Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пестициды как модификаторы энергетического обмена животных клеток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Пестициды как модификаторы энергетического обмена животных клеток"

од

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН Институт физиологии и биофизики

На правах рукописи

Орынбаева Зульфия Сейфуллаевна

ПЕСТИЦИДЫ КАК МОДИФИКАТОРЫ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент - 1993

Работа выполнена в лаборатории "Биофизики мембран" кафедры биофизики биологического факультета ТашГУ

Научные руководители:

д.б.н., проф. А.И.Гагельганс к.б.н. З.З.Гизатуллина

Официальные оппоненты:

д.м.н., проф. В.Б.Данилов к.б.н. М.И.Асраров

Ведущая организация - Институт биоорганической химии АН РУз

заседании Специализированного совета Д 015.01.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук При Институте физиологии и биофизики АН РУз по адресу: 700095, Ташкент, ул. Ниявова,!.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии и биофизики АН РУз.

Уч?ш;п секретарь

Защита состоится

в

14 часов на

Специалигироганного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность теми. Широкое применение в различных сферах народного хозяйства гербицидов, инсектицидов, фунгицидов, а также регуляторов роста растений, к числу которых относятся и дефолианты, наряду с очевидными полезными эффектами создает и ряд дополнительных проблем - загрязнение окружающей среды, побочное токсическое действие и т.д.

В основе неспецифического токсического действия пестицидов лежат функционально-морфологические изменения структурных элементов клетки и метаболические сдвиги, связанные с нарушением биохимических процессов. Одной из наиболее чутко реагирующих на внешние воздействия систем клетки является система энергообеспечения. В ряде работ высказывается мнение о митохондриях как наиболее вероятных "мишенях" большинства пестицидов (Ротенберг,1980; Abo-Khatwa et al.,1974; Hertel et al.,1981). Пестициды в значительной мере влияют на функциональное состояние митохондрий, изменение и угнетение окислительных процессов в итоге приводит к снижению энергетического потенциала клетки.

Изучение мембраноактивных свойств препаратов различных классов пестицидов ' на уровне энергетической системы клетки может рассматриваться как важный этап при первичной оценке неспецифической токсичности пестицидов. Потребность в подобной экспресс-оценке в настоящее время возрастает у химиков-синтетиков, токсикологов и гигиенистов. Доступной для изучения клеточной системой с типичным набором органелл и рецепторов ко многим биологически активным соединениям являются лимфоциты. Их состояние может отражать свойства клеток других тканей организма, кроме того, метаболическое состояние митохондрий в лимфоцитах можно исследовать такими же методами, как и метаболическое состояние изолированных митохондрий.

Цель и задачи работы. Целью данной работы явилось сопоставление особенностей действия различных групп пестицидов на энергетический обмен тимоцитов и функциональное состояние изолированных митохондрий.

В связи с этим основными задачами представленной работы явились :

- исследовать влияние ряда гербицидов, инсектицидов, фунгицидов, дефолиантов и антипротозойного препарата химкокцида на состояние энергетического метаболизма тимоцитов 1фнс;

- оценить прямое действие пестицидов на процессы дыхании и окислительного фосфорилирования изолированных митохондрий печени крыс;

- изучить влияние некоторых пестицидов на транспорт кальция и проницаемость внутренней мембраны митохондрий для различных ионов.

- на основе полученных результатов оценить адекватность использования препаратов изолированных митохондрий и суспензии тимоци-тов для оценки побочного токсического действия пестицидов.

Научная новизна работы. Изучение действия различных классов пестицидов на энергетический метаболизм животной клетки Показало, что большинство пестицидов является мембраноактивными соединениями, воздействующими на различные типы биологических мембран. Пестициды нарушают механизм трансформации энергии путем индукции ионной проводимости митохондриальных мембран, влияя на функционирование энергозависимых' ион-транспортирующих систем и изменения активности мембраносвязанных ферментов.

Впервые проведено исследование действия большой группы пестицидов на энергетику митохондрий в условиях целостной клетки с одновременной оценкой их эффекта на функциональное состояние изолированных митохондрий. ,

Установлено,что не все исследованные пестициды однонаправлен-но действуют на функции митохондрий в уелрвиях клетки и в изолированном состоянии, однако в целом мембранотропные свойства пестицидов на клеточном уровне коррелируют с их токсикологическими характеристиками (коэффициент корреляции равен 0,76).

Все исследованные гербициды являются протонофорами в концентрации 100 мкМ и разобщителями окислительного фосфорилирования. В присутствии этих препаратов (кроме хлортолурона) усиливается повреждающее действие ионов кальция на мембрану митохондрий печени крыс. На уровне целой клетки помимо эффекта разобщения окислительного фосфорилирования отмечаются нарушения в работе электрон-транспортной цепи.

Мембраноактивные свойства инсектицидов амбуша и токутиона коррелируют с показателями их токсичности ЛЦ50. Пиретроидный препарат амбуш ингибирует дыхание суспензии митохондрий печени крыс, уменьшает кальциевую "емкость" и незначительно стимулирует проницаемость мембраны митохондрий для различных катионов, однако на уровне суспензии тимоцитов амбуш не влияет на параметры дыхания.

Токутион действовал как антимицин А-подобный ингибитор дыхания в случае изолированных митохондрий печени и суспензии тимоцитов. Кроме того, токутион обусловливает циклоспорин А-подобную стабилизацию внутренней мембраны митохондрий при повреждающем действии ионов кальция.

Среди исследованных фунгицидов - производных нафтохинона -сциталон, флавиолин, 3'3-бифлавиолин практически не влияют на дыхание на уровне клетки, в то время как юглон (1 мкМ) и 2-оксиюг-лон (100 мкМ) обладают менадионподобным действием, шунтируя дыхательную цепь изолированных митохондрий и митохондрий в условиях клетки.

Дефолианты обладают разнообразными по характеру и силе мемб-ранотропными свойствами. Б отношении энергетики целостной клетки классические дефолианты бутифос, дропп и бутил-каптакс исследованы впервые. Изучались также перспективные препараты хиназопин, этрел, геметрел, сихат, АМПБ, ТБАБ, АЦПК, среди которых наименьшую токсичность в отношении клеточной энергетики проявили хиназопин и ТБАБ.

Епервые обнаружено, что антипротозойный препарат химкокцид (ХКЦ) является мембраноактивным соединением, модифицирующим энергетический обмен и проницаемость мембран, а также ингибирующим активность митохондриальной Н+-АТФазы.

На защиту вынесены следующие основные положения диссертации:

- Показатели состояния энергетического метаболизма лимфоцитов из тимуса крыс являются доступным и чувствительным критерием для оценки неспецифической токсичности ядохимикатов.

- Пестициды влияют на энергетический обмен, модифицируя ионную проводимость митохондриальных мембран, изменяя активность энергозависимых ион-транспортирующих механизмов, функционирование электрон-транспортной системы за счет ингибирования ферментов дыхательной цепи митохондрий.

- Механизм токсического действия пестицидов на биоэнергоику может реализоваться по типу классических разобщителей-протонофо-ров.

- Дефект энергопреобразующих функций митохондрий в присутствии химкокцида может быть следствием ингибирования Н+-АТФазы - ХКЦ тормозит активность этого фермента подобно олигомицину.

- Влияние некоторых пестицидов на энергетический метаболизм может реализоваться путем шунтирования дыхательной цепи, как в

случае производных 1,4-нафтохинона - юглона и 2-оксиюглона, которые снимают ингибирование дыхания митохондрий в присутствии цианида, антимицина А или ротенона.

Практическая значимость. Полученные в настоящей работе данные расширяют представления о механизмах действия и побочных эффектах различных химических и фармакологических препаратов. Наблюдаемая в большинстве случаев корреляция эффектов пестицидов на систему дыхания и фосфорилирования клеток с показателями их общей токсичности (ЛД50) свидетельствует о возможности использования оценки состояния энергетики тимоцитов как доступного и чувствительного метода, пригодного для первичного скрининга степени токсической активности ядохимикатов. Выявленные особенности мембранной активности некоторых соединений, в частности химкокцида, юглона и токутиона, создают перспективу их использования в качестве инструментов в экспериментальной мембранологии и биоэнергетике. Эффекты нафтохинонов на уровне дыхательной цепи митохондрий могут найти применение в практической медицине в связи с патологиями, связанными с различными биоэнергетическими дефектами.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на симпозиуме Содружества Независимых Государств "Организм и среда" (Бухара, 1992), научной конференции ТашГУ (Ташкент, 1993),научных семинарах кафедры биофизики ТашГУ, Института физиологии и биофизики АН РУз.

Структура и обьем'диссертации. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список литературы) и состоит из Введения, глав: Обзор литературы. Материалы и методы, Результаты и их обсуждение, а также Заключения, Выводов и списка литераторы, включающего 188 наименований. Диссертация содержит 20 таблиц и 13 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Митохондрии печени крыс выделяли методом дифференциального центрифугирования (Shneidar, 1948). Дыхание и окислительное' фосфорилирование митохондрий исследовали полярографически с по-' мощь» платинового электрода типа Кларка. Тимоциты получали из тимуса крыс (Коношенко, Мохова, 1983). Интактность исследуемых клеток оценивали по процентному содержанию тимоцитов, которые не окрашиваются трипаловым синим, не проникающим в неповрежденные

клетки. Количество жизнеспособных клеток в наших экспериментах составляло порядка 66%. Скорости дыхания тимоцитов регистрировали также полярографически в среде того же состава, что и среда выделения для тимоцитов.

Активный транспорт ионов 1ильция через мембрану митохондрий регистрировали рН-метрмчески или полярографически с помощью электрода Кларка. Пассивную проницаемость мембран митохондрий для различных катионов оценивали по скорости энергонезависимого набухания в солевых средах ( Brierley, 1974). Проницаемость для ионов К+, На+, Caz+, Ug2+ исследовали в изоосмотических растворах нитратов этих катионов, забуференных 10 мМ трис-нитратом (рН 7.4) и содержащих ингибитор дыхательной цепи ротенон (1 мкг/мл). Для изучения протонной проводимости использовали изоосмотический раствор нитрата аммония.

АТФазную реакцию митохондрий, подвергнутых процедуре замораживания-оттаивания, измеряли потенциометрически.

Содержание белка митохондрий определяли по биуретовой реакции с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

В работе были использованы фирменные препараты гербицидов (Египет), инсектициды, любезно предоставленные Н.И.Демиденко (кафедра гигиены труда ТашМИ), фунгициды - Н.Н.Степаииченко (лаб. химии природных соединений ТашГУ), дефолианты - Г.Г.Голустьян (Институт химии растительных веществ АН РУз), химк01щид - Е.В.Ро-зенгарт (Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН), а также использовались ротенон, антимицин А, олиго-мицин фирмы "Sigma" (США), MOPS фирмы "Serva" (ФРГ), остальные реактиЕН отечественного производства градации х.ч. и ч.д.а.

В таблицах результатов приведены экспериментальные средние величины из 6 опытов + стандартная ошибка среднего (Mjm).

Коэффициент корреляции рассчитывали с помощью стандартного пакета программ MathCAD version 2.01 на. персональной ЭВМ IBM PC.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Влияние гербицидов на энергетические процессы митохондрии печени и тимоцитов крыс.

Большинство исследованных гербицидов проявляют активность по отношению к энергетическому обмену тимоцитов, полностью сбуслов-

ленному функциональным состоянием митохондрий. Причем суммарный эффект соединений на энергетические процессы, как правило коррелирует с их общей токсичностью ДЦ50. Наиболее сильными ингибиторами дыхания клеток при концентрации 100 мкМ с разобщающим эффектом оказались барбан и бенсулид, о чем свидетельствует низкий процент ингибирования дыхания тимоцитов олигомицином, а также незначительная стимуляция дыхания в присутствии 2.4-ДНФ, всего на 20-50% от контроля (таблица 1). Суффикс свой эффект обнаруживает при концентрации 100 мкМ. На хлортолурон отзывчиво реагирует только мембрана митохондрий печени, а энергетический метаболизм тимоцитов не нарушается. Одновременные разобщающие и ингйбирующие эффекты, по-видимому, обусловлены опосредованным действием соединений на митохондриальную мембрану через механизм взаимодействия с факторами плазматической мембраны или цитозоли.

Таблица 1

Действие гербицидов на дыхание тимоцитов. (Среда инкубации: 145 мМ НаС1, 4.6 мМ KCl, 8 мЫ MOPS, 1 мМ фосфат калия, 10 мМ глюкозы, рН'7.4. Добавки: 1 мкг/мл олйгомицина, 20-нмоль 2.4-ДНФ)

I . I Скорость потребления Oz, I Z I

Препарат I Концентрация,I нг-атом О/мин на 100 млн.кл.I ингиб I

I мкМ I-----------------------------1 олиго. I

I I V I Уолиго. I Уднф I V I

контроль - 19+1.2 4.4+0.5 21+0.6 76

хлортолурон 100 19+1.2 3.2+0.5 21+0.6 83

суффикс 100 12+0.3 4.3+0.4 10+0.2 64

Оарбан ' 10 16+2.3 5.4+0.4 17+0.4 65

100 7+0.5 4.8+2.0 10+0.5 33

бенсулид 10 14+0.6 6.0+0.2 17+0.6 57

100 14+1.6 14.0+0.4 15+3.2 0

Снижение степени сопряженности, вызываемое гербицидами, кроме хлортолурона, связано с уменьшением эффективности фосфорилирования, поскольку в условиях экспериментов на изолированных митохондриях величина АДФ/О ниже контрольного значения. Эти данные подтверждают положение, что к гербицидам более чувствительна система окислительного фосфорилирования, чем электрон-транспорт-

ная'цепь (Федке, 1985). Однако возможно, что разобщающее действие этих соединений является следствием их протонофорной активности, убывающей в ряду бенсудид > барбан > суффикс > хлортолурон.

Результатом воздействия гербицидов на систему энергообеспечения является модификация энергозависиыых процессов в митохондриях. Препараты уменьшают кальциевую "емкость" митохондрий, а хлортолурон не влияет на этот параметр. Если учесть, что действующие концентрации этих соединений достаточно высоки (порядка 100 мкЫ), то очевидно, можно охарактеризовать эти препараты как относительно малотоксичные в отношении энергетики животных.

Мембраноактивные свойства инсектицидов амбуша и токутиона. t

Амбуш - высокоэффективный препарат контактного действия из группы пиретроидов. Нами обнаружено, что этот инсектицид не обладает какой-либо активностью в отношении процессов дыхания и окислительного фосфорилирования в суспензии интактных клеток. Однако он ингибирует дыхание изолированных митохондрий, снижая коэффициент ДК и величину АДФ/О на 20Z и 30 % соответственно при относительно высоких концентрациях (порядка 0.5-1 мМ). Наблюдается уменьшение величины кальциевой "емкости", незначительная стимуляция кальций-зависимого высокоамплитудного набухания. Амбущ также индуцирует набухание деэнергизованных митохондрий в среде ионов 0а2+, Н+ и Mgz+. Столь незначительные эффекты амбуша при достаточно больших концентрациях указывают на его низкую активность в отношении энергетики теплокровных, что коррелирует с показателем его общей токсичности (до 4000 мг/кг), характеризующий амбуш как умеренно токсичный препарат.

Токутион является инсектицидом широкого спектра действия. Данное соединение ингибирует дыхание митохондрий и тимоцитов (таблица 2). На изолированных митохондриях печени установлено, что блокирование переноса электронов происходит на участке цитох-ромов "Ь" и "с". Этог факт позволяет полагать, что токутион обладает антиыицин A-подобным действием. В концентрации уже 40 мкЫ препарат тормозит скорость высокоамплитудного кальций-зависимого набухания митохондрий, снимая повреждающий эффект кальция на БОХ. Обварено, что в концентрации 100 мкЫ токутион увеличивает кальциевую "емкость" митохондрий до 175 толь Са/мг белка против 131 нмодь Са/мг белка в контроле. Однако скорость аккумуляции кадь-

Таблица 2

Действие токутиона на энергетический обмен тиыоцитов крыс

I Скорость дыхания, нг-атом О / мин I X I Концентрация I на 100 млн. клеток I ингибир.I

токутиона, мкы1 -1 V 1 Уолиго. ' Уднф 1 токут. 1 V 1

0 12+2.0 7+1.2 28+0.5 -

50 9+0.4 12+0.9 21+2.3 25

100 5+1.3 4+0.8 13+1.2 58

200 4+1.6 4+0.6 9+1.1 66

Примечание: Услоеия эксперимента как в подписи к таблице 1.

ция почти в два pasa ниже, чем в контроле. Это, очевидно, связано с дефицитом энергии в результате подавления токутионом переноса электронов по дыхательной цепи. Отмеченные аффекты токутиона на функциональное состояние митохондрий указывают на циклоспорин A-подобное ингибирующее действие инсектицида на неспецифическую пору во внутренней мембране митохондрий (Crornpton et al., 1988; Halestrap et al.,1990; Davidson et al.,1990). Кроме того, обнаружена ионофорная активность токутиона в условиях деэнергизации митохондрий для ионов магния, кальЦия и калия. Возможно, предпочтительная магниевая проницаемость наряду с циклоспоринподобным эффектом может обусловить стабилизацию данным инсектицидом мембран митохондрий в условиях Са2+-индуцируешх повреждений. »

Действие фунгицидов - производных 1.4-кафтохинона на энергетический метаболизм митохондрий печени и тимоцитов крыс.

Нами были изучены мембраноактивные свойства 1.4-нафтохинонов природного происхождения. Их получают из кожуры грецкого ореха Juglans regla, аравийского кустарника Lawsonia inermls и других растительных материалов. Результаты исследования препаратов на параметры окислительного фосфорилирования митохондрий печени крыс показали, что при использовании НАД-зависимых субстратов окисления, юглон стимулирует дыхание митохондрий и и увеличением' кон-

центрации до 10 мкМ приводит к снятию механизма дыхательного контроля за счет стимуляции У4. Аналогичная картина наблюдается в присутствии 2-оксиюглона, начиная с концентрации 10 мкМ. Сцита-лон, флавиолин и 3'3-бифлавиолин лишь незначительно стимулируют дыхание митохондрий печени. В целом результаты хорошо согласуются с данными, полученными-при аналогичной постановке экспериментов на суспензии тимоцитов (таблица 3). В условиях клетки активность

Таблица 3

Влияние юглона и 2-оксиюглона на энергетический метаболизм

тимоцитов

.с.

1 Исследуемое 1 вещество 1 1 1 Концентрация, 1 мкМ 1 1 Скорость потребления кислорода, 1 нг-атом О/мин на 100 млн.клеток 1

V 1 Уолиго. 1 Уд„ф 1

- - 18+0.7 4+0.4 42+0.8

юглон 1 27+0.4 20+0.3 41+1.0

10 32+0.6 32+0.6 49+0.9

2-оксиюглон 100 28+0.6 22+1.2 БО+О.8

Примечание. Условия опыта как в таблице 1.

проявляли только юглон и 2-оксиюглон, а остальные фунгициды не модифицировали энергетическое состояние митохондрий. Для юглона и 2-оксиюглона обнаружены менадион-подобные свойства. Оба препарата восстанавливают дыхание, в присутствии ротенона, антимицина А и КСИ как в случае изолированных митохондрий печени,так и в митохондриях в условиях клетки (рис.1). Причем активность юглона на 1-2 порядка была вше, чем у менадиона, остальные препараты даже в концентрации 10 мМ не снимают блокирующего действия ингибиторов.

Энергозависимые- процессы в большой степени зависят от состояния проницаемости митохондриальных мембран. Исследование влияния фунгицидов на пассивную проницаемость митохондрий печени обнаружило стимуляцию набухания деэнергизованных митохондрий только в присутствии юглона (для ибнов Н+,К+,Ма+,Мг2+) и 2-оксиюглона (для Мгг+,Н+, К+), очевидно, за счет модуляции активности эндогенных систем переноса ионов митохондрий. Возможно наиболее существенным

Рис.1. Влияние производных 1.4-нафтохинона на дыхание митохондрий в присутствии ингибиторов. CII:0.1 мМ KCl, Б мЫ трис-буфер, по Б мМ глутамат/малат, 1 мМ КН2РО4, pH 7.1.

Добавки: по 1 мкг/мл ротенон, антимицин А, 1 мМ KCN. I I -контроль, ES3 - юглон, 1Ш - 2-0КСИЮГЛ0Н.

при этом является образование окисленных форм эндогенных пири-диннуклеотидов и появлением таких реакционных продуктов, как АДФ-рибоза, способных модифицировать проницаемость внутренних мембран митохондрий (Ве1ошо еЬ а1.,1982).

На основе полученных данных можно сделать вывод о том, что плазматическая мембрана проницаема для юглона и 2-оксиюглона, в результате чего они способны оказывать влияние на функциональное состояние митохондрий в условиях целостной клетки, угнетая эффективность окислительного фосфорилирования, что соответствует описанным в литературе эффектам менадиона.

Действие дефолиантов на энергетику митохондрий печени и тимоцитов крыс.

I

Результаты исследования влияния дефолиантов на энергетику тимоцитов представлены в таблице 4.

Показано, что присутствие препаратов хиназопин и ТБАБ практически не влияет на функциональное состояние митохондрий тимоцитов. Наибольшую активность в этих экспериментах проявили бутифос и дропп. При низких концентрациях (порядка 10 мкМ) бутифос инги-бирует дцхание тимоцитов на 27% относительно контроля, олигомицин тормозит эту скорость лишь >на 50%. При увеличении дозы дефолианта до 100 мкМ происходит максимальное разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования, в результате чего ни олигомицин, ни 2.4-ДНФ не влияют нз скорость потребления кислорода.

Дропп уже при концентрации 10 мкМ проявляет разобщающую ак-

скорооть дыхания (нг-атом 0/мин»мг белка)

К - 13 -

Таблица 4

Эффект дефолиантов на процесс дыхания тимоцитов крыс (Условия эксперимента как к таблице 1)

1 Дефолиант 1 1 1 1 Концент., 1 мкМ I-1 Скорость потребления кислорода, 1 нв-атом О/мин на 100 млн. клеток! 7. 1 ингиб.1 олиго.1 V 1

V 1 Уолиго. 1 Уднф '

- - 11+2.3 ■ 3.3+0.2 17+1.4 ■ '70

бутифос 10 8+1.5 3.9+0.6 15+0.2 50

100 5+2.4 Б.0+1.3 6+0. Б 0

дропп 10 14+0.3 9.1+0.2 19+0.1 34

. 100 16+0.3 16.0+2.5 21+2.1 0

бутил-каптакс 100 11+1.8 4.2+1.8 15+0.2 60

хиназопин 100 11+0.4 3.0+0.8 19+1.2 ,, 71

этрел 100 15+3.0 6.0+2.1 18+0.3 60

геметрел 100 17+2.4 10.5+0.2 17+0.3 36

сихат 100 17+2.2 9.0+0.2 18+1.0 46

АМПБ 100 8+1.5 3.3+0.6 20+1.8 57

ТБАБ 100 10+2.2 1.3+0.4 22+2.5 88

АЦПК 100 16+0.4 6.2+0.6 19+1.8 60

тивность, с увеличением концентрации эффект разобщения усиливается, при этом олигомицин уже не оказывает ингибирующего действия на дыхание.

Бутил-каптакс (100 мкМ) на уровне клетки также является разобщителем окислительного фосфорилирования. Препарат АМПБ ингиби-рует дыхание клеток по типу олигомицина, т.к. в присутствии 2.4-ДНФ полностью восстанавливается максимально стимулированная скорость окисления глюкозы.

Наблюдаемые эффекты этих дефолиантов полностью отражают обнаруженное ранее их действие на энергетику изолированных митохондрий (Очилов, 1989).

Дефолианты этрел, геметрел, сихат и АЩЖ являются разобщителями окислительного фосфорилирования митохондрий на уровне целой клетки.' Все эти препараты стимулировали скорость дыхания в среднем на 45%.

В отношении системы дыхания и окислительного фосфорилирования

Изолированных митохондрий дефолианты также проявляли различное действие. Препараты хиназопин, ТВАБ, АМПВ слабо стимулировали дыхание,, остальные соединения не влияли на параметры окислительного фосфорилирования митохондрий печени в диапазоне концентраций 10-200 мкМ. Нами показано, что в отличие от бутифоса, бутил-кап-такса и дроппа, обладающих значительной мембранной активностью, остальные изученные нами препараты практически не влияют на кинетику набухания деэнергизованных митохондрий в сахарозной среде и в присутствии одно- и двухвалентных катионов в концентрации 10-100 мкМ, что в основном коррелирует с их действием на окислительное фосфорилирование и говорит в польэу их низкой токсичности в отношении процессов энергообеспечения теплокровных.

Мембраноактивныё свойства химкокцида.

Химкокцид (ХКЦ) - антилротозойный препарат, используемый для профилактики и лечения кокцидоза и токсоплазмоза животных.

Изучение свойств химкокцида показало, что он является мембра-ноактивным соедиенением, дозо-зависимо увеличивающим скорость энергонезависимого набухания митохондрий в изоосмотических растворах ионов Mgz+, Н+, Са2+, Na+, К+. Однако в изоосмотическом растворе сахарозы кинетика набухания митохондрий в присутствии препарата практически не изменялась, чтр исключает возможность

Таблица Б

Действие ХКЦ на дыхание суспензии тимоцитов (Среда инкубации: 145 мМ NaCl, 4,6 мМ КС1, 8 t.il MOPS, 10 мМ пируват, 1 мМ фосфат калия, рН 7.4. Добавки: олигомицин - 0.2 мет/мл, 2,4-ДНФ - 10 нмоль)

1 Концентрация 1 ХКЦ, мкМ 1 1 Скорость нг-атом потребления 0/ мин на 100 кислорода, 1 млн. клеток 1 1 % 1 1 ингибир. 1 1 ХКЦ 1 V 1

V 1 Vojinro. 1 VaHe 1

0 17+0.2 4+0.4 28+0.2 0

20 13ю.3 13+1.1 23(0.2 23.5

50 11+0.4 11+0.4 12 Ю. 5 35

100 9 <-0.9 9+0.2 ЮН. Л 47

детергенто-подобного механизма индукции проницаемости химкокци-дом. ХОД существенно нарушает механизм тарнсформации энергии. В его присутствии тормозится спорость дыхания изолированных митохондрий в метаболическом состоянии 3 по Чансу при отсутствии торможения дыхания, разобщенного 2,4-ДНФ, что свидетельствует о возможном олигомицииподобном действии этого соединения. ХКЦ разобщает окислительное фосфорилирование клеток с одновременным ингиби-рующим эффектом (таблица 5). Основное отличие ХКЦ от других ан-типротозойных препаратов - это выраженное тормозящее действие на митохондриальную аденозинтрифосфотазу. Регистрация АТФазной активности митохондрий обнаружила тормозящее действие ХКЦ на скорость гидролиза АТФ, причем 5021-ое ингибирование наблюдалось в присутствии 10 мкМ ХКЦ.

Заключение.

Представленные выше данные показывают, что в присутствии пестицидов происходят изменения функционального состояния митохондрий клетки. При этом может иметь место торможение электрон-транспортной цепи, ингибирование митохондриальных ферментов, ыодифш?ация ионной проницаемости, изменение редокс-состояния эндогенных пиридиннуклеотидов и т.д., влекущее за собой нарушение клеточного гомеостаза.

Одни препараты, в частности амбуш, хлортолурон, несмотря на модификацию функций митохондрий в условиях экспериментов на изолированных органеллах, малоэффективны на уровне целостной клетки, поскольку плазматическая мембран?; клетки может представлять для этих соединений эффективный изолирующий барьер. Другие соединения, не влияющие на функциональное состояние изолированных митохондрий (сихат, АЦПК, геметрел), изменяют энергетический обмен клетки. Возможно, в этом случае имеют место либо изменения химических свойств данного соединения, что делает его более реакцион-носпособным, либо активация различных внутриклеточных факторов, индуцирующих изменение функционального состояния митохондрий. Лишь некоторые из изученных препаратов, например, счшталон, фла-виолин, хиназопин, ТБАВ, относительно инертны в отношении действия на энергетику животных клеток. В подавляющем же большинство случаев происходят существенные изменения энергетического метаболизма в присутствии исследованных веществ.

Следует отметить, что довольно часто эксперименты на изолированных митохондриях, лишенных своей физиологической среды, не отражают действительную картину влияния того или иного ядохимиката на энергетический метаболизм клетки. Поэтому эксперименты на изолированных органеллах для выяснения деталей механизма действия препаратов приобретают значимость лишь при идентичности эффектов на клетках и выделенных митохондриях.

Полученные в данной работе результаты обнаруживают корреляцию между токсическими эффектами большинства пестицидов на процессы трансформации энергии клетки с их общей токсичностью (таблица 6).

Таблица 6

Коррелирующие показатели для исследованных пестицидов (в таблице представлены скорости дыхания тимоцитов (%) за вычетом контроля, знак "-" соответствует ингибированию, а "+" - активации дыхания относительно контроля)

Препарат, ДДбо Для крыс Скорость дыхания

100 мкМ (мг/кг) (х) (У)

хлортолурон 10000 0

суффикс 1Б00 -37.1

барбан 1000 • -63.6

бенсулид 1900 -26.5

амбуш 4000 0

токутион 875 -58.1

бутифос 500 -54.0

дропп 4000 45.0

бутил-каптакс 1300 0

хиназопин 3700 0

этрел 4220 36.0

геметрел 15000 54.0

сихат 500 -46.4

Согг (х,у) - 0.76

Математическая обработка данных, представленных в таблице 6, выявила достаточно высокий показатель коэффициента корреляции -0.76. Этот факт свидетельствует о возможности использования параметров состояния энергетики тимоцитов в качестве адекватного кри-

терия при первичном скрининге ядохимикатов в отношении их неспецифической токсичности.

Выводы.

1. Показано, что все исследованные гербициды в концентрации 100 мкМ вызывают разобщение окислительного фосфорилирования митохондрий печени крыс, уменьшают кальциевую "емкость" митохондрий, лишь хлортолурон не изменяет этот параметр. Протонофорчая активность изученных препаратов соответствует ряду: бенсулид > барбан > суффикс > хлортолурон, что в основном коррелирует с их разобщающим действием на энергетику тимоцитов крыс.

2. Пиретроидный инсектицид амбуш ингибирует дыхание митохондрий при концентрации 0.5 и 1 мМ, снижая коэффициенты ДК и АДФ/0 на 20% и 30% соответственно, уменьшает кальциевую "емкость" на 32% и незначительно индуцирует высокоамплитудное кальций-зависимое набухание митохондрий печени крыс. В случае интактных тимоцитов крыс амбуш не оказывал влияния на энергетический обмен.

3. Обнаружено, что инсектицид токутион ингибирует дыхание тимоцитов и митохондрий печени на участке цитохромов "Ь" и "с", тормозит скорость высокоамплитудного кальций-зависимого набухания митохондрий, увеличивает кальциевую "емкость" митохондрий на 35%, индуцирует проницаемость мембраны митохондрий для ионов Ме2+, Са2+ и К+, но не Н+.

4. Установлено, что юглон и 2-оксиюглон снимают ротенон-, антимицин А- или цианид-индуцированное торможение переноса электронов по дыхательной цепи как в случае изолированных митохондрий, так и тимоцитов. Оба препарата увеличивают проницаемость внутренних мембран митохондрий, снижают Са2+-аккумулирую-дую ёмкость в силу разобщающей активности. Остальные нафтохинонн стимулируют дыхание митохондрий печени, снижая величину ДК на 5-12% и практически не действуя на энергетику тимоцитов.

5. Исследованные дефолианты, кроме хиназолина и ТБАБ, оказывают значительное влияние на энергетичес1шй метаболизм митохондрий тимоцитов. АМПБ ингибирует дыхание клеток по типу олиго-мицина. Все остальные соединения являются разобщителями окислительного фосфорилирования при достаточно высоких концентрациях (100 мкМ). Дропп действует по механизму раэобщителя-протонофора.

6. Антипротозойный препарат химкокцид нарушает процессы ды-

хания и фосфорилирования, индуцирует увеличение ионной проницаемости мембран митохондрий, ингибирует активность митохондриальной Н+-АТФазы.

7, Выявлена корреляция общей токсичности исследованных в настоящей работе пестицидов и их действия на энергетические процессы клетки с коэффициентом корреляции 0.76.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕЫЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Гизатуллина 3.3., Гагельганс А.И., Мусаыухамедов С.Р., Силантьева Е. А., Орынбаева З.С. Действие инсектицида токутиона на мембрану митохондрий печени крыс. 1991, Фармакология и токсикология. Деп. В ВИНИТИ 23.05.91. N 2163-В91.

2. Гизатуллина 3.3., Гагельганс А.И., Мусамухамедов С.Р., Силантьева Е.А., Орынбаева З.С. Действие инсектицида амбуша на мембрану митохондрий печени крыс. 1991, ДАН УзССР, N 6, с.49-51.

3. Гизатуллина 3-D., Гагельганс А.И., Орынбаева З.С., Степа-ниченко H.H., Очилов K.P. Действие природных фунгицидов на мембрану митохондрий печени крыс. Тезисы докладов симпозиума Содружества Независимых Государств "Организм и среда", 12-14 мая 1992, Бухара, с. 39.

4. Гизатуллина 3.3., Гагельганс А.И., Орынбаева З.С., Очилов K.P. Действие дефолиантов на митохондрии печени крыс. Тезисы докладов симпозиума Содружества Независимых Государств "Организм и среда", 12-14 мая 1992, Бухара, с. 40.

5. Гагельганс А.И., Гизатуллина 3.3., Ким A.A., Орынбаева З.С., Замараева М.В., Таринова М.В., Мусаев У.Н. Антипротозойный препарат химкокцид - ингибитор транспортных аденозинтрифосфотаз. 1992, Биологические мембраны, т. 9, N 5, с.482-488.

6. Гизатуллина 3.3., Орынбаева З.С., Очилов K.P., Галустьян Г.Г., Гагельганс А.И., Журбенко И.Ы. Действие дефолиантов на энергетику митохондрий. Биологические науки. 1992, N 10, с.81-87.

- 19 -

ПЕСТИЦИДЛАР ^АЙВОН фКАЙРАЛАРИ ЭНЕРГИЯ АЛ1Ш1ИНУВНИНГ МОДИФИКАТОРИ СИФАТИДА.

Оринбоева Зулфия Сейфуллаевна Биофизика мутахасислиги Мазкур илмий иш пестицидларнинг асосий синфларига маисуб гер-бицидлар, инсектицидлар, фунгицидлар, дефолиантлар х,амда антипро-тозой препарат - химкокциднинг хдйвон хужайрасини энергия б план таьминлаб турувчи системага курсатадиган таьсирларини текширишга дойр утказилган тадцикрт натижаларини уз ичига олади. Пестицидларнинг энергия богловчи мембраналарга курсатадиган таьсирининг узига хос тамонлари куриб чик^илган. Маьлум булдики, текширилган бирикмалардан фацат айримларигина хдйвон зфжайралари энергетика-сига таьсир этмайди. Аммо мазкур бирикмалар куп х,олларда оксидла-нишга бог лик фосфорланишш анча узгартиради. Бунда электрон та-шувчи зшшфнинг тормозланиши, Н+-АТФазанинг фаолсизланиши, мито-хондриал мембрана ион-утказувчанлигининг узгариши ва >^.к. юз бе-риши мумкин. Шу билан бир кдторда, улардан митохондрия фаолияти-нинг хийла зарарланишига сабаб булувчи баьзи бирлари яхлит чужай-ра де.ражасида кам эффективликга зга. Чунки плазматик мембрана бу хил препаратлар учун ажратувчи тусик; була олади. Изолирланган ми-тохондриялар фаолиятига таьсир этмайдиган баьзи бир биргаадалар эса зужайрининг энергия алмашинувини узгартиришга цодир. Э^тимол, бундай хол цитоплазма му^итида мазкур бирикма химиявий хоссалари-нинг узгариши билан шартлангандир.

Дайд этилдики, пестицидларнинг з^ужайра нафас системаси хдмда оксицланиш билан кечувчи фосфорланишга курсатадиган таъсири барча х;олларда уларнинг умум токсиклик курсаткичи (ДД50) билан корреля-цияланади. Корреляция коэффициентининг юксак даражаси (0.76) ти-моцитлар энергиявий ^олатлари параметрларидан, пестицидларнинг носпецифик токсиклигини бирламчи бах,олаш методи сифатида фойдала-ниш мумкинлигидан дарак беради.

- 20 -

PESTICIDES AS MODIrICATORS OF ENERGETIC METABOLISM OF ANIMAL CELLS.

Orynbaeva Zulfya Seifullaevna speciality - biophysics

Results of study of effects of pesticides general groups -herbicides, insecticides, fungicides, defoliants and antiprotozolc preparation chemcocclde are present in this dissertation. It was considered the specific actions of pesticides on mitochondrial coupling membrane.

It was shown only some of present'preparations are relatively inert with reference to energetic of animal cells. However in overwhelming majority cases oxidation and phosphor11ation systems essentlaly changes by investigated preparations. Braking of electron-transport chain, suppressing the activity of H+-ATPase, modification of ion-permeability of. the inner mitochondrial membrane and other effects are possible. At the same time some compounds that evoke considerable damage of mitochondrial functions are noneffective on the cell level, because the plasma membrane Is more effective barrier for this pesticides. And other that haven't effects on functional state of isolated mitochondria modify the cell energetical metabolism. Probably in this case changes of the preparetions chemical propeties occur in the cell cytoplasm.

It was found that effects of pesticides on respiration and oxidative phosphorylation system of cell practically in all cases corralated witfy the value LD50.

High correlation coefficient (0.76) testifies to possibility of using the parameter of thymocytes energetic state as method for primary evaluate of nonspecific toxicity of pesticides.