия.

Цели и задачи исследования. Целью работы было исследование участия и роли различных систем вторичных посредников в механизме увеличения осмотической проницаемости при действии вазопрессина. Основное внимание было уделено сигнальным молекулам, предшественниками которых являлись липиды. Соответственно были поставлйны следующие задачи:

1. Исследовать возможность участия к роль фосфоинозитидной■ системы передачи-сигнала в механизме действия Вазопрессина на осмотическую проницаемость стенки кочевого пузыря лягушки.

2. Изучить возможную роль свободной арахидоновой кислоты. как вторичного посредника в механизме регуляции, ос!готической проницаемости клеток, эпителия, .определить место ее действия в цепи

передачи сигнала, а также выявить источники е8 высвобождения. 3. Исследовать проблему взаимодействия изученных систем вторичных ^средников, участвующих в модуляции функциональной реакции на вззопрессин.

Научная новизна работа. Впервые показано, что в мочезом пузыре лягушки при действии" вазопрессина активируется гидролиз ФИФ2 фосфолипазой С с образованием 1Ш? и 1,2-ДАГ, сопровождающийся высвобождением свободной арахидоновой кислоты. Установлено, что данные сигнальные молекулы (инозиттрифосфат, арахи* "■•новая кислота, 1,2-диацилглицерин) выполняют функцию негативных регуляторов осмотической проницаемости стенки мочевого пузыря амфибий, причем выделяющаяся арахидоновая кислота служит предшественником биосинтеза простагландинов и обладает функциональными эффектами как самостоятельный модулятор гормональной реакции. Исследование потенциальных источников высвобождения арахидоновой кислоты показало, что еб основное количество происходит преимущественно из фосфатидилэтаноламина; небольшая часть арахидоновой кислоты высвоОоздаегся из 1,2-диацилглицерина, образующегося при гидролизе ФИФ2 фосфолипазой С. Показано, что одним из следствия активации фосфоинозитидной системы передачи сигнала является усиление биосинтеза простагландша Е.

Полученные результата вносят склад з развитие представлений о внутриклеточных механизмах реализации гормональных реакций. В сочетании с данными литературы они расширяют возможность построения модели функционирования различных систем передачи сигнала в процессе увеличения осмотической проницаэмости клеток осморегулирущего эпителия при действии вазопрессина. Практическое значение работы. При патологии почки одним из наиболее частых и-тяжелых поражений её функции является нарушение процесса осмотического концентрирования мочи. Полученные результаты, касающиеся роли вторичных мессенджеров в механизме реализации стимулируемой вазопрессином функциональной реакции, дают возможность поиска новых подходов для углубления представлений о нарушениях функции почек при ряде заболеваний, а тем самым и поиска новых способов коррекции наблюдаемых нарушений. Апробация работы. Результаты, полученные в настоящей работе,

- А ~

были доложены на III Всесоюзной: школе по эволюции биосистем (Ленинград, 1989), сатвллитном симпозиуме Тубуло-ингерстицк-альные расстройства" II-го Международного конгресса нефрологов (Иркутск, 1990), Международном конгрессе патофизиологов (Москва, 1991).

Публикации. По теш диссертации опубликовано 4 статьи. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, вклотаюцэго /источника. Работа изложена на l¡6 страницах, содержит рисунков и^ таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И METO® ИССЛЕДОВАНИЙ Объект исследования. В качестве объекта исследований была выбрана травяная лягушка Rana temporaria I.. Отловленные в* естественных условиях животные выдерживались до постановки опытов в условиях вивария при температуре 6-8'С. Для исследования отбирали взрослых особей без разделения по полу. Выделение препаратов мочевых пузырей лягушек и измерение транспорта вода. Выделение препаратов мочевых пузырей. лягушек и из-

мерение штока воды по осмотическому градиенту через стенку мочевого пузыря проводили по методу tBentley, 19581 в модификации Шэтотан, 19633. Раствор Рингерз с серозной сторонк препаратов содеркал (мМ): KaCl, III; СаС12, 0.8; NaHCOg, 2.4; глюкоза, 5.5; (рН 8.'0), с мукозной стороны имел разведение 1:10.-Приготовлвние лишдных экстрактов и хроматографическое разделение липидов. Общую* экстракцию лкпвдов проводили по методу ü'olch-Pi et al., 1957], экстракцию фосфоинозитидов смэсыо растворителей хлороформ:метанол:НС1 (200:100:1). Отдельные классы фосфолшидов'выделяли двумерной хроматографией в тонком

• слое сшккягеля на стеклянных пластинках 13x18 см или 6x6 см в системах растворителей:- I - хлороформ:метанол: 28% аммиак (6.5:2.5:0.5, по объему), II - хлороформ:ацетон:мвтанол:уксус-ная кислота:вода (5.0:2.0:1.0:1.0:0.5, по.объему). Фосфоинози-тады разделяли на пластинках бхв см. в системе растворителей н-нропшэл:4,'н аммиак (2:1, по объему).. Выделение 1,2-ДАГ и СЖК

проводили в системе растворителей гексан: даэтиловый эфир:уксусная кислота (55:19:1.5, по объему).

Получение и разделение метиловых эфиров жирных кислот ФЛ, СЖК и 1,2-ДАГ. Метиловые эфира жирных кислот ФЛ и 1,2-ДАГ получали щелочным метилированием в смеси растворителей хлороформ:0.21 н NaOH на абсолютном метаноле .(2:1), СЖК - кислым метилированном в 6% HCl на абсолютном метаноле. Смесь метиловых эфиров жирных кислот разделяли на газо-жидкостяом хроматографе PYE-I04 (Англия) с пламенно-ионизационным детектором в присутствии внутреннего стандарта (ионол). Колонка для разделения - 15% диэтиленгликольсукцинат, нанесенный на хромосорб W. Определение содержания меченых инозитфосфатов, 1,2-диацилглице-рина и фоефоинозитидов в ткани мочевого пузыря лягушки. Выделенные мочевые пузыри лягушек преданкубировали в течение 60 мин с 10 мкКи/мл [33P3Kí^P04 с последующей гомогенизацией ткани, экстракцией и хроматографическим разделением фоефоинозитидов. Изменение содержания фоефоинозитидов оценивали по изменению радиоактивности в соответствующих ' зонах на хроматэграфических пластинках. Содержание ИТФ оценивали двумя способами - (I) предварительным мечением мочевых пузырей с 200 мкКи/мл мио-[2-3НЗинозитолом и последующим анализом водорастворимых продуктов анионо-обменной хроматографией [Berridge, 1983] и (2) радиоиммунологическими наборами D-mj/o-inositol 1,4,5-trisphosphate l^U assay system (Amershan). Изменение содержания 1,2-ДАГ оценивали по радиоактивности после предварительной инкубации пузырей с 4 мкКи/мл С3Н]арахидоновой кислотой и последующим разделением липидов тонкослойной хроматографией. Определение содержания простагландина Е. Определение содержания простагландина Е проводил15 в стенке мочевого пузыря и в окружающем серозном растворе радиоиммунологическими наборами (Dade, 3axter Travenol Diagnostics Inc.).

Определение активности 1,2-ДАГ-липазы. Определение активности 1,2-ДАГ-липазы проводили по методу СBell et al., 19791. Субстратом для реакции служил 1-стеароил-2-[1-14С]арахидонош1-зп-глицерин.

РЕЗУЛЬТАТЫ К ОБСУЖДЕНИЕ Роль фосфоинозитидной сигнальной системы в реализации гидроос-котического эффекта вазопрессина на мочевой пузырь амфибий. По современным представлениям функционирование фосфоинозитидной системы передачи сигнала заключается в рецептор-зависимой активации фермента фосфолипазы С с последующим гидролизом минорного фосфолипида фосфатидилинозит-4р5-дифосфата (ФИФ^) на две сигнальные молекулы - инозит-1,4,5-трифосфат (ИТФ), активирующий 2+

выход ионов Ca из внутриклеточных запасов, и 1,2-диацилглицерин, стимулирующий протеинюшазу С CBerrldge, 1984; Nlshizuka, 19843. Для исследования участия фосфоинозитидной системы передачи сигнала е механизме реализации гидроосмотического эффекта вазопрессина на мочевой пузырь лягушки было необходимо определить изменение содержания iHig, ИТФ и.1,2-ДАГ при действии гормона. Мы обнаружили, что через 20 с после добавления гормона на 13Ж по сравнению с контролем активируется гидролиз [ Р]ФШ>2, в 1.7 раза увеличивается содержание С3ШИТФ и в 1.4 раза содержание 1,2-ДАГ, меченного ¡^З-арахвдоновой кислотой (рис.1). Эти данные указывали на то, что в ткани мочевого пузыря- амфибий при действии вазопрессина активируется фосфо-инозитидная система передачи сигнала, однако еб роль в реализации функционального ответа оставалась не ясной. Для исключёния участия данной сигнальной системы из общего механизме реализации гормональной реакции нами был использован специфический блокэтор гидролиза фосфоинозитидов - неомицин [Williams & Schacht, 19861. -

При исследовании злияния неомицина на вызванный вазо-прэссином поток вода через стенку мочевого пузыря лягушки, было обнаружено, что преданкубация пузырей в растворе неомицина I0~5-I0~4 M в течение 30 мин вызывает увеличение потока вода в присутствие гормона на 30% по сравнению с контрольными пузырями (рис.3). В широком интервале используемых концентраций его действие оказывается различным: преданкубация в растворе 10" M не оказывает эффекта на действие гормона, тогда как M достоверно сникает функциональную реакцию, что связано, по-Биди.'.ому,-с токсический действием высоких доз данного вещества.

: 1.оо

0.50

'ело

КОНТР НЕО АДГ АДГ НЕО

ИТФ

КОНТР НЕО АДГ АДГ

н!о

Рис.1. Рис.2.

Рис Л. Кинетика вызванного вазопрэссином. гидролиза [33Р]ФИФ2, образования (ЗшИТФ и С^ИП ,2-ДАГ в ткани мочевого пузыря лягушки. Значения являются средним в экспериментов. Рис.2. Влияние неомицина (нео) на вызванный вазопрессином гидролиз [33РШФ2 и образование ИТФ. Пузыри !феданкубировали в течение 30 мин в отсутствии или присутствии 10 М неомицина и, затем подвергали действию вазопрессина (Б мед/мл) в течение 20с.

Значение радиоактивности ФИФ2 отнесено к количеству липид-ного фосфора в пробе. Значения являются средним 5 экспериментов.

О Т5 30 45

мин

Рис.3. Влияние неомицина на вызванный вазопрессином поток вода по осмотическому градиенту через стенку мочевого пузыря лягушки. Перед добавлением вазопрессина (1.5 мед/мл) пузыри инкубировались 30 мин в отсутствии (■) или присутствии Ю"5 М (о), Ю-4 М (V), 1СГ3 М (Л) неомицина. Значения потока вода являются средним 10 экспериментов. Различия в индивидуальных значениях не превышали 5% от среднего.

Для проверки того, что неомщин действительно блокирует фосфоинозит'идный путь передачи сигнала в ткани мочевого-пузыря лягушки, параллельно измерениям функциональных изменений, были проведены исследования влияния данного вещества на содержание ИТФ и Ф®>2 при действии вазопрессина. Оказалось, что неомициа в концентрации Ю-5 М полностью блокирует гидролиз ФИФ- и ИТФ на 2С-й сокугде действия гормона (рис.2), что является подтверждением "выключения" данного пути передачи сигнала из общего пути реализации функциональной реакции.

Таким образом, на . основании, проведенных исследований можно сделать вывод о том, что в механизме реализации гидроос-котаческого эффекта вазопрессина на мочевой пузырь лягушки участвует фосфошгозитидяая система'передачи, сигнала, причем е§

роль заключается в модуляидк или обратной регуляции функциональной реакции.

Взаимосвязь активации фосфоинозитидаой сигнальной системы и усиления биосинтеза простагландинов. Одними из активнейших модуляторов функциональной реакции клето'с осморегулируюшего эпителия ка вазопрессин являются простагландина [Burch & Halush'v-i, 19821. Как известно, процесс высвобождения арахидоновоЛ кпплоты (АК), являющейся предшественником биосинтеза простагландинов (ПГ) , может осуществляться посредством двух основных механизмов - (I) действия фосфолипазы А2, отщепляющей молекулу АК преимущественно из второго положения глицеринового основания фосфолипида и (2) последовательным расщеплением ФЛ ферментом фэсфолилазой С, а затем даацилглицерин-липазой, высвобождающей АК из молекулы ДАТ [Hozara et al., 1991].

С целью изучения возможной взаимосвязи между процессами активации гидролиза ФИФ2 и усиления секреции простагландинов исследовалось влияние неомицина на стимулируемый вазопрессином синтез ПГЕ в ткани мочевого пузыря лягушки и его секрецию в окружающий серозный раствор, в результате проведенных исследований было обнаружено, что вазопрессин вызывает значительное, в 3.5 раза, увеличение содержания ПГЕ з серозном растворе, тогда как в стенке мочевого пузыря достоверных изменений не происходило (таблЛ). Эти данные указывают на то, что действие вазо-прессина заключается, по-видимому, не в увеличении секреции ПГЕ, накопленного в клетке, а в усилении его образования de novo. Преданкубация пузырей в растворе Рингера, содержащем Ю-5 М неомлцина, недостоверно повышает содержанке ПГЕ в серозном растворе, однако значительно, на 55%, ингибирует его образование в присутствии 2 мед/мл вэзопрессина. Таким образом,действие неомицина выражается в значительном уменьшении вызванного вазопрессином образования ПГЕ.

Приведенные данные свидетельствуют о существовании взаимосвязи функционирования двух систем передачи сигнала, активируемых при действии вазопрессина в ткани мочевого пузыря амфибий - фосфоинозитидной системы передачи сигнала и системы активации биосинтеза простагландина Е.

Табл.1. Действие вазопрессина на содержание ПГЕ в ткани мочевого ггузыря лягушки и окружающем серозном растворе, в присутствии и отсутствии неомицина.

Воздействие

ПГЕ (пкмоль/мг белка мин)

ткань пузыря серозный раствор

Контроль 4.83 ± 0.49 З.Т8 ± 0.82

несмицин (10~5 М) - 4.79 + 0.93

АДГ (2 мед/мл) '"4.73 ±-0.41 ,13.72 ± 2.50

неомицин (Ю-5 М) 3.88 ± 0.63 8.59 ± 0.93

+

АДГ 12 мод/мл)

Содержание ПГЕ в серозном растворе рассчитывалось на количество белка -ткани пузырей, инкубируемых в данном растворе. Значения являются средним 8-12 экспериментам.

Исследование участия даацилглицерин-лшйзы в процессе высвобождения "АК при-действии вазопрессина. Одним из потенциальных источников свободной АК является 1,2-ДАГ, образующийся при действии фосфолшазы С на Ф®2, несмотря • на его значительно более низкое содержание по- сравнению с фосфолипндами. Для проверки того, что реакция высвобождения АК из 1,2-ДАГ .находится под контролем вазопрессина, была проведена серия опытов, в которой измерялась активность ДАГ-лшазы гомогената мочевых пузырей при использовании в качестве субстрата 1-сте8роил-2-[14С1.зрахидоно-ил-эп-глицерина (радиоактизномеченного по арахидоновой кислоте '.1,2-ДАГ).. Методом газо-жидаостной хроматографии определяли содержание и состав жирных кислот,-высво^оадающихся в проводимых как в присутствии, так и отсутствии вазопрессина реакциях. Результаты дажгнх исследований показали, что при действии гормо-

< ,о

5

я

(Д

о

га о

90

80

70

-е-.

-а-

10

15

20

мин

Рис.4. Кинетика изменения

гиг

радиоактивности свободной [ СШ, высвобождаемой из 1-сгеароил-2-С1-^4С1зрахидоноил-зп-глицерина в результате реакции ДАГ-липазы. Каждое значение является средним 10 экспериментов и выражено по отношению к контролю, принятому за 100%. Отличия в индивидуальных значениях не превосходили' 5% от среднего.

на относительное содержание свободной АК в гомогенате менялось с 13.3% до 17.1?, абсолютное количество АК увеличивалось на 0.5 нг/мг белка гомогената за время действия гормона. Кинетическая зависимость высвобовдения меченой АК представлена на рис.4 (контрольный уровень принят за 100%). Как следует из графика, после двух минут действия гормона значение радиоактивности уменьшается на 20% и далее остается неизменным, кажущееся противоречие между химически измеренным увеличением содержания. АК и падением радиоактивности высврбодившейся АК в результате действия ДАТ-липазы объясняется эффектом "изотопного разбавления" меченого субстрата эндогенным 1,2-ДАГ, образующимся в результате гидролиза ФЖь>2 фосфолипазой С.

Для исследования.происхождения 1,2-ДАГ, являющегося субстратом для высвобождения АК, была измерена активность ДАТ-

липазы при блокаде гидролиза неомицином. Из представленных на рис.5 данных видно, что, хотя неомицин нес Рачительно повышает базальный уровень ферментативной активности, вазопресскн на активирует высвобождение АК из 1,2-ДАГ в присутствии неомицша. Таким образом, интенсивность реакции ДАТ-липазы в стенке мочевого пузыря лягушки зависит, по-видимому, от увеличения содержания субстрата - 1,2-ДАГ, уровень которого, в свою очеоэдь, контролируется опосредованным гормоном гидролизом ФИФ2. Эти данные подтверждаются результатами экспериментов с использованием специфического ингибитора реакции фосфорилирования 1,2-ДАГ до фосфатидной кислоты (реакция ДАГ-киназы). Данный ингибитор (1155022), увеличивая количество 1,2-ДАГ, метаболизируемого по

ДАГ-липазному пути, в концентрации 10 400

а

к <

ш и £

300 200 100

1 0

§•-100 I

лг -200

Е

£-300

нь

М значительно стимули-

ГЩ?-

Й59022

Контр АДГ А^Г

нео АДГ ■ +

СррЖр Нво

А|1Г

Й59022

Рис.5. В^лянио различных веществ на реакцию ДАГ-липазы в гомо-генаге молевого пузыря лягушки. срмк, срм^ являются счетом радиоактивности ё минуту в контроле и при действии стимула, соответственно. Гомогенат преданкубировался в течение 5 мин с 5» Ю-5 М СррШр, Ю-5 М неомицкна (нео) или Ю-5 М Н5Э022, после чего подвергался действию вазопрессина (ТО мед/мл) в течение 12 мин. Результаты являются сродним 8 экспериментов.

рует базальшй уровень активности ДАГ-лшазы и увеличивает высвобождение АК из 1,2-ДАГ при действии вазопрессина (рис.5).

Полученные данные свидетельствуют о том, что действительно 1,2-ДАГ, высвобождаемый в процессе вазопрессин-стимулируемого гидролиза является одним из источников

свободной АК.

Участие свободной арахидоновой кислоты в процессах модуляции функциональной реакции клэток осморегулирующего эпителии на вазопрессин. Из "исследований последних лет, проводимых на различных объектах стало очевидно, что свободная АК может оказывать свое функциональное воздействие не только в качестве пред-, шественника биосинтеза прсстагландинов, но и как самостоятельный вторичный посредник, осуществляющий различные эффекты на клетку [Ахе1гос1 е1; а!., 1988]. На клетках осморегулирующего эпителия участие и роль свободной АК в реализации гидроосмотической реакции на вазопрессин до настоящего времени изучены не были. В исследованиях, проводимых на мочевом пузыре лягушки, мы обнаружили, что экзогенная свободная АК в широком диапазоне концентраций (10~8-10~5 М) оказывает значительный ингибирующий эффект на развитие функционального ответа на вазопрессин (рис.7). Кинетическая зависимость увеличения потока вода по осмотическому градиенту в присутствии вазопрессина и 10~6 М свободной АК представлена на рис.6. Для проверки того, что АК оказывает свое влияние как самостоятельный эффектор, а не действует посредством увеличения биосинтеза простаглэндинов и других типов эйкоззновдов, нами были использованы специфические блока-торы циклоокситеназного и липоксигеназного путей метаболизма АК - индометацин и нордигидрогиуаретиковая кислота, соответственно.

Как следует из данных, представленных на .рис.8 , применение обога блокаторов не снимало иншЗирувдего действия АК. Сам по себе индометацин увеличивал, а нордигидрогиуаретиковая кислота снижала уровень ответа на гормон, что свидетельствует об участии просгагланданов и продуктов липоксигеназного окисления АК в регуляции осмотической проницаемости эпителия при действии вазопрессина, что также подтверждается литературными

1.50

14 -

15 30 45 60 75 90

МИН

л-6

Рис.6. Влияние АК (2-10 М) на вызванный вазопрессином поток воды по осмотическому градиенту через стенку мочевого пузыря амфибий. Результаты являются средним 10 экспериментов. '

и 120

5 юо

к

«Д СО

ЬЙ О

80 60 40 20 О

1.8

1.8

1.8

1.8

[АК]

1<Г8М 10~7М 10"6МЮ"5М

3'ис.7. Влияние АК в различных концентрациях на осмотический поток ьоды чор^з стенку мочевого пузыря лягушки. По оси абсцисс ог.'южены значения отношения потока ' воды при стимуляции вазопрессином присутствии АК к потоку вода, вызванному только гн'кчфисоиная. Результаты является средним 10 экспериментов. .

g 300

п 200

«Г

И 100

Ш

I о

a?

- 15

1

АДГ АДГ АДГ АДГ Л£Г АК ETYA АК АК

ИНДОНДГК

Рис.8. Влияние свободной АК (2-Ю-6 М) на вызва1шый вазопресси-ном ноток вода по осмотическому градиенту в присутствии индоме-тацина (Ю-5 М) (ЩДО) и нордигидросиуаретиковой кислоты (10~?М) (НДГК). Влияние 5,8,11,14-айкозатетраиновой кислоты (Б-КГ%) (ETYA) на функциональную реакцию на вазопрестош. Эффект ара-хидоновой кислоты принят за 1003. Результаты являются средним 10 экспериментов.

данными [Albert & Handler, 19741. Кроме того, близость эффекта АК с действием 'нёгидролизуемого аналога - 5,8,11,14-эйкозатетраиновой кислоты также • подтвердило самостоятельную роль свободной АК, катодного из модуляторов гидроосмотической реакции на вазопрессин. Однако, оставалось не ясным,на каком этапе в цепи передачи гормонального сигнала оказывает свое влияние АК.

Для выяснения данного вопроса наш били применены- два подхода -. (I) исследование влияния свободной АК на гидроосмотическую реакцию мочевого пузыря, вызванную непосредственно цЛМ1> в присутствии ингибитора фосфодиэстеразы циклических нуклооти-дов - изобутилметилксаятина и (2) изучение влияния свободной АК на фужциональнйй ответ, вызванный прямой-активацией cJ ДОН »'ЛУГ" циклагн форсколином.' В данных экспериментах Сило установлено.

3.00 = 2.50 -

Е •

о

5 1.50 -£

1-00 -

X

0.50 -

0.00

0

Рис.9. Влияние свободной АК на гидроосмотическую реакцию мочевого пузыря лягушки, вызванную цАШ и ИБМК. Результаты являются средним ГО экспериментов.

что свободная АК не оказывает своб ингибирувдее действие на гидроосмотическую реакцию мочевого пузыря лягушки, вызванную цАШ1 (ряс.9), а е5 эффект на реакцию, стимулируемую форсколи-ном, выражался в не достоверном снижении функционального ответа. Эти данные указывают на то, что свободная АК сказывает свое действие на этапах, предшествующих образованию цАМФ - посредника, ответственного за увеличение проницаемости для воды клеток осморегулирукщего эпителия при действии вазопрессша.

Таким образом, результаты, представленные в данном разделе, свидетельствуют об активной роли свободной арахидоновой кислоты в процессах модуляции функционального ответа клеток осморегулирувдего эпителия на вазопрессин. Однако, оставалось не ясным, происходят ли данные реакции in vivo или же наблюдаемые эффекта связаны исключительно с присутствием экзогенной свободной АК. Для ответа на данный- вопрос было необходимо оценить количество свободной АК в ткани мочевого пузыря лягушки, а таете определить источники «О высвобождения при действии вазо-

30

60

без АК

2 мкМ АК

90

120 МИН

прессина.

Определение содержания свободной арахидоновой кислоты и источников ей высвобождения в ткани мочевого пузыря лягушки при действии вазопрессина. Для оценки содержания свободной АК в ткани мочевого пузыря, а таете изучения основных источников АК, высвобождающейся при действии вазопрессина, исследовались изменения яирнокислогаого состава свободных жирных кислот (СЖК), фофсолипидов, нейтральных липидов и. окружающего пузыри

Табл.2. Содержание свободных жирных кислот в ткани мочевого пузыря лягушки яри действии вазопрессина-

СЯК

15:0 16:0 16:1 17:0 18:0 18:1 18:2 20:0 21:1 .20:4и£ 20:

20:5и.4 22:4ш£ 22:5со£

СЖК нг/мг белка ткани

К

Г

19.9 ± 0.7 19.1 л 1.2

211.9 ± 12.6 244.1 ± 37.3

35.8 ± 5.6 26.3 ± 3.0

14.4 ± 1.6 16.5 ± 1.6

93.3 ♦ 2.6 153.7 ± 22.0

87.6 ± 15.3 73.2 ± 3.5

53.7 ± 15.5

11.9 ± 1.5

15.Т ± 2.6

18.6 ± 1.2

13.5 ± 2.2

6.8 ± 1.0

23.4 ± 4.8

19.7 ± 8.1

57.5 ± 6.2

25.4 ± 3.3

15.7 ± 2.7

33.3 ± 3.9

6.2 - 1.6

8.3 ± 1.1

21.7 ± 5.9

21 .1 ± 3.0

Н.Д. Н.Д. Н.Д. Н.Д. <0.05 Н.Д. Н.Д. <0.01 Н.Д. <0.01 <0.05 Н.Д. Н.Д. Н.Д.

% от суммы СЖК

К

Г

2, 30, 5. 2. 13. 12. 7. 1. 2. 3. 1. 0. 3. 2.

,8 ± 0.2

1 ± 1.7

3 ± 1.2 О ± 0.1

4 ± 1.2

5 ± 1.1

5 + 1.6 7 ± 0.2

2 ± 0.3

6 ± 0.9

7 ± 0.3 9 г 0.2

3 ± 0.5 3 ± 1.0

1.9 ± 0.6 28.4 ± 1.5

3.2 4 0.3 2.0 ± 0.2

19.2 ± 3.4 10.4 ± 0.4 10.0 ± 2.0

2.3 ± 0.7 1.8 ± О.г ■3.9 0.6 0.9 ± 0.2 1 .0 ± 0.2 2.7 ± 0.3 2.5 ± 0.<

В таблице представлены данные о всех СЖК, превосходит 0.5% от суммы Есех СЖК. Результа1 4 экспериментов. Н.Д.- отличия. недостосерны

количество которых гы являются соеднкм

серозного раствора.

Данные об абсолютном и относительном содержании СЖК ткани мочевого пузыря лягушки представлены в Табл.2. В связи с тем, что измеренное содержание свободной АК в серозном растворе составляло не более I% от АК в ткани и не менялось при действии гормона, в дальнейших расчетах концентрация АК в серозном растворе не учитывалась. Как следует из Табл.2, достоверные изменения абсолютной величины СЖК при действии гормона наблюдаются для С20.4ш6, С20:0, С18;0 (увеличение) и С2С.4ш3 (уменьшение), причем увеличение составило 15 нг/мг белка. Исходя из

этой величины, оценочное значение концентрации свободной АК в ткани пузыря составило 4- Ю^М в отсутствие гормона и 7-КГ7М при действии вазопрессина. Эти данные в сравнении с концентрационной зависимостью действия экзогенной свободной АК (Рис.7)

Табл.3. Абсолютное содержание арахидоновой кислоты в фосфолипи-дах и I,2-даацилглицерине в ткани мочевого пузыря лягушки при действии вазопрессина.

с20:4и6 • нг/мг °9Лка Липид--А р

Контроль АДГ (10 мин)

ФЭА 23Т9 £ 158 1783 ± 89 596 <0.01

ФХ 1087 £ 48 1031 + 32 56 Н.Д.

ММ 408 ± 16 372 ± 19 35 н.д.

. ФС 426 ± 28 347 ± 41 79 Н.Д.

. ФК 22.5 ± 4.5 13.2 ± 1.3 9.3 Н.Д.

ДАТ 3.4 0.4 1.9 ± 0.3 . 1.5 <0.01

Результаты являются средним 6 экспериментов. Н.Д.- отличия не-достовзрпы.

указывают на то, что- в клетках осморегулируюцего эпителия АК действительно может выполнять функцию вторичного посредника, участвующего в механизмах модуляции ответа на вазопрессин.

Потенциальными источниками свободной АК в любой животной клетке служат фосфолипиды и нейтральные липида, причем наиболее эффектигчыми механизмами е9 высвобождения являются действие фосфэлипа?ч А2 на фосфолипиды и действие ДАГ-липазы на 1,2-дивцилглицерин. Во многих случаях, действие фосфолипазы А2 оказывается предпочтительным к одному из классов ФЛ ШаЪайеуарра & Но1иЬ, 19863. Таким образом, исследование изменений нирнокис-лотного состава при действии вазопрессша в основных классах фосфолипидов ФХ, ФЭА, МФИ, ФС и ФК, а также в 1,2-ДАГ, может дать ответ об основных источниках и количествах высвобождаемой АК в ткани мочевого пузыря. Данные об абсолютном изменении содержания АК в липидах мочевого пузыря представлены в Табл.3 , из которой следует, что достоверные изменения содержания АК происходят только в одном классе фосфолипидов - ФЭА и в 1,2-ДАГ, причем потеря АК в 1,2-ДАГ составляет менее I% от потери АК в ФЭА. Эти данные позволяют предположить, что основным источником свободной АК в ткани мочевого пузыря амфибий является ФЭА и, в значительно менмей степени, 1,2-ДАГ, однако вопрос о конкретных механизмах высвобовдения АК из ФЭА остается открытым.

ВЫВОДЫ.

I.- При действии вазопрессина на мочевой пузырь ляг-ушки активируется гидролиз фосфагидилинозит-4,5-дифосфага с образованием инозиттрифосфата и 1,2-диацилглицерина. Блокада гидролиза ФМФ2 неомицином (10~5-10~4 М) вызывает усиление эффекта Еазопр&ссина на Еодную проницаемость, что свидетельствует об участии фосфо-инозитидного пути передачи сигнала в механизме обратной регуляции действия гормона.

2. Вазопрессия в изолированных мочевых пузырях лягушки стимулирует секрецию в раствор у серозной оболочки простагландина Е. Блокада гидролиза ФИФ2 неомицином (10~5 М) приводит к снижению количества секрвтируемого ПГЕ на 55%, что указывает на то, что в значительной степени стимуляция синтеза ПГЕ в мочевом пузыре лягушки зависит от активации фосфоинозитидаого ответа.

3. Под влиянием вазопрессина в стенке мочевого пузыря лягушки увеличивается содержание свободной арахидоновой кислоты (АК) на 15 нг/мг бежа ткани, при этом снижение абсолютного содержания АК обнаружено в фосфатидилэтаноламине (на 28.8%) и 1,2-ДАГ (на 44.1%). Показано, что АК высвобовдается из 1,2-ДАГ в результате активации ДАГ-липазы, причем субстратом для нее служит, главным образом, 1,2-ДАГ, образующийся при в а зопре ссинстшулируемоь. гидролизе ФМФ2; механизм высвобождения АК из ФЭА обусловлен, вероятно, активацией фосфолипазы А2-

4. Арахидоновая кислота в клетках осморегулирующего эпителия оказывает влияние не только как предшественник биосинтеза эйко-заноидов, но и самостоятельный вторичный посредник, образующийся при действии вазопрессина. Эффект экзогенной арахидоновой кислоты ь концентрациях, сравнимых с количеством АК, высвобождающейся в ткани в результате действия гормона (Ю^-КГ® М), выражается в значительном снижении гвдроосмотической реакции на вазопрессин, что указывает на еб участие в механизме обратной регуляции гормонального эффекта.

5. Арахидоновая кислота не влияет на величину осмотического потока вода, вызванного добавлением форсколина или цАМФ в присутствии 1-метил-З-изобутилксантина. Следовательно, арахидоновая кислота оказывает ингибирующий эффект на этапах, предшествующих образованию цАМФ.

6. Полученные данные свидетельствуют о том, что увеличение проницаемости для воды вазопрессином обусловлено участием нескольких сигнальных.систем: цАМФ обеспечивает возрастание осмотической проницаемости, а действие других вторичных посредников (ИТФ, 1,2-ДАГ, АК, ПГЕ) заключается в модуляции или обратной регуляции гормонального эффекта.

/

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Ю.В.Наточил, Р.Г.Парнова, Л.В.Резник, В.С.Сааков, Д.Л.Фирсов, Е.И.Шахматова. Вторичные мессендаеры в механизме увеличения проницаемости для вода под влиянием вазопрессина. // Тезисы ^окладов VIII-й Всесоюзной конференции по физиологии почек,и вог'о-солевого обмена, г.Харьков, 1989, стр. 142-143.

2. Д.Л.Фирсов, Р.Г.Парнова, А.Л.Берман. Участие фосфо-инозитидов в клеточном механизме антидиуретического действия вазопрессина. // Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Механизмы действия гормонов", г.Суздаль, 1939, стр. 198.

3. Ю.В.Наточин, Р.Г.Парнова, Л.В.Резник, М.Ю.Наточин, Д.Л.Фирсов, Е.И.Шахматова. Влияние вазопрессина на осмотическую проницаемость стенки мочевого пузыря лягушки и содержание в ней цАМФ, цГМФ, и инозиттрифофсата. // Физиологический журнал СССР,1989, Т. 75, N 5, стр. 702-708.

4. Р.Г.Парнова, Д.Л.Фирсов. Увеличение гидроосмотического эффекта вазопрессина при угнетении неомицином гидролиза фос-фатидилинозит-4,5-дифосфата. // Доклады Академии наук СССР, 1990, Т. 310, N 4, стр. I0I3-I0I5.

5. Р.Г.Парнова, Д.Л.Фирсов. Инозигрифэсфат и диацилгли-церол как вторичные посредники в механизме увеличения осмотической проницаемости под влиянием вазопрессина. // Тезисы докладов V-й Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия ме-диаторных процессов", г.Москва, 1990, стр.221.

6. Ю.В.Наточин, Р.Г.Парнова, Д.Л.Фирсов, Е.И.Шахматова. Вторичные мессендаеры и простагланданы в механизме антидиуретического действия вазопрессина. // Тезисы докладов сателлит.о-го симпозиума 11-го Международного конгресса нефрологов "Тубу-ло-интерстициальные расстройства", г.Иркутск,1990.-

7. Р.Г.Парнова, Д.Л.Фирсов. Стимуляция вазопрессином гидролиза фосфатидилинозит-4,5-дифосфаха и его связь с биосинтезом простагландинов. // Билл.энсп.биол.мед., 1991, Т. CXI, К 16, стр. 5-7.

8. .Yu.V:Natochln, B.G.Parnova, D.L.Firsov, E.I.Shatfuna-• tora.-..Intracellular signalling system in the mechanism oí vaso-

pressin action and Its modulation. // Abstracts oi Constituent Congress International society for pathophysiology, Moscow, 1991, p. 221.

9. Yu.V.Natochin, R.G.Parnova, L.V.Reznik, D.L.Firsov, E.I.Shakhmatova. Vasopressin action and cAMP, cGMP and Inositol triphosphate contents In amphibian urinary bladder. // Abstracts of XXXI Congress' of IUPS, Helsinki, 1989, p. 493.

10. R.G.Parnova, ■ D.I.Flrsov. ADH-dependent phospholno-sltide signalling system and prostaglandin E formation In the frog urinary bladder. // Cellular Signalling, 1991, V.3, N 2, p.p.. 135-143.

PTII IHH$,saK.903,Tup.100, y».-03«.Ji.I;3A-199Ir. BecmiaTHO