Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные преобразования легочной ткани и свободнорадикальные процессы при гипоксическом и гипероксическом воздействиях на разных этапах постнатального онтогенеза

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Структурные преобразования легочной ткани и свободнорадикальные процессы при гипоксическом и гипероксическом воздействиях на разных этапах постнатального онтогенеза"

На правах рукописи

005020054

Турченко Надежда Валерьевна

СТРУКТУРНЫЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ И СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ ПРИ ГИПОКСИЧЕСКОМ И ГИПЕРОКСИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИЯХ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология 03.03.01 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 А ГіР 2Сі2

Астрахань - 2012

005020054

Работа выполнена на кафедре физиологии и морфологии человека и животных Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханский государственный

университет»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Нестеров Юрий Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, Лазько Алексей Евгеньевич, ФГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия», заведующий кафедрой патологической анатомии;

доктор биологических наук, профессор, Мейланов Иззет Сиражудинович, ФГБОУ ВПО «Дагестанский государственный университет», заведующий кафедрой биохимии и биофизики

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Волгоградский государственный университет»

Защита диссертации состоится «20» апреля 2012 года в 10.00 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 414000, Астрахань, пл. Шаумяна, д.1

Автореферат разослан «13» /Ч Д Р ТА 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Ю.В. Нестеров

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Одной из центральных проблем современной биологии и медицины является проблема адаптации и резистентности организма к действию экстремальных факторов разного генеза и реализации стресс-реакции на уровне отдельных органов и тканей (Фурдуй Ф.З. и соавт., 1996; Тодоров И.Н., 2003; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006). По-прежнему актуальным остается вопрос о стресс-реактивности дыхательной системы, которая включает в себя комплекс образований, обеспечивающих респираторную и целый ряд других функций, не имеющих прямого отношения к дыханию. Легочную ткань из-за многочисленных альвеол, их сурфактантной выстилки и капиллярно-альвеолярных контактов рассматривают как одну из наиболее обширных биологических «мембран» в организме, внешняя поверхность которой постоянно и непосредственно контактирует с окружающей средой и подвергается прямому действию ее неблагоприятных факторов, в том числе изменениям кислородного режима (Сыромятникова Н.В. и соавт., 1987; Мотавкин П.А., Гельцер Б.И., 1998; Rooney S.R., 1994). Несомненно, гипоксия, как и повышенное содержание кислорода, отражаются на структуре аэрогематического барьера, функциональном состоянии сурфактантной системы и гистоструктуре респираторных отделов легкого в целом (Коваленко Т.Н., 1983; Арбузов A.A., 1983; Прокофьев В.Н. и соавт, 1995). Наряду с этим, гипоксия, являясь одним из ведущих звеньев развития стресс-реакции любого генеза, и широко применяемая в современной медицине гипербарическая оксигенация могут приводить к серьезным изменениям свободнорадикальных процессов и антиоксидантного статуса органов и тканей (Дубинина Е.Е., 2006; Teply D.L., 2010). Высокий уровень метаболизма липидов, состав липидов тканей легкого, связанный с образованием основного элемента аэрогематического барьера - сурфактанта, определяющий режим адаптации органа и устойчивости к действию повреждающих факторов, во многом определяют актуальность исследований динамики процессов перекисного окисления липидов и активности системы антиоксидантной защиты легких (Федосеев Г.Б., Жихарев С.С., 1989; Коледова В.В., 2000; Нестеров Ю.В., 2003).

Изучение особенностей реакций организма на экстремальные воздействия невозможно без решения общих и частных вопросов в области онтогенетических механизмов развития и без учета возрастных различий. Степень влияния экстремального фактора на любую систему организма зависит не только от его природы и интенсивности воздействия, но и от морфофункционального состояния самой биологической системы в момент воздействия, которое, в свою очередь, определяется стадией онтогенеза (Тодоров И.Н., 2003; Гончарова Н.Д. и соавт., 2008). Общеизвестны возрастные изменения респираторной системы, неравномерность и гетерогенность ее развития (Лазько А.Е., 1997). В тоже время исследование возрастных особенностей структурно-функциональной организации легочной ткани при действии экстремальных факторов может иметь кроме теоретического, /

диагностическое и отчасти прогностическое значение для оценки биологической зрелости дыхательной системы и ее способности к адаптации. Актуальность этой проблемы возрастает в связи с недостаточной изученностью возрастных особенностей структуры легочной ткани, ее реакции в отношении свободнорадикальных процессов в условиях действия острых гипо- и гипероксии.

Цель исследования - изучить морфологические особенности легочной ткани крыс разного постнатального возраста и уровень свободнорадикальных процессов в норме, при гипо- и гипероксии и введении природного и синтетического антиоксидантов.

Задачи исследования:

1. Дать характеристику структурной организации легочной ткани у интактных неполовозрелых, взрослых и старых животных.

2. Провести сравнительное изучение морфологических показателей легких и стабильности альвеолярного сурфактантного комплекса на моделях острой гипо- и гипероксии у животных разных возрастных групп.

3. На моделях острой гипоксии и гипероксии провести сравнительный анализ возрастных и стресс-индуцированных изменений свободнорадикального окисления липидов и перекисной деструкции белков в легких и, для сравнения, других тканях.

4. Оценить степень зависимости структурных изменений ткани легкого от интенсивности свободнорадикальных процессов в норме и при экстремальных воздействиях.

5. Изучить влияние природного (а-токоферол) и синтетического (эмоксипин) антиоксидантов на морфометрические показатели легких и уровень белковой и липидной пероксидации в них при окислительном стрессе на разных этапах постнатального онтогенеза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Степень структурных изменений в легких при гипо- и гипероксическом воздействии зависит от возраста животных. Острая гипоксия у крыс сопровождается морфологическими изменениями легочной ткани (повышение толщины бронхиальных стенок, ширины сосудистых стенок и межальвеолярного пространства) наиболее выраженными на поздних этапах онтогенеза. При гипербарической оксигенации изменения морфологических показателей ткани легкого наиболее выражены у неполовозрелых животных.

2. Окислительный стресс сопровождается разнонаправленными изменениями интенсивности свободнорадикального окисления белковых и липидных компонентов легочной ткани. Процессы окислительной модификации белков и липидной пероксидации не находятся в тесной зависимости друг от друга; уровень стресс-индуцированных изменений перекисного окисления липидов зависит от возраста экспериментальных животных.

3. Изменения морфологических показателей легких находятся в зависимости, преимущественно положительной, от интенсивности

свободнорадикальных процессов; исследования демонстрируют формирование достоверной корреляции между этими параметрами, главным образом у неполовозрелых животных, вне зависимости от воздействия, и высокой корреляции между морфологическими показателями и свободнорадикальным окислением в легких старых крыс различную при гипо- и гипероксическом воздействиях.

4. Различия в направленности и степени действия природного и синтетического антиоксидантов определяются возрастом и характером воздействия.

Научная новизна. Впервые проведен анализ структурных изменений и свободнорадикальных процессов в легочной ткани в возрастной динамике при действии гипо- и гипероксии в эксперименте. Впервые дано морфологическое описание ткани легкого по наиболее значимым показателям в ряду предпубертатные, половозрелые и старые животные и ее изменений при гипоксическом и гиперокисческом воздействиях. В работе исследованы и сопоставлены процессы белковой и липидной пероксидации в легочной и других тканях на разных этапах онтогенеза и выявлены возрастные особенности стрессорной динамики свободнорадикальных процессов. На моделях острой гипо- и гипероксии показано, что процессы перекисного окисления липидов и перекисной деструкции белков в легких изменяются не однонаправленно у крыс разных возрастных групп. Получены ранее неизвестные данные о тесной зависимости изменений структуры ткани легкого, от интенсивности свободнорадикальных процессов и достаточно высокой силе влияния возраста на фоновую и стресс-индуцированную активность процессов перекисного окисления белков и липидов.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования демонстрируют наличие возрастных различий в особенностях структурных изменений и свободнорадикальных процессов в легочной ткани при воздействии гипо- и гипероксии и расширяют представления о механизмах стресс-реакции на уровне отдельных органов. Возрастные различия в морфологической картине легких и динамике накопления продуктов свободнорадикального окисления служат основанием для анализа последствий действия гипо- и гипероксии в эксперименте и клинической практике. Выявлены эффекты природного и синтетического антиоксидантов, которые открывают дальнейшие перспективы для обоснования и более широкого их применения в медицине и ветеринарии при профилактике и лечении стрессорных повреждений органов.

Материалы диссертационного исследования используются при изучении теоретических курсов и проведении лабораторных занятий по физиологии человека и животных, гистологии, биохимии в Астраханском государственном университете, Астраханской государственной медицинской академии, в исследованиях, проводимых в лаборатории экспериментальной физиологии Астраханского государственного университета.

Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на XXI Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), V Международной научно-практической конференции «Человек и животные» (Астрахань, 2010), I и II Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006, 2011). По материалам диссертационного исследования опубликовано 15 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из Введения, Обзора литературы, включающего три подглавы, главы Материал и методы исследования, четырех глав, посвященных результатам исследования и их обсуждению, Выводов, Заключения и Списка литературы. Текст иллюстрирован 14 таблицами и 40 рисунками. Библиографический список включает 282 источников, из которых 88 иностранных.

Материалы и методы исследования Исследования проводились на крысах - самцах в трех сериях опытов на Зх возрастных группах животных: 1 - неполовозрелые 28-дневного возраста средней массой 65 г; 2- половозрелые животные 2-х месячного возраста средней массой 210 г; 3- старые животные 24-х месячного возраста средней массой 345 г. В соответствии с возрастной классификацией лабораторных крыс E.G. Farris (1962), Н.Г. Карнаухова (1971), ВА. Душкина (1980), И.П. Западнюка и соавт. (1983), использованные в наших опытах крысы по возрасту соответствуют неполовозрелым, половозрелым и старым животным.

Животные были разделены на следующие группы: 1) интактные животные (контроль); 2) крысы, которые подвергались однократному действию гипоксии (ГПО); 3) крысы, которые подвергались действию гипербарической гипероксии (ГРО); 4) крысы, которым в течение 14 суток до гипоксии вводили а-токоферол в дозе 2 мг на 100 г массы тела (ГПО+Е); 5) крысы, которым в течение 14 суток до гипероксии вводили а-токоферол (ГРО+Е); 6) животные, которым на протяжении 14 дней до действия гипоксии вводили эмоксипин в дозе 0,5 мг на 100 г массы тела (ГПО+Э); 7) животные, которым на протяжении 14 дней до действия гипероксии вводили эмоксипин (ГРО+Э).

По окончании опытов животных декапитировали после предварительной наркотизации крыс внутрибрюшинным введением нембутала в дозе 4 мг/100 г массы тела (Арушанян Э.Б., Толпышев Б.А., 1981). Острую гипоксию моделировали с помощью известной методики с использованием аппарата Комовского (Тризно Н.Н., 1996). Крысу помещали на 5 мин для ознакомления с ним, после чего, при помощи насоса откачивали воздух из-под стеклянного колпака, при этом давление воздуха определяли по вакуммонометру. При давлении 0,3 атм, крысы находились в аппарате в течение 30 мин. Действию гипербарической гипероксии крысы подвергались в барокамере (бароаппарат одноместный медицинский «ОКА-МТ-С») при 1,5 атм в течение часа. После декапитации забирали кровь, вскрывали грудную и брюшную полость и отпрепаровывали легкие и печень для последующей гомогенизации, экстрагирования тканей и биохимического анализа.

Для исследования гистоструктуры и оценки морфологической картины получали гистопрепараты ткани легкого. Из различных участков отпрепарованных легких выделяли кусочки ткани размером в среднем 0,5 см, которые фиксировали в 5% растворе формальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4). Далее приготовлялись парафиновые блоки. Для микроскопии изготовлялись парафиновые срезы толщиной 5-10 мкм. Проводилась окраска гематоксилином-эозином (Ромейс Б. 1953; Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П.,1991; Саркисов Д.С., Перов ЮЛ.,1996).

Окрашенные срезы изучались в световом микроскопе, где производилась микрофотосъемка с помощью "ORBITOR MVE 50" ("Electronic Eyepiece" Япония).

Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа (Автандилов Г.Г., 1990, 2002). Для этого использовали автоматическую систему обработки изображений «Видеотест-Морфо 3.0» (Россия). Она включала в себя исследовательский микроскоп JIOMO (Россия) с фотокамерой "ORBITOR MVE 50" ("Electronic Eyepiece" Япония), компьютер с высокоразрешающим цветным принтером и программное обеспечение. Дифференцированному исследованию были подвергнуты участки вблизи корня легкого, а также сегменты, расположенные в каудальном, краниальном и латеральном направлении от него. Рассчитывали объемную долю (мкм3/мкм3) воздушного пространства (ВЛТ), ширину межальвеолярных перегородок (ШМП), относительную ширину сосудистой стенки (ШСС) и бронхиальной стенки (ТБС). Для определения объемной доли воздушного пространства использовали метод наложения точечных сеток на срезы с последующим подсчетом числа совпадений точек с альвеолярными перегородками. Доля точек, попавших на структурные профили (VbtX оценивает их относительный объем: Vbt = Va/Vo где Va - число точек, попавших на альвеолярные перегородки, V0 - общее число точек тестовой системы.

Для определения перекисного окисления белков использовали методику Дубининой Е.Е., Бурмистрова С.О., Леоновой Н.В. (1995). Оптическую плотность образовавшихся денитрофенилгидразонов измеряли при длине волны 540 нМ. Перекисное окисление липидов в гомогенатах тканей оценивали по скорости спонтанного и неферментативного аскорбатзависимого ПОЛ, содержанию в тканях конечного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) по методике Строева Е.А. и Макаровой Е.Г. (1986). Экстинцию проб измеряли на фотоэлектроколориметре при 532 нм.

О функциональном состоянии сурфактанта легкого судили по коэффициенту стабильности пузырьков пены, выжатых из легочной ткани по методу Паттла (Биркун А.А. и соавт., 1981). Для исследования фрагменты респираторного участка легкого помещали в небольшое количество воды и сдавливали пинцетом. Пузырьки полученной пены исследовали в висячей капле под микроскопом и с помощью окулярного микрометра измеряли диаметр 10 пузырьков. Измерения повторяли через 20 минут. Коэффициент стабильности (КС), определяемого отношением площади поверхности пузырька в конце наблюдения к площади поверхности пузырька в начале наблюдения находили

по формуле: КС = 2 Я о где О20 - диаметр пузырьков после 20

минутного периода, мкм; Э0 - диаметр пузырьков в начале наблюдения, мкм. КС выражается в условных единицах.

Весь экспериментальный материал обрабатывался статистически с вычислением средней арифметической, ошибки средней, достоверности различий по критерию Стьюдента и проведением корреляционного и дисперсионного анализа с вычислением достоверности силы влияния по Фишеру (Плохинский Н.А, 1980; Лакин Г.Ф., 1990).

Результаты исследований и их обсуждение С целью решения задач по изучению влияния возраста и окислительного стресса разной модальности, нами проведен анализ наиболее значимых морфологических показателей легочной ткани, таких как воздушность, ширина межальвеолярной перегородки, толщина бронхиальной стенки, ширина сосудистой стенки, а так же зафиксированы наиболее видимые особенности в гистоструктуре легочной паренхимы и аэро-гематического барьера. Обнаружены характерные изменения со стороны крови и легочного кровотока, которые, отчасти, могут быть критерием оценки структурно-функционального состояния аэро-гематического барьера. Результаты демонстрируют изменение морфологических параметров легких в ходе возрастной инволюции. Наиболее показательны результаты о возрастной динамике в сторону увеличения значений ширины сосудистой стенки, которая составляет в 4х недельном возрасте 11,9 % (табл.1) и увеличивается на 8,5 % в 2-х месячном и на 44/1 % в 2-х летнем возрасте. Более стабильным у всех групп является показатель воздушности легочной ткани и толщина бронхиальной стенки.

При воздействии острой гипоксии у крыс показаны следующие морфологические изменения. У животных всех возрастов в бронхиальной стенке, собственной пластинке появляются клеточные инфильтраты. Граница мышечной пластинки с окружающим интерстицием становится неровной и в зоне клеточной инфильтрации не определяется совсем. Воздушность легких становится неоднородной и соответствует 19% об. у половозрелых и 24% у неполовозрелых крыс и старых животных (табл.1). Появляются участки с ателектазами, гипоателектазами, где размеры альвеолярного пространства сопоставимы с размерами перегородок, строма легких инфильтрирована эритроцитами, обнаруживаются участки кровоизлияний. Реакция сосудов на гипоксию неравнозначная: часть сосудов оказывается в состоянии вазоконстрикции, что проявляется в увеличении толщины сосудистой стенки, отсутствии или сужениии просвета, в других сосудах просветы расширены, эритростаз, признаки кровоизлияния или периваскулярного отека, ТСС наибольшая у неполовозрелых крыс и составляет 37% от наружного диаметра сосуда, у половозрелых крыс 30% и 26% у старых животных (рис. 1,2,3).

В результате нарушения альвеолярно-гематического барьера в паренхиме легких, в слизистой бронхов, в просвете альвеол и бронхов появляется большое количество эритроцитов. Отмечены и возрастные различия в ответной реакции

Таблица 1

Морфологические показатели легочной ткани крыс разного возраста при гнпо- и _гнпероксическом воздействиях и введении антноксидантов

Й СЗ Группа Воздушность Ширина Толщина Ширина

а. о легочной ткани межальвеолярной бронхиальной сосудистой

03 (% об.) перегородки (мкм) стенки (%) стенки (%)

Неполовозрелые К 22,2±8,3 20,0±0,7 Д 13,1 ±0,5 Д 11,9± 1,6

ГПО 24,4±8,6 28,9±6,9 16,9±3,7 37±8,9*

ГПОЭ 21,0±6,4 40,0±9,6*+ 17,5±0,5* 22,0±2,3*+

ГПО Е 23.5±4,8 37,0±6,4*+ 18,0±5,2 21,0±3,4+

ГРО 24,4±6,1 35,0±3,5* Д 28,0±7,5- 30,0±4,8'

ГРОЭ 19,2±3,5 40,4±5,2' 26,3±5,Г Д 25,6±7,4*.

ГРОЕ 26,0±4,2 30,0±5,8* 22,0±7,2 24,6±6,7*

Половозрелые К 20±2,5 25,0±1,30 15,0±0,80 13,0±2,1

ГПО 18,6±3,2 30,0±8,1 25,0±6,3* 30,0±4,2*

ГПОЭ 21,9±4,8 35,8±4,4 22,0±8,4 23,4±4,4'

ГПО Е 22,0±6,5 30,0±5,2 21,3±4,1* 30,1±4,2*

ГРО 22,6±5,2 43,7±2,80 18,3±б,8 35,0±3,3*

ГРОЭ 25,0±4,0 35,1±3,9+ 15,0±2Д0 28,0±5,0"

ГРОЕ 21,9±7,3 37,3±5,9 17,6±4,8 32,5±2,5'

Старые К 22,0±3,6 26,0±4,7 15,0±4,6 21,0±3,20 Д

ГПО 24,2±4,1 32,1±2,8 21,0±5,1 26,7±4,2

ГПОЭ 23,0±5,0 30,0±5,0 20,0±7,0 33,5±4,90

ГПО Е 27,8±4,4 32,5±7,9 17,5±1,8 33,4±3,5

ГРО 25,0±4,7 32,8±7,2 19,0±6,1 38,3±7,0'

ГРОЭ 30,2±4,30 28,5±5,1 21,4±7,3 27,1±5,1

ГРОЕ 26,7±8,9 36,5±7,7 16,0±6,1 27,3±5,3

Примечание: * - разница достоверна при р<0,05-0,001в сравнении с контрольными значениями, +- р<0,05-0,001 в

сравнении с параллельной опытной группой; 0 - р <0,05-0,001 в сравнении с неполовозрелыми животными, Д - р <0,050,001 в сравнении с половозрелыми животными.

на гипоксическое воздействие. Так, у половозрелых (рис. 2) и старых животных отмечено увеличение толщины стенок бронхов, обусловленное отеком и массивной клеточной инфильтрацией; эпителий призматический, контуры ядер расплывчатые, граница с подлежащими слоями местами не определяется; в просвете бронхов встречаются скопления эритроцитов или слизи, инфильтрированной клетками, однако проходимость большинства бронхов не нарушена.

У старых животных также отмечается «сглаженность» складок слизистой и куполообразные ее выпячивания в просвет бронхов (рис.3). При гипероксическом воздействии у всех возрастных групп отмечены признаки повреждения бронхиального эпителия: слущивание эпителиальных клеток в просвет бронха, базофилия цитоплазмы эпителиоцитов, исчезновение контуров ядер, слоистое строение стенок бронхов не нарушается. Собственная пластинка инфильтрирована клетками. Четкость границ мышечной пластинки нарушает интенсивная клеточная инфильтрация перибронхиального пространства.

9

Обширные геморрагии в альвеолярном матриксе, просветы альвеол и бронхов. Неполовозрелые крысы. Гипоксическое воздействие. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. Об 8, ок.10.

Кровеносный сосуд с эритростазом, кровоизлияние в просвет альвеолы. Неполовозрелые крысы. Гипоксическое воздействие. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. Об 20, ок.10.

Геморрагии в просвет бронха, альвеол и межальвеолярный матрикс. Неполовозрелые крысы. ГПО+Е. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. Об 20, ок. 10.

Геморрагии в просвет бронхов и перибронхиальное пространство. Неполовозрелые крысы. Гипоксическое воздействие. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. Об 40, ок.10.

Обструкция бронха слизью и

клеточными массами. Неполовозрелые крысы. Гипероксическое воздействие. Окраска гематоксилином и эозином.

Ув. Об 20, ок.10.

Геморрагии в просвет бронха и альвеол. Сосуд в состоянии констрикции и периваскулярный отек. Неполовозрелые крысы. ГРО+Э. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. Об 8, ок. 10.

Рис. 1. Структурные изменения легочной ткани неполовозрелых крыс.

1 еморрагии в просвет бронха и полость альвеол. Участок легочной ткани с гипоателектазами. Половозрелые крысы. Гипоксическое воздействие. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. Об 20, ок.10.

Клеточная инфильтрация и

повышенная эозинофилия периваскулярной области. Половозрелые крысы. Гипероксическое воздействие. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. Об 20, ок.10.

перивакулярной области и стенок сосуда. Половозрелые крысы. ГПО+Е. Окраска гематоксилином и эозином. У в. Об 20, ок.10.

Гетерогенное окрашивание слизистой бронха, диффузная клеточная инфильтрация перибронхиального пространства. Половозрелые крысы. ГПО+Э. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. Об 20, ок.10.

Рис. 2. Структурные изменения легочной ткани половозрелых крыс.

клеточные инфильтраты клетками лимфоидного ряда в перибронхиальной

области. Половозрелые крысы. Гипероксическое воздействие. Окраска гематоксилином и эозином.

Интенсивная клеточная инфильтрация периваскулярной области и межальвеолярного матрикса Половозрелые крысы ГРО+Е. Окраска гематоксилином и эозином. У в. Об 20, ок.10

клеток эпителия в просвет бронха. Старые с гипоателектазами и эмфиземой легочной крысы. ГРО+Е. Окраска гематоксилином и ткани. Старые крысы. ГПО+Э.

эозином. Ув. Об 8, ок.10 Гематоксилин-эозин. Ув. Об. 20, ок. 10.

Рис. 3. Структурные изменения легочной ткани старых крыс. Формируются обширные зоны с ателектазами и гипоателектазами, которые могут занимать все поле зрения. Компенсаторная реакция увеличивает долю эмфизематозных участков и воздушность легочной ткани до 25% об. у старых крыс и 24,4% у крысят, а у половозрелых животных всего 22,6%. В среднем толщина межальвеолярных перегородок достигает максимального значения у половозрелых крыс и составляет 43,7 мкм, а у крысят и старых животных 35 и 32,8 мкм соответственно (табл.1). Сосуды легких отвечают повышением проницаемости сосудистой стенки, что сопровождается отеком и усилением клеточной инфильтрации периваскулярного пространства Большая часть мелких сосудов (менее 160 мкм) находятся в состоянии вазоконстрикции, их просветы запустевают, толщина стенок возрастает от 30 % (от величины наружного диаметра у крысят) до 38 у старых крыс. Более крупного диаметра сосуды чаще полнокровные, контуры нечеткие из-за клеточной инфильтрации стенок.

Анализ эффектов антиоксидантов в целом не выявил видимых возрастных отличий в группах животных, подвергшихся гипоксии и гипероксии и предварительно получавших природный и синтетический антиоксиданты. Так же как и в группах ГПО и ГРО после введения антиоксидантов наблюдали видимые и характерные для этих воздействий изменения морфологической картины легких: высокая проницаемость и сужение сосудов, многочисленные ателектазы сохранение деформации

12

Куполообразные выпячивания слизистой в просвет бронха. Старые крысы. Окраска гематоксилином и эозином. У в. Об 20, ок. 10

Неравномерная воздушность легочной ткани. Старые крысы. Острая гипероксия. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. Об 20, ок. 10

Таблица 2

Изменение коэффициента стабильности легочных пузырьков при гипоксии и

§ 8- Группы животных

со К то ГРО ГПО+Е ГРО+Е ГПО+Э ГРО+Э

я ч — и ^ ч 0,786± 0.01Д 0,929± 0,05Д 0,815± 0.006Д 0,961± 0.054 0,875± 0.012* Д 0,920± 0,03* 0,801± 0.04Д

3 а >0.05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 >0.05 >0.05

§ « 3 0,884± 0.0210 0,794± 0.0310 0,976± 0.040 0,944± 0,009* 0,968± 0,0250 0,972± 0,020 0,980± 0,017*0

2 >0.05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 >0.05

1 0,882± 0.0210 0,916± 0.009Д 0,94б± 0,0220 0,956± 0,028* 0,9б7± 0,0260 0,904± 0.023Д 0,983± 0,0230

1_ >0.05 >0.05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 >0.05

»----------- - — - ---------—. -V - У - — а К (ЦрШЮШЮМ

опытной группой; 0 - р <0,05-0,001 в сравнении с неполовозрелыми животными; Д-р <0,05-0,001 в сравнении с половозрелыми животными.

бронхиальных стенок и случаи эмфиземы. При этом, в легких крыс групп стресс+витамин Е и эмоксипин, введение антиоксидантов сопровождалось изменением, характерным для молодых и старых крыс однонаправленным изменением воздушности легочной ткани, ширины межальвеолярной перегородки, толщины бронхиальной стенки, значения которых имели тенденцию к снижению, по сравнению с гипо- и гипероксическим воздействием (как для витамина Е, так и для эмоксипина). Это может указывать на корригирующие эффекты антиоксидантов на стресс-индуцированные повреждения ткани легкого, что выражалось в приближении некоторых морфометрических параметров к контрольным значениям, причем в группах ГТО+Е и ГРО+Э эти изменения носили более выраженный характер в отношении всех показателей, по сравнению с гипоксическим воздействием. Необходимо отметить, что у. старых животных не обнаружено четкой выраженности и однонаправленности в эффектах антиоксидантов, в некоторых случаях сочетанное действие окислительного стресса и введения витаминов приводило к изменению ВЛТ, ШСС, ТБС, в сторону увеличения значений, даже по сравнению со стрессом.

Проведенный анализ поверхностной активности легкого интактных крыс показал, что коэффициент стабильности легочных пузырьков имел одинаковые значения у половозрелых и старых животных (0,88) и превышал величину КС у неполовозрелых животных на 12 %. Острая гипоксия вызывает повышение стабильности сурфактанта неполовозрелых и старых животных на 18% и на 4 % соответственно (табл.2). У половозрелых животных гипоксическое воздействие привело к снижению данного показателя на 11%. Таким образом, после гипоксического воздействия наиболее высоким оказался КС у крысят, а наиболее низким у половозрелых животных. При гипербарической оксигенации, напротив, КС пузырьков Паттла был значительно выше у

Таблица 3

Уровень перекисного окисления белков (мМ/г белка) в легочной ткани крыс разного постнатального возраста на моделях острого гипо- и гипероксического стресса

и при введении антиоксидантов.

Возраст К ГПО ГРО ГПО+Е ГРО+Е ГПО+Э ГРО+Э

4 недели 0.0123± 0.00031 0.0123± 0.00021 0.0106± 0.0001Д 0.0102± 0.0001*Д 0.0163± 0.0007* А 0.0121± 0.00035 0.0126± 0.0003 *Д

Р >0.05 <0,001 <0,001 <0,001 >0.05 >0.05

2 месяца 0,0135± 0,00080 0,0123± 0,00029 0,0125± 0,000430 0,0276± 0,0016*0 0,0116± 0,000220 0,0116± 0,00042 0,0135± 0,0002*0

Р >0.05 <0,05 <0,001 <0,05 <0,05 >0.05

2 года . 0,0120± ' 0,00021 0,01269± 0,00035 0,01229± 0,00010 0,0130± 0,0001 ОД 0,0122± 0.00020Д 0,0122± 0,00020 0,0135± 0,00020

Р <0,05 >0.05 <0,01 >0.05 >0.05 <0,001

Примечание: Р дано в сравнением с контролем;

* - р< 0,05 - 0,001 в сравнении с параллельной опытной группой;

0 - р <0,05-0,001 в сравнении с неполовозрелыми животными; взрослых и старых крыс по сравнению с неполовозрелыми, превышая контрольные значения. Сочетанное воздействие гипоксии и токоферола привело к стабильному увеличению КС легочных пузырьков у животных всех возрастов, причем наиболее выраженное у половозрелых животных (на 18%), у крысят и старых животных оно составило 4%. Воздействие гипероксии в сочетании с введением витамина Е сопровождается повышением коэффициента стабильности пузырьков Паттла у неполовозрелых на 7% у старых животных по сравнению с ГРО и контролем соответственно на 11% и 9%. У половозрелых крыс наблюдалось повышение этого показателя относительно контроля (на 10%) , а по сравнению с ГРО изменений обнаружено не было. Выявлены возрастные особенности в стабильности пузырьков Патгла, так у крысят и старых животных предварительное введение эмоксипина не вызвало изменения КС, а у взрослых животных привело к его значительному повышению. Результаты изучения интенсивности ПОБ показали, что после 30-минутной гипоксии у половозрелых крыс произошло достоверное снижение уровня ПОБ в тканях печени и легкого на 13% и 9% соответственно, тогда как в крови уровень ПОБ вырос на 51% . У старых животных было отмечено повышение скорости перекисной деструкции белков в ткани легких (на 5%) и печени (на 16%), тогда как в крови наблюдалось некоторое снижение значения данного показателя (табл. 3). Таким образом, наиболее чувствительной к гипоксическому воздействию оказалась плазма крови, а большая стабильность изучаемых параметров характерна для ткани легкого. При этом уровень ПОБ в легких незначительно отличался у разных возрастов, в ткани печени показатели ПОБ были одинаковы у старых и половозрелых животных, а у крысят были несколько ниже. В крови же отмечалось стабильное снижение скорости ПОБ с возрастом на 17 % у половозрелых и на 43% у старых животных. Острая гипербарическая оксигенация привела к достоверному снижению уровня ПОБ в

14

Таблица 4

Интенсивность перекисного окисления липидов в легочной ткани на моделях острых гипо- и гипероксического стрессов и введении природного и синтетического

антноксидяптов

Неполовозрелые животные Половозрелые животные Ста рые животные

МДА нмоль/ 0,05г СпПОЛ нмоль МДА*ч АЗО, нмоль МДА*ч МДА нмоль/ 0,05г СпПОЛ нмоль МДА*ч АЗО, нмоль МДА*ч МДА нмоль/ 0,05г СпПОЛ нмоль МДА*ч АЗО, нмоль МДА*ч

0.313± 0.001Д 3.1910± 0.149Д 3.385± 0.204Д 0.331± 0.0010 2.032± 0.0060 2.066± 0.0150 0.353± 0.0050Д 2.024± 0.0320 2.005± 0.0280

гпо 0.3168± 0.001Д 1.9195± 0.0112 2.0276± 0.050Д 0.348± 0.0040 1.907± 0.006* 2.331± 0.1130 0.328± 0.001од 2.004± 0.0460Д 2.217± 0.0530

<0,05 <0,001 <0,001 <0,001 < 0,001 <0,05 <0,05 >0.05 <0,01

Ё 0.3255± 0.002Д 1.968± 0.015Д 2.199± 0.017Д 0.416± 0.0020 2.49± 0.014*0 2.519± 0.0190 0.347± 0.0030Д 1.973± 0.009Д 2.143± 0.020Д

< 0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 >0.05 >0.05 <0,01

ш + О Е 0.324± 0.002« д 1.9285± 0.013Д 1.975± 0.019Д 0.416± 0.001*0 2.841± 0.133*0 2.649± 0.070*0 0.32±0. 001 «од 1.974± 0.004Д 2:076± 0.03*од

<0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 >0.05 >0.05

ГРО+Е 0.315± 0.001*Д 1.886± 0.009« л 1.947± 0.039'д 0.407± 0.001*0 3.312± 0.150*0 2.514± 0.0760 0.324±0 .002*од 1.973± О.ООЗОД 2.836± 0.385*0

<0,05 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 >0.05 <0,05

ГПО+Э 0.3267± 0.002*д 2.9086± 0.052* д 3.417± 0.106« д 0.352± 0.0010 2.245± 0.035*0 2.406± 0.0320 0.316±0 .0008*д 1.955± 0.0310Д 1.942±0 .019*0 д

<0,001 >0.05 >0.05 <0,001 <0,001 <0,001 <0,01 >0.05 <0,05

ГРО+Э 0.3245± 0.0011 1.9891± 0.018Д 2.127± 0.03* Д 0.332± 0.005* 2.756± 0.243*0 2.033± 0.019*0 0.323± 0.003* 1.94±0. 009*о д 2.319±0 .072*од

< 0,001 <0,001 <0,001 >0.05 <0,001 <0,05 < 0,001 <0,05 <0,01

Примечание: Р дано в сравнением с контролем, * - р< 0,05 - 0,001 в сравнении с параллельной опытной группой; 0 - р <0,05-0,001 в сравнении с неполовозрелыми животными; Л - р <0,05-0,001 в сравнении с половозрелыми животными.

ткани легкого и крови неполовозрелых крыс на 13% и 32% соответственно, в ткани печени было отмечено незначительное повышение уровня ПОБ. У половозрелых крыс так же наблюдалось снижение перекисной деструкции белков в легочной ткани (на 8% по сравнению с контролем) и печени (на 10%). В крови достоверных изменений выявлено не было. Гипероксический стресс не привел к изменениям уровня ПОБ в легких и крови старых животных, а в печени наблюдалось повышение уровня ПОБ на 19%. В легких и печени животных наиболее высоким оказался уровень ПОБ у половозрелых крыс, а в крови - у старых животных.

Результаты изучения уровня ПОЛ представлены в таблице 4. После гипоксического воздействия у неполовозрелых крыс отмечено отсутствие изменения уровня МДА как в ткани печени, так и в легком, незначительное, но достоверное снижение уровня СпПОЛ , снижение уровня АЗО во всех

исследуемых тканях, которое наиболее выражено в легочной ткани (на 60% по сравнению с контролем) и менее в печени (7%). У половозрелых животных наблюдалось достоверное повышение уровня МДА в легком. В условиях ГРО обнаружено повышение уровня МДА в легких и печени неполовозрелых крыс на 4% и 14% соответственно, снижение СпПОЛ на 62% а АЗО на 65%. При этом в ткани печени отмечено повышение значений этих показателей. Кроме того, произошло повышение уровня МДА у половозрелых животных как в печени (на 15%) так и в легких (на 25%).

Результаты дисперсионного анализа демонстрируют достаточно сильную зависимость изученных нами процессов СРО от возраста животного. Наибольшее влияние возрастной фактор оказывает на стресс-индуцированные изменения липидной пероксидации как в легких, так и в печени, что подтверждается достаточно высокими и достоверными значениями ц«2 (от 0,31 до 0,58). Высокая сила влияния возраста на окислительную модификацию белков показана как в легких, так и печени (сила влияния при ГПО и ГРО была достоверной и составляла от 0,24 до 0,59) в отличие от ПОЛ, где в условиях фоновой активности возраст имел высокую силу влияния (легкие, печень). Максимальная величина п.2 для ПОБ характерна только для печени интактных животных (0,86, р<0,001).

Далее, результаты исследования показали наличие корреляционной зависимости между морфологическими показателями и уровнем белковой пероксидации в легких интактных крыс, причем положительной у молодых и отрицательной у взрослых и старых животных (табл.5). При действии гипоксии выявлена положительная корреляция, причем ее наибольшие значения имели место у старых животных (г = 0,68-0,73). Результаты анализа корреляционных отношений между ПОБ и морфологическими показателями при действии гипероксии демонстрируют формирование слабой положительной корреляции у старых, отрицательной у взрослых и достоверно высокой в группе неполовозрелых крысят. В тех же условиях обнаружены достаточно разнонаправленные и разно выраженные значения коэффициента корреляции между изменениями ШМПДБС, ШСС и интенсивностью перекисного окисления липидов. Так, при острой гипоксии обнаружена выраженная отрицательная корреляция между морфологическими показателями и содержанием МДА только у старых животных (г = -0,56-0,76). У половозрелых крыс достоверной корреляционной зависимости, не выявлено, а у молодых наблюдается положительная взаимосвязь между шириной межальвеолярных перегородок и уровнем МДА в ткани легкого. Как видно (табл.5), действие гипероксии сформировало высокую положительную корреляцию у старых животных и у неполовозрелых крысят только в отношении толщины бронхиальных стенок.

. Таким образом, можно заключить, что значения морфологических показателей легких находятся в зависимости, преимущественно положительной, от интенсивности свободнорадикальных процессов, которая имеет возрастную специфику. Проведенный корреляционный анализ демонстрирует формирование сильной положительной корреляции главным

j. Таблица 5

Корреляционная зависимость между морфометрическими параметрами и

Морфометрические показатели

Í с с >> о. Показатели СРО Воздушность легочной ткани Ширина межальвео- лярноб перегородки Толщина бронхиальной стенки Ширнна сосудистой стенки

ПОБ 0,765* 0,399 0,456 0,436

2 3 МДА 0,851* 0,04 0,128 0,115

Ск о О с ПОБ 0,437 -0,3 0,436 0,336

о ч и МДА -0,186 0,534 -0,222 -0,182

с 01 Т, о ПОБ 0,905** 0,851* 0,31 0,839*

U МДА 0,162 0,180 0,89** 0,193

а ПОБ -0,207 -0,308 0,215 -0,15

2 5 О. «ч МДА -0,45 0,007 0,45 0,853*

о ПОБ 0,327 0,323 0,475 0,33

03 о 4 и МДА 0,276 0,291 -0,278 0,279

о С о ПОБ -0,259 -0,267 -0,004 -0,249

и МДА 0,116 0,162 -0,219 0,088

Ы ПОБ -0,291 -0,256 -0,262 0,371

МДА 0,195 0,151 0,158 -0,574

3 о. О г ПОБ 0,685* 0,680* 0,717* 0,730*

н <J ¿J - МДА -0,560 -0,580 -0,760 -0,762

о ПОБ 0,140 0,148 0,133 0,113

у U МДА 0,720* 0,733* 0,723* 0,730*

образом у неполовозрелых животных вне зависимости от модальности воздействия. Наряду с этим, только у старых крыс гипоксия формирует высокую положительную корреляционную связь относительно ПОБ и отрицательную относительно ПОЛ. Высокая положительная корреляция между морфологическими показателями легких и уровнем ПОЛ имеет место также только у старых крыс при гипероксическом воздействии.

Результаты исследования позволяют прийти к заключению о том, что однократное воздействие rano- и гипероксии сопровождается изменениями интенсивности свободнорадикальных процессов, которые выражаются, как правило, в усилении ПОЛ и ПОБ в большинстве изучаемых тканей у животных разного возраста, но при этом имеют место тканевые и возрастные особенности, которые заключаются в разнонаправленное™ изменений параметров свободнорадикального окисления. На модели гипоксического стресса показана достаточная реактивность легочной ткани в отношении свободно-радикального окисления, которая имеет возрастную специфику. Легкие крысят оказываются более устойчивыми к стресс-индуцированному усилению СРО, а в случае со скоростью ПОЛ наблюдается достоверное его снижение после гипоксического воздействия, что, возможно, может быть

связано с интенсивностью метаболизма липидов в легком и активностью ферментного звена антиоксидантной системы в этом возрасте. Аналогичная картина наблюдается и в группе старых крыс. Острый гипероксический стресс сопровождается выраженным усилением ПОЛ в легких взрослых крыс, наряду с отсутствием изменений ПОБ. В то же время менее выраженные изменения СРО имели место в легких старых и молодых неполовозрелых крыс.

выводы

1.Морфологические проявления в структурах легочной ткани у интактных крыс разного возраста выражаются в повышении с возрастом значений толщины бронхиальной (до 13%) и сосудистой стенок (от 8,5% до 44%), ширины межальвеолярных перегородок (на 20-23%); на этапе старческой инволюции обнаружены выраженные деформации слизистой и замещения эпителия мелких бронхов, разрастание межмышечной соединительной ткани и истончение межальвеолярных перегородок.

2.При острой гипоксии выявлены возрасгзависимые изменения структуры легочной ткани, которые заключаются в значительном повышении толщины бронхиальных стенок, ширины стенок легочных сосудов и межальвеолярных перегородок, наиболее выраженные у взрослых крыс (на 40%, 57% и 20% соответственно).

3.На модели острой гипероксии выявлены изменения морфологических показателей в легких у животных всех возрастных групп: значительное увеличение ширины межальвеолярных стенок у четырехнедельных и двухмесячных, ширины сосудистых стенок у половозрелых и старых и утолщения бронхиальных стенок, особенно выраженные у неполовозрелых животных (на 54%).

4. Гипо- и гипероксическое воздействия сопровождаются повышением стабильности альвеолярного выстилающего комплекса, что выражается в увеличении коэффициента стабильности пузырьков Паттла у животных всех возрастных групп (от 4%до 16%); у двухмесячных крыс только острая гипоксия приводит к снижению стабильности легочного сурфактанта.

5. Легкие животных всех возрастных групп проявляют большую устойчивость в отношении индуцированной гипо- и гипероксическим воздействиями перекисной деструкции белков по сравнению с печенью и кровью.

6.Гипо- и гипероксия сопровождаются разнонаправленными'изменениями перекисного окисления липидов в ткани легкого крыс разного возраста. Показано усиление образования малонового диальдегида в легких неполовозрелых и, особенно, двухмесячных крыс и снижение уровня спонтанного и индуцированного ПОЛ только у 4-недельных крысят. Легкие более устойчивы к стресс-индуцированному усилению перекисного окисления липидов, значительная активация которого имеет место в печени у животных всех возрастных групп.

7. Изменение значений морфологических показателей легких находятся в тесной зависимости от интенсивности свободнорадикальных процессов, которая имеет возрастную специфику; это выражается в наличии высокой положительной корреляции между этими показателями у неполовозрелых

животных (г - 0,71 - 0,90) и сильной как положительной (г = 0,68 - 0,73) так и отрицательной (от г = -0,56 до г = -0,79) взаимосвязи структуры легочной'ткани и белково-липидной пероксидации в легких старых крыс. 8.Предварительное введение антиоксидантов не сопровождается видимыми изменениями морфометрических показателей легких; при сочетанном действии а-токоферола и эмоксипина с гипербарической оксигенацией антиоксиданты проявляют коррегирующий эффект, приближая значения некоторых морфометрических параметров к контрольным значениям.

9.Специфика в действии природного и синтетического антиоксидантов на свободнорадикальные процессы зависят от возраста, характера воздействия и вида ткани. Больший антиоксидантный эффект проявляет а-токоферол, снижая стрессорное усиление перекисной деструкции белков у взрослых и старых крыс, при этом эмоксипин в условиях действия гипоксии оказывает прооксидантное действие преимущественно у молодых животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Нестеров Ю.В. Влияние гипо- и гипсрокснческого стресса на свободнорадикальные процессы в эксперименте II Ю.В. Нестеров, P.A. Азизов, HB Карнаухова // Естественные науки.- 2007, № 4(4}-с. 46-53.

2. Нестеров Ю.В. Сравнительное изучение стресс-ивдуцировшшых и возрастных изменении перекисной деструкции белковых и липвдеых компонентов тканей в эксперименте/ Ю.В. Нестеров, A.C. Чумакова, P.A. Азизов, Н.В. Карнаухова // Биологически е исследования,- 2009, №2(2).- С. 103-110.

3. Нестеров Ю.В. Изменение перекисной деструкции белков и липидов в тканях крыс в условиях острых гипо- и гипероксии и введении природного и синтетического антиоксвдантов / Ю.В. Нестеров, Н.В. Гурченко, A.B. Тряеучев // Биологически е исследования.-2009, №4(4).- С. 45-50.

4. Нестеров Ю.В. Влияние острого гипо- и гипероксического стресса на поверхностную активность легких в эксперименте / Ю.В. Нестеров, HB Гурченко // Биологически е исследования,- 2009, №4(4).- С. 41-44.

5. Нестеров Ю.В. Структурные особенности аэрогематнческого барьера легких в условиях острого гнпо- и гипероксического стресса и Ю.В. Нестеров, Н.В. Турченко // Естественные науки.-2010,№3(32).-с. 112-116.

6. Нестеров Ю.В. Стресс-реактивность поверхностной активности н свободнорадикальных процессов в легких при остром гипо- и пшероксическом воздействии в эксперименте // Ю.В. Нестеров, Н.В. Турченко, P.A. Азизов II Естественные науки,-2010, №3(32)-С. 116-121.

7. Нестеров Ю.В. Влияние егресс-индуцированных воздействий разной модальности и антиоксиданта на свободнорадикальные процессы в легких и печени белых крыс И Ю.В. Нестеров, Н.В. Турченко //Естественные науки,-2010, JVs 3(32)-С. 122-126.

8. Нестеров Ю.В. Влияние гипоксии на свободнорадикальное окисление белков в разных органах крыс / Ю.В. Нестеров, Н.В. Турченко // Материалы 21 Съезда физиологического общества им. И.П.Павлова.- М,- Калуга.- 2010.- С.615.

9. Нестеров Ю.В., Изменение антиоксидантного статуса организма при изменении кислородного режима / Ю.В. Нестеров, Н.В. Турченко // Материалы 5 Международн Научно-праетич. Конф. «Человек и животные»,- Астрахань: Изд-во «Астраханский университет», 2010, - С. 1 б-18.

10. Нестеров Ю.В. Влияние острых гипо-, гипероксического и эмоционально-болевого стресса на свободнорадикальные процессы в висцеральных органах / Ю.В. Нестеров, HB.

Турченко, A.C. Чумакова, P.A. Азизов // Материалы 5 Международн. Научно-пракгич. Конф. «Человек и животные».- Астрахань: Изд-во «Астраханский университет», 2010,- С. 14-16.

11. Нестеров Ю.В. Влияние острого гипо- и гипероксического стресса на поверхностную активность легких в эксперименте / Ю.В Нестеров, Н.В. Турченко // Материалы 5 Международн. Научно-практич. Конф. «Человек и животные»,- Астрахань: Изд-во «Астраханский университет». - 2010,- С. 18-20.

12. Нестеров Ю.В. Анализ возрастных различий реакций легких на острую гипосшо и гипероксию в отношении свободно-радикалышх процессов в эксперименте /Ю.В. Нестеров, Н.В. Турченко, A.B. Трясучее // Свободные радикалы, антиоксиданты и старение. Издательский дом «Астраханский университет». - 2011.- С.35-38.

13. Нестеров Ю.В. Эффекты биологического и синтетического антиоксидантов на интенсивность свободнорадикального окисления в тканях крыс разного возраста на моделях острого гипо- и гипероксического стресса / Ю.В. Нестеров, Н.В. Турченко, А.В.Трясучев // Свободные радикалы, антиоксиданты и старение. Издательский дом «Астраханский университет». - 2011.- С. 64-67.

14. Нестеров Ю.В. Тканеспецифические особенности свободнорадикального окисления белков и липидов в условиях экспериментальной гипоксии и введения природного и синтетического антиоксидантов /Ю.В. Нестеров, Н.В. Турченко // Свободные радикалы, антиоксиданты и старение. Издательский дом «Астраханский университет». - 2011г.- С. 112-114.

15.Нестеров Ю.В. Морфологическое описание и морфометрические показатели легочной ткани крыс разного постнатального возраста / Ю.В. Нестеров, Н.В. Турченко// Свободные радикалы, антиоксиданты и старение. Издательский дом «Астраханский университет». -2011- С. 49-51.

Список условных сокращений.

АЗО - индуцированное перекисное окисление липидов

АКМ - активные кислородные метаболиты

АОА - антиоксидантная активность

АФК - активные формы кислорода

ВЛТ - воздушность легочной ткани

ГПО - гипоксичесхое воздействие

ГРО - гипероксическое воздействие

ИС - индекс стабильности

КС - коэффициент стабильности

МДА - малоновый диальдегид

ОМБ - окислительная модификация белков

ПН - поверхностное натяжение

ПОБ - перекисное окисление белков

ПОЛ - перекисное окисление липидов

САК - сурфактантно-альвеолярные комплекс

СЛ - сурфактант легких

СОД - супер оксид дисмутаза

СиПОЛ - спонтанное перекисное окисление липидов

СР - свободные радикалы

СРО -свободнорадикальное окисление

ССЛ - сурфактантная система легких

ТБС - толщина бронхиальной стенки

ШМП - ширина межальвеолярных перегородок

ШСС - ширина сосудистой стенки

Заказ № 2653. Тираж 100 экз. Уч.-изд.-л. 1,3. Усл.-печ. л. 1,2.

Издательский дом «Астраханский университет» 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20 Тел. (8512) 48-53-47 (отдел маркетинга), 48-53-45 (магазин), 48-53-44, факс: (8512) 48-53-46. E-mail: asupress@yandex.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Турченко, Надежда Валерьевна, Астрахань

61 12-3/1181

МИНОБРНАУКИ РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования _«Астраханский государственный университет»_

Кафедра физиологии и морфологии человека и животных

На правах рукописи

Турченко Надежда Валерьевна

СТРУКТУРНЫЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ И СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ ПРИ ГИПОКСИЧЕСКОМ И ГИПЕРОКСИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИЯХ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология 03.03.01 - Физиология

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Нестеров Юрий Викторович

Астрахань, 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................4

ГЛАВА 1 . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................9

1.1. Современные представления о механизмах стресса и адаптации.

1.1.1 Физиологические механизмы стресс-реакции...........................9

1.1.2 Влияние окислительного стресса на функциональные системы организма..................................................................................13

1.2 Морфо-функциональная характеристика легочной ткани........26

1.2.1 Современные данные о морфологической организации и возрастных особенностях респираторных отделов легкого...........................26

1.2.2 Физиологическое значение сурфактантной системы легких....36

1.3 Значение перекисного окисления в легких в норме и при повреждающих воздйствиях............................................................42

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................49

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Морфологические особенности легких и стабильность сурфактанта в норме, при гипо- и гипероксическом воздействиях на разных этапах онтогенеза...................................................................................55

3.2 Влияние гипо- и гипероксического стресса на свободнорадикальные процессы в легких крыс разного постнатального возраста......................75

3.3 Особенности морфологических изменений ткани легкого при введении антиоксидантов.................................................................93

3.4 Влияние природного и синтетического антиоксидантов на свободнорадикальные процессы при окислительном стрессе в онтогенезе..................................................................................116

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................125

ВЫВОДЫ.........................................................................141

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................143

Список условных сокращений

АЗО - индуцированное перекисное окисление липидов

АКМ - активные кислородные метаболиты

АОА - антиоксидантная активность

АФК - активные формы кислорода

ВЛТ - воздушность легочной ткани

ГПО - гипоксическое воздействие

ГРО — гипероксическое воздействие

ИС - индекс стабильности

КС - коэффициент стабильности

МДА - малоновый диальдегид

ОМБ - окислительная модификация белков

ПН - поверхностное натяжение

ПОБ - перекисное окисление белков

ПОЛ - перекисное окисление липидов

САК - сурфактантно-альвеолярные комплекс

СЛ - сурфактант легких

СОД - супер оксид дисмутаза

СпПОЛ - спонтанное перекисное окисление липидов

СР - свободные радикалы

СРО - свободнорадикальное окисление

ССЛ - сурфактантная система легких

ТБС - толщина бронхиальной стенки

ШМП - ширина межальвеолярных перегородок

ШСС - ширина сосудистой стенки

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одной из центральных проблем современной

биологии и медицины является проблема адаптации и резистентности

организма к действию экстремальных факторов разного генеза и реализации

стресс-реакции на уровне отдельных органов и тканей (Фурдуй Ф. и соавт.,

1996; Тодоров И.Н., 2003; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006). По-прежнему

актуальным остается вопрос о стресс-реактивности дыхательной системы,

которая включает в себя комплекс образований, обеспечивающих

респираторную и целый ряд других функций, не имеющих прямого отношения

к дыханию. Легочную ткань из-за многочисленных альвеол, их сурфактантной

выстилки и капиллярно-альвеолярных контактов рассматривают как одну из

наиболее обширных биологических «мембран» в организме, внешняя

поверхность которой постоянно и непосредственно контактирует с

окружающей средой и подвергается прямому действию ее неблагоприятных

факторов, в том числе изменениям кислородного режима (Сыромятникова Н.В.

и соавт., 1987; Мотавкин П.А., Гельцер Б.И., 1998; Rooney S.R., 1994).

Несомненно, гипоксия, как и повышенное содержание кислорода, отражаются

на структуре аэрогематического барьера, функциональном состоянии

сурфактантной системы и гистоструктуре респираторных отделов легкого в

целом (Коваленко Т.Н., 1983; Арбузов A.A., 1983; Прокофьев В.Н. и соавт,

1995). Наряду с этим, гипоксия, являясь одним из ведущих звеньев развития

стресс-реакции любого генеза, и широко применяемая в современной медицине

гипербарическая оксигенация, могут приводить к серьезным изменениям

свободнорадикальных процессов и антиоксидантного статуса органов и тканей

(Дубинина Е.Е., 2006; Teply D.L., 2010). Высокий уровень метаболизма

липидов, состав липидов тканей легкого, связанный с образованием основного

элемента аэрогематического барьера - сурфактанта, определяющий режим

адаптации органа и устойчивости к действию повреждающих факторов, во

многом определяют актуальность исследований динамики процессов

перекисного окисления липидов и активности системы антиоксидантной

4

защиты легких (Федосеев Г.Б., Жихарев С.С., 1989; Коледова В.В., 2000; Нестеров Ю.В., 2003).

Изучение особенностей реакций организма на экстремальные воздействия невозможно без решения общих и частных вопросов в области онтогенетических механизмов развития и без учета возрастных различий. Степень влияния экстремального фактора на любую систему организма зависит не только от его природы и интенсивности воздействия, но и от морфофункционального состояния самой биологической системы в момент воздействия, которое, в свою очередь, определяется стадией онтогенеза (Тодоров И.Н., 2003; Гончарова Н.Д. и соавт., 2008). Общеизвестны возрастные изменения респираторной системы, неравномерность и гетерогенность ее развития (Лазько А.Е., 1997). В тоже время исследования возрастных особенностей структурно-функциональной организации легочной ткани при действии экстремальных факторов может иметь кроме теоретического, диагностическое и отчасти прогностическое значение для оценки биологической зрелости дыхательной системы и ее способности к адаптации. Актуальность этой проблемы возрастает в связи с недостаточной изученностью возрастных особенностей структуры легочной ткани, ее реакции в отношении свободнорадикальных процессов в условиях действия острых гипо- и гипероксии.

Цель исследования - изучить морфологические особенности легочной ткани крыс разного постнатального возраста и уровень свободнорадикальных процессов в норме, при гипо- и гипероксии и введении природного и синтетического антиоксидантов.

Задачи исследования:

1. Дать характеристику структурной организации легочной ткани у интактных неполовозрелых, взрослых и старых животных.

2. Провести сравнительное изучение морфологических показателей легких и стабильности альвеолярного сурфактантного комплекса на моделях

острой гипо- и гипероксии у животных разных возрастных групп.

5

3. Оценить степень зависимости структурных изменений ткани легкого от интенсивности свободнорадикальных процессов в норме и при экстремальных воздействиях.

4. На моделях острой гипоксии и гипероксии провести сравнительный анализ возрастных и стресс-индуцированных изменений свободнорадикального окисления липидов и перекисной деструкции белков в легких и, для сравнения, других тканях.

5. Изучить влияние природного (а-токоферол) и синтетического (эмоксипин) антиоксидантов на морфометрические показатели легких и уровень белковой и липидной пероксидации в них при окислительном стрессе на разных этапах постнатального онтогенеза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Степень структурных изменений в легких при гипо- и гипероксическом воздействии зависит от возраста животных. Острая гипоксия у крыс сопровождается морфологическими изменениями легочной ткани (повышение толщины бронхиальных стенок, ширины сосудистых стенок и межальвеолярного пространства) наиболее выраженными на поздних этапах онтогенеза. При гипербарической оксигенации изменения морфологических показателей ткани легкого наиболее выражены у неполовозрелых животных.

2. Окислительный стресс сопровождается разнонаправленными изменениями интенсивности свободнорадикального окисления белковых и липидных компонентов легочной ткани. Процессы окислительной модификации белков и липидной пероксидации не находятся в тесной зависимости друг от друга; уровень стресс-индуцированных изменений перекисного окисления липидов зависит от возраста экспериментальных животных.

3. Изменения морфологических показателей легких находятся в

зависимости, преимущественно положительной, от интенсивности

свободнорадикальных процессов; исследования демонстрируют формирование

достоверной корреляции между этими параметрами, главным образом у

6

неполовозрелых животных, вне зависимости от воздействия, и высокой корреляции между морфологическими показателями и свободнорадикальным окислением в легких старых крыс различную при гипо- и гипероксическом воздействиях.

4. Природный и синтетический антиоксиданты проявляют различные эффекты; различия в направленности и степени действия витамина Е и эмоксипина определяются возрастом и характером воздействия.

Научная новизна. Впервые проведен анализ структурных изменений и свободнорадикальных процессов в легочной ткани в возрастной динамике при действии гипо- и гипероксии в эксперименте. Впервые дано морфологическое описание ткани легкого по наиболее значимым показателям в ряду предпубертатные, половозрелые и старые животные и ее изменения при гипоксическом и гиперокисческом воздействиях. В работе исследованы и сопоставлены процессы белковой и липидной пероксидации в легочной и других тканях на разных этапах онтогенеза и выявлены возрастные особенности стрессорной динамики свободнорадикальных процессов. На моделях острой гипо- и гипероксии показано, что процессы перекисного окисления липидов и перекисной деструкции белков в легких изменяются не однонаправленно у крыс разных возрастных групп. Получены ранее неизвестные данные о тесной зависимости изменений структуры ткани легкого, от интенсивности свободнорадикальных процессов и достаточно высокой силе влияния возраста на фоновую и стресс-индуцированную активность процессов перекисного окисления белков и липидов.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования

демонстрируют наличие возрастных различий в особенностях структурных

изменений и свободнорадикальных процессов в легочной ткани при

воздействии гипо- и гипероксии и расширяют представления о механизмах

стресс-реакции на уровне отдельных органов. Возрастные различия в

морфологической картине легких и динамике накопления продуктов

свободнорадикального окисления служат основанием для анализа последствий

7

действия гипо- и гипероксии в эксперименте и клинической практике. Выявлены эффекты природного и синтетического антиоксидантов, которые открывают дальнейшие перспективы для обоснования и более широкого их применения в медицине и ветеринарии при профилактике и лечении стрессорных повреждений органов.

Материалы диссертационного исследования используются при изучении теоретических курсов и проведении лабораторных занятий по физиологии человека и животных, гистологии, биохимии в Астраханском государственном университете, Астраханской государственной медицинской академии, в исследованиях, проводимых в лаборатории экспериментальной физиологии Астраханского государственного университета.

Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на XXI Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), V Международной научно-практической конференции «Человек и животные» (Астрахань, 2010), I и II Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006, 2011). По материалам диссертационного исследования опубликовано 15 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из Введения, Обзора литературы, включающего три подглавы, главы Материал и методы исследования, четырех глав, посвященных результатам исследования и их обсуждению, Выводов, Заключения и Списка литературы. Текст иллюстрирован 14 таблицами и 40 рисунками. Библиографический список включает 282 источников, из которых 88 иностранных.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления о механизмах стресса и адаптации

1.1.1. Физиологические механизмы стресс-реакции

В последнее время система взглядов на стресс получила широкое распространение среди ученых и специалистов разных областей знаний. Интерес к этой проблеме вызван резкими изменениями экологических условий жизни человека и животных, вызванными интенсификацией производственных процессов, урбанизацией, а также ростом, так называемых болезней стресса. В современном мире стресс стал характерным состоянием не только для людей, но и для животных. Они испытывают его сразу при появлении на свет и продолжают испытывать до самой смерти. С развитием цивилизации последствия стрессовых воздействий на организм не только не уменьшаются, но расширяются и усугубляются. Сегодня в биологии, медицине, педагогике и животноводстве вряд ли есть другая проблема, привлекающая столь пристальное внимание, как проблема стресса (Судаков К.В., 1996; Фурдуй Ф.И., 1987).

Согласно последним данным стресс-синдром это совокупность защитных физиологических реакций в ответ на действие экстремальных факторов: экзогенных, эндогенных, социальных. Стресс - экстренная адаптационная программа, включающая в себя как неспецифические, так и специфические реакции, осуществляющаяся в результате взаимодействия стресс-реализующей и стресс-лимитирующей систем. Соотношение стресс-синдрома и адаптации следующее: стресс-синдром прекращается при достижении устойчивой долговременной адаптации, при которой снижается напряженность регуляторных систем (Зенков Н.К., 1993; Яковлева В.Н., 2005).

При длительном воздействии стрессора возникают адаптивные реакции организма, названные Селье общим адаптационным синдромом, включающим стадии тревоги, резистентности и истощения.

Трехфазная природа общего адаптационного синдрома дала первое указание на то, что способность организма к приспособлению, или, как ее называет Селье, адаптационная энергия, не беспредельна. Холод, мышечная нагрузка, кровотечения и другие стрессоры могут быть переносимы только в течение ограниченного срока. После первоначальной реакции тревоги организм адаптируется и оказывает сопротивление, причем продолжительность периода сопротивления зависит от врожденной приспособляемости организма и от силы стрессора. В конце концов, наступает истощение (Селье Г., 1979; Тигранян P.A., 1988; Тодоров И.Н., 2003).

Стадия тревоги (или аварийная) разделяется на две фазы: шока и противошока. Обычно развивается в первые 6 ч. от начала действия стрессора и длится 1-2 суток. Непродолжительная фаза шока следует сразу после действия раздражителя. Для нее характерны торможение ЦНС, снижение АД, мышечного тонуса, температуры тела, уровня глюкозы и лейкоцитов крови и др. Резистентность организма при этом снижена. Если сила раздражителя велика, то в этой фазе может наступить смерть (этому способствует недостаточность коры надпочечников). Если сила стрессора невелика, то фаза шока отсутствует и сразу наступает фаза противошока, во время которой повышается резистентность организма. Стадия тревоги соответствует срочной адаптации и развивается в результате нейрогуморальной мобилизации существующих резервов физиологических систем организма (Меерсон Ф.З. 1981, 1993; Ченеев С.Б.,1999).

Стадия резистентности характеризуется максимальной устойчивостью

организма к стрессору, которая может сохраняться длительное время. В

этой фазе срочная адаптация переходит в долговременную адаптацию,

формируется структурный след адаптации, уменьшается

напряженность регуляторных систем. Стадия истощения возникает при

действии сильных и длительных стрессоров. При этом снижается

резистентность организма (и уровень глюкокортикоидов в крови), возникают

болезни адаптации. (Смирнов В.Ф.,2002; Тодоров H.H., 2003).

ю

Многочисленные данные позволяют говорить о том, что стресс-реализующая система это регуляторный комплекс, активирующий и координирующий все изменения в организме, составляющие адаптивную реакцию на стрессоры, который состоит из цент�