Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция биологически активными соединениями энергетического метаболизма и кальциевого гомеостаза тимоцитов крыс

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Регуляция биологически активными соединениями энергетического метаболизма и кальциевого гомеостаза тимоцитов крыс"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН д-.-тл'^

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ ' " . 'V}

РГб ОД ^

2 0 да г™

На правах рукописи УДК 576.32/36 +577.115.3

ГИЗАТУЛЛИНА Земфнра Заннулловна

РЕГУЛЯЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА II КАЛЬЦИЕВОГО ГОМЕОСТАЗА ТИМОЦИТОВ КРЫС

03.00.02. - биофизика

А Н ТОРГ Ф Е Р А Т лнссерташш на соискание _\ченои степенп доктора биологических паук

Ташкент - 2000

Работа выполнена на кафедре биофизики биолого-почвенного факультет; Национального Университета Узбекистана им. М. Улугбека

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Р.Н.АХМЕРОВ

доктор биологических наук В.П.ТАТАРСКИЙ

доктор биологических наук Б.У. АТАКУЗИЕВ

Ведущая организация: Институт биоорганической химии АН РУз им. А.С.Садыкова

Защита диссертации состоится ООО г. в ./¿'часов на

заседании Специализированного совета Д 015.01.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии и биофизики АН РУз по адресу: 700095, г.Ташкент, ул. Нпязова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии и биофизики АН РУз по адресу. 700095, г.Ташкент, ул. Ниязова, 1.

Автореферат разослан

" // " &/и?иЛ^с/1т г.

Ученый секретарь Специализированного совета, д.б.н., профессор

У

Э.С.Махмудов

ЕбМ-ъ.о Еб&./МЬО

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из наиболее чутко реагирующей системой клетки на эндогенные и экзогенные воздействия является система энергообеспечения. В условиях проницаемости плазмалем.мы, модификация энерге-тичесикого метаболизма теми или иными соединениями возможна, при их непосредственном взаимодействии с мембранами митохондрий. Рецептор-опосредованная модификация энергетического метаболизма осуществляется через многочисленные, специфические внутриклеточные факторы (Czech M.et al.,1995; Гайнутдинов и др..1980; Гагсльганс,1981; Далимопа и др.,1990) и (или) через универсальные вторичные мессенджеры: ионы Са~\ циклические н_\к-леотиды, система гидролиза и окисления фосфолипидов и др. (Левицкий, 1990; Ткачук, 1999; Зинченко,2000).

При исследовании рецептор-зависимых и рецептор-независимых механизмов клеточного ответа на стимуляцию биологически активными соединениями (БАС) (гормоны, пестициды, фармакологические препараты), необходимо выяснить последовательность биохимических и биофизических механизмов передачи сигнала, приводящих к активации физиологических функций клетки (llertel et al.,1981; Berridge, 1997; Gnkovskaya et al, 1989).

Доступной для изучения клеточной системой с типичным набором oprv.-нелл и рецепторов ко многим БАС являются лимфоциты. Их состояние може! отражать свойства клеток других тканей организма, кроме того, метаболическое состояние митохондрии в лимфоцитах можно исследовать такими же методами, как и метаболическое состояние изолированных митохондрий (Мохо-ва.1987; Коношенко,1989). На плазмалемме лимфоцитов показано наличие рецепторов к тиреоидным и глюкокортикоидным гормонам (Segal. 1986. 1989; ). а также в цитозоле (Голиков. 1988; Carlson et al. 1992; Peers et al, 1993), па ядерной (Tienrungroj.l 987; Hashizume, et al,1989) и митохондриальнон мембранах (Sterling, 1991; Buttgereit et al. 1993). Механизм передачи сигнала от таких рецепторов во многом не ясен, хотя согласно ряда данным основным посредником на участке, предшествующем нуклеарным гормональным эффектам, являются ионы Са"* (Ткачук, 1999; Смирнова,1999; Segal,1990).

Изучение действия тироксина и гидрокортизона на состояние энергетического обмена и кальциевого гомеостаза клетки может явиться предпосылкой создания целостной картины первичного действия гормонов через систему трансмембранной передачи сигнала, включающей или тормозящей активность клеток иммунной системы на "до нуклеарном уровне". До настоящего времени не предпринимались попытки детального исследования действия данных гормонов на уровень внутриклеточного кальция [Са"+],„ тимоцитов. а их эффекты рассматривались обособленно, без учета новых данных о регуляции входа Са~~ в клетки.

Исследования в этой области имеют не только фундаментальное значение, но вызывает и большой практический интерес, т.к. действие различных гормонов, пестицидов и фармакологических препаратов связано с модификацией активности ряда ферментов системы внутриклеточной сигнализации, управляющих функциональной активностью клеток (Ротенберг,1980; Altman et al, 1990; Malbon et al,1988) и могут рассматриваться как важный этап при первичной оценке специфической и неспецифической токсичности. Потребность в подобной экспресс оценке в настоящее время возрастает у химиков-синтетиков, токсикологов, гигиенистов и медиков.

Цель работы. Исходя из вышеизложенного целью настоящей работы явилось изучение прямого и рецептор-зависимого влияния биологически активных соединений на энергетический метаболизм и кальциевый гомеостаз тимоцитов крыс.

Основные задачи исследования:

• исследовать влияние различных доз тироксина и гидрокортизона in vivo и in situ на энергетический метаболизм тимоцитов;

• выяснить направленность изменений уровня [Са"1"],,, и роли различных Са:~-трапспортирующих систем клетки в формировании Са"'- сигнала при действии тироксина и гидрокортизона;

• исследовать взаимосвязь Са"+-сигнала с другими процессами, протекающими в тимоцитах при гормональном воздействии, в частности, зависимость Са"*-сигнала от влияния циклических нуклеотидов, арахидоновой кислоты и продуктов метаболизма, активности протеинкиназ, G-белков и кальмодулина (КМ);

• изучить влияние тироксина и гидрокортизона на Са~"- сигнал, индуцированный митогеном-конканавалином А и другими [Са"+]!п-повышающими агентами;

• исследовать влияние фармпрепарата экдистерона на энергетический метаболизм в норме и при патологии в экспкриментах in vivo и in vitro.

• исследовать влияние ряда гербицидов, инсектицидов, фунгицидов, дефолиантов и антипротозойного препарата химкокцнда на состояние энергетического метаболизма тимоцитов крыс, в сопоставление с прямым действием пестицидов на процессы дыхания и окислительного фосфорилирования изолированных митохондрий печени крыс;

• изучить влияние ряда пестицидов на транспорт кальция и проницаемость внутренней мембраны митохондрий для различных ионов;

• на основе полученных результатов оценить адекватность использования препаратов изолированных митохондрий и суспензии тимоцитов для оценки неспецифической токсичности пестицидов.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование действия тироксина (ТД гидрокортизона (ГК) и пестицидов на энергетический метаболизм митохондрий на уровне целостной клетки. В условиях рецептор-

( '

зависимой передачи сигнала эти изменения, сопоставлены с колебаниями уровня свободного и мембраносвязанного Са~+. Оценено участие в этом процессе внутриклеточных компартментов Са2+ и ряда белков трансмембранной сигнализации плазмалеммы тимоцитов. Для исследованных гормонов определен диапазон концентраций, при которых они оказывают цитотоксическое действие. Влияние пестицидов на энергетический метаболизм на клеточном и субклеточном уровнях сопоставлено с их общей токсичностью.

Впервые показано, что гипертиреоз вызывает стимуляцию дыхания тимоцитов крыс, разобщение окислительного фосфорилирования (ОФ) и оказывают цитотоксическое действие на тимоциты. Тиреоидэктомия характеризуется снижением дыхательной активности суспензии тимоцитов крыс с увеличением степени сопряженности ОФ в два раза. Эффекты Тз (1 мкМ) in situ проявляются в стимуляции дыхания тимоцитов. и разобщении ОФ. Преинкубация тимоцитов (30 мин.) с Т3 увеличивает уровень разобщенности ОФ.

Впервые проведено исследование Са~^- транспортирующих систем клетки, принимающих участие в генерации Са2+- сигнала при активации рецепторов гормонов. Показано, что уровень [Са~*],п - наиболее чувствительный параметр к действию Т4 in vitro, существенно изменяющийся уже в присутствии 1-10 нМ этого гормона.

На основе полученных данных сделано заключение, что влияние Т4 на энергетический метаболизм имеет рецептор-опосредованный характер и заключается в модификации кальциевого гомеостаза, сопровождающегося уве-1 имением Са2т- пула плазмалеммы тимоцитов и перераспределением Са24 меж-iy эндоплазматичееким ретикулумом (ЭР) и MX. Подобное перераспределение Га"\ посредством которого гормон осуществляет свое воздействие в концен-рациях, близких к физиологическим, возможно, является определенным эта-юм в цепи его последующих эффектов.

Согласно экспериментам с применением различных ингибиторов, в повышении [Ca"r]in в тимоцитах, при действии Т4, принимают участие Са"4"- зависите протеинкиназы и кальмодулин. Кроме того получены данные в пользу уча-тия арахидоновой кислоты или ее продуктов в формировании Т,-зависимого 'а"*- ответа тимоцитов. Участия цАМФ-зависимой протеинкиназы при этом не бнаружено.

Установлен дозозависимый характер влияния ГК на энергетику тимоци-эв. Высокие концентрации и длительное действие ГК вызывают угнетение ;ергетического метаболизма MX тимоцитов и оказывают цитотоксическое гйствие. Кратковременное действие ГК in vivo, как и низкие концентрации ГК i vitro, вызывают стимуляцию транспорта пирувата и его окисления и тормо-[т окисление глюкозы в тимоцитах.

ГК вызывал снижение [Ca2+]in тимоцитов, путем блокирования Са"г- кана-)в плазмалеммы, ч .о сопровождается последующим выходом Са~* из ЭР и по-ющением его в MX.

Обнаружено, что регуляции энергетического метаболизма тнмоцитов фармпрепаратом экдистсном проявляются только в экспериментах /и vivo. Эффекты экдистена в экспериментах in vitro на клеточном и субклеточном уровнях не проявляются, что указывает на его анаболический характер поведения.

Впервые проведено исследование действия большой группы пестицидов и фармпрепаратов на энергетику митохондрий в условиях целостной клетки с одновременной оценкой их эффекта на функциональное состояние изолированных митохондрий. Установлено, что рецептор-независимые эффекты исследованных пестицидов проявляются на уровне функционального состояния тнмоцитов и изолированных митохондрий в виде разобщения ОФ (гербициды, дефолианты), шунтирования (фунгициды юглон и 2-оксиюглон) или блокирования дыхательной цепи (инсектицид токутион, некоторые гербициды), стимуляции проницаемости внутренних мембран МХ для различных катионов (дефолианты) или преимущественно для Са"" и Mg2r (антипротозойпый препарат химкокцид) и т.д. Последнее соединение, согласно нашим данным, эффективно ингибировал ЬГ-АТФазу МХ. Кроме того, токутион обладает циклоспорин A-подобным действием на внутреннюю мембрану митохондрий в присутствии ионов кальция.

Мембранотропные свойства пестицидов на клеточном уровне коррелируют с их токсикологическими показателямими (коэффициент корреляции равен 0,76).

Научно-практпческос значение работы. Полученные нами результаты способствуют углублению фундаментальных представлений о механизме действия БАС на энергетический метаболизм клетки с учетом проницаемости плазмалеммы. Гормональная регуляция энергетического метаболизма связана с генерацией рецептор-зависимого Са"^- сигнала в тимоцитах. Результаты работы могут быть использованы при оценке глубины сдвигов энергетического метаболизма, обусловленных влиянием ксейобиотиков, на основе данных о функциональном состояни митохндрий в лимфоцитх крови. Неспецифическая регуляция энергетического метаболизма пестицидами и фармпрепаратами на клеточном и субклеточном уровнях коррелирует с их токсикологическим показатель ЛД50. Этот факт позволяет рекомендовать использование параметров энергетики тнмоцитов в качестве адекватного критерия при первичном скрининге ядохимикатов в отношении их неспецифической токсичности.

Апробпипя работы и публикации. Материалы диссертации были доложены на симпозиуме СНГ "Организм и среда" (Бухара, 1992), научной конференции Института физиологии и биофизики АН РУз "Структура и функции биологических мембран" (Ташкент, 1994), на конференциях молодых ученых биолого-почвенного факультета и научных семинарах кафедры биофизики ТашГУ. По материалам диссертации опубликовано 25 работ, в том числе - 10 журнальных статей.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (гл.1), описания материалов и методов исследования (гл.И), изложения полученных результатов и их обсуждения (гл.III), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (404 ссылок). Работа изложена на 192 страницах машинописного текста, включая 37 рисунков и 24 таблиц.

Настоящая работа обобщает исследования, проведенные нами в период 1988-1999 г.г. совместно с З.С.Орынбаевой, О.А.Сукочсвой, Р.Я.Лайлиевым, Г.Л.Сайфуллиной и другими сотрудниками.

Глава П. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на изолированных MX и тимоцитах беспородных белых крыс массой 100-150 г. MX выделяли по общепринятому методу (Shneider, 194S), тимоцнты по методике, описанной Гуковскои и др., (1986), в среде А, содержащей 4,6 мМ КС!, 145 мМ NaCl, 8 мМ MOPS, 1 мМ KHiPOj, 10 мМ пирувата Na или глюкозы, 1 мМ СаСЬ (или без него); рН 7,4. Без Са~т среду получали добавлением 2мМ ЭГТА.

Скорость окисления субстратов суспензией митохондрий (Chance. 1965), ги-моцитов (Мохова,1987) крыс и гомогената печени крыс (Корниенко, 1979) измеряли при помощи полярографа LP-7 (Чехия), с использованием платинового электрода типа Кларка. Пассивную проницаемость мембран митохондрий для одно- и двухвалентных катионов измеряли по скорости энергонезависимого набухания суспензии митохондрий, вызывающая изменение оптической плотности при 520 им на фотометре ЛМФ-69.

Измерения [Са'"]ш и количества мембраноспязаниого С'а"' проводили спектрофлуорнметр,¡чески с помошыо флуоресцентных зондов Fura- 2/АМ и хлортетрациклина (Добрецов, 1989).

В экспериментах in vivo крысам внутримышечно вводили тироксин (Т.) в дозе 200 мкт/кг массы животного ежедневно в течении 7 дней или ГК в дозе 20 мкг/'кг массы животного ежедневно в течении 6 дней (длительное воздействие ГК), за 3 ч. (кратковременное воздействие ГК) или за 72 ч. (однократное введение) до забоя. Острый гепатит (ОГ) вызывали однократным, внутрибрю-шинным введением гелиотрина в дозе 20 мг/кт который формирмировался 2496 ч. Крысам с О Г внутрибрюшинно вводили экдистен в дозе 5 мг/кг в течение 3 дней. Контрольным крысам вводили растворитель. В экспериментах in vitro тимоцнты, когда указано, инкубировали ¡з среде Ас 1-100 нМ Т4 в течение 30 мин., или с 0,1-1,0 мкМ ГК в течение 20-40 мин., или с 100 мМ экдистеном в течение 30 мин.

Условия содержания и кормления животных соответствовали нормативным (Лоскутова, 1990). ' -

Коэффициент корреляции рассчитывали с помощью стандартного пакета программ MathCAD version 2.01 на IBM РК.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние тироксина на энергетический метаболизм тимоцитов

Специальная серия экспериментов была посвящена исследованию соотношения "быстрых" и "пролонгированных" эффектов тиреоидных гормонов в стимуляции дыхания и состояния энергетического сопряжения митохондрий в тимоцитах.

В результате внутримышечного введения крысам Т4 в дозе 200 мкг на 1 кг. массы животного в течение 7 дней наблюдалась стимуляция потребления кислорода изолированными тнмоцитами на 46% при использовании пирувата в качестве субстрата окисления (табл.1). В присутствии олигомицина скорость потребления кислорода тимоцитами тироксинизированных животных (V4) нн-гибировалась на 56%, тогда как в контроле - на 72%. Скорость дыхания тимоцитов, стимулированная 2,4-ДНФ, в этих условиях не превышала контрольной величины. Таким образом, введение животным Т| разобщает ОФ в митохондрий тимоцитов, о чем свидетельствует более высокий в сравнении с контролем уровень окисления нирувата в присутствии олигомицина.

Тиреондэктомия (ТЭ) крыс вызывает торможение скорости дыхания суспензии тимоцитов на 44% относительно клеток ложнотиреоидэктомированных (ЛТЭ) при использовании пирувата в качестве субстрата окисления (табл.1). Олигомицин ингибнрует скорость потребления кислорода в тимоцитах ТЭ крыс на 78%, в то время как в контроле и при ЛТЭ - на 72 и 71% соответственно. Эти данные указывают на то, что степень сопряжения ОФ митохондрий тимоцитов ТЭ крыс незначительно выше, чем в группе контрольных и ЛТЭ животных.

Таблица 1

Влияние гипертиреоза и тиреоидэктомии на энергетику тимоцитов крыс

Скорость потреб. Кислорода , нг-атом О/мин. 100 млн. кл.

Группа V,, or гр.гга V ohgünncin % ингиб. Vollg +DNP

VCM-)C oligo

Контроль 15,6 ±0,8 2,6 ±0,1 80 59,4 ± 1,5

Гипертиреоз 34,2 ±2,0 15,0 ±0,3 56 56,8 ±3,0

Лож.Тир.экт. 26,3 ± 2,2 3,2 ±0,1 " 87 52,7 ± 1,0

Тир.эктомия 15,1+0,5 1,5 + 0,3 90 48,6 ± 1,2

Среда инкубации: 145 mfvl NaCl, 4,6 тМ КС1, 1 Mm КН2Р04, 8 гаМ MOPS. 10 тМ пируват, 0,1 шМ СаС12, рН 7,4. Добавки: 0,2 мкг/мл oligomycin, 40 мкМ 2.4-ДНФ. В таблице даны средние из 6 экспериментов ± стандартная ошибка среднего (М±т).

I I

Таблица 2

Влияние трийодтиронина на энергетику тимоцитов in situ

Концентра- Скорость потреб. Кислорода, нг-атом О/мин. 100 млн. кл.

ция Т3, мкМ ^субстрат VoIigom>cin % нгибир. Vollgom + DNP

Vcvoct Oligo.

0 17,0+ 1.0 3,2 ±0,5 82 52,8 ±2,7

0,5 18,8 ± 1,8 3,8 ±0,4 79 58,0 ±4,0

1,0 29,2 ± 3,5 4,6 ±0,4 84 60,4 ± 5,2

Примечание. Преинкубация тимоцитов с Тз - 15 мин. Условия эксперимента

см.таблица 1

В другой серии экспериментов с преинкубацией тимоцитов крыс с 1 мкМ Тз в течение 15 мин. наблюдалась стимуляция окисления пирувага на 42%, однако, скорость дыхания в присутствии олигомицина при этом изменялась незначительно (табл.2). Максимальная скорость потребления кислорода, наблюдавшаяся в присутствии ДНФ, возрастала п пробах не более чем на 20%.

Хорошо известно, что при регуляции метаболизма гепатоцитов тиреоид-ными гормонами наблюдается быстрая стимуляция дыхания, обусловленная активацией адениннуклеотидтранслоказы митохондрий (Brand et ai.,1994: Gregory et al.,1992; Sterling 1991), которая не предотвращается ингибиторами синтеза белка и нуклеиновых кислот. Увеличение потребления кислорода органами-мишенями, так называемый "калоригенный эффект", - один из основных и наиболее специфических эффектов тироксина. Четкая корреляция между уровнем тиреоидных гормонов в крови и величиной дыхательного коэффициента в митохондриях, выделенных из органов-мишеней, дает представление о механизме калоригенного эффекта тироксина. Туракулов Я.Х., Гагельганс А.И. и др. (1972) в 60-70 годы постулировали, что первичное действие тиреоидных гормонов направлено на митохондриальные процессы, а эффекты на функцию генетического аппарата являются вторичными. Ими показано, что в присутствии тиреоидных гормонов резко увеличивается проницаемость митохондрий для одновалентных катионов К" и Na~, а разобщение ОФ осуществляется при довольно высоких его концентрациях 5х 10°-10""* М, т.е. под действием токсических доз тироксина, в то время как физиологические концентрации тироксина не оказывали заметного влияния на функции митохондрий.

Вероятно, эффект тиреоидных гормонов на метаболизм может быть опосредован активацией Са37кальмодулин-зависпмых процессов. Очевидно, к числу этих процессов могут быть отнесены и ферменты окислительного и энергетического обмена. С другой стороны, тиреоидные гормоны in vitro могут непосредственно воздействовать на мембрану митохондрий, при этом увеличивается активность некоторых компонентов дыхательной цепи и общая скорость поглощения кислорода митохондриями, даже когда синтез белка ингибирован.

В основе этих эффектов, по-видимому, лежит модификация ТГ микровязкости мембран митохондрий, которая усиливается в присутствии Са"*.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что "пролонгированное" действие тиреоидных гормонов на энергетику тимоцитов in vivo характеризуется стимуляцией дыхания и разобщением ОФ митохондрий тимоцитов, в то время как "быстрые" эффекты Tj in situ проявляются в стимуляции дыхания без значительного разобщения ОФ. Уменьшение скорости дыхания тимоцитов крыс с тиреодэктомией сопровождается увеличением степени сопряженности с синтезом АТФ.

3.2. Действие тироксина in vitro па распределение мембраносвязаипого Са2+ п изменение [Ca2+]¡„ в тнмоцитах крыс.

В связи с вышеизложенным нами было исследовано влияние тироксина на гомеостаз ионов кальция в тнмоцитах. При этом было установлено, что Т4 стимулирует рост уровня меморасвязаного Са" на плазмалемме тимоцитов (рис. 1а), которое усиливалось в присутствии 1мМ СаСЬ в связи с переходом внеклеточного Са"* в мембраносвязанное состояние. Рост уровня мембраносвя-занного Са"г под влиянием Т4 может быть результатом активации CV-транспоргирующих систем, в частности - Са-АТФазы плазмалемм (Segal, 1989), активность которой зависит от состояния Са"^-связываюшнх белков -КМ (Пестов и др.,1999, Wornic et al., 1988) и G-беплков. С помощью ингибиторов КМ - трифтазина или R24 (р»с. 16) удалось показать, что в Т4-стимулированных тнмоцитах активность КМ в 1,5-2 раза выше чем в контроле. В среде без Ca2t реакция на ингибиторы КМ не обнаружена.

Рис.1 (а,б,с). Влияние Т4 на интенсивность ХТЦ-флуоресценции: а) при добавлении 2 мМ ЭГТА; б) при добавлении 3 мкМ кальмидазолиума (пли 0,1 мМ трифтазина); с) при добавлении А1Р4- (А1Р4- применяли как смесь 5 мМ №Р + 25 мкМ А1С1з). 1 - Контроль, 2 1* нМ Т4, 3 - 10 нМ Т4. Добавляли 10 мкМ ВН(} для определения заполненности внутриклеточных немитохондри-альных Са~г -пулов.

Т4 стимулирует активность аденилатциклазы (АЦ) сопряженной с G¡,-белком. (Malbon et al.,1988). Вместе с тем, Т4-зависимая стимуляция активности ПКС'по Са"* -зависимому механизму (Meier et al.,1991) не исключает участия в этом процессе G-белков. сопряженных с активацией фосфолппазы С и, следовательно, ПКС.

Согласно нашим данным, Т4 стимулирует активность G-белков, сопряженных с Са~* -зависимыми ПКС, до A1F4- (активатор G-белков, стимулирующих ПКС), что указывает на возможность рецептор-опосредованного механизма действия Т4 на определенную часть Са"*-пула плазмалеммы, проявляющую чувствительность к тиреокдным гормонам в условиях ¡n vitro (рис. ¡с).

В 70-80 гг. было исследовано действие Т4 на состояние Са~-транспортирующпх систем изолированных МХ и ЭР ('Гуракулов и др.Л 980; Га-гельганс 1981; Crespo-Armas et al., 1988) - кальциевых депо, накапливающих Са" и препятствующих избыточному росту [Са""]ш в тимоцптах (Gukovskaya et al., 1986). Нами было показано, что в Т4-стимулированных тимоцптах наблюдалось более интенсивное по сравнению с контролем снижение ХТ1Д-флуоресцеишш в присутствии ингибиторов дыхания (1 мкМ антиминин А или смеси: 1 мкМ олигомицин + 0,33 мкг/мл ротенон). Следовательно в T4-cin-мулированных тимоцитах МХ способны активно накапливать Са~\ восстанавливая прежний уровень [Са"*],п, что вызывает стимуляцию дыхания. Присутствие Са"' в среде инкубации способствует его накоплению в мембранах МХ. причем Т) усиливает лот процесс, возможно, вследствие увеличения [Са" Увеличение Са~"-пула МХ может быть обусловлено как увеличением входа Са"* в клетку, так и мобилизацией Са"+ из внутренних не-МХ компартментов.

В этих экспериментах нами было впервые обнаружено, что действие Т4 in vitro на величину не-МХ Са"* пула было разнонаправленным и зависело от используемой дозы Т.,. С использованием блокаторов Са""-АТФазы ЭИР ортова-надата или BHQ было обнаружено, что физиологические концентрации Т4 1-10 нМ без инкубации стимулировали сокращение Са"'-пула ЭПР, что регистрировалось как снижение ХТЦ-флуоресценции. Действие Т( в до!ах более 10 нМ в течение 30 мин инкубации, напротив, вызывало рост размеров исследуемого пула. Наши результаты свидетельствуют, что снижение активности Са-АТФазы ЭПР при действии близких к физиологическим доз Т4 в первые минуты инкубации или в условиях преннкубации с 1 нМ. Т4 приводит к освобождению Са"" из ЭПР, возможно, по 1Р5 зависимому пути. При 30 мин. инкубации тимоцитов в присутствии 100 нМ Т4 наблюдался противоположный эффект, сопровождаемый активацией Са-АТФазы ЭПР и ростом количества мембраносвязанного Са"".

Выход Са2* из ЭПР сопряжен с стимуляцией Са"+ каналов рецептор-зависимым долгоживущим интермедиатом - 1Р3 или др. (Nishizuka,1984). С другой стороны, опустошение внутриклеточного депо индуцирует Са"*-зависимый вход Са2* (Gukovskaya et al.,1990). Спустя некоторое время, избыточный рост

[Ca:']¡„ способствует реаккумуляции Са2* в ЭР и активации Са-АТФазы плазма-леммы, что служит сигналом для включения механизмов поддержания кальциевого гомеостаза. Стимулирующее действие Т4 на дыхание МХ может осуществляться через увеличение [Са2+],п с последующей аккумуляцией Са2+ в МХ.

Результаты исследований показали, что Т4 стимулирует прирост [Са2*]ш тимощпов, регистрируемое по флуоресценции Fura-2/АМ, от уровня по-коя (115±5 нМ) до уровня 350±50-нМ. Он исчезает в присутствии 0,1 мМ Ni2* (бло-катора Са~+каналов), 0,1 мМ ЭГТА или в бескальциевой среде (рис.2). Действие Т4 на рост [Са"+];пбыло дозозависимым, достигая максимума при 0,1 мкМ гормона.

Для анализа вклада Са"'-зависимых протеинкиназ в активацию Са2' сигнала при гормональной стимуляции, мы использовали их специфические бло-каторы

Рис.2. Т4-зависимое влияние на [Са"+]ш втимоцитах

1-0,1 мкМ Т4 (контроль);

2-0,1 мкМ Т4 + 20 мкг/мл Кон А;

3 - 20 мкг/мл Кон А + 0,1 мкМ Т4;

4 - 250 нМ стауроспорина (StSp)

+ 0,1 мкМТ4;

5 - 1 мкМ неомицина + 0,1 мкМТ4; 6-0,1 мМ ЭГТА или 0,1 мМ Ni2'

+ 0,1 мкМ Т4

(Hidaka et al., 1981). Т4-зависимый прирост цитозольного Са2+ блокировался стауроспорином (ингибитор протеинкиназ), или неомицином (ингибитор фос-фолипазы С (ФЛС), что указывает на рецептор-зависимое вовлечение ФлС, системы гидролиза инозитфосфатов и Са'^-зависимых протеинкиназ в генерацию Са"+-сигната от Т4 (рис.2). Об этом же свидетельствует и тот факт, что Т4 почти полностью блокирует Са"' ответ клеток на Con А. В свою очередь, Con А блокирует Т4-сигнал только на 50%, что возможно, если передача сигнала от Т4-рецептора идет по нескольким путям (рис.2). Рост [Ca_t ],„ под действием Т4 был сравним с действием Con А, который, как предполагается, вызывает рост [Са2+]|„ через систему гидролиза инозитфосфатов (Altman et al.,1990).

Дополнительный прирост [Ca2f]¡n наблюдался и в экспериментах после блокирования Са-АТФазы ЭПР, поскольку МХ в условиях роста [Са2+],„ не только не освобождают Са"\ но, напротив, способствуют снижению [Са2,]ш (Евтодиепко,2000; Зинченко,2000). Можно полагать в связи с этим, что Т4 открывает рецептор-зависимые или Са2^-управляемые Са24"-каналы плазмалеммы. Возможно, что Т4 при этом не является непосредственным регулятором работы Са2+-каналов, а осуществляет свое влияние на уровне посредников, роль кото-

рых могут играть АЛ или продукты ее окисления (Нокт е1 а1.,1985), инозит-фосфаты (Вегпс^е,1997), Са2+-зависимые протеинкиназы или их продукты (М1БЫ2ика, 1984), а, возможно, и комбинация ряда мессенджеров.

В рецептор-зависимых процессах, сопровождающихся ростом [Са~+]ш часто наблюдают освобождение АА и продуктов ее окисления, повышение активности ФлАт и липоксигеназы. Ряд метаболитов липоксигеназного пути окисления АА, в свою очередь, может активировать рецептор-зависимый вход Са~* в клетку, возможно, открывая Са^-каналы (ОеиЬагп е1 а1., 1993). Гипертнреоз в мембранах клеток крови приводит к увеличению содержания ненасыщенных СЖК (Робб е1 а1.,1990), в том числе - и АА. Нами было показано, что рост [Са"т]ш при действии Т.| почти полностью блокировался внесением ингибитора метаболизма АА нордигидро-гуаретиковой кислоты ^БСА) и на 50% при ин-гибированни ФлАг бром-фенацилбромидом (ВгРЬВг) (рис.3). Следовательно в развитии Т4-зависимого роста [Са~*]1П принимают участие ФлА2 и продукты метаболизма АА.

[Са21;„,нМ —

Рис.З Изменение [Са"+],п под действием: 1-0,1 мкМ Т4 (контроль); 2 - 5 мкМ ВгРЬВг + 0,1 мкМ Т4;

3-10 мкМ NDGA + 0,1 мкМ Т4;

4- 10 мкМ BHQ + 0,1 мкМ Т4

5-10 мкМ BHQ + 5 мкМ BrPhBr + 0,1 мкМ Т4;

6 - 10 мк.М BI-IQ + 10 мкМ NDGA или 250 нМ StSp, или 2 мкМ неомицина + 0,1 мкМ Т4.

500.

300.

100-

Установлено, что дополнительного роста Са~+ после действия блокаторов Са-АТФаз ЭПР не наблюдалось, если перед Т4 были добавлены ингибиторы Са"'-зависимых протеинкнназ и фосфолипаз (SiSp, Н7, неоминин) (рис.3).

Известно, что ТГ стимулируют рост [цАМФ]ш и рост [Ca~+],n (Segal,-1987,1989). При этом, нельзя исключить роль аденилатциклазной системы в регуляции входа [Ca2+]in (Seamon et al., 1981). Однако, судя по полученным нами данным, в формировании роста [Ca~T]¡„ тимоцитов в ответ на добавление Т4 ни ПКА, ни АЦ не принимают непосредственного участия, т.к. действие цАМФ-повышающих агентов, форсколина или проникающего аналога цАМФ (дибутирил-цАМФ), не влияли на величину Т4-зависимого клеточного ответа. Возможно, что Т4-рецептор сопряжен с двумя эффекторными молекулами -ФЛС, обеспечивающей рост [Са"*]ш, и с АЦ, обеспечивающей рост [цАМФ]|„. В этом случае Т4-рецептор сопряжён с двумя G-белками: Gp, связывающим Т4-рецептор с ФЛС, и с Gs, связывающим рецептор с АЦ. Следовательно, рост

[цАМФ]ш и рост [Ca2f]m в тимоцитах может идти одновременно и, возможно, независимо, вызывая активацию тимоцитов в различных направлениях.

3.3. Дозозавнсн.мын характер влияния гндрокортнзона на энергетический метаболизм тимоцитов крыс.

Эффекты ГК на энергетический метаболизм тимоцитов имели дозоза-висимый характер, т.е. определялись временем действия и количеством гормона. Однократное введение ГК ¡n vivo за 72 ч. до забоя вызывало стимуляцию скорости дыхания тимоцитов с разобщением окислительного фосфорилирова-Пия (ОФ) (таблица 3).

Таблица 3

Влияние гидрокортизона in vivo и in vitro на энергетику тимоцитов крыс

Группа Животных Скорость потреб. 02, нг-атом О/мин. 100 млн к.т.

Vc>6crpara \ 7 * ohiJOHl>ein %инг.\'с>Г)с Ölig. VuM+DNP

Контроль 16,0 ±0,8 4,0 ±0,1 75 35,4 ± 1,5

ГК 1 мкМ 25,0 ±0,2 5,0 ±0,3 80 36.0 ±3,0

ГК 10 мкМ 19,2 ±0,5 19,0 ±0,3 0 19,0 ± 0.1

ГК 20 мкг/кг 27,1 ±0,5 5,0 ±0,6 81 39,6 ± 1,2

За 3 ч. до забоя

ГК 20 мкг/кг 27,4 ± 0,2 19,3 ±0,1 29 39,0 ± 1,0

За 72 ч. до забоя

ГК 20 мкт/кг 5,0 ±0,0 5,0 ± 0,0 0 12,3 ±0,4

Ьжеднев. 6 дней

Среда инкубации: 145 гпМ NaCi, 4,6 гаМ KCl, 1 Mm КН2Р04, 8 mM MOPS, 10 тМ нируват, 0,1 гпМ СаС12, pH 7,4. В таблице даны средние из 6 экспериментов! стандартная ошибка среднего (М±ш).

Таблица 4

Влияние 1-кратного введения ГК животным (20 мкг/мл за 3 часа до забоя) на энергетику тимоцитов с различными субстратами (10 мМ).

Группа Животных Субстрат окисления Скорость нотреб. 02, нг-атом О/мин. 10s кл.

V - ^о||<?ОП1\С1П V, 4-DVI"

Контроль Контроль ГК ГК Пир>ват Глюкоза Пируват Глюкоза 16,0 ±0,1 17,0 ±0,3 25,0 ± 0,1 12,4 ±0,6 4,0 ± 0,4 6,0 ±0,1 5,0 ±0,0 5,0 ± 0,9 35,5 ±0,2 29,0 ±0,3 36,0 ±0,6 25,0 ±0.3

Добавки: 0,2 мкг/мл олигомицин, 40 мкМ 2.4-ДНФ. Условия эксперимента см. таблица 3.

Кратковременное действие ГК (однократное ведение ГК за 3 часа до забоя) вызывало стимуляцию дыхания без разобщения ОФ.

Бь1Л0 установлено, что результаты преинкубации тимоцитов in vitro с 1 мкМ ГК сравнимы с данными, полученными в условиях кратковременного введения ГК in vivo. Преинкубация с 10 мкМ ГК in vitro не стимулировала дыхания, и его скорость при окислении пирувата у контрольных и опытных проб была примерно одинаковой (табл.3). Присутствие олигомицпна практически не изменяло исходной скорости окисления субстратов, а ДНФ не вызывал стимуляции дыхания у ГК-обработанных клеток. Присутствие сукцината значительно стимулировало дыхание клеток, что свидетельствует о повреждении плаз-малеммы и цитотоксическом эффекте ГК. Аналогичные результаты получены в экспериментах in vivo. При длительном введении ГК скорость окисления пирувата (табл.3) была ниже, чем в контроле, олигомицин практически не ингиби-ровал дыхание, а в присутствии ДПФ наблюдалась меньшая стимуляция, чем в контроле, что указывает на значительное разобщение ОФ и уменьшение активности дыхательной цепи. Эти результаты согласуются с положением о том. что длительное действие и высокие концентрации ГК оказывают нитотоксическое действие и запускают механизм апоптоза клетки (Terri et al, 1987).

Известно, что ГК стимулирует глюконеогенез в клетках печени и повышает концентрацию глюкозы в крови (Hassan et al., 1986; Корнева и др., 19S8). Введение ГК за 3 часа до забоя и преинкубапия тимоцитов с 1 мкМ ГК вызывали ингиопрование дыхания тимоцитов при использовании глюкозы как cvö-страта окисления. Гели к ГК-стимулнрованпым тимоцптами in vivo или in vitro вносили пиру ват, то дыхание тимоцитов усиливалось (табл.4), свидетельствуя о росте скорости потребления кислорода без признаков разобщения ОФ. Полученные данные подтверждают предположение о том, что ГК моделирует транспортные процессы на уровне плазматической и митохондрнальных мембран, блокирует транспорт глюкозы в клетку, не препятствуя транспорт} пирувата в тнмошггы и его окислению в MX.

3.4. Действие ГК in vitro на уровень мембраносвязанного и ионизированного Са"+ в нитозолс тимоцитов крыс.

Впервые было установлено, что ГК стимулирует рост уровня мембрано-связанного Са"т на плазмалемме тимоцитов, которое усиливается в прнсутсвип 1 мМ Ca"4 в среде инкубации.

Рост количества мембраносвязанного Ca'' на плазмалемме тимоцитов под влиянием ГК может быть результатом активации Са'^-транспортируюших систем, в частности - Са-АТФазы плазмалеммы, активность которой зависит от состояния кальций-связывающих белков - КМ н (или) G-белков (Gukovskaya, 1991; Iseki et al.,1993; Пестов и др.,1999). С помощью ингибиторов КМ (триф-тазин или кальмидазолиум) нами было показано, что в ГК-стимулированных тимоцитах КМ инактивирован (рис.4), однако, уровень мембраносвязанного

Са:~ на плазмалемме не снижается, а увеличивается. Можно предположить, что Са-АТФазу плазмалеммы стимулирут неизвестный, внутриклеточный регулятор - роль которого может выполнять трифтазин-нечувствительный белок (Петруняка и др., 1989). При оценке активности G-белков in vitro нами показано, что ГК стимулировал ее уже до действия AlFj-. Это свидетельствует о возможности рецептор-опосредованного механизма действия ГК на определенную часть Са~'-пула плазмалеммы.

Рис.4 Влияние ГК на интенсивность ХТЦ- флуоресценции тнмоцитов в присутствии блокаторов КМ: 3 мкМ кальмидазолиума (R24) или 0,1 мМ трифтазина + 2 мМ ЭГТА. 1 - контроль, 2-0,1-1 мкМ ГК.

При последовательном добавлении ингибиторов Са-АТФазы ЭПР и ингибиторов дыхания MX нами показано, что Са~+, выходящий из ретикулума при блокировании Са-АТФазы, накапливается в MX, и, наоборот, Са:', высвобождаемый из MX, аккумулируется в ЭР (рис.5а).

Рис.5 Влияние ГК на интенсивность флуоресценции ХТЦ при использовании ингибиторов Са2+-пулов МХ и ЭР: а - перераспределение мембраносвязанного Са2*" в контроле; б - в присутствии 1мкМ антимицина А; в - при добавлении 10 мкМ ВНР. 1 - Контроль, 2-0,1 мкМ ГК, 3 - 1 мкМ ГК.

МХ принимают участие в регуляции [Са"т]ш в ка1.:стве "краткосрочного" Са^-депо, когда при повышении [Са~*];„ внутримитохондриальный уровень

• »

[Са2+] также увеличивается, что сопровождается усилением дыхательной активности, вследствие модулирования активности системы Н7 Са2*-обмена. 0,1-I мкМ-ГК способствует накоплению Са2+ в МХ, при этом увеличение [Са2+],п в МХ в наших экспериментах обусловлено мобилизацией Са2+ из внутренних компартментов, о чем свидетельствует снижение содержания Са"+ в ЭПР (рис.5в), сопровождаемое ростом [Ca2+]¡„. Наблюдавшиеся нами эффекты ГК на состояние МХ пула Са"* в условиях in situ (рис.56) в целом совпадают с эффектом кратковременного действия ГК in vivo.

Известно, что ГК-зависимый апоптоз связан с ростом [Са"*]|П. за счет его освобождения из ЭПР (Iwata et al., 1994), однако, этот процесс может происходить и в отсутствие роста [Са~*]|П. (Хансон,1997) и, что в первые часы инкубации увеличение [Са~+]ш. после добавления ГК не является обязательным условием реализации его эффектов (Buttgereit et al., 1993). На рис. 6 показано Независимое уменьшение [Са~*],„. тимоцитов на 90±15 нМ от уровня покоя. В течение 10 и более мин. происходило восстановление прежнего уровня [Ca**]¡„. и затем незначительный рост [Са"*]т.. Внесение в среду инкубации 2 мМ ЭГТА или 1 мкМ SH-реагента тимеросала - инактиватора рецепторов плазмалеммы, пли 0,1 мМ ионов Ni2+ приводило к исчезновению картины ГК-зависимого снижения [Са"*]1П.

Рис.6. Влияние ГК на [Са2*],,,. с учетом эффектов на у ровне Са~-каналов, протеинкиназ, фосфолипаз, аденилатциклазы. 1 - 1 мкМ ГК (контроль); 2-2 мМ ЭГТА или 0,1 мМ Ni2*;

или I мкМ тимеросал т мкМ ГК; 3 - 250 нМ StSp + 1 мкМ ГК;

4-10 мкМ Forsk. + ! мкМ ГК;

5-10 мкМ BrPhBr + 1 мкМ ГК.

Внесение ингибитора ФлА2 10 мкМ бромфенацилбромида (BrPhBr) в среду инкубации перед ГК вызывает резкое снижение уровня [Са"*],„. (рис.6), т.е. блокирование ФлАт стимулирует действие ГК на систему снижения [Са"*],„ на уровне плазмалеммы тимоцитов. Известно, что активация ФлА? вызывает освобождение арахидоновой кислоты (АА), которая стимулирует рост [Са2+]1п. (Трепакова,1994). По-видимому, ГК и продукты окисления АА оказывают диаметрально противоположное действие на систему транспорта СаЛ

Снижение [Са"*],„. при действии ГК может быть опосредовано либо выходом Са"^ из клетки, хотя нет показаний в пользу ГК-активации Са-АТФазы п.гзмалеммы (Tienrungroj et al., 1987), но можно допустить наличие ГК-активируемого трифтазин-независи.мого регулятора, стимулирующего Са-

150' ICO-SO

ССа'%, НМ

\тн.

АТФазу (Петруняка, 1989), либо входом цитозольиого Са2* в ретнкулум (что исключается на основании наших результатов - рис.5в) или в MX, которые, по современным представлениям, могут аккумулировать Са"* даже при концентрации его во внешней среде 0,4-0,6 мкМ (Евтодиенко,2000), либо блокированием Са~'-каналов плазмалеммы, что влечет за собой снижение уровня [Са"*],п. При этом именно последнее предположение подтверждается результатами, полученными при блокировании Са2*-каналов ионами Ni"* (Rink, 1990). В присутствии [Са"*],„.-повышающих агентов (иономицина, Con Л, BHQ или ванада-та) ГК снижал [Са~*]ш. на 50% (рис. 7а), что также указывает на ГК-зависнмое блокирование входа внешнего Са"+. Если ГК блокирует Са~*-каналы

£0аг%,н(1 ГК

Рис. 7. Влияние ГК на [Са:"]ш в тимоцитах: а) 1 - 10 мкМ BHQ (или 0,1 мМ ва-надата) + 1 мкМ ГК; 2-10 нМ иономицина (iono.) + 1 мкМ ГК; 3 - 20 мкг/мл Кон А + 1 мкМ ГК; 4 - 1 мкМ ГК; б) под действием: 1-10 мкМ BI1Q, 2 - 1 мкМ ГК + 10 мкМ BHQ; 3 - 5 мкМ А А; 4 - 20 мкг/мл Коп А; 5 - 1 мкМ ГК + 5 мкМ АА; 6 - 1 мкМ ГК + 20 мкг/мл Кон А.

плазмалеммы тимоцитов со снижением [Са2^,,., то вслед за блокированием поступления внешнего Са"^ может идти освобождение Са~+ из внутриклеточных (не-МХ) пулов, необходимое для поддержания Са~"-гомеостаза клетки, и вслед за этим - незначительный рост [Са"*],„. В пользу ГК-зависимого блокирования Са"*-каналов свидетельствует и тот факт, что после добавления ГК ни Соп А, ни АА не вызывали обычного прироста [Ca"*]i„, а прирост [Са"г]т при добавлении BHQ после ГК был ниже, чем в контроле (рис. 76). Этот процесс, возможно, опосредован изменением активностей протеинкиназ (Hoeck et al.,1993; Pallogianni et al.,1993). fie исключается и путь действия ГК через модулирование функционального состояния Са"*-актпвируемой протеинкиназы С (ПКС) посредством блокирования работь: ФлА: (Kostellow et al., 1993). Блока-торы Са2+-зависимых протеинкиназ в' нгших экспериментах не оказывали ви-

димого влияния на формирование ГК-индуцируемого Са2*-ответа, что не исключает участия в этом процессе других изоформ ПКС (Akimoto et а!., 1994).

Известно, что ГК стимулирует аденилатциклазу (АЦ) в тимоцитах крыс (Сергеев и др., 1987), возможно, что процесс блокирования Са~+-каналов обусловлен ростом [цАМФ]„,. Увеличение уровня [цАМФ]ш сопровождается ростом активности протеинкиназы (ITKA), которая способна фосфорилировать ФЛС-gamma и ингибировать образование 1Р3 по принципу обратной связи, снижая [Са~*]„„ что опосредовано G-белками (Gannon, 1990). Однако вопрос о возможном ГК-зависимом блокировании Са"+-каналов тимоцитов посредством увеличения продукции цАМФ подлежит дальнейшему исследованию, т.к. стимуляция ПКА в наших экспериментах форсколином и присутствие дибутирил-цАМФ не оказывали видимого влияния на ГК-зависимый Са~+-сигнал.

3.5. Рецептор-пезаписнмые эффекты пестицидов на эпергегпчсскнн метаболизм тимоцитов и суспензии .митохондрии

3.5.1. Гербициды. Среди исследованных гербицидов хлортолурон, суффикс, барбан и бенсулпд, только последние два обладают выраженными мем-бранотропнымн свойствами. Из полученных данных следует, что все изученные

Таблица 5.

Действие гербицидов на энергетический метаболизм тимоцитов

Вещество 100 мк.\1 Скорость потреб. От, нг-атом О/мин на 10 ,s кл %инг Vsubs.Ob

Vsiibstr.i'e v(,„„„ Vi.j-DNp

Контроль 19 ± 1,2 4,4 ±0,5 21 ±0.6 76

Хлортолурон ] 9 ± 1,2 3,2 ±0,5 21 ±0.6 83

Суффикс 12 ±0,3 4,3 ±0,4 10 ±0,2 64

Барбан 7 + 0,5 4,8 ±2,0 10 ±0,5 33

Бенсулпд 14 ± 1,6 14 ±0.4 15 ± 3,2 0

Среда инкубации: 145 mM NaCI, 4,6 inM КС1, 1 Mm KH2 P04, S mM MOPS, 10 mM пируват, 0,1 mM CaCl2, pH 7,4. Добавки: 0,2 мкг/мл oligomycin, 40 мкМ

2.4-ДНФ. В таблице даны средние из 6 экспериментов ± стандартная ошибка среднего (М±т).

соединения в концентрации 100 мкМ являются разобщителями окислительного фосфорилирования на уровне изолированной суспензии митохондрийи, а на уровне суспензии тимоцитов (таблица 5) ингибируют дыхание с разобщением.

Разобщающее действие этих соединений является следствием их прото-нофорной активности. Одновременные разобщающие и ингибирующне эффекты, в зависимости от уровня воздействия, по-видимому, обусловлены опосредованным действием соединений на митохондриальную мембрану через

механизмы взаимодействия с факторами плазматической мембраны или цито-золем. При этом исключается предположение о рецептор-опосредованном механизме передачи сигнала т.к. эффекты исследованных гербицидов на всех уровнях проявляются в одном концентрационном диапазоне. Известно, что к гербицидам более чувствительна система окислительного фосфорилировання , чем электрон-транспортная цепь (Федке, 1985).

Мембранотоксическос действие исследованных гербицидов на параметры трансформации энергии коррелирует с их общей токсичностью.

3.5.2. Инсектициды. К числу активных препаратов с выраженными инсектицидными свойствами относятся амбуш и токутион. Пиретроидный инсектицид амбуш оказывает действие на мембрану митохондрий печени крыс при достаточно высоких концентрациях. Учитывая, что амбуш не проявляет какой-либо активности на уровне клетки, можно констатировать о его низкой токсичности по отношению к энергетике теплокровных животных, что коррелирует с показателем его общей токсичности (до 4000 мг/кг), характеризующий его как умеренно токсичный.

Таблица 6.

Действие токутиона на энергетический метаболизм тимоцитов

Концентрация Скорость погоеб. О:, нг-атом О/мин на 10 8 кл %инг

Токутиона, мкМ ^иМкис V: 4-ом1 У

Контроль 12+ 1,2 4,4 ± 0,5 28 ±0,6 76

50 9 ±0,2 8 ±0,5 21 ±0,6 25

100 5± 1,3 4 ±0,4 13 ±0,2 58

200 4 ±0,5 4 ±2,0 9 ±0,5 66

Примечание: условия эксперимента см. в таблице 5.

Токутион [0-(2,4-дихлорфенил)-5-иропил О-этилтиофосфат] является инсектицидом широкого диапазона. Результаты наших исследований показали, что токутион (таблица 6) (50-200 мкМ) ингибирует дыхание тимоцитов крыс. На изолированной суспензии митохондрий определили, что блокирование переноса электронов происходит на участке цитохромов "Ь" и "с", т.е. токутион обладает антимицин А-подобным действием.

В присутствии этого инсектицида увеличивается проницаемость деэ-нергизованных митохондрий для Са""*, но не для протонов Токутион-

стимулированное набухание наиболее выражено в присутствии ионов магния и увеличение проницаемости мембраны осуществляется при наличии токутиона в среде даже в концентрации 6 мкМ. Известно, что ионы магния являются физиологическими антагонистами ионов кальция, вызывающих серьезные повреждения митохондрий при высоких концентрациях.

В концентрации 40 мкМ этот препарат тормозит скорость кальций-зависимого высокоамплитудного набухания митохондрий, снимая повреждающий эффект кальция на 80%. Увеличивает Ca"* "ёмкость" митохондрий до 175 нмоль Са/мг белка против контроля 131 нмоль Са/белка.

Отмеченные эффекты токутиона на функциональное состояние митохондрий указывают на циклоспорин А- подобное ингибирующее действие инсектицида на неспецифическую пору во внутренней мембране митохондрий (Crompton et al.,1988; Halestrap et al., 1999). Ионофорная активность токутиона, для Mg"T наряду с циклоспорин-подобным эффектом может обусловить стабилизацию мембран MX в условиях Са24-индуцируемых повреждений.

3.5.3. Фунгициды - производные 1,4-нафтох лиона. 1,4-нафтохиноны принадлежат к фунгицидам природного происхождения. Их получают как из растительного материала - кожуры грецкого ореха Juglans regia, аравийского кустарника Lcnvsonia biennis (хна) и т.д.

Таблица 7.

Влияние юглона и 2-оксшоглона на скорость дыхания митохондрий печени крыс на фоне ингибиторов дыхания цепи..

Условия Эксперимента Скор. Потреб. От в состоял.V4 нг-атом О/мин на 1 мг белка

контроль Юглон 1 мкМ Юглон 10 мкМ 2-оксиюглон 100 мкМ

Ротенон+фунг Антим.А+фун KCN+фунг. 5 ±0,4 2 ±0,7 1,3 ±0,0 14 ±0,6 11 ± 0,2 . 9 ±0,2 36 ±1,3 27 ± 0,9 26 ± 0,9 10 ±0,6 12 ±0,2 9 ± 1,1

Среда инкубации: 0,1 гаМ KCl, 10 mM трис-ампн, 1 шМ КН2 РОд, глутмат+ма-лат по 5 шМ, pH 7,1. Белок MX - 3,2 мг/мл.

Добавки: ротенон - 1 мкг/мл, антимицин А - 1 мкг/мл, KCN - 1 гаМ.

Среди исследованных фунгицидов сциталон, флавиолин, 3,3-бифлави-олин практически не влияют на дыхание на уровне клетки, в то время как юг-лон (1мкМ) и 2-оксиюглон (100 мкМ) обладают менадионподобным действием. Из таблици 7 видно, что юглон и 2-оксиюглон снимают блокирющее действие ингибиторов дыхания митохондиальной мембраны - ротенона, антимицина А, KCN. Следует отметить, что иглон и 2-оксиюглон шунтировали дыхательную цепь в присутствии ингибиторов как на клеточном так и на субклеточном уровнях.

При использовании НАД-зависимых субстратов окисления юглон с концентрации 1-10 мкМ, по возростающей, стимулировал дыхание в 3 и 4 метаболических состояниях по Чансу т.е. разобщал ОФ митохондрий. Аналогичные эффекты в случае 2-оксиюглона отмечаются, начиная с концентрации 10 мкМ.

На уровне клетки влияние юглона, 2-оксиюглона на дыхание и энергетический метаболизм суспензии тимоцитов крыс проявлялось в том же концентрационном диапазоне (таблица 8). В этих экспериментах юглон (1 мкМ) стимулировал исходное дыхание тимоцитов на 33% и разобщал окислительное фосфорилиро-вание, о чем свидетельствует увеличение скорости окисления пирувата в присутствии олигомицина на 72% относительно контрольных данных (таблица 8). Максимальное разобщение ОФ митохондрий в тнмоцитах наблюдается в присутствии юглона в концентрации 10 мкМ, Эффективность 2-оксиюглона в этой серии экспериментов, как и в случае изолированных митохондрий, на два порядка меньше, чем у юглона.

Таблица 8.

Влияние юглона и 2-оксиюглона на энергетический метаболизм тимоцитов

Исследуемое Концентра- Скор. Потреб. О , нг-атом О/мин.на 10м кл.

Вещество ция, мкМ

Контроль 18 ± 0,7 4 ±0,4 42 ±0,8

Юглон 1 27 ±0,4 20 ±0,3 41 ±1,0

10 32 ±0,6 32 ±0,6 49 ±0.9

2-оксиюглон 100 28 ±0,6 22 ±1,2 50 ±0,8

(Условия экспериментов см. в таблице 5.)

Следовательно, можно констатировать, что юглон (1-10 мкМ) и 2-оксиюглон (100 мкМ) обладают менадион-подобным действием на мембрану митохондрий, причем активность юглона примерно на порядок выше, чем у классического препарата менадиона.

Исследованные фунгициды по-разному действуют на кинетику набухания деэнергизованных митохондрий в различных изоосмотических растворах солей нитрата. Стимуляция набухания деэнергизованных митохондрий отмечена только в присутствии юглона и 2-оксиюглона. Юглон является эффективным индуктором проницаемости для ионов Н\ К+, Mg:!+, но не Са2\ Очевидно наибольшая активность по протонам в определенной степени определяет разобщающее действие юглона. 2-оксиюглон стимулирует проницаемость внутренних мембран митохондрий только для ионов Н*, К+ и Mg"^

Таким образом, можно сделать вывод о том, что плазматическая мембрана проницаема для юглона и 2-оксиюглона, в результате чего они могут оказывать менадион-подобное действие на функциональное состояние митохондрий в условиях целой клетки.

3.5.4. Дефолианты. Дефолианты обладают разнообразными по характеру и силе мембранотропными свойствами. В отношении целостной клетки классические дефолианты бутифос, дропп и бутил-каптакс исследованы впервые (таблица 9). Бутифос (10-100 мкМ) ингибируе скорость дыхания ти-

моцитов, с разобщением окислительного фосфорилирования. Дропп стимулирует дыхание с разобщением ОФ. Бутил-каптакс на уровне клетки также является разобщителем ОФ.

Эффекты этих дефолиантов полностью отражают обнаруженное ранее действие на энергетику суспензии митохондрий (Очилов,1989). Нами были изучены перспективные препараты хиназопин, этрел, геметрел, сихат, АМПБ. АЦИК, среди которых наименьшую токсичность проявил хиназопин и ТБАБ.

Таблица 9.

Эффект дефолиантов на процесс дыхания тимоцитов крыс

Дефолиант Конц-ция,

Контроль

Бутнфос 10

100

Дропп 10

100

Бутил-каптакс 100

Хиназопин 100

Этрел 100

Геметрел 100

Сихат 100

АМПБ 100

ТБАБ 100

АЦПК 100

Скор. Потреб.О;, нг-атом О/мин.на 10х кл.

^иЫг.цс V: (.ом*

11 ±0,7 3,3± 0,4 17 ±0,8

8 ±0,4 3,9 ±0,3 15 ±1,0

5 ±0,6 5 ±0,6 6 + 0,9

14 ±0,6 9,1 ±1,2 19 ±0,8

16 ±0,3 16 ±0,3 21 ±2,1

11 ±1,8 4,2 ±1,8 15 ± 0,2

11 ±0,4 3 ±0,8 19 ± 1,2

15 ±3,0 6 ±2,1 18 ±0,3

17 ±2,4 10,5 ±0,2 17 ±0,3

17 ±2,2 9 ± 0,2 18 ± 1,0

8 ±,5 3,3 ±0,6 20 ± 1,8

10 ±2,2 1,3 ±0,4 22 ± 2,5

16 + 0,4 6,2 ± 0.6 19 ± 1.8

(Условия эксперимента см. в таблице 5)

Соединение АМПБ ингибирует дыхание клеток по типу олигомишша, т.к. в присутствии 2.4-ДНФ полностью восстанавливается максимально стимулированная скорость окисления глюкозы (таблица 9).

Нами показано, что в отличие от бутифоса дронпа и бутил-каптакса, обладающих значительной мембранной активностью, остальные изученные препараты (10-100 мкМ) практически не влияли на проницаемость мембраны митохондрий для одно- и двухвалентных катионов, что в основном коррелирует е их действием на ОФ и свидетельствует о их низкой токсичности.

3.6. Влияннс фармпрепаратов на энергетический .метаболизм

3.6.1. Эффекты экднетена на энергетический метаболизм митохондрий в норме н при патологии. Фитоэкдистероид, выделенный из левзеи саф-лоровидной (экдистерон), обладает гепатопротекторными свойствами, что бы-

ло установлено в экспериментах in vivo (Алматов и др, 1985). Нами было исследовано влияние экднстена на энергетический метаболизм тимоцитов в экспериментах in vivo, in situ и in vitro в норме и при остром гепатите (ОГ), вызванном введение гелиотрина.

В таблице 10 представлены данные о влиянии длительного введения экдн-стерона (7 дней по 5 мг/кг) на энергетический метаболизм тимоцитов крыс. Препарат улучшает показатели энергообеспечения тимоцитов, поскольку скорость окисления пирувата в тимоцитах в присутствии олигомицина ингиби-руется на 92% против контроля 72%, т.е. дыхание клеток в опыте в большей степени сопряжено с синтезом АТФ.

Таблица 10

Влияние экднстена на дыхание тимоцитов in vivo

Скорость потреб. От, нг-атом О/мин на 10 s кл %инг

Группы ^substrate V()„„o Vi.4.[)NI> Vitral «ligo.

Контороль 29,0+1,2 8+0,8 50 72

Экдистен 18±1,5 1,5±0.0 48 92

Примечание: Экдистен вводили крысам орально в течение 7 дней по 5 мг/кг. Субстрат окисления - пируват 10 мМ. Остальные условия см..в таблице 5. Добавки: олигомицин-0.2 мкг/мл, 2,4-ДНФ-Ю нмоль.

Следует отметить, что дыхание тнмоцшов, максимально стимулированное ДНФ, во всех случаях мало отличается от контроля, что свидетельствует о практически неизменном количестве дыхательных цепочек в тимоцигах животных, которым вводили экдистен.

Одновременно с экспериментами in vivo на тимоцитах крыс, которым вводили экдистен, исследовалось влияние этого препарата на параметры ОФ суспензии митохондрий печени крыс. Результаты свидетельствуют о том, что введение экднстена в течение 7 дней снижает дыхательную активность, но увеличивает степень сопряженности ОФ митохондрий печени крыс.

Известно, что дыхание митохондрий в тимоцитах мало отличается от дыхания изолированных митохондрии печени крыс (Мохова, 1987). Поэтому "быстрые" эффекты экднстена исследовались на изолированной суспензии интакг-ных митохондрий печени крыс in vitro и на суспензии тимоцитов in situ.

В этой серии экспериментов экдистен в концентрации 10"4 незначительно изменял параметры ОФ суспензии митохондрий с увеличением ДК на 10-15%. Однако, с другой стороны, в экспериментах на тимоцитах экдистен в концентрациях порядка 10'4-10"3 М практически не влияет на энергетический метаболизм. Это явление, расценивается, как неспособность препарата проникать через плазматическую мембрану тимоцитов и непосредственно взаимодействовать с мембраной митохондрий. Можно предположить, что в основе регуляции экдистероном энергетического обмена клеток имеет место следующий каскад

событий. Экдистен взаимодействует с рецепторами на плазмадемме, с передачей сигнала на генетический аппарат, с последующим синтезом внутриклеточных экдистен-зависимых регуляторов - посредников действия на функции митохондрий. Незначительные эффекты in vitro на уровне суспензии митохондрий имеют, скорее всего, неспецифический характер.

Далее в экспериментах in vivo было исследовано влияние: а) - экдистена (Э) в дозе 5 мг/кг; б) - экдистена инкапсулированного в липосомы (Э+Л) в дозе 5 мг/кг экдистена + 200 мг/кг липосом; в) - липосом (JI) в дозе 200 мг/кг на ОФ и цитохромоксидазную активность митохондрии и на энергетику тимоцитов крыс с острым гелиотриновым гепатитом (гелиотрин - 300 мг/кг).

Установлено, что введение гелиотрина через 24-96 часов вызывает разобщение ОФ митохондрий печени в два раза относительно контроля. При этом обнаружено, что ОГ снижает цитохромоксидазную активность гомогената печени крыс о чем свидетельствует снижение скорости окисления аскорбата в присутствии ТМПД (рис.8). . .

Известно, что критерием изменения окислительного обмена является снижение концентрации цитохромов в печеночной ткани или уменьшение цито-хромоксидазной активности гомогената печени (Корниенко, 1979). Поэтому восстановление активности цитохромоксидазы в гомогенате печени крыс с 01". которым вводили Э, Э+Л, Л в течение 3 дней (рис.8), свидетельствует о положительном влиянии препаратов на окислительный обмен печени в целом.

Введение экдистена крысам с О Г снимает токсическое действие гелиотрина на параметры ОФ MX т.е. восстанавливается уровень сопряжения ОФ, а метаболические состояния по Чансу приближаются до уровня контроля. Нам не удалось исследовать влияние экдистена в экспериментах in situ на тимоцптах крыс с ОГ т.к. у этих животных практически отсутствовал тимус.

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что регуляция энергетического метаболизма экдпетеном проявляется только в экспериментах in vivo (пролонгированные) и практически не проявляется in vitro (быстрые).

Эффекты экдистена имеют выраженный анаболический характер, о чем свидетельствуют данные, о снижении дыхательной активности, увеличении степени сопряженности ОФ и восстановлении активности цитохромоксидазы митохондрий печени на фоне токсического воздействия гелиофина. В совокупности эти результаты указывают о наличие у экдистена мембраностабилп-зитрующих, гепатопротекторных свойств.

Современное представление о механизме регуляции клеточного метаболизма белково-пептидных, стероидных гормонов или фармпрепаратов- анаболиков связано с индукцией экспрессии генов клетки и (пли) активацией, вторичных посредников внутриклеточных сигнальных каскадов (Смирнова, 1999; Ткачук, 1999). По-видимому, экдистен-зависимая регуляция энергетического метаболизма митохондрий в клетке' идет по первому пути и осуществляется

опосредованно через экдистен-зависимые внутриклеточные регуляторы неизвестной природы. В пользу именно такого "пролонгированного" механизма действия экдистена косвенно подтверждают результаты, недавно полученные на кафедре биофизики био-почв.факультета Национального Университета, где показано, что экдистен in vitro практически не меняет уровень [Ca"+]in в тимо-цитах (Кутепова и др., 2000). Эти данные и результаты нащих исследований, о том, что экдистен не влияет на параметры энергетики суспензии тимоцитов в экспериментах in situ, согласуется с концепцией о корреляции концентрации Са"' в цитоплазме и дыхательной активностью митохондрий в клетке (Nicotera, 1990; Зинченко, 2000).

Рис. 8 Цитохромоксидазная активность гомогената печени крыс с острым гели-отриновым гепатитом и после 3-х дневного введения Э, Э+Л,Л. Среда инкубации: 0,1 М KCl, 1 мМ КН2Р04, 10 мМ трис-буфер, 4 мМ аскорбат, 1 мкг/мл ротенон, pH 7,4. 1 - контроль; 2 - ОГ; 3 - ОГ + Э; 4 - ОГ + Э+Л; 5 - ОГ + Л. Для определения скорости окисления

i0 0,8 0,60,40,2-

1 [тнАОпг(ннопьОг)~'] ^

2,5" 5 <017№А

аскорбата при бесконечно большой концентрации ТМФД использовали координаты Лайнуивера и Берка, исходя из концентраций ТМФД 100 мкМ, 200 мкМ, 400 мкМ. У-скорость окисления аскорбата в нмоль О^/мин. на 10 мг сырого веса гомогената печени.

3.6.2. Антипоротозойный препарат хнмкокцида. Хи.мкокцид - 1,3-бис-(п-хлорбензилиденамино)гуанидин (ХКЦ) - используется для профилактики и лечения кокцидоза и токсоплазмоза животных.

Таблица 11.

Действие ХКЦ на дыхание суспензии тимоцитов.

[ХКЦ], мкМ Скорость потреб. 0?, нг-атом О/мин на 10 8кл %ин r.Wsubs. oligo.

^suhitrate v„,iB0 4-ПХР

Контроль 12+1,2 4,4 ±0,5 28 ±0,6 lb

50 9 ±0,2 8 ±0,5 21 ±0,6 25

100 5 ± 1,3 4 ±0,4 13 ±0,2 58

200 4 ±0,5 4+2,0 9 ±0.5 66

Условия эксперимента см. в таблице 5

Нашими экспериментами установлено, что ХКЦ увеличивает проницаемость внутренних мембран для ионов Са2+, М£2+, Н\ Однако под влиянием

ХКЦ практически не изменяется кинетика набухания митохондрий в изоосмо-тическом растворе сахарозы, что исключает возможность детергентоподобного механизма индукции проницаемости химкокцидом.

В опытах по изучению действия химкокцида на дыхание суспензии лимфоцитов обнаружено, что ХКЦ дозозависимо ингибирует дыхание тимоцитов (таблица 11). Добавление олигомицина на фоне ХКЦ не меняет кинетику дыхания, что свидетельствует об эффекте полного разобщения дыхания с процессом фосфорилирования. Иными словами, этот препарат является разобщителем ОФ при одновременном ингибировании дыхательной цепи, о чем свидетельствуют скорости потребления кислорода на фоне 2,4-Д11Ф. Аналогичные результаты получены в экспериментах изолированной суспензии митохондрий печени крыс. Приведенные данные позволяют рассматривать ХКЦ как модификатор энергетического обмена лимфоцитов, проникающий через плазматические мембраны и взаимодействующий с мембранами митохондрий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе представлены результаты изучения влияния гормонов (гидрокортизона и тироксина), фармпрепаратов и основных классов пестицидов - гербицидов, инсектицидов, фунгицидов и дефолиантов - на систему энергообеспечения живой клетки, в значительной степени определяющей процессы её жизнедеятельности.

Действие гормонов 1К и Т4 in situ па энергетический метаболизм зависит от уров ня [Са~~]1П и мембраносвязанпого Са"* в тимоцитах и является рецептор- опосредованным процессом и связано с влиянием на Са"~-каналы плазма-леммы. Передача сигнала от рецепторов гормонов до митохондрий осуществляется по нескольким ферментативным путям через ряд посредников на фоне множественной картины механизмов их влияния на энергетический метаболизм. На функциональное состояние митохондрий, до нуклеарного уровня, т.е. "быстрые эффекты", гормоны ГК и Tj оказывают влияние через изменение [Са"*],„ Пролонгированное действие гормонов осуществляется через экспрессию генов в результате чего синтезируются гормон-зависимые регуляторы функции митохондрий.

Рецептор-зависимое действие ТГ, ГК опосредовано системой трансмем-брапной сигнализации - G-белки, КМ, и Са""-зависимые протеинкпназы.

На основании полученных данных предложены гипотетические схемы гормональной регуляции тироксином и гидрокортизоном рецепторзавнеимого входа Са~' тнмоцигы (рис. 9,10). Эти схемы, естественно, подлежат дальнейшей детализации и дополнению.

Причиной Тд-зависимого стимулированного разобщенного дыхание является рецептор-зависимое увеличение [Са"']1П ь тимоцитах.

Тгзависимый рост [Са2^],п (рис. 9), опосредован, с одной стороны, стимуляцией Ср-белков, сопряженных с ФлС, ПКС и гидролизом инозитфосфатов, активацией КМ, а с другой стороны активацией ФлА2 и увеличением уровня АА и продуктов её метаболизма. Рецептор-зависимое увеличение [Са2+]„, за счет, во-первых, транспорта Са2"1 в клетку через Са2т-каналы, во-вторых, выход Са"" в цитозоль из немитохондриальных Са2+-пулов, способствует аккумуляции Са" в митохондрии, что является причиной стимулированного разобщенного дыхания.

Рис.9. Гипотетическая схема тироксин-зависимой регуляции кальциевого го-меостаза тимоцитов крыс. Сокращения: - тироксин; Я- рецептор; й - ГТФ-гидролизующие белки (р - активирующие ФлС, б- активирующие АС); ФлС -фосфолипаза С; ФлА2 - фосфолипаза А:; АС - аденилатциклаза; 1Р3 - инозитол-1,4,5-трифосфат; ОАО - диацилглицерол; СМ - кальмодулин; СШ - фактор входа Са" ; СМ-РР - кальмодулин-зависимая протеинфосфатаза; РКС - нротеинки-наза С; РКА - протеинкиназа А; АА - арахидоновая кислота; МХ - митохондрии; ЭПР - эндоплазматический ретикулум.

Тирокснн-стимулирующее действие на рецептор-зависимые Са2+-каналы и рост [Са'^щ может происходить, во-первых, при непосредственной активации рецептор-зависимых Са"*" -каналов или Са2' -каналы непосредственно сопряженные с рецептором через С-белки (Шик, 1990; Ткачук,1999). Во-вторых, при активации Са2+-каналов ионами Са2', освобождающимися из ЭПР по 1Р3-зависимому механизму при участии й-белков, ФлС и ПКС (рис. 9). В-третьих,

посредством образования других, неизвестных мессенджерсз. действующих независимо или сопрягающих выше перечисленные пути. Первичное повышение [Са2+]1П может активировать КМ, а следовательно и КМ-зависимую проте-инкиназу и протеинфосфатазу, баланс между активностями которых может поддерживать колебания активности Са^-каналов и уровня [Са"т]ш, Са-АТФазу плазмалеммы и вход Са"* в MX, при этом меняется активность некоторых ферментов ОФ, наблюдается стимуляция разобщенного дыхания (Brand, 1994) и реаккумуляция Са~~ в ЭПР. Действие ТГ сопровождается ростом количества мембраносвязанного Са"^ в плазмалемме тимоцитов и перераспределением Са~' между MX и ЭПР в зависимости от дозы гормона (рис.9).

Действие ГК, в свою очередь, может осуществляться посредством модулирования функционального состояния ПКС через активацию ФлА2 (рис.10). Непосредственного участия ПКА и изменение [цАМФ]т в рецептор опосредованном действии исследованных гормонов на [Са"* ]|П не обнаружено, хотя показано их стимулирующее действие на рост [Ca"']in тимоцитов (Malbon,19SS).

Рецептор-зависимые эффекты ГК сопровождаются первоначальным снижением [Ca"f]i„, что вызывает освобождение Са" из ЭР и последующую аккумуляцию его в MX и рост дыхания (рис.10). Показано стимулирующее действие ГК в низких концентрациях на рост мембраносвязанного Са"* в плазмалемме тимоцитов, транспорт пирувата и его окисление в MX.

Рис.10. Гипотетическая схема гидрокортизон-зависимой регуляции кальциевого гомеостаза тимоцитов крыс. Сокращения: ГК - гидрокортизон; Я - рецептор; О - ГТФ-гидролизующие белки (р - активирующие ФлС, б - активирующие АС); ФлС - фосфолипаза С; ФлА2 - фосфолипаза А:; АС - адснплатцнклаза; СМ - кальмодулин; РКС - протепнкиназа С; РКА - протеинкиназа А; АА - арахидо-новая кислота; МХ - митохондрии; ЭПР - эндоплазматический ретпкулум.

Модулирующее действие ГК на транспортные процессы на уровне плазматической и митохондриальных мембран тимоцитов сопровождалось торможением транспорта глюкозы. При «длительном» действие ГК in vivo и высоких концентрациях in vitro наблюдалось угнетение энергетического метаболизма тимоцитов.

По-видимому, в тимоцитах рецептор-активируемые Са"+-канаты плазма-леммы не сопряжены непосредственно с рецепторами гормонов, и их активация осуществляется посредниками (ионы Са"^ из внутриклеточных пулов или новый посредник - фактор входа Са"+, обнаруженный в цитоплазме лимфоцитов (Randriamampita,1993)).

Эти процессы предшествуют событиям, происходящим на нуклеарном уровне, сопровождающиеся экспрессией генов при гормональной стимуляции и последующей трансляции. По-видимому, модулирование активности систем транспорта ионов Са является первым этапом в цепи последующих гормон-зависимых модификаций энергетического метаболизма митохондрий и является общим механизмом рецептор-опосредованной сигнализации. Быстрая гормон-зависимая регуляция энергетического метаболизма митохондрий обусловлена изменением [Са~* ],„.

Совершенно другая картина представилась при исследовании регуляции энергетического метаболизма тимоцитов фармпрепаратом с анаболической активностью - экдистеном. Эффекты экдистена проявляются только в экспериментах in vivo и сопряжены со снижением дыхательной активности и увеличением уровня синтеза АТФ, восстановлением цитохро.моксидазной активности митохонрий в норме и при токсическом гепатите. Для экдистена не характерны ''быстрые" эффекты т.к. он практически не влияет на энергетический метаболизм в экспериментах in vitro как на клеточном, так и субклеточном уровнях. В сложившейся ситуации, наше предположение, о том, что рецептор-зависимые эффекты экдистена не связаны с ростом [Са"~]ш, недавно получило подтверждение на кафедре биофизики Национального Университета Узбекистана. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что регуляция энергетического метаболизма экдистеном осуществляется через индукцию экслресси генов и, на функциональное состояние митохондрий в клетке влияют экдистен-зависимые внутриклеточные посредники.

Рецептор-независимая регуляция энергетического метаболизма мембрано-тропными веществами адекватно отражает физиологическое состояние митохондрий в клетке.

Основой токсического действия пестицидов являются их мембранотропные свойства.' По своей химической структуре пестициды чрезвычайно разнообразны. Общим для всех пестицидов является высокая биологическая активность. В настоящей работе представлены результаты изучения влияния основных классов пестицидов - гербицидов, инсектицидов, фунгицидов и дефолиан-

тов - на систему энергообеспечения животной клетки. Каждый исследованный пестицид модифицировал энергетический метаболизм митохондрий на клеточном и субклеточном уровнях в соизмеримых концентрациях, что указывает о проницаемости плазмалеммы и непосредственном контакте препарата или его метаболитов с мембраной митохондрий.

В присутствии пестицидов происходят неспецифические изменения функционального состояния митохондрий клетки. При этом может иметь место торможение электрон-транспортной цепи (гербициды), ингнбирование мито-хондриальных ферментов (ХКЦ), модификация ионной проводимости, изменение рсдокс-состояния эндогенных пиридиннуклеотидов и т.д., влекущие за собой нару шение клеточного гомеостаза.

В условиях проницаемости плазматической мембраны тимоцитов эффекты одних препаратов проявляются в одинаковом концентрационном диапазоне как на клеточном так и субклеточном уровнях (барбан, бенсулид, токутион, юглон и т.д.). Другие соединения (амбущ, бутил-каптакс), несмотря на модификацию функционального состояния митохондрий, малоэффективны на уровне целостной клетки, поскольку плазматическая мембрана клетки для этих соединений может представлять эффективный барьер. Среди исследованных препаратов встречаются относительно инертные в отношении действия на энергетику животных клеток (сцпталон, флавиолнн, хиназонин, ТБАБ). В подавляющем же большинстве случаев происходят существенные изменения энергетического метаболизма в присутствии ядохимикатов.

Следует отметить, что эксперименты на изолированных митохондриях, лишенных своей физиологической среды, зачастую, не отражают действительную картину влияния того или иного ядохимиката на энергетический метаболизм клетки. Поэтому эксперименты на изолированных органеллах для выяснения деталей механизма действия препаратов приобретают значимость лишь при идентичности эффектов на клетках и выделенных митохондриях.

Полученные в данной работе результаты обнаруживают корреляцию между токсическими эффектами большинства пестицидов на процессы трансформации энергии клетки и показателями их общей токсичности. Математическая обработка данных выявила достаточно высокий показатель коэффициента корреляции - 0.76. Этот факт свидетельствует о возможности использования параметров состояния энергетики тимоцитов как вполне адекватного критерия при первичном скрининге ядохимикатов в отношении их неспецнфической токсичности (Табл. 12).

Все вЕлшеизложенное хорошо согласуется с известным положением, что характер влияния на энергетику целостной клетки зависит от природы вещества. Рецептор-опосредованная регуляция энергетического метаболизма ш ¿-/ш запускается при низких концентрациях гормонов Т4 (0,01-0,1 мкМ) и ГК (0,11,0 мкМ) близких к физиологическим. В то время как, в экспериментах т \-iu-o чувствительность изолированной суспензии МХ к этим гормонам проявляется

в присутствии 50-100 мкМ Т4 и не менее 100 мкМ гидрокортизона (табл. 13). Регуляция энергетического метаболизма экдистеном осуществляется только в экспериментах in vivo через экспрессию генов, что характерно для анаболиков т.к. в экспериментах in vitro этот препарат практически не оказывает влияния на энергетику клетки.

Таблица 12.

Коррелирующие показатели для исследованных пестицидов (в таблице представлены скорости дыхания тимоцитов (%) за вычетом контроля, знак соответствует ингибированию, а знак "+" активации дыхания относительно контроля) Con-(х,у) = 0,76._

' Препарат 100 мкМ ЛД50ДЛЯ крыс (мг/кг) (х) Скорость дыхания(у)

Хлортолурон 10000 0

Суффикс 1500 -37,1

Барбан 1000 -63,6

Бенсулид 1900 -26,5

Амбуш 4000 0

Токутион 875 -58,1

Бутифос 500 -54,0

Дропп 4000 45,0

Бутил-каптакс 1300 0

Хиназопин 3700 0

Этрел 4220 36,0

Геметрел 15000 54,0

Снхат 500 -46,4

При рецептор-незавимой регуляции энергетики клетки in situ «эффективный» концентрационный диапазон пестицидов, в условиях проницаемости плазмалеммы, как правило, по величине соизмерим с концентрациями в экспериментах in vitro на изолированной суспензии MX (таблица 13). При этом следует отметить, что рецептор-независимые эффекты ядохимикатов могут осуществляться как при их непосредственном взаимодействии с мембраной MX, так и опосредованно через внутриклеточные метаболиты, которые образуются в результате биохимических реакций пестицидов с ферментативной системой клетки.

В последнее десятилетие выдвигаются ряд гипотез о «мембранном» и «цитоплазматическом» механизме генерации [Ca"'],n (Berridge,1997; Ткачук, 1999; Евтодиенко,2000: Зинченко,2000). В рамках этих гипотез предполагается, что в основе механизма генерации [Ca"f]m лежат явления рецептор-нндуцированного освобождения Са* из внутриклеточных депо: 1Рз -зависимое освобождение Са2' из ЭГ1Р, при котором участвуют Са2+-транспортирующие системы внутриклеточных мембран и плазмалеммы; стимуляция Са"~-

транспортирующей системы митохондриального пула. Известно, что одним из весьма ёмких Са^-депо в клетках являются MX, однако их роль в генерации внутриклеточных колебаний [Са2+]„, практически не обсуждается в литературе, из-за, якобы, низкого сродства MX к Са"+, хотя в литературе последних лет указано, что аккумуляция Ca_t в MX может происходить даже при концентрации в среде инкубации 0,4-0,6 мкМ (I3alestrap,2000; Евтодиенко,2000) и с высокой скоростью (Gunter et al., 2000). Зинченко с совторами (2000) убедительно доказали, что скорость дыхание MX коррелирует с [Са"+]„„ что подтверждает нашу концепцию о том, что гормон-зависимая стимуляция дыхания митохондрий в тимоцитах и степень её разобщенности завися от [Са2+],„ в клетке.

Таблица 13.

Сравнение действующих концентраций БАС рецептор-зависимых (гормонов) и рецептор-независнмых (пестицидов) на уровне тимоцнтов и изолированной суспензии митохондрий.

Биолог. Активные Соединени Эффектив. конц-цин (мкМ) Характерис.действия БАС на энергетич. Метабол.

Тимоциты суспенз. MX

1. Тироксин 0,01 50-100 стимул. Дыхание, разоб.ОФ

(Гагельгапс, 1972) уменыи. Са""-ёмкости МХ

2. Гидрокортизон 0,1-1,0 100 стимул. Дыхание, разоб.ОФ

(Холматова,1985) уменьщ. Са"* -ёмкости МХ

3. Барбан 100 100 разобщение ОФ

4. Бенсулид 100 100 разобщение ОФ

5. Амбуш нет эфф. 500 ингнбир. Дыхания МХ

6. Токутион 10-100 100 ингибир. Дыхания

7. Юглон 1-10 10 шунтирование дыхания

8. 2-оксиюглон 100 100 шунтирование дыхания

9. Бутифос 100 100 ингибированне дыхания

(Очнлов,1989)

Ю.Дропп 10-100 10-100 разобщение ОФ

(Очилов, 1989)

11 .Бутил-каптакс нет эфф. 100 слабое разобщение ОФ

12.Геметрел 100 нет эфф. разобщение ОФ

13.Сихат 100 нет эфф. разобщение ОФ

14.Хиназопин нет эфф. нет эфф.

15.Химкокцид 20 20 ингибированне дыхания

Таким образом, обобщая полученные результаты, в связи с поставленной целью, можно заключить, что рецептор-опосредованная регуляция энергетического метаболизма тимоцитов до нуклеарных событий зависит от [Са"* ],„ и имеет специфический характер а рецептор-независимая регуляция энергетиче-

ского метаболизма, в условиях проницаемости плазматической мембраны,

имеет неспецифический характер.

ВЫВОД ы

1. Регуляция энергетического метаболизма тимоцнтов крыс тироксином имеет дозо-завпсимый характер. "Быстрые" эффекты ТГ in vitro проявляются в стиму ляции дыхания без значительного разобщения ОФ, тогда как в условиях in vivo (гипертиреоз) вызывает стимуляцию дыхания с разобщением ОФ. Тиреоидэктомия ингибирует дыхание MX суспензии тимоцитов с увеличением степени сопряженности ОФ.

2. оказывает рецептор-опосредованное действие на увеличение Са"+-пула плазмалеммы тимоцитов в результате активации кальмодулина и G-белков. В Т4-стимулированных тимоцитах Са" гомеостаз поддерживается и за счет стимуляции митохондриального Са"*-пула.

3. Рецептор-зависимый рост [Ca"*]in в присутствии Т4 осуществляется через G-белкн активирую[цие ФлС, Са"*-зависимые протеинкиназы и ФлАт при посредничестве арахпдоновой кислоты и (пли) продуктов его метаболизма. Состояние аденилатциклазной системы не влияет на Т4-зависимое повышение [Са"*]ш в тимоцитах

4. Влияние ГК на энергетический метаболизм тимоцитов дозозависимо. Высокие концентрации и длительное действие ГК вызывают угнетение энергетического метаболизма MX тимоцитов и оказывают цитотоксическое действие. Кратковременное действие ГК in vivo и низкие концентрации ГК in vitro стимулируют транспорт пирувата и его окисление и тормозят окисление глюкозы в тимоцитах.

5. ГК рецептор-опосредованно увеличивает Са" -пул плазмалеммы тимоцитов, при этом кальциевый гомеостаз характеризуется перераспределением ионов Са:* между MX и ЭГ1Р. ГК вызывает рецептор-опосредованное двухфазное влияние на [Са"*],„ в тимоцитах - снижение [Са" ],„ и восстановление до ба-зального уровня, за счет блокирования Са"*-каналов плазмалеммы и увеличения активность ФлА?.

6. Фармпрепарат экдистерон только in vivo оказывает анаболическое действие на энергетический метаболизм митохондрий (увеличивает активность ци-тохромокспдазы и степень энергообеспечения клетки), а антипротозойный препарат хнмкокцид рецептор-независимо ингибирует дыхание митохондрий.

7. Показано, что исследованные пестициды оказывают в целом рецептор-независимое, неспецифическое действие на мембрану митохондрии. Среди пестицидов обнаружены: разобщители ОФ с протонофорчой и ионофорной активностью, ингибиторы электрон-гранснортной системы; соединения с

менадион-подобными, олигомицин-подобными и циклоспорин А-нодобными свойствами. Выявлена корреляция между общей токсичностью^ исследованных пестицидов и их действием на энергетические процессы клетки с коэффициентом корреляции >-=0,76. 8. Гормональная регуляция энергетического метаболизма тимоцитов имеет рецептор-зависимый характер и до нуклеарных событий опосредована через ионы Са~*. Исследованные пестициды регулируют энергетический метаболизм рецептор-независимо при условии проницаемости для них плаз-малеммы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи и журналах

1. Гизатуллина 3.3., Гагельганс А.И., Мусамухамедов С.Р. и др. Действие инсектицида амбуша на мембрану митохондрий печени крыс. ДАН РУ, 1991, N 6, с.49-51

2. Gizatullina Z.Z., Fesenko L.M., Dombrovskaya N.V., Mochova E.N., Aripov A.N., Gagelgans A.I., Atabekov A.G. Disturbances in oxidative phosphorylation in the liver of rats with heliotrine-mduced hepatitis and restoration by phosphatidylcholine and ATP Biomedical science, 1991, V.2, p.460-464

3. Ппатуллнна 3.3., Гагельганс А.И., Мохова E.H., Орынбаева З.С. Влияние тиреоидных гормонов на энергетику тимоцитов. Биологические мембраны. 1992, Т.10-11, с.i 162-1163.

4. Гагельганс А.П., Гизагуллина 3.3., Ким А.А., Орынбаева З.С., Замараева MB.. Тарпнова М.В., Мусаев У.Н. Антипротозойный препарат химкокцид- ингибитор транспортных аденозиптрифосфатаз. Биологические мембраны, 1992, Т.9. N 5,482-488

5. Гизатуллина 3.3., Орынбаева З.С., Гплустьян Г.Г., Гагельганс А.И. и др. Действие дефолиантов на энергетику митохондрий печени крыс in vitro. Биологические науки, 1992, Т.346, N 10, с.81-87.

6. Гизатуллина 3.3., Сыров В.Н., Гагельганс А.И. Влияние' экдиетерона, туркесгерона и нерабола на энергетический метаболизм тимоцитов. ДАН РУ. 1994, N 10, с.49-52

7. Gizatullina Z.Z., Sukocheva О.A., Gagelgans A.I. Dose-depend influence of hydrocortisone on energy metabolism of rat thymocytes. Biochemistry, 1996, V.61, N.3. p.330-333

S. Sukocheva O.A., Gizatullina Z.Z., Gagelgans A.I. In. vitro effect of hydrocortisone on calcium distribution in rat thymocytes. Membrane and Cell Biol., 1997, V10, p.623-630

9. Sukocheva O.A., Gizatullina Z.Z., Hagelgans A.I. Effect of thyroxine on calcium dis-tribution in rat thymocytes in vitro. Membran and Cell Biol., 1999, V16, N5, p.509-515

Ю.Орынбаева З.С., Гагельганс А.И., Гизатуллина 3.3. Модификация пестицидами энергетического обмена животных клеток коррелирует с их токсичностью. Биотехнология. Теория и практика, 1999, N 3-4, с.75-79

Статьи в сборниках и депонированные с ВИНИТИ

1. Гизатуллина 3.3., Гагельганс А.И., Ким А.А. Действие химкокцида на мембрану митохондрий печени и лимфоциты тимуса крыс. ВИНИТИ 06.09.90 N 4906В

2. Гизатуллина 3.3., Гагельганс А.И., Мусамухамедов С.Р. Действие токутиона н; мембрану митохондрий печени крыс. ВИНИТИ 23.05.91 ,N 2163-В91

.3. Гизатуллина 3.3., Ташмухамедов Б.А. Действие препаратов с фунгицидно! активностью на функциональное состояние митохондрий печени крыс. В сб. Актуальные вопросы биохимии и биотех., ТашГУ, 1990, 38-43.

4. Gizatullina Z.Z., Hagelgans A.I., Mochova E.N., Orinbaeva Z.S. Effects of Thyroii Hormones on Thymocyte Energetics. In: Intra- and intercellular signalling., 1993 Amsterdam, p. 1469-1471.

5. Гагельганс А.И., Гизатуллина 3.3., Сукочева О.А., Сайфуллина Г.Л. Регуляци гидрокортизоном кальциевого гомеостаза в тнмоцптах крыс. "Известия вузо РУ", 1998, с.119-123.

Тезисы

¡.Гизатуллина 3.3., Гагельганс А.И., Орынбасва З.С., Замараева М.В., Лайлт Р.Я. Действие антипротозойного препарата химкокцида и его комплекса с гк лимером на биологические мембраны. 14 Мендел. съезд общей прикл.хими Ташкент. 1989, Т.4, с.330

2. Гизатуллина 3.3., Гагельганс А.И., Мусамухамедов С.Р., Силантьева E.j Действие инсектицидов на митохондрии печени крыс. 10 объед. Сим биох.обществ, Ташкент, 1989, с.25.

3. Гизатуллина 3.3., Гагельганс А.И., Орынбаева З.С. Дозозавнсимый характ влияния тиреоидных гормонов на энергетику тимоцитов. V Конфер. биохим ков Средней Азии и Казахстана, Ташкент, 1991, с.33

4. Гизатуллина 3.3., Гагельганс А.И., Орынбаева З.С. Действие природных ф> гицидов на мембрану митохондрий печени крыс. Бухара В сб.: Организм среда. 1992, с. 39

5. Гизатуллина 3.3., Гагельганс А.И., Орынбаева З.С. Действие дефолиантов митохондрии печени крыс. Бухара, В сб: Организм и среда, 1992. с.40

6. Гизатуллина 3.3., Гагельганс А.И., Орынбаева З.С. Дозозавнсимый хараг влияния гидрокортизона на энергетику Т и Б тимоцитов циплят. I съезд фи ол.Ср.Азии Каз., Душанбе, 1991, с.102

7. Сукочева O.A., Гизатуллина 3.3., Сайфуллина Г.Л. Регуляция гидрокортизон внутриклеточного дыхания тимоцитов. В сб.: Структ. функ. биол.мемб. Те доклада, Ташкент, 1994, с.63

8. Сукочева O.A., Гизатуллина 3.3., Сайфуллина Г.Л. Перераспределение мембра-носвязанного кальция в интактных тимоцитах крыс под воздействием гидрокортизона. там же, с.64

9. Сукочева O.A., Гагельганс А.И., Гизатуллина А.И., Ташмухамедов Б.А. Рост уровня [Са2+]ш тимоцитов при действии тироксина опосредован системой генерации инознтфосфатов. Тез. 3 Конф. биохим. Узбекистана. 1996, с.6

10.Гизатуллина 3.3., Сукочева O.A., Гагельганс А.И., Туракулов Я.Х. Перераспределение мембраносвязанного кальция в тимоцитах при действии тироксина, там же, с. 10

Автор глубоко признателен научному консультанту доктору биологических наук, профессору А.И.Гагельгансу за ценные консультации и поддержку в период проведения исследования и подготовки работы.

3.3.Гизатуллина

ТИМОЦИТЛАРДЛ БИОЛОГИК АКТИВ МОДДЛЛАР ЁРДАЛШДА КАЛЬЦИИ ГОМЕОСТАЗИНИ ВА ЭНЕРГЕТИК Л1ЕТАБОЛИЗМИНИ

БОШЦАРИШ

Хулоса

Ушбу диссертацияда биологик фаол моддалар - гормонлар ва пестицидлар-нинг энергетик метаболнзмга таъсирининг текшнриш натижалари берилган.

Гипертиреоз океидланиш-фосфорлаиишни (ОФ) бузшн бнлан оксидла-ниш тезлиги даражасини кутарди. Тимоцитлар in vitro тажрибаларда Т4 1 мкМ концентрацияда пируватнинг оксидланишини ОФ-ни бузмасдан кучайтирди. Тиреоидэктомия ОФ-ни кучайтирган >$олда нафас олишни сусайтнрди.

In vitro-да ГК-нинг ю^ори концентрацияси ва in vivo-да унинг узо^ давом этувчи таъснри уни босиь;тиради, in vitro-да ГК-нинг тубан концентрацияси ва унинг in vivo-даги ^иска муддатли таъсири тнмоцитларда ппруват транспорт ва оксидланишни рагбатлантиртб, глюкозанинг оксидланишини тормозлайди.

Намойиш этилдики, 1-100 нМ Т4 ёки 0,1-1 мкМ ГК плазмалеммада oof-ланган Са'^-нинг рецептор оркали воситаланган ошишгаш келтириб чи^ардн. Буида унинг митохондриал ва ретикулум Ca"" -пуллари аро ^айта та^силаниши ^айд этилди. Т4 Са2г-нинг тимоцитларга киришинн рагбарлантиради. Са^-нппг Т4 фпзи-ологик дозалари таъсиридан тимоцитларга кириши, ФлС, ннозитфос-фатни гидролизлувчи система, Са"+-га борлик протеинкиназа, ФлА2. АА, каль-модулпн (КМ) ва КМ-га боглик ферментлар воситасида, ПКА-нинг бевосита иштрокисиз, ^исман митоген КонА таъсиридан уша утказувчи йиллар оркали амалга ошади. Шу билан бирга, Т4 Са""-каналинпнг бош^арувчи сохаларига бевосита еки воситали таъсир этиб плазмалеммаиииг номаххус утказувчанли-гини ча^иради.

ГК [Са2+]ш-нинг рецептор оркали воситаланган камайишини келтири£ чикара-ди, афтидан у плазмалемма Са"+-каналарини блоклайди.

Пестицидларнинг энергия богловчи мембраналарга куреатадиган таъси рииинг узига хос томонлари куриб чи^илгац. Кайд этилдики, пестицидларнин] ^ужайра нафас системаси хамда оксидланиш билан кечувчи фосфорланишп куреатадиган таъсири барча холларда уларнинг умум токсиклик курсаткич! (ЛД^о) билан корреляцияланади. Корреляция коэффициентининг юксак дара жаси (0,76) тимоцитлар энергиявий холатлари параметрларидан, пеетицидлар нннг носпецифик токсиклигини бирламчи бахолаш методи сифатида фойдала ниш муыкинлигидан дарак беради.

SUMMARY

REGULATION OF THE ENERGETIC METABOLISM AND CAL-CUIM HOMEOSTASIS IN RAT THYMOCYTES BY BIOLOGICAL ACTIVI

COMPOUNDS

by Gizatullina Zemfira Zaynullovna

Results of study of effects of biological active preparations (BAP) - hormone and pesticides on energy metabolism thymocytes are present in this dissertation.

Hyperthyreosis increases the rate of oxygen consumption with uncoupling с oxi-dative phosphorylation (OP) in rat thymocytes. Preincubation of thymocytes wit 1 mkM T4 stimulates oxidation of pyruvate without any uncoupling of OP. Thyro dectomy brings about a decrease in the rate of respiration of thymocytes with coupling of OP.

Prolonged action of HC in vivo (20 mkg/kg daily during 6 days) as the preir cubation of thymocytes with 10 mkM HC in vitro are cytothocsical and induce th decrease of the level of energetic metabolism. Short-time action of HC at the sam dose and so the thymocyte preincubation with 1 mkM HC stimulated the transpo processes on the level of substrate (pyruvate) oxidation without the oxidative pho: phorilation uncoupling and inhibited the glucose oxidation in thymocytes.

It was shown that the action of T4 (1-100 nM) or HC (0,1-1 mkM) on the th; mocytes increased the quantity of membrane-bound Ca2' in plasma membrane. Те gather with it was observed the Ca""-redistribution between intracellular thymocytf compartments, in particular between mitochondria and endoplasmic reticulum.

HC induced the receptor-mediated [Ca"*]in decrease in thymocytes by blocl ade of Ca2+-channels on the level of plasma membrane that was shown by the HC mediated decreasing of the level of Ca"*-signals from agents (ionomicyne, Concan valin A, BHQ, arachidonic acid and others) induced the rise of [Ca~*]in through о of enterance of external Ca2*-ions.

T4 stimulated the [Ca"*]j„-increase through out of enterance of external Ca2 ions and inhibited the receptor-dependent and -independent Ca~*-signals fro [Ca2']in-increasing agents, possibly, with participating the IPrhydrolise-s) stem, b without participating the PKA.

Jt was investigated the receptor-independent, nonspecific actions of pesticides on mitochondrial coupling membrane on cellular and subcellular levels. It was found thai effets of pesticides on respiration and OP system of cell in all cases correlated •.vith the value LDi0. The high correlation coefficient (0,76) make it possible of using (he parameter of thymocytes energetic state as method for primary evaluate of nonspecific toxicity of pesticides.

Синеок сокращений

• ТГ - тиреоидные гормоны

• ГК - гидрокортизон

• Т4 -тироксин

• БАС - биологически активные соединения

• MX - митохондрии

• ОФ - окислительное фосфориллрование

• АТФ - аденозинтрифосфат

• Ант.А - антимицпн А

• oligo. -олигом ищгн

• 2,4-ДНФ -2,4-динитрофенол

• ИКС -протеинкнназа С

• ПКЛ -протеинкнназа А

• ФлС - фосфолппаза С

• ФлА2 - фосфолппаза А2

• АЦ - аденилатциклаза

• нАМФ - циклический аденозинмонофосфат

• ЭПР - зндорлазматический ретнкулум

• [Са2']1П - концентрация ионов кальция в цитоплазме

• Кон А - конканавалин А

• BHQ - 2,5-дп-трет-бутил-1,4-бензогидрохпнон

• ЭГТА - угнленглпколь-(бпс-аминоэтиловый эфир)-М,К тетрауксусная к-ia

• StSp - стауроспорин

• ХТЦ - хлортетрациклин

• АА - арахидоновая кислота

• КМ - кальмодулин

• 1Р3 - фосфатиднлинозитол-1,4,5-тртфосфат

• ДАГ - диацилглицерол

• R;4 - кальмидазолиум

• NDGA - нордигидрогуаретпковая кислота ^^

• BrPhBr - бромфенацилбромид

• Tim - тимеросал уу/^у^

• Forscalin - форсколин i^T^i?