Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная взаимосвязь апоптоза элементов белой крови и свободнорадикальных процессов при действии стресса и антиоксидантов на этапах онтогенеза у лабораторных животных

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Функциональная взаимосвязь апоптоза элементов белой крови и свободнорадикальных процессов при действии стресса и антиоксидантов на этапах онтогенеза у лабораторных животных"

На правах рукописи

Рябыкина Наталья Валерьевна

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ВЗАИМОСВЯЗЬ АПОПТОЗА ЭЛЕМЕНТОВ БЕЛОЙ КРОВИ И СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ СТРЕССА И АНТИОКСИДАНТОВ НА ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

03.03.01-физиология (биологические науки)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 НОЯ 2013

005540794

Астрахань-2013

005540794

Работа выполнена на кафедре физиологии и морфологии человека и животных Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханский государственный университет», г. Астрахань

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Бажапова Елена Давыдовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет», заведующая кафедрой молекулярной биологии, генетики и биохимии

Кондратенко Елена Игоревна

доктор биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО « Астраханский государственный технический университет», профессор кафедры гидробиологии и общей экологии

Котельников Андрей Вячеславович

Ведущая организация: ФГАОУ ВПО «Волгоградский государственный университет»

Защита диссертации состоится 27 декабря 2013 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке АГУ по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1

Автореферат разослан «/^3» ноября 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Лозовский А.Р.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение механизмов гибели клеток по типу апоптоза или «программированной клеточной гибели» стало в последние годы одним из стержневых направлений биологии клетки, особенно иммунологии и биологии развития. К настоящему времени установлено, что апоптоз играет важную роль в различных биологических процессах, включая дифференцировку, развитие и созревание клеток (Clapp С., Portt L. et al., 2012). В течение эмбрионального и фетального развития огромное число клеток удаляются путем апоптоза (Joaquin A.M. et al., 2001; Bailly A., Gartner A., 2013). Этот процесс распространен и в пределах иммунной системы.

Апоптозу принадлежит роль и в развитии процесса старения (Зайнуллин В.Г., Москалев A.A., 2000, 2001; Krabbe et al., 2004; Huang H et al., 2005; Fülle S„ Centurione L., Mancinelli R. et al., 2012). К старости организм утрачивает способность адекватно реагировать на сигналы апоптоза, что приводит к развитию различных патологий, однако, увеличение гибели клеток, необходимо для нормальной жизнедеятельности организма (Суханова Г.А., Акбашева O.E., 2006). Исследования последних лет показали, что патогенез многих болезней, в том числе рака, лейкозов и вирусных инфекций, связан с неспособностью клеток запускать механизм апоптоза (Ryoo H.D., Begmann А., 2012). Такие болезни, как СПИД, остеопороз, апластическая анемия, напротив, связаны с повышенной способностью клеток к апоптозу (Favaloro В., Allocati N., Graziano V. et al.,2012). В настоящее время доказана прямая связь между нарушением регуляции апоптоза и заболеваниями иммунной системы.

В последние десятилетия накоплен большой опыт в изучении механизмов апоптоза различных клеток, однако вопрос о гибели клеток белой крови на поздних этапах онтогенеза изучен не полностью. Известно, что процессы апоптоза и старения взаимосвязаны, и влияние на один из них влечет изменение другого. Однако недостаточная изученность и отсутствие точного представления о механизмах регуляции апоптоза клеток белой крови при старении и влиянии на этот процесс свободнорадикального окисления, не дает возможность полноценно использовать антиоксиданты как геро- и стрессопротекторы в клинической гериатрии. В связи с этим представляется актуальным исследовать механизмы регуляции апоптоза клеток белой крови при старении, и эффекты антиоксидантов в контроле и при стрессе у животных разного возраста.

Накопление продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях организма является одним из пусковых сигналов развития апоптоза (Goretti A.W., 1998). Благодаря накопленным за последние десятилетия данным, представления о механизмах свободнорадикальных реакций, их месте и роли в жизни отдельных клеток и целостного организма складываются в гармоничную свободнорадикальную теорию (Harman D.,1956,1994, 2006). Эта теория раскрывает не только уже известные положения о роли процессов ПОЛ при стрессе, различных токсических воздействиях, при развитии многих заболеваний, но и физиологически необходимые свойства активных форм кислорода и его продуктов, их влияние на липиды мембран

з

(Зенков Н.К., Меньшиков Е.Б. и др., 1993; Вгеппап Ь.А., МсСгеа1 Я-Б., Kantorow М., 2012)

Известно, что старение организма сопровождается усилением свободнорадикальных процессов. С возрастом происходит снижение содержания витаминов-антиоксидантов в организме (]argar .Ш., НаШ\уа1е Б.Н. й а1., 2012), что служит веским основанием для применения их в медицинской практике (Панкин В.З., Техазе А. К., Беленков Д.Н., 2001; Хавинсон В.Х. и др., 2003). Эти вещества вызывают большой интерес, так как способны влиять на интенсивность апоптоза и свободнорадикальные процессы.

Попытки изучить по данным литературы возрастные изменения апоптоза элементов белой крови под действием различных факторов, в том числе при интенсификации свободнорадикального окисления (СРО), привели нас к выводу, что этот вопрос исследован недостаточно.

Цель данного исследования изучить протекторное действие

антиоксидантов различной природы (природного - а-токоферола и синтетического -эмоксипина) на физиологический и стресс-индуцированный апоптоз клеток белой крови, и интенсивность свободнорадикальных процессов у лабораторных животных на разных этапах онтогенеза.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить особенности физиологического апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов у молодых и старых лабораторных животных - мышей и крыс.

2. Изучить влияние иммобилизационного и гипогидратационного стресса на уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, изменения лейкоцитарной формулы, интенсивность перекисного окисления липидов плазмы крови и печени, а также степень перекисного гемолиза эритроцитов у лабораторных животных и их особенности при старении.

3. Изучить влияние природного антиоксиданта - а-токоферола и синтетического антиоксиданта - эмоксипина на динамику апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, интенсивность перекисного окисления липидов плазмы крови, печени и степень перекисного гемолиза эритроцитов у мышей и крыс разных возрастных групп.

4. Изучить влияние стресс-протекторного эффекта а-токоферола и эмоксипина в условиях стресса на уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, интенсивность ПОЛ плазмы крови, печени и степень ПГЭ у мышей и крыс на этапах онтогенеза.

Научная новизна. Впервые комплексно изучено влияние природного антиоксиданта а-токоферола и синтетического антиоксиданта - эмоксипина на уровень апоптоза клеток белой крови (нейтрофилы, лимфоциты), у интактных мышей и крыс, и при действии стрессогенных факторов (иммобилизационного и гипогидратационного стресса) на разных этапах онтогенеза. Обнаружено, что антиоксиданты, преимущественно а-токоферол, оказывают более выраженное антиапоптозное действие на старых животных, что связано с истощением антиоксидантной системы при старении. Получены новые данные о функциональной взаимосвязи динамики апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов и

4

интенсивности свободнорадикальных процессов у животных на разных этапах онтогенеза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов увеличивается с возрастом, что коррелирует с повышением свободнорадикальных процессов в период инволюции.

2. Стресс вызывает повышение уровня апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, интенсификацию перекисного окисления липидов в плазме крови и печени, лейкопению, усиление гемолиза эритроцитов вне зависимости от возраста.

3. а-Токоферол оказывает более выраженное антиоксидантное и антиапоптическое действие на позднем этапе онтогенеза. Менее выраженным действием обладает синтетический антиоксидант эмоксипин.

4. а-Токоферол в условиях стресса снижает стрессорное действие на организм, уменьшает уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, интенсивность ПОЛ плазмы крови, печени и перекисный гемолиз эритроцитов вне зависимости от возраста. Эмоксипин в аналогичных условиях менее эффективен как антиоксидант.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты экспериментальных исследований служит теоретическим обоснованием возможности использования антиоксидантов для замедления темпов апоптоза и в качестве средств предупреждения патологии иммунной системы. Полученные результаты исследований позволят предупреждать индукцию апоптоза при возрастной и стрессорной (иммобилизационный и гипогидратационный стресс) интенсификации свободнорадикальных процессов. Обнаруженные данные представляют интерес для медицины, ветеринарии и геронтологии. Используются при проведении лекций по физиологии человека и животных, гистологии, а также для чтения спецкурсов у магистрантов и аспирантов в Астраханском государственном университете.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на Международной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006); Материалах IV научной конференции «Гомеостаз и эндокринология» с международным участием (Хургада, 2006); Материалах первой Международной научно - практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010); Международной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» посвященной 80 - летию академика РАЕН, д.б.н. профессора Д.Л. Теплого (Астрахань, 2011). По теме диссертации опубликовании 10 работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований, выводов. Общий объем диссертации 150 страниц с 31 таблицей и 26 рисунками. Список литературы включает 340 источников, в том числе 243 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ

В эксперименте были использованы два вида животных — беспородные белые мыши-самцы и беспородные белые крысы-самцы двух возрастных групп (молодые и старые). Животные содержались в стандартных условиях вивария. Все эксперименты выполнены в весеннее-летний период.

Экспериментальный материал получен от двух серий опытов.

I серия опытов выполнена на самцах мышей (90 шт.) двух возрастных групп: молодые - 2,5 месяца, средней массой 22,6 г. и старые - 14 месяцев, средней массой 28,6 г. Различия по массе тела были достоверны.

При проведении опытов использовалась экспериментальная модель -гипогидратационный стресс (водная депривация) в условиях нормальной освещенности. Мыши находились без доступа к воде в течение 4-х дней.

Животные получали а-токоферол и комплекс «а-токоферол и витамин С» в качестве антиоксидантов для определения эффективности их антистрессорных и антиоксидантных свойств.

Доза а-токоферола выбрана на основании данных об оптимальном действии витамина Е как антиоксиданта при разовом введении per os не более 2 мг/100 г. массы тела (Теплый Д.Л. 2008) и максимальном уровне в тканях через 12 часов после введения (Carpenter М. Р., 1971).

Все животные в соответствии с целями и задачами исследования были подразделены на 5 групп (соответственно для каждой возрастной группы):

1. Интактные (контроль);

2. Мыши, подвергшиеся гипогидратационному стрессу в течение четырех

дней;

3. Мыши, получавшие масляный 10% раствор D,L- а-токоферолацетата per os ежедневно в течение 14 дней, в дозе 1 мг./100г. массы тела, и подвергнутые в течение последних 4 дней приема а-токоферола воздействию гипогидратационного стресса.

4. Мыши, получавшие масляный 10% раствор D,L- а-токоферолацетата per os ежедневно в течение 14 дней, в дозе 1 мг./100г. массы тела;

5. Мыши, получавшие масляный 10% раствор D,L- а-токоферолацетата в дозе 1 мг./100г. массы тела и витамин С в дозе1мг/100 г. массы тела per os в течении 14 дней и подвергнутые в течение последних 4-х дней приема витаминов гипогидратационному стрессу.

II серия опытов поставлена на самцах крыс (94 шт.) двух возрастов, молодые (5,5 мес.) средней массой 105,5 г. и старые (27 мес.) средней массой 217,2 г. Различия по массе тела были достоверны.

В качестве экспериментальной модели избран иммобилизационный стресс. Животных помещали в тесную пластиковую камеру, ограничивающую их движения, на 2 часа при комнатной температуре в одно и то же время суток. По окончанию опытов крыс декапитировали после предварительной наркотизации внутрибрюшинным введением этаминала натрия (4 мг/ 100 г массы тела животного).

Доза а-токоферола подобрана аналогично дозе для мышей (Теплый Д.Л. 2008). Доза эмоксипина подобрана экспериментально по сходному антиоксидантному

действию а-токоферола в дозе 1мг/100г массы тела, т.к литературные данные не содержат однозначных сведений о терапевтических дозах для лабораторных животных.

Животные были подразделены на следующие экспериментальные группы:

1. Интактные животные (контроль);

2. Крысы, подвергшиеся иммобилизационному стрессу в пластиковых цилиндрах соответствующего размера в течение 7 дней по 2 ч. в день;

3. Животные, получавшие 10% масляный раствор D,L- а-токоферолацетата per os в дозе 1мг/100 г. массы тела ежедневно в течение 14 дней;

4. Крысы, получавшие масляный 10% раствор D,L- а-токоферолацетата per os ежедневно в течение 14 дней, в дозе 1 мг./100г. массы тела, и подвергнутые в течение последних 7 дней введения витамина действию иммобилизационного стресса;

5. Животные, которым внутримышечно вводили 1% р-р эмоксипина в дозе 1мг/ 100г. массы тела в течение 7 дней;

6. Крысы, которым внутримышечно вводили 1% р-р эмоксипина в дозе 1мг/ 100г. массы тела в течение 7 дней, и подвергнутые в этот период воздействию иммобилизационного стресса.

Для решения задач исследования изучались: динамика массы тела, относительная масса надпочечников, уровень апоптоза клеток белой крови (нейтрофилы, лимфоциты), лейкоцитарная формула, уровень свободнорадикального окисления липидов плазмы крови и печени, степень перекисного гемолиза эритроцитов.

Результаты экспериментов обрабатывались статистически с использованием алгоритма для определения средней арифметической, её ошибки и достоверности различия между средними сопоставляемых групп с помощью критерия t/p Стьюдента. Характер распределения результатов кариометрии количественно оценивали по критерию «X» Колмогорова-Смирнова (Лакин Г.Ф, 1990; Козак М.Ф.,1995). Достоверным являлись отличия при уровне значимости р<0,05. При выполнении исследования использовалась программа Microsoft Excel 2007.

Лейкоцитарная формула

Мазки крови готовились по стандартной методике, фиксировались в абсолютном спирте и окрашивались по Гимза-Романовскому. В мазках крови определяли лейкоцитарную формулу на основании дифференциального подсчета 200 лейкоцитов в окрашенном мазке крови и последующего вычисления их процентного содержания.

Уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов

Определение уровня апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов проводили с помощью световой и флуоресцентной микроскопии.

Световая микроскопия.

Мазки крови каждого животного высушивали на воздухе, фиксировали в абсолютном спирте и окрашивали по Гимза - Романовскому.

Характерные для апоптоза оценивали методом световой микроскопии с помощью светового микроскопа Leica EZ4 D через цветную цифровую камеру Leica

ЕСЗ. Изображение вводили в компьютер, при увеличении хбОО. Подсчитывали количество клеток с признаками апоптоза в процентах от доли нейтрофилов и лимфоцитов в общей лейкоцитарной формуле.

Флуоресцентная микроскопия.

Мазки крови фиксировали в абсолютном спирте, окрашивали флуоресцентным красителем этидия бромидом (Kumari S.R.,Alvares-Gonzales R., 2000; Lim H.H., De Lano F.A. et al, 2001).

С помощью флуоресцентного микроскопа Микмед 2 версия 16 через цветную цифровую камеру вводили изображение в компьютер, при увеличении хбОО и определяли количество апоптозных нейтрофилов и лимфоцитов. Для определения апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов использовали длину волны 460-550 нм. Подсчитывали долю нейтрофилов и лимфоцитов, подвергшихся апоптозу из каждых 100 лейкоцитов в мазке.

Уровень свободнорадикального окисления липидов в тканях

определяли по методу И.Д. Стальной и Т.Г. Гаришвили ( 1977) в модификации Е.А. Строева и В.Г. Макаровой (1986). Этот метод основан на реакции одного из конечных продуктов — малонового диальдегида (МДА) — с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при 532 нм. Экстинкцию всех проб измеряли на спектрофотометре КФК-2 (светофильтр зелёный, длина волны 532 нм) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Перекисный гемолиз эритроцитов (ПГЭ) определяли по методу, предложенному A.A. Покровским и A.A. Абраровым (1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние стресса и антиоксидантов на уровень апоптоза нейтрофилов и

лимфоцитов.

В ходе многочисленных исследований было установлено, что клетки стареющего организма более чувствительны к развитию апоптоза (Khansari N. et al., 1983; Sasaki M. et al., 2001; Kujoth G.C., Hiona A., et al., 2005; Le Gall S.Y., Ardaillou R., 2009; Conradt В., 2010; Schleich Kolja, Lavrik I.N., 2013). Чувствительность к индукции апоптоза Т-клеток и полиморфноядерных гранулоцитов с возрастом повышается, что играет важную роль в старческой патологии, связанной с иммунной системой (Krammer P.H., Arnold R., Lavrik I.N., 2007; Conradt В., 2009).

Результатом последних открытий стало доказательство того, что стимуляция апоптоза идет при разнообразных патологических воздействиях (Mates J.M., Segura J.A. et al., 2012; Haines D.D., Juhasz В. et al., 2013), сопровождающихся окислительным стрессом, который является одним из инициаторов апоптоза (Malinin N.L., West X. Z. et al., 2011).

В настоящее время сформировались чёткое представления о механизмах апоптоза и об участии в них процессов свободнорадикального окисления. Имеется ряд экспериментальных исследований, доказывающих, что развитие апоптоза

8

происходит при избыточном образовании АФК и недостатке в организме антиоксидантов (Хавинсон В. X., Баринов В. А., и др., 2003; Salucci S., Burattini S. et al., 2013). Согласно взглядам ряда ученых процессы свободнорадикального окисления и продолжительности жизни взаимосвязаны между собой (Pratico D., 2002; Анисимов В.Н., 2008; Perez V., Bokov A. et al., 2009; Sohal R.S., Orr W.C.,

2012). С возрастом в организме увеличивается продукция АФК, которые вызывают повреждение липидов, ДНК, белков, запускающих каскад, ведущий к нарастанию темпов апоптоза (Скулачев В.П., 1997; Oliveira B.F., et al., 2010; Hekimi S., Lapointe J. et al., 2011; Dorstyn L., 2012; Yang J., Dong S., et al., 2013; Liochev S.I., 2013; Gems D., Partridge L.,2013).

В наших экспериментах количество апоптозных нейтрофилов и лимфоцитов в контроле неодинаково: у старых животных их число значительно выше (р<0,01-нейтрофилы, р<0,05- лимфоциты - мыши; р<0,001-нейтрофилы, р<0,01- лимфоциты —крысы), чем у молодых мышей и крыс.

В ходе экспериментального исследования межвидовых отличий не найдено. Также не обнаружено достоверных различий во влиянии между иммобилизационным и гипогидратационным стрессов на изучаемые показатели (табл. 1,2,3,4).

Воздействие стресса (гипогидратационный и иммобилизационный) резко повысило уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов в обеих возрастных группах животных (мыши, крысы) в сравнении с контрольными грызунами (р<0,01-нейтрофилы, р<0,001- лимфоциты -молодые мыши, р<0,01-нейтрофилы, лимфоциты-старые мыши; р<0,01-нейтрофилы, лимфоциты -крысы).

Одним из факторов увеличения уровня апоптоза при старении является высокий уровень свободнорадикального окисления (Prolla Т.A. et al., 2001; Wallace D.C. 2001; Pollack M. et al. 2002; Kyaw M. et al. 2004; Liu X.F., Zhang L.M. et al.,

2013). В клинической практике большой интерес представляют вещества, обладающие антиоксидантными свойствами, увеличивающие продолжительность жизни, замедляющие темпы старения и предупреждающие индукцию апоптоза при интенсификации свободнорадикальных процессов (Anisimov V.N. 2001; Анисимов Н.В., 2003). Наибольший интерес представляют вещества, которые функционируют в живом организме - биоантиоксиданты т.к. они способны защищать биологические структуры от свободнорадикального окисления (Joshi Y.B., Pratico D., 2012). Несмотря на то, что прямых доказательств о влиянии а-токоферола на апоптоз клеток белой крови в литературе мы не обнаружили, однако имеются данные о снижении уровня апоптоза витамином Е в ооцитах мышей после воздействия никотина (Asadi Е., Jahanshahi М. et al., 2012), а также ингибировании апоптоза а-токоферолом, вызванного различными воздействиями в опухолевых клетках печени (Maalouf S. et al., 2002; Calfee-Mason K.G. et al., 2002; Mohan M. et al., 2003).

В наших экспериментах у молодых и старых животных при введении а-токоферола обнаружена некоторая разница в динамике апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов. У молодых мышей и крыс наблюдалась лишь тенденция к снижению уровня апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов по сравнению с интактными, в то

время как у старых животных произошло достоверное его снижение (р<0,01). При введении синтетического антиоксиданта эмоксипина отмечена лишь тенденция к снижению уровня апоптоза изучаемых клеток у разновозрастных крыс (табл. 1,2).

Предварительное двухнедельное введение а-токоферола и комплекса «а-токоферол и витамин С» животным перед стрессированием способствовало снижению уровня апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов по сравнению с воздействием стресса без предварительного введения витаминов в обеих возрастных группах мышей. При аналогичном экспериментальном воздействии синтетическим антиоксидантом эмоксипином наблюдалась лишь тенденция к снижению уровня апоптоза у разновозрастных животных. Отмечено достоверное различие в динамике апоптоза лимфоцитов у молодых и старых лабораторных грызунов (мыши, крысы) при введении в рацион животных перед стрессированием антиоксидантов различной природы (а-токоферол: р<0,05-нейтрофилы-мыши; р<0,01-нейтрофилы, лимфоциты-крысы; эмоксипин: р<0,05- нейтрофилы, лимфоциты-крысы) и комплекса витаминов (р<0,01 -нейтрофилы, р<0,05-лимфоциты) (увеличение уровня апоптоза у старых животных) (табл. 1,2).

Результаты эксперимента показали, что нейтрофилы и лимфоциты крови старых животных более чувствительны к развитию апоптоза, а а-токоферол оказывает более выраженное антиапоптозное действие на нейтрофилы и лимфоциты старых мышей .

Таблица 1

Влияние стресса и витаминов-антиоксидантов на уровень апоптоза нейтрофилов и

ЛИМ( юцитов мышей (световая микроскопия).

Условия опыта п Доля нейтрофилов с признаками апоптоза в %, ±т Доля лимфоцитов с признаками апоптоза в %, ±т

молодые старые молодые старые

Контроль 9 5,91±0,217 ++ 7,85±0,297 6,38 ± 0,298 + 7,89 ±0,312

Гипогидратационный стресс 9 8,11± 0,415 ** + 10,18± 0,611 ** 9,04 ±0,381 *** + 10,67 ±0,579 **

а-токоферол 9 5,23 ± 0,149 ++ 6,21 ±0,278 ** 5,67± 0,321 6,33 ±0,215 **

Стресс + а-токоферол 9 6,22 ± 0,453 # + 7,52 ± 0,349 т 7,36± 0,275 * т 7,85± 0,191 **#

Стресс + а-токоферол + витамин С 9 5,97 ± 0,272 ###++ 7,35 ± 0,243 #т 6,89± 0,173 #№ + 7,48± 0,204 ###

Примечание: (здесь и в остальных таблицах)*-р<0,05, **-р<0,01 ;***-р<0,001 достоверность

различий в сравнении с контрольной группой #- р<0,05, ##-р<0,01 ;###-р<0,001 - достоверность различий в сравнении с стрессированными

животными

+-р<0,05,++-р<0,01 ;+++-р<0,001 - достоверность различий в сравнении с старыми животными

±т — ошибка средней

Таблица 2

Влияние стресса и антиоксндантов на уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов крыс ___(световая микроскопия). _

Условия опыта п Доля нейтрофилов с признаками апоптоза в %, ±т Доля лимфоцитов с признаками апоптоза в %, ±т

молодые старые молодые старые

Контроль 8 6,53± 0,324 +++ 8,64±0,359 6,84 ± 0,322 ++ 8,83±0,371

Иммобилизационный стресс 7 9,04± 0,553 **+ 11,21±0,602 ** 9,22 ± 0,489 **++ 11,64±0,632 **

а-токоферол 8 5,69 ±0,307 6,52±0,461 ** 5,91± 0,356 ++ 6,77±0,389 **

Стресс + а-токоферол 8 7,08 ± 0,409 # + 8,97±0,538 # 7,11± 0,315 *## 8,05±0,416 #т

Эмоксипин 8 6,07 ± 0,344 ++ 7,83±0,508 5,92± 0,354 *++ 7,91±0,437

Стресс + эмоксипин 8 7,91±0,482 *+ 10,04±0,723 8,09±0,512 *#+ 10,13±0,804

При исследовании динамики апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов с помощью флуоресцентной микроскопии прослеживается аналогичная закономерность в изменении уровня апоптоза элементов белой крови, что и при световой микроскопии. Однако процент апоптозных нейтрофилов и лимфоцитов оказался несколько выше, чем при световой микроскопии, что связано с тем, что при флуоресцентном окрашивании апоптоз можно наблюдать на более ранних стадиях (табл. 3,4).

Таблица 3

Влияние стресса и витаминов на уровень апоптоз нейтрофилов и лимфоцитов молодых и _старых мышей (люминесцентная микроскопия)._

Условия опыта п Доля нейтрофилов с признаками апоптоза в %, ±т Доля лимфоцитов с признаками апоптоза в %, ±т

молодые старые молодые старые

Контроль 9 9,51±0,502 + 11,85±0,748 9,87±0,616 + 11,93±0,818

Гипогидратационный стресс 9 13,26±0,867 16,31±0,986 ** 14,05±0,934 **,+ 16,82±0,903 ***

а-токоферол 9 9,06±0,539 9,46±0,509 * 8,81±0,546 + 9,14±0,481 *

Стресс + а-токоферол 9 10,84±0,692 12,81±0,645 т 11,23±0,781 # 12,33±0,636 т#

Стресс + а-токоферол + витамин С 9 10.29±0,728 12,06±0,456 т 10,71±0,632 ## 12,12±0,719 ###

Таблица 4

Влияние стресса и антиоксидантов на уровень апонтоза неитрофилов и лимфоцитов крыс __ (люминесцентная микроскопия)._

Условия опыта п Доля неитрофилов с признаками апоптоза в %, ±т Доля лимфоцитов с признаками апоптоза в %, ±т

молодые старые молодые старые

Контроль 8 9,73± 0,611 + 12,01±0,831 10,39±0,796 + 13,01±0,751

Иммобилизационный стресс 7 12,98 ± 0,806 **-н- 16,89±0,774 *** 14,86±0,724 ** + 17,29±0,853 **

а-токоферол 8 8,34±0,437 ++ 9,45±0,425 * 8,46±0,413 +++ 10,61±0,534 *

Стресс + а-токоферол 8 10,39±0,707 13,56±0,583 т 11,78±0,728 #++ 14,87±0,628 #

Эмоксипин 8 9,05±0,552 11,32±0,501 9,72±0,623 ++ 12,49±0,616

Стресс + эмоксипин 8 10,81±0,644 #++ 14,02±0,818 # 12,14±0,656 #++ 15,07±0,584 * #

Динамика концентрации МДА и скорости ПОЛ в плазме крови и печени при действии стресса и антиоксидантов

Системе антиоксидантной защиты организма принадлежит значительная роль в формировании физиологических и патологических процессов (Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков И.К. и др., 2006; Yankova Т.М., 2013; Vina J., Borras С. et al., 2013). С возрастом антиоксидантная защита организма ослабевает, за счет уменьшения содержания природных антиоксидантов и увеличению содержания «неактивных» молекул ферментов, разрушающих перекиси (Sohal R.S., Orr W.C., 2011; Kumar Н., Lim Hyung-Woo et al., 2012; Kasapovic J., Stojiljkovic V. et al., 2012; Van Raamsdonk J.M., Hekimi S., 2012; Kojima Т., Wakamatsu Т.Н., et al., 2012; Aliahmat N.S., et al., 2012; Honma Т., Tsuduki Т., 2013). Усиление свободнорадикальных процессов и накопление окислительных повреждений биомолекул приводит к ускорению процессов естественного старения и преждевременному развитию болезней пожилого возраста (Valko М., Leibfriz D. et al., 2007; Маренин В.Ю. и др., 2008; Teply D.L. 2010).

По литературным данным, сведения о возрастной динамике ПОЛ противоречивы (Harman D., 1994; Кольтовер В.К., 1998; Suzuki М., Willcox D.C. et al., 2010; Uzun D., Korkmaz G.G. et al., 2013), что может быть связано с различными условиями проведения опытов и состоянием антиоксидантной системы организма.

В нашем исследовании у интактных старых животных исходный уровень МДА плазмы крови и печени значительно выше, чем у молодых мышей и крыс. Эта же закономерность характерна и для других показателей - скорости спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ. Сравнивая контрольные показатели ПОЛ, молодых и старых животных, можно сделать вывод, что у старых особей скорость спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ выше, чем у молодых (табл. 5,6,7,8). Эти данные

противоречат результатам исследований В.Н. Анисимова и др. (1999), согласно которым уровень антиоксидантов в печени с возрастом не претерпевает существенных изменений. Однако имеются литературные данные, доказывающие, что уровень ПОЛ увеличивается с возрастом (Suzuki М., Willcox D.C. et al., 2010; Ay din S., Atukeren P. et al., 2010; Gautam N., Das S., 2011). Различия в результатах исследований, возможно, связаны с разными условиями проведения эксперимента.

Таблица 5

Влняпне гппогндратационного стресса и витаминов - антиоксидантов па перекнсное _окисление липидов в плазме крови молодых и старых мышей._

Характер воздействия Уровень МДА

Исходный уровень МДА, нмоль, ±т Спонтанное ПОЛ, нмоль/час, ±т Лскарбатзави-свмое ПОЛ, нмоль/час, ±ш

молодые старые молодые старые молодые старые

Контроль 0,32±0,002 +++ 0,37±0,013 2,05±0,017 +++ 2,77±0,152 2,79±0,094 4-Н- 3,86±0,106

Гипогидратационный стресс 0,41 ±0,025 ** 0,46±0,021 ** 2,74±0,146 *** + 3,18±0,074 * 3,51±0,138 ** ++ 4,3) ±0,128 *

а-токоферол 0,30±0,018 0,32±0,009 ** 1,98±0,042 2,12±0,069 ** 2,53±0,104 + 3,05±0,164 ***

Стресс + а-токоферол 0,35±0,011 и 0,39±0,025 # 2,29±0,139 № + 2,81±0,133 и 2,87±0,088 ##+++ 3,91 ±0,076 #

Стресс + а-токоферол + витамин С 0,34±0,015 # + 0,38±0,014 ## 2,17±0,126 ###+++ 2,79±0,087 № 2,84±0,10] ## +-Н- 3,88±0,112 #

Таблица 6

Влияние гнпогидратациопиого стресса и витаминов - антиоксидантов на перекисное _окисление липидов в печени молодых и старых мышей._

Характер воздействия Уровень МДА

Исходное содержание МДА нмоль МДА/0,5г ткани печени, ±ш Скорость спонтанного ПОЛ нмоль МДА/0,5г ткани печени, ±т Скорость аскорбатзависимого ПОЛ нмоль МДА/0,5г ткани печени, ±т

молодые старые молодые старые молодые старые

Контроль 0,38±0,016 + 0,51±0,017 2,08±0,034 +++ 2,43±0,056 2,53±0,086 ++ 3,07±0,112

Гипогидратационный стресс 0,49±0,026 ** 0,64±0,012 *** 2,49±0,067 *** ++ 2,81±0,083 ** 3,27±0,135 3,75±0,184 **

а-токоферол 0,35±0,007 0,37±0,008 *** 2.02±0,028 2,17±0,072 ** 2,37±0,044 2,46±0,091 ***

Стресс + а-токоферол 0,41±0,014 #++ 0,48±0,015 т 2,21±0,043 ##+++ 2,47±0,041 т 2,58±0,072 ###++ 3,04±0,104 ##

Стресс + а-токоферол + витамин С 0,39±0,011 ##+++ 0,47±0,013 т 2,19±0,053 ##++ 2,45±0,064 т 2,^5±0,057 ###++ 3,01±0,125 №

Таблица 7

Влияние иммобилизационного стресса и антиоксидантов на перекмсное окисление липидов __ в плазме крови молодых и старых крыс_

Характер воздействия Уровень МДА

Исходный уровень МДА, нмоль, ±т Спонтанное ПОЛ, нмоль/час, ±т Аскарбатзави- снмое ПОЛ, нмоль/час, ±т

молодые старые молодые старые молодые старые

Контроль 0,31±0.007 +++ 0,38±0,005 2,11±0.021 +++ 2,91±0,079 2,88±0.045 +++ 3,92±0,123

Иммобилизационный стресс 0,42±0.014 *** +++ 0,51±0,004 ** * 2,82±0.119 3,34±0,132 * 3,62±0,149 *** +_(- 4,46±0,201 *

а-токоферол 0,29±0.010 0,30±0,006 *** 2,07±0.054 +++ 2,37±0,008 *** 2,67±0,124 + 3,07±0,126 **

Стресс + а-токоферол 0,35±0.016 *##+++ 0,42±0,009 *,### 2,13±0.083 ### +++ 2,96±0,114 # 2,92±0,048 ###+++ 3,96±0,107 #

Эмоксипин 0,38±0,008 *** 0,35±0,007 # 2,07±0,065 +++ 2,76±0,068 2,94±0,051 ++ 3,62±0,184

Стресс + эмоксипин 0,39±0,011 *** +++ 0,45±0,003 ***,### 2,59,±0,126 ** ++ 3,11±0,107 3,41±0,124 ++ 4,15±0,205

Таблица 8

Влияние иммобилизационного стресса и антиоксидантов на перекисное окисление липидов __в печени молодых и старых крыс_

Характер воздействия Уровень МДА

Исходное содержание МДА нмоль МДА/0,5г ткани печени, ±т Скорость спонтанного ПОЛ нмоль МДА/0,5г ткани печени, ±т Скорость аскорбатзависимого ПОЛ нмоль МДА/0,5г ткани печени, ±т

молодые старые молодые старые молодые старые

Контроль 0,36±0,006 +++ 0,57±0,013 2,14±0,051 +++ 2,49±0,041 2,62±0,072 +++ 3,03±0,081

Иммобилизационный стресс 0,48±0,008 ***+++ 0,69±0,032 *** 2,43±0,082 **++ 2,97±0,105 *** 3,12±0,101 3,82±0,165 ***

а-токоферол 0,34±0,011 0,34±0,026 2,09±0,036 2,12±0,038 *** 2,49±0,036 2,68±0,094 **

Стресс + а-токоферол 0,39±0,009 ###+++ 0,59±0,014 # 2,17±0,077 #++ 2,53±0,054 т 2,87±0,049 3,11±0,097 т

Эмоксипин 0,42±0,005 ***+++ 0,51±0,023 2,13±0,048 +++ 2,43±0,036 ** 2,79±0,063 2,84±0,074

Стресс + эмоксипин 0,47±0,008 ***+++ 0,60±0,009 ## 2,34±0,071 *+++ 2,88±0,057 3,01±0,096 ** 1 | 3,56±0,123 **

Исследование последних десятилетий указывают на усиление свободнорадикальных процессов при развитии стресса различной природы (Дильман В.М., 1987; Меерсон Ф.З. и др., 1993; Барабой В.А., 1991, 2006; Арутюнян A.B. и др., 2000; Дубинина Е.Е., 2001; Маслова М.Н., 2005; Chaturvedi Р., 2009), что подтверждается и результатами наших исследований. Стрессорное воздействие

приводит к напряжению и последующей декомпенсации механизмов антиоксидантной защиты. Такая реакция в разной степени характерна как для молодых, так и для старых животных. Результаты наших опытов показали, что под действием стресса увеличился исходный уровень МДА в плазме крови у животных обеих возрастных групп. Так же значительно вырос уровень спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ по сравнению с интактными животными. Данная закономерность стрессорного воздействия прослеживается и в увеличении скорости спонтанного, аскорбатзависимого ПОЛ и исходного уровня МДА в тканях печени у молодых и старых самцов крыс и мышей (табл. 5,6,7,8).

Высокая антирадикальная активность а-токоферола объясняет эффективность его воздействия на интенсивность свободнорадикальных процессов. При взаимодействии молекулы а-токоферола с свободными радикалами и пероксидами образуется токоферилхинон и димеры а- токоферола, что приводит к прерыванию процессов ПОЛ (Зенков Н.К., и др., 2003; Farbstein D., Kazak- Blickstein A., et al., 2010; Thiagarajan R., Manikandan R., 2013). Установлено, что витамин E оказывает более выраженный антиоксидантный эффект именно на стареющий организм (Naziroglu М. et al, 2011). В наших экспериментах а-токоферол оказал характерное для него антиоксидантное действие — наблюдалось снижение уровня исходного МДА плазмы крови и печени у старых животных. У молодых грызунов наблюдалась тенденция к снижению данного показателя, что можно объяснить характерным для них более высоким уровнем эндогенных антиоксидантов и сбалансированностью системы про- и антиоксидантов, в отличие от старых, у которых уровень свободнорадикальных процессов повышен, и не компенсируется антиоксидантной системой (Кольтовер В.К., 1998).

При предварительном введении в рацион животных перед стрессированием а-токоферола произошло снижение скорости спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ, а также исходного уровня МДА в плазме крови и печени у разновозрастных животных по сравнению с одним стрессорным воздействием (табл. 5,6,7,8). Аналогичное введение а-токоферола в сочетании с витамином С привело к более выраженному антиоксидантному эффекту. Механизм этого эффекта связан по-видимому с тем, что взаимодействие витаминов Е и С повышает антиоксидантную активность одного витамина Е. Молекула а-токоферола эффективно взаимодействует с большинством активных форм кислорода и продуктами ПОЛ, находящихся в липидной фазе, образует малоактивный токоферольный радикал. Кроме того обратное превращение а-токоферола осуществляется при участии водорастворимых антиоксидантов: аскорбиновой кислоты, глутатиона и др. Аскорбиновая кислота, восстанавливает а-токоферольный радикал, возвращая ему антиоксидантные свойства и обеспечивает перенос радикалов из гидрофобной фазы липидного бислоя в водную фазу (Fusco D., Colloca G. et al., 2007; Niki E., 2013).

В отличие от природного антиоксиданта а-токоферола, обладающего полифункциональным действием (Зенков Н.К., Кандалинцева Н.В., Ланкин В.З., и др. 2003), предварительное введение эмоксипина стрессированным животным привело лишь к незначительному снижению исходного уровня МДА и кинетических показателей в плазме крови и печени у разновозрастных

животных(табл.7,8). Причиной такого эффекта могло послужить различие в химическом строении и природе веществ. Фармацевтический препарат эмоксипин представляет собой соль органического происхождения. Имеются экспериментальные данные о том, что эмоксипин корректирует усиление свободнорадикального окисления в плазме крови и разных отделах центральной нервной системы в неодинаковой степени, таким образом можно полагать, что распространение этого препарата в тканях и органах организма происходит неравномерно (Машковский М.Д., 2002; Мажитова М.В., Карибьянц М.А., 2011). Синтетический антиоксидант эмоксипин обладает слабо выраженным антиоксидантным и антиапоптическим эффектом у молодых и старых животных.

Увеличение интенсивности свободнорадикальных процессов в старости может приводить к росту уровня апоптоза клеток белой крови. Согласно взглядам ряда ученых, этот процесс может отличаться от физиологического апоптоза по биохимическим характеристикам (Pollack М. et al., 2002; Kyaw М. et al„ 2004).

Перекисная резистентность эритроцитов в условиях стресса и введения

антиоксидантов

Эритроциты, как носители кислорода, имеют весьма высокий уровень активности антиоксидантных ферментов (Дубинина Е.Е., 2006).

При старении в организме увеличивается продукция АФК, основной мишенью которой является мембрана эритроцитов (Краснов А.Ф., Самоданова Г.И., и др., 1978). По данным литературы, при старении происходит увеличения уровня гемолиза эритроцитов (Войтенко В.П., 1984; Теплый Д.Д., 2010).

В наших экспериментах уровень перекисного гемолиза эритроцитов старых животных оказался значительно выше, чем у молодых, что свидетельствует об возрастном истощения антиоксидантной системы эритроцитов (табл. 9,10).

Таблица 9

Влияние гипогидратационного стресса и витаминов на перекисный гемолиз эритроцитов у

старых мышей.

Характер воздействия Гемолиз эритроцитов %, ±т

молодые старые

Контроль 4,62±0,138 +++ 7,31±0,406

Гипогидратационный стресс 7,45±0,394 *** +++ 10,92±0,757 ***

а-токоферол 4,73±0,119 4,61±0,252

Стресс + а-токоферол 5,19±0,157 ##+++ 8,15±0,564 #т

Стресс + а-токоферол + витамин С 4,98±0,242 ##+++ 8,04±0,575 ###

Таблица 10

Влияние иммобилизацноиного стресса и антиоксидантов на перекисный гемолиз _ эритроцитов у старых крыс._

Характер воздействия Гемолиз эритроцитов %, ±ш

молодые старые

Контроль 4,38±0,259 +++ 7,93±0,387

Иммобилизационный стресс 7,16±0,425 ***++ 10,87±0,826 **

а-токоферол 4,42±0,158 + 5,04±0,243 ***

Стресс + а-токоферол 4,97±0,276 ###+++ 8,21±0,615 #

Эмоксшшн 4,81±0,236 +++ 7,65±0,361

Стресс + эмоксипин 6,29±0,381 ***+++ 9,13±0,411 *

Установлено, что при развитии старческих изменений в организме, только СРО подвергаться регуляции различными антиоксидантами (Арутюнян A.B., Козина Л.С., 2009). В наших исследованиях при добавлении к рациону животных а-токоферола выявлены следующие закономерности: у старых животных произошло резкое уменьшение процента гемолизированных эритроцитов в сравнении с контролем, в то время как у молодых данный показатель несколько увеличился. Возможно, это связано с тем, что уровень мембранной защиты эритроцитов молодых животных вполне достаточен для устойчивости к действию пероксидов, а добавление избыточных концентраций а-токоферола привело к напряжению антиоксидантной системы эритроцитарных мембран. Колебание содержания а-токоферола как в сторону снижения, так и в сторону увеличения от оптимального уровня приводит к дестибализации мембран эритроцитов (Теплый Д.Л., 2008; Teply D.L., 2010). У старых животных с возрастом снижается антиоксидантная защита и проявляются антиоксидантные свойства а-токоферола, направленные на нормализацию оксидативного потенциала клеточных мембран, что подтверждается литературными данными (Kucukatay V. et al, 2012).

При введении экспериментальным животным синтетического антиоксиданта эмоксипина произошло незначительное снижение процента гемолизированных эритроцитов у старых крыс по сравнению с контрольной группой, в то время как у молодых животных данный показатель повысился (табл. 9,10).

В наших исследованиях при действии гипогидратационного и иммобилизационного стресса степень гемолиза эритроцитов возросла у молодых и старых животных в сравнении с контролем. Данная тенденция прослеживается и в работе З.Ж. Сейдахметовой и Г.К. Ташеновой (2005), согласно которой иммобилизационный стресс вызывает усиление свободнорадикальных процессов, что приводит к снижению гемолитической стойкости эритроцитов.

Предварительное введение в рацион животных обеих возрастных групп а-токоферола и комплекса витаминов перед стрессированием привело к увеличению

17

резистентности мембран эритроцитов к перекисной провокации. Аналогичное предварительное введение эмоксипина способствовало незначительному уменьшению процента гемолизированных эритроцитов в сравнении с воздействием только стресса и достоверному увеличению по сравнению с контрольной группой у молодых и старых крыс (табл. 9,10).

Изменение лейкоцитарной формулы в условиях стресса и введения антиоксидантов

В нормальных условиях лейкоцитарная формула довольно постоянна. Незначительное отклонение от нормального состояния организма вызывает изменения морфологических показателей крови. В старческом возрасте лейкоцитарная формула мало отличается от таковой у особей более молодого возраста. Вместе с тем, в исследованиях (Анфиногенова О.И., 2011) отмечено снижение палочкоядерных нейтрофилов и некоторое повышение содержания эозинофильных гранулоцитов. Данная тенденция прослеживается и в наших экспериментах (табл. 11,12).

Таблица 11

Влияние гипогидратациопного стресса и витаминов на лейкоцитарную формулу крови __молодых и старых мышеи__

Лейкоциты, % п ГРУППЫ

Контроль, ±ш Гипогидрата-ционный стресс, ±ш а- токоферол, ±т Стресс + а-токоферол, ±т Стресс + а-токоферол + витамин С, ±т

Эозинофилы М 0,842±0,087 0,433±0,071 ** 1,471 ±0,073 *** 0,879±0,107 т 0,967±0,156 ##

С 0,954±0,ШЗ 0,587±0,101 * 1,548±0,117 *** 0.852±0,064 # 1,017±0,068 М

Базофилы м 0,959±0,144 0,512±0,057 ** 0,732±0,084 0,732±0,072 # 0,811±0,058 ##

с 0,813±0,094 0,635±0,062 0,789±0,057 0,757±0,039 0,798±0,041 т

Палочкоядерные нейтрофилы м 2,451±0,138 +++ 1,139±0,119 ***++ 1,764±0,042 ** ++ 1,882±0,059 **,т#+++ 2,181±0,078 ###+++

с 1,512±0,176 0,713±0,082 *** 1,241±0,142 1,095±0,153 # 1,234±0,115 ##№

Сегментоядерные нейтрофилы м 39,875±2,715 54,398±3,507 35.304±1,173 45,282±2,041 # 44,244±2,126 #

с 41,875±2,076 56,977±3,751 ** 36,964±1,846 46,592±1,182 № 45,961±2,171 т

Лимфоциты м 52,865±2,241 41,392±1,133 *** 57,838±2,814 48,724±1,701 т 44,244±2,126 #

с 51,943±2,258 39,717±2,117 *** 56,881±3,857 48,382±1,705 М 48,456±2,627 #

Моноциты м 3,008±0,158 2,126±0,175 **++ 2,891±0,064 + 2,501±0,102 ** 2,618±0,069 *,#

с 2,903±0,154 1,371±0,146 *** 2,577±0,157 2,322±0,121 **м# 2,534±0,132 №#

У старых интактных животных наблюдается снижение процента палочкоядерных нейтрофилов по сравнению с молодыми, а также повышение содержания эозинофилов в крови. Стресс вызвал четко выраженную лейкопению в обеих возрастных группах. а-токоферол способствовал формированию эозинофилии у молодых, и старых животных, существенно не изменив процентное содержание других форм лейкоцитов. Межвозрастных изменений процента содержания лейкоцитов в лейкоцитарной формуле под действием а-токоферола не отмечено, за исключением процента палочкоядерных нейтрофилов и моноцитов (процент данных элементов выше у молодых животных). Существенных изменений процентного соотношения лейкоцитов в формуле под действием эмоксипина у разновозрастных животных не произошло. Увеличился лишь процент эозинофилов у старых крыс по сравнению с контролем. Межвозрастных изменений процента содержания лейкоцитов в лейкоцитарной формуле под влиянием антиоксидантов различной природы не выявлено (табл. 11,12).

Таблица 12

Влияние иммобилизациониого стресса и антиоксидантов па лейкоцитарную формулу кровп _молодых н старых крыс_

Лейкоциты, % п ГРУППЫ

Контроль, ±ш Иммобилиза-ционньш стресс, ±т а- токоферол, ±т Стресс + а-токоферол, ±ш Эмоксипин ±ш Стресс + Эмоксипин ±ш

Эозинофилы М 0,871±0,052 0,478±0,064 * 1,492±0,202 ** 1,103±0,219 # 0,938±0,106 + 0,844±0,097 ## +

С 1,052±0,135 0,534±0,055 ** 1,421 ±0,163 1,272±0,061 ### 1,383±0,063 * 1,124±0,092 ###

Базофилы м 0,883±0,062 0,575±0,077 ** 0,751±0,046 0,822±0,058 # 0,818±0,056 0,735±0,081

с 0,824±0,054 0,601±0,056 * 0,787±0,037 0,862±0,098 # 0,812±0,061 0,804±0,076 #

Палочкоядер- ные нейтрофилы м 2,335±0,272 + 1,123±0,139 ** 1,773±0,034 2,383±0,288 1,852±0,182 2,077±0,166 #№+++

с 1,547±0,177 0,921 ±0,042 ** 1,273±0,144 1,343±0,138 # 1,465±0,126 1,231±0,108 #

Сегментоядер -ные нейтрофилы м 40,117±2,116 53,439±3,124 ** 37,374±1,17 2 42,750±2,014 т 39,769±1,846 45,173±1,982 #

с 40,037±2,078 55,473±3,715 37,601±1,86 4 44,274± 1,821 # 38,629±2,104 46,017±2,145 #

Лимфоциты м 52,983± 1,921 42,252±2,332 ** 55,794±1,87 2 50,359±1,713 # 53,918±2,017 48,677±2,561

с 53,609±2,351 41,144±2,218 ** 56,234±2,02 7 49,831±2,106 # 54,878±3,261 48,276±2,754

Моноциты м 3,011 ±0,326 2,133±0,171 » ++ 2,816±0,112 2,583±0,104 # 2,505±0,257 2,394±0,228

с 2,931±0,408 1,327±0,157 ** 2,684±0,157 2,418±0,301 ## 2,833±0,221 2,348±0,189 ти

Предварительное двухнедельное введение животным перед стрессированием а-токоферола и комплекса «а-токоферол и витамин С» способствовало приближению процентного содержания лейкоцитов к контрольным показателям у

молодых и старых грызунов по сравнению с животными, не получавшими перед стрессом витаминов. Введение животным перед стрессированием синтетического антиоксиданта эмоксипина привело к изменению процента эозинофилов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов у молодых животных и эозинофилов, базофилов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов у старых крыс в сравнении с животными, подвергнутыми воздействию лишь стресса (табл. 11,12).

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что апоптоз нейтрофилов и лимфоцитов интенсифицируется с возрастом, что вызвано повышением свободнорадикальных процессов в старости. Усиление антиоксидантной системы экспериментальных животных введением супрафизиологической концентрации витамина Е приводит не только к существенному ингибированию свободнорадикального окисления, но и, как следствие, к повышению прочности клеточных мембран, у старых животных, а-токоферол оказывает более выраженное антиапоптическое действие на позднем этапе онтогенеза. В условиях стресса а-токоферол снижает стрессорное воздействие на организм, уменьшает уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, интенсивность ПОЛ плазмы крови, печени и перекисный гемолиз эритроцитов вне зависимости от возраста, но более выражено у старых животных. Эмоксипин в аналогичных условиях менее эффективен как антиоксидант.

Выводы

1. Уровень физиологической гибели нейтрофилов и лимфоцитов у лабораторных животных (мыши, крысы) при старении значительно повышается. Одной из причин этого является высокий уровень свободнорадикального окисления при старении.

2. Иммобилизационный и гипогидратационный стресс вызывают интенсификацию свободнорадикальных процессов в плазме крови и печени, одновременно резко усиливается гемолиз эритроцитов у лабораторных животных (мыши, крысы) вне зависимости от возраста. Под влиянием стресса независимо от возраста развивается лейкопения, что выражается в снижении числа эозинофилов, базофилов, палочкоядерных нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов.

3. Под влиянием стресса повышается уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов у молодых и старых мышей и крыс вследствие повышения уровня свободнорадикальных процессов.

4. В условиях иммобилизационного и гипогидратационного стресса а-токоферол способствует снижению уровня ПОЛ плазмы крови и печени и, как результат, уменьшению уровня апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, а также интенсивности перекисного гемолиза эритроцитов лабораторных животных вне зависимости от возраста по сравнению с группой стрессированных, не получавших предварительно а-токоферола. Таким образом, а-токоферол проявляет стресс-протекторное действие и выраженный антиапоптозный эффект.

5. В отличие от природного антиоксиданта а-токоферола, синтетический антиоксидант эмоксипин оказывает менее выраженный антиоксидантный и

антиапоптозный эффект у молодых и старых мышей и крыс, что по-видимому, определяется различием химической структуры и, соответственно, свойств обоих антиоксидантов.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кобзева Н.В., Ясенявская A.JI. Влияние антиоксидантов на уровень перекисного гемолиза эритроцитов старых крыс в норме и при иммобилизационном стрессе // Современные наукоемкие технологии.- Москва,- 2006.-№2.-. С. 69-70.-ISSN 1812-7320. -0,12 п.л, личный вклад 50 %.

2. Кобзева Н.В., Ясенявская А.Л. Изучение влияния иммобилизационного стресса и антиоксидантов на интенсивность свободнорадикальных процессов у самцов белых крыс на разных этапах онтогенеза // Материалы Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение»,- 1-3 ноября 2006, Астрахань.: Изд. дом «Астраханский университет». - С.86-88.- ISBN 588200-909-х. - 0,19 п.л, личный вклад 50 %.

3. Кобзева Н.В., Ясенявская А. Л., Теплый Д. Л. Изменение свободнорадикальных процессов в печени и эритроцитах молодых и старых крыс и их коррекция природными и синтетическими антиоксидантами // Естественные науки,- 2007.- № 2 (19).- С.62-67 ISBN -1818-5-507-х. -0,37 п.л, личный вклад 55 %.

4. Рябыкина Н.В. Современные представления об апоптозе. Особенности апоптоза лейкоцитов // Естественные науки.-2008,- № 4.- С.89-97.- ISBN -1818-5507-х. -0,56 п.л, личный вклад 100 %.

5. Рябыкина Н.В. Апоптоз клеток белой крови у молодых мышей в норме и при гипогидратационном стрессе // Сборник трудов первой Международной конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине».- 23-26.11.2010, Санкт - Петербург.: Изд-во Политехи, ун-та,- С. 209-210. - ISBN 978-5-7422-2799-1.- 0,12 п.л, личный вклад 100 %.

6. Рябыкина Н.В. Исследование апоптоза клеток белой крови и изменение лейкоцитарной формулы у старых самцов мышей при действии гипогидратационного стресса и а-токоферолацетата // Молодой ученый.-Чита. -2010.-Т.1, № 12(23).- С.57-59,- ISSN 2072-0297,- 0,19 п.л, личный вклад 100 %.

7. Рябыкина Н.В., Теплый Д.Л., Чумакова A.C. Исследование действия гипогидратационного стресса и антиоксидантов на интенсивность свободнорадикальных процессов у самцов мышей на разных стадиях онтогенеза // Естественные науки.-2011,- № 1,- С.131-137.- ISBN -1818-5-507-х. -0,31 п.л, личный вклад 50%.

8. Рябыкина Н.В. Исследование апоптоза клеток белой крови молодых и старых самцов мышей под влиянием витамина С, а-токоферолацетата и гипогидратационного стресса//Естественные науки.-2011,-№ 1.-С.127-131,- ISBN -1818-5-507-х. -0,31 п.л, личный вклад 100 %.

9. Рябыкина Н.В., Ясенявская А.Л.Изучение влияния гипогидратационного стресса и антиоксидантов на перекисную резистентность эритроцитов у самцов белых мышей на разных этапах онтогенеза // Материалы II Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение».- 2-3 ноября 2011, Астрахань.: Изд. дом «Астраханский университет». - С.79-82.- ISSN978-5-9926-0522-8.-0,25 п.л, личный вклад 50 %.

10. Рябыкина Н.В. Влияние антиоксидантов и иммобилизационного стресса на апоптоз клеток белой крови крыс на разных этапах онтогенеза // Материалы II

Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение». - 2-3 ноября 2011, Астрахань.: Изд. дом «Астраханский университет». -2011,- С.158-160.- 158Ы978-5-9926-0522-8.-0,2 п.л, личный вклад 100 %.

Принятые сокращения и условные обозначения

МДА - малоновый диальдегид ПОЛ - перекисное окисление липидов ГТГЭ - перекисный гемолиз эритроцитов СРО - свободнорадикальное окисление а-ТФ- а-токоферол

Отзывы можно присылать по адресу:

414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1, Инновационный Естественный институт

Астраханского государственного университета.

Техническому секретарю - Васильевой Людмиле Александровне

Тел. (8512)51-82-64

E-mail: sovetei@rambler.ru

Отпечатано в ООО КПЦ «Полиграфком» г. Астрахань, пл. Дж. Рида, 1 тел.: 44-80-44 Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рябыкина, Наталья Валерьевна, Астрахань

МИНОБРНАУКИ РОССИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Астраханский государственный университет»

04201454392

РЯБЫКИНА Наталья Валерьевна

На правахрукописи

Функциональная взаимосвязь апоптоза элементов белой крови и

свободнорадикальных процессов при действии стресса и антиоксидантов на этапах онтогенеза у лабораторных животных

03.03.01 -физиология

\ _

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, Бажанова Е.Д.

Астрахань 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Введение_5

ГЛАВА I. Обзор литературы

1.1.Основные концепции старения_10

1.1.1. Иммунологическая теория старения_10

1.1.2. «Предел Хейфлика», теломеры и теломеразы_11

1.1.3. Элевационная теория старения_11

1.1.4. Старение как медленный феноптоз_12

1.1.5. Свободнорадикальная теория старения_13

1.1.5.1. Понятие об антиоксидантной системе_15

1.1.5.2. Система антиоксидантной защиты при старении_16

1.1.5.3. Антиоксиданты как геропротекторы_17

1.1.5.4.Возрастные изменения перекисного окисления липидов_20

2.Современные представления об апоптозе

2.1. Морфологическая характеристика апоптоза_22

2.2. Апоптоз клеток иммунной системы и крови_24

2.2.1. Апоптоз при селекции Т-лимфоцитов_27

2.2.2. Апоптоз при селекции В-лимфоцитов_29

2.2.3. Апоптоз нейтрофилов_31

2.3. Роль апоптоза в процессе старения_34

2.4.Влияние витамина Е на апоптоз_36

ГЛАВА II. Материал и методы исследования

2.1. Общая характеристика экспериментов_39

2.2. Определение лейкоцитарной формулы_42

2.3. Определение уровня апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов_42

2.4. Определение степени перекисного гемолиза эритроцитов_43

2.5. Исследование динамики процессов ПОЛ ткани_44

ГЛАВА III. Результаты исследований

3.1. Влияние стресса и витаминов на уровень ПОЛ и динамику апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов белых мышей (I серия)

2

3.1.1. Изменение массы тела мышей в ходе эксперимента_47

3.1.2. Изменение относительной массы надпочечников под влиянием стресса и антиоксидантов_48

3.1.3. Влияние стресса и витаминов на уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов_51

3.1.4. Влияние гипогидратационного стресса и витаминов на лейкоцитарную формулу крови белых мышей_61

3.1.5. Влияние гипогидратационного стресса и витаминов на перекисное окисление липидов плазмы крови_64

3.1.6. Влияние гипогидратационного стресса и витаминов на перекисное

окисление липидов в печени мышей_68

3.1.6. Влияние гипогидратационного стресса и витаминов на перекисный гемолиз эритроцитов_72

3.2. Влияние стресса и антиоксидантов различной природы на уровень ПОЛ и динамику апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов белых крыс (II серия).

3.2.1. Изменение массы тела крыс в ходе эксперимента_75

3.2.2. Изменение относительной массы надпочечников под влиянием стресса и антиоксидантов_76

3.2.3. Влияние иммобилизационного стресса и антиоксидантов различной природы на апоптоз нейтрофилов и лимфоцитов_78

3.2.4. Влияние иммобилизационного стресса и антиоксидантов на лейкоцитарную формулу крови белых крыс_90

3.2.5. Перекисное окисление липидов плазмы крови _93

3.2.6. Перекисное окисление липидов в печени крыс_98

3.2.7. Перекисный гемолиз эритроцитов_104

ГЛАВА IV. Обсуждение результатов исследований_107

Выводы_118

Список литературы_119

Принятые сокращения и условные обозначения

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СРО - свободнорадикальное окисление

ПГЭ - перекисный гемолиз эритроцитов

АФК - активные формы кислорода

АОА - антиокислительная активность

СОД - супероксиддисмутаза

ЛНП - липопротеины низкой плотности

МДА - малоновый диальдегид

ЛП - липопротеид

ТГ - триацилгицирин

В-ЛП - В-липопротеид

ПКГ - программированная клеточная гибель

ГКГ - главный комплекс гистосовместимости

ТСЯ - Т-клеточный рецептор

ТБК - тиобарбитуровая кислота

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цГМФ - циклический гуазинмонофосфат

Введение

Актуальность темы. Исследование механизмов апоптоза или «программированной клеточной гибели» стало в последние десятилетие одним из ведущих направлений биологии клетки, особенно иммунологии и биологии развития. К настоящему времени установлено, что апоптоз играет важную роль в различных биологических процессах, включая дифференцировку, развитие и созревание клеток (Clapp С., Portt L. et al., 2012). В течение эмбрионального и фетального развития огромное число клеток удаляются путем апоптоза (Joaquin A.M. et al., 2001; Bailly A., Gartner

A., 2013). Этот процесс распространен и в пределах иммунной системы.

Апоптозу принадлежит роль и в развитии процесса старения (Зайнуллин В.Г., Москалев A.A., 2000, 2001; Krabbe et al., 2004; Huang H et al., 2005; Fülle S., Centurione L., Mancinelli R. et al., 2012). К старости организм утрачивает способность верно реагировать на сигналы апоптоза, что приводит к развитию различных патологий, однако, увеличение гибели клеток, необходимо для нормальной жизнедеятельности организма (Pettmann

B. et al., 1998; Суханова Г.А., Акбашева O.E., 2006). Исследования последних лет показали, что патогенез многих болезней, в том числе рака, лейкозов и вирусных инфекций, связан с неспособностью клеток запускать механизм апоптоза (Ryoo H.D., Begmann А., 2012). Такие болезни, как СПИД, остеопороз, апластическая анемия, напротив, связаны с повышенной способностью клеток к апоптозу (Favaloro В., Allocati N., Graziano V. et al., 2012). В настоящее время доказана прямая связь между нарушением регуляции апоптоза и заболеваниями иммунной системы.

В последние десятилетия накоплен большой опыт в изучении механизмов апоптоза различных клеток, однако вопрос о гибели клеток белой крови на поздних этапах онтогенеза изучен не полностью. Известно, что процессы апоптоза и старения взаимосвязаны, и влияние на один из них влечет изменение другого. Однако недостаточная изученность и отсутствие точного представления о механизмах регуляции апоптоза клеток белой крови

5

при старении и влиянии на этот процесс свободнорадикального окисления, не дает возможность полноценно использовать антиоксиданты как геро- и стрессопротекторы в клинической гериатрии. В связи с этим представляется актуальным исследовать механизмы регуляции апоптоза клеток белой крови при старении, и эффекты антиоксидантов в контроле и при стрессе у разновозрастных животных.

Накопление продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях организма является одним из пусковых сигналов развития апоптоза является (ОогоШ А.\¥., 1998). Благодаря накопленным за последние десятилетия данным, представления о механизмах свободнорадикальных реакций, их месте и роли в жизни отдельных клеток и целостного организма складываются в гармоничную свободнорадикальную теорию (Нагшап О., 1956,1994, 2006). Эта теория раскрывает не только уже известные положения о роли процессов ПОЛ при стрессе, различных токсических воздействиях, при развитии многих заболеваний, но и физиологически необходимые свойства активных форм кислорода и его продуктов, их влияние на липиды мембран (Зенков Н.К., Меныциков Е.Б. и др., 1993; Вгеппап Ь.А., МсСгеа1 Я.Б., КапЮгош М., 2012)

Установлено, что при старении организма происходит интенсификация свободнорадикальных процессов. С возрастом происходит снижение содержания витаминов-антиоксидантов в организме (1а^аг Ю., Найлша1е 8.Н. е1 а1., 2012), что служит веским основанием для применения их в медицинской практике (Ланкин В.З., Техазе А. К., Беленков Д.Н., 2001; Хавинсон В.Х. и др., 2003). Эти вещества вызывают большой интерес, так как способны влиять на интенсивность апоптоза и свободнорадикальные процессы.

Попытки изучить по данным литературы возрастные изменения апоптоза элементов белой крови под действием различных факторов, в том числе при интенсификации свободнорадикального окисления (СРО) привели нас к выводу, что этот вопрос исследован недостаточно.

Цель данного исследования - изучить протекторное действие антиоксидантов различной природы (природного - а-токоферола и синтетического - эмоксипина) на физиологический и стресс-индуцированный апоптоз клеток белой крови и интенсивность свободнорадикальных процессов у лабораторных животных, на разных этапах онтогенеза.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности физиологического апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов у молодых и старых мышей и крыс.

2. Изучить влияние иммобилизационного и гипогидратационного стресса на уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, изменения лейкоцитарной формулы, интенсивность перекисного окисления липидов плазмы крови и печени, а также степень перекисного гемолиза эритроцитов у лабораторных животных (мыши, крысы) и их особенности при старении.

3. Изучить влияние природного антиоксиданта - а-токоферола и синтетического антиоксиданта - эмоксипина на динамику апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, интенсивность перекисного окисления липидов плазмы крови, печени и степень перекисного гемолиза эритроцитов у мышей и крыс разных возрастных групп.

4. Изучить влияние стресс-протекторного эффекта а-токоферола и эмоксипина в условиях стресса на уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, интенсивность ПОЛ плазмы крови, печени и степень ПГЭ у лабораторных животных (мыши, крысы) на этапах онтогенеза.

Научная новизна. Впервые комплексно изучено влияние природного антиоксиданта а-токоферола и синтетического антиоксиданта - эмоксипина на уровень апоптоза клеток белой крови (нейтрофилы, лимфоциты), у интактных мышей и крыс, и при действии стрессогенных факторов (иммобилизационного и гипогидратационного стресса) на разных этапах онтогенеза. Обнаружено, что антиоксиданты, преимущественно а-токоферол, оказывают более выраженное антиапоптозное действие на старых животных, что связано с истощением антиоксидантной системы при

7

старении. Получены новые данные о функциональной взаимосвязи динамики апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов и интенсивности свободнорадикальных процессов у животных на разных этапах онтогенеза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов увеличивается с возрастом, что коррелирует с повышением свободнорадикальных процессов в период инволюции.

2. Стресс вызывает повышение уровня апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, интенсификацию перекисного окисления липидов в плазме крови и печени, лейкопению, усиление гемолиза эритроцитов вне зависимости от возраста.

3. а-токоферол оказывает более выраженное антиоксидантное и антиапоптическое действие на позднем этапе онтогенеза. Менее выраженным действием обладает синтетический антиоксидант эмоксипин.

4. а-токоферол в условиях стресса снижает стрессорное воздействие на организм, уменьшает уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, интенсивность ПОЛ плазмы крови, печени и перекисный гемолиз эритроцитов вне зависимости от возраста. Эмоксипин в аналогичных условиях менее эффективен как антиоксидант.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты экспериментальных исследований служит теоретическим обоснованием возможности использования антиоксидантов для замедления темпов апоптоза и в качестве средств предупреждения патологии иммунной системы. Полученные результаты исследований позволят предупреждать индукцию апоптоза при возрастной и стрессорной (иммобилизационный и гипогидратационный стресс) интенсификации свободнорадикальных процессов. Обнаруженные данные представляют интерес для медицины, ветеринарии и геронтологии. Используются для чтения лекций по физиологии человека и животных, гистологии а также для чтения спецкурсов магистрантам и аспирантам в Астраханском государственном университете.

8

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006); Материалах IV научно-практической конференции «Гомеостаз и эндокринология» с международным участием (Хургада, 2006); Материалах первой Международной научно - практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010); II Международной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2011). По теме диссертации опубликовании 10 работ, в том числе 3 в изданиях рекомендованных ВАК РФ.

ГЛАВА I Обзор литературы

1.1. Основные концепции старения.

В настоящее время насчитывается более 300 теорий старения (Medvedev Z.A., 1990). Более значимыми теориями остаются выдвинутая в 1956 году Д. Харманом свободнорадикальная теория (Harman D., 1956), теория клеточного старения Л. Хейфлика (Hayflick L., 1961,1998), элевационная теория старения В.М. Дильмана (Дильман

В.М., 1971,1987,1994) и теломерная теория А.М. Оловникова (Оловников А.В. 1971,1992)

1.1.1. Иммунологическая теория старения.

М. Бернет (Burnet М., 1974) и Уолфорд (Walford D.L., 1969) предположили, что с возрастом снижается активность иммунных клеток Т-звена, вследствие чего учащаются случаи различных инфекционных заболеваний, аутомных процессов и опухолей.

У человека в старости общее число Т-клеток периферической крови существенно не меняется, однако происходят изменения в подтипах Т-клеток, а также в функционировании Т-лимфоцитов (Chen Guobing, Ana Lustig et al., 2013). С возрастом происходит увеличение числа незрелых лимфоцитов Т-предшественников и частично активированных Т-лимфоцитов(Т1ютр8оп J.S.et al., 1987; Moro-Garcia М.А., Alonso-Arias et al., 2013).

Важным результатом в исследовании механизмов иммуностарения является изучение его роли в развитии возрастных изменений эндокринной и нервной систем. Нейроэндокринно-иммунные взаимодействия осуществляются через гипоталамо-гипофизарную систему (Reiche Е.М. et al., 2004), при помощи цитокинам и гормонам (Markovic L., 2004). Возрастные изменения иммунной системы могут быть связаны с увеличением уровня

10

апоптоза макрофагов и тимоцитов. В настоящее время известно, что элиминация тимоцитов с возрастом происходит путем апоптоза (С)иа§Нпо В.ег.а!.. 2001).

1.1.2. «Предел Хейфлика», теломеры и теломераза.

В 1961 году американский геронтолог JI. Хейфлик установил, что с возрастом происходит остановка роста соматических клеток высших эукариот после определенного числа делений, это явление назвали «пределом Хейфлика».

В 1971 году А. М. Оловников предложил теорию, согласно которой при каждом делении клетки происходит укорачивание хромосомы. Концевые участки хромосом - теломеры после удвоения хромосом немного укорачиваются до определенного момента, пока не укоротятся на столько, что клетка будет не способна к делению. Клетка теряет жизнеспособность и погибает в чем согласно данной теории и заключается старение клеток организма. В 1985 г. был открыт фермент теломеразы, при помощи которого достраиваются укороченные теломеры в половых и опухолевых клетках, обеспечивая им бессмертие. Данное открытие стало подтверждением гипотезы A.M. Оловникова.

1.1.3. Элевационная теория старения.

Одной из самых изучаемых теорий в геронтологии является элевационная теория старения, согласно которой с возрастом происходит увеличение чувствительности гипоталамуса к гомеостатическим сигналам (Дильман В.М., 1987; DilmanV.M., 1971, 1994). В.М. Дильман выдвинул гипотезу о существование единого регулирующего механизма, который определяет последовательность возникновения и развития различных гомеостатических систем организма в процессе онтогенеза. Именно повышение порога чувствительности гипоталамуса с возрастом и является

таким механизмом. Данный процесс приводит к возрастному изменению функций репродуктивной системы у женщин, гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы.

В.М. Дильман установил, что старение и болезни пожилого возраста не запрограммированы, а являются побочным звеном генетической программы, от которой зависит закономерность возникновения старческих изменений в организме (Дильман, 1987; Dilman, 1994).

1.1.4. Старение как медленный феноптоз.

В ряде работ последних лет В.П. Скулачев (Скулачев В.П., 1997, SkulachevV.P., 2001, 2005) развивает концепцию феноптоза как механизма запрограммированной смерти и старения. Под феноптозом понимается процесс биохимического самоуничтожения (самоубийства) на уровне организма. На субклеточном уровне запрограммированным механизмом самоуничтожения является митоптоз, на клеточном — апоптоз, надклеточном — коллективный апоптоз, органоптоз. Утверждается, что «любая достаточно сложная биологическая система снабжена программой самоликвидации ее составных частей. Такая программа реализуется, если данная составляющая оказывается вредной (а иногда просто ненужной) для системы в целом (Skulachev, Longo, 2005).

В.П. Скулачев (Skulachev V.P., 2001, 2005) полагает, что процесс старения у животных, включая млекопитающих, представляет собой медленный феноптоз. Биологический смысл этого феномена, возможно, заключается в его ускоряющем действии на эволюцию. В известных пределах ускорение жизни может благоприятно сказываться на темпе эволюции благодаря сопутствующему этому ускорению сме