Исследование путей реализации апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием УФ-света и активных форм кислорода

Трубицына, Мария Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование путей реализации апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием УФ-света и активных форм кислорода
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование путей реализации апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием УФ-света и активных форм кислорода"

На правах рукописи

Трубицына Мария Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПУТЕЙ РЕАЛИЗАЦИИ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, ИНДУЦИРОВАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЕМ УФ-СВЕТА И АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА

Специальность 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□34В1372

Воронеж-2009

003481372

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Артюхов Валерий Григорьевич

доктор биологических наук, профессор Пелевина Ирина Ивановна

доктор биологических наук, профессор Епринцев Александр Трофимович

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии

Защита состоится 20 ноября 2009 г. в 13.30 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан « 19» октября 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

М.Ю. Грабович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гибель клеток в результате апоптоза — основное свойство практически всех клеток (M.D. Jacobson et al., 1997). Это обязательный процесс нормального развития органов, тканевого гомеостаза, развития нервной системы и регуляции иммунной системы. Недостаточная или избыточная гибель клеток ведет к различным заболеваниям человека, включая злокачественные образования, дегенеративные заболевания, иммунодефицитные состояния (C.B. Thompson, 1995). Высокая степень координации и стереотипность процессов индуцированной гибели клеток свидетельствуют о том, что клетки активируют типовую программу гибели, к которой сводятся разнообразные пути сигнальной трансдукции (A.M. Chinnaiyan, V.M. Dixit, 1996; E. White, 1996; J. Yang, 1997).

К настоящему времени накоплены обширные сведения о типах программированной клеточной гибели, ее морфологических проявлениях, путях реализации, основных «участниках» и регуляторах апоптоза (Е.Б. Владимирская, 2002).

Вместе с тем отсутствуют детальные представления о взаимосвязи отдельных этапов программированной клеточной смерти, составляющих ее основные независимые фазы: инициацию, эффекторную фазу и деградацию, и оценке их временных характеристик. Не менее значимыми представляются вопросы, касающиеся изучения способов инициации различных путей апоптоза (рецепторопосредованного, митохондриального, каспазонезависимого и др.), выяснения точек («сайтов») их интеграции и возможности целенаправленного регулирования процессов клеточной гибели при помощи физико-химических агентов.

Поскольку апоптоз — физиологическое явление, то в организме должны быть факторы, приводящие к ПКГ. В настоящее время известно, что таковыми могут быть как внутриклеточные сигналы, так и внешние, опосредующие свое действие через рецепторные системы, которые сами по себе не являются токсическими или деструктивными. Это могут быть неспецифические факторы, такие как температура, токсические агенты, оксиданты, свободные радикалы, гамма- и УФ-излучение, бактериальные токсины и др. Во всех этих случаях происходит индукция апоптоза, но при увеличении дозы соответствующего агента развивается некроз клетки (Т.А. Ушакова и др., 2004).

УФ-свет известен как потенциальный индуктор апоптоза в различных типах клеток (И.Ф. Донская и др., 1997). Показано, что УФ-свет может индуцировать апоптоз в клетках некоторых лимфоидных линий. Известно, что апоптоз иммунокомпетентных клеток в условиях УФ-В-излучения запускается С095(Раз/Аро-1)-рецепторно/лигандной системой (R. Caricchio et al., 1998). Однако молекулярные механизмы этого процесса и последовательность начальных этапов развития клеточной гибели в условиях облучения изучены да-

леко не полностью. Остаются открытыми вопросы, касающиеся выявления спо- ц

собов запуска различных путей реали- зации апоптоза в условиях воздействия УФ-света.

Особое внимание в последние годы уделяется изучению роли активированных кислородных метаболитов в развитии апоптоза. Известно, что программированная гибель клеток, как правило, сопровождается образованием значительного количества активных форм кислорода. В то же время АФК способны инициировать апоптоз в различных типах клеток (О.Ю. Плетюшкина и др., 2006). Показано (В.В. Новицкий и др., 2008), что интенсификация внутриклеточной продукции АФК связана с вовлечением митохоидриального и TNFR(tumor necrosis factor гесер!ог)-опосредованного путей. Однако, несмотря на очевидную взаимосвязь окислительного стресса с апоптозом, роль АКМ в саморазрушении клеток неясны (Н.К. Зенков и др., 1999).

В связи с вышеизложенным нами были исследованы механизмы и последовательность этапов программированной клеточной гибели лимфоцитов крови доноров в условиях воздействия УФ-света и активных форм кислорода.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью работы явилось выявление путей реализации апоптоза лимфоцитов периферической крови доноров, индуцированного воздействием УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м2 и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода).

Задачи работы предусматривали:

1. Исследование изменений уровня экспрессии мембранных рецепторов смерти CD95 (Fas) лимфоцитов человека после воздействия УФ-света и АФК.

2. Исследование изменений функциональной активности эффекторной каспазы-3 лимфоцитов доноров после УФ-облучения клеток и генерации АФК.

3. Изучение структурных модификаций ДНК лимфоцитов человека в динамике развития апоптоза, индуцированного воздействием УФ-излучения и АФК.

4. Исследование изменений уровня белка р53 в лимфоцитах доноров после УФ-облучения клеток и генерации АФК.

5. Исследование изменений уровня цитохрома с в цитозоле и структурного состояния митохондриальных мембран лимфоцитарных клеток после воздействия УФ-света и АФК.

Научная новизна. Впервые изучены изменения структурного состояния ДНК, уровня экспрессии мембранного Fas-рецептора, функциональной активности каспазы-3, концентрации белков р53 и цитохрома с лимфоцитарных клеток человека в динамике развития апоптоза, индуцированного воздействием УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м2 и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода). Установлено, что УФ-свет и АФК индуцируют фрагментацию ДНК лимфоцитов после 20 ч инкубации модифицированных клеток. Показано, что в течение 1-5 ч после воздействия УФ-света и АФК

на лимфоциты наблюдается повыше- ние уровня экспрессии мембранных Fas-рецепторов смерти по сравнению с интактными клетками. Обнаружено увеличение функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов через 4 ч после генерации синглетного кислорода, гидроксильного радикала и добавления пе-роксида водорода, а также через 8и24и6и8ч после УФ-облучения клеток соответственно в дозах 151 и 1510 Дж/м2. С использованием метода ДНК-комет выявлено, что повреждения ДНК (двунитевые разрывы) появляются сразу после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 и добавления перок-сида водорода в концентрации 10"6 моль/л (кометы типа С1) и достигают максимума через 6 ч после модификации клеток (кометы типов С2 и СЗ). Установлено, что через 6 ч после воздействия пероксида водорода и УФ-света в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 на лимфоциты происходит повышение уровня р53 в исследуемых клетках. Сделано заключение о ведущей роли рецепторопосредованно-го (Fas-зависимого) каспазного и р53-зависимого путей в реализации апоптоза лимфоцитов, индуцированного воздействием УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м2 и пероксида водорода (10"6 моль/л). Предложена схема возможных внутриклеточных событий, приводящих к апоптотической гибели лимфоцитов после их УФ-облучения.

Практическая значимость. Теоретические положения диссертационной работы углубляют современные представления о путях и механизмах реализации апоптоза иммунокомпетентных клеток человека, индуцированного воздействием физико-химических факторов. Они могут быть использованы для разработки способов целенаправленного управления программами жизнедеятельности клеток организма при патологических состояниях, связанных с усилением или ослаблением процессов клеточной гибели. Результаты работы используются в учебном процессе Воронежского государственного университета при проведении занятий по дисциплинам «Биофизика», «Биофизика мембран», «Физико-химические основы межклеточных взаимодействий», «Медицинская биохимия и биофизика», а также в ходе выполнения магистерских и дипломных работ студентами кафедры биофизики и биотехнологии.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на IV съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); 3-й Международной конференции ИНТЕРНАС-2007 "Актуальные проблемы современного естествознания" (Калуга, 2007); 15-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2008" (Москва, 2008); Международной научной конференции "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем" (Беларусь, Минск, 2008); 5-ом съезде Российского фотобиологического общества "Преобразование энергии света при фотосинтезе" (Пущино, 2008); 6-ом Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008);. на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2009" (Москва, 2009); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 статей и 8 тезисов, в том числе 2 статьи в журнале системы РАН.

На защиту выносятся следующие положения:

1. В реализации апоптоза лимфоцитов периферической крови доноров, индуцированного воздействием УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510 Дж/м2 и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода) ведущая роль принадлежит рецепторопосредованному каспазному и р53-зависимому путям.

2. В условиях УФ-облучения лимфоцитов в дозе 3020 Дж/м2 осуществляются рецепторопосредованный без участия каспазы-3, р53-зависимый и каспазонезависимый пути инициации программированной клеточной гибели.

3. Гибель лимфоцитов в условиях воздействия УФ-света и Н202 происходит через промежуточное состояние С1 с образованием высокомолекулярных фрагментов ДНК (> 300 т.п.н.) и состояние С2, характеризующееся наличием фрагментов ДНК (< 50 т. п.н.) до состояния СЗ, характеризующегося межнуклеосомной фрагментацией ДНК (Ых180 п. н.).

4. Схема возможных внутриклеточных событий, приводящих к апоп-тотической гибели лимфоцитов после их УФ-облучения.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 172 страницы машинописного текста, 4 таблицы, 50 рисунков. Состоит из "Введения", 5 глав, "Заключения", "Выводов" и "Приложения". Список литературы содержит 240 источников, из них 88 — отечественных и 152 — зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Структурно-функциональные свойства лимфоцитов

В главе изложены современные представления о структурно-функциональных свойствах лимфоцитов человека и их субпопуляций.

1.2. Механизмы реализации апоптоза

Рассмотрены морфологические признаки, физиологическое значение апоптоза, возможные пути реализации апоптоза, регуляторы апоптоза.

1.3. Структурно-функциональные фотомодификации лимфоцитарных клеток

Рассмотрены УФ-индуцированные изменения лимфоцитов крови доноров, (антителопродуцирующая способность, уровень экспрессии поверхностных рецепторов, цитокины, система комплемента); проанализированы литературные данные, касающиеся изучения УФ-света как потенциального индуктора апоптоза иммунокомпетентных клеток.

1.4. Активные формы кислорода: механизмы образования, свойства, утилизация, биологическая роль

Представлен анализ литературных данных о механизмах образования, физико-химических свойствах, биологической роли и путях регулирования уровня активных форм кислорода в живых организмах. Рассмотрены возможные пути реализации апоптоза иммунокомпетентных клеток в условиях окислительного стресса.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 2. Объекты и методы исследования

Объектом исследования явились лимфоцитарные клетки, выделенные из гепаринизированной крови доноров. Лимфоциты получали путем центрифугирования донорской крови в градиенте плотности фиколл-урографина (Дж. Клаус, 1990).

УФ-облучение суспензии лимфоцитарных клеток осуществляли при их перемешивании в термостатируемой (при 20 ± 1° С) кювете полусферической формы с помощью ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240 - 390 нм. Интенсивность излучения - 151 Дж/м2 в мин с учетом расстояния до облучаемого объекта 0,23 м. Объем вносимого в кювету образца составил 1 мл. Дозы облучения клеточных суспензий -151; 1510 и 3020 Дж/м2.

В экспериментах по изучению структурно-функциональных свойств лимфоцитов применяли следующие системы генерации активных форм кислорода: 1) образование гидроксильных радикалов (ОН") в системе унивалентного восстановления пероксида водорода ионами металлов (S. Goldstein et al., 1984); 2) образование супероксидных анион-радикалов (Ог) в системе тетраметилэти-лендиамин—рибофлавин под действием видимого света (В.Н. Чумаков, Л.Ф. Осинская, 1977); 3) пероксид водорода в концентрации 10"6 моль/л; 4) генерация синглетного кислорода (]02) в присутствии метиленового голубого в условиях облучения красным светом с помощью устройства «Улокс», длина волны максимума излучения — 665±15 нм, диапазон излучения — 630-700 нм, выходная интенсивность излучения - 20 мВт/см2.

Для изучения уровня экспрессии CD95-peuenropoB на поверхности на-тивных и модифицированных лимфоцитов применяли метод иммунофермент-ного анализа (ИФА) с использованием соответственно моноклональных антител (МКА) LT95, конъюгата к ним — козьих антител против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена («Сорбент», Москва) (В.А. Егоров, 1991).

Для определения уровня цитохрома с и р53 в лизатах лимфоцитов использовали тест-систему ("Bender MedSystems", Австрия).

Функциональную активность каспазы-3 в нативных и УФ-модифицированных лимфоцитах определяли на спектрофлуориметре Shimadzu RF1501 в соответствии с протоколом фирмы производителя (BD Biosciences Pharmingen) используемого флуоресцентного субстрата.

Выделение ДНК из лимфоцитов проводили при помощи фенольного метода. Анализ изменений структурного состояния ДНК осуществляли путем электрофореза в агарозном геле (В.Е. Галитовский, В.Г. Гогвадзе, 2001), а также при помощи метода ДНК-комет (В.А. Тронов, И.И. Пелевина, 1996). Размеры фрагментов ДНК лимфоцитарных клеток при проведении электрофореза в агарозном геле определяли с помощью MassRuler*"1 ДНК-маркер, который представляет собой набор из 9 ДНК-фрагментов длиной от 1500 до 10000 пар нуклеотидов. Слайды ДНК-комет исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа (Zeiss 450-490, FT 510, LP 520, увеличение - 400). Изображения регистрировали цифровым фотоаппаратом «Samsung S760». Сканирование комет проводили при помощи программы CometScore1™.

Исследование изменений структурного состояния митохондриальных мембран лимфоцитов осуществляли при помощи флуоресцентного зонда 1-анилинонафталин-8-сульфоната.

Обработку результатов экспериментов проводили с помощью пакета статистических программ «Statgraphics». Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.

Глава 3. Исследование рецепторного каспазозависимого пути апоптоза лимфоцитов человека, модифицированных воздействием УФ-света и активных форм кислорода

С целью выявления возможных путей реализации апоптоза в лимфоцитах нами были исследованы изменения уровня экспрессии CD95 (Fas-рецепторов) исследуемых клеток после их модификации УФ-светом и активными формами кислорода.

Показано, что статистически достоверные отличия уровня экспрессии Fas-рецептора по отношению к контролю были зарегистрированы через 3, 4, 5 часов после воздействия УФ-света в дозе 151 Дж/м2 (рис. 1) и через 1-5 часов после воздействия УФ-света в дозах 1510 и 3020 Дж/м2.

Рис. 1. Изменения уровня экспрессии Fas-рецепторов лимфоцитов в течение 1-5 часов после облучения в дозе 151 Дж/м2 в свободном состоянии и в присутствии циклогексимида:

— контроль (интактные лимфоциты); ..... контроль+цг;

- 151 Дж/м2;

т ш т 151 Дж/м2+ЦГ; По оси абсцисс - время, прошедшее после УФ-облучения лимфоцитов

SO -'-'-'-'-'-

О I 2 3 4 5ч

В присутствии циклогексимида в концентрации 10^ моль/л статистически достоверное снижение уровня CD95 по сравнению с таковым для УФ-модифицированных свободных клеток обнаружено через 4 и 5 часов после облучения лимфоцитов во всех использованных дозах (рис. 1).

Полученные результаты указы- вают на то, что повышение уровня экспрессии Fas-рецепторов лимфоцитов через 4 и 5 часов после УФ-облучения связано не только с демаскированием ранее скрытых молекул Fas-рецепторов лифоцитарных мембран, но и с синтезом их новых молекул.

Повышение уровня CD95 лимфоцитов, суспендированных в растворе Хенкса, относительно контроля выявлено лишь через 1 час после генерации синглетного кислорода, супероксидного анион-радикала, гидроксильного радикала. В присутствии циклогексимида не обнаружены статистически достоверные отличия величины изучаемого параметра по сравнению с таковой для клеток, модифицированных АФК в отсутствие ингибитора синтеза белка.

Следовательно, повышение уровня экспрессии Fas-рецептора лимфоцитов после воздействия '02, ОН* по сравнению с контрольным образцом связано с демаскированием скрытых (предсуществующих) молекул CD95 вследствие изменения структурного состояния плазматических мембран клеток, обусловленного интенсификацией ПОЛ и оксидативной модификацией мембранных белков.

Воздействие Н2О2 (10"6 моль/л) на лимфоциты человека индуцировало статистически достоверное повышение уровня Fas-рецепторов по сравнению с контролем через 2-5 часов после добавления модификатора к суспензии клеток (рис. 2). В тех же условиях через 4 и 5 ч в присутствии циклогексимида наблюдалось статистически достоверное снижение величины исследуемого параметра по сравнению с таковой для клеток, модифицированных воздействием Н2О2 в отсутствие ингибитора белкового синтеза.

Уровень экспрессии CD95. %

Рис. 2. Изменения уровня экспрессии Fas-рецепторов лимфоцитов в течение 1-5 часов после добавления пероксида водорода в свободном состоянии и в присутствии циклогексимида:

контроль (интактные клетки); 2 контроль +цг; пероксид водорода; пероксид водорода+цг

1) 1 2 "> 4 S ч

Таким образом, повышение уровня экспрессии CD95 лимфоцитов по сравнению с интактными иммуноцитами через 4 и 5 часов после воздействия пероксида водорода связано с синтезом новых молекул изучаемых рецепторов.

Анализ полученных результатов позволяет сделать заключение о возможности реализации рецепторопосредованного (Fas-зависимого) пути апопто-за лимфоцитов в условиях воздействия УФ-свега и АФК.

В связи с тем, что каспаза-3 является ключевой эффекторной каспазой, активирующей ряд других каспаз и расщепляющей комплекс ДНКазы CAD (caspase-activated DNAse) с ингибитором ICAD, нами были исследованы изме-

нения функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов, модифицированных воздействием УФ-света и АФК.

При исследовании УФ-индуцированных изменений функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов человека (рис. 3, 4, 5) установлено, что сразу после облучения лимфоцитов во всех используемых дозах регистрируется снижение активности каспазы-3 по отношению к таковому интактных клеток. Через 2, 4, 6 часов после УФ-модификации в дозе 151 Дж/м2 исследуемых клеток не обнаружены статистически достоверные отличия величин изучаемого параметра по сравнению с контрольными образцами. Через 8 и 24 ч после облучения в используемой дозе выявлено увеличение интенсивности флуоресценции продукта каспазной реакции относительно интактных клеток (рис. 3).

Рис. 3. Изменение функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов человека после воздействия УФ-света в дозе 151 Дж/м2:

□ контроль (интактные клетки); И 151 Дж/м2

Через 6 и 8 часов после облучения лимфоцитов в дозе 1510 Дж/м2 наблюдается статистически достоверное повышение уровня активности каспазы-3 по отношению к таковому для немодифицированных клеток, а через 24 часа - спад исследуемого параметра (рис. 4).

1Ь , оти ед. 40

гЬ|

Г*

6 8

Рис. 4. Изменение функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов человека после воздействия УФ-света в дозе 1510 Дж/м2:

П контроль (интактные клетки); ■ 1510 Дж/м2

После облучения лимфоцитов в дозе 3020 Дж/м2 и последующей инкубации клеток в течение 2, 4, 6 и 24 ч выявлено статистически достоверное сниже-

ние уровня функциональной активно- сти каспазы-3 по отношению к контрольным образцам (рис. 5).

ота.ед.

Рис. 5. Изменение функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов человека после воздействия УФ-света в дозе 3020 Дж/м2: □ контроль (интактные

клетки); И 3020 Дж/м2

На основе анализа результатов проведенных экспериментов можно заключить, что в запуске апоптоза лимфоцитов после воздействия УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м2 определяющую роль играет рецепторопосредованный кас-пазозависимый путь программированной клеточной гибели.

По всей вероятности, с повышением дозы УФ-света до 3020 Дж/м2 происходит переключение каспазного рецепторного пути апоптоза с участием каспазы-3 на каспазонезависимый путь, связанный с освобождением из митохондрий фактора АИ7 (фактор, индуцирующий апоптоз), вызывающего конденсацию хроматина и разрыв ДНК.

Обнаружено, что через 4 часа после генерации '02, ОН* и добавления Н202 к суспензии лимфоцитов происходит статистически достоверное повышение уровня активности каспазы-3 лимфоцитов по отношению к таковому для контрольных образцов. Следовательно, воздействие АФК на лимфоциты индуцирует активацию рецепторного каспазозависимого пути реализации апоптоза.

Глава 4. Исследование р53-зависимого пути апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием УФ-света и активных кислородных метаболитов

С целью выявления возможного процесса фрагментации ДНК после воз-| действия УФ-света в дозах 151, 1510 и 3020 Дж/м2 на лимфоциты периферической крови доноров нами были проведены процедуры выделения ДНК из лим-| фоцитов при помощи фенольного метода и электрофореза полученных препаратов ДНК в интактном состоянии и после УФ-облучения. Из анализа данных, . представленных на рис. 6, следует, что на дорожке, обозначенной 1 (контроль), выявляется одна полоса, характерная для высокомолекулярной ДНК нативных клеток. Через 20 ч после УФ-облучения на электрофореграмме обнаружена совокупность полос ("апоптозная лестница"). Размеры фрагментов ДНК лимфо-I цитарных клеток определяли с помощью МаБзКикг011 ДНК-маркер, который

представляет собой набор из 9 ДНК- фрагментов длиной от 1500 до 10000 пар нуклеотидов. Размеры фрагментов ДНК лимфоцитарных клеток, УФ-модифицированных в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м2 , варьируют соответственно в пределах от 6000 п.н. и менее 1500 п.н., менее 1500 п.н., ~5000 п.н. и менее 1500 п.н.

Рис. 6. Электрофореграмма ДНК интактных и УФ-облученных лимфоцитов человека: дорожка 1 - контроль; дорожка 2 - доза облучения 151 Дж/м2; дорожка 3 - доза облучения 1510 Дж/м2; дорожка 4 - доза облучения 3020 Дж/м2; дорожка М - маркер

1 2 3 4 М

После 20 часов инкубации лимфоцитов, модифицированных воздействием супероксидного радикала, синглетного кислорода, гидроксильного радикала и пероксида водорода происходит фрагментация ДНК, на что указывает совокупность полос ("апоптозная лестница") на электрофореграмме, соответствующая фрагментам ДНК меньшего размера (рис. 7).

Рис. 7. Электрофореграмма ДНК интактных и модифицированных АФК лимфоцитов человека: 1 - контроль;

дорожка 2 - Н202 (10'6 моль/л); дорожка 3 - 0*2; дорожка 4 - 'Ог; дорожка 5 - ОН"; М - маркер

Размеры фрагментов ДНК лим- фоцитов, модифицированных воздействием О'г , '02, ОН*, Н202, варьируют соответственно в пределах 2500 - 5000 п. н., 1500 - 2500 п. н., 2000-4500 п. н., 1500-4000 п. н.

Таким образом, УФ-свет (240-390 нм) в дозах 151, 1510 и 3020 Дж/м2 и активные формы кислорода индуцируют процессы апоптоза лимфоцитарных клеток человека.

При помощи метода ДНК-комет был исследован уровень поврежденности ДНК лимфоцитов после воздействия УФ-излучения в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м2.

На рис. 8 представлены микрофотографии типов комет, формируемых лимфоцитами сразу и через 6 и 20 ч после воздействия УФ-света.

Кометы интактных лимфоцитов, инкубированных в течение 6 и 20 часов, относятся к классу СО (рис. 8, а). Кометы лимфоцитов, УФ-модифицированных в дозе 151 Дж/м2, непосредственно после облучения относятся к классу С0/С1. После 6 и 20 часовой инкубации облученных иммуноцитов обнаружены кометы класса С2, характерные для предапоптотических клеток (коммитированных к гибели) с фрагментами ДНК < 50 т.п.н. (рис. 8, б).

После облучения лимфоцитов в дозе 1510 Дж/м2 наблюдали образование комет класса С1, через 6 и 20 ч инкубации УФ-модифицированных в этой дозе клеток соответственно - комет С2/СЗ и СЗ классов (рис. 8, в). Кометы СЗ класса соответствуют апоптотическим с межнуклеосомной фрагментацией ДНК (Ы х180 п. н.).

После облучения лимфоцитов в дозе 3020 Дж/м2 были обнаружены кометы С1/С2 класса, через 6 и 20 ч инкубации УФ-модифицированных клеток -кометы СЗ/С4 класса (рис. 8, г). Наличие в исследуемых образцах комет С4 класса указывает на реализацию гибели части лимфоцитов по типу некроза. Некроз может развиваться как самостоятельный, параллельно протекающий с апоптозом процесс, и как вторичный процесс, завершающий апоптоз.

Рис. 8. Микрофотографии ДНК-комет после воздействия УФ-излучения: а — интактные клетки; 6-151 Дж/м2; в-1510 Дж/м2; г-3020 Дж/м2; 1 - без инкубации;

2-6 часов инкубации;

3-20 часов инкубации

Следовательно, гибель лимфо- цитов в условиях воздействия УФ-света происходит через промежуточное состояние С1 с образованием высокомолекулярных фрагментов ДНК (> 300 т.п.н.) и состояние С2, характеризующееся наличием фрагментов ДНК (< 50 т. п.н.). Для части клеток после их УФ-облучения в дозе 3020 Дж/м2 возможен переход апоптоза в некроз, сопровождающийся стохастической деградацией ДНК.

Обнаружено статистически достоверное по отношению к контролю повышение уровня поврежденное™ ДНК лимфоцитов сразу после облучения клеток в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 и через 6 и 20 ч после воздействия УФ-света во всех используемых дозах. Наиболее существенное возрастание по сравнению с интактными клетками степени поврежденное™ ДНК зарегистрировано через 6 ч после УФ-модификации лимфоцитов в дозе 1510 Дж/м2. Уровень поврежденное™ ДНК клеток, облученных в дозе 3020 Дж/м2, выше по сравнению с таковым для немодифицированных клеток, но сохраняется на одном уровне сразу и через 6 и 20 ч после облучения.

Таким образом, повреждения ДНК (двунитевые разрывы) обнаруживаются сразу после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 (кометы типа С1) и достигают максимума через 6 ч после модификации клеток (кометы типов С2 и СЗ). Вероятно, двунитевые разрывы ДНК являются сигналом к запуску пути апоптоза, осуществляющегося с участием транскрипционного фактора р53, проапоптозного белка Вах и других митохондриальных факторов апоптоза.

После обработки лимфоцитов раствором пероксида водорода (10"6 моль/л) наблюдали образование комет класса С1, через 6 и 20 ч инкубации модифицированных клеток соответственно - комет С2/СЗ и СЗ/С4 классов (рис.

9).

Рис. 9. Микрофотографии ДНК-комет клеток, модифицированных добавлением пероксида водорода:

а - интактные клетки; б - после добавления пероксида водорода; в - ДНК некротических клеток; 1 — без инкубации;

2-6 часов инкубации;

3-20 часов инкубации

Следовательно, гибель лимфоцитов в условиях воздействия Н2О2 происходит через промежуточное состояние С1 с образованием высокомолекулярных фрагментов ДНК (> 300 т.п.н.) и состояние С2, характеризующееся наличием

фрагментов ДНК (< 50 т. п.н.). Для части клеток после воздействия Н2О2 на них возможен переход апоптоза в некроз.

Статистически достоверное по сравнению с контролем повышение уровня поврежденности ДНК лимфоцитов, обработанных Н2О2, зарегистрировано сразу и через 6 ч после воздействия на клетки пероксида водорода. Наибольший объем повреждений ДНК приходится на время 6 ч после обработки лимфоцитов Н202.

Таким образом, нами выявлено, что гибель лимфоцитов по типу апоптоза в условиях воздействия УФ-света и пероксида водорода происходит через промежуточные состояния С1 и С2 с образованием соответственно высокомолекулярных фрагментов ДНК размером > 300 т. п. н. и фрагментов размером < 50 т. п. н. до состояния СЗ, характеризующегося межнуклеосомной фрагментацией ДНК (№<180 п. н.). Для части клеток после их УФ-облучения в дозе 3020 Дж/м2 и воздействия Н202 возможен переход апоптоза в некроз, сопровождающийся стохастической деградацией Д НК.

Полученные нами результаты указывают на важную роль р53-зависимого пути в реализации апоптоза лимфоцитов человека в условиях воздействия УФ-света и активных форм кислорода.

Установлено, что после облучения иммуноцитов в дозе 151 Дж/м2 концентрация р53 не отличалась от таковой для немодифицированных образцов. УФ-модификация клеток в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 приводила к статистически достоверному возрастанию уровня исследуемого параметра относительно контроля. Причем облучение в дозе 1510 Дж/м2 вызывало наиболее ярко выраженный эффект (рис. 10).

700

Рис. 10. Изменение концентрации р53 в лимфоцитах крови доноров через 6 ч после УФ-облучения

30» Дж-'мг

Добавление к суспензии лимфоцитов пероксида водорода в конечной концентрации 10"6 моль/л вызывало статистически достоверное повышение концентрации р53 по сравнению с интактными клетками (рис. 11).

180 160 140 120 100

Рис. 11. Изменения концентрации р53 в лимфоцитах крови доноров через 6 ч инкубации после воздействия Н202

«о •

60 ■ ■

20 ■

О ---1-1--.

титр(Ш. НО

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют в пользу представлений об участии р53-зависимого пути реализации апоптоза в процессах гибели лимфоцитов крови доноров, индуцированных воздействием УФ-облучения и Н202.

Глава 5. Исследование митохондриального пути апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием УФ-света и активных форм

кислорода

При помощи флуоресцентного зонда АНС были исследованы изменения структурного состояния митохондриальных мембран после воздействия УФ-света и АФК.

Полученные результаты указывают на процессы модификации структурного состояния митохондриальных мембран после воздействия УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м2, а также *02 и Н202 на лимфоциты человека, что может приводить к нарушению их целостности и выходу в цитоплазму клеток апопто-генных факторов, запускающих митохондриальный путь апоптоза.

С целью выявления возможности реализации митохондриального пути апоптоза, осуществляющегося с участием цитохрома с, нами был исследован уровень этого белка в цитозоле лимфоцитов после их УФ-облучения и генерации АФК.

Через 1,5 ч после воздействия УФ-излучения в дозе 151 Дж/м2 на лимфоциты обнаружено статистически достоверное повышение уровня цитохрома с по отношению к контролю (рис. 12). После УФ-облучения клеток в дозе 1510 Дж/м2 концентрация цитохрома с не отличалась от таковой для нативных им-муноцитов. УФ-модификация лимфоцитов в дозе 3020 Дж/м2 вызывала статистически достоверное снижение уровня изучаемого параметра по сравнению с контролем.

Через 4 часа инкубации УФ-облученных в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 клеток зарегистрировано снижение величины изучаемого параметра относительно таковой для нативных клеток (рис. 13). По-видимому, лишь при минимальной

дозе облучения (151 Дж/м2) цитохром с вносит вклад в процессы апоптоза лимфоцитов.

Концентрация цитохром;! с. % 160

140

120

100

80 «0 40 20 0

Концентрация цитохрома с, % 141)

120 КМ Я0 ЬО

4(1 20 0

гЬ

контроль

151

1510

3020 Дж/м~

1Я0

Ж0 Дж/м'

Рис. 12. Изменения уровня цитохрома с в лимфоцитах человека через 1,5 ч после их УФ-облучения

Рис. 13. Изменения уровня цитохрома с в лимфоцитах человека после их УФ-облучения: - без инкубации; п через 4 часа инкубации

Можно предположить, что для УФ-модифицированных в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 лимфоцитов путь апоптоза, связанный с выходом цитохрома с из митохондрий и образованием апоптосомы с последующей активацией каспаз 9 и 3, не играет существенную роль в реализации программируемой смерти исследуемых клеток.

Через 1,5 часа инкубации иммуноцитов в присутствии пероксида водорода наблюдается незначительное повышение концентрации цитохрома с по отношению к инкубированному в течение того же времени образцу (контроль). Через 4 часа инкубации интактных лимфоцитов наблюдается снижение величины изучаемого параметра по сравнению с таковой для нативных клеток, но и в этом случае не обнаружены статистически достоверные отличия уровня цитохрома с по отношению к контролю (рис. 14,15).

Зарегистрировано статистически достоверное снижение уровня цитохрома в лимфоцитах через 4 часа после их обработки пероксидом водорода по сравнению с исследуемым показателем для модифицированных клеток без инкубации.

Таким образом, нами не выявлено существенных изменений уровня цитохрома с в цитозоле клеток после воздействия пероксида водорода. Можно предположить, что для лимфоцитов в присутствии пероксида водорода путь апоптоза, связанный с выходом цитохрома с из митохондрий и образованием апоптосомы с последующей активацией каспаз 9 и 3, не играет существенную роль в реализации программируемой клеточной смерти исследуемых клеток.

Концентрация цлтахрош с, % 160 •

140 '

120 "

100 " -

80 '

«0 •

40 '

20 '

о -—■—-1---

котршь 1

Рис. 14. Изменения уровня цито-хрома с в лимфоцитах после 1,5 часов инкубации в условиях воздействия пероксида водорода

Коищпрацм цитохрома с, % 140 г

120 -

100 - -

80 •

60 ■

40 •

20 -

0 ---—'-1----1

! 2

Рис. 15. Изменения уровня цитохрома с в лимфоцитах после воздействия пероксида водорода:

1 - контроль;

2 - воздействие пероксида водорода;

□ без инкубации; В через 4 часа инкубации

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При помощи методов иммуноферментного анализа, люминесценции, электрофореза в агарозном геле, ДНК-комет исследованы пути реализации апоптоза лимфоцитов периферической крови доноров, индуцированного воздействием УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м2 и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидро-ксильного радикала, синглетного кислорода).

Обнаружено повышение по отношению к контролю уровня экспрессии мембранных рецепторов апоптотических сигналов СЭ95 лимфоцитов, суспендированных в питательной среде ЯРМ1-1640 и растворе Хенкса, в течение 1-5 ч после УФ-облучения клеток в использованных дозах. Установлено, что увеличение экспрессии Раз-рецепторов лимфоцитов, модифицированных воздействием УФ-света, в растворе Хенкса связано не только с демаскированием ранее недоступных (скрытых) молекул С095, но и с синтезом их новых молекул через 4 и 5 после облучения иммуноцитов. Показано, что динамика исследуемого параметра суспензии лимфоцитов в условиях воздействия УФ-света обусловлена изменением уровня Раз-рецепторов Т-клеток.

Обнаружено повышение уровня функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов человека по отношению к таковому для интактных образцов через 8и24чи6и8ч соответственно после облучения клеток в дозах 151 и 1510

Дж/м2. УФ-модификация лимфоцитов в дозе 3020 Дж/м2 индуцирует инактивацию каепазы-3.

Установлено, что после 20 ч инкубации лимфоцитов, УФ-облученных в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м2, происходит фрагментация ДНК, на что указывает совокупность полос («апоптозная лестница») на электрофореграмме, соответствующая фрагментам ДНК меньшего размера по сравнению с контролем.

Повреждения ДНК (двунитевые разрывы) обнаруживаются сразу после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 (ДНК-кометы типа С1) и достигают максимума через 6 ч после модификации клеток (кометы типов С2 и СЗ). Вероятно, двунитевые разрывы ДНК являются сигналом к запуску апопто-за, осуществляющегося с участием транкрипционного фактора р53, проапоп-тозного белка Вах и других митохондриальных факторов апоптоза. Изменения структурного состояния митохондриальных мембран были обнаружены нами после воздействия на лимфоциты УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м2.

Через 20 ч после облучения лимфоцитов в дозе 151 Дж/м2 обнаружены фрагменты ДНК с размерами 6000 п.н. и менее 1500 п.н. Использование метода ДНК-комет в этих условиях позволило выявить кометы класса С2, характерные для предапоптотических клеток (фрагменты ДНК < 50 т.п.н.).

Через 20 ч после воздействия на лимфоциты УФ-света в дозе 1510 Дж/м2 зарегистрировано образование фрагментов ДНК менее 1500 п.н. и ДНК-комет СЗ-класса, что указывает на межнуклеосомную фрагментацию ДНК, характерную для погибающих клеток.

Через 20 ч после воздействия на лимфоциты УФ-света в дозе 3020 Дж/м2 обнаружены фрагменты ДНК размером примерно 5000 п.н. и менее 1500 п.н., кометы СЗ- и С4-классов. В этих же условиях наблюдалась инактивация каспа-зы-3. По-видимому, эти результаты указывают на возможность реализации р53-зависимого пути апоптоза, сопровождающегося выходом из митохондрий АР -фактора, индуцирующего апоптоз, и индукцией каспазонезависимого пути программированной клеточной смерти. В то же время ингибирование каспаз и снижение уровня АТФ в клетке могут приводить к блокированию фазы деградации апоптоза, переходу апоптоза во вторичный некроз.

Предположение о возможности участия р53 в осуществлении апоптоза лимфоцитов было подтверждено нами после обнаружения (по сравнению с ин-тактными иммуноцитами) более высокого уровня этого белка через 6 ч после облучения клеток в дозах 1510 и 3020 Дж/м .

На основании результатов определения уровня цитохрома с в цитозоле лимфоцитов через 1,5 и 4 ч после УФ-облучения клеток предполагается возможность участия цитохрома с в осуществлении программированной клеточной смерти лимфоцитов человека, индуцированной воздействием УФ-света в минимальной из использованных доз (151 Дж/м2).

Полученные нами результаты позволили сделать заключение о ведущей роли рецепторопосредованного (Баз-зависимого) каспазного пути в реализации апоптоза лимфоцитов после воздействия УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м2 (рис. 16). УФ-облучение индуцирует активацию мембранных рецепторов смерти СБ95, что приводит к запуску каспазного каскада и активации эффекторной

каспазы-3, следствием чего является фрагментация ДНК. Через 6 ч после облучения клеток, когда выявляется максимальный уровень повреждений ДНК и рост количества р53 в лимфоцитах по сравнению с контрольными образцами, дополнительно запускается р53-зависимый путь программированной клеточной смерти, также завершающийся фрагментацией ДНК. В случае УФ-облучения исследуемых клеток в дозе 3020 Дж/м2 можно предположить участие рецепто-ропосредованного без участия каспазы-3 (с участием каспазы-12), р53-зависимого и каспазонезависимого путей реализации апоптоза лимфоцитов.

Нельзя исключить и роль ионов кальция в инициации апоптоза (рис. 16), так как обнаружено (М.А. Наквасина и др., 2008) повышение внутриклеточной концентрации этого иона после УФ-облучения лимфоцитов.

При исследовании структурно-функциональных модификаций лимфоцитов человека в динамике развития апоптоза, индуцированного воздействием АФК, выявлено повышение по сравнению с контролем уровня экспрессии Раз-рецепторов иммуноцитов, суспендированных в среде КРМ1-1640, растворе Хенкса, а также их Т-клеточной суспензии.

Через 4 ч после генерации синглетного кислорода, гидроксильного радикала и добавления пероксида водорода к лимфоцитам наблюдалось повышение функциональной активности каспазы-3 по отношению к таковому для контрольных образцов.

После 20 часов инкубации лимфоцитов, модифицированных воздействием пероксида водорода (10"6 моль/л) происходит образование фрагментов ДНК, размеры которых составляют 1500-4000 п. н. После обработки лимфоцитов раствором пероксида водорода наблюдали образование комет класса С1, через 6 и 20 ч инкубации модифицированных клеток соответственно — комет С2/СЗ и СЗ/С4 классов. Наибольший объем повреждений ДНК приходился на время 6 ч после обработки лимфоцитов Н202. Через 6 ч регистрировали также повышение уровня р53 в лимфоцитах, модифицированных воздействием пероксида водорода.

Следовательно, полученные результаты свидетельствуют в пользу представления о реализации рецепторопосредованного каспазного и р53-зависимого путей апоптоза лимфоцитов в условиях воздействия АФК и, в частности, пероксида водорода. По-видимому, структурно-функциональные модификации лимфоцитов под влиянием АФК вносят определенный вклад в реализацию последовательности внутриклеточных событий, приводящих к программированной клеточной смерти иммуноцитов в условиях воздействия УФ-света (рис. 16).

Освобождение (мобилизация) Fas-L

Активация фосфош юзитидного пути передани информации

Повышение уровня Са:' в цитозоле

Аетивани* каеггазы-12

Плазматическая мембрана___________ Образование радикальных

лимфоцита

Активация Fas (демаскироващгс, синтез de novo)

Запуск реиепторного пути апоптоза

Активация каспаз (в т.ч. касгтазы-3)

соединений (в т. ч. АФК)

ДНК

| Образование "разрывов ДНК | *

Сенсорные белки I

Активация ииназы ATM I

Активация р53 |

Фрагмекпшя ДНК

Трансаетивация Fas

Активация Ва*

Каспазонезависимый путь апоптоза

Повышение уровня цитохрома с

Экспрессия ге1юв P1G Репрессия гена Вс1-2

Оксндятивный стресс

Изменения структурного состояния митохоилриальньк _мембран_

Выход . цитохрома с I

Цнтохром-с независимый

путь аггоггго й

Снижение

уровня щгто.урома с

Рис. 16. Схема возможных внутриклеточных событий, приводящих к апоптотической гибели лимфоцитов после их УФ-облучения: -> - через промежуточные стадии;

___i - вклад автора (результаты собственных исследований)

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в течение 1-5 ч после воздействия УФ-света (240390 нм) в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м2 и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, синг-летного кислорода) наблюдается повышение уровня экспрессии мембранных рецепторов смерти — Fas (CD95) — по сравнению с таковым для интактных клеток.

2. Показано, что увеличение уровня экспрессии CD95 лимфоцитов, модифицированных воздействием УФ-излучения в использованных дозах и пероксида водорода в концентрации 10"6 моль/л, обусловлено демаскированием ранее скрытых (предсуществующих) и синтезом новых молекул Fas-рецепторов. Экзогенная генерация в исследуемых образцах синглетного кислорода, супероксидного анион-радикала и гидроксильного радикала индуцировала демаскирование ранее недоступных молекул CD95 лимфоцитарных мембран.

3. Обнаружено повышение функциональной активности эффекторной каспазы-3 по отношению к контролю через 8 и 24 ч; 6 и 8 ч; 4 ч соответственно после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 151; 1510 Дж/м2; воздействия АФК (синглетного кислорода, пероксида водорода, гидроксильного радикала).

4. Выявлена фрагментация ДНК лимфоцитов через 20 ч после воздействия УФ-света в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м2 и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода).

5. Установлено, что повреждения ДНК (двунитевые разрывы) появляются сразу после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 и добавления пероксида водорода в концентрации 10"6 моль/л (кометы типа С1) и достигают максимума через 6 ч после модификации клеток (кометы типов С2 и СЗ).

6. Обнаружено, что гибель лимфоцитов по типу апоптоза в условиях воздействия УФ-света и пероксида водорода происходит через промежуточные состояния С1 и С2 с образованием соответственно высокомолекулярных фрагментов ДНК размером > 300 т.п.н. и фрагментов размером < 50 т.п.н. до состояния СЗ, характеризующегося межнуклеосомной фрагментацией ДНК (Nxl80 п.н.).

7. Показано, что через 6 ч после облучения клеток в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 и воздействия пероксида водорода наблюдается повышение уровня белка р53 по сравнению с таковым для интактных лимфоцитов.

8. Увеличение внутриклеточной концентрации цитохрома с по отношению к контролю зарегистрировано через 1,5 ч после УФ-облучения лимфоцитов в дозе 151 Дж/м .

9. Нарушения структурного состояния митохондриальных мембран обнаружены после воздействия на лимфоциты УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м , синглетного кислорода и пероксида водорода.

10. Выявлена ведущая роль рецепторопосредованного каспазного и р53-зависимого путей в реализации апоптоза лимфоцитов в условиях воздействия УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м2 и активных форм кислорода, в частности, пероксида водорода.

11. Постулируется возможность инициации рецепторопосредованного без участия каспазы-3, р53-зависимого и каспазонезависимого путей апоптоза в условиях УФ-облучения лимфоцитов в дозе 3020 Дж/м2.

12. Предложена схема возможных внутриклеточных событий, приводящих к апоптотической гибели лимфоцитов после их УФ-облучения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Структурно-функциональные модификации лимфоцитарных клеток человека в условиях воздействия активных форм кислорода / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина, Л.И. Попова, М.С. Трубицына // Вестник ВГУ. — Сер. Химия, Биология. -2005.- №2. -С. 110-115.

2. Артюхов В.Г. Анализ механизмов действия УФ-света на лимфоцитар-ные клетки человека / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина, О.В. Лидохова, М.С. Трубицына, Л.И. Попова // Вестник Калужского университета. - 2007. - №1. -С. 56-63.

3. Artyukhov V.G. The modification of structural-functional properties of human blood lymphocytes in conditions of superoxide anion-radical generation / V.G.

Artyukhov, MA. Nakvasina, O.V. Li- dokhova, M.S. Trubicina, L.I. Popova II 3rd International Conference INTERNAS'2007, Kaluga, Russia, 22-25 may 2007 -Kaluga, 2007.-P. 48-49.

4. Изменение уровня экспрессии Fas-рецептора лимфоцитов человека после воздействия УФ-света и активных форм кислорода / В.Г. Артюхов, М.А. Навасина, М.С. Трубицына, ЕА. Кошкина // Организация и регуляция физио-лого-биохимических процессов : межрегион, сб науч. работ .— Воронеж, 2007 .— Вып. 9.-С. 197-206.

5. Исследование УФ-индуцированных изменений интенсивности свободно-радикальных процессов в лимфоцитах крови доноров / М.С. Трубицына, ЕА. Кошкина, В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина // Физиология и психофизиология мотиваций : межрегион, сб. науч. работ .— Воронеж, 2007 .— Вып. № 8. -С. 38-40 .

6. О механизмах модулирующего действия УФ-света на структурно-функциональные свойства лимфоцитов человека / В.Г. Артюхов, JI.C. Свекло, М.С. Трубицына, Л.И. Попова, О.В. Лидохова, М.А. Наквасина // Производственная, клиническая и транспортная трансфузиология : этапы реформирования, инфекционная и иммунологическая безопасность, критерии качества : сб. науч,-практ. работ .— 2008 .—№ 2. - С. 128-141.

7. Лидохова О.В. Биофизические аспекты апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием активных форм кислорода / О.В. Лидохова, М.С. Трубицына // Ломоносов-2008 : тез. докл. 15 Междунар. науч. конф. студ., аспирантов и молодых ученых, 8-11 апр. 2008 г. — М., 2008 .— С. 14.

8. Лидохова О.В. Взаимосвязь уровня экспрессии мембранных рецепторов и цАМФ лимфоцитов человека в условиях УФ-облучения У О.В. Лидохова, М.С. Трубицына, Л.И. Попова // Труды молодых ученых .— Воронеж, 2007 .— № 1-2. - С. 75-77.

9. Трубицына М.С. Биофизические аспекты рецепторопосредованного пути апоптоза УФ-модифицированных лимфоцитов человека / М.С. Трубицына, Е.А. Кошкина, И.Ю. Искусных // Труды молодых ученых .— Воронеж, 2007 .— № 1-2. - С. 85-89 .

10. О взаимосвязи структурно-функциональных модификаций и уровня вторичных мессенджеров лимфоцитов человека в условиях УФ-облучения / МА. Наквасина, О.В. Лидохова, М.С. Трубицына, Л.И. Попова, В.Г. Артюхов // Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем : междунар. науч. конф., 25-27 июня 2008 г., Минск, Белорусь .— Минск, 2008,—4.1.-С. 242-244.

11.* Структурно-функциональные модификации лимфоцитов человека, индуцированные воздействием УФ-света / В Л". Артюхов, М.А. Наквасина, О.В. Лидохова, М.С. Трубицына, Л.С. Свекло // Радиационная биология. Радиоэкология .— 2008 .— Т. 48, № 6. - С. 741-747 .

12. Структурно-функциональные модификации лимфоцитов человека, индуцированные воздействием активных форм кислорода / О.В. Лидохова, М.С. Трубицына, В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина // Организация и регуляция

физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб науч. работ .— Воронеж, 2008 .— Вып. 10. - С. 142-148 .

13. УФ-свет и активные формы кислорода как модуляторы структурно-функционального состояния лимфоцитов человека / М.А. Наквасина, В.Г. Ар-тюхов, О.В. Лидохова, М.С. Трубицына // Пребразование энергии света при фотосинтезе : тез. докл. междунар. конф., 5-го съезда Рос. фотобиологического о-ва, Пущино, 8-13 июня 2008 г. —, 2008 .— С. 142.

14. Исследование механизмов апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного УФ-светом / М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов, М.С. Трбицына // Пребразование энергии света при фотосинтезе : тез. докл. междунар. конф., 5-го съезда Рос. фотобиологического о-ва, Пущино, 8-13 июня 2008 г. —, 2008 .— С. 159.

15. О путях апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием активных форм кислорода / М.С. Трубицына, Е.А. Кошкина, М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов // 6-й Сибирский физиологический съезд : тез. докл., 25-27 июня 2008 г., г. Барнаул .— 2008 .— Т. 1. - С. 243 .

16. Трубицына М.С. Пути реализации апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием УФ-света / М.С. Трубицына // Ломоносов-2009. Секция Биология : тез. докл. междунар. конф. студ., аспирантов и молодых ученых.—М., 2009 .— С. 34-35 .

17.* Рецепторные каспазозависимый и каспазонезависимый пути апоптоза, индуцированного УФ-излучением в лимфоцитах человека / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина, М.С. Трубицына, Т.Н. Попова, И.Ю. Искусных // Радиационная биология. Радиоэкология.— 2009 .— Т. 49, № 4. - С. 432-437.

18. Участие рецепторного и митохондриального путей в реализации апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного УФ-излучением / М.С. Трубицына, Е.В. Духанина, В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб науч. работ .— Воронеж, 2009 —Вып. 11. - С. 215-223.

19. Об индукции рецепторопосредованного пути реализации апоптоза / М.А. Наквасина, О.В. Лидохова, М.С. Трубицына, В.Г. Артюхов // II Съезд физиологов СНГ « Физиология и здоровье человека» : тез. докл., 29 — 31 октября, 2008 г., г. Кишинев, Молдова. - 2008. - С. 39.

Статьи 11, 17 опубликованы в изданиях, соответствующих списку ВАК

РФ.

Подписано в печать 14.10.09. Формат 60x84 '/и. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 1636

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательско-полиграфического цешра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Трубицына, Мария Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурно-функциональные свойства лимфоцитов.

1.1.1. Общая характеристика лимфоцитов.

1.1.2. Т-лимфоциты.151.1.3. В-лимфоциты.

1.1.4. Натуральные киллеры.

1.2. Механизмы реализации апоптоза.

1.2.1. Определение, морфологические признаки, физиологическое значение апоптоза.

1.2.2. Пути реализации апоптоза.

1.2.3. Регуляторы апоптоза.

1.3. Структурно-функциональные фотомодификации лимфоцитарных клеток .361.4. Активные формы кислорода: механизмы образования, свойства, утилизация, биологическая роль.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. Объект и методы исследования.

2.1. Объект исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение лимфоцитов из крови доноров.

2.2.2. Определение жизнеспособности клеток.

2.2.3. Определение уровня экспрессии Fas-рецепторов лимфоцитов методом иммуноферментного анализа.

2.2.4. Определение уровня цитохрома с в лизатах лимфоцитов при помощи метода иммуноферментного анализа.

2.2.5. Определение уровня р53 в лизатах лимфоцитов при помощи метода иммуноферментного анализа.

2.2.6. Определение активности каспазы-3 лимфоцитов при помощи флуоресцентного метода.

2.2.7. Выделение ДНК из лимфоцитов и исследование ее структурных свойств методом электрофореза в агарозном, геле.

2.2.8. Исследование структурного состояния ДНК методом ДНК-комет.

2.2.9. Исследование люминолзависимой хемилюминесценции лимфоцитов.

2.2.101 Исследование изменений структурного состояния митохондриальных мембран лимфоцитов при помощи метода флуоресцентных зондов.

2.2.11. УФ-облучение исследуемых образцов.

2.2.12. Системы генерации активных форм кислорода.

2.2.13. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА1 3. Исследование рецепторного- каспазозависимого пути апоптоза лимфоцитов человека, модифицированных воздействием УФ-света и активных форм,кислорода.

3.1. Исследование жизнеспособности лимфоцитов человека после воздействия УФ-излучения и активных форм кислорода.

3.2. Изменения уровня экспрессии рецепторов смерти CD95 лимфоцитов человека после воздействия УФ-света и активных форм кислорода.

3.2.1. Изменения уровня экспрессии рецепторов смерти CD95 лимфоцитов человека после воздействия УФ-света.

3.2.2. Изменения уровня экспрессии рецепторов смерти CD95 лимфоцитов человека после воздействия активных форм кислорода.

3.3. Исследование люминолзависимой хемилюминесценции лимфоцитов человека после воздействия УФ-света и генерации активных форм кислорода. 92.

3.3.1. Исследование люминолзависимой хемилюминесценции лимфоцитов человека после воздействия УФ-света.

3.3.2. Исследование люминолзависимой хемилюминесценции^ лимфоцитов человека после генерации активных форм кислорода*.

3.4. Изменения функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов человека после воздействия УФ-излучения и активных форм кислорода.

3.4.1. Изменения функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов человека после воздействия УФ-излучения.

3.4.2. Изменения функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов человека после воздействия активных форм кислорода.

ГЛАВА 4. Исследование р53-зависимого > пути- апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием УФ-света и активных кислородных метаболитов.

4.1. Структурные модификации ДНК лимфоцитов человека в динамике развития- апоптоза, индуцированного воздействием УФ-излучения и' активных форм кислорода.

4.1.1. Исследование изменений структурного состояния ДНК лимфоцитов, модифицированных воздействием УФ-света, методом электрофореза в агарозном геле.

4.1.2. Исследование изменений структурного состояния ДНК лимфоцитов, модифицированных воздействием- активных форм кислорода, методом электрофореза в агарозном геле.

4.1.3. Исследование изменений структурного состояния ДНК лимфоцитов. человека при помощи метода ДНК-комет.

4.1.3.1. Исследование изменений структурного состояния ДНК лимфоцитов человека, модифицированных воздействием УФ-света, при помощи метода ДНК-комет.ИЗ

4.1.3.2. Исследование изменений структурного состояния ДНК лимфоцитов человека, модифицированных воздействием пероксида водорода, при помощи метода ДНК-комет.

4.2. Изменения уровня р53 в цитозоле лимфоцитов человека, модифицированных воздействием УФ-света и активных форм кислорода.

ГЛАВА 5. Исследование митохондриального пути апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием УФ-света и активных форм кислорода.

5.1. Исследование изменений структурного состояния митохондриальных мембран лимфоцитов человека после воздействия УФ-света и активных форм кислорода.

5.1.1. Исследование изменений структурного состояния митохондриальных мембран УФ-облученных лимфоцитов человека.

5.1.2. Исследование изменений структурного состояния митохондриальных мембран после модификации лимфоцитов активными формами кислорода.

5.2. Изменения уровня цитохрома с в цитозоле лимфоцитов человека, модифицированных воздействием УФ-света и активных форм кислорода.

5.2.1'. Изменения уровня цитохрома с в цитозоле лимфоцитов человека, модифицированных воздействием УФ-света.

5.2.2. Изменения уровня цитохрома с в цитозоле лимфоцитов человека. модифицированных воздействием пероксида водорода.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование путей реализации апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием УФ-света и активных форм кислорода"

Актуальность проблемы. Гибель клеток в результате апоптоза — основное свойство практически всех клеток (M.D. Jacobson et al., 1997). Это обязательный процесс нормального развития органов, тканевого гомеостаза, развития нервной системы и регуляции иммунной системы. Недостаточная илк избыточная гибель клеток ведет к различным заболеваниям человека, включая злокачественные образования, дегенеративные заболевания, иммуноде-фицитные состояния (С.В. Thompson, 1995). Высокая степень координации и стереотипность процессов индуцированной гибели клеток свидетельствуют о том, что клетки активируют типовую программу гибели, к которой сводятся разнообразные пути сигнальной трансдукции (A.M. Chinnaiyan, V.M. Dixit, 1996; E. White, 1996; J. Yang, 1997).

Вместе с тем отсутствуют детальные представления о взаимосвязи отдельных этапов программированной клеточной смерти, составляющих ее основные независимые фазы: инициацию, эффекторную фазу и деградацию, и оценке их временных характеристик. Не менее значимыми представляются вопросы, касающиеся изучения способов инициации различных путей апоптоза (рецепторопосредованного, митохондриального, каспазонезависимого и др.), выяснения точек («сайтов») их интеграции и возможности целенаправ: ленного регулирования процессов клеточной гибели при помощи физико-химических агентов.

УФ-свет известен как потенциальный индуктор апоптоза в различных типах клеток (И.Ф. Донская и др., 1997). Показано, что УФ-свет может индуцировать апоптоз в клетках некоторых лимфоидных линий. Известно, что апоптоз иммунокомпетентных клеток в условиях УФ-В-излучения запускается С095(РаБ/Аро-1)-рецепторно/лигандной системой (R. Caricchio et al., 1998). Однако молекулярные механизмы этого процесса и последовательность начальных этапов развития клеточной гибели в условиях облучения изучены далеко не полностью. Остаются открытыми вопросы, касающиеся выявления способов запуска различных путей реализации апоптоза в условиях воздействия УФ-света.

Особое внимание в последние годы уделяется изучению роли активированных кислородных метаболитов в развитии апоптоза. Известно, что программированная гибель клеток, как правило, сопровождается образованием значительного количества активных форм кислорода. В то же время АФК способны инициировать апоптоз в различных типах клеток (О.Ю. Плетюш-кина и др., 2006). Показано (В.В. Новицкий и др., 2008), что интенсификация внутриклеточной продукции АФК связана с вовлечением митохондриального и TNFR(tumor necrosis factor гесер!ог)-опосредованного путей. Однако, несмотря на очевидную взаимосвязь окислительного стресса с апоптозом, роль АКМ в саморазрушении клеток неясны (Н.К. Зенков и др., 1999).

Цель и задачи диссертационной работы. Целью работы явилось выявление путей реализации апоптоза лимфоцитов периферической крови доноров, индуцированного воздействием УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м" и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода). Задачи работы предусматривали:

2. Исследование изменений функциональной активности эффекторной* каспазы-3 лимфоцитов доноров после УФ-облучения клеток и генера1 ции АФК.

4. Исследование изменений уровня белка р53 в лимфоцитах доноров после У Ф-облучения* клеток и генерации АФК.

УФ-света и АФК на лимфоциты наблюдается повышение уровня экспрессии мембранных Fas-рецепторов смерти по сравнению с интактными клетками. Обнаружено увеличение функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов через 4 ч после генерации синглетного кислорода, гидроксильного радикала и добавления пероксида водорода, а также через 8и24и6и8ч после УФ-облучения клеток соответственно в дозах 151 и 1510 Дж/м . С использованием метода ДНК-комет выявлено, что повреждения ДНК (двунитевые разрывы) появляются сразу после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 1510 и 3020

- О {л

Дж/м" и добавления пероксида водорода в концентрации 10" моль/л (кометы типа С1) и достигают максимума через 6 ч после модификации клеток (кометы типов С2 и СЗ). Установлено, что через 6 ч после воздействия пероксида водорода и УФ-света в дозах 1510 и 3020 Дж/м" на лимфоциты происходит повышение уровня р53 в исследуемых клетках. Сделано заключение о ведущей роли рецепторопосредованного (Fas-зависимого)* каспазного и р53-зависимого путей в реализации апоптоза лимфоцитов, индуцированного воздействием УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м и пероксида водорода (10" моль/л). Предложена схема возможных внутриклеточных событий, приводящих к апоптотической гибели лимфоцитов после их УФ-облучения.

2008); 5-ом съезде Российского фотобиологического общества "Преобразование энергии света при фотосинтезе" (Пущино, 2008); 6-ом Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008);. на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2009" (Москва, 2009); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж,

2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 статей и 8 тезисов, в том числе 2 статьи в журнале системы РАН.

На защиту выносятся следующие положения:

1. В реализации апоптоза лимфоцитов периферической крови доноров, индуцированного воздействием УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510 Дж/м" и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетногб кислорода) ведущая роль принадлежит рецепторопосредованному кас-пазному и р53-зависимому путям. л

2. В условиях УФ-облучения лимфоцитов в дозе 3020 Дж/м осуществляются рецепторопосредованный без участия каспазы-3, р53зависимый и каспазонезависимый пути инициации программированной клеточной гибели.

3. Гибель лимфоцитов в условиях воздействия УФ-света и Н2С>2 происходит через промежуточное состояние С1 с образованием высокомолекулярных фрагментов ДНК (> 300 т.п.н.) и состояние С2, характеризующееся наличием фрагментов ДНК (< 50 т. п.н.) до состояния СЗ, характеризующегося межнуклеосомной фрагментацией ДНК (Nxl80 п. н.).

4. Схема возможных внутриклеточных событий, приводящих к апоптоти-ческой гибели лимфоцитов после их УФ-облучения.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 172 страницы машинописного текста, 4 таблицы, 50 рисунков. Состоит из "Введения", 5 глав, "Заключения", "Выводов" и "Приложения". Список литературы содержит 240 источников, из них 88 - отечественных и 152 — зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Трубицына, Мария Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в течение 1-5 ч после воздействия УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м2 и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода) наблюдается повышение уровня экспрессии мембранных рецепторов смерти - Fas (CD95) — по сравнению с таковым для интактных клеток.

3. Обнаружено повышение функциональной активности эффекторной каспазы-3 по отношению к контролю через 8 и 24 ч; 6 и 8 ч; 4 ч соответственно после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 151; 1510 Дж/м"; воздействия АФК (синглетного кислорода, пероксида водорода, гидроксильного радикала).

4. Выявлена фрагментация ДНК лимфоцитов через 20 ч после воздействия УФ-света в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м" и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода).

5. Установлено, что повреждения ДНК (двунитевые разрывы) появляются сразу после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 1510 и 3020 Дж/м и добавления пероксида водорода в концентрации 10"6 моль/л (кометы типа С1) и достигают максимума через 6 ч после модификации клеток (кометы типов С2 и СЗ).

7. Показано, что через 6 ч после облучения клеток в дозах 1510 и 3020 Дж/м и воздействия пероксида водорода наблюдается повышение уровня белка р53 по сравнению с таковым для интактных лимфоцитов.

9. Нарушения структурного состояния митохондриальных мембран обнаружены после воздействия на лимфоциты УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м", синглетного кислорода и пероксида водорода.

10. Выявлена ведущая роль рецепторопосредованного каспазного и р53: зависимого путей в реализации апоптоза лимфоцитов в условиях воздействия УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м и активных форм кислорода, в частности, пероксида водорода.

11 .Постулируется возможность инициации рецепторопосредованного без участия каспазы-3, р53-зависимого и каспазонезависимого путей

2 i апоптоза в условиях УФ-облучения лимфоцитов в дозе 3020 Дж/м .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При помощи методов иммуноферментного анализа, люминесценции, электрофореза в агарозном геле, ДНК-комет исследованы пути- реализации апоптоза лимфоцитов периферической крови доноров, индуцированного воздействием УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м2 и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала; пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода)

Обнаружено повышение по отношению к контролю уровня экспрессии мембранных рецепторов* апоптотических сигналов CD95 лимфоцитов, суспендированных в питательной среде RPMI-16401 и растворе Хенкса, в течение 1-5 ч после УФ-облучения клеток в использованных дозах. Установлено, что' увеличение экспрессии Fas-рецепторов^ лимфоцитов, модифицированных воздействием УФ-света, в растворе Хенкса связано не только с демаскированием ранее недоступных (скрытых) молекул CD95, но и с синтезом их новых молекул через 4 и 5 после облучения иммуноцитов. Показано, что динамика исследуемого5 параметра суспензии лимфоцитов в условиях воздействия УФ-света. обусловлена изменением уровня5 Fas-рецепторов Т-клеток.

Обнаружено повышение уровня функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов человека по отношению > к, таковому для интактных образцов через 8и24чи6и8ч соответственно после облучения клеток в дозах 151 и

О О

1510 Дж/м". УФ-модификация лимфоцитов в дозе 3020 Дж/м" индуцирует инактивацию каспазы-3.

Установлено, что после 20 ч инкубации лимфоцитов, УФ-облученных в л дозах 151, 1510,' 3020 Дж/м(, происходит фрагментация ДНК, на что указывает совокупность полос («апоптозная лестница») на электрофореграмме, соответствующая фрагментам ДНК меньшего* размера по сравнению с контролем.

Повреждения ДНК (двунитевые разрывы) обнаруживаются сразу после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 (ДНК-кометы типа С1) и достигают максимума через 6 ч после модификации клеток (кометы типов С2 и СЗ). Вероятно, двунитевые разрывы ДНК являются сигналом к запуску апоптоза, осуществляющегося с участием транкрипционного фактора р53, проапоптозного белка Вах и других митохондриальных факторов апоптоза. Изменения структурного состояния митохондриальных мембран были обнаружены нами после воздействия на лимфоциты УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м".

Через 20 ч после облучения лимфоцитов в дозе 151 Дж/м обнаружены фрагменты ДНК с размерами 6000 п.н. и менее 1500 п.н. Использование метода ДНК-комет в этих условиях позволило выявить кометы класса С2, характерные для предапоптотических клеток (фрагменты ДНК < 50 т.п.н.).

Через 20 ч после воздействия на лимфоциты УФ-света в дозе 1510 Дж/м зарегистрировано образование фрагментов ДНК менее 1500 п.н. и ДНК-комет СЗ-класса, что указывает на межнуклеосомную фрагментацию ДНК, характерную для погибающих клеток.

Через 20 ч после воздействия на лимфоциты УФ-света в дозе 3020 Дж/м" обнаружены фрагменты ДНК размером примерно 5000 п.н. и менее 1500 п.н., кометы СЗ- и С4-классов. В этих же условиях наблюдалась инактивация каспазы-3. По-видимому, эти результаты указывают на возможность реализации р53-зависимого пути апоптоза, сопровождающегося выходом из митохондрий AIF - фактора, индуцирующего апоптоз, и индукцией каспазонезависимого пути программированной клеточной смерти. В то же время ингибирование каспаз и снижение уровня АТФ в клетке могут приводить к блокированию фазы деградации апоптоза, переходу апоптоза во вторичный некроз.

Предположение о возможности участия р53 в осуществлении апоптоза лимфоцитов было подтверждено нами после обнаружения (по сравнению с интактными иммуноцитами) более высокого уровня этого белка через 6 ч " после облучения клеток в дозах 1510 и 3020 Дж/м2.

На основании результатов определения уровня цитохрома с в цитозоле лимфоцитов через 1,5 и 4 ч после УФ-облучения клеток предполагается* возможность участия цитохрома с в осуществлении программированной клеточной смерти лимфоцитов человека, индуцированной воздействием УФ-света в минимальной из использованных доз (151 Дж/м ).

Полученные нами результаты позволили сделать заключение о ведущей роли рецепторопосредованного (Fas-зависимого) каспазного пути в реализации апоптоза лимфоцитов после воздействия УФ-света в дозах 151 й 1510 Дж/м~ (рис. 50). УФ-облучение индуцирует активациюг мембранных рецепторов смерти CD95, что приводит к запуску каспазного каскада- и активации эффекторной каспазы-3, следствием чего является фрагментация ДНК. Через 6 ч после облучения клеток, когда выявляется, максимальный уровень повреждений ДНК и рост количества р53 в лимфоцитах по сравнению с контрольными образцами, дополнительно запускается р53-зависимый путь программированной клеточной! смерти, также завершающийся фрагментацией ДНК. В случае УФ-облучения исследуемых клеток в дозе 3020 Дж/м" можно предположить участие рецепторопосредованного без участия каспазы-3 (с участием каспазы-12), р53-зависимого и каспазонезависимого путей реализации1 апоптоза лимфоцитов.

Нельзя исключить и роль ионов кальция в инициации апоптоза (рис. 50), так как обнаружено (М.А. Наквасина и др., 2008)» повышение внутриклеточной концентрации этого иона1 после УФ-облучения лимфоцитов.

При исследовании структурно-функциональных модификаций лимфоцитов человека в динамике развития» апоптоза, индуцированного воздействием АФК, выявлено повышение по сравнению с контролем уровня экспрессии Fas-рецепторов иммуноцитов, суспендированных в среде RPMI-1640, растворе Хенкса, а также их Т-клеточной суспензии.

После 20 часов инкубации лимфоцитов, модифицированных воздействием пероксида водорода (10*6 моль/л) происходит образование фрагментов ДНК, размеры которых составляют 1500-4000 п. н. После обработки лимфоцитов раствором пероксида водорода наблюдали образование комет класса С1, через 6 и 20 ч инкубации модифицированных клеток соответственно - комет С2/СЗ и СЗ/С4 классов. Наибольший объем, повреждений ДНК приходился на время 6 ч после обработки лимфоцитов Н2О2. Через 6 ч регистрировали также повышение уровня р53 в лимфоцитах, модифицированных воздействием пероксида водорода.

Следовательно, полученные результаты свидетельствуют в пользу представления о реализации рецепторопосредованного. каспазного и р53-зависимого путей апоптоза лимфоцитов в условиях воздействия АФК и, в частности, пероксида водорода. По-видимому, структурно-функциональные модификации;лимфоцитов под влиянием АФК вносят определенный вклад в. реализацию последовательности внутриклеточных событий, приводящих к программированной клеточной смерти иммуноцитов в условиях воздействия УФ-света.

Освобождение (мобилизация) Fas-L

Активация фосфоинозитидного пути передачи информации

Повышение уровня Са2+ в цитозоле

Активация каспазы-12

УФ-свет

Плазматическая мембрана лимфоцита

Активация Fas (демаскирование, синтез de novo)

Запуск рецепторного пути апоптоза

Активация каспаз (в т.ч. каспазы-3)

Образование радикальных соединений (в т. ч. АФК)

ДНК 1

Образование разрывов ДНК

Сенсорные белки

Активация киназы ATM

Трансактивация Fas

Активация Вах

Каспазонезависимый путь апоптоза

Экспрессия генов PIG Репрессия гена Bcl-2

Оксидативный стресс

Изменения структурного состояния митохондриальных мембран

Выход AIF

Выход цитохрома с

Повышение уровня цитохрома с

Цитохром-с Снижение независимый <— уровня путь апоптоза цитохрома с

Рис. 50. Схема возможных внутриклеточных событий, приводящих к апоптотической гибели лимфоцитов после их УФ-облучения: > - через промежуточные стадии; L -1 - вклад автора (результаты собственных исследований)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трубицына, Мария Сергеевна, Воронеж

1. Апоптоз клеток Hela и антиапоптозное действие онкобелка Bcl-2 не зависят от дыхания и мембранного потенциала митохондрий / J1. А. Щепина и др. // Биохимия. 2002. - Т. 67, вып. 2. - С. 265-270:

2. Артюхов В.Г. Оптические методы анализа интактных й модифицированных биологических систем / В. Г. Артюхов, О. В. Путинцева. — Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 1996. 240 с.

3. АртюховВ.Г. Структурно-функциональное состояние биомембран и межклеточные взаимодействия / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина. Воронеж. -2008. - 156 с.

4. Барышников А.Ю. Иммунологические проблемы апоптоза / А.Ю. Барышников, Ю.В. Шишкин. М. : Эдитореал УРСС, 2002. - 320 с.

5. Борисов Л. Б; Медицинская- микробиология, вирусология, иммунология / Л.Б. Борисов. М. : Медицинское информационное агентство, 2001. — 736 с.

6. Бра М. Митохондрии в программированной гибели клетки: различные механизмы гибели / М. Бра, Б. Квинан, С.А. Сузин // Биохимия. 2005. — Т. 70, вып. 2.-С. 284-293.

7. Брондз Б.Д. Молекулярные и клеточные аспекты иммунологического рас-познвания / Б.Д. Брондз, О.В. Рохлин. — М. : Наука, 1978. — 336 с.

8. Влияние ультрафиолетового света и дексаметазона на функциональные свойства лимфоцитов и нейтрофилов В.Г. Артюхов и др. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2005. - Т. 45, № 2. - С. 196-200.

9. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз / Н.К. Зенков и и др. // Успехи современной биологии. 1999. - Т. 119, № 5. - С. 440-450.

10. Волгарева Е.В. Влияние УФ-облучения в терапевтической дозе и УФ-облученной крови на пролиферативную и рецепторную- активность ауто-логичных лимфоцитов / Е.В. Волгарева // Цитология. 1991. - № 9. - С~ 59.;

11. Волгарева Е.В. Влияние УФ-облучения и УФ-облученной аутологичной крови на функциональное состояние лимфоцитов периферической крови человека / Е.В. Волгарева, А.П. Волгарев, К.А. Самойлова // Цитология. — 1990. -№ 12.-С. 1217-1223.

12. Вольский Н.Н. Влияние супероксидного радикала на пролиферацию лимфоцитов, стимулированную митогеном / Н.Н. Вольский, Н.В. Кашлакова, В.А. Козлов // Цитология. — 1988. — Т. 30, № 7. — С. 898—902.

13. Галактионов В.Г. Иммунология / В.Г. Галактионов. М. : Изд-во МГУ, 1998.-480 с.

14. Гамалей И.А. Перекись водорода как сигнальная молекула / И.А. Гамалей, И.В. Клюбин // Цитология. 1996. - Т. 38, № 12. - С. 1233-1247.

15. Двурекова Е.А. Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной-системы в условиях УФ-облучения: дис. . канд. биол. наук / Е.А. Двурекова. — Воронеж, 2005.-208 с.

16. Дмитриев Е.В. Модуляция структурно-функциональных изменений- мемт бран Т- и В-лимфоцитов крови человека некоторыми химическими и физическими агентами: дис. . канд. биол. наук / Е.В. Дмитриев. — Воронеж, 2003. — 161 с.

17. Иммунология / Е.С. Воронин и др.; Под ред. Е.С. Воронина. — М. : Колос-Пресс, 2002 .- 405 с.

18. Кассирский И. А. Клиническая гематология / И.А. Кассирский, Г.А. Алексеев. М. : Медгиз, 1955. - С. 61-88.

19. Кетлинский С.А. Роль Т-хелперов типов 1 и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета / С.А. Кетлинский // Иммунология. — 2002. — N22. С. 77-79.

20. Клинико-иммунологические параллели при лечении больных аутотранс-фузией УФ-облученной крови / А.Ф. Гаврилова и др. // Механизмы влияния облученной ультрафиолетовыми лучами крови на- организм человека и животных. Л., 1986. — С. 74-79.

21. Колтаков И.А. Исследование структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов крови человека при модификации а-интерфероном. и в условиях УФ-облучения: Автореф. дис. . канд. биол. наук / И.А.Колтаков. — Воронеж, 2007. 24 с.

22. Косолапов В.А. Хемилюминесцентные методы в оценке свободноради-кальных реакций / В.А. Косолапов, О.В. Островский, А. А. Спасов // Клин, и лаб: диагност. 1999. - № 9. - С. 41.

23. Красновский^А.А. Синглетный молекулярный кислород: механизмы образования и пути дезактивации в фотосинтетических системах / А.А. Крас-новский // Биофизика. — 1994: — Т. 39, вып. 2. — С. 236—250.

24. Крыленков В.А. Электронно-микроскопическое исследование поверхности необлученных и УФ-облученных лимфоцитов крови человека / В. А. Крыленков, М. С. Брудная, Я. Ю. Комиссарчик // Цитология. — 1983. Т. 25, №4.-С. 476-481.

25. Куклина Е. М. сАМФ-зависимая сигнальная трансдукциЯ|В контроле активации Т-лимфоцитов / Е. М. Куклина, С. В. Ширшев // Биохимия, 2000. — Т. 65, вып. 6.-С. 741-752.

26. Кульберг А .Я. Молекулярная иммунология / А.Я. Кульберг. — М. : Высш. шк., 1985.-287 с.

27. Куцый М.П. Участие протеаз в апоптозе / М.П. Куцый, Е.А. Кузнецова,

28. A.И. Газиев // Биохимия 1999: - Т. 64, № 2. - С. 149-163.

29. Лимфоциты: методы / Под ред. Дж. Клауса. — М.: Мир, 1990 — 395 с.

30. Лонская И.А. Индукция и подавление апоптоза в тимоцитах крысы ультрафиолетовым облучением / И.А. Лонская, В.Н. Афанасьев, В.А. Печатников // Биофизика. 1997. - Т.42, вып. 3. - С. 680-685.

31. Мартынова Е.А. Влияние сфинголипидов на активацию Т-лимфоцитов / Е.А. Мартынова // Биохимия. 1998. -Т.63, № 1. - С. 122-132.

32. Маянский А.Н. Реактивность и медиаторные функции интестинальных эпителиоцитов в системе мукозального гомеостаза / А.Н. Маянский, И.В: Маянская // Иммунология. 2004. - № 3. - С. 185-192.

33. Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меныци: кова, Н.К. Зенков // Успехи современной биологии. — 1997. — Т. 117, вып. 2.-С. 155-157.

34. Михилева Е.А. Модуляция физико-химическими- агентами структурно-функционального состояния нейтрофилов крови человека: дис. . канд. биол. наук / Е.А. Михилева. Воронеж, 2006. - 20 Г с.

35. Модуляция апоптоза мононуклеаров в условиях окислительного стресса /

36. B.В. Новицкий, и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. - Т. 45, №3.-С. 251-254.

37. Молекулярная биология клетки : В 5 т. / Б. Албертс, Д; Брей, Дж. Льюис, М. Рэфф, К. Роберте, Дж. Уотсон ; Пер. с англ. под ред. Р.П. Георгиева. — М. : Мир, 1986.

38. Наградов Н.К. Взаимодействие «гидрофобной пробы» 1-анилин-8-нафталинсульфоната с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой / Р.А.

39. Асриянц // Доклады АН СССР.-1971.-Т. 199,№2.- С. 474-477.

40. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. Е.Б. Меньшикова и др.. М. : Слово. - 2006. - 556 с.

41. Осипов А.Н. Активированные формы кислорода и их роль в организме / А.Н. Осипов, О.А. Азизова, Ю.А. Владимиров // Успехи биол. химии. -1990.-Т. 31.-С. 180-208.

42. Пероксид водорода, образуемый внутри митохондрий; участвует в neper даче апоптозного сигнала от клетки к клетке / О.Ю. Плетюшкина и др. // Биохимия. 2006. - Т. 71, № 1, С. 75-84.

43. Петров Р.В. Иммунология / Р.В. Петров. М. : Медицина, 1987. — 416 с.

44. Пол У. Иммунология: в 3 т. / У. Пол, А. Сильверстайн, М. Купер и др.; перевод* с англ. Т. И. Власик; под ред. У. Пола.-М. : Мир, 1987-Т. 1. 476 с.

45. Практикум по иммунологии / И.А. Кондратьева и др.; Подг ред. И.А. Кондратьевой, В.Д. Самуилова. М. : Изд-во Моск. ун-та, 2001. - С. 3031.

46. Разумовский С.Д. Кислород — элементарные формы и свойства / С.Д. Разумовский. -М.: Химия, 1979. 126 с.

47. Робинсон М.В. Морфология и метаболизм лимфоцитов / М.В. Робинсон, А. Б. Топоркова, В. А. Труфакин. Новосибирск : Наука, 1986. — 128 с.

48. Ройт А. Основы иммунологии / А. Ройт / Пер. с англ. М. : Мир, 1991. — 328 с.

49. Савостина И.Е. Исследование влияния УФ-света и иммуномодуляторов на антиоксидантный статус и состояние мембран лейкоцитов. Автореф. дис. . канд. биол. наук. Воронеж, 2005. 23 с.

50. Самойлова К. А. Выход веществ* из лимфоцитов периферической крови человека, облученных коротковолновыми УФ-лучами / К. А. Самойлова, А. П. Миронова, Г. А. Арцишевская // Цитология. — 1984. — Т. 26, № 1. С. 102-107.

51. Самуилов В.Д. Программируемая клеточная смерть / В.Д. Самилов, А.В. Олескин, Е.М. Лагунова // Биохимия. 2000. - Т. 65, вып. 8. — С. 10291046.

52. Свободные радикалы в биологии: в 2-х т. / Под ред. У. Прайора. — М.: Мир, 1979.—Т. 1. —320 с.

53. Сидорик Е.П. Биохемилюминесценция клеток при опухолевом процессе / Е.П. Сидорик, Е.А. Баглей, М.И. Данко. — Киев: Наукова думка, 1989. —г 218 с.

54. Сидорова Е.В. Субпопуляции В-лимфоцитов и их функциональная роль / Е.В. Сидорова// Успехи современной биологии. 2002. — Т. 122, № 5. — С. 467-479.

55. Стимулирующее действие УФ-излучения на активность антител и комплемента крови человека / К.А. Самойлова и др. // Механизмы влияния облученной ультрафиолетовыми лучами крови на организм человека и животных Л., 1986. - С. 226-237.

56. Теория и практика иммуноферментного анализа / Под ред. В. А. Егорова. М. : Высшая школа, 1991. - 288 с.

57. Тронов В. А. Метод ДНК-комет индивидуальных клеток. Принцип и применение метода / В.А. Тронов, И.И. Пелевина // Цитология. 1996. — Т.38, №4/5. С. 631-641.

58. Тронов В.А. Механизм радиационной гибели лимфоцитов периферической крови человека, оцениваемой методом ДНК-комет / В.А. Тронов, Д.Г. Терещенко, М! А. Коноплянников // Биофизика. — 1998. — Т. 43, № 1. -С. 115-124.

59. Тронов В.А. Репарация ДНК и апоптоз. / В.А. Тронов // Цитология. — 1999. -Т. 41, №5.-С. 405-411.

60. Тронов В.А. Репарация ДНК и гибель покоящихся лимфоцитов крови человека, индуцированные перекисью водорода / В.А. Тронов, В.М. Константинов // Биохимия. — 2000. — Т.65, вып.1. — С. 1516-1524.

61. Турпаев К.Т. Активные формы-кислорода и регуляция экспрессии генов / К.Т. Турпаев // Биохимия. 2002. - Т. 67. - С. 281-292.

62. Ушакова Т.А. Механизм и роль апоптоза при патологии: актуальность ис-1 следования в комбустиологии (обзор литературы)' / Т.А. Ушакова, А.А.

63. Карелин, А.Г. Глоба // Комбустиология, электронная версия, 2004. №14.

64. Финкелыптейн Б.Б. Опыт применения аутотрансфузии УФ-облученной крови в детской дерматологии / Б.Б. Финкельштейн, Ф.А. Зверькова, Ю.В.ч i

65. Попов // Механизмы влияния облученной ультрафиолетовыми лучами крови на организм человека и животных. JL, 1986. - С. 122-132.

66. Фотобиология и мембранная биофизика / Под ред. И.Д. Волотовского. —-Минск.: Технопринт, 1999. 352 с.

67. Фрейдлин И.С. Иммунная система и ее дефекты: руководство для врачей / И.С. Фрейдлин. — СПб: НТФФ : «Полисан», 1998. 113 с.

68. Хаитов P.M. Иммунология / P.M. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. М. : Медицина, 2000. - 432 с.

69. Хаитов P.M. Иммунология : учебник для вузов с компакт-диском : учебник для студ. мед. вузов / P.M. Хаитов. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 311 с.

70. Хаитов P.M. Экологическая иммунология / P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин; Х.И. Истамов. М. : Изд - во ВНИРО, 1995. - 219 с.

71. Ярилин А. А. Основы иммунологии : Учебник для студ. мед. вузов / А.А. Ярилин . М. : Медицина, 1999. - 606 с.

72. A hemopoietic specific gene encoding a smallGTP binding protein is overex-pressed during T cell activation»/ L. Reibel et al. // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1991. - V. 175. - P. 451-458.

73. Adams JiM. The Bcl-2 Protein Family: Arbiters of Cell Survival / J.M. Adams, S. Cory // Science. 1998.- V. 281. -P. 1322-1326.

74. Adenosine: an endogenous inhibitor of neutrophil-mediated injury to endothelial cells / B.N. Cronstein et al. // J. Clin. Invest. 1986. - V. 78. - P. 760770.

75. Albina J.E. Role of nitric oxide in mediation of macrophage cytotoxicity and apoptosis / J.E. Albina and J.S. Reichner // Cancer and Metastasis Reviews. — 1998.-V. 17.-P. 39-53.

76. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: Implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide / Beckman J.S. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87.-P. 1620 -1624.

77. Aravind L. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery / L. Aravind, V.M. Dixit, E.V. Koonin // Trends Biochem Sci. 1999. - V. 24, №2. -P. 47-53.

78. Bandy B. Mitochondrial mutations may increase oxidative stress — Implications for carcinogenesis and aging / B. Bandy, A.J. Davison // Free Radical Biol, and Med. 1990. - V. 8. - P. 523-535.

79. Bast A. Oxidants and antioxidants: State of the art / A. Bast, G.R.M.M. Haenen,

80. C.J.A. Doelman // Amer. J. Med. 1991. -V. 91. - P. 2S-13S.

81. Basu-Modak S., Tyrell R.M. Singlet oxygen: a primary effector in the ultraviolet A / near-visible light induction of the human heme oxygenase gene / S.Basu-Modak, R.M. Tyrell // Cancer Res. 1993. - V. 53. - P.4510-4550.

82. Berki T. Photo-immunotargeting with haematoporphyrin conjugates activated by a lowpower He-Ne laser / T. Berki; P. Nemeth // Cancer Immunol, and Im-munother. 1992. - V. 35. - P. 69-74.

83. Bokoch G.M. The role of small GTP-binding proteins in leukocyte function / G.M. Bokoch, U.G. Knaus // Curr. Opin. Immunol. 1994. - V. 6. - P. 98-105.

84. Bossy-Wetzel E. Mitochondrial cytochrome с release in apoptosis occurs upstream of DEVD-specific caspase activation and independently of mitochondrial transmembrane depolarization / E. Bossy-Wetzel, D.D Newmeyer,

85. D.R. Green // EMBO J. 1998.-V. 17.- P. 37-49.

86. Cadenas E. Low-level chemiluminescence of biological systems / E. Cade-nas, A. Boveris, Bv. Chance // Methods in Enzymology. 1984. - V. 105. - P. 211-242.

87. Caricchio R. Fas/Fas Ligand Interactions Are Involved in Ultraviolet-B-Induced Human Lymphocyte Apoptosis / R. Caricchio, E.A. Reap, P.L. Cohen // The Journal of Immunology. 1998. - V. 161. - P. 241-251.

88. Cell Surface Trafficking of Fas: A Rapid Mechanism of p53-Mediated Apoptosis / M. Bennett et al. // Science. 1998. - V. 282. - P.290-293.

89. Chemiluminescence determination of hydroperoxides following radiolysis and photolysis of free amino acids / S. Robinson et al. // FEBS Lett. 1998. -V. 430, №3.- P. 297-300.

90. Chinnaiyan A.M. The cell-death machine / A.M. Chinnaiyan, V.M. Dixit // Curr. Biol. 1996. - V. 6. - P. 555-562.

91. Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis / G.M. Cohen // Bio-chem. J. 1997.-V. 326.-P. 1-16.

92. Collier J. Endothelium-derived relaxing factor is an endogenous vasodilator in man / J. Collier, P. Vallanse // British. J. Pharmacol. 1989. - V. 97. - P. 639-641.

93. Cornwell D.G. Fatty acid paradoxes in the control of cell proliferation: Prostaglandins, lipid peroxides, and cooxidation reactions / D.G. Cornwell, N. Morisaki // Free Radicals in Biology. 1984. - V. 6. - P. 96-149.

94. Do human neutrophils form hydroxyl radical? Evaluation of an unresolved controversy / M.S. Cohen et al. // Free Radical Biol, and Med. 1988. - V. 5. -P. 81-88.

95. Kulms D. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis / D. Kulms, T. Schwarz // Photodermatol Photoimmunol Photomed. 2000. - V. 16. — P. 195-201.

96. Ashkenazi A. Death Receptors: Signaling and Modulation / A. Ashkenazi, V.M. Dixit//Science. 1998.-V.281.-P. 1305-1308.

97. Differential requirement for caspase-9 in apoptotic pathways in vivo / R.Hakem et al. // Cell. 1998. - V. 94, № 3. - P.339-52.

98. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function / W. Droge // Physiol. Rev. 2002. - V. 82. - P. 47-95.

99. Dougherty T.J. Photodynamic therapy / T.J. Dougherty, S.L. Marcus // Eun J. Cancer. -1992. V. 28A. - P. 1734-1742.

100. Dysregulated Fas and Bcl-2 expression leading to enhanced apoptosis in T-cell of multiple myeloma patients / M. Massaia et al. // Blood. — 1995. V. 85.-P. 3679-3687.

101. Earnshaw W.C. Mammalian caspases: Structure, activation, substrates and functions during apoptosis / W.C. Earnshaw, L.M. Martins, S.H. Kaufmann // Annu. Rev. Biochem. 1999. -V. 68. - P. 383-424.

102. Engel P. Expression of bcl-2 in fetal thymus, thymomas and thymic carcinomas. Association with p53 expression and review of the literature / P. Engel", D. Francis, N. Graem // APMIS. 1998 - V. 106. - P 449 - 455.

103. Ermak G. Calcium and oxidative stress: from cell signaling to cell death / G.Ermak, K.J. Davies // Mol. Immunol. 2002. - V. 38, № 10. - P. 713-721.

104. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages / V. A. Fadok et al. // J: Im Munol. 1992. - V. 148, № 7. - P. 2207-2216.

105. Free radicals and other reactive oxygen metabolites in inflammatory bowel disease / M.L. Harris et al. // Pharmacol, and Therapy. 1992. - V. 53. - P. 375-408.

106. Freeman B.A. Biology of disease: free radicals and tissue injury / B.A. Freeman, J.D. Crapo // Lab Invest, (1982). 47, 412-426.

107. Frei B. Ascorbate is an outstanding antioxidant in human plasma / B. Frei, L. England, B.N. Ames//PNAS USA-1989.-V. 86.-P. 6337-6381.

108. Goeptar A.R. Oxygen and xenobiotic reductase activities of cytochrome P450 / A.R.Goeptar, H. Scheerens, N.P. Vermeulen // Crit. Rev. Toxicol. -1995.-V. 25.-P. 25-65.

109. Golstein P. Cell death: TRAIL and its receptors / P. Golstein // Current Biol. 1997. - V. 7. - P. R750-R753.

110. Goldstein S. Mannitol as an OH" scavenger in aqueous solutions and in biological systems / S. Goldstein, G. Czapski // Int. J. Radiat. Biol. 1984. - V. 46. - P. 725-729.

111. Green D. R. Apoptosis. Death deceiver / D.R. Green // Nature. 1998.-V. 396. - P. 629-630.

112. Green D. R. Apoptotic pathways: the roads to ruin / D.R. Green // Cell. -1998.-V. 94, №6-P. 695-698.

113. Green D.R. Mitochondria and Apoptosis / D.R. Green, J. Reed // Science. -1998.-V. 281.-P. 1309-1312.

114. Green D.R. T cell development: some cells get all the breaks / D.R. Green, M. Schuler // Nat. Immunol. 2000. - V. 1. - P. 15-17.

115. Gross A. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis / A. Gross, J. M. McDonnell, S. Korsmeyer // Genes Dev. 1999. - V. 13. - P. 1899-1911.

116. Hamers M.N. Oxidative stress in human neutrophilic granulocytes: Host defense and self-defense / M.N. Hamers, D. Roos // Oxidative stress. 1985. - V. 145.-P. 351-381.

117. Hansen R. p53; from inductive signal to cellular effect / R. Hansen, M. Oren // Curr. Opin. Genet. Develop. 1997. - V. 7, № 1. - P.46-51.

118. Harman D. Free radicals theory of aging / D. Harman // Mutat. Res. 1992. - V. 275. - P. 257-266.

119. Haunstetter A. Apoptosis: Basic mechanisms and implications for cardiovascular disease/ A. Haunstetter, S. Izumo // Circ. Res. 1998. - V. 82. - P. 1111-1129.

120. Hengartner M. Apoptosis. Death by crowd control / M. Hengartner // Science. 1998. - V. 281.-P. 1298-1299.

121. Huppertz B. The apoptosis cascade morphological and immunohistochemi-cal methods for its visualization / B. Huppertz, H.-G. Frank, P. Kaufmann // Anat. Embryol. - 1999. - V. 200. - P. 1-18.

122. Imlay J.A. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli / J. A. Imlay, I. Fridovich // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P.6957-6965.

123. Jacobson M.D. Programmed cell death in animal development / M.D. Jacob-son, M. Weil, M.C. Raff// Cell. 1997. - V. 88. - P. 347-354.

124. Juond A.F. Effects of oxygen intermediates on cellular functions / A.F. Juond // Amer. Revs. Respir. Dis. 1987. - V. 135. - P.S32-S34.

125. Kanofsky J!R. Singlet oxygen production by biological systems / J.R. Kanofsky // Chem.-Biol. Interact. 1989. - V. 70. - P. 1-8.

126. Kidd VJ. Proteolytic activities that mediate apoptosis / V.J. Kidd // Annu. Rev. Physiol. 1998. - V. 60. - P.533-573.

127. Klebanoff S.J. Myeloperoxidase: contribution to the microbicidal activity of intact leukocytes / S.J. Klebanoff// Science. 1970. - V. 169. - P. 1095-1097.

128. Koga S. Mechanism for the generation of superoxide anion and singlet oxygen during heme compound-catalyzed linoleic acid hydroperoxide decomposition / S. Koga, M. Nakano, K. Uehara // Arch. Biochem. and Biophys. — 1991. — V. 289. P. 223-229.

129. Kohler C. Evaluation of caspase activity in apoptotic cells / C. Kohler, S. Orrenius, B. Zhivotovsky // J. Immunol. Methods. 2002. - V. 265. - P. 97110.

130. Koppenol W.H. The Centennial of the Fenton reaction / Koppenol W.H. // Free Rad. Biol. Med.- 1993. V. 15. - P. 645-651.

131. Kroemer G. The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis / G. Kroemer // Nature Med. 1997. - V. 3. - P. 614-620.

132. Kroemer G. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis / G. Kroemer, B. Dallaporta, M. Resche-Rigon // Annu. Rev. Physiol. 1998. -V. 60. P. 619-642.

133. Kroemer G. Mitochondrial control of apoptosis / G. Kroemer, N. Zamzami, S.A. Susin. Immunol. Today. - 1997. -V. 18. P. 44-51.

134. Krueger 312-nanometer Ultraviolet В Light (Narrow-Band UVB) Induces Apoptosis of T Cells within Psoriatic Lesions Exp / M. Ozawa et al. // Med — 1999. V. 189, № 4. — P.711-718.

135. Krutmann J. Involvement of cytokines, DNA damage, and reactive oxygen intermediates in ultraviolet radiation — induced modulation of intercellular adhesion molecule-1 expression / J. Krutmann, M. Grewe // J. Invest. Dermatol. -1995.-V. 105.-P. 67-70.

136. Kulms D: Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis / D. Kulms; T. Schwarz // Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 2000. - V. 16. - P. 195-201.

137. Kumar S. Prodomains, adaptors, oligomerization: the pursuit of caspase activation in apoptosis / S. Kumar, P.A. Colussi // Trends Biochem. Sci. 1999. -V. 24.-P. 14.

138. Cytochrome с and dATP-dependent formation of Apaf-l/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade / P. Li et al. // Cell. — 1997. V. 91. P. 479-489.

139. Liang H. Three-dimensional structures of proteins involved in programmed cell death / H. Liang, S.W. Fesik // J. Mol. Biol. 1997. - V. 274, № 3. - P. 291-302.

140. Role of tissue glutation in prevention of surgical trauma / P.T. Liu et al. // Xenobiotica. 1993. - V. 23. - P. 899-911.

141. Induction of the apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome с / X. Liu et al. // Cell. 1996. - V. 86. P. 147-157.

142. Apoptosis inducing factor (AIF): a phylogenetically old, caspase-independent effector of cell death / Lorenzo H.K. et al. // Cell Death Differ.1999.-V. 6.-P. 516-524.

143. Cytochrome с is rapidly released from the cell upon apoptosis induction: a new marker for cell death in vivo / M. Los et al. // IFES Congress, Poland,2000.

144. Loss of Function of Cytochrome с in Jurkat Cells Undergoing Fas-mediated Apoptosis / A. Krippner et al. //jbc online. 1996. - V. 271, № 35. - P. 2162921636.

145. Lovaas E. Free radical generation and coupled thiol oxidation by lactoper-oxidase/SCN7H2C>2 / E. Lovaas // Free Radical Biol, and Med. 1992. - V. 13. -P. 187-195.

146. The Caspase-3 Precursor Has a Cytosolic and Mitochondrial Distribution: Implications for Apoptotic Signaling / M. Mancini et al. // JCB. 1998. - V. 140.-P. 1485-1495.

147. Martin S.J. Ultraviolet В Irradiation of Human Leukaemia HL-60 Cells in Vitro Induces Apoptosis / S.J. Martin, T.G. Gotter // Int. J. Radiat. Biol. -1991. -V.59.-P. 1001-1016.

148. McCordJ. M. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocu-prein (hemocuprein) / J.M. McCord, I. Fridovich // J. Biol. Chem. 1969. -V. 244.-P. 6049-6055.

149. McCaughan J.S. Photodynamic therapy: a review / J.S. McCaughan // Drugs Aging. 1999. - V. 15. - P. 49-68.

150. Mehmet H. Apoptosis Caspases find a new place to hide / H. Mehmet // NATURE. - 2000. - V.403. - P. 29-30.

151. Meikrantz W. Apoptosis and the cell cycle / W. Meikrantz, R. Schlegel // J. Cell. Biochem., 1995.-V.-58.-P. 160-174.167. p53 Phosphorylation: biochemical and functional consequences / G.J. Milczarek et al.//Life Sci. 1997. V. 60, № l.-P.l-ll

152. Milner J. Structures and functions of the tumor suppressor p53 / J. Milner Pathol. Biol. (Paris). 1997. - V. 45, № 10. - P. 797-803.

153. Moncada S. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology / S. Moncada, R.M.J. Palmer, E.A. Higgs // Pharmacol. Revs. 1991. - V. 43. -P. 109-142.

154. Mullarkey C.J. Free radical generation by early glycation products: a mechanism for accelerated atherogenesis in diabetes / C.J. Mullarkey, D. Edelstein, M. Brownlee // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1990. — V. 173, № 3. P. 932-939.

155. An induced proximity model for caspase-8 activation / M. Muzio et al. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 2926-2930.

156. Nagata S. Apoptosis by death factor / S. Nagata // Cell. 1997. - V. 88. - P. 355-365.

157. Caspase-12 mediates endoplasmic reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-b / T. Nakagawa et al. // Nature. 2000. -V. 403. - P. 98103.

158. Biological Sources of Reduced Oxygen Species. In: Analysis of Free Radicals in Biological Systems. / A.E. Favier et al. // eds., Basel, Boston, Berlin: Birkhauser.- 1995.-P. 11-19.

159. Noronha-Dutra A.A. Reaction of nitric oxide with hydrogen peroxide as a model for nitric oxide-mediated killing / A.A. Noronha-Dutra, M.M. Epperlein, N. Woolf // FEBS Lett. 1993. - V. 321. - P. 59-62.

160. Optical measurement of the catalase-hydrogen peroxide intermediate (Compound I) in the liver of anaesthetized rats and its implication to hydrogen peroxide production in situ / N. Oshino et al. // Biochem J. 1975. — V. 146, № 1. -P. 67-77.

161. Protective role of vitamin E in biological systems / L. Parker // Am. J. Clin. Nutrition.-1991.-V. 53.-P. 150S-1055S.

162. Perez H.D. Generation of a chemotactic lipid from arachidonic acid by exposure to a superoxidegenerating system / H.D. Perez // Inflammation. 1980. -V. 4.-P. 313-328.

163. Perspectives on the mitochondrial permeability transition / P.Bernardi et al. // Biochim. Biophys. V. 1365. - P. 200-206.

164. Peter M.E. Advances in apoptosis research / M.E. Peter, A.E Heufelder, M.O. Hengartner // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. - V. 94. - P. 12736-12737.

165. Free radicals and inflammation: superoxidedependent activation of a neutrophil chemotactic factor in plasma / W.F. Petrone et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - V. 77. - P. 1159-1163.

166. Physico-chemical modeling the role of free radicals in photodynamic therapy / A. Nemeth et al. // Biochem. and Biophys. Res. Commun. — 1999i — V. 255, №2. -P. 360-366.

167. Physiological production of singlet molecular oxygen in the myeloperoxi-dase-H202-chloride system / C. Kiryu et al. // FEBS Lett. 1999. - V. 443. -P. 154-158.

168. Popov I. Photochemiluminescent detection of antiradical activity / I. Popov, G. Levin//Luminescence. 1999. -V. 14, №3.-P. 169-174.

169. Possible contribution of apoptosis-inducing factor (AIF) and reactive oxygen species (ROS) to UVB-induced caspase-independent cell death in the T cell line Jurkat / H. Murahashi et al. // Journal of Leukocyte Biology. 2003. -V.73. — P.399-406.

170. Prodczacy J.J. Reduction of iodonitrotetrazolium violet by superoxide radicals / J.J. Prodczacy, R. Wei // Biochem. and Biophys. Res. Comm. 1988. — V. 150.-P. 1294-1301.

171. Pooled analysis of p53 mutations in hematological malignancies. M. Proko-cimer et al.. Hum. Mutat. - 1998.-V. 12, № l.-P. 4-18.

172. Pryor W.A. Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes, and reactions / W.A. Pryor // Ann. Rev. Physiol. 1986. - V. 48. - P. 657-667.

173. Raff M. (1998). Cell suicide for beginners / M. Raff»// Nature. V. 396. - P. 119-122.

174. Reed J.C. Bcl-2 family proteins and mitochondria / J.C. Reed, J.M. Jur-gensmeier, S. Matsuyama // Biochim. Biophys. Acta. 1998. — V. 1366. P. 127-137.

175. Reed, J.C. Cytochrome c: can't live with it -can't live without it / J.C. Reed. Cell. - 1997. - V. 91, № 5. - P. 559-62.

176. Regulation of apoptotic protease activating factor—1 oligomerization and apoptosis by the WD-40 repeat region / Adrain C. et. al. // J. Biol. Chem. — 1999. V. 274. P. 20855-20860.

177. Riley J.C.M. Oxygen radicals and reactive oxygen species in reproduction / J.C.M. Riley, H.R. Behrman // Proc. Soc. Exp. Biol, and Med. 1991. - V. 198.-P. 781-791.

178. RGD peptides induce apoptosis by direct caspase-3 activation / C.D. Buckley et al. // Nature. V.397. - P. 534-539.

179. Caricchio R. Fas/Fas Ligand Interactions Are Involved in Ultraviolet-B-Induced Human Lymphocyte Apoptosis / R. Caricchio, E.A. Reap, P.L. Cohen //The Journal of Immunology. 1998. - V. 161. - P. 241-251.

180. Role of cytochrome с and dATP/ATP hydrolysis in Apaf-1-mediated'cas-pase-9 activation and apoptosis/ Y. Hu et al.'// EMBO J. 1999. - V. 18, № 18.-P. 3586-3595.

181. Rubanyi C.M: Vascular effects, of oxygen-derived free radicals / C.M. Rubanyi // Free Radical Biol, and,Med. 1988: - V. 4. - P. 107-121.

182. Ruoslahti R. A new way to active caspases / R. Ruoslahti, J. Reed // Nature. 1999. - V. 397. - P. 479-480.

183. Sajithal G.B. The role of metalcatalysed oxidation in the formation of advanced glycation end products: an in vitro study on.collagen,/ G.B. Sajithal, P. Chithra, G. Chandrakasan // Free Radic. Biol'. Med. 1998. - V. 25. - P. 264269.

184. Saran M. Radical functions in vivo: a critical review of current concepts and hypotheses / M. Saran, C. Michel, W. Bors // Naturforsch С. 1998. - V. 53, №3-4.-P. 210-227.

185. Servomaa К. UV light and ionizing radiations cause programmed death of rat chlorleukemia cells by inducing retropositions of a mobile DNA element (LIRn) / K. Servomaa, T. Rytomaa // Int. J. Radiat. Biol. 1990. - V. 57, № 2. -P. 331-343.

186. Shaw P.H. The role of p53 in cell cycle regulation / P.H. Shaw Pathol. Res. Pract. 1996. -V. 192, № 7. - P. 669-675.

187. Singlet oxygen ('Ag 02) as the principal oxidant in myeloperoxidase-mediated bacterial killing in neutriphil phagosome / H. Tatsuzawa et al. // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1999. - V. 262. - P.' 647-650.

188. Sjoodin B. Biochemical1 mechanisms for oxygen free radical formation during exercise / B. Sjoodin, Y.H. Westing, E.S. Apple // Sports Med. 1990. - V. 10.-P. 236-254.

189. Skulachev V.P. Cytochrome с in the apoptotic and antioxidant cascades / V.P. Skulachev // FEBS Lett. 1998.- V. 423.- P. 275-280.

190. Ordering the cytochrome c- initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2,-3,- 6,-7,-8, and -10 in a caspase-9-dependent manner / E.A. Slee et ah. // J. Cell Biol. 1999. - V. 144, № 2. - P.281-292.

191. The WD repeat: a common architecture for diverse functions / T.F. Smith et al. // Trends Biochem. Sci. 1999. - V. 24. - P. 181-185.2091 p53: prospects for cancer gene therapy / Soddu S. et al. // Cytokines Cell Mol. Ther. 1998. - V. 4,№3.-P. 177-185.

192. The p53 tumour suppressor gene // Steele R.J. et al. // Br. J. Surg. 1998. -V. 85, № 11.-P. 1460-1467.

193. Steinbeck M.J. Intracellular singlet oxygen generation by phagocytosing neutrophils in response to particles coated with a chemical trap / M.J Steinbeck, A.U. Khan, M.G. Karnovsky // J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - P. 1342513423.

194. Sundqvist T. Bovine aortic endothelial cells release hydrogen peroxide / T. Sundqvist//J. Cell. Physiol.-1991.-V. 148.-P. 152-156.

195. Mitochondrial release of caspase-2 and -9 during the apoptotic process / SusinS.A. et al. //J. Exp. Med. 1999.-V. 189. - P. 381-394.

196. Takahama U. Hydrogen peroxide-dependent generation of singlet molecular oxygen by human saliva: Its detection by chemiluminescence from a cypridina luciferin analog / U. Takahama // Photochem. and Photobiol. — 1993. V. 57. -P. 376-379.

197. The release of cytochrome с from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis / R.M. Kluck // Science. 1997. - V. 275: - P. 11321136.

198. The* superoxide generating system of В cell lines. Structural homology with the phagocytic oxidase and triggering' via surface Ig / F.E. Maly et al.- // J. Immunol. 1988. - V. 140. - P. 2334-2339.

199. Thompson C.B: Apoptosis in the pathogenesis and'treatment of disease i C.B. Thompson // Science. 1995. - V. 267. - P. 1456-1462.

200. Thombery N.A. Caspases: Enemies Within / N.A. Thombery, Y. Lazebnik // Science. 1998-.-V. 281.-P. 1312-1316.219: p53 from basic research to clinical applications / O. Tominaga et al. Crit. Rev. Oncog. 1992. - V. 3, № 3. - P. 257-282.

201. The* fight of viruses against apoptosis / J. Tschopp et al. // Curr. Opin. Gen. Develop. 1998. - V. 8, № 1. - P. 82-87.

202. Tumor-suppressor p53: implications for tumor development and prognosis / Kirsch D.G. et al. / J. Clin. Oncol. 1998. -V. 16, № 9. - P. 3158-3168.

203. Vanasbeck B.S. Involvement of oxygen radikals and blood cells in the pato-genesis of ARDS by endotoxin and hyperoxia /B.S. Vanasbeck // Appl. Car-diopulm. and Pathophysiol. 1991.- V. 4.-P. 127-138.

204. Vaux DiL. Cell death in development / D.L. Vaux, S.J. Korsmeyer // Cell. — 1999.-V. 96.-P. 245-254.

205. Voeikov V.L. Reactive Oxygen Species, Water, Photons, and Life / Voeikov V.L.// Rivista di Biologia / Biology Forum 2001. V. 94: - P. 193-214.

206. Walsh G. Enzymatic reaction mechanisms / C. Walsh-// W.H; Freeman and: Company, San-Francisco. 1979. - P. 978.

207. Weisfeldt M.L. Oxygen-derived free radicals and'myocardial ischemic injury / M.L. Weisfeldt, J.L. Zweier, J.T. Flaherty // Heart Dis. 1988. - № 3. -P. 60-72.

208. White E. Life, death and the pursuit, of apoptosis / E. White // Genes Dev. -1996. -V. 10.-P. 1-15.

209. Wu; S.M: Mechanism of hypochlorite-mediated inactivation of proteinase inhibition by alpha 2-macroglobulin / S.M. Wu, S.V. Pizzo // Biochemistry. -1999. V. 38.-P. 13983-13990.

210. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome с from mitochondria blocked / J. Yang et al. // Science. 1997.-V. 275. - P. 1129-1132.

211. Yu B.R. Cellular defenses against damage from» reactive oxygen? species / B.R. Yu // Physiol: Revs. 1994. - V. 74. - P. 139-162.

212. Zamojska R., Travers P. // T-cell Receptors. Oxford, 1995 - P. 46-49.

213. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3 / H. Zou et al. // Cell. -1997.-V. 90.-P. 405-413.

Информация о работе

Трубицына, Мария Сергеевна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование путей реализации апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием УФ-света и активных форм кислорода - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Исследование путей реализации апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного воздействием УФ-света и активных форм кислорода - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы