Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индукция и подавление апоптоза тимоцитов крысы ультрафиолетовым облучением

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Индукция и подавление апоптоза тимоцитов крысы ультрафиолетовым облучением"

На правах рукописи

№

ДОЛГАЧЁВ Владислав Александрович

ИНДУКЦИЯ II ПОДАВЛЕНИЕ АПОПТОЗА ТИМОЦИТОВ КРЫСЫ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ.

Биофизика 03.00.02

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук.

I

г. Пущине 2000

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научный руководитель:

, Доктор физико - математических наук, профессор Печатников В.А.

Офицальные оппоненты:

Доктор биологических наук, Новосёлова Е.Г.

Доктор биологических наук, профессор Климов В.В.

Ведущая организация - Институт теоретической и экспериментальной биофизики (ИТЭБ) РАН, г. Пущнно.

Защита состоится на заседании

Диссертационного совета Д 200.23.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущнно, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г. Пущино.

Автореферат разослан »^»¿/^У^С/ЦЮООГ,

/

Ученый секретарь

Диссертационного совета, ( У ¡/^^¡^^ЛУ / кандидат биологических наук Т.И. Смешанна.

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. УФС облучение крови давно и успешно используется в медицине как антисептический и иммуностимулирующий агент [Карандашов, Петухов 1997]. Известно, что УФС может вызывать апоптоз в клетках млекопитающих [Rehemtulla et al, 1997]. В работе Винокурова [Винокуров и др.,1999] показано, что УФС приводит к запуску апоптоза нейтрофилов, достигающему максимума при дозе 300 Дж/м2. В процессе апоптоза происходит деградация ДНК, он заканчивается распадом клетки на фрагменты, сохраняющие целостность внешней мембраны. Апоптоз не сопровождается развитием воспаления и не вызывает поражения других клеток и тканей организма [Darzynkiewicz et al., 1997]. Апоптоз является обязательным компонентом жизни многоклеточных организмов (их развития, нормального функционирования, осуществления регулягорных процессов), одновременно внося вклад в реакцию клеток на внешние воздействия (например, ультрафиолетовое облучение) и осуществление иммунной защиты [Ярилин, 1996]. Нарушения процесса апоптоза (его усиление или ослабление) является основой ряда заболеваний, затрагивающих различные системы и вносит вклад в патогенез ещё большего числа болезней [Jacobson et al, 1994]. Проявления иммунопатологии при этих заболеваниях человека могут служить иллюстрацией важности апоптоза для нормального функционирования организма. Однако, несмотря на большой интерес многих исследователей к апоптозу клеток иммунной системы, вызванному УФС, мало известно о молекулярных механизмах его реализации.

Цель и основные задачи исследования. Целью работы является выяснение эффекторного пути реализации апоптоза тимоцитов крысы вызванным УФС облучением. Для достижения поставленной цели с помощью ингибиторного анализа были решены следующие задачи:

1) исследована способность мембранных и цитоплазматических

антиоксидантов предотвращать УФС- вызванный апоптоз тимоцитов крысы

2) исследована роль эксцизионной репарации ДНК и поли- (ЛДФ)- рибозо

полимеразы (ПАРП)

а) влияние афидиколина, ингибитора дельта- и эпсилон- ДНК полимераз

б) действие 3-аминобензамида, ингибитора ПАРП

в) действие ингибиторов синтеза белка и макромолекул

3) исследована роль внутриклеточных протеинкиназ

4) исследована роль фосфолипазы А2, липоксигеназы и циклооксигеназы

5) изучена роль калмодулина и внутриклеточного кальция

Научная новизна. Впервые показано, что различные дозы УФС облучения способны индуцировать или подавлять апоптоз нативных тимоцитов крыс in vitro. С помощью тиол- содержащего антиоксиданта показано, что окислительный стресс является ключевым компонентом эффекторного пути УФС-вызватюго апоптоза тимоцитов. Как индукция, так и подавление апоптоза клеток требуют участия протеинкиназы С и предотвращаются ингибиторами синтеза белков и макромолекул.. Процесс подавления апоптоза тимоцитов дозами УФС более 20 Дж/м2 требует активного статуса поли(АДФ-рибозы) полимеразы и отменяется специфическим ингибитором ПАРП 3-аминобензамидом. Представленные данные позволяют предложить возможный механизм запуска апоптоза тимоцитов крысы in vitro под действием ультрафиолета С. Предполагаемый механизм отличается от ранее известных путей развития апоптоза в тимоцитах крысы под действием гамма- радиации, антн CD-3 антител или гормонов.

Научно-практическая ценность. Разработана экспериментальная модель зависимости гибели тимоцитов крысы по пути апоптоза от дозы УФС облучения. Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, какие внутриклеточные

системы принимают участие в реализации апоптоза под действием УФС. При дальнейших исследованиях представляет несомненный интерес перспектива регулирования апоптоза клеток иммунной системы различными дозами УФС облучения.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, май 1997); на международных конференциях: «7th Congress of the European Socicty for Photobiology» (Stresa, Italy, 8-13 Septhember 1997), XIX International Congress of the International Society for Analytical Cytology (Colorado, USA, 28 February - 5 March 1998) на III Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, май 1998), на школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 28мая-2июня 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 4 статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на Страницах, включает /^рисунков и $ таблицы; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных экспериментальных данных и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы содержитувйссылок.

Список сокращений. УФС - ультрафиолетовое облучение, NAC- Ы-ацетил-Ь-цистеин, GSH-внутриклеточный глютатион, ПКС - протеин киназа С, ФЛА2 -фосфолипаза А2, ПАРП - поли(АДФ-рибоза) полимераза, ЭРО - эксцизионная репарация оснований, ЭРН - эксцизионная репарация нуклеотидов, 3-АМБ - 3-аминобензимид.

Материалы и методы.

Применялись: среда RPMI-1640, эмбриональная сыворотка теленка, Na2HP04, Na2-EDTA, дигигошш, афидиколин, 4-бромфеКАСилбромид, R24571 производства фирмы «Serva», Германия. Среда Хенкса, HEPES-буфер, антибиотики, циклог ексимид, актиномицин Д, 3-аминобензамид, бутилированный гидрокситолуен (ионол), N-ацетил-L-цистеин (NAC) нодигидрогуаретиковая кислота (NDGA) получены от фирмы «Sigraa», США. 1-(5-изокуинолинесульфо1шл)-2-метилпиперазин, дигидрохлорид (Н-7), тирфостин В46, 4',5,7-тригидроксиизофлавон (генистеин), Н-(2-[Метиламино]этил)-5-изокуинолинесульффонамид (Н-8), форсколин, ВАРТА/АМ, пропидиум иодид, Хекст-33258, производства фирмы «Calbiochem» США.

В работе использовали крыс-самцов Вистар весом 200 г. Тимоцигы выделяли и инкубировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% телячьей сыворотки, 10 мМ HEPES-буфера (pH 7.2) и стандартного набора антибиотиков. Для получения клеточной суспензии животных декапитировали, тимус измельчали и гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера и затем тимоциты фильтровали через капроновую сетку с размером ячеек 22x22 мкм. Перед УФС-облучением RPMI-1640 заменяли на среду Хенкса без фенолового красного. Ультрафиолетовое облучение суспензии клеток проводили при комнатной температуре на медицинском аппарате «Изольда» МД-73М. Прибор имеет 6 Вт бактерицидную лампу в качестве источника УФС света, основная мощность излучения которой приходится на длину волны 254 им. Дозу облучения клеток регулировали временем экспозиции и расстоянием до окна прибора. Дозиметрия УФС проводилась с помощью приборов ULX-3W и «Аргус-06». Затем тимоциты возвращали в среду RPMI-1640. содержащую или не содержащую (контроль) ингибиторы и инкубировали в атмосфере 5% С02 при 37 С в течение 30 часов. Время инкубации определяли в предварительных экспериментах по снятию кинетических кривых гибели. Выбирали то время, когда кинетические кривые гибели выходили на плато (30 ч). Процент погибших клеток измеряли методом проточной цитометрии. Долю тимоцитов, проницаемых для суправитального красителя

пропиднум иодида, регистрировали как описано ранее [Afanasyev et al.,1993] методом проточной цнтометрии. Апоптозные клетки идентифицировали как клетки с деградированной ДНК, расположенные в «субдиплоидном» пике проточно-цитометрической ДНК гистограммы после экстракции из них низкомолекулярных продуктов расщепления и специфичного флуоресцентного окрашивашгя по ДНК. Так как тимоциты крысы in vitro не образуют апоптозных телец [Afanasyev et al.,1993], то все объекты на ДНК-гистограммах левее пика 1С мы относили к апоптозшлм клеткам. Для их обнаружения к 1 мл клеточной суспензии в среде RPMI-1640 добавляли 0.3 мл смеси до конечной концентрации следующих реагентов: 40 мкг/мл дигитонина, 8 мМ Na2-EDTA (pH 7.2), 30 мМ Na2HP04, 1 мкг/мл ДНК-специфичного красителя Hoechst 33258. После 15-30 минутного окрашивания при 37°С, в ходе которого одновременно происходит вымывание деградированной ДНК, клетки анализировали на проточном цитометре, оснащенном ртутной дуговой лампой и лазером в качестве источников возбуждающего излучения. Накопление и обработка данных, а также представление результатов выполняли с использованием программного обеспечения, специально разработанного для проточно цитометрических задач. Для каждого образца параллельно определяли количество клеток с деградированной ДНК и количество клеток с проницаемой для суправитальных красителей плазматической мембраной. Тип клеточной гибели (некроз или апоптоз) определяли из сравнения кинетических кривых для клеток с деградированным хроматином и клеток с проницаемой мембраной. Апоптоз характеризуется поздним увеличением проницаемости внешней мембраны клеток по отношению к деградации ДНК, а некроз наоборот [Afanas'ev et al., 1986].

Для измерения изменений концентрации цитозольного кальция клетки нагружали флуоресцентным красителем FURA-2AM 40 мин при 37°С. Затем дважды этмывали от остатков зонда, не проникшего в клетки. За изменением флюоресценции ;ледили с помощью проточного цитометра и с помощью спектрофлуориметра СФР-1.

Результаты и их обсуждение.

-1а рис. 1 приведена кинетика гибели тимоцитов крысы под действием УФС. В каждой тробе параллельно измерялся процент клеток с деградированной ДНК (апоптозных имоцитов) и процент клеток, проницаемых для бромистого этидня. У контрольных ■леток (кривая 4) наблюдается непрерывное увеличение доли погибших клеток по )боим критериям. Несмотря на несколько различную динамику накопления .поптозных тимоцитов для доз 2 и 50 Дж/м2 видно, 41 о после 30-го часа обе кривые .ыходят на плато. Во всех трех случаях доля проницаемых клеток меньше доли клеток деградированной ДНК, что является характерной закономерностью апоптоза, когда порядоченная межнуклеосомная фрагментация хроматина предшествует нарушению арьерной функции плазматической мембраны [Afanas'ev et al.,1986]. Для дозы 200 (ж/м" (кривая 3), количество клеток с деградировашюй ДНК достигает стационарного ровня начиная с 6-го часа, а процент проницаемых клеток постоянно растет, причем с 4-го часа он превышает долю клеток с фрагментированным хроматином. Интересно тметить, что при дозе 2 Дж/м2 к 32 часу погибает больше клеток, чем при дозе УФС 00 Дж/м2, но меньше, чем при 50 Дж/м2. Таким образом, не наблюдается монотонной звисимости между дозой облучения и количеством погибших клеток. Наличие плато а всех кинетических кривых рис. 1 а после 30-го часа говорит о том, что к этому ремени все УФС-облученные клетки, способные реализовать апоптоз, погибают, аким образом можно корректно снять дозовую кривую, т.к. исключается влияние ззной скорости гибели при разных дозах воздействия на определение конечного числа огибших клеток.

100

»—■ ) 80

*—* 2

♦—» 3 60

т а 4

40

20

0

20 30 40 90 Л Ч

Рис.1. Процент клеток с деградированной ДНК (а) н проницаемых для бромистого этидия (б) в зависимости от времени после УФС облучения. Тимоциты, облученные УФС в дозе: 2 Дж/м! (1), 50 Дж/м! (2), 200 Дж/м1 (3); 4 - тимоциты без дополнительных воздействий.

б

Доза УФС, Дж/м'

На рис. 2 представлены графики зависимости

гибели тимоцитов от дозы УФС-облучения. Количество клеток с деградированной ДНК остается на уровне контроля (необлученные тимоциты) до дозы 1 Дж/м2, далее возрастает и достигает максимума в районе 20 Дж/м2 , а затем убывает вплоть до уровня контроля.

Рис 2. Дозовая зависимость гибели тимоцитов через 30 ч после УФС-облучения. По оси абсцисс-доза облучения, Дж/м2. По оси ординат- доля клеток, %: 1-е деградированной ДНК, 2 - проницаемых для бромистого этидия.

Анализ проницаемости тимоцитов для бромистого этидия показывает, что доля проницаемых для него клеток ниже, чем доля клеток, с деградированной ДНК вплоть до 100 Дж/м". В этом диапазоне процетное содержание проницаемых для бромистого этидия клеток колеблется таким же образом, как и доля клеток, с деградированной ДНК. Для более высоких доз к 30-му часу проницаемых клеток больше, чем аноптозных (см. рис.1).

I. Исследование способности мембранных и цитоплазматических антиоксидантов предотвращать УФС- вызванный апонтоз тимоцитов крысы.

Известно, что УФС облучение нативных клеток приводит к окислительному стресс) [Зенков. 1999]. УФС, цитокины, стероидные гормоны и другие соединения, индуцнрмощие апоптоз, стимулируют продукцию клетками активных форм кислорода или снижают содержание клеточных антиоксидантов. что приводит к повреждению

ДНК, нарушению функций митохондрий и изменению липидного состава мембран в результате активации радикальных окислительных процессов [Зенков, 1999].

Для того, чтобы выяснить каким образом УФС вызывает окислительный стресс в тимоцитах крыс, были использованы два различных антиоксиданта. Первый, N-ацетил-Ь-цистеин (NAC), широко применяется в медишше, обладает антимутагенными и анти-канцирогенными качествами, которые могут быть обусловлены множественными защитным механизмам, таким как антиоксидантная активность, способность выступать в роли предшественника внутриклеточного глютатиона, способность модулировать детоксикацию и процесс репарации ДНК [van Zandwijk, 1995]. Второй, ионол, (бутилированный гидрокситолуен), - фенол содержащий липофильный перехватчик свободных радикалов кислорода, способен предотвращать перекисное окисление липидов [Shertger, 1991].

Действие NAC было исследовано в широком диапапазоне концентраций, от 2мкМ до 2мМ. NAC не вызывал роста неспецифической проницаемости плазматической мембраны тимоцитов во всем исследованном диапазоне концентраций, что контролировалось по прокрашиванию клеток суправитальным красителем пропидиум йодидом.

Наиболее эффективной оказалась концентрация 2 мМ. Как видно из рис.3, присутствие 1 мМ NAC в среде инкубации клеток снижало количество

апоптозных тимоцитов, облученных УФС, хотя менее выраженная

зависимость гибели клеток от дозы УФС сохранялась. NAC в концентрации 2 мМ практически полностью предотвращал гибель

6 10 30 J0 40 60 120 240 г *

клеток, вызванную УФС.

Доза УФ, Дж/м2 —•— контроль -»- NAC2MM NAC 1 мМ

Рис. 3 Дозоваи зависимость гибели тимоцитов крысы после УФС облучения в присутствии 1 иМ н 2 мМ N-ацетил-Ь-иистснна.

Важно, что количество погибших необлученных клеток в контроле (точка 0 Дж/м2) и в присутствии NAC практически одинаково. Видно, что NAC в концентрации 2 мМ даже незначительно снижал гибель необлученных клеток.

Полученные данные свидетельствуют, что окислительный стресс играет ключевую роль в реализации апоптоза тимоцитами крыс при УФС облучении. Результаты по действию ультрафиолета хорошо согласуются с данными других авторов, которые использовали иные индукторы апоптоза тимоцитов, полагая, что окисление GSH в результате продукции в клетках активных форм кислорода является ранним событием в апоптозе [Macho, 1996]. Известно, что обработка тимоцитов глгококортикоидами приводит к продукции активных форм кислорода и истощению восстановленного глютатиона [Fernandez, 1995]. Fernandez и соавторы показали, что NAC предотвращает развитие апоптоза тимоцитов, вызванное глюкокортикоидными гормонами. Было сделано предположение, что окислительный стресс является

ключевым компонентом зффекториого пути апоптоза в тнмоцитах крыс, вызванным обработкой глюкокортикоидами. Опираясь на данные Fernandez и соавторов, можно предположить, что в случае УФС облучения NAC ингибирует апошоз тимоцитов за счет предотвращения истощения внутриклеточного глютатиона и/или поддержания его на необходимом физиологическом уровне.

Другой использованный нами антиокеидант, - ионол, в диапазоне концентраций от 5 до 30 мкМ не оказал сколько-нибудь заметного влияния на зависимость гибели клеток от дозы УФС облучения (данные не приводятся). В указанных концентрациях ионол не вызывал нсспецифической проницаемости цитоплазматической мембраны клеток. Эти данные не согласуются с данными Салго и соавт., согласно которым ионол способен защищать тимоциты крысы от окислительного стресса и апонтоза, вызванных сильным окислителем пероксинитритом (индуктор однонитевых разрывов ДНК) [Salgo, 1996]. Возможно, наблюдаемая нами неспособность ионола предотвращать апоптоз, вызываемый УФС связана с природой агента, вызывающего внутриклеточный окислительный стресс. Вероятно, перекисное окисление липидов при УФС облучении тимоцитов in vitro не играет существенной роли в запуске и реализации апоптоза.

2. Исследование роли поли(АДФ-рибозо) полимеразы (ПАРП) и эксцизионной репарации ДНК.

В литературе известно, что индукция различных клеток к апоптозу сопровождается протеолитическим расщеплением ПКС и ПАРП. Брас и соавторы [Bras et al., 1997]; на А20 линии клеток исследовали механизмы, которые модулируют Fas-оиосредованный путь апоптоза через В клеточный рецептор клетки. Было выявлено, что Fas- сигнализация активизирует цистеиновые протеазы, что ведет к специфическому расщеплению ПАРП и ПКС дельта. Другими авторами показано, что вызванное церамидом (липидным медиатором TNF-индуцированного апоптоза) мсжнуклеосомное расщепление ДНК совпадает во времени с 'протеолитическим расщеплением ПАРП и ПКС дельта [Kojima, Datta, 1996] Известно, что 1-бета-арабиносульфанозалцитозин (ara-С) вызванный апоптоз человеческюс миелоидных клеток лейкемии (U-937) также связан с протеолитическим расщеплением ПАРП и ПКС дельта [Datta et al, 1996]. Расщепление ПАРП в последнем случае очевидно было опосредовано протеазой СРР32, которая, как известно, расщепляет ПАРП в различных клетках, и её расщеплешге начинается вскоре после индукции клеток к апоптозу [Куцый, 1999].

В связи с вышеизложенным мы также решили исследовать возможность участия ПАРП в УФС-вызванном апоитозе тимоцитов крысы. Большинство исследователей связывают физиологическую функцию ПАРП с восстановлением повреждений ДНК, однако её точная роль в защите клеток от повреждений ДНК всё ещё не определена точно.

Известно, что одной из мишеней УФС в клетке является ДНК. Возникшие в геноме повреждения индуцируют ответ со стороны клетки, который включает в себя трн типа реакции: задержку прохождения по циклу, репарацию ДНК и гибель клетки по механизму апоптоза. Считается, чго эксцизионная репарация является основным механизмом ликвидации вызванных УФС повреждений ДНК. Различают два основных пути эксцизионной репарации: ЭРО, которая устраняет одиночные поврежденные основания, и ЭРН, осуществляющую «расчистку» повреждения внутри олигомера длиной 25-32 нуклеотидов. Их механизм в общих чертах известен [Wood. 1996]. Считается, что УФС-облучение клеток млекопитающих приводит к образованию фоюпродуктов (в основном, циклобутановых гшримидиновых димеров и 6-4 фотопродуктов), которые затем удаляются из ДНК главным образом с помощью эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН) [Wood, 1996, Molinete с! al.,1993]. ЭРН в

клетках млекопитающих чувствительна к афидиколину, специфическому ингибитору дельта- и эпсилон-полимераз [Wood, 1996; Михайлов, 1998; Burgers, 1998; Satoh, 1993].

ЭРО сопровождается образованием открытых одиночных разрывов ДНК. Фермент ПАРП имеет высокое сродство к разрывам цепей ДНК и активируется при связывании с ними [de Murcia et al., 1995]. Если фермент не освобождается с ДНК, то ЭРО ингибирустся [Molinete et al., 1993]. Подавить диссоциацию ПАРП с ДНК (а, следовательно, и ЭРО) можно с помощью специфичного ингибитора каталитического центра ПАРП 3-аминобензамида (3-АМБ) [Lindahl et al., 1995].

Мы исследовали влияние ингибитора дельта- и эпсилон-полимераз афидиколина и ингибитора ПАРП 3-АМБ на индукцию и подавление апоптоза тимоцитов крысы под действием коротковолнового ультрафиолета. Были также использованы ингибиторы синтеза белка и РНК циклогекснмид и актиномицин Д, соответственно, с целью выяснить, нуждаются ли вышеназванные процессы в синтезе белков de novo.

Влияние афидиколина, ингибитора дельта- и эпсилон- ДНК потшераз.

О 10 20 30 40 60 120 Дои УФ, ДжЛГ кшпроть

;н|)н.'1 ико tun ]ü мк[/м:1 :ii¡ni.inKO ivni 2.5 Mi v./m í

Ml 540

Нами показано, что дозы УФС от 1 до 10 Дж/м" вызывают апоптоз

тимоцитов, достигая

максимума при 10 Дж/м". Как уже отмечалось ранее, основные повреждения, вызываемые УФС,

репарируются по пути ЭРН, который

чувствителен к

афидиколину.

Рис. 4 Дозовая зависимость гибели тимоцитов крысы после УФС облучения в присутствии афидиколина.

В концентрации 1 мкг/мл присутствие афидиколина в среде культивирования облученных клеток не приводило к достоверным различиям по отношению к контролю (данные не приводятся). В концентрации 2.5 мкг/мл (Рис.1) наблюдалось незначительное (10%) увеличение количества погибших клеток при дозах УФС до 10 Дж/м". Добавка афидиколина в среду культивирования облученных клеток в концентрации 10 мкг/мл (Рис.4) приводила к значительному увеличению количества клеток с деградированной ДНК при дозах УФС до 10 Дж/м". В концентрации 10 мкг/мл афиднколин вызывал дополнительную гибель необлученных клеток (точка 0 Дж/м"). Эффект угнетения апоптоза тимоцитов более высокими дозами (10 -500 Дж/м") УФС в присутствии афидиколина сохранялся. То есть ингибирование ЭРН с помощью афидиколина не отменяло действия доз УФС от 10 до 500 Дж/м". угнетающих апоптоз тимоцитов. Вероятно, при указанных дозах УФС-облучения клетки наряду с

ЭКСЦИЗИ01Ш0Й репарацией нуклеотвдов задействуют и другой путь репарации полученных повреждений ДНК, например эксцизионную репарацию оснований (ЭРО).

Действие 3-аминобеизамида (ингибитора ПАРП).

Считается, что 3-АМБ является ингибитором ЭРО и имеется небольшая доля повреждешш, вызываемых УФС- облучением - пиримидиновые гидраты, которые репарируются ЭРО [Satoh et al.,1993; Hjertvik et al., 1998]. 3-аминобезамид является

конкурентным ингибитором поли(АДФ-рибозо) полимеразы. ПАРП

активируется в ответ не только на агенты, непосредственно индуцирующие разрывы, ионизирующее излучение [Lindahl et al.,1995], активные кислородные радикалы и NO [Heller et al.,1995], ингибиторы топоизомераз [Negri et al.,1993; Barnardi et al.,1995], 110 и при действии

Рис. 5 Дозовая зависимость гибели тимоцитов крысы после УФС облучения в присутствии З-аминобензамида.

коротковолнового ультрафиолетового облучения [Cleaver et al.,1991] и алкилирующих соединений [Satoh et al.,1993], для которых характерно образование временного разрыва в результате репаративного вырезания первичного повреждения.

Возникновение однонитевых разрывов ДНК в ходе репарации оснований активирует ПАРП, которая временно скрепляет свободные концы цепи в промежутке между действием АП- эндонуклеаз и бета- ДНК полимеразы [Lindahl et al.,1995]. Ингибирование аутомодификации 3-амшюбензамидом приводит к невозможности диссоциации ПАРП с ДНК и появлению таким образом долгоживущих однонитевых разрывов. Возможно, что появление таких долгоживущих разрывов является сигналом к запуску апоптоза в тимоцитах. Мы наблюдали, что присутствие 3- АМБ (Рис.4) в среде культивирования тимоцитов не влияло на запуск апоптоза под действием низких доз УФС(часть кривой от 0.6 до 10 Дж/м"), но отменяло ингибирующее апоптоз действие ультрафиолета (дозы более 20 Дж/м2). Видно, что при дозах более 10 Дж/м: почти все клетки реализовывали апоптоз, в то время как гибель контрольных клеток убывала с ростом дозы УФС. Эти данные позволяют предположить, что процесс подавления апоптоза тимоцитов крысы ультрафиолетом С в дозах более 10 Дж/м" требует активного статуса ПАРП. Вероятно, в этом диапазоне доз ПАРП активируется и её активность сопряжена с механизмом ЭРО. Такой высокий порог активации ПАРП может быть связан с тем. что имеется лишь небольшая доля повреждений, вызываемых УФС-облучением, которые репарируются ЭРО.

На основании вышеизло-женного можно предположить, что наблюдавшаяся в наших экспериментах способность 3-АМБ отменять ингибирующее апоптоз тимоцитов действие доз УФС более 20 Дж/м" связана с тем. что ЭРО является жизненно

Доза УФ, Дж/м2 контроль

З-амкнобензамнд 1 мМ

необходимой для клеток, что хорошо согласуется с представлениями других исследователей [Wood, 1996].

Как уже отмечалось, ПАРП является конститутивным ферментом, представленным в ядре в большом количестве копий [Lindahl et al.,1995]. То есть для активации ПАРП по-видимому не требуется индукция соответствующих генов и синтез белка de novo. Мы проверили, подавляют ли ингибиторы синтеза РНК (актиномнцин Д) и белка (циклогексимид) эффект снижения количества апоптозных клеток в ответ на увеличение дозы УФС.

Действие ингибиторов синтеза белка и макромолекул.

При изучении значения сщггеза макромолекул для УФС-индуцированного апоптоза тимоцнты облучали УФС и переводили в среду RPMI, содержащую либо ингибитор синтеза белка - циклогексимид, либо ингибитор синтеза мРНК - актиномицин Д. Ингибиторы присутствовали в культуральной среде в ходе всего эксперимента (30 ч.). На рис. 6. видно, что сами ингибиторы вызывали дополнительную гибель необлученных клеток (точка 0 Дж/м2), что хорошо согласуется с литературными данными [Martin et al., 1990]. Видно, что в присутствии ингибиторов количество апоптозпьгх клеток оставалось на уровне гибели необлученных тимоцитов до дозы 20 Дж/м". Таким образом, и актиномищш Д и циклогексимид предо-твращали индукцшо апоптоза тимоцитов, поскольку подавлялась транскрипция и трансляция соответствующих генов [Тронов, 1999]. Тем не менее шпибирование апоптоза большими дозами УФС сохранялось, подтверждая предположение, что оно осуществляется предсуще-ствующими факторами. Следует отметить, что УФС подавлял также апоптоз, вызванный действием самих ингибиторов.

Таким образом, и актиномицин Д и циклогекагмид предотвращали гащукцию апоптоза тимоцитов, поскольку подавляли транскрипцию и трансляцию соответствующих генов [Тронов, 1999]. Тем не менее ингибирование апоптоза большими дозами УФС сохранялось, подтверждая предположение, что оно осуществляется пред-существующими факторами, в число которых по нашему предположению может входить ПАРП.

Рис. 6 Дозовая зависимость гибели тимоцитов крысы после УФС облучения в присутствии цпклогскснмпда и актииомнцина Д.

Было сделано предположение, что эффект ингибитора трансляции на апоптоз тимоцитов является неспецифэтеским и вызывает задержку в развитии апоптоза, а не предотвращение его [Chow et а1.,1995]. Мы сняли кинетические кривые гибели обличенных УФС тимоцитов крысы в прис}тствии циклогексимида, однако не

Доза УФ, Дж/м! контроль

циклогексимид 0.2 мкМ актиномицин Д 2мкМ

наблюдали задержки в развитии апоптоза тимоцитов, которая могла бы быть обусловлена ингибитором (данные не приводятся).

Таким образом, в случае УФС- вызванного апоптоза присутствие циклогексимида, вероятно, предотвращает, а не задерживает развитие апоптоза. Интересно, что ни циклогексимид ни актиномицин Д не оказывали влияния на механизм ингибирования апоптоза тимоцитов высокими дозами УФС. Следует отметить, что УФС подавлял также аиоптоз, вызванный действием самих ингибиторов.

2. Исследование роли внутриклеточных npomewiKUiiai.

В 1992г. Девари с сотр. [Devary Y et al, 1992] показал, что в клетках HcLa S3 одним из первых регистрируемых событий после УФС-облучепия (254 нм, 40 Дж/м") является активация Src тирозиновых киназ, которая приводила в конечном счете к активации транскрипционного фактора АР-1 и окислительному стрессу. Ингибиторы тирозиновых протеин киназ (генистеин и тирфостин) блокировали этот УФС-ответ HeLa клеток. Поэтому нам представлялось целесообразным выяснить, не является ли активация тирозиновых гашаз необходимой стадией в УФС-ответе тимоцитов. Для этого клетки предвар1гтелыю инкубировали с генистеипом (74 мкМ) или тирфостином В46 (5, 10, 20 и 35 мкМ), затем облучали в разных дозах и исследовали клеточпмо гибель. Как показали эксперименты, ингибиторы тирозиновых киназ не оказывали существенного влияния ни на индукцию, ни па подавление апоптоза в тимоцигах ультрафиолетовым облучением (данные не приводятся). Отсюда можно предположить, что в тимоцитах крыс активация тирозиновых прогеинкимаз вероятно не является инициирующим событием в УФС -ответе.

Важно отметить, что генистеин также является ингибитором сАМФ-зависимой протеин киназы А (ПКА) и Са2+/фосфолипид зависимой изоформы протеин киназы С [Akiyama Т. et.al., 1987]. Чтобы проверить возможное участие сАМФ - зависимой протеин киназы А в УФС-ответе тимоцитов мы использовали активатор 1IKA форсколин [Halvorson M.J., Coligan J.E.,1995], ингибитор зависящих от циклических нуклеогидов киназ 118 [Hagiwara М. et al 1987] и неспецифический ингибитор IIKA генистеин (см. выше). Однако в присутствии перечисленных соединений количество погибающих к 30-му часу культивирования клеток не отличалось от контрольных образцов (данные не приводятся). Таким образом, полученные экспериментальные данные противоречат участию ПКА в УФС- ответе тимоцитов крысы.

Известно, что протеин киназа С (ПКС) является важным элементом сигнальных путей, задействованных при апоптозе [Harkin et al., 1998]. Ингибитор ПКС Н-7 [Slukvin, Jerrells ,1995; Донская и др., 1997] способен ипгибировать апоптоз тимоцитов, вызванный различными апоптогенными воздействиями [Sakurai et al, 1997; Shao et al. 1995]. Sakurai с соавторами показали, что Н-7 способен также вызывать апоптоз тимоцитов мыши в дозозависимой манере. Было сделано предположение, что с индукцией и реализацией апоптоза тимоцитов связана активность определенной изоформы ПКС [Sakurai et al, 1997]. Мы исследовали влияние Н-7 в диапазоне концентраций 10-50 мкМ на апоптоз тимоцитов крысы, вызванный УФС. Оптимальной оказалась концентрация 50 мкМ (рис.7). Видно что. инкубация необлученных тимоцитов (0 Дж/м2) с высокой концентрацией Н-7 приводит к дополнительной гибели части клеток (~20%), что хорошо согласуется с литературными данными [Sakurai et al. 1997]. Поэтому кривая дозовой зависимости в присутствии Н-7 приподнята над контрольным уровнем числа погибших к 30-му часу культивирования клеток. Ингибитор Н-7 должен постоянно находиться в среде инкубации, т.к. отмывка от него в первые часы после облучения отменяет его ингибирующее действие (данные не приводятся). Предварительная инкубация клеток с Н-7 также не требуется - ингибитор можно добавлять в инкубационную среду через 20-30 мин. после облучения.

Т-Г~

10 20 30 40 60 120 260

Доза уф, Дж/м

Контроль PMA 10 шкМ Н-7 50 mkM

Это указывает на относительно позднюю активацию протеинкиназы С в ответ на УФС-облучение. Следует

обратить внимание на то, что Н-7 ингибирует как индукцию, так и подавление апоптоза. т.е. клетки ведут себя так как будто "не знают", что облучены (рис. 7). Это свидетельствует о том, что протеинкиназа С стоит в самом начале цени регуляции запуска УФС-ответа тимоцитов.

Рис.7 Дозовап зависимость гибели тимоцитов крыс в контроле, в присутствии 10 нМ РИА -активатора ПКС, и 50 чкМ 11-7 -ингибитора ПКС.

Предварительная активация Са2+- и фосфолипид-зависимой формы протеинкиназы С с помощью форбол миристат ацетата (PMA) [Michie et.al., 1998] за 15 мин., 9 ч. и 14 ч. перед облучением вызывала лишь 10-20% дополнительное увеличение гибели клеток, но не меняла характер ответа (рис. 7).

Исследование роли фосфолипазы А2, циклооксигеиазы и липоксигеназы.

Активация протеинкиназы С может происходить через активацию фосфолипазы А2 и образование лизоформ липидов, арахидоновой кислоты и ее метаболитов, которые прямо влияют на протеинкиназу С [Asaoka Y et al, 1992; Hug II and Sarre F,]. В свою очередь, способность УФС активировать фосфолнпазу А; в некоторых типах клеток хорошо известна [DeLeo, 1985]. В связи с этим мы решили проверить участие ключевых ферментов метаболизма арахидоновой кислоты в исследуемом процессе. В качестве ингибитора фосфолипазы А: был выбран 4-бромфепацил бромид (ВРВ). Оказалось, что концентрации ВРВ от 3.3 мкМ и выше вызывают быстрый рост неспецифической прошщаемости плазматической мембраны при отсутствии упорядоченной деградации ДНК (данные не приводятся). То есть типичный некроз клеток. В то же время в диапазоне доз 0.1-2.0 мкМ ВРВ оказался нетоксичным, однако не оказывал влияния на УФС-ответ тимоцитов (данные не приводятся).

Добавление экзогенной арахидоновой кислоты в концентрации 4-10 мкМ также не меняло ответа тимоцитов (графики не приводятся). Свободная арахпдоновая кислота, образующаяся при действии фосфолипазы А;, далее может окисляться с участием ферментов циклооксигеиазы, липоксигеназы. Чтобы блокировать образование метаболитов арахидоновой кислоты мы использовали индометацнн, как ингибитор циклооксигеиазы. и нордигндрогуаретиковую кислоту (NDGA), как ишнбитор липоксигеназ. Индометацин применяли в дозах 1-30 мкМ, a NDGA в дозах 5-20 мкМ. Индометацин не оказывал никакого действия на поведение клеток после облучения. NDGA в концентрации 20 мкМ повышал (~10°о) гибель клеток в контроле и на столько же снижал ингибирующий эффект высоких доз УФС. Меньшие

концентрации таким действием не обладали. Как показал анализ кривых проницаемости плазматической мембраны для суправиталыгаго красителя пропидиум иодида (не приводятся) такой эффект ИБСА можно объяснить его токсичностью. Полученные результаты позволяют предположить, что ключевые ферменты метаболизма арахидоповой кислоты не участвуют в УФС-ответе тимоцитов.

Изучение роли внутриклеточного Са2*.

Кальций, как важнейший регуляторный ион, участвует в инициации и реализации апоптоза, вызванного глюкокортикоидами, аоти-СОЗ антителами и некоторыми другими агентами [МсСопкеу Б.!, Оггешив Б, 1997]. Вход Са:* сам по себе способен вызвать апоптоз, а изменение его внутриклеточной концентрации сопровождает некоторые стадгш апоптоза, такие как активация протеннкиназ, фосфолипаз, эвдонуклеаз, протеаз и других биохимических процессов. Естественно, что вопрос об участии ионов кальция являлся одним из главных в раскрытии механизма УФС-ответа тимоцитов. Мы провели исследования по блокированию передачи кальциевого сигнала внутри клетки. Тимоциты предварительно нагружали 20 мкМ препарата ВАРТА/АМ, который, проникая в клетку и подвергаясь действию эстераз, превращается в активный кальциевый хелатор. Далее клетки облучали и сравнивали уровень апоптоза с контрольным образцом. ВАРТА не изменял ответ тимоцитов (графики не приводятся). Поскольку во многих случаях кальций в клетке функционирует в комплексе с калмодулшюм, мы использовали калмодулиновый ингибитор 1124571, чтобы блокировать калмодулин-зависимый сигнал. Были протестированы четыре концентрации К24571 - 0.145, 0.435, 1.45, и 2.90 мкМ. Концентрации 1.45 мкМ и выше вызывали быстрый некроз тимоцитов, а более низкие концентрации оказались не эффективными - зависимости не отличались от контрольных (графики не приводятся). Таким образом, ответ тимоцитов на УФС отличается от глюкокортикоид-стимулированного апоптоза, когда внутриклеточное хелатирование кальция и блокирование калмодулина предотвращало деградацию ДНК и гибель клеток [МсСопкеу е1 а1, 1989]. Непосредственные измерения изменений концентрации внутриклеточного кальция ([Са2+ ],) осуществляли с помощью проточного флуориметра ЛАКС-1 на одиночной клетке и с помощью спектрофлуориметра на суспензии клеток. Клетки окрашивали риКА-2 АМ в течение 30 мин ири 37° С. В процессе измерений образцы были термостатироваины при 37° С Измерения [Са2* ], проводили непосредственно перед облучением свежевыделенных клеток, сразу после облучения ультрафиолетом Сив течение первых 6 часов культивирования. Изменений [Са2+ ]„ вызванных УФС, зафиксировано не было (графики не приводятся). Таким образом можно предположить, что, по крайней мере на начальных этапах индукции апоптоза ультрафиолетом, Са2+ не требуется. На рис. 8 обобщены полученные в работе результаты в виде схемы. Из наших экспериментальных данных с применением антиоксидантов следует, что УФС облучение тимоцитов приводит к окислительному стрессу (рис. 8). На роль эффекторного фермента, активирующегося при окислительном стрессе и способного запустить каскад каспаз мы предположили протеин киназу С (ПКС) (рис. 8). Далее происходит активация ряда каспаз, осуществляющих рас-щепление соответствующих субстратов. Согласно приведенным выше экспериментальным данным мы раздели пути, ведущие к индукции апоптоза (с привлечением механизма эксцизиошюй репарации нуклеотидов - ЭРН) и подавлению апоптоза (с привлечением механизма эксцизионной репарации оснований - ЭРО и связанного по-видимому с активностью поли (АДФ-рибозо)полимеразы - ПАРП) в зависимости от дозы УФС - облучения. Согласно Тронову [Тронов, 1999], конкуренция процессов апоптоза и репарации является особенностью предапоптической фазы клетки и преобладание того ми иного процесса определяет дальнейшую судьбу клетки (рис. 8).

УФС

Цнтоплаэматическая мембрана

НАЦ

окислительный стресс

,пкс

j©

более 10 Дж/м2

(J) 3-аминобензамнд

Рис. 8 Предполагаемая схема путей индукцин и подавления апоптоза тнмоцитов крысы УФС-облученнем.

Таблица1.

Действие соединений на УФС-вызванную индукцию и подавление апоптоза тнмоцнтов крысы._

Агент Ингибирование/предотвращение УФС-вызванной

индукции апоптоза тнмоцитов подавления апоптоза тнмоцитов

Ы-ацетил-Ь-цистеин + +

Ионол - -

Афидиколин + -

3-амннобензамид - +

Циклогексимид + +

Актиномицин Д + +

H 7 + +

H 8 - -

PMA -/+ -

Генистеин - -

Тнрфостин В46 - -

Вромфенацилбромид - -

Индометацин - -

Нордигидрогуаретикова я кислота - -

Арахидоновая кислота - -

ВАРТА-АМ - -

R24571 - -

Выводы.

Исследовано действие различных ингибиторов на процессы индукции и подавления апоптоза тимоцитов разными дозами УФС:

1. Антиоксидант N-aueriui-L-miCTCHH, синтетический предшественник внутриклеточного глутатитона, предотвращал развитие УФС стимулированного апоптоза тимоцитов крысы за счет поддержания необходимого уровня глютатиона в клетках.

2. Ингибитор перекисного окисления липидов содержащий фенолы антиоксидант ионол не влиял на активацию апоптоза, вызванного УФС, что может свидетельствовать о несущественном влиянии перекисного окисления липидов in vitro в запуске и реализации апоптоза.

3. 3- аминобензамид, ингибитор поли(АДФ-рибозо) полимеразы (ПАРГ1) и эксцизионной репарации оснований (ЭРО), снимал эффект ингибирования УФС в шггервале более 10 Дж/м2, увеличивая количество погибших к 30-му часу культивирования клеток до максимума. Таким образом, процесс подавления апоптоза тимоцитов УФС-облучением связан с активацией ПАРП и эксцизионной репарации оснований.

4. Афидиколин, ингибитор полимераз дельта и эпсилон и эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН) не оказывал влияния на гибель клеток при дозах УФС облучения более 10 Дж/м2, однако вызывал практически полную гибель необлученных клеток и клеток, облучешшх дозами УФС до 10 Дж/м2. Таким образом, процесс индукции апоптоза тимоцитов УФС-облучением связан с ингибированием полимераз дельта и эпсилон и эксцизионной репарации нуклеотидов.

5. Ингибиторы синтеза белка и РНК предотвращали индукцию апоптоза, вызванного малыми и средними дозами УФС, но не отменяли ингибирующее апоптоз действие высоких доз УФС. Таким образом, процесс индукции апоптоза тимоцитов требует синтеза белка de novo.

6. Ингибитор иротеинкиназы С (ПКС) Н-7 предотвращал индукцию и подавление апоптоза тимоцитов крысы УФС. Таким образом, ПКС-зависимое фосфорилирование является необходимым условием индукции и подавления УФС-вызванного апоптоза тимоцитов крысы. Ингибиторы тирозиновых киназ генистеин и тирфостин В46 не влияли на зависимость апоптоза тимоцитов от дозы УФС. Таким образом, тирозиновые киназы не вовлечены в процессы индукции и подавления апоптоза тимоцитов, вызванным УФС.

7. Не было зафиксировано изменений [Ca2* ]„ вызванных УФС. Можно предположить, что, по крайней мере на начальных этапах индукции апоптоза ультрафиолетом, Са2+ не требуется.

Список публикаций.

1. Долгачев В.А., Афанасьев В.Н., Долгачева H.H., Печатников В.А. Активация поли(АДФ-рибозы) полимеразы ингибирует апоптоз тимоцитов, вызванный облучением коротковолновым ультрафиолетом (УФС). Биофизика, 2000, №5

2. Долгачев В.А., Афанасьев В.Н., Долгачева H.H., Печатников В.А. Н-ацетил-Л-цистеин предотвращает апоптоз тимоцитов, вызванный облучением ультрафиолетом С (УФС). Иммунология, 2000, №4, стр. 20-21.

3. Зинченко В.П., Мысякин Е.Б., Долгачев В.А., Дедкова E.H., Сафронова В.Г., Танеев А.Б., Шебзухов Ю.В., Вайсбуд М.Ю. Действие структурных аналогов фактора активации тромбоцитов на передачу внутриклеточных сигналов в перитонеальных нейтрофилах мыши и макрофагах линии Р388Д1. Биофизика. (Biofizica), 1997, том 42, вып. 5, стр. 1097-1105.

4. Долгачев В.А., Николаева H.H., Афанасьев В.Н., Донская И.А. Фосфолипаза А2 и

•

тирозиновая протеишашаза не участвуют в апоптозе тимоцнтов крысы вызванном ультрафиолетом С. Российская Академия Наук, Путинский Научный Центр, Совет молодых ученых и специалистов г.Пущино. П открытая городская научная конференция молодых ученых. Сборник трудов.Пущино, 1997, стр 78-85.

5. Николаева H.H., Долгачев В.А., Афанасьев В.Н., Донская И.А. Изучение апоптоза тимоцитов индуцированного ультрафиолетом С: роль внутриклеточного кальция и синтеза макромолекул. Российская Академия Наук, Путцинский Научный Центр, Совет молодых ученых и специалистов г.Пущино. II открытая городская научная конференция молодых ученых. Сборник трудов. Пущино, 1997, стр 85-92.

6. I.A. Lonskaya, V.N. Afanasyev, V.A. Peshatnikov, V.A. Dolgachev, N.N. Nicolaeva. Thymocyte apoptosis induced and suppressed by UV-irradiation. «7th Congress of the European Society for Photobiology» Stresa, Italy, 8-13 Septhember 1997. p.l 15.

7. Долгачев B.A. Анализ Ca2+ сигналов, генерируемых рецепторами фактора активации тромбоцитов (PAF) и АТФ макрофагоподобных клеток линии Р388Д1. Механизм ингибирования действия PAF его синтетическими структурными аналогами. Российская Академия Наук, Пущинский Научный Центр, Совет молодых ученых и специалистов г.Пущино. Городская научная конференция молодых ученых. Тезисы докладов. Пущино, 1996, стр. 32.

8. Долгачев В.А., Николаева H.H., Афанасьев В.Н., Лонская И.А. Изучение апоптоза тимоцитов, индуцированнго ультрафиолетовым облучением. Российская Академия Наук, Пущинский Научный Центр, Совет молодых ученых и специалистов г.Пущино. II открытая городская научная конференция молодых ученых. Тезисы докладов. Пущино, 1997, стр.101.

9. Николаева H.H., Долгачев В.А., Афанасьев В.Н., Лонская И.А. Апоптоз тимоцитов, индуцированный ультрафиолетовым облучением: исследование механизма. Российская Академия Наук, Пущинский Научный Центр, Совет молодых ученых и специалистов г.Пущино. II открытая городская научная конференция молодых ученых. Тезисы докладов. Пущино, 1997, стр. 110-111.

10. Pechatnikov V.A., Afanasyev V.N., Lonskaya I.A., Dolgachev V.A., Nicolaeva N.N. Induction and suppression of thymocyte apoptosis by UVC irradiation. XIX International Congress of the International Society for Analytical Cytology 28 February - 5 March 1998, The Broadmoor Hotel in Colorado Springs, Colorado, USA.Cytometry, Supplement 9,1998, page 63.

11. Печатников B.A., Косякова Н.И., Винокуров М.Г., Николаева H.H., Долгачев В.А., Афанасьев В.Н. Действие ультрафиолета С на иммунокомпетентные клетки человека и животных. «Здоровье, профилактика и эндоэкологическая реабилитация (новые медицинские технологии». Тезисы докладов научно - практической конференции. Пущино-Серпухов, 1998, стр. 22.

12. Долгачев В.А., Николаева H.H., Винокуров М.Г., Афанасьев В.Н., Лонская И.А., Печатников В.А. Изучение апоптоза иммунокомпетентных клеток под действием ультрафиолета С. Российская Академия Наук, Пущинский Научный Центр, Совет молодых ученых и специалистов г.Пущино. III открытая городская научная конференция молодых ученых. Тезисы докладов. Пущино, 1998, стр.112-113.

13. Николаева H.H., Винокуров М.Г., Долгачев В.А., Печатников В.А. Определение уровня соматических мутаций в эритроцитах периферической крови человека гликофориновым методом. Российская Академия Наук, Пущинский Научный Центр, Совет молодых ученых и специалистов г.Пущино. III открытая городская научная конференция молодых ученых. Тезисы докладов. Пущино. 1998, стр. 124-125.

14. Dolgachev V.A., Dolgacheva N.N., Afanasyev V.N., Pechatnikov V.A. Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) activation inhibits rat thymocytes apoptosis induced by short-wave UV irradiation (UVC). XX International Congress of the International Society for Analytical C> tolog) 19 May - 25 March 2000, Cytometry, Supplement 10. 2000, page 80.

15. В.А. Долгачев, В.Н. Афанасьев. II.H. Долгачева, В.А. Печатников. Активация

поли(АДФ-рибозо) полимеразы Ш1гибирует апоптоз тимоцитов, вызванный облучением коротковолновым ультрафиолетом. «Горизонты физико-химической биологии». Тезисы докладов. Пущино, 2000, стр. 170.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Индукция и подавление апоптоза тимоцитов крысы ультрафиолетовым облучением"

Еще в 60-х годах установлен факт гибели большей части развивающихся клеток Т-ряда внутри тимуса, и эта гибель позже была квалифицирована как проявление апоптоза [Kizakí Н., et al 1989]. Наблюдения, в которых были отмечены гибель развивающихся клеток в тимусе и чувствительность тимоцитов к действию ионизирующей радиации и глюкокортикоидов, легли в основу учения об апогггозе, а тимоциш стали классическим объектом исследований в этой области.

Понятие "апоптоз" объединяет различные варианты смерти клеток, наступающей вследствие передачи в клетку сигнала, который включает или деблокирует предсуществукяцую генетическую программу гибели; апоптоз представляет собой активную гибель клетки, требующую затрат энергии, транскрипции генов и, как правило, синтеза белка de novo. В зависимости от природы пускового сигнала и начальных событий реализации программы гибели выделяют несколько разновидностей апоптоза. Наиболее распространённые варианты запуска сигналов связаны с воздействием на специализированные рецепторы (Fas, рецепторы для ФНОа, глюкокортикоидов), с дисбалансом активационных сигналов, с нарушением спирализации и целостности ДНК.

Апоптоз изучают около 25 лет, в последние 10 лет его изучение стало более интенсивным. Оно знаменуется переходом от морфологического уровня к биохимическому и генетическому. В соответсвии с мировыми тенденциями, в настоящей работе с помощью ингибиторного анализа была предпринята попытка определить, какие из ферментов внутриклеточной сигнализации участвуют в индукции и подавлении апоптоза тимоцитов крысы коротковолновым ультрафиолетовым излучением (УФС).

Интерес исследователей к ультрафиолетовому облучению весьма разнообразен. От чисто прикладных работ, посвященных действию солнечного света на кожу человека, до фундаментальных исследований УФ-иидуцированных повреждений ДНК и действию на систему ключевых ферментов. Объекты исследований также весьма различны: E-coli, кератиноциты, иммунокомпетенгные клетки, клетки печени, различные вирусы и т.д.

УФС облучение клеток крови давно и успешно используется в медицине как антисептический и иммуностимулирующий агент [Карандашов, Петухов 1997].

Извесно, что УФС может вызывать апоптоз во многих типах клеток млекопитающих [Rehemiulla et al, 1997]. В работе Винокурова [Винокуров и др.,1999] показано, что УФС облучение нейгрофилов периферической крови человека приводит к запуску в них апопгоза, достигающему максимума при дозе облучения 300 Дж/м2. В процессе апоптоза происходит деградация ДНК, он заканчивается распадом клетки на фрагмента!, сохраняющие целостность внешней мембраны. Апоптоз не сопровождается развитием воспаления и не вызывает поражения других клеток и тканей организма [Darzyitfdewicz Z., et al., 1997]. Апоптоз является обязательным компонентом жизни многоклеточных организмов (их развития, нормального функционирования, осуществления регуляторных процессов), одновременно внося вклад в реакцию клеток на внешние воздействия (например, ультрафиолетовое облучение) и проявления иммунной защиты [Ярилин A.A. 1996]. Нарушения процесса апоптоза (его усиление или ослабление) является основой ряда заболеваний, затрагивающих различные системы и вносит вклад в патогенез ещё большего числа болезней [Jacobson M.D., et al, 1994]. Проявления иммунопатологии при этих заболеваниях человека могут служить иллюстрацией важности апопгоза для нормального функционирования организма. Однако, несмотря на большой интерес многих исследователей к апоптозу клеток иммунной системы, вызванному УФС, мало известно о механизме его реализации.

Целью настоящей работы явилось исследование эффекторных механизмов ивдукции и подавления апоптоза в тимоцитах крыс, подвергнутых облучению in vitro ультрафиолетом с максимумом при 254 нм (диапазон С). Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1) исследование способности мембранных и цитоплазматических антиоксидантов предотвращать УФС- вызванный апоптоз тимоцитов крысы; •

2) исследование роли эксцизионной репарации ДНК и поли- (АДФ)- рибозы полимеразы (ПАРП): а) влияние афидиколина, ингибитора дельта- и эпсилон- ДНК полимераз; б) действие 3-аминобензамида, ингибитора ПАРП; в) действие ингибиторов синтеза белка и макромолекул;

3) исследование роли внутриклеточных протеинкиназ;

4) исследование роли фосфолипазы А2, липоксигеназы и циклооксигеназы; 5) изучение роли калмодулина и внутриклеточного кальция. ^ ^ б

В результате проведенных исследований было установлено, что вызванный УФС-облучением апоптоз тимоцитов крысы предовращался синтетическим предшественником внутриклеточного глутатиона антиоксидантом М-ацетил-Ь-цистеином за счет поддержания необходимого уровня глутатиона в клетках. Таким образом, УФС-вызванный апоптоз зависит от содержания в клетке глютатиона. Ингибитор перекисного окисления липидов (ПОЛ) - антиоксидант ионол - не влиял на индукцию и развитие апоптоза тимоцитов под действием УФС, что говорит о несущественном влияние ПОЛ на апоптоз тимоцитов.

Апоптоз тимоцитов, вызываемый УФС, зависит от активности протеинкиназы С, причём от её кальций - независимой изоформы. Согласно результатам исследований, тирозиновые киназы, чувствительные к ингибиторам - генистеин, тирфостин В 46, Н8 -не участвуют в УФС - вызванном апоптозе.

Активация апоптоза тимоцитов дозами УФС до 10 Дж/м2 связана с подавлением активности чувствительных к афидиколину полимераз дельта и эпсилон и возможно с ингибированием эксцизионной репарации нуклеотидов. При дозах УФС более 10 Дж/м2 табель клеток дозозависимо снижалась, почти достигая контрольного уровня гари дозе УФС облучения 60 Дж/м2. С помощью ингибиторного анализа было установлено, что наблюдавшееся снижение связано с активностью поли(АДФ-рибозо) полимеразы и по-видимому с активацией эксцизионной репарации оснований. В присутствии ингибиторов синтеза белка и макромолекул как активация так и снижение апоптоза тимоцитов в зависимости от дозы УФС практически элиминировались, указывая на то что оба процесса зависят от синтеза белка de novo.

Апоптоз тимоцитов, вызванный УФС облучением, не был чувствителен к ингибиторам фосфолипазы А2, липоксигеназы и циклооксигеназы, т.е УФС -зависимый апоптоз тимоцитов не требует участия этих ферментов. Не было зарегистрировано изменения концентрации внутриклеточного кальция и участия калмодулина.

Диссертационная работа начинается обзором литературных данных. Поскольку исследованию апоптоза, вызванного в различных типах клеток разнообразными воздействиями, посвящены многие сотни научных публикаций, приведенный здесь обзор включает только те вопросы, которые так или иначе затронуты в работе. Основные результаты, полученные автором, сформулированы в выводах. я ■

Обзор литературы.

1. Аиоптоз как форма гибели клеток

В первой части обзора будет рассмотрен процесс апоптоза с морфологической и биохимической точек зрения. Так как в настоящей работе апоптозные клетки регистрировались с помощью методов проточной цитометрии, их рассмотрению посвящена отдельная глава. В заключительной, третьей ^ части работы изложены полученные результаты и сделаны выводы.

Существуют два типа гибели клеток - некроз и апоптоз. Первый ассоциируется с действием вредоносных агентов и обстоятельств, приводящих к нарушению целостности клеточной мембраны (вследствие повреждения или формирования пор) и изоляции внутренней среды клетки от её окружения. Второй тип гибели представляет собой активный процесс реализации программы гибели клетки; он может быть вызван действием поступающих извне сигналов, которые сами по себе не являются токсичными или деструктивными. Этот тип гибели иногда обозначают как самоубийство клетки [\Vyllie А.Н. 1986]. Апоптоз выражается в деградации ДНК, заканчивается он распадом клетки на фрагменты, сохраняющие целостность внешней мембраны, и поэтому, в отличие от некроза, не сопровождается развитием воспаления и не вызывает поражения других клеток и тканей организма [БаггупЫешюг Z., й а1 1997] (рис. 1 и 2). Основные морфологические признаки апоптоза - вакуолизация и конденсация цитоплазмы и хроматина с последующей клеточной фрагментацией на апоптические тельца, содержащие остатки ДНК и клеточные органеллы [БаггупЫемсг X., е! а1 1997] ] (рис. 1 и 2). На биохимическом уровне апоптоз сопровождается угнетением включения в клетки глюкозы и нуклеотидов; снижением синтеза липидов, белков и АТФ; фрагментацией ДНК в результате активации эндонуклеаз. Так как разрезание ДНК идёт по межнуклеосомным участкам, то длина фрагментов кратна 180-200 парам оснований, что при электрофорезе в агарозном геле даёт характерную картину в виде «лестницы» [Уманский С.Р. 1996]. Апоптоз является обязательным компонентом жизни многоклеточных организмов (их развития, нормального функционирования, осуществления регуляторыых процессов), одновременно внося вклад в реакцию клеток на внешние воздействия (например, ультрафиолетовое облучение) и проявления иммунной защиты [Ярилнн А.А, 1996]. Наибольший интерес у исследователей вызывает апоптоз. Основные отличительные признаки этих двух типов гибели клеток обобщены в

Рис. 2 Схема представляет апоптоз, злокачественное перерождение и некроз согласно клеточной таксономии, пред ложенной Мартой Доле [67]. Ранние стадии апоптоза характеризуются наличием неразрушенной плазматической мембраны и внутриклеточными изменениями (см. подпись к рис. I). На последней стадии (апоптический некроз) транспортные функции плазматической мембраны нарушены и в результате клетки становятся проницаемы для трипановсго синего и пропидиумйодида. Остатки апоптических клеток поглощаются соседними клетками. В течении злокочесгвеного перерождения митохондрии набухают и разрушаются, наблюдается набухание всей клетки.Некого рое время другие жизненно важные функции клетки в различной степени сохраняются. Разрывы плазматической мембраны ведут к некротической стадии, сопряженной с локальным воспалением. в таблице 1.

В соответсвии с современными представлениями апоптоз - явление неоднородное. В зависимости от индукторных факторов различают несколько его вариантов, которые можно дифференцировать по биохимическим проявлениям. Как правило, все эти разновидности имеют идентичные заключительные этапы развития и одинаковые морфологические проявления. В иммунной системе чаще других реализуются три формы апоотоза: гибель клеток вследствие дефицита ростовых факторов, апоптоз, вызванный глюкокортикоидами и другими агентами со сходным действием, и «активационный» апоптоз, развивающийся вследствие дисбаланса активационных сигналов или по другим причинам, обусловливающим включение программы гибели клетки при их активации.

Таблица 1

Сравнительная характеристика апоптоза и некроза клеток.

Показатель Апоптоз Некроз

Причинный фактор Сигнал, воспринимаемый мембранными рецепторами, или отсутствие физиологического сигнала Токсичные и мембранотропные агенты, неадекватные внешние условия

Скорость развития 1—12 ч В пределах 1ч

Причины гибели клетки Деградация ДНК, нарушение работы генов, энергетики клетки Нарушение целостности мембраны

Локализация первичного повреждения Обычно в ядре Обычно в клеточной мембране

Изменение размера клетки Уменьшение (сморщивание) Увеличение (набухание) размера клетки (сморщивание)

Изменение ядра Конгломераты хроматина, прилежащие к мембране, пикноз, фрагментация Набухание

Изменения в цитоплазме Конденсация цитоплазмы, уплотнение гранул Лизис гранул, разрыв их мембран

Изменение клеточной мембраны Потеря микроворсинок, образование пузырей Нарушение целостности

Состояние ДНК Разрывы с образованием сначала крупных, затем мелких фрагментов Неупорядоченная деградация

Энергозависимос ть Зависит Не зависит

Зависимость от синтеза макромолекул Обычно зависит от синтеза РНК и белка Не зависит

Примеры проявления у животных Метаморфоз, отрицательная селекция лимфоцитов, гормонозависимая атрофия, интерфазная радиационная гибель лимфоцитов Гибель клеток от гипоксии, действия ядов и токсинов, вирусный цитолиз, комплемент-зависимый цитолиз

Методы выявления: морфологические Сморщивание клетки Набухание клетки тинкториальные Ослабление окрашиваемости ДНК-тропными красителями Восприятие суправитальных красителей цитофлюорометр ические Уменьшение размеров клеток, гиподиплоидность, дифференцированное окрашивание комбинацией красителей электрофоретичес кие Формирование "лесенки" при электрофорезе ДНК Размазанное пятно при электрофорезе ДНК

Морфологические и биохимические проявления апоптоза.

Некоторые проявления апоптоза указаны в таблице 1. По морфологическим признакам при апоптозе происходят уменьшение размеров, сморщивание клетки, уплотнение и фрагментация хроматина. В ядре формируются осмиофильные скопления хроматина, обычно прилежащие к ядерной оболочке. Эти изменения служат самым ранним проявлением апоптоза, предшествующим процессам деградации. На этой стадии прогрессирование апоптоза может быть приостановлено действием ингибиторов, о которых будет сказано далее, в связи с чем данная стадия развития клеточной гибели обозначается как преапопотоз [Cohen JJ., et al 1993]. Затем в ядерной мембране образуются инвагинации, и хроматиновые фрагменты отшнуровываются от ядра. Такие фрагменты, окруженные мембраной, называют апоптическими тельцами (рис. 1).

В цитоплазме происходят конденсация и сморщивание гранул без их разрушения, расширение эндоплазматмческого ретикулума. Для апоптоза характерны потеря клеточной мембраной микроворсинок и нормальной складчатости, отделение клетки от субстрата, формирование на её поверхности пузырен [Wyllie А.Н., et al 19В0] (рис.1). Лизис клеток, обнаруживаемый по проницаемости для пропидия йодида, регистрируется позже, чем события, связанные с фрагментацией хроматина: если признаки л oryr регистрироваться уже через 1 час после воздействия и »проникновение пропидия йодидатолько через 3-5 часов [Cohen JJ. Ътличие от некроза, когда одновременно гибнут массы соседствующие^ ^^ \ оз развивается изолированно в единичных клетках (рис. 1 и 2). Если в ра роза из клеток в среду поступает внутриклеточное содержимое, в ^асг лизосомы, что нередко приводит к развитию или прогрессированию воспален^ гглЬ^п Т Т 19921 (пиг. 1 и 2У ае лизичллиш, -11V -----г - •СТИапоптозе подобные проявления отсутсвуют [Cohen JJ. 1992] (рис. 1 и 2). Хара*^

•т» UQVnnCITtTMÍ^ra "R ППГИТРГ.Г.^ ЯПГ— anumw* —----,------ - ^ клетки, подвергшиеся апоптозу m vivo (а иногда и находящиеся в процессе ап^^ * Что апоптические тельца быстро фагоцитируются, причем не только макрофа^ам1^ . И и «непрофессиональными» фагоцитами (например, мезанглиальными клег^ами

Savffl J., et al 1993]. v ^чек и фрагментация ДНК.

Одно из основных проявлений апоптоза на биохимическом уровне- реалИ. ядре клетки и состоит в фрагментации ДНК [Wu М.Х., et al 1994]. Снач^ ß образование крупных фрагментов ДНК, содержащих 700, 200-250, SO-70 >цЧ<>дит оснований (т. п. о.), несколько позже - 30-50 т. п. о. [Steller Н. 1995]. Уж^ на ^ * „ар регистрируются конденсация хроматина и выпячивание ядерной мембра.^ хар %дии для апоптоза. Полагают, что именно этот начальный этап фраг¥ен~гации ^ ^нь,е является ключевым событием апоптоза, после осуществления которого ^ина становится необратимым [Cohen G.M., et al 1993]. Более подробно а^учен Хдесс этап фрагментации ДНК - её межнуклеосомная деградация, т.е. расщеа^ение в формирования, разрывов (в основном двунитевых) между нуклеос^^ате формированием фрагментов, содержащих 180-190 т. п. о. (протяжен*ость ^Ч нуклеосоме) или кратных им по величине [Cohen J.J., Barankievich J. 19щ ^ фрагменты выявляются в виде «лесенки» при электрофорезе Для иден эти апоптоза [Burgoyne L.A., et al 1974] (случайный характер деградации дас развивающейся ~ как следствие нарушения целостности клеТки, с в

Розе, эазвивающст/л —-----------------' ^Ло размазанный» характер юны миграции ДНК при электрофорезе). При ^вает цитометрии апоптозные и некрозные клетки четко разделяются на диагра^ ^»ой их накопления. Через 3 часа после обработки тимоцитов глюко^0 фрагментация ДНК обнаруживается в 30% клеток, через 15 часов - в 75% Хами

Ч, и

1992]. Деградация ДНК обусловливает выход в растворимую фазу низкомолекулярных фрагментов ДНК - полидезоксирибонуклеотидов, определение которых также используется для регистрации апоптоза. Процесс деградации не затрагивает митохондриальную ДНК [Murgia M., et al 1992].

Деградация хроматина при апоптозе является активным процессом: она зависит от температуры, блокируется энергетическим ядом - азидом натрия, требует синтеза РНК и белка de novo [Cohen J.J., Duke R.C. 1984; Sellins KS., Cohen J.J. 1987]. Осуществление различных этапов деградации ДНК связывают с проявлением активности разных ферментов. Несмотря на пристальное внимание исследователей к ферментам, опосредующим деградацию хроматина, этот процесс изучен далеко не полно. Пока не удалось клонировать гены соответсвующих эндонуклеаз; нет единства в представлениях об их природе. Считают, что межнуклеосомная деградация ДНК при апоптозе обусловлена активацией резидентной ядерной Са2+, Mg2+ - зависимой эндонуклеазы, которая обнаружена вначале в кортикальных тимоцитах [Hewish D.R., Burgoyne L.A. 1973], а затем и в других клетках. Выделена эндонуклеаза с молекулярной массой 18 кД, родственная циклофиллинам [Gaido M.L., Gidlowski J.A. 1991]. В интакгных клетках она входит в состав высокомолекулярного (более 100 кД) комплекса, а после воздействия индуктора апоптоза (глюкокортикоидов) выходит из него в низкомолекулярной форме -18 кД [Montague J.W., et al 1994, Wyllie A.H., et al 1984]. Описаны молекулы эндонуклеазы с другой молекулярной массой. Приводились свидетельства в пользу идентичности эндонуклеазы, обусловливающей межнуклеосомную деградацию хроматина и ДНКазы I.

Ещё меньше сведений о ферментах, обусловливающих формирование крупных разрывов ДНК (по-видимому, их несколько). Они отличаются от Са2+, Mg2+ - зависимой эндонуклеазы по ряду свойств: в отличие от неё не ингибируются солями цинка [Brown D.G., et al 1993], а также ингибиторами сериновых протеаз [Brown D.G., et al 1993, Walker P.R., et al 1994]. Отличия касаются также разной зависимости от ионов Са2+: эндонуклеазы, ответсвенные за формирование наиболее крупных фрагментов ДНК, не зависят от Са2+ (хотя и зависят от Mg24) [Sun Х.М., Cohen G.M. 1994]; по другим данным, формирование крупных фрагментов ДНК также зависит от Са2+ [Zhivotovsky В.; et al 1994].

Роль ионов Са2+ в осуществлении межнуклеосомной деградации ДНК и развитии апоптоза связывают по преимуществу с активацией Са2+, Mg2+ - зависимой эндонуклеазы. Это следует в частности из данных о том, что деградация ДНК и апоптоз индуцируются при повышении концентрации в клетке ионов Са2+, например под влиянием Са2+ ионофоров [McConkey D.J., et al 1989; Shi Y.F., et al 1989]; повышение внутриклеточной концентрации Ca регистрируется при действии многих, но не всех индукторов апоптоза (например, антител к рецепторному комплексу TCR-CD3 [Lowe S.W., et al 1994]), что коррелирует со способностью этих факторов вызывать межнуклеосомную деградацию хроматина [McConkey DJ., et al 1992]. Активация межнуклеосомной деградации ДНК под влиянием ионов Са2+ показана в опытах на изолированных ядрах и очищенных препаратах эндонуклеазы [Hewish D.R., Burgoyne L.A. 1973; Vanderbilt J.N., et al 1982]. В то же время У не все препараты, повышающие уровень Са2+ в клетках, индуцируют апоптоз: его вызывает валиномицин но не меллитин и стафилококковый экзотоксин [McConkey D.J., et al 1989sep]; кальциевые ионофоры вызывают апоптоз тимоцитов, но не зрелых Т-клеток [McConkey D.J., et al 1989may], а в некоторых случаях даже ингибируют апоптоз [Rodriguez-Tarduchy G.,1989]. Развитие апоптоза блокируется хелаторами Са2+ (например, этиленгликольтетраацетатом) [McConkey D.J., et al 1989sep], а также ионами Zn2+ [Cohen J.J., et al 1993] и ингибитором эндонуклеазы - ауринтрикарбоновой кислотой [McConkey D.J., et al 1989 may].

Первоначально считалось, что межнуклеосомная деградация ДНК с формированием фрагментов размером 180-190 т. п. о., отражая основную сущность апоптоза, служит ключевым событием и условием реализации этой формы гибели клетки. Однако выяснилось, что некоторые из ингибиторов топоизомеразы П индуцируют апоптоз, вызывая формирование крупных фрагментов ДНК и изменяя спирализацию ДНК без её межнуклеосомной деградации [Onishi Y., et al 1993]; при воздействии ионов Zn2+ [Brown D.G., et al 1993] и некоторых других ингибиторов Са2+, Mg2+ - зависимой эндонуклеазы на фоне индукции апоптоза также формируются только крупные фрагменты ДНК, что не препятсвует гибели клеток.

Наблюдения последних лет заставили пересмотреть представления об абсолютном преобладании событий в ядре при апоптозе. Дело в том, что морфологические признаки апоптоза в виде характерных изменений цитоплазмы можно индуцировать в клетках, из которых в результате обработки цитохолазином удалено ядро [Jacobson M.D., et al 1994]. В связи с этим события в ядре рассматриваются как важнейшие, но не абсолютно обязательные для реализации апоптоза [Steller Н.1995], а эффект апоптогенов трактуется как воздействие, деблокирующее предсуществующую и готовую к реализации программу гибели клетки [Raff М.С. 1992]. То же касается эффекта ингибиторов; подавление синтеза

РНК и белков не влияет на некоторые формы апоптоза (в частности, на эффект ингибиторов топоизомераз [Cotter T.G. 1992] и активационный апоптоз зрелых лимфоцитов [Alnemri E.S., Litwack G. 1989; Baughman G., et al 1992]), а в некоторых случаях ингибиторы макромолекулярных синтезов циклогексимид актиномицин Д даже сами по себе вызывают апоптоз {Martin S.J., et al 1990; Raían R.R., et al 1994].

Наблюдаемые при апоптозе уплотнение и деформации наружной и внутриклеточной мембран, формирование устойчивого к действию детергентов покрова, сморщивание цитоплазматических гранул связывают с перекрёстным сшиванием белков, обусловленным активацией Са2+-зависимой трансглутаминазы типа П, которое служит обязательным и характерным биохимическим признаком апоптоза [Fesus L. 1991].

Хотя повышение проницаемости мембраны для крупных молекул и нарушение её целостности наступают относительно поздно, довольно выраженные биохимические процессы, связанные с апоптозом, регистрируются в ней даже несколько раньше, чем деградация хроматина в ядре. Они выражаются в изменении характера упаковки фосфолипидов, что проявляется усилением связывания липофильных красителей и некоторых флюоресцентных зондов. При этом устраняется ассиметрия фосфолипидов мембраны: так, фосф&гадилсерин, сосредоточенный во внутренней части мембраны, оказывается экспрессированным на наружной поверхности [Fadok V.A., et al 1992]. Фосфйгадилсерин является одним из мембранных маркеров апоптотических клеток, который распознается макрофагами, что обусловливает исключительно высокую эффективность фагоцитоза апоптотических клеток. К другим маркерам апоптотических клеток, выполняющим аналогичную функцию, относят тромбоспондин, распознаваемый интегрином avb3 макрофагов, и мембранные гликоконьюгаты с концевым b-D-N-ацетилглюкозамином, который распознается мембранными лектинами макрофагов [Savill J , et al 1993]. При апоптозе Т-клеток перестройки в мембране затрагивают также известные маркерные молекулы: одним из неспецифических проявлений апоптоза Т-клеток служит ослабление экспрессии молекул CD4 и CD8.

Несмотря на довольно многочисленные указания на изменения активности ферментов метаболизма клеток в процессе апоптоза, вопрос о том, что служит непосредственной причиной их гибели, не решён. Расщепление ДНК, конечно, приводит к нарушению работы генов, синтеза макромолекул. Однако прямые данные о блокаде этого синтеза свидетельствуют о значительно более позднем наступлении при этом гибели клеток [Golstein Р., et al 1991]. Одно из обяъснений связывает гибель клеток при апоптозе с энергетическим голоданием, вызванным расходованием АТФ на работу по репарации повреждений ДНК [Carson D.A, et al 1986]. Действительно, при апоптозе происходит активация фермента поли(АДФ-рибозы) полимеразы, которая активируется при возникновении разрывов ДНК и обусловливает перенос АДФ-рибозного комплекса с НАД на белки; вследствие этого истощается пул НАД и на его восстановление тратится АТФ [Пескин A.B. 1997], снижение содержания которой в клетке также регистрируется при апоптозе [Пескин AB. 1997].

Таким образом, проявление апоптоза на уровне морфологических структур и биохимических процессов позволяют заключить, что при его развитии наиболее характерные события происходят в ядре и выражаются в конденсации хроматина, что является результатом деградации ДНК вследствие активации эндонуклеаз. Важные процессы, связанные с активацией сериновых и цистеиновых протеиназ, происходят в цитоплазме и мембранах. Непосредственная причина гибели клеток при этом не установлена: вероятно, она состоит в истощении энергетических ресурсов клетки.

Из изложенного следует, что феномен апоптоза неоднороден и при действии различных его индукторов события, по крайней мере до определенного этапа, могут развиваться по разнообразным сценариям и, лишь достигнув определенной точки конвергенции, различные пути сходятся, а механизмы реализации гибели оказываются идентичными [Steller Н. 1995]. К ключевым дистальным механизмам реализации апоптоза относят активацию цистеиновых и сериновых протеиназ. Са2+ зависимая протеиназа-калпаин, а также сериновые протеиназы- гранзимы (гранзим В участвует в реализации цитолитического действия Т-киллеров) способны вызывать апоптоз [Nakajima Н., et al 1995, Shi Y., et al 1992, Shiver J.W., Henkart P.A 1992]. Ингибиторы сериновых протеиназ подавляют апоптоз, индуцированный глюкокортикоидами [Sarin А, et al, 1993, Shi Y.,et al, 1992]. Важную роль в осуществлении апоптоза отводят цистеиновым протеиназам типа ICE (interleukin 1 converting enzyme) и родственным ей ферментам Nedd2 (Ich-1) и СРР32, которые определяют осуществление общих для различных форм апоптоза звеньев необратимой фазы клеточной гибели [Steller Н. 1995]. При апоптозе, вызванном фактором некроза опухоли а (ФИО а), обнаруживаются продукты протеолиза ряда важных внутриклеточных (в частности, ядерных) белков -л амина В, топоизомеразы I, гистона PI, фосфолипазы А2, протеинкиназы С [Voelkel-Johnson С., et al 1995].

В регуляции апоптоза выделяют два основных этапа: фазу индукции ("принятия решения1) и фазу экзекуции ("исполнения приговора). Последняя осуществляется путем активации кастаз - семейства цистеиновых протеиназ, расщепляющих свои субстраты по остаткам аспартатовой кислоты. Расщепление каспазами 3, 6, 7 (так называемые «эффекторные» или «казнящие» каспазы) ряда ключевых субстратов, в частности, DFF45/ICAD - ингибитора нуклеазы DFF40/CAD (осуществляется каспазой 3), ламинов -ядерных цитоскелетных белков (осуществляется каспазой 6) и т.д., приводит к фрагментации ДНК и деструкции клетки [Nunez G., et al 1998]. Каспазы присутствуют в цитоплазме в виде проэнзимов и активируются до полностью функциональных протеаз путем расщепления проэнзима на большую и малую субъединицы и дальнейшего отщепления от них N-концевых доменов. Затем субъединицы собираются в тетрамер с двумя активными центрами [Green D.R. 1998, Nunez G., et al 1998]. Расщепление прокаспаз могут осуществлять различные протеазы, в том числе и другие каспазы.

Предполагается, что существует по меньшей мере два принципиально разных сигнальных пути, приводящих к активации каспаз 3, 6, 7 [Green D.R. 1998., Nunez G., et al 1998] (рис. 3). Один из них инициируется связыванием специфических киллерных молекул (Fas-лиганд, TNF-а и др.) со своими рецепторами, что вызывает рекрутирование адаптерных белков и прокаспаз, в частности прокаспазы 8. Агрегация молекул прокаспазы 8 достаточна, чтобы инициировать их аутопроцессирование (расщепление) и образование активных форм каспазы 8, которая, в свою очередь, процессирует «казнящие» каспазы. При альтернативном механизме расщепление каспаз 3, 6, 7 осуществляется каспазой 9, активация которой инициируется выходом из митохондрий протеазы AIF (Apoptosis Inducing Factor) и/или цитохрома с, стимулирующего связывание прокаспаз 9 с белком Apafl (гомолог белка CED-4 у С. elegans) и, как следствие, образование агрегатов прокаспаз 9 и аутопроцессирование их до активных форм (рис. 3). Проницаемость митохондриальной мембраны для AIF и цитохрома с регулируется белками семейства Вс12. Это семейство структурно сходных белков включает более двух десятков членов, в том числе продукты протоонкогенов Bel2 и bcl-x, обладающие способностью блокировать апоптоз, и опухолевый супрессор Вах, наоборот, индуцирующий апоптоз [Adams J.M., Cory S. 1998, Reed J.С. 1998]. Предполагается, что антиапоптогенные молекулы Вс12 и Bcl-x, локализуясь в мембранах митохондрий, закрывают каналы, через которые осуществляется выброс цитохрома с и/или AIF (рис. 3). Вах, находящийся в норме в определенных компартментах цитоплазмы, при апоптогенных сигналах перемещается в митохондриальные мембраны, где он, взаимодействуя с интегральным белком наружной митохондриальной мембраны VDAC, 7 . 7;-::;:■. ;777 7,

- 4nf, -т— „ÄÄJ^^--' в'.=--■----' ------" ~ м - * * .»s-i- стимулирует открытие канала, через который секрегируется цитохром с. Кроме того, Вах образует гетеромерные комплексы с белками Вс12, Bcl-x, что, возможно, открывает закрытые до этого каналы [Chao D.T. et al 1998, Reed J.C. 1998.]. Другие проалоптотические

Повреждения, стресс

Рис. 3. Участие онкогенов и опухолевых супрессоров в регуляции апоптоза (объяснения в тексте) белки семейства Вс12 (Bak, Bad, Bid и т.д.), по-видимому, обладают сходным действием [Adams J.M., Cory S. 1998., Reed J.C. 1998.].

Бели Вс12, Bcl-x и Вах непосредственно контролируют выброс го митохондрий апоптогенных молекул, то ряд других протоонкогенов и оцухолевых супрессоров ре1улируют активность этих и других белков семейства Вс12 (рис. 3). Одним го таких наиболее мощных регуляторов является опухолевый супрессор р53, который активируется в ответ на самые разные неблагоприятные воздействия (повреждения ДНК, гипоксия, потеря контактов клетки с субстратом, и т.д). Получены данные об его участии в активации каспаз 1, 3 и рекрутировании белка Вах при апоптозе, индуцированном TNF-ot, интерферонами 1 и 2, активацией Fas и повреждениями ДНК [Wang Z.C., et al 1998, Quignon F., et al 1998].

Ген р53, апоптоз и репарация.

Ген р53 получил образное имя «страж генома» [Чумаков П.М. 2000]. Действительно, этот ген координирует все основные процессы поддержания стабильности генома многоклеточного организма. Несмотря на чрезвычайную сложность генома, все клетки в организме генетически однородны. Возникшие в геноме повреждения индуцируют ответ со стороны клетки, который включает в себя три типа реакции: задержку прохождения по циклу, репарацию ДНК и гибель клетки по механизму апоптоза. Все эти реакции находятся под «патронажем» гена р53, относящегося к семейству генов-супрессоров опухолевого роста Ген р53 постоянно транскрибируется и транслируется, однако его продукт - белок р53 быстро подвергается убиквиганзависимой деградации в протеасомах: время его жизни в клетках не превышает двух часов [Hochstrasser M, 1998]. Р53 представляет собой полифункциональный белок, основная функция которого осуществляется в ядре. Повреждения в ДНК приводят к подавлению рапада белка р53, возрастанию уровня его содержания в клетке и открывают возможность для бежа р53 выполнять свои разнообразные функции. Большое разнообразие функций и регуляторных взаимодействий, в которые белок р53 может вступить, даёт основание предполагать существование его в клетке в виде трех форм (см. схему 4): латентной, активированной и апоптаческой [Тронов В. А. 1999].

Две последние формы являются активными и обеспечивают контроль за реакциями клетки на повреждение. Каждая из трёх форм строго не идентифицирована, но существуют экспериментальные данные, косвенно свидетельствующие в пользу их существования [Тронов В.А. 1999]. Считается, что одним из механизмов поддержания белка р53 в латентной форме является его изоляция в цитоплазме [Knippschñd U., et al 1996].

Повреждение ДНК i

Транслокация р53

Транскрипционная активация р53 Трансляционная активация р53 Связывание р53 с ДНК

V V V V

Активированный р53 V

Гипоксия Онкогены

Повреждение ДНК Отсутсвие ростовых факторов

W I

Апоптотический" Viр53

Трансактивация Связывание р53 сенсор , повреждения

Г V V p53 3'-5V p21(Wafl/Cipl) Gadd45 ERCC3,PCNA экзонуклеазная активность bax трансактивация) bcl-2

Задержка клеточного цикла

Схема 4 предполагаемых путей трансляции первичных сигналов различной природы (повреждение ДНК, гипоксия, активация онкогенов, отсутсвие ростовых факторов) до конечного эффекта. Первичным транслятором сигнала является белок р53. Вторичные переносчики зависят от белка р53. [Тронов В.А. 1999].

Транслокация белка из цитоплазмы в ядро после повреждения ДНК, возможно, ослабляет его экспрессию. Предполагается, что активация белка до апоптического уровня достигается либо путем дальнейшей модификации активированной формы белка р53, либо за счёт формирования сигнала, увеличивающего активность белка выше порогового уровня [Hansen R., Oren М. 1997]. Как видно на рисунке, репарация - процесс, связанный с активацией белка р53, однако непосредсвенно не включенный в клеточную гибель, хотя его влияние на процесс гибели очевидно. Проблема взаимоотношения апоптоза и репарации является интригующей по нескольким причинам. Во-первых, эти два процесса противоположно направлены в отношении повреждений ДНК; в процессе апоптоза ДНК подвергается деградации, а репарация призвана устранять возникающие дефекты. По-видимому, их конкуренция является особенностью преапоптической фазы клетки [Lyndall D., Weinret T. 1996].

Врэл с соавторами [Vrai et al., 199S] исследовали роль репарации ДНК в радиационно-индуцированном апоптозе покоящихся лимфоцитов. Поскольку уровень апоптоза в их работе не зависел от мощности дозы в диапазоне 0,006-1,500 Гр/мин и величины ЛПЭ, авторы предположили, что в индукции апоптоза определяющими являются первичные повреждения ДНК, а не те, которые остались после завершения репарации. Вообще в репарации разрывов важная роль принадлежит белкам, временно скрепляющим образовавшиеся концы. Два кандидата на эту роль наиболее вероятны - поли(АДФ-рибозо) полимераза (ПАРП) и ДНК-зависимая протеинкиназа (ДНК-ПК). ПАРП активируется в одинаковой степени одно- и двухнитевыми разрывами ДНК; ДНК-ПК активируется только двухнитевыми разрывами [Weinfeld M, et al 1997]. Оказалось, что ПАРП активируется в ответ не только на агенты, непосредственно индуцирующие разрывы, - ионизирующее излучение [Le Rhun et al., 1998], активные кислородные радикалы, NO [Heller et al., 1995], ингибиторы топоизомераз [Negri et al., 1993; Barnardi et al., 1995], - но и при действии УФ [Cleaver, Morgan, 1991] и алкилирующих соединений [Satoh et al., 1993], для которых характерно образование временного разрыва в результате репаративного вырезания первичного повреждения. Такая универсальность ПАРП объясняет тот факт, что этот фермент является конститутивным, представлен большим количеством копий в ядре эукариотической клекги [Lindahl et al., 1995] и одним из первых подвергается протеолизу при апоптозе [Labeznik et al., 1994].

Эксцизионная репарация.

Эксцизионная репарация эволюционно является высоко консервативной стратегией репарации разнообразных обширных повреждений ДНК, включая УФС-индуцированные циклобутановые пиримидиновие димеры (ЦПД) и 6-4 фотопродукты. Необходимым шагом в этом процессе является вырезание поврежденного участка ДНК и последующая застройка его неповрежденным материалом.

21

Эксцизионная репарация оснований.

К настоящему времени описано много типов ферментов-гликозилаз, каждый из которых узнает разнообразные поврежденные основания (такие, как метилированные, окисленные, восстановленные, дезаминированные основания, основания, связанные с формамидными группировками, и т.п., табл. 1). Гликозилазы присоединяются к ним, рвут гликозидные связи между модифицированным основанием и сахаром дезоксирибозой, за счет чего образуются АП-сайты. АП-сайт распознается теперь другим ферментом, АП-эндонуклеазой. Последние найдены у бактерий, растений к животных, включая человека. Как только в нити ДНК возникает разрыв, в работу вступает еще один фермент -фосфодиэстераза: он отщепляет от ДНК ту сахарофосфатную группу, к которой теперь не присоединено основание. Появляется брешь в одной цепи ДНК размером в один нуклеотид. Напротив бреши в противоположной нити ДНК расположен неповрежденный нуклеотид, и следующий фермент - ДНК полимераза I вставляет в брешь комплементарный ему нуклеотид, присоединяя его к свободному З'ОН-концу. Чтобы соединить два свободных конца (З'ОН-конец вставленного нуклеотида и 5-конец, ранее образовавшийся при разрыве нити ДНК АП-эндонуклеазой), вступает в действие еще один фермент полинуклеотидлигаза. Теперь вся структура ДНК полностью восстановлена: неправильное основание удалено, сахарофосфат, к которому это основание было прикреплено, вырезан из нити ДНК, брешь заполнена правильным нуклеотидом, и все однонитевые разрывы залечены. Поскольку последовательность реакций запущена в действие путем расщепления гликозидной связи, этот вид репарации получил название "эксцизионная репарация оснований".

Эксцизионная репарация нуклеотидов.

Другим типом эксцизионной репарации является более сложная и энергетически более дорогая реакция вырезания не просто поврежденного основания, а значительного участка цепи ДНК перед и позади повреждения (рис. 5 ). Эту реакцию в клетках Е. coli выполняет мультиферментный комплекс, содержащий эндонуклеазы, кодируемые тремя генами: uvrA, uvrB и uvrC (названия генов даны по первым буквам слов ultra violet repair). Комплекс получил название "эксинуклеаза". В клетках млекопитающих имеются подобные ферменты, имеющие другие названия.

Роль поли(АДФ-рибозо) полимеразы.

Эффект эндонуклеаз, действие которых способствует появлению разрывов, тесно связан с полирибозилированием, направленым на репарацию разрывов. Радиационный апоптоз при облучении начинается с первичных однонитевых разрывов, в репарацию которых вовлекается поли(АДФ-рибозо) полимераза (ПАРП) [Lunee J. 1984], регулирующая в том числе и дифференцировку лимфоидных клеток [Johnstone АР., Williams G.T. 1983]. Прямые разрывы ДНК прямо стимулируют эти ферменты in vitro; для двойных разрывов такие возможности выше, чем для одиночных [Benjamin R.C., Gill D.M. 1980]. Используя НАД+ как субстрат, ферменты при помощи ПАРП связывают примерно половину поврежденных сайтов, предположительно поддерживая на короткое время структурную целостность, пока ДНК-полимераза еще может осуществлять свою перманентную репарацию.

Информацию о роли полирибозилирования при апоптозе тимоцитов получают при изучении действия конкурентных ингибиторов, таких как никотинамид и 3-аминобензамид. Эти агенты потенциируют ДНК-фрагментацию [Nelipovich Р.А et al.,1988; McConkey DJ. et al.,1989may], что даёт возможность сделать вывод о том, что ингибирование ПАРП может быть общим механизмом активации во время апоптоза. Были найдены доказательства вовлечения ПАРП - ферментов в ДНК-фрагментацию ядер печени крыс, хотя в этой системе для эндонуклеазной активности требуется ПАРП [Jones D.P. et al., 1989]. Однако, клеточную гибель и истощение НАД+ в тимоцитах при воздействии глюкокортикоидов или Са2+-ионофоров связать не удалось.

В облученных тимоцитах, погибающих от апоптоза, активность ПАРП падает, и это падение коррелирует с активацией Са2+, М|>2+-зависимых эндонуклеаз. При апоптозе тимоцитов, вызываемом глюкокортикоидами, цитостатиками или облучением имеет место раннее специфическое разщепление ПАРП с молекулярным весом 116 кДа на две единицы с молекулярными весами 85 и 24 кДа. Это расщепление отделяет ДНК-связывающий домен от каталитического и таким образом снимает активацию фермента однонитевыми разрывами ДНК. Установлено, что расщепляющим ПАРП ферментом является протеаза СРР32. ICE и другие члены семейства могут расщеплять ПАРП, находясь в концентрациях в 50-100 раз более высоких, чем СРР32.

Молекулярный контроль апоптоза.

Существуют два взгляда на природу механизмов, запускающих апоптоз. Согласно одному из них, в клетках предсуществуют генетическая прграмма и готовый механизм реализации гибели и индукторы апоптоза деблокируют эти программу и механизм [Raff М.С. 1992]. Согласно другой точке зрения, механизм гибели клеток происходит вследствие аберрантной реализации сигнальных механизмов, в норме приводящих к осуществлению активации или дифференцировке клеток [Ucker D.S. et al 1989]. Изложенное выше объясняет интерес исследователей к изучению генетического контроля и механизмов сигнализации при развитии апоптоза.

Генетический контроль апоптоза.

Естественно ожидать, что на первых этапах генетического изучения контроля апоптоза наиболее точная информация может быть получена на простых биологических объектах. Таким объектом оказалась нематода Caenorhabditis elegans, у которой существует жесткий гомеостаз общей численности клеток. Вычленены 4 уровня контроля апоптоза индивидуальных клеток у этого червя, реализуемого с участием 14 генов: выбор гибели (ген ces-1 и ингибигорные гены ces-2 и egl-1), осуществление гибели (гены ced-3 и ced-4, ингибиторный ген ced-9), поглощение фагоцитирующей клеткой (7 генов серии ced) и деградация (ген nuc-1) [Ellis R.E., et al. 1991]. Вторая стадия и 3 контролирующих её гена имеют прямые аналоги у животных Гомологом гена ced-3 являются гены, детерминирующие семейство уже упоминавшихся цистеиновых протеиназ ICE [Yuan J. et al, 1993], гомологом гена ced-9, супрессирующего апоптоз, является протоонкоген bcl-2 [Hengartner М.О., HorvitzHR. 1994].

Разные авторы изучали гены, индуцируемые в тимоцитах в процессе развития апоптоза под влиянием глюкокортикоидов. В одной из работ из 20 индуцируемых генов охарактеризованы 2: ген КР-8, эспрессирующийся через 1ч. после действия дексаметазона и кодирующий белок, структурно близкий белкам теплового шока и способный связывать ионы Zn2+ (он экспрессируется in vivo в кортико-медулярной зоне тимуса после введения крысам дексаметазона), а также RP-2, экспрессирующийся через через 2ч. И кодирующий интегральный мембранный белок. Оба гена не экспрессируются уже через 6ч. после воздействия дексаметазона [Cohen J.J. 1992; Owens G.P., et al 1991]. В другой работе

-йу. показана индукция 13 генов, в том числе Tel, кодирующего плацентарный белок РР-11 (454 аминокислотных остатка) [Baibieri D., et al 1992].

Природа апоптогенных сигналов и их рецепция.

Как уже отмечалось, сейчас общепринятым является мнение, что пусковые сигналы и начальные механизмы развития апоптоза могут быть довольно разнообразными и лишь на определенном этапе они вливаются в единый сигнальный путь, реализующийся в виде стандартного эффекторного механизма. Общепринятая классификация разновидностей апоптоза отсутсвует. Удобно различать их в зависимости от характера сигнализации (табл. 2). Таблица 2

Разновидности апоптоза, различающиеся по происхождению сигнала

Происхождение сигнала; отсутствие сигнала Природа сигнала Примеры

Внеклеточные сигналы Антиген Гормон Цитокин или его аналог Отрицательная селекция тимоцитов, апоптоз при активации через ТСЯ-СОЗ. Гибель клеток при действии глюкокортиковдов. БаБ-зависимый апоптоз; цитолиз, вызванный ФИО, лимфотоксином.

Внутриклеточный сигнал Повреждение хромосом Вызванный УФС облучением апоптоз. Радиационная гибель лимфоцитов в интерфазе. Апоптоз при действии ингибиторов топоизомераз.

Дефицит сигнала Цитокин Корецептор Гибель кроветворных клеток при дефиците цитокинов. Гибель активированных Т-гибридом в отсутствие интерлейкина-3. Апоптоз активируемых Т-клеток в отсутствие С028-зависимого сигнала.

Из таблицы 2 видно, что большинство внешних сигналов, приводящих к развитию апоптоза, являются физиологическими. Их источниками служат глюкокортикоиды [Wu J., et al 1994], антигены или их аналоги (митогены, суперантигены [Jenkinson E.J. et al., 1989], моноклональные антитела к рецепторам лимфоцитов для антигенов - мембранному иммуноглобулину [Norvell A. et al., 1995] или комплексу TCR-CD3 [Smith С.А. et al., 1989], некоторые цитокины (ФНОа, лимфотоксины, интерфероны [Nagata S. 1997]). Очевидно, что характер ответа клеток на них зависит не от природы сигналов, а от сопутствующих обстоятельств (костимуляция или её отсутствие) или особенностей самих клеток (стадия дифференцировки, состояние системы репарации разрывов ДНК).

В то же время описаны индукторный фактор и его рецептор, для которых пока неизвестны иные функции, чем индукция апоптоза. Это - Fas-лиганд (FasL) и Fas-рецептор (Fas, АРО-1, CD95) [Nagata S. 1997, Yonehara LA. et al., 1989]. Перекрестное сшивание мембранного Fas-рецептора с помощью Fas-лиганда или моноклональных антител (МКАТ) приводит к развитию апоптоза клетки-мишени [Trauth B.C. et al., 1989] даже при отсутствии в клетке ядра. Как правило, Fas-индуцированный апоптоз не требует синтеза макромолекул de novo и не зависит от Са2+ [Rouvier Е. et al., 1993]. Пара молекул FasL-Fas структурно и функционально гомологична парам ФНО-ФНО-Р (Р-рецептор), CD40L-CD40, ФРН-ФРН-Р (ФРН-фактор роста нервов). Вторые члены этих рядов относятся к семейству рецепторов ФРН [Nagata S., Golstein P. 1995; Suda Т. et al., 1993]. Для него характерно присутствие во внеклеточных доменах 3 участков, богатых цистеином. Fas имеет 3 гомологичных внеклеточных домена; определённая степень гомологии свойственна цитоплазматическим учаскам Fas и ФНО-Р1. Молекулярная масса Fas составляет 36 кД [Ярилин А. А. 1996]. FasL, как и первые члены других названных пар, представляет собой гомолог ФНОа и может рассматриваться как цитокин, связанный с мембраной. Молекулярная масса мономера FasL составляет 46 кД; в мембране он присутствует в ди- и тримерной форме (соответсвенно 75 и 105 кД) [Hahne М. et al., 1995]. Как и его гомологи, FasL является мембранным белком П типа, т.е. обращён во внеклеточное пространство С-концом [Suda Т. et al., 1993].

Fas экспрессируется на многих типах клеток, причём его экспрессия усиливается при активации клеток, а в некоторых ситуациях через Fas может передаваться активационный сигнал [Nagata S. 1997]. В ряде случаев прослежено изменение экспрессии Fas в процессе дифференцировки клеток (например, тимоцитов), довольно точно соответствующее изменениям их подверженности апоптозу. FasL экспрессируется на более ограниченном числе клеточных типов (в случае Т-клеток - только на активированных формах (Nagata S. 1997]). Следует подчеркнуть, что гомологи Fas и FasL также имеют прямое отношение к апоптозу: ФНОа является наиболее апоптогенным из цитокинов [Hernandez-Caselles Т., Stutman О. 1993], тогда как CD40 воспринимает сигнал от CD40L, способствующий защите активированных В-лимфоцитов от апоптоза [Ярилин А.А. 1996]. Растворимая форма Fas, являющаяся, очевидно, результатом альтернативного сплайсинга, как полагают, конкурентно ослабляет Fas-зависимый апоптоз [Nagata S. 1997].

26

Результаты изучения последствий мутаций генов Fas и FasL, а также их инактивации или, наоборот, трансфекции свидетельствуют о роли Fas-опосредованного апоптоза в элиминации дефектных и «отработавших» клеток и в предупреждении аутоиммунных и лимфопролиферативных процессов.

Если Fas-рецептор является «профессиональным» акцептором апоптогенных сигналов, то в случае других мембранных молекул, способных принимать сигналы к развитию апоптоза, решающая роль принадлежит не им, а внутриклеточным факторам, определяющим «интерпретацию» сигнала. Различный ответ на сигнализацию через рецептор для антигена (TCR-CD3) определяется стадией развития и состоянием Т-клеток: CD4+CD8+ - тимоциты отвечают на неё гибелью [Tateyama М. et al 2000], а зрелые Т-клетки, как правило, - активацией и пролиферацией [Van Wauwe J.P., De Mey J.R., Goossens J.G. 1980; Anderson G., Hare J.K., Jenkinson E.J. 1999]; но при повторной стимуляции активированных Т-клеток или дисбалансе активационных сигналов происходит их гибель вследствие апоптоза [Odaka С., Kizaki Н., Tadakuma Т. 1990] Однако в ряде упомянутых случаев зарегистрирована экспрессия Fas в процессе активации Т-клеток, что даёт основание для утверждений о более универсальной роли этой молекулы в индукции апоптоза [Nagata S. 1997].

Помимо рецепторов, прямо связанных с запуском апоптоза, известны мембранные молекулы, модифицирующие апоптогенный сигнал. Примером молекул, связывание которых способствует развитию апоптоза, служат рецепторные молекулы CD8 и особенно CD4, перекрёстное сшивание которых определяет развитие апоптоза при активации через TCR-CD3 [Mercep М. et al 1988]. Известны также мембранные молекулы, через которые в клетку поступают сигналы, защищающие клетки от активапионного апоптоза. Для В-лимфоцитов такой способностью обладает уже упоминавшаяся молекула CD40 [Tsubata T.et al 1999], для Т-лимфоцитов (по крайней мере в некоторых ситуациях) - CD28 [Groux H.,et al 1993]. В случае CD28 защитный эффект может быть связан с тем, что сигнализация через этот корецептор ответственна за индукцию экспрессии генов цитокинов [Di Renzo М et al 2000] и, следовательно, предохраняет активируемые клетки от дефицита ростовых факторов. Путь, запускаемый через CD40 - молекулу, родственную Fas, очевидно, конкурирует с Fas-зависимым сигналом к развитию апоптоза.

Таким образом, импульс, приводящий к развитию апоптоза, может восприниматься как специализированными акцепторными молекулами, так и рецепторами активационных и регуляторных сигналов. При этом нередки ситуации, когда один и тот же фактор может индуцировать или предотвращать развитие апоптоза.

Внутриклеточные факторы, участвующие в передаче сигналов при развитии апоптоза.

Поскольку апоптоз может быть индуцирован разнообразными факторами и воздействиями, естественно считать, что пути передачи соответствующих сигналов по крайней мере до определённого момента могут быть различными. Конкретно о них известно пока немного. Однако не вызывает сомнений тот факт, что в случае передачи сигнала через рецепторный комплекс TCR-CD3, рецепторы для глюкокортикоидов и цитокинов эти пути в значительной своей части совпадают с нормальными путями передачи сигналов, т.е. апоптоз является процессом, родственным активации и дифференцировке клеток.

Известно, что сигнал, включаемый через рецепторный комплекс TCR-CD3, благодаря активации связанных с ним тирозинкиназ, а затем фосфолипазы С подразделяется на два пути, инициируемые разными продуктами расщепления фосфоинозитолов. Образующийся при этом инозитолтрифосфат обусловливает мобилизацию ионов активацию Са2+/кальмодулинзависимой протеинфосфатазы калыданеврина и в конечном счете - формирование транскрипционного димерного фактора АР-1. Другой инозитид - диацилглицерин - активирует протеинкиназу С и обусловливает включение каскада активации протеинкиназ, завершающегося экспрессией генов c-fos и c-jun и димеризацией их продуктов с формированием другого транскрипционного фактора NF-AT. При участии АР-1 и NF-AT индуцируется экспрессия генов ИЛ-2 и его рецептора, что служит проявлением активации Т-клеток и служит предпосылкой их вступления в митоз. При передаче сигналов от цитокинов, в частности от ФНОа, существенную роль играют каскады реакций, приводящих к формированию транскрипционного фактора NF-kB, активации гена с-тус и ряду других событий. Большинство названных путей и факторов задействованы при развитии апоптоза. Это относится в первую очередь к вариантам апоптоза, запускаемым через рецепторы для антигенов, а также через Fas рецептор.

При некоторых разновидностях апоптоза, например при апоптозе, вызываемом глюкокортикоидами, в его реализации участвует система циклического АМФ. Повышение внутриклеточного уровня цАМФ вследствие активации аденилатциклазы и фосфолипазы А2 или ингибирования фосфодиэстеразы цАМФ может стать сигналом или составляющей сигнала к быстрой фрагментации ДНК и гибели клеток [McConkey D.J. et al 1989]. Эффект цАМФ реализуется через активацию протеинкиназы А. По-видимому, через систему цАМФ реализуют свое апоптогенное действие простагландины Ei и Ег, аденозин, форскалин и ряд других агентов [McConkey D.J., Jondal М., Orrenius S. 1992]. Чрезвычайно важно, что протеинкиназы А и С являются антагонистами в отношении индукции апоптоза, что выражается, например, во взаимном ингибировании апоптогенных эффектов глюкокортикоидов и МКАТ анти-СОЗ [Iwata М, et al 1991,208].

Как и при нормальной активации клеток, сигналы, обусловливающие развитие апоптоза, отличаются большой вариабельностью в отношении использования различных внутриклеточных факторов в зависимости от природы клеток и стадии их развития. Так, при запуске сигнала через TCR-CD3 развитие апоптоза тимоцитов зависит от Са2+, предотвращается циклоспорином А, ингибиторами биосинтеза РНК и белка, но не ингибиторами протеинкиназ, в то время как развитие CD3-зависимого апоптоза зрелых Т-клеток не подавляется хелаторами Са2+, циклоспорином А, блокаторами макромолекулярных синтезов, но зависит от активности протеинкиназ [Green D.R., et al 1992, Peradones C.E., et al 1993].

Пока не изучены уровни и механизмы расхождения путей передачи сигналов к активации и апоптозу. Известны примеры воздействий на направление сигнального пути в сторону развития того или иного процесса. Так, при перекрестном связывании молекулы Ly6 на поверхности тимоцитов применение антисмысловых олигонуклеотидов, блокирующих активность гена с-тус, позволяет избежать развитие апоптоза [Shi Y., et al 1992]. В своих дистальных отделах пути передачи сигнала к активации и апоптозу различаются достаточно четко и могут бьггь зарегистрированы по определенным маркерным признакам. К ним относится, например, экспрессия транскрипционного фактора Nur-77 (он относится к семейству рецепторов для стероидов/ тироксина) при развитии апоптоза, но нё активации [Woronicz J.D., et al 1994]. Предполагается ее связь с индукцией экспрессии на клеточной мембране молекулы Fas.

Ключевые механизмы на поздних этапах передачи сигнала связаны с экспрессией генов и проявлением активности цистеиновых протеиназ семейства ICE (гомолога продукта гена ced-3 дрозофилы), включая протеиназы Nedd-2 (Ich-1) и СРР32 [Steller Н. 1995; Yuan J., et al

1993], а также сериновых протеиназ-гранзимов [Nakajima Н., et al 1995] и цитолизинов. Всем им свойственна редкая специфичность в отношении связи Asp-X [SM L., et al 1992]. Субстратами протеиназ этой группы являются ядерные белки - поли(АОР-рибозо)полимераза, топоизомеразы, ламины и белок Г11 (70 кД) [Voelkel-Johnson С., et al .1995]. Ингибиторы протеиназ указанных типов способны подавлять развитие апоптоза [Sarin А., et al 1993]. Полагают, что эффект этих протеиназ является ключевым для осуществления как относительно ранних (формирование крупных фрагментов ДНК), так и заключительных этапов апоптоза, общих для всех его разновидностей [Steller Н 1995], причем сериновые протеиназы включаются раньше и активируют цисгеиновые протеинкиназы, осуществляя их процессинг.

Другим фактором, претендующим на роль точки конвергенции различных апоптогенных путей, является зависимая от циклинов серин-треониновая киназа p32cdc2 [Bissonnette R.P., et al 1992]. Она вызывает растворение ядерной мембраны и конденсацию хроматина в поздней Gi-фазе. Известно, что циклины и зависящие от них киназы участвуют в осуществлении и регуляции продвижения клеток по циклу. Ингибиторы циклинзависимых протеинкиназ способны предотвращать фрагментацию ДНК и гибель клеток путем блокады их вступления в цикл. Наоборот, фосфорилирование циклинзависимыми киназами ингибиторных белков семейства pRb подавляет их активность и позволяет клетке перейти из фазы Gi в фазу S.

Аналогичную функцию регуляторов выбора клетками, содержащими множественные разрывы ДНК (например, вследствие действия радиации), между вступлением в цикл (с последующей гибелью) и остановкой в фазе Gi выполняют продукты протоонкогенов -ранний акгивационный белок с-тус и онкосупрессор р53 [Lowe S.W. 1999; Steller Н. 1995]. В обычных условиях активации экспрессия с-тус сопутствует выходу клеток в цикл. При удалении ростовых факторов его экспрессия ослабляется и клетка задерживается в фазе Gi. В случае повышенной экспрессии с-тус на фоне устранения ростового фактора клетки входят в S-фазу и подвергаются апоптозу. Полагают, что с-тус обусловливает баланс размножения и гибели клеток при ответе на разного рода стимуляторы [Green D.R., et al 1992]. Как уже отмечалось, ингибирование эффектов гена с-тус с помощью антисмысловых олигонуклеотидов предотвращает акгивационный апоптоз [Shi Y., et al 1992]; в то же время активация гена с-тус не существенна для реализации апоптоза при действии глюкокортикоидов.

Сходную роль играет белок р53, обозначаемый как онкосупрессор [Lowe S.W. 1999]. В норме он выполняет роль отрицательного регулятора пролиферации клеток. Обнаружено, что утрата или мутации его гена приводят к подавлению апоптоза и в то же время - к учащению развития опухолей после действия ионизирующей радиации [Lowe S.W., et al

1994]. Наоборот, трансфекция гена р53 в опухолевые клетки обусловливает их апоптоз (особенно при 32°С) [Yonish-Rouach Е., et al. 1991]. Р53 является транскрипционным фактором, повышенная экспрессия которого репрессирует ряд генов, имеющих отношение к регуляции процесса транскрипции. Среди мишеней р53 - ген WAF1, продукты которого активируют белки семейства pRb, причастные, как отмечено выше, к задержке клеток в фазе Gi. После действия факторов, вызывающих повреждение ДНК (радиация, УФ-излучение, ингибиторы топоизомеразы П), экспрессия р53 в клетках существенно усиливается. Под влиянием р53 клетки, имеющие множественные разрывы ДНК, задерживаются в фазе Gb а если входят в S-фазу (например, в случае опухолевой трансформации), то подвергаются апоптозу: гибель в этом случае может быть предотвращена ИЛ-6 [Lowe SW, et al 1993]. Мутации гена р53 позволяют таким клеткам сохранять жизнеспособность в митозе, что чревато выживанием клеток, подвергшихся опухолевой трансформации; при этом опухолевые клетки оказываются резистентными к лучевой и химиотерапии [Thompson C.B.

1995].

Важным следствием изучения путей передачи сигналов к развитию апоптоза, а также механизмов его реализации является разработка подходов к направленному контролю за этим процессом. Сами представления о природе и механизмах развития и разновидностях апоптоза сформировались в значительной степени благодаря исследованию его чувствительности к действию экзогенных (в отношении клетки) агентов. Часть этих данных суммирована в таблице 3. Изучение факторов, модулирующих развитие апоптоза, может стать основой для разработки подходов к фармакологическому контролю апоптоза, который играет важную роль в развитии многих заболеваний.

Внутриклеточные ингибиторы апоптоза.

Активная природа апоптоза и родство его сигнальных путей активационным, предполагают существование внутриклеточных механизмов ингибирования апоптоза, а также возможность создания подходов к его модификации, в том числе медикаментозной.

Уже упоминалось, что среди генов, контролирующих апоптоз клеток С. elegans, имеется супрессорный ген ced-9, гомолог которого - протоонкоген bcl-2 - имеется у млекопитающих.

31

- . ~ " - - - „"Ai - "- — <

Ген bcl-2 обнаружен при изучении транслокации t (14; 18)(q32-q31) в клетках фолликулярной В-клеточной лимфомы, при которой ген Ъс1-2 перемещается в локус Igh [Tsujimoto Y., et al 1985]. Продукт гена bcl-2 имеет мол. массу 26 кД. Он экспрессируется на мембране митохондрий, в меньшей степени - на поверхности клеток [Hockenbery D.M., et al 1990; Hockenbery D.M., et al.1993]. Из клеток иммунной системы Bcl-2 содержится в юных кроветворных клетках, про-В-лймфоцитах, CD4—CD8— - тимоцитах, зрелых долгоживущих Т- и В-клетках, клетках памяти, но отсутствует на лимфоцитах в период реаранжировки генов антигенраспознающих рецепторов, а также на эффекторных клетках [Boise L.H., et al 1995]. Вне кроветворной и иммунной систем Bcl-2 обнаруживается в быстро делящихся эпителиальных клетках, клетках секреторного эпителия, нейронах [Hockenbery D.M., et al 1990; Hockenbery D.M., et al. 1993].

Таким образом, понятие "апоптоз" объединяет различные варианты смерти клеток, наступающей вследствие передачи в клетку сигнала, который включает или деблокирует предсущесгвующую генетическую программу гибели; апоптоз представляет собой активную гибель клетки, требующую затрат энергии, транскрипции генов и, как правило, синтеза белка de novo.

В зависимости от природы пускового сигнала и начальных событий реализации программы гибели выделяют несколько разновидностей апоптоза. Наиболее распространенные варианты запуска сигналов связаны с воздействием на специализированные рецепторы (Fas, рецепторы для ФНОа, глюкокортикоидов), с дисбалансом активационных сигналов, с нарушением спирализации и целостности ДНК.

Таблица 3.

Влияние ингибнрующнх факторов на различные формы апоптоза

Агент Подавление апоптоза, вызванного . . -V.-—.--."■ ПС ИИ активацией лигандами Fas

Ингибиторы синтеза белка и РНК + + +/-

Циклоспорин А - - + нет данных

Хелаторы Са2+ + + +/-

Соли цинка + + + нет данных

Ингибиторы Са2+, Mg2+ - эндонуклеазы + + + нет данных

Ингибиторы протенкиназы С + + +/-

Ингсбиторы протеиназ + + + +

Экспрессия Вс1-2 +/- нет данных +/- +/

Примечание. ГК - глюкокортикоиды; ИИ - ионизирующие излучения; + наличие ингибирующего действия; - отсутствие ингибирующего действия; +/- наличие или отсутствие эффекта в зависимости от типа реагирующих клеток и других деталей.

В передаче сигнала участвуют внутриклеточные медиаторы, запускаемые через соответствующие рецепторы и участвующие также в нормальной активации клеток. Лишь заключительные этапы передачи сигналов являются, по-видимому, универсальными для всех разновидностей апоптоза. К ним относят активацию сериновых и цистеиновых протеиназ, циклиизависимых протеинкиназ, выбор между вступлением в цикл или в апоптоз.

Важнейшим, но не универсальным механизмом реализации апоптоза является деградация ядерной ДНК, происходящая в несколько этапов с образованием сначала больших, а затем все более мелких фрагментов. Начальный этап - образование крупных фрагментов ДНК -знаменует собой вступление в необратимую фазу апоптоза. Заключительный этап -межнуклеосомная деградация ДНК с формированием фрагментов в 180 п. о. - происходит с участием Са2+ ,Mg2+ - зависимой эндонуклеазы. Её следствием является фрагментация хроматина и ядра. Непосредственной причиной гибели клеток при апоптозе, вероятно, служит истощение пула АТФ, являющееся следствием активации поли(АДФ-рибозо)полимеразы в ответ на повреждение ДНК.

Обязательный признак апоптоза - сморщивание клеток и уплотнение мембран -связывают с активацией трансглутаминазы, которая вызывает перекрестное сшивание мембранных белков. Перестройка фосфолипидной структуры мембран приводит к экспрессии на поверхности клеток детерминантных групп, распознаваемых фагоцитами, что способствует быстрому поглощению ими апоптотических клеток.

Апоптоз при селекции Т-лимфоцитов

Роль апоптоза в развития Т-лимфоцитов, особенно на этапе их созревания в тимусе, изучена достаточно полно. Наблюдения, в которых были отмечены гибель развивающихся клеток в тимусе и чувствительность тимоцитов к действию ионизирующей радиации и глюкокортикоидов, легли в основу учения об апоптозе, а тимоциты стали классическим объектом исследований в этой области.

Еще в 60-х годах установлен факт гибели большей части развивающихся клеток Т-ряда внутри тимуса, и эта гибель позже была квалифицирована как проявление апоптоза [Wu J., et al 1994]. Однако обнаружить в тимусе клетки в состоянии апоптоза трудно по указанной выше причине (быстрое осуществление фагоцитоза этих клеток). Лишь методом nick-трансляции in situ, позволяющим зарегистрировать клетки, содержащие разрывы ДНК, на которые наращиваются меченые олигонуклеотиды (ISEL-мегод), удастся обнаружить мелкие очаги апоптоза преимущественно в коре тимуса [Fehsei К., et al 1994].

Выявлены по меньшей мере две формы апоптоза тимоцитов, одна из которых обусловлена действием глюкокортикоидов или агентов с аналогичным действием [Jondal et. al.,1993], а другая - связыванием рецепторного комплекса TCR-CD3 с антигенами или иными лигандами [Green D.R. 1992]. Первый тип апоптоза имеет отношение к процессу положительной селекции: его «жертвами» становятся клетки, не поддерживаемые отбором, т. е. клоны тимоцитов, рецептор которых не распознает аутологичные молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), а также, вероятно, тимоциты, в которых произошла неудачная реаранжировка генов TCR или комиттирование CD44+- и CD84- субпопуляций, не соответствующее специфичности рецепторов в отношении классов П и I молекул ГКГ [Von Boehmer Н., et al 1994]. Активационный апоптоз, обусловленный связыванием рецептора для антигена, служит основой отрицательной селекции, приводящей к делеции аутореактивных клонов (клеток, распознающих комплекс аутологичного пептида с аутологичными молекулами ПСГ) [Nossal G.J.V. 1994].

Связь положительной селекции с апоптозом изучена неполно. Полагают, что при взаимодействии клонов тимоцитов, несущих рецептор, способный распознать аутологичные

34 i^-i.v?'- - - • - — - ----------\ молекулы ГКГ, экспрессированные на эпителиальных клетках коры тимуса, происходит обмен сигналами, в результате которого тимоциты стимулируются к пролиферации и дифференцировке и избегают апоптоза. Что это означает конкретно, с точностью не установлено. Допускаются две возможности: стимулированные тимоциты становятся нечувствительными к апоптогенному действию глюкокортикоидов, аденозина или иных компонентов внутренней среды тимуса, способных вызвать апоптоз, или в них блокируется эндогенная программа гибели [Cohen J.J. 1992].

В пользу возможной роли глюкокортикоидов в опосредовании гибели тимоцитов, не поддержанных положительной селекцией, свидетельствует то обстоятельство, что уровень этих гормонов в крови на верхнем пике его суточных колебаний соответствует концентрациям, способным вызвать апоптоз тимоцитов (у мышей - около 0,1 мкмоль) [Cohen J. J. 1992]. Кроме того, обнаружено, что предшественник гидрокортизона прегненолон вырабатывается эпителиальными клетками стромы тимуса и его дальнейшие превращения способны обеспечить во внутренней среде тимуса достаточную концентрацию активных форм глюкокортикоидов, которая может вызвать апоптоз тимоцитов [Vacchio M.S. et al 1994]. При введении мышам дексаметазона (или липополисахарида Е. coli) в тимусе с помощью метода nick-трансляции выявляются крупные очаги апоптоза вокруг сосудов, преимущественно в коре [Fehsei К., et al 1994]. ИЛ-2 и ИЛ-4 защищают тимоциты от апоптоза, вызываемого глюкокортикоидами [Migliorati G., et al 1992], однако реализация этого эффекта в тимусе проблематична в связи с низкой локальной концентрацией этих цитокинов. Роль двух других цитокинов, обладающих защитными свойствами, - ИЛ-1 [Migliorati G., et al 1992] и ИЛ-7 [Hernandez-Caselles Т., et al 1993] - более вероятна: они могут вносить вклад в положительную селекцию, защищая тимоциты от гибели, так как вырабатываются эпителиальными клетками, особенно после их контактной активации как раз с теми тимоцитами, которые распознают их мембранные молекулы ГКГ, т. е. подлежат положительной селекции. у-ИФ, наоборот, может вызывать апоптоз тимоцитов: выраженность экспрессии рецепторов этого цитокина коррелирует с интенсивностью апоптоза [Groux Н., et al 1993]. у-ИФ может вырабатываться тимоцитами при контакте с эпителиальными клетками; следовательно, тимоииты, поддерживаемые7 положительным отбором, возможно, способствуют гибели клеток, не поддержанных им.

Установлено, что глюкокортикоиды и антитела к CD3, в отдельности вызывающие апоптоз незрелых тимоцитов, взаимно ингибируют его при совместном действии на клетки

Iwata M., et al 1991; Zacharchuk C.M., et al 1990]. Возможно, это наблюдение проясняет механизм избегания апоптоза, индуцируемого глюкокортикоидами, при положительной селекции. Существенно, что нейтрализация апоптогенных эффектов наблюдается при использовании невысоких концентраций МКАТ анти-СБЗ [Iwata М., et al 1991], что соответствует относительно слабому воздействию эпителиальных клеток на тимоциты из-за низкого уровня экспрессии на их поверхности рецептора TCR-CD3.

В качестве фактора внутренней среды тимуса, способного вызвать апоптоз, могут рассматриваться пуриновые нуклеотиды, накапливающиеся в тимусе в результате массовой гибели тимоцитов: способность вызывать апоптоз показана для аденозина. Важное место в механизме их апоптогенного действия имеет повышение активности поли(АДФ-рибоза)полимеразы [Tanaka J., et al 1994]. Предпосылкой реализации этого эффекта является неспособность CD4+CD8+-thmo4htob инактивировать пуриновые нуклеотиды вследствие слабой активности в них пуриннуклеотидфосфорилазы.

Причиной апоптоза тимоцитов, не поддержанных положительной селекцией, могут быть также их эндогенные особенности, например, высокий уровень нерепарированных однонитевых разрывов ДНК [Williams G.T., Johnstone А.Р. 1983], сопровождающийся индукцией апоптоза с участием фактора р53, сильно экспрессируемого тимоцитами [Lowe S.W. 1999]. При активации лимфоцитов усиливается активность ферментов репарации разрывов ДНК; аналогичного эффекта можно ожидать при распознавании тимоцитами молекул ПОТ при контакте с эпителиальными клетками, и это

Таблица 4

Экспрессия продуктов генов fas и bcl-2 на тимоцитах разной степени зрелости,

Фракция клеток Экспрессия Fas Экспрессия Вс1-2 [182] по данным [10] по данным [36]

Все тимоциты 96,7 76-78 20-35

CD4CD8* 10,4 66-80 25-40 (человека) 65-80 (мыши)

CD4+CD8+ 99,8 79-95 5-10

CD4+CD8" 95,2 48-65 -100

CD4"CD8+ 74,6 40-68 -100

Примечание. Представлен процент клеток тимуса человека, содержащих указанные белки- Данные [Veis D.J., et al 1993] получены на клетках человека и мыши. может рассматриваться с качестве еще одного механизма поддержания жизнеспособности тимоцитов при положительной селекции. Генетические дефекты, возникающие при неудачной реаранжировке генов TCR, по-видимому, также могут вызвать апоптоз клеток по механизму, зависимому от фактора р53.

Другой особенностью СБ4+СБ8+-тимоцитов, делающей эти клетки высокочувствительными к индукции апоптоза, является обнаруженная в них блокада экспрессии a-цепи рецептора для ИЛ-2 [Rothenberg E.V.,et al 1988]. При этом любое активирующее воздействие должно привести к апоптозу вследствие дисбаланса активациюнных сигналов: установлено, что в клетках, поддержанных положительной селекцией, эта блокада устраняется [McConkey DJ., et al 1992dec].

Данные о экспрессии Fas-рецептора и ингибитора апоптоза Вс1-2 на субпопуляциях тимоцитов, представленные в табл. 4, заставляют предположить, что этим факторам принадлежит важная роль в регуляции апоптоза тимоцитов. Действительно, юные CD4+CD8+-THM04HTbi, а также зрелые медуллярные клетки слабо экспрессируют Fas и сильно экспрессируют Вс1-2, тогда как кортикальные CD4+CD8+-Knenoi богаты Fas-рецептором и лишены Bcl-2 [Anel A., et al 1994; Debatin K.M., et al 1994; Veis D.J., et al 1993], что соответствует устойчивости к апоптозу первых и чувствительности последних. У мышей с мутациями 1рг и gld, затрагивающими соответственно гены Fas-рецептора и Fas-лиганда, несколько увеличивается численность С04+С08+-тимоцитов с промежуточной по интенсивности экспрессией рецепторного комплекса TCR-CDS [Sentman С. L., et al 1991], т. е., по-видимому, ослабляется гибель клеток, не поддержанных положительным отбором. Трансфекция гена bcl-2 защищает тимоциты от гибели, вызываемой глюкокортикоидами [Hockenbery D.M., et al. 1990].

Следующий этап развития тимоцитов связан с отрицательной селекцией ауто реактивных (т. е. потенциально аутоагрессивных) клонов, способных распознавать аутологичные пептиды в комплексе с аутологичными продуктами ГКГ. Считается, что в основе отрицательной селекции лежит преимущественно элиминация аутореактивных

37 клонов, тогда как индукции их анергии принадлежит более скромное место [Nossal G.J.V. 1994; Sprent J., Webb S.R. 1995]. Элиминация аутореактивных клонов в процессе развития Т-лимфоцитов Т-ряда в тимусе была первоначально документирована путем регистрации исчезновения клонов тимоцитов, несущих в составе рецептора VP-цепи тех семейств, которые ответственны за распознавание известных аугологичных антигенов - самцового (H-Y), I-E-продуктов ГКГ или эндогенного суперантигена Mls-la [Kappler J.W.,et al 1987; MacDonald H.R., et al 1988]. Вскоре было показано, что элиминация аутореактивных клеток происходит по механизму апоптоза [Sprent J., Webb S.R. 1995].

Возможная связь отрицательной селекции с апоптозом была еще ранее продемонстрирована в опытах с индукцией апоптоза СШ+С08+-тимоцитов МКАТ анти-CD3 in vitro [Smith С.A., et al 1989], а затем также при введении таких антител in vivo [Jenkinson E.J., et al 1989]. Апоптоз тимоцитов под влиянием суперантигена был воспроизведен в органной культуре доли тимуса [Jenkinson E.J., et al 1989]. Подавление активности Са2+, Mg^-зависимой эндонуклеазы аурилтрикарбоновой кислотой приводит к блокаде апоптоза тимоцитов in vitro, a in vivo предотвращает элиминацию V03+-тимоцитов, что рассматривается как признак подавления отрицательной селекции тимоцитов (Mogil R.J., et al 1994].

Приведенные ранее сведения о зависимости развития апоптоза от ионов Са2+ и условиях блокады активности Са2+, М§2+-зависимой эндонуклеазы справедливы в отношении апоптоза тимоцитов в процессе отрицательной селекции. При перекрестном сшивании рецептора в CD4+CD8+-THMomrrax регистрируется подъем внутриклеточной концентрации Са2+ [Lowe S.W.,1994], В то же время оказалось, что для индукции апоптоза этих клеток достаточно действия кальциевого ионофора [Shi Y.F., et al 1989]. Активационный апоптоз CD4+CD8+-thmoiíhtob сопровождается межнуклеосомной деградацией ДНК при участии Са2+-М§2+-зависимой эндонуклеазы, активность которой блокируется хелаторами Са2+, ионами Zn2+, ауринтрикарбоновой кислотой [Green D R. 1992, McConkey D.J., et al 1990]. О роли активации кальциневрина при участии Са2+ и кальмодулина при апоптозе тимоцитов, вызванном МКАТ аши-СБЗ, свидетельствует блокирующий эффект циклоспорина A [Shi Y.F., et al 1989], который в то же время ингибирует процесс отрицательной селекции. Дня реализации этой формы апоптоза, по-видимому, не требуется активации тирозинкиназ (их блокада, по некоторым данным, даже усиливает его [Perandones С.Е., et al 1993] и протеинкиназы С. Согласно другим данным, ингибиторы протеинкиназы С подавляют апоптоз [Migliorati G., et al 1992], Рассматриваемый процесс не зависит от экспрессии транскрипционного фактора NF-AT (c-fos/c-jun) [Iwata М., et al 1991]. В его реализации участвует ядерный транскрипционный фактор Nnr-77 [Liu Z.G., et al 1994]. Для осуществления отрицательной селекции требуются затраты энергии, синтез de novo РНК и белка [D'Adamio L., et al 1992].

Несколько неожиданные результаты были получены при изучении контроля отрицательной селекции тимоцигов со стороны факторов Fas и Вс1-2. Вопреки ожиданиям, у мышей-носителей мутации 1рг и gld, как указывалось выше, затрагивающих гены соответственно Fas-рецептора и Fas-лиганда, а также у трансфектантов по гену bcl-2,

СБЗ-зависимый апоптоз и отрицательная селекция аутореакгивных тимоцигов эффективно осуществляются, хотя и в замедленном темпе [С. L. Sentman, et al 1991; Ong C.J., et al 1994]. В то же время показано, что на СВ4+СБ8+-тимоцитах с выраженной экспрессией рецептора (что соответствует стадии отрицательной селекции) под влиянием МКАТ анти-СБЗ усиливается исходно слабая экспрессия Fas и после этого клетки становятся чувствительными к индукции апоптоза с помощью МКАТ анги-Fas [Drappa J., et al 1993]. По-видимому, Fas-зависимый путь не исчерпывает механизмы, которые вовлекаются в развитие апоптоза при отрицательной селекции тимоцигов [Green D.R. 1992].

Таким образом, апоптоз представляет собой процесс, столь же важный и неотъемлемый от формирования и функционирования иммунной системы, как пролиферация и дифференцировка клеток. Апоптоз является тем механизмом, который обусловливает удаление клеток с трансформированным генетическим потенциалом или неадекватной специфичностью рецепторов. Апоптоз является общебиологическим механизмом, ответственным за поддержание общей численности клеток организма и выбраковку дефектных клеток. Эти особенности апоптоза, а также большое количество эндогенных и экзогенных факторов, которые способны модифицировать его осуществление вплоть до полной блокады или тотального проявления, указывают на то, что этот процесс является одним из ключевых в паталогии человека и животных. Апоптогенность должна учитываться при оценке действия неблагоприятных экологических факторов. Таким образом, проблема апоптоза, давно являющаяся одной из важнейших фундаментальных проблем биологии, приобретает всё более очевидное практическое значение в медицине, экологии и других прикладных науках.

МАТЕРИАЛЫ.

Использовавшиеся в экспериментах реагенты.

Применялись: среда RPMI-1640, эмбриональная сыворотка теленка, Na2HP04, Na2-EDTA, дигатонин, афидиколин, 4-бромфенацилбромид, R24571 (калмидазолиум) производства фирмы «Serva», Германия. Среда Хенкса, HEPES-буфер, антибиотики, циклогексимид, акганомицин Д, 3-аминобензамид, бутилированный щцроксиголуен (ионол), К-ацетип-Ь-цистеин (NAC), нодигидрогуаретшсовая кислота (NDGA) получены от фирмы «Sigma», США 1-(5-изокуинолинесульфонил)-2-мет0лпиперазин, дигидрохлорид (Н-7), тирфостин В46, 4',5,7-тригщфоксишофлавон (генистеин), Н-(2-[Метш1амино]эхш1)-5-изокуинолинесульффонамид (Н-8), форсколин, ВАРТА/АМ, пропщщум иодид, Хекст-33258, производства фирмы «Calbiochem» США.

Клетки

В работе использовали крыс-самцов линии Вистар массой 200 г. Тимоциты вьщеляли и культивировали в среде RPMI-1640 "Serva", содержащей 10% телячьей сыворотки "Serva", 10 мМ HEPES-буфера "Sigma" и набор антибиотиков "Sigma", состоящий из 100 ед/мл пенициллина G, 100 мкг/мл стрептомицина, 200 мкг/мл неомицина. Для получения суспензии клеток животных декапитировали, тимус измельчали и гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера, а затем клетки фильтровали через капроновую сетку с ячейками 50x50 мкм и 20x20 мкм (рис 6). Промывку и смену среды проводили центрифугированием при 100 g. Суспензию тимоцитов облучали УФ-светом на аппарате "Изольда" МД-73М с главным максимумом в области 254 нм в среде Хенкса "Sigma" без фенолового красного. Клетки культивировали в пенициллиновых флаконах в атмосфере 95% 02 и 5% С02 при ЗГС.

АО

Расчёт количества квантов, падающих на клетки при УФС -облучении.

Дозирование УФС-облучения, приходящегося на образцы клеток, достигали цутём изменения: 1) расстояния от облучаемой кюветы до источника УФ-света и 2) времени экспозиции. Точность дозировки определяли экспериментально с помощью радиометра ультрафиолетового УФ-С «Аргус-06» (Россия) и прибора иЪХ-3\У №9853-3(Франция).

Э^веш = 18,09 см2 = 1,8*10э м2 4

На поверхность кюветы в монослой можно поместить 18*10б клеток если принять размер клетки равным 10*1045 м. В наших экспериментах количество УФС - облучаемых за один раз в одной кювете клеток составляло 106. Рассчитаем количество квантов, падающих на одну клетку при дозе УФС облучения 2 Дж/м2.

Энергия одного кванта при X =254*1О*7 см:

254 = <А = 3*Ю10 см*с1 / 254*10"7 см = 1,2*1015с1

Егм = 6,626*10'34*1,2*1015 = 8*10'19 Дж = 8*10"12 эрг

Доза на кювету БОБЕк = 1,8*10'3 м2 * 2 Дж/м2 = З,6*10'3 Дж

Доза на 10е клеток = БС^ЕЛО = 1,8*10*4 Дж = МПО"4 Дж = 1800 эрг

Пкештов на 10б клеток = 1800 эрг / 8*10"12 эрг = 2,25*1014

Таким образом, при дозе УФС облучения 2 Дж/м2 на одну клетку падает

2,25*108 квантов.

Методы измерений.

Проточная цитометрия

Долю клеток, проницаемых для суправитального красителя йодистого пропидия, определяли на проточном цитометре ЛАКС-1 [АГапаяуеу У.М, е1 а1 1993]. Апогоозные клетки в популяции выявляли как клетки с деградированным хроматином. Для этого к 1 мл суспензии клеток в среде RPMI-1640 добавляли 40 мкг/мл дигитонина "Serva", 10 мМ Na2-3flTA "Serva", рН 7.2, 30 мМ цитрат-фосфатного буфера, рН 7.2 и 1 мкг/мл ДНК-специфичного красителя Hoechst-33258 "Calbiochem". Через 15-30 минут инкубирования при 37°С образец анализировали на проточном цитометре. Так как в данных условиях инкубации фрагментированный хроматин экстрагируется из апоптозных клеток, они выявляются на ДНК-гистограммах левее пика Go/Gj (рис. 7), Поскольку ранее было показано, что in vitro тимоциты не фрагментируются на апоптозные тельца [Afanasyev V.N., et al 1993], то все зарегистрированные объекты с содержанием ДНК меньше нормального (левее пика Go/Gi) мы относим к апоптозным клеткам. Флуоресценцию Hoechst-33258 возбуждали излучением с длиной волны 365 нм, а измеряли в области 460-520 нм. Одновренно определялось количество клеток с нарушенной барьерной функцией плазматической мембраны.

1. Изменения в плазматической мембране апоптозных клеток.

К особенностям, отличающим погибшую клетку от живой относятся потеря транспортной функции через мембрану и часто потеря структурной целостности. Ряд подходов по исследованию жизнеспособности клеток были разработаны на основе изменений свойств плазматичееской мембраны. Поскольку интактность мембраны исключает проникновение положительно заряженных красителей, таких как трипановый синий, йодистый пропидий или бромистый этидий, и 7-амино-актиномицинД (7-АМД), короткая инкубация с этими красителями приводит к селективному мечению погибших клеток, в то время как живые клетки показывают минимальное включение красителя [Belloc F., et al 1994; Jacobs D.P., Pipho С. 1983; Lyons А.В., et al 1992; Philpott N.J., et al 1996; Schmid I., 1992; Zamai L., et al 1996]. Исследования, основанные на включении этих флюорохромов широко используются при определении жизнеспособности клеток. Обычно инкубация клеток (5-10мин) в присутствии этих флюорохромов позволяет определить погибшие клетки, как клетки, неспособные исключить краситель (некротические и клетки в поздних стадиях апоптоза, то есть все мертвые клетки по терминологии, предложенной Majno and Joris {[Majno G., Joris I. 1995], рис. (2)}. Тест на включение пропидия часто используется в проточной циометрии как эквивалент теста на включение трипанового синего. Такие исследования можно комбинировать с иммунофенотипическим анализом клеточной поверхности [Riedy М.С., et al 1991; Stewart C.C., Stewart S.J. 1994].

В процесе апоптоза транспортная функция мембраны кратковременно становится дефектной перед полной потерей способности исключать заряженные флюорохромы. Показано, что на этой стадии апоптоза скорость включения некоторых из этих красителей повышается по сравнению с контрольными клетками, и можно отличить популяцию некротических клеток по интенсивному окрашиванию флюорохромом после короткой инкубации с краской, от умеренно окрашенных апоптозных клеток и живых клеток, проявляющих минимальное включение флюорохрома [Belloc F., et al 1994; Lyons A.B., et al 1992; Philpott N.J., et al 1996].

Флюорохром этвдиум моноазид (EMA), как и этидиум или пропидиум иодид, также являются положительно заряженными молекулами и исключаются из живых и ранних апоптозных клеток. Они окрашивают клетки, потерявшие целостность плазматической мембраны, то есть некрозные или клетки в поздних стациях апоптоза, а также механически поврежденные клетки [Riedy М.С., et al 1991]. Эти красители могут фотохимически связываться с нуклеиновыми кислотами при освещении (видимая область спектра). Инкубация клеток с ЕМА и последующим его отмыванием необратимо окрашивает клетки, неспособные исключать краску во время инкубации. Фотохимическое мечение с ЕМА может быть совмешено с иммунофенотипированием [Stewart С.С., Stewart S.J. 1994].

Другой метод исследования целостности мембраны использует нефлюоресцентный субстрат этреразы - флюоресцеин диацетат (FDA). Этот субстрат после поглощения живой клеткой гидролизуется внутриклеточными эстеразами, общими для всех типов клеток [Rotman В., Papermaster B.W. 1996]. Продукт гидролиза, флюоресцеин, высокофлюоресцентная заряженная молекула, оказывается "запертой " в живой клетке. При инкубации клеток в присутствии пропидиум иодида и FDA живые клетки окрашиваются флюоресцеином в зеленый цвет, а мертвые клетки - пропидием в красный. Этот надежный метод широко используется в проточной цитометрии [Darzynkiewicz Z., et al 1994].

Другой ДНК-флюорохром, HoecHSt 33342 (HÖ342), в отличие от пропидия не выбрасьшается живыми или апоптозными клетками. Было обнаружено, что короткая экспозиция клеток с малыми концентрациями Н0342 ведет к прочному окрашиванию апоптозных клеток [Belloc F., et al 1994; Chrest F.J., et al 1993; Dive С., et al 1992]. Живые клетки, с другой стороны, требуют более длительной инкубации Н0342 чтобы получить сравнимую интенсивность флюоресценции. Суправитальное включение Н0342 сочетают с включением пропидия (чтобы определить некрозные клетки и клетки в поздних стадиях апоптоза) и анализом клеточного светорассеяния [Belloc F., et al 1994; Onnerod M.G., Sun X.-M., et al 1992]. Флюорохром HoecHSt 258 имеет преимущество в стабильности флюоресценции по сравнению с Н0342 [Echaniz Р., et al 1995]. Другие красители, например, SYTO-16 и LCS-751, могут также быть использованы для определения апоптозных клеток по тому же принципу как и Н0342, что позволяет выбирать флюорохромы с разными спектрами возбуждения и эмиссии [Frey Т. 1995]. Комбинация мечения клеток с Н0342 и 7-АМД позволяет отличить некрозные клетк от апоптозных и использовать поверхностное фенотипирование [Phüpott N.J., et al 1996; SchmidT. 1992].

Степень изменения проницаемости плазматичской мембраны для заряженных и незаряженых флюорохромов варьирует в зависимости от стадии апоптоза, типа клеток, способа индукции апоптоза (например, повреждение ДНК или взаимодействие с Fas рецептором). Таким образом, оптимальные условия для определения апоптозных клеток (концентрация флюорохрома, температура и время инкубации, часто ионный состав инкубационной среды) могут значительно варьировать для различных клеточных систем. Поэтому, проводя эксперименты, всегда необходимо проверять условия для различных клеточных систем, чтобы достичь максимального разделения апоптозных клеток от живых и/или некротических.

В живых клетках фосфолипиды плазматической мембраны распределены ассимметрично между ее наружной и внутренней поверхностями. Так, фосфатидилхолин и сфингомиелин располагаются на внешней стороне липидного бислоя, а фосфатидилсерин на внутренней [Fadok V.A., et al 1992]. Недавно было показано, что потеря ассимметрии фосфолипидов, ведущая к появлению фосфотидилсерина на внешней стороне мембраны, является ранним событием при апоптозе (Fadok V.A., et al 1992; Koopman G., et al 1994]. Антиоксидант аннексин-5 примущественно связывается с отрицательно заряженными фосфолипидами, такими как фосфотидилсерин. Коньюгат аннексина-5 и флюоресцеина можно использовать как маркер для определения апоптозных клеток методом проточной цитометрии [Castedo М., et al 1996; Koopman G., et al 1994]. Апоптозные клетки можно определить с помощью аннексина-5 после конденсации хроматина, но до потери плазматической мембраной способности исключать пропидий. Таким образом, путем окрашивания клеток комбинацией флюоресцирующего аннексина-5 и пропидия, можно определить неапоптозные живые клетки (аннексин-5 негативные и негативные по попидию), клетки на ранних стадиях апоптоза (позитивные по аннексину-5 и негативные по пропидию) и клетки на поздней стадии апоптоза (позитивные по пропидию) методом проточной цитометрии pCoopman G., et al 1994].

2. Измерение содержания ДНК.

Фрагментация ДНК, будучи характерным признаком апоптоза, является основой для развития новых цитометрических подходов к определению апопозных клеток. Для определения фрагментации ДНК часто используют подход, основанный на вымывании фрагментов ДНК с низким молекулярным весом при окрашивании клеток. Содержание ДНК в клетках измеряется вслед за пермеабилизацией клеток с помощью детергентов (дигитонин) или фиксации преципитирующими агентами, такими как спирт или ацетон. Пермеабилизация клеток или спиртовая фиксация не полностью предотвращают вытекание деградированой ДНК из апоптозных клеток во время отмывания и окрашивания. Как следствие этого, содержание ДНК в апоптозных клетках уменьшается, и, таким образом, эти клетки можно распознать при окрашивании клеточной ДНК, как клетки, у которых ДНК окрашивается в меньшей степени, чем у клеток в Gi-фазе ("sub-Gi"mne) [Elstein К.Н., et al 1995; Elstein K.H., et al 1994; Nicoletti I., et al 1991; Umansky S.R., et al 1981].

Степень деградации ДНК варьирует в зависимости от стадии апоптоза, типа клеток и часто от природы агента, индуцирующего апоптоз. Степень вымывания ДНК во время процедуры окрашивания (а следовательно, разделение живых и апоптозных клеток этим методом), также варьирует. Отмечено, что добавление высокомолярного фосфатцитратного буфера к рабочему раствору увеличивает вымываниее деградированной ДНК [Gong J., et al 1994]. Этот подход может быть использован для контроля во время вымывания ДНК из апоптозных клеток, чтобы достичь желаемого уровня отделения апоптозных клеток методом проточной цитометрии [Gong J., et al 1994].

Поскольку определение содержания ДНК обеспечивает информацию о фазе клеточного цикла неапоптозных ¡клеток, этот подход может быть использован для исследования специфики клеточного цикла апоптоза. Другие преимущества этого подхода -простота и возможность использовать любой ДНК-флюорохром или прибор. Сочетание измерений ДНК и РНК, которое позволяет идентифицировать клетки в фазе Go, дает возможность определять, происходит ли апоптоз преимущественно в клетках Gi или Go [Bruno S., et al 1992]. Ограничением этого метода является низкая специфичность определения апоптоза. В sub-Gj пик могут попадать, помимо апоптозных клеток, механически поврежденные клетки, клетки с низким содеержанием ДНК (часто образцы содержат популяции клеток, различающиеся по ДНК-индексу), или клетки с различной структурой хроматина (клетки эритроидного ростка), в которых ДНК менее досягаема для флюорохрома [Castedo М., et al 1996]. Существует подход, использующий лизис нефиксированных клеток в гипотоническом растворе, в результате чего изолируется множество ядерных фрагментов. Число "sub-Gi" клеток при такой обработке отражает число ядерных фрагментов и не дает информации о числе апоптозных клеток. Более того, помимо ядерных фрагментов, индивидуальне хромосомы, выделяющиеся из митотических клеток, обломки клеток и микроядра могут быть ошибочно приняты за апоптозные клетки, особенно при определении содержания ДНК в логарифмическом масштабе.

Измерения концентрации внутриклеточного кальция.

Измерения концентрации внутриклеточного кальция осуществляли с помощью проточного флуориметра JLAKC-1 (1) на одиночной клетке и с помощью спектрофлуориметра (2) на суспензии клеток.

1. Проточный флуориметр ЛАКС-1.

Свежевыделенные клетки, находящиеся в полной среде для культивирования ИРМ-1640 рН 7.2 разделяли на три равные порции (рис. 8). Первую порцию разделяли на аликвоты по 1 мл и нагружали 1Ж)0-1 АМ в концентрации 1 мкМ в течение 40 мин. при 37°С. Затем клетки переводили в среду Непкз рН 7.2 и подвергали УФ-облучению. Измерения флуоресценции клеток, нагруженных Ш1Ю-1 АМ проводили до УФ-облучения в среде КРМ1-1640, до УФ-облучения в среде НепкБ рН 7.2, после УФ-облучения в среде НепЬз рН 7.2. и среде КРМ1-1640 (рис. 8). Со второй порцией клеток осуществляли те же операции что и с первой, но нагружали клетки ВД1Ю-1 АМ непосредственно за 40 мин. до измерений. Третью порцию клеток нагружали ШВО-1 АМ и культивировали в полной среде для культивирования ЯРМ-1640 рН 7.2 (рис. 8).

2. Спектрофлуориметр СФР-1.

Клетки нагружали ИЖА-2 АМ в течение 30 мин при 37° С. Затем клетки дважды отмывали от остатков краски. В процессе измерений образцы были термостатированны при 37° С. Измерения [Са24]{ проводили непосредственно перед облучением свежевыделенных клеток, сразу после облучения ультрафиолетом и через некоторое время культивирования.

Результаты и их обсуждение.

На рис. 9 приведена кинетика гибели тимоцитов крысы под действием УФС. В каждой пробе параллельно измерялся процент клеток с деградированной ДНК (апоптозных тимоцитов) и процент клеток, проницаемых для бромистого этидия. У контрольных клеток (кривая 4) наблюдается непрерывное увеличение доли погибших клеток по обоим критериям. Несмотря на несколько различную динамику накопления апоптозных тимоцитов для доз 2 и 50 Дж/м2 видно, что к 48-му часу культивирования количество погибших клеток одинаково. Во всех трех случаях доля проницаемых клеток меньше доли клеток с деградированной ДНК, что является характерной закономерностью апоптоза, когда упорядоченная межнуклеосомная фрагментация хроматина предшествует нарушению барьерной функции плазматической мембраны [Магш'еу е1 а!.,1986]. Для дозы 200 Дж/м2 (кривая 3), количество клеток с деградированной ДНК достигает стационарного уровня начиная с 6-го часа, а процент проницаемых клеток постоянно растет, причем с 24-го часа он превышает долю клеток с фрагментированным хроматином.

Таким образом, при больших дозах УФС часть тимоцитов не могут реализовать программу апоптоза и впоследствии погибают по некротическому типу. Интересно отметить, что при дозе 2 Дж/м2 к 32 часу погибает больше клеток, чем при дозе УФС 200 Дж/м2, но меньше, чем при 50 Дж/м2. Таким образом, не наблюдается монотонной зависимости между дозой облучения и количеством погибших клеток. Как видно из рис. 9а, к 30-му часу культивирования практически все УФС-облученные клетки, способные реализовать апоптоз, погибают. Таким образом можно корректно снять дозовую кривую, т.к. исключается влияние разной скорости гибели при разных дозах воздействия на определение конечного числа погибших клеток. На рис. 10 представлены графики зависимости гибели тимоцитов от дозы УФС-облучения. Количество клеток с деградированной ДНК остается на уровне контроля (необлученные тимоциты) до дозы 1 Дж/м2 , далее возрастает и достигает максимума в районе 20 Дж/м2, а затем убывает вплоть до уровня контроля. На рисунке 11 приведены гистограммы распределения популяций клеток по б

Рис. 9. Процент клеток с деградированной ДНК (а) и проницаемых для бромистого этидия (б) в зависимости от времени после УФС облучения. Тимоциты, облученные УФС в дозе: 1-2 Дж/м2

2 - 50 Дж/м2

3 - 200 Дж/м2

4 - тимоциты без дополнительных воздействий

0,6 1 3 6 10 20 3040 60 120 260 540

Доза УФС, Дис/м2

Рис 10. Дозовая зависимость гибели тимоцитов через 30 ч после УФС-облучения. По оси абсцисс - доза облучения, Дж/м2. По оси ординат- доля клеток, %:

1-е деградированной ДНК 2 - проницаемых для бромистого этидия содержанию ДНК, полученные после 30 часов культивирования облученых ультрафиолетом клеток в дозах 20, 70 и 400 20 Дж/м2. На самой правой гистограмме (отметка 0) показаны необлученные контрольные клетки. Видно, что при дозе 20 Дж/м2 количество клеток с деградированным хроматином наибольшее. При дозе 400 Дж/м2 процентное соотношение клеток с нормальным набором ДНК к клеткам с деградированным хроматином практически не отличается от того же показателя для контрольного необлученного образца (отметка 0).

Анализ проницаемости тимоцитов для бромистого этидия показывает, что доля проницаемых для него клеток ниже, чем доля клеток, с деградированной ДНК вплоть до 100 Дж/м2. В этом диапазоне процентное содержание проницаемых для бромистого этидия клеток колеблется таким же образом, как и доля клеток, с деградированной ДНК. Для более высоких доз к 30-му часу проницаемых клеток больше, чем апоптозных (см. рис. 9).

Исследование способности мембранных и цитоплазматических антиоксидантов предотвращать УФС- вызванный апоптоз тимоцитов крысы.

Известно, что УФС облучение нативных клеток приводит к окислительному стрессу [Зенков, 1999]. УФС, цитокины, стероидные гормоны и другие соединения, индуцирующие апоптоз, стимулируют продукцию клетками активных форм кислорода или снижают содержание клеточных антиоксидантов, что приводит к повреждению ДНК, нарушению функций митохондрий и изменению липидного состава мембран в результате активации радикальных окислительных процессов [Скулачёв, 1998; Зенков, 1999].

Для того, чтобы выяснить, каким образом УФС вызывает окислительный стресс в тимоцитах крыс, были использованы два различных антиоксиданта. Первый, Н-ацетил-Ь-цистеин (NAC), широко применяется в медицине, обладает антимутагенными и антиканцерогенными качествами, которые могут быть обусловлены множественными защитными механизмами, такими как антиоксидантная активность, способность выступать в роли предшественника внутриклеточного глютатиона, способность модулировать детоксикацию и процесс репарации ДНК [van Zandwijk, 1995]. Второй, ионол, (бутилированный гидрокситолуен), -фенол, содержащий липофильный перехватчик свободных радикалов кислорода, способен предотвращать перекисное окисление липидов [Shertger, 1991].

Действие NAC было исследовано в широком диапапазоне концентраций, от 2мкМ до 2мМ. NAC не вызывая роста неспецифической проницаемости плазматической мембраны тимоцитов во всем исследованном диапазоне концентраций, что контролировалось по прокрашиванию клеток суправитальным красителем пропидиум йодидом. Наиболее эффективной оказалась концентрация 2 мМ. Как видно из рис. 12, присутствие 1 мМ NAC в среде инкубации клеток снижало количество апоптозных тимоцитов, облученных УФС, хотя менее выраженная зависимость гибели клеток от дозы УФС сохранялась. NAC в концентрации 2 мМ практически полностью предотвращал гибель клеток, вызванную УФС. Важно, что количество погибших необлученных клеток в контроле (точка 0 Дж/м2) и в присутствии NAC практически одинаково. Видно, что NAC в концентрации 2 мМ даже незначительно снижал гибель необлученных клеток.

Полученные данные свидетельствуют о том, что окислительный стресс играет ключевую роль в реализации апоптоза тимоцитами крыс при УФС облучении. Результаты по действию ультрафиолета хорошо согласуются с данными других авторов,

58

ЩШё которые использовали иные индукторы апоптоза тимоцитов, полагая, что окисление GSH в результате продукции в клетках активных форм кислорода является ранним событием в апоптозе [Macho, 1996]. Известно, что обработка тимоцитов глюкокортикоидами приводит к Гфодукции активных форм кислорода и истощению восстановленного глютатиона [Fernandez, 1995]. Fernandez и соавторы показали, что NAC предотвращает развитие апоптоза тимоцитов, вызванное глюкокортикоидными гормонами. Было сделано предположение, что окислительный стресс является ключевым компонентом эффекторного пути апоптоза в тимоцитах крыс, вызванным обработкой глюкокортикоидами. Опираясь на данные Fernandez и соавторов, можно предположить, что в случае УФС облучения NAC ингибирует апоптоз тимоцитов за счет предотвращения истощения внутриклеточного глютатиона и/или поддержания его на необходимом физиологическом уровне.

Другой использованный нами антиоксид ант, - ионол, в диапазоне концентраций от 5 до 30 мкМ не оказывал сколько-нибудь заметного влияния на зависимость гибели клеток от дозы УФС облучения (данные не приводятся). В указанных концентрациях ионол не вызывал изменений неспецифической проницаемости цитоплазматической мембраны клеток. Эти данные не согласуются с данными Салю и соавт., согласно которым ионол способен защищать тимоциты крысы от окислительного стресса и апоптоза, вызванных сильным окислителем пероксинитритом (индуктор однонитевых разрывов ДНК) [Salgo, 1996]. Возможно, наблюдаемая нами неспособность ионола предотвращать апоптоз, вызываемый УФС связана с природой агента, вызывающего внутриклеточный окислительный стресс. Вероятно, перекисное окисление липидов при УФС облучении тимоцитов in vitro не играет существенной роли в запуске и реализации апоптоза.

Исследование роля поли(АДФ-рибозо) полимеразы (ПАРИ) и эксцизионной репарации ДНК.

В литературе известно, что индукция различных клеток к апоптозу сопровождается протеолитическим расщеплением ПКС и ПАРП. Брас и соавторы [Bras et al., 1997]. на А20 линии клеток исследовали механизмы, которые модулируют Fas-опосредованный путь апоптоза через В клеточный рецептор клетки. Было выявлено, что Fas- сигнализация активизирует цистеиновые протеазы, что ведет к специфическому расщеплению ПАРП и ПКС дельта. Другими авторами показано, что вызванное церамидом (липидным медиатором TNF-индуцированного апоптоза) межнуклеосомное расщепление ДНК совпадает во времени с протеолитическим расщеплением ПАРП и ПКС дельта [Kojima, Datta, 1996], Известно, что 1 -бета-арабиносульфанозалцнтозин (ага-С) вызванный апоптоз человеческих миелоидных клеток лейкемии (U-937) также связан с протеолитическим расщеплением ПАРП и ПКС дельта [Datta et al, 1996]. Расщепление ПАРП в последнем случае очевидно было опосредовано протеазой СРР32, которая, как известно, расщепляет ПАРП в различных клетках, и её расщепление начинается вскоре после индукции клеток к апоптозу [Куцый, 1999].

В связи с вышеизложенным мы также решили исследовать возможность участия ПАРП в УФС-вызванном апоптозе тимоцитов крысы. Большинство исследователей связывают физиологическую функцию ПАРП с восстановлением повреждений ДНК, однако её точная роль в защите клеток от повреждений ДНК всё ещё не определена точно.

Известно, что одной из мишеней УФС в клетке является ДНК. Возникшие в геноме поврёждения индуцируют ответ со стороны клетки, который включает в себя три типа реакции: задержку прохождения по циклу, репарацию ДНК и гибель клетки по механизму апоптоза. Считается, что эксцизионная репарация является основным механизмом ликвидации вызванных УФС повреждений ДНК. Различают два основных пути эксцизионной репарации: ЭРО, которая устраняет одиночные поврежденные основания, и ЭРН, осуществляющую «расчистку» повреждения внутри олигомера длиной 25-32 нуклеотидов. Их механизм в общих чертах известен [Wood, 1996]. Считается, что УФС-облучение клеток млекопитающих приводит к образованию фотопродуктов (в основном, циклобутановых пиримидиновых димеров и 6-4 фотопродуктов), которые затем удаляются из ДНК главным образом с помощью эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН) [Wood, 1996, Molinete et al.,1993]. ЭРН в клетках млекопитающих чувствительна к афидиколину, специфическому ингибитору дельта- и эпсилон-полимераз [Wood, 1996; Михайлов, 1998; Burgers, 1998; Satoh, 1993].

ЭРО сопровождается образованием открытых одиночных разрывов ДНК. Фермент ПАРП имеет высокое сродство к разрывам цепей ДНК и активируется при связывании с ними [de Murcia et al., 1995]. Если фермент не освобождается с ДНК, то ЭРО ингибируется [Molinete et al:,1993]. Подавить диссоциацию ПАРП с ДНК (а, следовательно, и ЭРО) можно с помощью специфичного ингибитора каталитического центра ПАРП-3-аминобензамида (3-АМБ) [Lindahl et al.,1995].

Мы исследовали влияние ингибитора дельта- и эпсилон-полимераз афидиколина и ингибитора ПАРП 3-АМБ на индукцию и подавление апоптоза тимоцитов крысы под действием коротковолнового ультрафиолета. Были также использованы ингибиторы синтеза белка и РНК- циклогексимид и актиномицин Д, соответственно, с целью выяснить, нуждаются ли вышеназванные процессы в синтезе белков efe «ovo.

Влияние афидиколина, ингибитора дельта- и эпсилон- ДНК полимераз.

Нами показано, что дозы УФС от 1 до 10 Дж/м2 вызывают апоптоз тимоцитов, достигая максимума при 10 Дж/м2. Как уже отмечалось ранее, основные повреждения, вызываемые УФС, репарируются по пути ЭРН, который чувствителен к афидиколину. В концентрации 1 мкг/мл присутствие афидиколина в среде культивирования облученных клеток не приводило к достоверным различиям по отношению к контролю (данные не приводятся). В концентрации 2.5 мкг/мл (Рис. 13) наблюдалось незначительное (10%) увеличение количества погибших клеток при дозах УФС до 10 Дж/м2. Добавка афидиколина в среду культивирования облученных клеток в концентрации 10 мкг/мл (Рис. 13) приводила к значительному увеличению количества клеток с деградированной ДНК при дозах УФС до 10 Дж/м2. В концентрации 10 мкг/мл афидиколин вызывал дополнительную гибель необлученных клеток (точка 0 Дж/м2). Эффект угнетения апоптоза тимоцитов более высокими дозами (10 -500 Дж/м2) УФС в присутствии афидиколина сохранялся: то есть ингибирование ЭРН с помощью афидиколина не отменяло действия доз УФС от 10 до 500 Дж/м2, угнетающих апоптоз тимоцитов. Вероятно, при указанных дозах УФС-облучения клетки наряду с эксцизионной репарацией нуклеотидов задействуют и другой путь репарации полученных повреждений ДНК, например эксцизионную репарацию оснований (ЭРО).

Действие З-аминобензамида (ингибитора ПАРП).

Считается, что 3-АМБ является ингибитором ЭРО, и имеется небольшая доля повреждений, вызываемых УФС- облучением -пиримидиновые гидраты, которые репарируются ЭРО (Зай)!! е1 и -,-1-1-1—|-1—Í—г-1-1-1—г

О 0,6 1 3 6 10 20 30 40 60 120 260540

Доза УФ, Дж/м2

Рис. 14 Дозовая зависимость гибели тимоцитов крысы после УФС облучения в присутствии 3-аминобензамида.

1 - контроль

2 - 3-аминобензамид 1мМ al.,1993; Hjertvik et aL, 1998]. 3-аминобезамид является конкурентным ингибитором поли(АДФ-рибозо) полимеразы. ПАРП активируется в ответ не только на агенты, непосредственно индуцирующие разрывы, - ионизирующее излучение [Lindahl et al.,1995], активные кислородные радикалы и NO [Heller et al.,1995], ингибиторы топоизомераз [Negri et al.,1993; Bamardi et al.,1995], но и при действии коротковолнового ультрафиолетового облучения [Cleaver et al.,1991] и алкилирующих соединений [Satoh et al.,1993], для которых характерно образование временного разрыва в результате репаративного вырезания первичного повреждения.

Возникновение однонитевых разрывов ДНК в ходе репарации оснований активирует ПАРП, которая временно скрепляет свободные концы цепи в промежутке между действием АП- эндонуклеаз и бета-ДНК полимеразы [Lindahl et al.,1995]. Ингибирование аутомодификации 3-аминобензамидом приводит к невозможности диссоциации ПАРП с ДНК и появлению i таким образом долгоживущих однонитевых разрывов. Возможно, что появление таких долгоживущих разрывов является сигналом к запуску апоптоза в тимоцитах. Мы наблюдали, что присутствие 3- АМБ (Рис. 14) в среде культивирования шмоцитов не влияло на запуск апоптоза под действием низких доз УФС (часть кривой от 0.6 до 10 Дж/м2), но отменяло ингибирующее апоптоз действие ультрафиолета (дозы более 20 Дж/м2). Видно, что при дозах более 10 Дж/м2 почти все клетки реализовывали апоптоз, в то время как гибель контрольных клеток убывала с ростом дозы УФС. Эти данные позволяют предположить, что процесс подавления апоптоза шмоцитов крысы ультрафиолетом С в дозах более 10 Дж/м2 требует активного статуса ПАРП. Вероятно, в этом диапазоне доз ПАРП активируется и её активность сопряжена с механизмом ЭРО. Такой высокий порог активации ПАРП может быть связан с тем, что имеется лишь небольшая доля повреждений, вызываемых УФС-облучением, которые репарируются ЭРО.

На основании вышеизложенного можно предположить, что наблюдавшаяся в наших экспериментах способность 3-АМБ отменять ингибирующее апоптоз тимоцитов действие доз УФС более 20 Дж/м2 связана с тем, что ЭРО является жизненно необходимой для клеток, что хорошо согласуется с представлениями других исследователей [Wood, 1996].

Как уже отмечалось, ПАРП является конститутивным ферментом, представленным в ядре в большом количестве копий [Lindahl et al.,1995]. То есть для активации ПАРП по-видимому не требуется индукция соответствующих генов и синтез белка de novo. Мы проверили, подавляют ли ингибиторы синтеза РНК (актиномицин Д) и белка (цюслогексимид) эффект снижения количества апоптозных клеток в ответ на увеличение дозы УФС.

Действие ингибиторов синтеза белка и макромолекул.

При изучении значения синтеза макромолекул для УФС-индуцированного апоптоза тимоциты облучали УФС и переводили в среду RPMI, содержащую либо ингибитор синтеза белка -циклогексимид, либо ингибитор синтеза мРНК - актиномицин Д. Ингибиторы присутствовали в культуральной среде в ходе всего эксперимента (30 ч.). На рис. 15 видно, что сами ингибиторы вызывали дополнительную гибель необлученных клеток (точка 0 Дж/м2), что хорошо согласуется с литературными данными [Martin et al.,1990]. Видно, что в присутствии ингибиторов количество апоптозных клеток оставалось на уровне гибели необлученных тимоцитов до дозы 20 Дж/м2. Таким образом, и актиномицин Д^и циклогексимид предотвращали индукцию апоптоза тимоцитов, поскольку подавлялась транскрипция и трансляция соответствующих генов [Тронов, 1999]. Тем не менее, ингибирование апоптоза большими дозами УФС сохранялось, подтверждая предположение, что оно осуществляется предсуществующими факторами. Следует отметить, что УФС подавлял также апоптоз, вызванный действием самих ингибиторов.

Было сделано предположение, что эффект ингибитора трансляции на апоптоз тимоцитов является неспецифическим и вызывает задержку в развитии апоптоза, а не предотвращение его [Chow et al.,1995]. Мы получили кинетические кривые гибели облученных УФС тимоцитов крысы в присутствии циклогексимида, однако не наблюдали задержки в развитии апоптоза тимоцитов, которая могла бы быть обусловлена ингибитором (данные не приводятся).

Таким образом, в случае УФС- вызванного апоптоза присутствие циклогексимида, вероятно, предотвращает, а не задерживает развитие апоптоза. Интересно, что ни циклогексимид, ни актиномицин Д не оказывали влияния на механизм ингибирования апоптоза тимоцитов высокими дозами УФС. Следует отметить, что УФС подавлял также апоптоз, вызванный действием самих ингибиторов.

Таким образом, и актиномицин Д и циклогексимид предотвращали индукцию апоптоза тимоцитов, поскольку подавляли транскрипцию и трансляцию соответствующих генов [Тронов, 1999]. Тем не менее, ингибирование апоптоза большими дозами УФС сохранялось, подтверждая предположение, что оно осуществляется предсуществующими факторами, в число которых, по нашему предположению^ может входить ПАРП.

Исследование роли внутриклеточных протеинкиназ.

В 1992г. Девари с сотр. [Devaiy Y et al, 1992] показали,что в клетках HeLa S3 одним из первых регистрируемых событий после УФС-облучения (254 нм, 40 Дж/м2) является активация Src тирозиновых киназ, которая приводила в конечном счете к активации транскрипционного фактора АР-1 и окислительному стрессу. Ингибиторы тирозиновых протеин киназ (генистеин и тарфостин) блокировали этот УФС-ответ HeLa клеток. Поэтому нам представлялось целесообразным выяснить, не является ли активация тирозиновых киназ необходимой стадией в УФС-ответе тимоцитов. Для этого клетки предварительно инкубировали с генистеином (74 мкМ) или тирфостином В46 (5, 10, 20 и 35 мкМ), затем облучали в разных дозах и исследовали клеточную гибель. Как показали эксперименты, ингибиторы тирозиновых киназ не оказывали существенного влияния ни на индукцию, ни на подавление апоптоза в тимоцитах ультрафиолетовым облучением (Рис. 16). Отсюда можно предположить, что в тимоцитах крыс активация тирозиновых протеинкиназ вероятно не является инициирующим событием в УФС -ответе.

Важно отметить, что генистеин также является ингибитором сАМФ-зависимой протеин киназы А (ПКА) и Са2+/фосфолипид зависимой изоформы протеин киназы С [Akiyama Т. etal., 1987]. Чтобы проверить возможное участие сАМФ - зависимой протеин киназы А в УФС-ответе тимоцитов мы использовали активатор ПКА форсколин [Halvorson M.J., Coligan J.E.,1995], ингибитор зависящих от циклических нуклеотидов киназ Н8 [Hagiwara М. et al 1987] и неспецифический ингибитор ПКА - генистеин (см. выше). Однако в присутствии перечисленных соединений количество погибающих к 30-му часу культивирования клеток не отличалось от контрольных образцов (данные не приводятся). Таким образом, полученные экспериментальные данные противоречат предположению об участии ПКА в УФС- ответе тимоцитов крысы.

Известно, что протеин киназа С (ПКС) является важным элементом сигнальных путей, задействованных при апопгозе [Harkin et aL, 1998]. Ингибитор ПКС Н-7 [Slukvin, JerreBs ,1995; Лонская и др., 1997] способен ингибировать апоптоз тимоцитов, вызванный различными апоптогенными воздействиями [Sakurai et al, 1997; Shao et al, 1995]. Sakurai с соавторами показали, что Н-7 способен также вызывать апоптоз тимоцитов мыши в дозозависимой манере. Было сделано предположение, что с индукцией и реализацией апоптоза тимоцитов связана активность определенной изоформы ПКС [Sakurai et al, 1997]. Мы исследовали влияние Н-7 в диапазоне концентраций 10-50 мкМ на апоптоз тимоцитов крысы, вызванный УФС. Оптимальной оказалась концентрация 50 мкМ (рис. 17). Видно что, инкубация необлученных тимоцитов (0 Дж/м2) с высокой концентрацией Н-7 приводит к дополнительной гибели части клеток (-20%), что хорошо согласуется с литературными данными [Sakurai et al, 1997]. Поэтому кривая дозовой зависимости в присутствии Н-7 приподнята над контрольным уровнем числа погибших к 30-му часу культивирования клеток. Ингибитор Н-7 должен постоянно находиться в среде инкубации, т.к. отмывка от него в первые часы после облучения отменяет его ингибирующее действие (данные не приводятся). Предварительная инкубация клеток с Н-7 также не требуется - ингибитор можно добавлять в инкубационную среду через 20-30 мин. после облучения. Это указывает на относительно позднюю активацию протеинкиназы С в ответ на УФС-облучение. Следует обратить внимание на то, что Н-7 ингибирует как индукцию, так и подавление апоптоза, т.е. клетки ведут себя так как будто "не знают", что облучены (рис. 17). Это свидетельствует о том, что протеинкиназа С стоит в самом начале цепи регуляции запуска УФС-ответа тимоцитов.

Предварительная активация и фосфолипид-зависимой формы протеинкиназы С с помощью форбол миристат ацетата (РМА) [Michie et.al., 1998] за 15 мин., 9 ч. и 14 ч. перед облучением вызывала лишь 10-20% дополнительное увеличение гибели клеток, но не меняла характер ответа (рис. 17).

Исследование роли фосфолипазы А2, циклооксигеназы и липоксигеназы.

Активация протеинкиназы С может происходить через активацию фосфолипазы А2 и образование лизоформ липидов, арахидоновой кислоты и ее метаболитов, которые прямо влияют на протеинкиназу С [Asaoka Y et al, 1992; Hug H and Sarre F,]. В свою очередь, способность УФС активировать фосфолипазу А2 в некоторых типах клеток хорошо известна [DeLeo, 1985]. В связи с этим мы решили проверить участие ключевых ферментов метаболизма арахидоновой кислоты в исследуемом процессе. В качестве ингибитора фосфолипазы А2 был выбран 4-бромфенацил бромид (ВРВ). Оказалось, что концентрации ВРВ от 3.3 мкМ и выше вызывают быстрый рост неспецифической проницаемости плазматической мембраны при отсутствии упорядоченной деградации ДНК (то есть типичный некроз клеток). В то же время, в диапазоне доз 0.1-2.0 мкМ ВРВ оказался не токсичным, однако не оказывал влияния на УФС-ответ тимоцитов (Рис. 18).

Запуск многих физиологических процессов, в том числе, активация лимфоцитов, сопровождается усилением продукции арахидоновой кислоты, образующейся в результате активации липаз: фосфолипазы А2 или совместного действия фосфолипазы С и диацилглицероллипазы. Известно, что экзогенное добавление от 4 до 10 мкМ арахидоновой кислоты (АА) к тимоцитам крысы обратимо повышает в них концентрацию внутриклеточного кальция. В нашей модели мы стимулировали клетки с помощью АА в указанных выше дозах непосредсвенно перед УФ облучением или сразу после. При этом количество клеток, погибающих к 30 часу по типу апоптоза, не отличалось от контрольного. Это значит, что вся добавленная АА утилизировалась тимоцигами. Присутствие АА в среде культивирования также не изменяло дозозависимого характера табели тимоцитов под действием УФ (рис. 19).

Свободная арахидоновая кислота, образующаяся при действии фосфолипазы А2, далее может окисляться с участием ферментов циклооксигеназы, липоксигеназы. Чтобы блокировать образование метаболитов арахидоновой кислота, мы использовали индометацин, как ингибитор циклооксигеназы, и нордигидрогуаретиковую кислоту (ТМГЮА), как ингибитор липоксигеназ. Индометацин применяли в дозах 1-30 мкМ, а ЖЮА в дозах 5-20 мкМ. Индометацин не оказывал никакого действия на поведение клеток после облучения. №ЮА в концентрации 20 мкМ повышал (~10%) гибель клеток в контроле и на столько же снижал ингибирующий эффект высоких доз УФС. Меньшие концентрации таким действием не обладали. Как показал анализ кривых проницаемости плазматической мембраны, для суправитального красителя пропидиум иодида такой эффект №ЮА можно объяснить его токсичностью (данные не приводятся). Полученные результаты позволяют предположить, что ключевые ферменты метаболизма арахидоновой кислоты не участвуют в УФС-ответе тимоцитов.

Изучение роли внутриклеточного Са2+.

Кальций, как важнейший регуляторный ион, участвует в инициации и реализации апоптоза, вызванного глюкокортикоидами, анти-СОЗ антителами и некоторыми другими агентами [МсСопкеу Ш, Оггешш £>, 1997]. Вход Са2+ в клетку сам по себе способен вызвать апоптоз, а изменение его внутриклеточной концентрации сопровождает некоторые стадии апоптоза, такие как активация протеинкиназ, фосфолипаз, эндонуклеаз, протеаз и других биохимических процессов. Естественно, что вопрос об участии ионов кальция являлся одним из главных в раскрытии механизма УФС-ответа тимоцитов. Мы провели исследования по блокированию

Доза УФ, Дж/м2

Рис. 20 Дозовая зависимость гибели тимоцитов крыс в контроле и в присутсвии ВАРТА-АМ. 1 - контроль 2-ВАРТА-АМ20 мкМ передачи кальциевого сигнала внутри клетки. Тимоциты предварительно нагружали 20 мкМ препарата В APT А/AM, который, проникая в клетку и подвергаясь действию эстераз, превращается в активный кальциевый хелатор. Далее клетки облучали и сравнивали уровень апоптоза с контрольным образцом. ВАРТА не изменял ответ тимоцитов на УФ-облучение (Рис. 20).

Поскольку во многих случаях кальций в клетке функционирует в комплексе с калмодулином, мы использовали ингибитор калмодулина R24571, чтобы блокировать калмодулин - зависимый сигнал. Были протестированы четыре концентрации R24571 - 0.145, 0.435, 1.45, и 2.90 мкМ. Концентрации 1.45 мкМ и выше вызывали быстрый некроз тимоцитов, а более низкие концентрации оказались не эффективными - зависимости не отличались от контрольных (данные не приводятся). Таким образом, ответ тимоцитов на УФС отличается от глюкокортикоид-стамулированного апоптоза, когда внутриклеточное хелатирование кальция и блокирование калмодулина предотвращало деградацию ДНК и гибель клеток [McConkey DJ et al, 1989]. Непосредственные измерения изменений концентрации внутриклеточного кальция ([Са2+ ];) осуществляли с помощью проточного флуориметра JIAKC-1 на одиночной клетке и с помощью спектрофлуориметра на суспензии клеток. Клетки окрашивали FURA-2 AM в течение 30 мин при 37° С. В процессе измерений образцы были термостатированны при 37° G Измерения [Са2+ 1 проводили непосредственно перед облучением свежевыделенных клеток, сразу после облучения ультрафиолетом С и в течение первых 6 часов культивирования. Изменений [Са2+ ]ь вызванных УФС, зафиксировано не было (данные не приводятся). Таким образом, можно предположить, что, по крайней мере, на начальных этапах индукции апоптоза ультрафиолетом, Са2+ не требуется. На рис. 22 обобщены полученные в работе результаты в виде схемы. Из наших экспериментальных данных, полученных с применением антиоксндантов, следует, что УФС облучение тимоцитов приводит к

Таблица 5.

Действие различных соединений на УФС-вызванную индукцию и подавление апоптоза тимоцитов крысы.

Агент Ингабирование/предотвращение УФС-вызванной индукции апоптоза тимоцитов подавления апоптоза тимоцитов

Ы-ацетил-Ь-цистеин + +

Ионол -

Афидшсолин +

3-аминобензамид - +

Циклогексимид + +

Актиномицин Д + +

Н7 + +

H 8 -

PMA -/+

Генистеин -

Тирфостин В46 -

Вромфенацилбромид -

Индометацин -

Нордагадрогуаретико вая кислота -

Арахидоновая кислота -

ВАРТА-АМ -

R24571 - окислительному стрессу (рис. 22). На роль эффекторного фермента, активирующегося при окислительном стрессе и способного запустить каскад каспаз, мы предположили протеин киназу С (ПКС) (рис. 22). Далее, согласно литературным данным [Копнин 2000]у происходит активация ряда каспаз, осуществляющих расщепление соответствующих субстратов.

Согласно приведенным выше экспериментальным данным,мы разделили пути, ведущие к индукции апоптоза (с привлечением механизма эксцизионной репарации нуклеотидов - ЭРН) и подавлению апоптоза (с привлечением механизма эксцизионной репараций оснований - ЭЮ и связанного, по-видимому, с активностью поли (АДФ-рибозо)полимеразы - ПАРП) в зависимости от дозы УФС - облучения. Согласно Тронову [Тронов, 1999], конкуренция процессов апоптоза и репарации является особенностью предапоптической фазы клетки, и преобладание того или иного процесса определяет дальнейшую судьбу клетки (рис. 22);

Выводы.

В результате исследования действия различных ингибиторов на процессы индукции и подавления апоптоза тимоцитов разными дозами УФС показано, что:

1. Антиоксидант Ы-ацетил-Ь-цистеин, синтетический предшественник внутриклеточного глутатитона, предотвращал развитие УФС стимулированного апоптоза тамоцитов крысы за счет поддержания необходимого уровня глютатиона в клетках.

2. Ингибитор перекисного окисления липидов - содержащий фенолы антиоксидант ионол - не влиял на активацию апоптоза, вызванного УФС, что может свидетельствовать о несущественной роли перекисного окисления липидов in vitro в запуске и реализации апоптоза.

3. 3- аминобензамид, ингибитор поли(АДФ-рибозо) полимеразы (ПАРП) и эксцизионной репарации оснований (ЭРО), снимал эффект ингибировант УФС при дозах облучения более 10 Дж/м2, увеличивая количество погибших к 30-му часу культивирования клеток до максимума. Таким образом, процесс подавления апоптоза тамоцитов УФС-облучением связан с активацией ПАРП и эксцизионной репарации оснований.

4. Афидиколин, ингибитор полимераз дельта и эпсилон и эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН) не оказывал влияния на гибель клеток при дозах УФС облучения более 10 Дж/м2, однако вызывал практически полную гибель необлученных клеток и клеток, облученных дозами УФС до 10 Дж/м2. Таким образом, процесс индукции апоптоза тамоцитов УФС-облучением связан с ингибированием полимераз дельта и эпсилон и эксцизионной репарации нуклеотидов.

5. Ингибиторы синтеза белка и РНК цредотвращали индукцию апоптоза, вызванного малыми и средними дозами УФС, но не

81 отменяли ингибирующее апоптоз действие высоких доз УФС. Таким образом, процесс индукции апоптоза тимоцитов требует синтеза белка de novo.

6. Ингибитор протеинкиназы С (ПКС) Н-7 предотвращал индукцию и подавление апоптоза тимоцитов крысы УФС. Таким образом, ПКС-зависимое фосфорилирование является необходимым условием индукции и подавления УФС-вызванного апоптоза тимоцитов крысы. Ингибиторы тирозиновых киназ генистеин и тирфостин В46 не влияли на зависимость апоптоза тимоцитов от дозы УФС. Таким образом, тирозиновые киназы не вовлечены в процессы индукции и подавления апоптоза тимоцитов, вызванным УФС.

7. Не было зафиксировано изменений концентрации внутриклеточного кальция, вызванных УФС. Можно предположить, что, по крайней мере на начальных этапах индукции апоптоза ультрафиолетом, Са2+ не требуется.

8. Таким образом, в результате проведённых исследований показано, что при облучении in vitro тимоцитов крыс ультрафиолетом С происходит индукция апоптоза при дозах до 10 Дж/м 2; дозы более 10 Дж/м 2 угнетают реализацию апоптоза. Предложен ранее не известный эффекторный механизм действия ультрафиолета С на тимоциты крыс.

Литература.

1. Adams J.M., Cory S. 1998. The bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science. V.281. P. 1322-1326.

2. Afanas'ev V.N., Korol' B.A, Mantsygin Yu.A., Nelipovich P.A, Pechatuikov V.A Flow cytometiy and biochemical analysis of DNA degradation characteristic of two types of cell death. EBBS Lett 1986. V.194. P.347.

3. Afanasyev V.N., Korol B.A., Matylevich N.P., Pechatnikov V.A., Umansky S.R. The use of flow cytometiy for the investigation of cell death. Cytometry. 1993. V.14. P.603.

4. Alnemri E.S., Litwack G. Glucocorticoid-induced lymphocytolysis is not mediated by an induced endonuclease. J. Biol. Chem. 1989 Mar 5;V.264(7) P.4104-11.

5. Anel A. Buferne M.5 Boyer C., Schmitt-Verhulst AM, Golstein P. T cell receptor-induced Fas ligand expression in cytotoxic T lymphocyte clones is blocked by protein tyrosine kinase inhibitors and cyclosporin A. Eur. J. Immunol. 1994 Oct; V. 24(10) P. 2469-2507.

6. Barbieri D., Troiano L., Giassilli E., Agnesini C., Cristofalo E.A., Monti D., Capri M, Cossarizza A., Franceschi C. Inhibition of apoptosis by zinc: a reappraisal. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992 Sep 30; V. 187(3) P. 1256-1261.

7. Barnardi R., Negri C., Douzelli M, Guano F., Torti M., Prosperi E., Scovassi A.T. 1995. Activation of poly(ADP-ribose) polymerase in apoptotic human cells. Biochimie. V.77 P.378-384.

8. Barnardi R., Negri C., Douzelli M, Guano F., Torti M., Prosperi E., Scovassi A.T. 1995. Activation of poly(ADP-ribose) polymerase in apoptotic human cells. Biochimie. V.77 P. 378-384.

9. Baughman G., Lesley J., Trotter J., Hyman R., Bourgeois S. Tcl-30, a new T cell-specific gene expressed in immature glucocorticoid-sensitive thymocytes. J. Immunol. 1992 Sep IV. 149(5) P. 1488-96.

10.Benjamin R.C., Gill D.M. Poly(ADP-ribose) synthesis in vitro programmed by damaged DNA J.Biol. Chem. 1980 V. 255 P. 1049310506.

1 l.Bissormette R.P., Echeverri F., Mahboubi A., Green D.R. Apoptotic cell death induced by c-myc is inhibited by bcl-2. Nature. 1992 Oct 8; V. 359(6395) P. 552-554.

12.Brown D.G., Sun X.M., Cohen G.M. Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol. Chem. 1993 Feb 15;V.268(5) P. 3037-9.

13.Burgers P.M.J. Eukaiyotic DNA polymerases in DNA replication and DNA repair. Chromosoma, 1998, V. 107 P. 218-227.

14.Burgoyne L.A., Hewish D.R., Mobbs J. Mammalian chromatin substructure studies with the calcium-magnesium endonuclease and two-dimensional polyaciylamide-gel electrophoresis. Biochem. J. 1974 Oct; V. 143(1) P.67-72.

15.L. Sentman, J. R. Shutter, D. Hockenbeiy, O. Kanagawa, and S. J. Korsmeyer. bcl-2 Inhibits Multiple Forms of Apoptosis But Not Negative Selection In Thymocytes. Cell. 1991. V. 67. P. 879-888.

16.CarsonD.A, Seto S., WassonDJB., Carrera C.J. DNA strand breaks, NAD metabolism, and programmed cell death. Exp. Cell. Res. 1986 Jun;V. 164(2) P.273-81.

17.Chao D.T., Korsmeyer S.J. BCL-2 family: regulators of cell death. Annu. Rev. Immunol. 1998. V. 16 P. 395-419.

18.Cleaver J., Morgan W.F. 1991 Poly(ADP-ribose) polymerase: a perplexing participant in cellular responses to DNA beakages. Mutat. Res. V.257P.1-18.

19.Cleaver J., Morgan W.F. 1991. Poly(ADP-ribose) polymerase: a perplexing participant in cellular responses to DNA breakages. Mutat. Rss. V.257. P. 1-18.

20.Cohen G.M., Sun XM,, Snowden R.T., Ormerod M.G, DinsdaJe D. Identification of a transitional preapoptotic population of thymocytes. J. Immunol. 1993 Jul 15 V.151(2) P.566-74.

21.Cohen J.J. Glucocorticoid-induced apoptosis in the thymus. Semin Immunol 1992 Dec; V.4(6) P.363-9.

22.Cohen JJ.,Duke R.C. Glucocorticoid activation of calcium dependent endonuclease in thymocyte nuclei leads to cell death. J.Immunol., V. 132 P. 38-42,1984

23.Cotter T.G., Glynn J.M., Echeverri F. Green D.R. The induction of apoptosis by chemotherapeutic agents occurs in all phases of the cell cycle. Anticancer Res. 1992May-Jun;12(3):773-9.

24.Dar2ynkiewicz Z., Juan G., Li X., Gorczyca W., Murakami T., Traganos F. Cytometry in cell necrobiology: analysis of apoptosis and accidental cell death (necrosis). Cytometry. 1997 Jan 1; V. 27(1) P. 120.

25.Debatin K.M., Suss D., Krammer P.H. Differential expression of APO-1 on human thymocytes: implications for negative selection? Eur. J. Immunol. 1994 Mar; V. 24(3) P. 753-758.

26.Di Renzo M., Zhou Z.} George I., Becker K., Cunningham-Rundles C. Enhanced apoptosis of T cells in common variable immunodeficiency (CVID): role of defective CD28 co-stimulation. Clin, Exp. Immunol. 2000 Jun; V. 120(3) P. 503-511.

27.Ellis RE., Yuan J.Y., Horvitz H.R Mechanisms and functions of cell death. Annu. Rev. Cell. Biol. 1991. V. 7 P. 663-698.

28.Fadok VA, Voelker DR, Cammpbell PA, Cohen JJ, Bratton DL, Henson PM. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol V. 148, P.2207-2216,1992.

29.Fernandez A., Kiefer J., Fosdick L., McConkey D. J. Oxygen radical production and thiol depletion are required for Ca(2+)-mediated endogenous endonuclease activation in apoptotic thymocytes. J. Immunol. - 1995. - Vol. 155, N. 11 - P. 5133-5139.

30.Fesus L. Apoptosis fashions T and B cell repertoire. Immunol. Lett 1991 Nov;30(3):277-82.

31.Gaido M.L., Cidlowski J.A. Identification, purification, and characterization of a calcium-dependent endonuclease (NUC18) from apoptotic rat thymocytes. NUC18 is not histone H2B. J. Biol. Chem. 1991 Oct 5; V.266(28):18580-5.

32.Golstein P., Ojcius D.M., Ding-E Young. "Cell mechanisms and the immune system." Immunol Rev 121:29-65,1994. Proc. Nat. Acad. Sci. USA.

33.Gottschalk AR., Boise L.H., Thompson C.B., Quintains J. Identification of immunosuppressant-induced apoptosis in a murine B-cell line and its prevention by bcl-x but not bcl-2. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Jul 19;91(15):7350-4. V. 91. P. 7350-7354.

34.GreenD.R-1998. Apoptosis pathways: the road to ruin. Cell. V.94. P.695-698.

35.Green D.R., Bissonn R.P., Glinn J.M., Sen Y. Activation-induced apoptosis in lymphoid systems. Semin. Immunol. 1992 V.4 P. 379-388.

36.Groux H., Monte D., Plouvier B., Capron A., Ameisen J.C. CD3-mediated apoptosis of human medullary thymocytes and activated peripheral T cells: respective roles of interleukin-1, interleukin-2, interferon-gamma and accessory cells. Eur. J. Immunol. 1993 Jul; V. 23(7) P. 1623-1629.

37.Hahne M., Peitsch M.C., Iimler M., Schroter M., Lowin B., Rousseau M., Bron C., Renno T., French L., Tschopp J. Characterization of the non-functional Fas ligand of gld mice. Int. Immunol. 1995 Sep; V. 7(9) P. 1381-1386.

38.Hansen R., Oren M. 1997. P53; from inductive signal to cellular effect. Curr. Opia Genet Develop. V.7 P.46-51.

39.Heller B., Wang Z.-Q., Wagner E.R., Radous J., Burkle A., Fensel K., BurkatV., Kolb H. 1995. Inactivation of the poly(ADP-ribose) polymerase gene affects oxigen radical and nitric oxide toxicity in islet cells. J. Biol. Chem. V.270 P.11176-11180.

40.Heller B., Wang Z.-Q., WagYDi E.F., Radous J., Burkle A., Fehsel K., Burkat V., Kolb H. 1995. Inactivation of the poly(ADP-ribose) polymerase gene affects oxigen radical and nitric oxide in islet cells. J.Biol.Chem. V.270 P.11176-11180.

41.HengartnerM0., Horvitz H.R. C. elegans cell survival gene ced-9 encodes a functional homolog of the mammalian proto-oncogene bcl-2. Cell. 1994 Feb 25; V. 76(4) P. 665-676.

42.Hemandez-Caselles T., Stutman O. Immune functions of tumor necrosis factor. I. Tumor necrosis factor induces apoptosis of mouse thymocytes and can also stimulate or inhibit IL-6-induced proliferation depending on the concentration of mitogenic costimulation. J. Immunol. 1993 Oct 15; V. 151(8) P. 3999-4012.

43.Hewish D.R., Burgoyne L.A. Chromatin sub-structure. The digestion of chromatin DNA at regularly spaced sites by a nuclear deoxyribonuclease. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973 May 15; V.52(2) P.504-10.

44.Hochstrasser M. 1998. There is the rub: a novel ubiquitin-like modification linked to cell cycle regulatioa Genes Develop. V.12 P.901-907.

45.Hockenbery D.M, Nunez G., Millman C., Schreiber R.D., Korsmeyer S.J Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death. Nature. 1990 V. 348 P. 334-336.

46iwata M., Hanaoka S. Sato K. Rescue of thymocytes and T cell hybridomas from glucocorticoid-induced apoptosis by stimulation via the T cell receptor/CD3 complex: a possible in vitro model for positive selection of the T cell repertoire. Eur. J. Immunol. 1991 V. 21(3) P. 643-648.

47JacobsonM.D., Burane J.F., Raff MC. Programmed cell death and bcl-2 protection in the absence of a nucleus. EMBO J. 1994. V. 13 P. 1899-1910.

48.Jenkinson E.J., Kingston R., Smith C.A., Williams G.T., Owen J.J. Antigen-induced apoptosis in developing T cells: a mechanism for negative selection of the T cell receptor repertoire. Eur. J. Immunol. 1989 Nov; V. 19(11) P. 2175-2177.

49.Johnstone A.P., Williams G.T. Role of DNA breaks and ADP-ribosil transferase activity in eucaryotic differetiation demonstrated in human lymphocytes. Immunol. Today. 1983 V.4 P. 8-9.

50.Jones D.P., McConkey D.J., Nicotera P., Orrenius S. Calcium-activated DNA fragmentation in rat liver nuclei. J. Biol. Chem. 1989 Apr 15; V.264(l 1) P.6398-6403.

51.Kappler J.W., Roehm N., Marrack P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 1987 Apr 24; V.49(2) P.273-280.

52.Kizaki H., Tadakuma T., Odaka C., Muramatsu J.,Ishimura Y. Activation of a suiside process of thymocytes through DNA fragmentation by calcium ionofores and forbol esters. J.Immunol. 1989. V. 143 P. 1710-1794.

53.Knippschild U.} Oren M., Deppert W. 1996. Abrogation of wild-type p53 protein impairs the G1 chekpoint after DNA damage. Mol. Cell. Biol. V. 16 P. 1126-1137.

54.Labeznik Y. A.s Kaufman S. H., Desnoyers S., Poirier G. G., Farnshaw W. C. 1994. Cleveage of poly(ADP-ribose) polymerase by proteinase with properties like ICE. Nature. V.376 P.346-347.

55.Le Rhun Y., Kirkland J. B., Shah G. M. 1998. Cellular responses to DNA damage in the absence of poly(ADP-ribose) polymerase. Biochem. Biophys. Res. Commen. V.245 P. 1-10.

56.Lindahl T. SatohM.S., Poirier G.G., and KlunglandA. Post-translational modification of poly(ADP-ribose) polymerase induced by DNA strand breaks. TIBS 1995 V.20,10 P.405-411.

57.Lindahl T., Satoh M.S., Poirier G.G., and KlunglandA.// Post-translational modification of poly(ADP-ribose) polymerase induced by DNA strand breaks. TIBS 1995 Vol.20, P.405-411.

58.Liu Z.G., Smith S.W., McLaughlin K.A., Schwartz L.M., Osborne B.A. Apoptopic signals delivered through the T-cell receptor of a T-cell hybrid require the immediate early gene nur77. Nature. 1994 V.367 P.281-284.

59.Lowe S.W. Activation of p53 by oncogenes. Endocr. Relat Cancer. 1999 Mar; V.6(l) P.45-48. ;

60.Lowe S.W., Bodis S., McClatchey A., Remington L., Ruley H.E., Fisher D.E., Housman D.E., Jacks T. p53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo. Science 1994 Nov 4;V.266(5186) P.807-10. il

61.Lunee J. Introductory review: Involvement of ADP-ribosilation in cellular recovery from some forms of DNA damage. Br. J. Cancer. 19S4. V.49 P. 13-19.

62.Lynda!l D., Weinret T. 1996. From DNA damage to cell cycle arrest and cuicide: a budding yeast perspective. Curr. Opin. Genet. Develop. V.6P.4-11.

63.MacDonald H.R., Howe R.C., Pedrazzini T., Lees R.K., Budd RC., Schneider R., Liao N.S., Zinkernagel R.M., Louis J.A., Raulet D.H., et al. T-cell lineages, repertoire selection and tolerance induction. Immunol. Rev. 1988 Aug; Y.104 P. 157-182.

64.Macho A., Hirsch T., Marzo I., Marchetti P., Dallaporta B., Susin S.A., Zamzami N., Kroemer G. Glutation depletion is an early and calcium elevation is a late event of thymocyte apoptosis. J. Immunol. - 1997. Vol.158, N. 10. -P.4612-4619.

65.Macho A., Hirsch T., Marzo I., Marchetti P., Dallaporta B., Susin S.A., Zamzami N., Kroemer G. Glutation depletion is an early and calcium elevation is a late event of thymocyte apoptosis. J. Immunol., 1997,

V. 158(10), P.4612-4619.

66.Martin S.J., Cotter T.G. Ultraviolet B irradiation of human leukaemia HL-60 cells in vitro induced apoptosis. Int. J. Radiat. Biol. 1991. V.59. P. 1001.

67.Martin S.J., Lennon S.V., Bonham A.M., Cotter T.G. Induction of apoptosis (programmed cell death) in human leukemic HL-60 cells by inhibition of RNA or protein synthesis. J. Immunol. 1990 Sep 15;

V. 145(6) P. 1859-67.

68.Martin S.J., Newmeyler D.D., Mathias S., Farschon D.M, Wang H.G., Reed J.C., Kolesnick RN., Green D.R Cell-free reconstruction of Fas-, UV radiation- and ceramide- induced apoptosis. The EMBO J. 1995. V.14. D.5191.

69.McConkey D. J., Hartzell P., Amador-Perez J.F., Orrenius S., Jondal M Calcium-dependent killing of immature thymocytes by stimulation via the CD3/T cell receptor complex. J. Immunol. 1989 Sep 15;V. 143(6) P. 1801-6.

S9

70.McCohkey DJ., Hartzell P., Nicotera P., Orrenius S. Calcium-activated DNA fragmentation kills immature thymocytes. FASEB J. 1989 May;V.3(7)P. 1843-9.

71.McConkey DJ., Jondal M., Orrenius S. Cellular signaling in thymocyte apoptosis. Semin. Immunol. 1992 Dec; V.4(6) P.371-7.

72.McConkey DJ, Nikotera P, Hartzell P, Bellomo G, Wyllie AH, Orrenius S. Glucocorticoids activate a suicide process in thymocytes through an elevation of cytosolic Ca2+ concentration. Arch Biochem Biophys, 1989, V.269(l) P.365-370.

73.McGregor W.G. DNA repair, DNA replication and UV mutagenesis. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 1999 Sep;4(l):l-5.

74.Mercep M., Bomfacino J.S., Garcia-Morales P., Samelson L.E., Klausner R.D., Ashwell J.D. T cell CD3-zeta eta heterodimer expression and coupling to phosphoinositide hydrolysis. Science. 1988 Oct 28; V. 242(4878) P. 571-574.

75.Migliorati G., Pagliacci C., Moraca R., Crocicchio F., Nicoletti I., Riccardi C. Interleukins modulate glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis. Int. J. Clin. Lab. Res. 1992; V. 21(4) P.300-303.

76.Mogil R.J., Shi Y., Bissonnette R.P., Bromley P., Yamaguchi I., Green D.R. Role of DNA fragmentation in T cell activation-induced apoptosis in vitro and in vivo. J. Immunol. 1994 Feb 15; V. 152(4)

P. 1674-1683.

77.Molinete M., Vermeulen W., Burkle A., Menissier-de Mureia J., Kupper J.H., Hoeijmakers J. H. J. and de Murcia G. Overproduction of the poly(ADP-ribose) polymerase DNA-binding domain blocks alkylation-induced DNA repair synthesis in mammalian cells. 1993, EMBO J., V.12, P.2109-2117.

78.Montague J.W., Gaido ML., Frye C., Cidlowski J.A. A calcium-dependent nuclease from apoptotic rat thymocytes is homologous with cyclophilin. Recombinant cyclophilins A, B, and C have nuclease activity. J. Biol. Chem. 1994 Jul 22; V.269(29) P.18877-80.

79.Murgia M, Pizzo P., Sandona D., Zanovello P., Rizzuto R, Di Virgilio F. Mitochondrial DNA is not fragmented during apoptosis. J Biol Chem 1992 Jun 5; V.267(16) P. 10939-41.

80.Nagata S. 1997. Apoptosis by death factor. Cell. V. 88. P. 355-365.

81.Nagata S., Golstein P. The Fas death factor. Science. 1995 Mar 10; V.267(5203) P. 1449-56.

82.Nakajima H., Park H.L., Henkart P.A J. Synergistic roles of granzymes A and B in mediating target cell death by rat basophilic leukemia mast cell tumors also expressing cytolysin/perforin. Exp. Med. 1995 Mar 1; V. 181(3) P. 1037-46.

83.Nakajima H., Park H.L., Henkart P.A. J. Synergistic roles of granzymes A and B in mediating target cell death by rat basophilic leukemia mast cell tumors also expressing cytolysin/perforin. Exp. Med. 1995 Mar 1; V. 181(3) P. 1037-1046.

84 .Negri C., Bernardi R., Brachetti A., Ricotti G. G. B., Scovassi A.L. 1993. Effect therapeutic drug VP-16 on poly(ADP-ribosylation) in apoptotic HeLa cells. Carcinogenesis. V. 14 P.2559-2564. S5.Negri C., 3POnardi R, Brachetti A., Ricotti G. G. B.5 Scovassi A.L. 1993. Effect therapeutic drug VP-16 on poly(ADP-ribosylation) in apoptotic HeLa cells. Carcinogenesis. V.14 P.2559-2564.

86.NelipovichP.A.,NikonovaL.V.,Umansky S.R Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase as a possible reason for activation of Ca2+/Mg2+-dependent endonuclease in thymocyte of irradiated rats. lnt.J.Radiat.Biol. 1988 V. 53 P. 749-758.

87.Newell M.K., HaughnLJ., Maroun C.R., Julius M.H. Death of mature T cells by separate ligation öf CD4 and the T-cell receptor for antigen. Nature. 1990 Sep 20; V. 347(6290) P. 286-289.

88.Norvell A., Mandik L., Monroe J.G. Engagement of the antigen-receptor on immature murine B lymphocytes results in death by apoptosis. J. Immunol. 1995 May 1;V. 154(9) P.4404-4413.

89.Nossal G.J.V. Negative selection of lymphocytes. 1994. Cell. V.76. P.229-239.

9i

90.Nunez G., Benedict M.A., Hu Y., Inohara N. 1998. Caspases: the proteases of the apoptotic pathway. Oncogene. V. 17(25) p.3237-3245. 91.0daka C., Kizaki H., Tadakuma T. T cell receptor-mediated DNA fragmentation and cell death in T cell hybridomas. J. Immunol. 1990 V.144P.2096-2101. 92.0nishi Y., Azuma Y., Sato Y., Mizuno Y., Tadakuma T., Kizaki H. Topoisomerase inhibitors induce apoptosis in thymocytes. Biochim. Biophys. Acta. 1993 Jan 17; V. 1175(2) P. 147-54. 93.Owens G.P., Hahn W.E., Cohen J.J. Identification of mRNAs associated with programmed cell death in immature thymocytes. Mol. Cell. Biol. 1991 Aug; V.l 1(8) P.4177-4188.

94.Perandones C.E., Ulera V.A., Peckham D., Stunz L.L., Ashman R.F. Regulation of apoptosis in vitro in mature murine spleen T cells. J. Immunol. 1993 Oct 1;V. 151(7) P. 521-3529.

95.Pourzand C eta!., Apoptosis, the role of oxidative stress and the example of solar UV radiation.//Photochem Photobiol. 1999 oct; V. 70(4) P. 380-90.

96.Quignon F., de Bels F., Koken M., Feunteun J., Ameisen J.C., de The H. 1998. Nat. Genet. V.20 P. 259-265.

97.Raff M.C. Social controls on cell survival and cell death. Nature 1992 Apr 2; V. 356(6368) P. 397-400.

98.Ratan R.R., Murphy T.H., Baraban J.M. Macromolecular synthesis inhibitors prevent oxidative stress-induced apoptosis in embryonic cortical neurons by shunting cysteine from protein synthesis to glutathione. J. Neurosci. 1994 Jul; V. 14(7) P. 4385-92. 99 Reed J.C. 1998. Oncogene. V.17. P.3225-3236. lOO.Rehemtulla A., Hamilton C.A., Chinnaiyan A.M. J. Biol. Chem. 1997

V.272 (41). P.25783-25786. 101 Rodriguez-Tarduchy G., Lopez-Rivas A. Phorbol esters inhibit apoptosis in IL-2-dependent T lymphocytes. Biochem Biophys. Res. Commun. 1989 Nov 15;164(3):1069-75.

102.Rothenberg E. V., McGuire K.L., Boyer P.D. Molecular indices of functional competence in developing T cells. Immunol. Rev. 1988 Aug; V. 104 P. 29-53.

103.Rouvier E, Luciani ME., Goldstein P. Fas involvement in Ca2+independent T-Cell mediated cytotoxity. J. Exp. Med. 1993 V. 177 P. 195-200.

104.Salgo M.G., Pryor W.A. Trolox inhibits peroxynitrite-mediated oxidative stress and apoptosis in rat thymocytes. Arch Biochem Biophys. -1996. V.15, N.333(2). P.482-488.

105.Sarin A, Adams D.EL, Henkart P.A Protease inhibitors selectively block T cell receptor-triggered programmed cell death in a murine T cell hybridoma and activated peripheral T cells. J. Exp. Med. 1993 Nov 1;V. 178(5) P. 1693-700.

106.Sarin A., Adams D.H., Henkart P.A Protease inhibitors selectively block T cell receptor-triggered programmed cell death in a murine T cell hybridoma and activated peripheral T cells. J. Exp. Med. 1993 Nov 1; V. 178(5) P. 1693-1700.

107.SatohM.S., Poirier G.G., Lindahl T. NAD(+>dependent repair of damaged DNA by human cell extracts. J. Biol. Chem. 1993 Mar 15; V.268(8) P.5480-5487.

108.Savill J.s Fadok V., HensonP., Haslett C. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis. Immunol. Today. 1993 Mar; 14(3): 131-6.

109.Sellins K.S., Cohen J.J. Gene induction by gamma-irradiation leads to DNA fragmentation in lymphocytes. J. Immunol. 1987 Nov 15; V. 139(10). P.3199-206. llO.Servomaa K., Rytomaa T. UV light and ionizing radiations cause : programmed death of rat chloroleukaemia cells by inducing retropositions of a mobile DNA element (LIRn). Int. J. Radiat. Biol. 1990. V.57. P.331. lll.Shertger H.G., Bannenbery G.L., Ruadren M.3 Moldens P. Relationship of membrane bluidity, chemoprotection, and the intrinsic toxity of butylated hydroxytoluene. Biochemical Pharmacology. -1991. Vol.42. P.1587-1593.

112.Shi Y., Glynn J.M., Guilbert L.J., Cotter T.G., Bissonnette R.P., Green D.R. Role for c-myc in activation-induced apoptotic cell death in T cell hybridomas. Science 1992 Jul 10; V.257(5067) P.212-4.

113.Shi Y., Glynn J.M, Guilbert L.J., Cotter T.G., Bissonnette R.P., Green D.R. Role for c-myc in activation-induced apoptotic cell death in T cell hybridomas. Science. 1992 Jul 10; V.257(5067) P.212-214.

114.Shi Y.F., Scalay M.G., Green D.R Cyclosporin A inhibits activation induced cell death in T-hybridomas and thymocytes. Nature V.339 P.625-626,1989.

115.Shiver J.W., Su L., Henkart P.A. Cytotoxicity with target DNA breakdown by rat basophilic leukemia cells expressing both cytolysin and granzyme A. Cell 1992 Oct 16;71(2):315-22.

116.Smith C.A., Williams G.T., Kingston R., Jenkinson E.J., Owen J.J. Antibodies to CD3/T-cell receptor complex induce death by apoptosis in immature T cells in thymic cultures. Nature 1989 Jan 12; V. 337(6203) P. 181-183.

117.Sprent J., Webb S.R. Intrathymic and extrathymic clonal deletion of T cells. Curr. Opin. Immunol. 1995 Apr; V. 7(2) P. 196-205.

118.Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide.Science 1995 Mar 10; V. 267(5203) P. 1445-1449.

119.Suda T., Takahashi T., Golstein P., Nagata S. Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis factor family. Cell. 1993 Dec 17; V.75(6) P.l 169-1178.

120. Sun X.M, Cohen G.M Mg(2+>dependent cleavage of DNA into kilobase pair fragments is responsible for the initial degradation of DNA in apoptosis. J. Biol. Chem. 1994 May 27;269(21):14857-60.

121.Tanaka J., Yoshihara K., Tsyuki M., Kamiuta T. Exp. Cell. Res. 1994. V. 213. P. 242-252.

122.Tateyama M., Oyaizu N., McCloskey T.W., Than S., Pahwa S. CD4 T lymphocytes are primed to express Fas ligand by CD4 cross-linking and to contribute to CD8 T-cell apoptosis via Fas/FasL death signaling pathway. Blood. 2000 Jul 1; V. 96(1) P. 195-202.

94

123.Thompson C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science. 1995. Mar 10; V. 267(5203) P. 1456-1462.

124.Trauth B.C., Klas C., Peters A.M., Matzku S., Moller P., Falk W., Debatin K.M, Krammer P.H. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis. Science 1989 Jul 21; V.245(4915) P.301-305.

125.Tsubata T. Co-receptors onB lymphocytes. Curr. Opin. Immunol. 1999 Jun; V. 11(3) P.249-255.

126.Tsujimoto Y., Cossman J., JaiFe E., Croce C.M. Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma. Science. 1985. Jun 21; V.228(4706) P. 1440-1443.

127.Ucker D.S., Ashwell J.D.,Nickas G. Activation-driven T cell death. Requirements for the novo transcription and translation and association with genome fragmentation J. Immunol. 1989 V. 143 P. 3461-3469.

128.Vacchio M.S., Papadopoulos V., Ashwell J.D. Steroid production in the thymus: implications for thymocyte selection. J. Exp. Med. 1994. Jun 1; V. 179(6) P. 1835-1846.

129. Van Wauwe J.P., De Mey J.R., Goossens J.G. OKT3: a monoclonal anti-human T lymphocyte antibody with potent mitogenic properties. J. Immunol. 1980 Jun; V. 124(6) P.2708-2713.

130.van Zandwijk N. N-acetylcysteine (NAC) and glutatione (GHS): antioxidant and chemopreventive properties, with special reference to lung cancer. J. Cell Biochem. Suppl. V.22 P. 24-32,1995.

131.Vanderbilt J.N., Bloom K.S., Anderson J.N. Endogenous nuclease. Properties and effects on transcribed genes in chromatin. J. Biol. Chem. 1982 Nov 10; V.257(21) P. 13009-13017.

132.Vanderbilt J.N., Bloom K.S., Anderson J.N. Endogenous nuclease. Properties and effects on transcribed genes in chromatin. J. Biol. Chem. 1982 Nov 10; V.257(21) P. 13009-13017.

133.Veis D.J., Sentman C.L., Bach E.A., Korsmeyer S J. Expression of the Bcl-2 protein in murine and human thymocytes and in peripheral T lymphocytes. J. Immunol. 1993 Sep 1; V.151(5)P.2546-2554.

134.Voelkel-Johnson C., EntinghA.J., Wold W.S., Gooding L.R., Laster S.M Activation of intracellular proteases is an early event in TNF-induced apoptosis. J. Immunol. 1995 Feb 15; V. 154(4) P.1707-16.

135.Vral A., Cornelissen M., Thierens H., Louagie H., Philippe J., Strijckmans K., De Ridder L. Apoptosis induced by fast neutrons versus 60Co gamma-rays in human peripheral blood lymphocytes. Int. J. Radiat Biol. 1998 Mar; V. 73(3) P. 289-295.

136. Walker P.R., Weaver V.M., Lach B., LeBlanc J., Sikorska M. Endonuclease activities associated with high molecular weight and internucleosomal DNA fragmentation in apoptosis. Exp. Cell. Res. 1994 Jul; V.213(l)P.100-6.

137. Wang Z.C., Ruggero D., Ronchetti S., Zhong S., Gaboli M, Rivi R., Pandolfi P.P. 1998. Nat. Genet. V.20. P.266-272.

138.Weinfield M, Chaudhiy M A, D'Amours D., Pelletier J. D., Poirier G. G., Povik L. F., Lees-Miller S. P. 1997. Interaction of DNA-dependent protein kinase and poly(ADP-ribose) polymerase with radiation-induced DNA strand breaks. Radiat. Res. V. 148 P.22-28.

139.Williams G.T., Johnstone A.P. ADP-ribosyl transferase, rearrangement of DNA, and cell differentiation. Biosci. Rep. 1983 Sep; V.3(9) P.815-830.

140. Wood R.D. DNA repair in eukariotes. 1996, Annu. Rev. Biochem. V.65 P. 135-67.

141.Woronicz J.D., Calnan B., Ngo V., Winoto A Requirement for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis of T-cell hybridomas. Nature. 1994. Jan 20; V.367(6460) P.277-281.

142.Wu J., Zhou T., Zhang J., He J., Gause W.C., Mountz J.D. Correction of accelerated autoimmune disease by early replacement of the mutated lpr gene with the normal Fas apoptosis gene in the T cells of transgenic MRL-lpr/lpr mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994 Mar 15; V.91(6) P.2344-8.

143.Wyllie A.H. What is apoptosis? Histopathology. 1986. Sep; V.10(9) P.995-998.

144.Wyffie A.H., Kerr J.F., Cunie A.R. Cell death: the significance of apoptosis. Int. Rev. Cytol. 1980; V.68 P.51-306.

145.Wyllie A.H., Morris R.G., Smith A.L., Dunlop D. Chromatin cleavage in apoptosis: association with condensed chromatin morphology and dependence on macromolecuiar synthesis. J Pathol 1984 Jan; V. 142(1) P.67-77.

146.Yonehara LA., Yonehara M.A. A cell-killing monoclonal antibody (anti-Fas) to a cell surface antigene co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor. J. Exp. Med. 1989 V. 169 P. 1747-1756.

147. Yuan J., Shaham S., Ledoux S., Ellis H.M, Horvitz H.R. The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell. 1993 Nov 19; V.75(4) P.641-652.

148.Zacharchuk C.M., Mercep M., Chacraborti P.K., Simmins S.S., Ashwell J.D. Programmed T-lymphocytes death: cell activation and steroid induced pathway are mutually antagonistic. J. Immunol 1990 V.145 P.4037-4045.

149.Zhivotovsky В., Cedervall В., Jiang S., Nicotera P., Orrenius S. Involvement of Ca2+ in the formation of high molecular weight DNA fragments in thymocyte apoptosis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994 Jul 15; V.202(l) P. 120-7.

150.Винокуров М.Г., Косякова Н.И., Николаева H.H., Печатников В. А. Модуляция апоптоза нейтрофилов периферической крови человека ультрафиолетовым изучением диапазона С и гамма-излучением. Биофизика. 1999. Том 44. Вып. 5. С. 929-930.

151.3енков Н. К., Меньшикова Е. Б., Вольский Н. Н., Козлов В. А. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз. Успехи современной биолопшГ- 1999. - Т. 119, №5. - С. 440-450.

152.Скулачёв В. П. Возможная роль активных форм кислорода в антивирусной защите. Биохимия. 1998. Т. 63(12) С. 1438-1440.

153.Карандашов В. И., Петухов Е. Б. Ультрафиолетовое облучение крови. М.: Медицина. 1997.

154.Донская И.А., Афанасьев В.Н., Печатников В.А. Индукция и подавление апоптоза в тимоцитах крысы ультрафиолетовым облучением. - Биофизика, 1997, т.42, в.З, с.680- 686. 155 .Михайлов B.C. ДНК-полимеразы эукариот. Молекулярная биология, 1998, т.33(4), с.567-580.

156.Пескин А. В. Взаимодействие активного кислорода с ДНК 1997. Биохимия. Т. 62. С. 1571-1578.

157.Тронов В. А. 1999, Репарация ДНК и апоптоз. Цитология, том 41, №5,405-410.

158.Тронов В. А. 1999, Репарация ДНК и апоптоз. Цитология, том 41, №5,405-410.

159.Уманский С.Р. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы. Молекулярная биология, 1996, т.30(3), с.487-502.

160.Чумаков ПМ Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия. 2000. Т. 65, С. 34-47. 161 .Ярилин А. А. Апоптоз и его место в иммунных процессах. Иммунология. 1996. №6. - С. 10-23.

Автор выражает глубокую благодарность руководителю этой работы, доктору физико-математических наук, профессору, Печатникову Владимиру Алексеевичу, а также всему коллективу лаборатории Структурно-функционального анализа клетки Института биофизики клетки за постоянное внимание и интерес к работе.

Особую благодарность хочется выразить доктору биологических наук, профессору, Зинченко Валерию Петровичу за мнокократное плодотворное обсуждение результатов работы и помощь при её подготовке в виде кандидатской диссертации.

Хочется выразить большую признательность доктору биологических наук, профессору, Новосёловой Елене Григорьевне за своевременную критику и помощь в представлении полученных результатов.

Благодарю доктора биологических наук, профессора, Климова Вячеслава Васильевича за внимательное отношение к моей работе и критические замечания.

Благодарю доктора биологических наук, профессора, зав. лабораторией радиационной и молекулярной биологии Газиева Ажуба Ибрагимовича за интерес к моей работе и помощь при интерпретации её результатов.