Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли митохондрий в апоптозе в тимоцитах и клетках культуры U937

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Галитовский, Валентин Евгеньевич

I. Введение.

II. Обзор литературы.

Глава I Виды клеточной гибели.

1. Апоптоз и некроз - два вида клеточной гибели.

2. Характерные признаки апоптоза.

3. Межнуклеосомная фрагментация ДНК - один из основных признаков апоптоза в тимоцитах.

4. Регуляторные механизмы апоптоза.

5. Молекулярные механизмы апоптоза.

6. Роль цистеиновых протеаз (каспаз) в апоптозе.

7. Роль митохондрий в апоптозе.

8. Снижение мембранного потенциала митохондрий при апоптозе.

9. Роль цитохрома с в апоптозе.

10. Механизмы выхода цитохрома с из митохондрий.

Глава II. Индукция неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны.

1. Кальциевый гомеостаз клетки и его регуляция.

2. Роль митохондрий в регуляции клеточного гомеостаза.

3. Система аккумуляции ионов Са

4. Система выхода ионов Са из митохондрий.

5. Индукция неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны.

Глава III. Материалы и методы исследования.

1. Выделение и подготовка тимоцитов к опыту.

2. Выделение митохондрий печени.

3. Оценка функциональной активности митохондрий.

4. Оценка активности систем транспорта ионов Са2+ в митохондриях пермеабилизованных тимоцитов.

5. Спектрофотометрическое определение 37 межнуклеосомной деградации ДНК.

6. Электрофоретическое определение фрагментации ДНК.

7. Облучение.

8. Оценка содержания ATP.

Глава IV. Результаты собственных исследований.

1. Ингибиторы митохондриальной энергетики предотвращают межнуклеосомную фрагментацию ДНК в тимоцитах при апоптозе.

2. Влияние ингибиторов энергетики митохондрий на индукцию неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны.

3. Исследование Са2+ аккумулирующей способности митохондрий тимоцитов при апоптозе.

4. Влияние энергетического состояния митохондрий на межнуклеосомную фрагментацию ДНК в тимоцитах после облучения.

5. Циклоспориин А предотвращает падение мембранного потенциала митохондрий и выход ионов кальция в отсутствие индукции неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны.

6. Исследование подавления ингибиторами митохондрильной энергетики межнуклеосомной фрагментации ДНК в клетках U937.

Глава V. Обсуждение результатов. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование роли митохондрий в апоптозе в тимоцитах и клетках культуры U937"

Анализируя морфологические и биохимические изменения, происходящие в процессе гибели клетки, исследователи обнаружили и описали два вида клеточной гибели - апоптоз и некроз (Wyllie, et al., 1980). Некротическая гибель является пассивным ответом клетки на внешние воздействия, которые повреждают, прежде всего, плазматическую мембрану (Wyllie, et al. 1980; Raff, 1992). В результате повреждения плазматической мембраны, а впоследствие и мембран клеточных органелл, происходит выброс лизосомальных ферментов в межклеточное пространство, что приводит к возникновению очага воспаления (Reiter, et al. 1999). Апоптоз в отличие от некроза является активным процессом самоубийства клетки необходимым для нормального протекания процессов эмбрио- и морфогенеза (Raff, 1992; Steller, 1995). Эта форма клеточной гибели имеет место практически на всех этапах развития и жизнедеятельности организма. Сбой в функционировании механизмов, лежащих в основе апоптоза, способен вызвать целый ряд патологических изменений - так ослабление апоптоза в результате утраты рецепторов которые принимают участие в формировании сигнала к его развитию, определяет повышенную вероятность формирования аутоиммунных процессов. И напротив, повышенная склонность к апоптозу приводит к заболеваниям, связанным с развитием атрофических процессов (Ярилин, 1995).

Интерес к этому типу клеточной гибели усилился в последние годы в связи с установлением важной роли этого явления в развитии многих заболеваний - онкологических, инфекционных, нейродегенеративных и др. (Fisher, 1994; Thompson, 1995; Pettmann, Henderson, 1998). Выяснение механизмов клеточной гибели при различных патологиях позволяет не только понять причины заболеваний, но и осуществлять направленный поиск способов лечения.

В последние годы к изучению процесса апоптоза привлечено значительное внимание исследователей, работающих в разных областях биологии и экспериментальной медицины. Исследуя ряд морфологических признаков апоптоза, таких как уменьшение объема клетки, образование изгибов на плазматической мембране и образование апоптозных телец, были идентифицированы и биохимические признаки апоптоза, такие как межнуклеосомная деградация хроматина, активация целого ряда цистеиновых протеаз (этим ферментам многие исследователи придают ключевую роль в реализации апоптоза), появление фосфатидилсерина на наружной стороне плазматической мембраны и ряд других. В последнее десятилетие появились данные о непосредственном участии митохондрий в апоптозе. Было показано, что в первые часы апоптоза происходит падение мембранного потенциала (Ац/) на митохондриальной мембране (Petit, et al. 1995). По мнению этих авторов, снижение мембранного потенциала обусловлено индукцией неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны вследствие открытия поры во внутренней мембране митохондрий. Это приводит к набуханию органелл, разрыву внешней мембраны и высвобождению из межмембранного пространства цитохрома с (Petit, et al. 1995). В результате этого, цитохром с соединяется с белком APAF-1, dATP и прокаспазой-9. Происходит образование, так называемого апоптосомного комплекса, в результате образования, которого активируется каспаза-9, которая, в сою очередь, активирует каспазу-3 (Zou, 1999). Именно этой каспазе принадлежит ключевая роль в реализации апоптоза.

В ряде работ апоптоз удавалось инициировать ингибиторами энергетики митохондрий такими как ингибитор дыхательной цепи антимицином, либо разобщитель окислительного фосфорилирования СССР. Следует отметить, что при этом апоптоз наблюдали и в присутствии ингибитора митохондриальной АТФ-азы олигомицина, соединения, не оказывающего непосредственного влияния на величину мембранного потенциала (Castedo, 1996). Следует также отметить, что само по себе снижение мембранного потенциала, вследствие ингибирования дыхательной цепи или разобщения митохондрий, должно вызывать выход ионов Са2+ из митохондрий, и, следовательно, предотвращать индукцию неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны, поскольку кальциевая нагрузка является необходимым условием для открытия поры. Кроме того известно, что открытие неселективной поры, скорее всего, свидетельствует о некротических изменениях в клетке, нежели об изменениях апоптотического характера (Crompton, 1999).

Таким образом, суммируя вышеизложенные данные, нами была поставлена задача, исследовать роль митохондрий как в инициации, так и в реализации программируемой гибели клетки. В соответствии с этим были поставлены следующие цели:

1. Исследование механизмов модификации апоптоза ингибиторами энергетики митохондрий в тимоцитах

2. Исследование функциональной активности, в частности, Са аккумулирующей способности митохондрий при апоптозе.

3. Исследование роли индукции неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны для реализации апоптоза.

4. Сопоставление роли митохондрий в индукции апоптоза в тимоцитах и клетках культуры U937.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Галитовский, Валентин Евгеньевич

Выводы:

1. Ингибиторы энергетики, снижающие мембранный потенциал митохондрий (ротенон, антимицин, разобщитель окислительного фосфорилирования СССР), а также ингибитор митохондриальной АТФазы олигомицин не способны индуцировать межнуклеосомную фрагментацию ДНК в тимоцитах.

2. Исследованные ингибиторы митохондриальной энергетики эффективно подавляют межнуклеосомную фрагментацию ДНК в тимоцитах в случае индукции апоптоза глюкокортикоидами, либо ионофором А2зш, либо ионизирующей радиацией.

3. Подавление межнуклеосомной фрагментации ДНК не связано с величиной мембранного потенциала митохондрий, поскольку наблюдается как при снижении мембранного потенциала (ротенон, антимицин, СССР), так и при его сохранении (олигомицин).

4. Оценка кальциевой емкости митохондрий (параметра, отражающего устойчивость митохондрий к индукции неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны) не выявила изменений по сравнению с контролем. Это говорит о том, что митохондрии при апоптозе остаются функционально активными даже при наступлении фрагментации ДНК.

5. Циклоспорин А стабилизировал емкость митохондрий тимоцитов по Са2+ как в отсутствие, так и в присутствии дексаметазона, не влияя при этом на межнуклеосомную фрагментацию ДНК. Из этого следует, что фрагментация ДНК не связана с индукцией неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны.

6. Циклоспорин А способен предотвращать падение мембранного потенциала и выход накопленных ионов кальция и в отсутствие индукции неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны. В связи с этим, предотвращение снижения мембранного потенциала циклоспорином А при апоптозе нельзя рассматривать как признак того, что в митохондриях происходит открытие поры.

7. Подавление межнуклеосомной фрагментации ДНК в тимоцитах ингибиторами митохондриальной энергетики результат ограничения поступления АТР, необходимого для этого процесса.

8. В клетках U-937 ингибиторы митохондриальной энергетики не влияют на межнуклеосомную фрагментацию ДНК, поскольку основным путем энергоснабжения является гликолиз.

9. Переход с гликолитического пути образования АТФ на митохондриальный делает межнуклеосомную фрагментацию ДНК чувствительной к ингибиторам митохондриальной энергетики.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Галитовский, Валентин Евгеньевич, Пущино

1. Bursch W. (1992) Growth Regulation and Carcinogenesis. Cell death by apoptosis: significance for regulation of homeostasis of cell number and its disturbance during cancer development. V. 2. P. 327 341.

2. Burton K. (1956) Biochem. J. V. 62. P. 315 323.

3. Carafoli E. (1987) Annu. Rev. Biochem. Intracellular calcium homeostasis. V. 264. P. 395-433.

4. Carafoli E., Crompton M. (1978) The regulation of intracellular calcium. -Curr. Top Membranes Transp. P. 151 -216.

5. Carafoli E., Tiozzo R, Lugli G., Crowetti F., Kratzing C. (1974) JMol Cell Cardiol. The release of calcium from heart mitochondria by sodium. V. 6(4). P. 361 -371.

6. Caron-Leslie L.M., Cidlowski J.A (1991) Mol. Endocr. Similar actions of glucocorticoids and calcium on the regulation of apoptosis in S49 cells. V. 5. P. 1169- 1178.

7. Castedo M., Macho A., Zamzami N., Hirsch Т., Marchetti P., Uriel J., Kroemer G. (1995) Eur. J. Immunol. Mitochondrial perturbations define lymphocytes undergoing apoptotic depletion in vivo. V. 25(12). P. 3277 -3284.

8. Cohen G.M. (1997) Biochem. J. Caspases: the executioners of apoptosis. V. 326, P. 1 16.

9. Cohen J.J. (1993) Immunol. Today. Apoptosis. V. 14, P. 126 130.

10. Cohen J.J., Duke R.C. (1984) J. Immunol. Glucocorticoid activation of a calcium-dependent endonuclease in thymocyte nuclei leads to cell death. V. 132. P. 38-42.

11. Cope F.O., Wille J.J. (1994) Cold Spring Harbor Lab. Press. Carcinogenesis and apoptosis: paradigms and paradoxes in cell cycle and differentiation// Apoptosis. The molecular basis of apoptosis disease/ Ed. Tomei L.D., Cope F.O.P. 61-86.

12. Crompton M. (1999) Biochem. J., The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death. V. 341. P. 233 249.

13. Crompton M. (2000) J Physiol. Mitochondrial intermembrane junctional complexes and their role in cell death. V. 529. P. 11-21.

14. Crompton M., Capano M., Carafoli E. (1976) Biochem J. Respiration-dependent efflux of magnesium ions from heart mitochondria. V. 15; 154(3). P. 735-742.

15. Crompton M., Ellinger H., Costi A. (1988) Biochem. J. Inhibition by cyclosporin A of a Ca -dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress. V. 255. P. 357 360.

16. Douglas W.W. (1976) Stimulus secretion coupling in mast cells: regulation of exocytosis by cellular and extracellular calcium. In: Calcium transport in contraction and secretion. Amsterdam: North Holland. P. 167 176.

17. Du C., Fang M., Li Y., Li L., Wang X., (2000) Cell. Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by elimination IAP inhibition. V. 102. P. 33 42.

18. Fabiato A., Fabiato F. (1978) Ann. NY Acad. Sci. Calcium induced release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of skinned cells from human, dog, rabbit and frog hearts and from fetal and newborn rat ventricles. V. 307. P. 491 -522.

19. Fadeel В., Zhivotovsky В., Orrenius S. (1999) FASEB J. All along the watchtower: on the regulation of apoptosis regulators. V. 13(13). P. 1647 -1657.

20. Fisher DE. (2001) Apoptosis. The p53 tumor suppressor: critical regulator of life & death in cancer. V. 6(1-2). P. 7 15.

21. Fisher D.E. (1994) Cell Apoptosis in cancer therapy: crossing threshold. V. 78. № 4. P. 539 542.

22. Fozzard H.A. (1977) Annu. Rev. Phisiol. Heart: excitation contraction coupling. V. 39. P. 201 -220.

23. Green D.R., Reed J.C. (1998) Science. Mitochondria and apoptosis. V. 281(5381). P. 1309- 1312.

24. Greenberg J.T. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Programmed cell death: a way of life for plants. V. 93, P. 12094 12097.

25. Halestrap A.P. (1994) Interactions between oxidative stress and calcium overload on mitochondrial function, in: Mitochondria: DNA, Proteins and Disease (Darley-Usmar V, and Shapira A.H.V, eds) pp.113 142, Portland Press Ltd, London.

26. Hockenbery D, Nunez G, Milliman C, Schreiber R.D, Korsmeyer S.J. (1990) Nature Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death. V. 348(6299). P. 334 336.

27. Hunter D.R, Haworth R.A. (1979a) Arch Biochem Biophys. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. V. 195. P. 453-459.

28. Hunter D.R, Haworth R.A. (1979b) Arch Biochem Biophys. The Ca2+• 2+ induced membrane transition in mitochondria. III. Transitional Ca release.1. V. 195. P. 468-477.

29. Jacobson M.D, Weil M, Raff M.C. (1997) Cell. Programmed cell death in animal development. V. 88, P. 347 354.

30. Kerr J.F. (1971) J. Pathol. Shrinkage necrosis of adrenal cortical cells. V.107 (3). P. 217-219.

31. Kidd VJ. (1998) Annu. Rev. Phisiol. Proteolytic activities that mediate apoptosis. V. 60. P. 533 573.

32. Kim Т.Н., Zhao Y., Barber M.J., Kuharsky D.K., Yin X.M. (2000) J. Biol. Chem. Bid-induced cytochrome с release is mediated by a pathway independent of mitochondrial permeability transition pore and Bax. V. 275(50). P. 39474-39481.

33. Kohler C., Gahm A., Noma Т., Nakazawa A., Orrenius S., Zhivotovsky B. (1999) FEBS Lett. Release of adenylate kinase 2 from the mitochondrial intermembrane space during apoptosis. V. 447. P. 10 12.

34. Kretsinger R.H. (1976) Ann. Rev. Biochem. Calcium binding proteins. V. 45. P. 239-266.

35. Maniatis Т., Fritch E., Sambrook J. (1982) Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

36. McConkey D.J., Orrenius S. (1996) Stem Cells. Signal transduction pathways in apoptosis. V. 14(6). P. 619-631.

37. Moor C.L. (1971) Biochem. Biophys. Res. Commun. Specific inhibition of mitochondrial Ca++ transport by ruthenium red. V. 42(2). P. 298 305.

38. Muzio M., Stokwell B.R., Stennicke H.R., Salvesen G.S., Dixit V.N. (1998) J. Biol. Chem. An induced proximity model for caspase-8 activation. V. 273. P. 2926 2930.

39. Newmeyer D.D., Farschon D.M., Reed J.C. (1994) Cell Cell-free apoptosis in Xenopus egg extracts: inhibition by Bcl-2 and requirement for an organelle fraction enriched in mitochondria. V. 79(2). P. 353 364.

40. Nikonova L.V., Nelipovich P.A., Umansky S.R. (1982) Biochem. Biophis. Acta. The involvement of nuclear nucleases in rat thymocytes DNA degradation after y-irradiation. V. 699. P. 281 289.

41. Norbury C., Nurse P. (1992) Annu. Rev. Biochem. Animal cell cycles and their control. V.6. P. 441 470.

42. Patriarca P., Carafoli E. (1969) Experientia A comparative study of the intracellular Ca++ movements in white and red muscle. V. 25. № 6. P. 598 -599.

43. Peitsch M.S., Muller C., Tschopp J. (1993) Nucleic acids reserch. DNA fragmentation during apoptosis is caused by frequent single-strand cuts. V. 21. P. 4206-4209.

44. Peter M.E., Heufelder A.E., Hengartner M.O. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Advances in apoptosis research. V. 94. P. 12736 12737.

45. Petit P.X., Lecoeur H., Zorn E., Dauguet C., Mignotte В., Gougeon M.-L. (1995) J. Cell Biol., Alterations in mitochondrial structure and function are early events of dexamethasone-induced thymocyte apoptosis. V. 130. P. 157 — 167.

46. Pettman В., Henderson C.E. (1998) Neurone Neuronal cell death. V. 20. № 4. P. 633-647.

47. Raff M. C. (1992) Nature Social controls on cell survival and cell death. V. 356, № 6368. P. 397-400.

48. Rasmussen H. (1970) Science Cell communication, calcium ion and cyclic adenosine monophosphate. V. 170(3956). P. 404-412.

49. Rasmussen H., Tenenhouse A. (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Cyclic adenosine monophosphate, Ca , and membranes. V. 54(4). P. 1364 1370.

50. Reiter I., Krammer В., Schwamberger G. (1999) J. Immunol. Cutting edge: differential effect of apoptotic versus necrotic tumor cells on macrophage antitumor activities. V. 163. № 4. P. 1730 1732.

51. Richter C., Schweizer M., Cossarizza A., Franceschi C. (1996) FEBS Lett. Control of apoptosis by the cellular ATP level. V. 378(2). P. 107 110.

52. Rossi C.S, Lehninger A.L. (1963) Biochem. Z. Stoichiometric relationships between accumulation of ions by mitochondria and the energy-coupling sites in the respiratory chain. V. 338. P. 698 713.

53. Samali A, Zhivotovsky B, Jones D, Nagata S, Orrenius S. (1999b) Cell Death Differ. Apoptosis: Cell Death defined by caspase activation. V. 6. P. 495-496.

54. Scarpa A, Carafoli E. (1978) Ann. NY Acad. Sci. Calcium transport and cell function. V. 307. P. 665.

55. Shimizu S, Narita M, Tsujimoto Y. (1999) Nature. Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome с by the mitochondrial channel VDAC. V. 399(6735). P. 483 487. Skulachev V. P. (1996) FEBS Lett. V. 397. P. 7 - 10.

56. Somlyo A.P, Somlyo A. V, Schuman H, Sloane B, Scarpa A. (1978) Ann. NY Acad. Sci. Electron probe analysis of Ca compartment in cryo-section of smooth and striated muscles. V. 307. P. 523 544.

57. Susin S.A, Lorenzo H.K, Zamzami N, Marzo I, Brenner C, Larochette N, Prevost M.C, Alzari P.M., Kroemer G, (1999a) J. Exp. Med. Mitochondrial release of caspase-2 and -9 during the apoptotic process. V. 189. P. 381 -394.

58. Steller H. (1995) Science Mechanisms and genes of cellular suicide. V. 267. № 5203. P. 1445- 1449.

59. Thompson C.B. (1995) Science Apoptosis in the pathogenesis and treatment decease. V. 267. № 5203. P. 1456 1462.

60. Thornberry N.A., Lazebnik Y. (1998) Science V. Caspases: enemies within. 281.P. 1312-1316.

61. Vasington F.D., Murphy J.V. (1962) J. Biol. Chem. Ca++ uptake by rat kidney mitochondria and its dependence on respiration and phosphorylation. V. 237. P. 2670.

62. Vaux D.L., Korsmeyer S.J. (1999) Cell, Cell death in development. V. 96, P. 245-254.

63. Wang H.G., Pathan N., Ethell I.M., Krajewski S., Yamaguchi Y., Shibasaki F„ McKeon F., Bobo Т., Franke T.F., Reed J.C. (1999) Science. Ca2+-induced apoptosis through calcineurin dephosphorylation of BAD. V. 284(5412). P. 339-343.

64. Wester P.O. (1965) Biochim. Biophis. Acta. Concentration of 17 elements in subcellular fractions of beef heart determined by neutron activation analysis. V. 109(1). P. 268-283.

65. Winnegrad S. (1970) J. Gen. Phisiol. The intracellular site of calcium activation of contraction in frog skeletal muscle. V. 55. № 1. P. 77 88.

66. Zhivotovsky В., Orrenius S., Brustugun O.T., Doskeland S.O. (1998) Nature Injected cytochrome с induces apoptosis. V. 391(6666). P. 449 450.

67. Zhivotovsky В., Samali A., Gahm A., Orrenius S. (1999) Cell Death Differ. Caspases: their intracellular localization and translocation during apoptosis. V. 6. P. 644-651.

68. Белецкий И.П., Уманский C.P. (1987) Радиобилогия. Природа разрывов, индуцируемых в ДНК на ранних этапах интерфазной гибели клеток. Т. 27. С. 227-230.

69. Галанкин В.Н., Токмаков A.M. (1991) Проблемы воспаления с позиций теории и практики. М., УДН, С. 120.

70. Комар В.Е., Хансон К.П. (1972) информационные макромолекулы при лучевом поражении. Москва. Атомиздат. С. 42 55.

71. Куцый М.П., Кузнецова Е.А., Газиев А.И. (1999) Биохимия Т. 64. С. 149 163.

72. Никонова JI.B., Селищева И.М., Уманский С.Р. (1982) Радиобиология. Механизм деградации хроматина в тимоцитах облученных крыс. Т. 22. С. 441-445.

73. Новожилова А.П., Плужников Н.Н., Новиков B.C. (1996) В кн. Программированная клеточная смерть (под ред. B.C. Новикова), Наука. Спб., с. 9-29.

74. Окада Ш. (1974) Радиационная биохимия клетки. Москва. Атомиздат. С. 289-300.

75. Филатов М.В., Шейкина Т.А. (1978) Радиобиология Т. 18(5). С. 751 -754.