Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическая ремедиация черноземных почв Поволжья, загрязненных пестицидом тетраметилтиурамдисульфидом

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биологическая ремедиация черноземных почв Поволжья, загрязненных пестицидом тетраметилтиурамдисульфидом"

На правах рукописи

ТУГАЕВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

БИОЛОГИЧЕСКАЯ РЕМЕДИАЦИЯ ЧЕРНОЗЕМНЫХ ПОЧВ ПОВОЛЖЬЯ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПЕСТИЦИДОМ ТЕТРАМЕТИЛТИУРАМДИСУЛЬФИДОМ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005061370

Саратов -2013

005061370

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный социально-экономический университет».

Научный руководитель:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Решетов Геннадий Георгиевич

Официальные оппоненты:

Сергеева Ирина Вячеславовна

доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова», заведующая кафедрой ботаники и экологии

Ксенофонтова Оксана Юрьевна

кандидат биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского», доцент кафедры микробиологии и физиологии растений

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет»

Защита состоится «20» июня 2013 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ».

Автореферат диссертации разослан « ~77» 2013 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл.1, ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Карпунина Лидия Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из серьезных современных экологических проблем является загрязнение природных объектов органическими пестицидами, обладающими высокой токсичностью и персистентностью. Интенсивное применение химических средств защиты растений привело к тому, что они рассматриваются в числе самых опасных синтетических поллютантов (Ермаков и др., 2001; Ананьева, 2003; Попов и др., 2003). По многочисленным данным их применение приводит к подавлению не только вредных организмов, но и большинства других видов. Пестициды ухудшают качество почв, так как убивают живые организмы, которые участвуют в почвообразовательных процессах и поддерживают плодородие почв.

Установлена огромная роль микроорганизмов в поддержании экологического равновесия. Многочисленные формы микроорганизмов обладают способностью включать в обмен веществ ксенобиотики, то есть использовать их в конструктивном и энергетическом метаболизме клетки (Квеситадзе, 2002).

В результате использования микроорганизмов-деструкторов происходит не только очистка почвы от ксенобиотиков, но и повышение плодородия почвы, восстановление ее основных функций, так как именно микроорганизмы осуществляют в почве разложение растительных и животных остатков, превращая их в новые органические вещества, которые при взаимодействии с минеральными компонентами придают почве все ее специфические свойства (Мотузова, Безуглова, 2007).

Следовательно, изучение микробиологического способа очистки почвы от пестицидов чрезвычайно актуально. В связи с этим ведутся поиски штаммов микроорганизмов-деструкторов для различных видов пестицидов. Микробная деградация токсикантов, осуществляемая за счет ферментных систем, является обнадеживающим подходом для деструкции органических токсикантов. По многочисленным данным биологические методы восстановления загрязненных почв требуют намного меньше затрат для своего применения, чем известные небиологические технологии, что объясняет актуальность проводимых исследований по разработке и применению на практике биотехнологических способов очистки почв, загрязненных пестицидами.

Пестицид тетраметилтиурамдисульфид (ТМТД) нашел широкое применение на всей территории Российской Федерации, в том числе и в Саратовской области, в связи с низкой стоимостью и эффективностью использования. Поэтому, проведенные исследования по определению влияния пестицида ТМТД на почвенные микроорганизмы на примере чернозема обыкновенного, а также определение способности микроорганизмов из этих почв к биодеструкции пестицида ТМТД имеет важное научно-теоретическое и практическое значение.

Степень разработанности проблемы. Вопросы влияния пестицидов на почвенные микроорганизмы и их микробная деструкция составляют

значительную часть зарубежных исследований в области почвенной микробиологии, отечественными авторами им отводится меньшее внимание.

В основном работы проводились по определению влияния различных пестицидов на общую численность, видовой состав и структуру почвенных организмов и их чувствительность к пестициду. Имеются данные ряда зарубежных авторов, таких как F.W. Breazeale (1970), A.C. Guar (1977), К.Н. Domsh (1984), Р.Н. Don и J.M. Pemberton (1985), J.S. Bridges и C.R. Dempsey (1988), A. Brokamp и В. Happe (1997), F.R.J. Schmidt (1997), L.B. Taiwo и В.A. Oso (1997), M. Biziuk (2001), D. Fournier, A. Halasz, J. Spain, P. Fiurasek и J. Hawari (2002), A. Fließbach и P. Mäder (2004), A.B. Caracciolo (2005), M. Cycoñ и Z. Piotrowska-Seget (2009) и др.

Среди отечественных авторов 20 века следует отметить H.H. Мельникова (1980), A.B. Полякову (1985), М.Ф. Овчинникову (1987), А.Б. Азаматову (1988), И.М. Габрилович (1988), Д.Г. Звягинцева (1989), Г.Ф. Лебедеву, В.И. Агапова, Ю.Н. Благовещенского и В.П. Самсонову (1990), Ю.В. Круглова (1991), O.E. Марфенину (1991), М.А. Анисимову (1997), H.A. Куликову (1999), J1.A. Федорова (1999), A.B. Яблокова (1999) и др.

Воздействие различных пестицидов на почвенные микроорганизмы и их микробная деструкция исследованы в трудах современных отечественных ученых, таких как Н.Д. Ананьева (2001), П.А.Чиров (2002), О.Ю. Ксенофонтова (2004), О.П. Бурхан (2010). Исследования по поиску микроорганизмов-биодеструкторов пестицида ТМТД ранее были проведены и отражены в работе A.B. Колупаева (2010). Однако объектом исследования служила дерново-подзолистая почва, которая по своим характеристикам значительно отличается от чернозема обыкновенного.

Учитывая количество вносимых и уже имеющихся в биосфере пестицидов, следует отметить необходимость детального изучения существующей проблемы. Актуальность, теоретическая и практическая значимость обусловили выбор темы, определили цель, задачи и структуру исследования.

Цель работы - изучение влияния пестицида тетраметилтиурамдисульфида на численность основных групп микроорганизмов чернозема обыкновенного и поиск штаммов микроорганизмов-деструкторов этого пестицида.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести экспериментальные лабораторные исследования по изучению влияния различных доз пестицида ТМТД на численность актиномицетов, гетеротрофных бактерий и плесневых грибов.

2. Выделить устойчивые и доминирующие виды микроорганизмов из чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД.

3. Выявить штаммы деструкторов пестицида ТМТД и произвести их идентификацию.

4. Изучить деструктивную активность выделенных штаммов микроорганизмов.

5. Определить эффективность микробиологической ремедиации чернозема обыкновенного методами биотестирования.

Научная новизна. Впервые изучено влияние различных концентраций пестицида ТМТД, широко используемого в настоящее время в сельскохозяйственной области, на рост и размножение микроорганизмов в обыкновенных черноземах. Выделен штамм микроорганизма-деструктора пестицида ТМТД из аборигенной микрофлоры чернозема обыкновенного, который способен использовать пестицид в процессе жизнедеятельности. Проведена его идентификация на основании изучения фенотипических признаков. Изучена деструктивная активность штамма бактерий, выделенного из чернозема обыкновенного.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость исследования заключается в том, что основные ее результаты способствуют расширению знаний в области ремедиации черноземных почв, загрязненных пестицидом тетраметилтиурамдисульфидом, определяя специфику влияния данного пестицида на почвенные микроорганизмы, способности выделения из аборигенной микрофлоры штамма-деструктора.

В работе впервые даны характеристики воздействия различных доз пестицида ТМТД на численность актиномицетов, плесневых грибов и гетеротрофных бактерий чернозема обыкновенного. Вид гетеротрофных бактерий Pseudomonas putida выделен из аборигенной микрофлоры почвы как наиболее устойчивый к пестицидному загрязнению. Штамм Pseudomonas putida Тм4 рекомендован как деструктор пестицида ТМТД для использования в целях очистки чернозема обыкновенного от его загрязнения.

Основные положения и научные выводы, разработанные и обоснованные автором, приняты к использованию в Федеральной целевой программе «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации на 2009-2013 годы».

Результаты диссертационного исследования используются в производственной деятельности предприятия ООО «ЭкоХим» для осуществления рекультивации территорий, загрязненных пестицидами (в том числе ТМТД), что подтверждается актом о внедрении.

Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных ученых по вопросам влияния пестицидов на почвенные микроорганизмы и их микробной деструкции. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы.

При проведении исследования и изложения материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа.

Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволил обеспечить объективность полученных выводов и результатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Снижение численности актиномицетов, плесневых грибов и увеличение численности гетеротрофных бактерий зависит от загрязнения чернозема обыкновенного различными концентрациями пестицида ТМТД.

2. Различные штаммы микроорганизмов-деструкторов ТМТД, используют пестицид как косубстрат или как единственный источник углерода. Ряд штаммов бактерий Pseudomonas putida обладают наивысшим деструкционным потенциалом.

3. Степень токсичности чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД устанавливается по смертности дафний в почвенной вытяжке и по изменению всхожести семян и длины корней проростков пшеницы.

Апробация результатов исследований. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на: Международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова (Саратов, 2012); Международной заочной научно-практической конференции «Инновационное развитие в экономике, социологии, образовании, юриспруденции, управлении проектами, медицине, экологии» (Санкт-Петербург, 2012); V Международной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы физики, химии, биологии» (Москва, 2012); конференции «Модернизация экономики и общества России в условиях кризиса мирохозяйственных отношений» по итогам научно-исследовательской работы Саратовского государственного социально-экономического университета (Саратов, 2012); конференции «Экология и общество в условиях глобальной конкуренции: инновационные пути развития» по итогам научно-исследовательской работы Саратовского государственного социально-экономического университета (Саратов, 2013); V региональной научной конференции «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» в СГУ имени Н.Г. Чернышевского (Саратов, 2013).

Публикации. Результаты исследований изложены в 9 печатных работах, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад автора. Соискателем проведен анализ полученных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость.

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный социально-экономический университет» на кафедре экологии и безопасности жизнедеятельности.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, двух глав экспериментальной части, включающих объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включает 16 рисунков и 19 таблиц. Список литературы включает в себя 178 источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект, материалы и методы исследований

Объект исследований. В работе использовали пестицид тетраметилтиурамдисульфид (ТМТД) (ЗАО Фирма «Август»), разрешенный к применению на территории Российской Федерации (Государственный каталог пестицидов, 2012).

Тетраметилтиурамдисульфид (тиурам Д, тетратиен, ТМТД, ферназон, арозон, тирам; C6H12N2S4) - контактный фунгицид защитного действия, подавляющий прорастание спор или начальный рост мицелия патогена. Применяется для сухого протравливания семян против комплекса возбудителей болезней зерновых, бобовых, технических и овощных культур, лекарственных и цветочных растений, а также для борьбы с грызунами.

В экспериментах использовали три концентрации пестицида, соответствующие 10 (0,6 мг/кг), 100 (6 мг/кг) и 1000 (60 мг/кг) доз ПДК.

Материалом для экспериментов служили пробы почвы чернозема обыкновенного, взятого с поля ООО «Ягоднополянское» Татищевского района Саратовской области. Гранулометрический состав чернозема представляет собой глину легкую. Агрохимические показатели чернозема обыкновенного представляют следующее: содержание гумуса - 4,6%, степень кислотности (рН) - 6,8, нитрификационная способность - 22 мг/кг, фосфор - 96 мг/кг, калий - 419 мг/кг.

Методы исследований. Отбор почвы проводили в соответствии с ГОСТ 28168-89 методом маршрутных ходов на глубину пахотного слоя (до 25-30 см). Подготовку почвы к исследованию проводили в лабораторных условиях согласно стандартной методике (Кауричев, 1980).

Эксперименты по влиянию пестицида на численность микроорганизмов и получению деструкторов пестицида для рекультивации земель проводили согласно методическим рекомендациям П.А.Чирова, О.Ю.Ксенофонтовой «Изучение влияния пестицидов на микроорганизмы почвы» (2002).

Численность микроорганизмов в загрязненных почвах, определяли по стандартной методике (Егоров, 1995), используя метод последовательных разведений почвенной суспензии. Численность актиномицетов и плесневых грибов выявляли поверхностным методом, гетеротрофных бактерий -глубинным методом посева. Затем производили подсчет числа выросших колоний.

Для выделения доминирующих микроорганизмов из группы гетеротрофных бактерий использовали почву, длительно (30 дней) контактировавшую с пестицидом и технику накопительной культуры. После получения накопительной культуры, приступали к выделению чистой кулыуры для изучения индивидуальных деструктивных свойств. Получение чистых культур осуществляли по стандартной методике (Нетрусов, 2005), используя метод истощающего штриха (метод штриха с обжигом петли). Отдельные колонии проверяли на чистоту путем микроскопирования.

Выделение микроорганизмов проводили по двум направлениям: - использующих пестицид как косубстрат;

- использующих пестицид в качестве единственного источника углерода и энергии.

Для обнаружения у микроорганизмов дегидрогеназной активности использовали 5% водный раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТХ) (патент 2051961), который добавляли в среду М9 в количестве 1% от объема среды. ТТХ под действием продуктов жизнедеятельности микроорганизмов переходит из бесцветного в красный нерастворимый в воде трифенилформазан (ТФФ). О способности микроорганизмов разрушать препарат свидетельствовало окрашивание колоний и среды вокруг них в красный цвет.

Изучение деструкции пестицида ТМТД проводили путем внесения чистых культур штаммов деструкторов с явными признаками роста и размножения в присутствии ксенобиотика, как единственного источника углерода, в жидкую среду М9, содержащую пестицид.

Определение концентрации пестицида в среде и определение численности микроорганизмов проводили через 24 часа в течение семи суток. Изменение концентрации ксенобиотика отмечали с помощью спектрофотометра СФ-102.

Идентификацию микроорганизмов-деструкторов пестицида осуществляли на основании изучения фенотипических признаков исследуемых штаммов. Определение проводилось по девятому изданию определителя бактерий «Руководство по определению бактерий Берджи» (1997).

Для оценки эффективности ремедиации чернозема обыкновенного с использованием микроорганизмов биодеструкторов были использованы два тест-объекта: гидробионт Daphnia magna Straus, согласно рекомендациям «Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний» (2007) и представитель высших растений — пшеница, согласно «Методика выполнения измерений всхожести семян и длины корней проростков высших растений для определения токсичности техногенно-загрязненных почв» (2006).

Статистическую обработку данных проводили с помощью встроенного статистического пакета Excel (MS Office 2007).

Результаты исследований и их обсуждение

Влияние пестицида ТМТД на численность основных групп почвенных микроорганизмов. Большое количество исследований свидетельствует о том, что небольшие концентрации пестицидов могут стимулировать развитие тех или иных микроорганизмов. При увеличении концентрации пестицидов, начинает проявляться их токсический эффект. Однако не во всех случаях наблюдается снижение численности почвенных микроорганизмов. В наших исследованиях отмечено увеличение численности почвенных бактерий. По нашему предположению, это объясняется гибелью чувствительных микроорганизмов и активным развитием устойчивых форм, использующих пестицид в качестве источника энергии.

После инкубации посевов был проведен количественный учет выросших колоний микробов. Количественные показатели, полученные при подсчете колоний микробов, регистрировали, анализируя и формируя таблицы для

каждой систематико-физиологической группы. Полученные количественные данные переводили в проценты по отношению к контролю, который принимали за 100%. Исходя из показателей таблиц, были построены графики, отражающие динамику численности гетеротрофных бактерий, актиномицетов и плесневых грибов в присутствии различных концентраций органического ксенобиотика (рисунок 1-3).

Проведенные исследования показали, что все дозы ТМТД на пятые сутки снижали содержание актиномицетов на 30-40%, а к 30 дню в почве, содержащей 10 ПДК, наблюдался некоторый подъем численности актиномицетов до 81% (рисунок 1). Очевидно, это связано с постепенным разложением пестицида в почве, в результате которого негативное действие на актиномицеты снижалось. Под влиянием повышенных доз (100 и 1000 ПДК) ТМТД рост и размножение актиномицетов сдерживались, и к 30 дню их численность достигла 30-50% по сравнению с контролем. Вероятно, большие концентрации пестицида оказывали токсичное действие на популяцию актиномицетов.

Численность, % 110

-10 ПДК .100 ПДК

юоо пдк

«контроль

Время, сут

Рисунок 1 - Влияние различных концентраций пестицида ТМТД на численность актиномицетов

Установлено, что ТМТД подавлял плесневые грибы, так же как и актиномицеты, в течение первых дней эксперимента (рисунок 2). Однако затем наблюдалось восстановление численности грибов. Это объясняется высокой скоростью роста и размножения плесневых грибов, а также постепенным разложением пестицида ТМТД, в результате которого негативное воздействие на плесневые грибов снижалось. Однако контрольных значений численность плесневых грибов так и не достигла.

Совершенно иначе реагировали на присутствие пестицида в почве гетеротрофные бактерии (рисунок 3). Дозы 10 и 100 ПДК стимулировали рост

бактерий, численность которых к 30 дню, превысила контроль в 1,2 - 1,5 раза. При максимальной концентрации, количественное увеличение бактерий наблюдалось лишь в течение пяти дней, затем численность их стабилизировалась и к 30 суткам превышала контроль только на 8%.

Численность, %

110

100

-10 ПДК -100 ГТДК 1000 ПДК ■контроль

V

Время, сут

Рисунок 2 - Влияние различных концентраций пестицида ТМТД на численность плесневых грибов

Численность, %

150

-10 ПДК -100 ПДК "1000ПДК ■контроль

V

Время, сут

Рисунок 3 - Влияние различных концентраций пестицида ТМТД на численность гетеротрофных бактерий

Наиболее чувствительными к загрязнению почвы пестицидом ТМТД

оказались актиномицеты, в меньшей степени плесневые грибы и наименее чувствительными - гетеротрофные бактерии. Можно сказать, что максимальный токсический эффект пестицида на актиномицеты и плесневые грибы проявился в первое время после загрязнения, когда в большинстве случаев их численность существенно упала. Однако по истечении некоторого времени значения численности в некоторых вариантах опыта резко возросли, но контрольные значения так и не превысили. При этом свою численность увеличивали толерантные к загрязнению пестицидом ТМТД гетеротрофные бактерии. В первое время после загрязнения значения численности бактерий во многих вариантах опыта резко возросли и превысили контрольные значения.

Проведенные нами исследования показали, что гетеротрофные бактерии проявили высокую устойчивость к повышенным концентрациям пестицида ТМТД. В почве, содержащей различные дозы пестицида, было отмечено существенное увеличение количества бактерий. По нашему предположению это указывало на способность бактерий использовать препарат в процессах метаболизма, а соответственно участвовать в деструкции пестицида ТМТД.

Получение микроорганизмов - деструкторов пестицида ТМТД

Методология микробиологической деградации позволяет использовать для химического превращения любой микроорганизм. Применение в качестве биодеструкторов находят гетеротрофы, отличающиеся интенсивным обменом (Зименко и др., 1983).

На этапе получения накопительной культуры при пассировке на средах с увеличенными концентрациями пестицида нами были выявлены штаммы бактерий, использующие пестицид в качестве единственного источника углерода и как косубстрат (таблица 1).

Таблица 1 — Отбор штаммов деструкторов пестицида ТМТД

Лабораторный шифр штамма Рост культур на средах

М9+ПЄСТИЦИД+ глюкоза М9 + пестицид М9+глюкоза (контроль)

Тм 1 - -

Тм 2 — -

Тм 3 ■ - +

Тм 4 + + +

Тм 5 - - +

Тм 6 - - +

Тм 7 - - +

Тм 8 - - +

Тм 9 + + +

Тм 10 + + +

Тм 11 - - +

Тм 12 - +

Примечания - «+» - наличие роста микроорганизмов и окрашенной зоны; «—» — отсутствие роста и окрашенной зоны.

На данном этапе исследования идентификация штаммов не производилась. В результате исследования был отобран штамм деструктор ТМТД (ТмЗ), использующий пестицид как косубстрат. Согласно полученным результатам, пестицид ТМТД наиболее активно стимулировал рост 3 штаммов гетеротрофных бактерий (Тм4, Тм9 и ТмЮ), которые образовывали крупные колонии с зонами просветления, что позволяет предположить способность данных культур использовать пестицид как единственный источник углерода, а, следовательно, и разрушать его. Это позволило нам отобрать данные штаммы для исследования деструкционного потенциала.

Для исследования деструктивной активности микроорганизмов по отношению к пестициду ТМТД, нами были выбраны штаммы бактерий Тм4, Тм9 и ТмЮ, у которых были обнаружены признаки роста и размножения в присутствии пестицида. Деструкцию ТМТД наблюдали при культивировании штаммов в жидкой среде М9, содержащей 300 мг/л пестицида в качестве единственного источника углерода. Определение концентрации пестицида в среде и численности микроорганизмов проводили через 24 часа в течение семи суток. Наиболее четкие изменения в спектральной характеристике были получены только при культивировании штамма Тм4. Выявленный пик при 225 нм исчезал на третьи сутки, а на седьмые зафиксировано возникновение нового пика в области 210 нм. Установленные изменения в спектральной характеристике ТМТД при культивировании со штаммом деструктором говорят о трансформации пестицида.

При культивировании штамма Тм4 на среде М9, содержащей пестицид ТМТД в концентрации 300 мг/л, наблюдался видимый рост численности микроорганизмов в течение 7 суток (рисунок 4).

90

0 1 2 3 4 5 6 7

Рисунок 4 - Рост штамма Тм4 на среде М9, содержащей пестицид

Анализ полученных результатов позволил выделить штамм бактерий Тм4, который обладает наиболее активным деструкционным потенциалом и может быть рекомендован как деструктор пестицида ТМТД.

Идентификацию выделенного штамма деструктора пестицида ТМТД (Тм4) осуществляли на основании изучения фенотипических признаков исследуемого штамма (Определителя бактерий Берджи, 1997).

Идентификация данного штамма позволила отнести его к виду Pseudomonas putida (рисунок 5). Результаты нашего исследования дополнили представления о том, что представители данного рода бактерий являются одними из самых устойчивых и перспективных агентов в биодеструкции высоко персистентных органических пестицидов.

а) б)

Рисунок 5 - Колонии (а) и клетки (б) штамма Pseudomonas putida Тм4

Учитывая мировой ассортимент пестицидов, экологическую эффективность и экономическую выгодность применения биологических методов восстановления загрязненных почв, штамм Pseudomonas putida Тм4 может быть рекомендован как деструктор пестицида ТМТД для практического применения. Внесение оптимальных доз бактерий-деструкторов может оказать существенное влияние на уровень концентрации пестицидов в столь важной природной среде, как почва.

Оценка эффективности ремедиации чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД, методами биотестирования

Промежуточные продукты микробной деградации пестицидов могут оказаться более токсичными, чем исходные соединения (Попов и др., 2003). В связи с этим в мировой практике используют для установления токсичности среды методы биотестирования.

Для оценки эффективности ремедиации чернозема обыкновенного с использованием микроорганизмов биодеструкторов были использованы два тест-объекта: гидробионт Daphnia magna Straus и представитель высших растений — пшеница.

Результаты экотоксикологического исследования на дафниях представлены в таблицах 2 и 3.

Биотестирование показало острое токсическое действие водных вытяжек проб почвы, загрязненных пестицидом ТМТД, на тест-объект Daphnia magna за все время исследования. Процент погибших в тестируемых пробах дафний превышает 50 по сравнению с контролем, что подтверждает токсичные свойства пестицида ТМТД. Введение биодеструктора в загрязненные почвы дало положительный результат: на 7 сутки исследования смертность дафний составила 27%, что показывает на отсутствие острой токсичности в исследуемой пробе; на 30 сутки исследования смертность дафний составила 10% —. тестируемая водная вытяжка не оказывает острого токсического действия.

Таблица 2 — Результаты биотестирования водных вытяжек проб почвы на тест-объектах Daphnia magna (7 сутки после загрязнения почвы и внесения

биодеструктора)

Варианты опыта Время от начала биотестирования Количество выживших дафний (в трех паралл. определениях) Смертность дафний в опыте, в % к контролю

Контроль через 48 ч. 30±1 -

Чернозем + ТМТД через 48 ч. 2±\ 93

Чернозем + ТМТД + БД через 48 ч. 22±2 27

Таблица 3 - Результаты биотестирования водных вытяжек проб почвы на тест-объектах Daphnia magna (30 сутки после загрязнения почвы и внесения

биодеструктора)

Варианты опыта Время от начала биотестирования Количество выживших дафний (в трех паралл. определениях) Смертность дафний в опыте, в % к контролю

Контроль через 48 ч. 30±1 -

Чернозем + ТМТД через 48 ч. 10±2 67

Чернозем + ТМТД + БД через 48 ч. 27±2 10

По итогам биотестирования водных вьггяжек проб почвы на тест-объектах Daphnia magna рассчитывали интегральный показатель токсичности среды (ИТФ) и сравнивали полученные результаты со шкалой токсичности (Методика определения токсичности воды..., 2007). Проведенные расчеты отражены в таблицах 4 и 5.

Результаты оценки токсичности экспериментальных проб чернозема обыкновенного методами биотестирования с использованием биотест-объектов дафний (Daphnia magna Straus) показали высокую токсичность проб почвы, зараженной пестицидом ТМТД, до 30 суток исследования.

Результаты исследования проб почвы, загрязненной пестицидом ТМТД и внесенным биодеструктором, показали низкую степень токсичности на 7 и 30 сутки исследования. Это говорит об отсутствии острой токсичности в исследуемых пробах, но дополнительно указывает, что эти пробы нельзя признать безвредными по показателю токсичности. Однако, на основании данных результатов, можно отметить эффективность действия биодеструктора в разрушении пестицида ТМТД.

Таблица 4 - Динамика индекса токсичности проб чернозема обыкновенного

Варианты опыта ИТФср в разные сроки наблюдения

7 суток 30 суток

Контроль 1 1

Чернозем + ТМТД 0,06 0,33

Чернозем + ТМТД + БД 0,73 0,9

Таблица 5 — Токсичность проб почвы по результатам биотестирования на

дафниях

Вариант опыта Оценка качества почвенной среды в разные сроки исследования (по шкале токсичности)

1 суток 30 суток

Контроль 5 класс - норма 5 класс — норма

Чернозем + ТМТД 2 класс — высокая токсичность (1Л35о) 2 класс — высокая токсичность (ЬО50)

Чернозем + ТМТД + БД 4 класс - низкая токсичность 4 класс — низкая токсичность

Нами было изучено влияние пестицида ТМТД на токсичность чернозема обыкновенного по отношению к пшенице. В качестве тест-объекта была выбрана именно эта культура ввиду ее широкого сельскохозяйственного использования на изучаемых почвах.

Параллельно с исследованием фитотоксичности чернозема обыкновенного были проведены исследования каждого образца почвы, участвующего в эксперименте, с помощью хромато-масс-спектрометра Agilent Technologies, на остаточные количества пестицида ТМТД (таблица 6).

Таблица 6 - Остаточные количества ТМТД в почве (мг/кг)

Почва № пробы* ТМТД ТМТД + агротехнические приемы ТМТД + БД + агротехнические приемы

Чернозем обыкновенный 1 2 3 5,1±0,04 4,7±0,02 2,59±0,01 4,0±0,03 3,9±0,03 1,96±0,02 3,98±0,02 3,77±0,04 0,06±0,01

* 1 проба - через 7 дней после внесения БД; 2 - через 14 дней; 3 проба - через 30 дней.

Для сравнительного анализа в эксперименте использовалась почва, загрязненная пестицидом ТМТД, которая не подвергалась ни поливу, ни рыхлению, ни перемешиванию. Этот образец находился в тех же условиях, что и экспериментальные образцы почв.

Динамика деградации пестицида ТМТД в черноземе обыкновенном отражена на рисунке 6.

Рисунок 6 - Динамика деградации ТМТД в почве

На рисунке 6 показана тенденция к снижению содержания пестицида ТМТД в почве во всех вариантах опыта. Однако на 7 и 14 сутки отмечено незначительное снижение концентрации пестицида.

В первом варианте опыта отмечено снижение содержания пестицида на 30 сутки в 2 раза. Вероятно, пестицид ТМТД подвергался микробной деструкции аборигенной микрофлорой чернозема обыкновенного. Однако этот процесс шел достаточно медленно. Лучшего результата удалось добиться во втором варианте опыта при использовании агротехнических приемов (полив, рыхление, перемешивание). В данном случае удалось активизировать почвенные микроорганизмы и содержание пестицида на 30 сутки составило 1,96 мг/кг, что в 3 раза ниже внесенной концентрации пестицида (6 мг/кг).

Наилучший результат по ремедиации был отмечен на 30 сутки в третьем варианте опыта с внесением в почву биодеструктора. При внесении в почву пестицида ТМТД 100 ПДК, что составляет 6 мг/кг, в черноземе обыкновенном остаточное его количество на 30 сутки составило 0,06 мг/кг, что соответствует предельно допустимой концентрации пестицида ТМТД в почве.

Отбор образцов почв для исследования фитотоксичности чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД (100 ПДК) проводили на 7, 14 и 30 сутки после внесения в почву биодеструктора (БД). В качестве контроля служила почва, не загрязненная пестицидом. Также проводили сравнительный анализ с почвой, загрязненной пестицидом, но без внесения в нее микроорганизмов-биодеструкторов.

Для проведения биотестирования чернозема обыкновенного использовали семена пшеницы со всхожестью не менее 95%.

Результаты проведенного биотестирования с использованием семян пшеницы отражены в таблицах 7 и 8. Важным показателем фитотоксического действия пестицида ТМТД является всхожесть семян (таблица 7).

Таблица 7 — Исследование фитотоксического эффекта на всхожести семян

Длительность Варианты Измеряемые показатели Степень токсичности

этап сутки эксперимента Всхожесть семян, % а, % V, % Ыь %

Контроль 95 1,15 6,2 0 V - Практически не токсичная

I 7 ТМТД 25 0,58 10,8 74 II - Опасно токсичная

ТМТД + БД 30 0,58 9,1 68 III - Умеренно токсичная

Контроль 100 0,58 2,9 0 V - Практически не токсичная

И 14 ТМТД 45 1,15 13,3 55 II - Опасно токсичная

ТМТД + БД 75 1,15 7,9 25 III - Умеренно токсичная

Контроль 100 0 0 0 V - Практически не токсичная

III 30 ТМТД 50 1,15 11,2 50 III - Умеренно токсичная

ТМТД + БД 85 1,15 6,7 15 V - Практически не токсичная

Примечания — а — среднее квадратическое отклонение; V- коэффициент вариации;

N1 — степень изменения всхожести семян по сравнению с контрольным образцом.

Анализ результатов исследований на 7 и 14 сутки после загрязнения почвы пестицидом ТМТД показал, что чернозем обыкновенный обладает второй

степенью токсичности — опасно токсичная почва. Однако на 30 сутки эксперимента негативное воздействие пестицида ТМТД на всхожесть семян снижается. О чем свидетельствует понижение токсичности почвы до третьей степени - умеренно токсичная. Вероятно, это связано с постепенным разложением пестицида ТМТД аборигенной микрофлорой чернозема обыкновенного.

Положительный результат применения биодеструктора был отмечен на всех сроках наблюдения. На 7 и 14 сутки эксперимента почва была охарактеризована как «умеренно токсичная». Наилучший результат был отмечен на 30 сутки эксперимента. Применение биодеструктора способствовало разрушению пестицида ТМТД в черноземе обыкновенном, что сказалось на увеличении всхожести семян пшеницы по сравнению с показателями, полученными на 7 и 14 сутки. Почва была отнесена к пятой степени токсичности - практически не токсичная. Это свидетельствует о том, что внесенная культура биодеструктора, включившись в сложившийся биоценоз чернозема обыкновенного, увеличила детоксикационный потенциал почвы. Однако всхожесть семян пшеницы на всех этапах эксперимента не достигла контрольных показателей. Это говорит о том, что пестицид ТМТД является токсичным для большинства сельскохозяйственных культур и может влиять на количество, а также возможно на качество урожаев.

Таблица 8 — Исследование фитотоксического эффекта на показателе длины

корней

Длительность Варианты Измеряемые показатели Степень

этап сутки эксперимента 2 А см а V, % N2, %

Контроль 22,62 1,12 5,0 0 V - Практически не токсичная

I 7 ТМТД 5,66 0,67 11,8 75 II - Опасно токсичная

ТМТД + БД 8,37 0,42 5,0 63 III — Умеренно токсичная

Контроль 21,30 1,18 5,5 0 V - Практически не токсичная

II 14 ТМТД 6,18 0,40 6,5 71 II - Опасно токсичная

ТМТД + БД 10,65 0,76 7,2 50 III - Умеренно токсичная

Контроль 29,80 1,70 5,7 0 V - Практически не токсичная

III 30 ТМТД 11,32 0,37 3,2 62 III - Умеренно токсичная

ТМТД + БД 20,56 0,82 4,0 31 IV — Мало токсичная

Примечания — £ / - сумма длины корней;

а — среднее квадратическое отклонение; V— коэффициент вариации; N2— степень изменения длины корней по сравнению с контрольным образцом.

По результатам эксперимента нами было отмечено, что пестицид ТМТД оказывал негативное воздействие на корни проростков пшеницы, проявляющееся в угнетении их роста на всех сроках исследования (таблица 8). На 7 и 14 сутки эксперимента по показателям суммы длины корней почва отнесена ко второй степени токсичности — опасно токсичная. На 30 сутки эксперимента мы наблюдали снижение негативного влияния пестицида ТМТД на рост и развитие корней проростков пшеницы. О чем свидетельствует понижение токсичности почвы до третьей степени — умеренно токсичная. Аналогичные данные были получены нами при исследовании всхожести семян пшеницы.

На 7 и 14 сутки в почве с биодеструктором мы наблюдали уменьшение токсического воздействия загрязнителя на число корней и их длину. По показателям суммы длины корней почва была отнесена к третьей степени токсичности - умеренно токсичная. Положительный результат применения биодеструктора также был отмечен и на 30 сутки эксперимента. Внесение биодеструктора в почву способствовало снижению фитотоксичности чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД. В результате чего почва была отнесена к четвертой степени токсичности и охарактеризована как «мало токсичная». Как и в случае со всхожестью семян пшеницы, показатели роста и развития корней при применении биодеструктора не достигли контрольных, что говорит нам о высокой токсичности пестицида ТМТД по отношению к сельскохозяйственным культурам. Однако нами отмечена тенденция к снижению фитотоксичности чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД, при применении микроорганизмов-биодеструкторов.

Результаты опытов дают нам основание предполагать, что наиболее перспективными агентами в биотехнологии ремедиации природных сред от пестицидов являются бактерии: они обладают высокой скоростью деструкции и меньшим фитототоксическим эффектом.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что наиболее устойчивыми к загрязнению различными концентрациями пестицида ТМТД (10, 100 и 1000 ПДК) являются гетеротрофные бактерии, обитающие в черноземе обыкновенном. Присутствие пестицида ТМТД в почве стимулирует рост бактерий, численность которых к 30 дню эксперимента, превышает контроль в 1,5 раза.

2. Выявлены три доминирующих штамма бактерий, использующие пестицид ТМТД в качестве единственного источника углерода (Тм4, Тм9, ТмЮ) и один штамм бактерий, использующий пестицид как косубстрат (ТмЗ).

3. Показано, что пестицид ТМТД подвергается деструкции штаммом Тм4 в течение 7 суток, о чем свидетельствуют изменения в спектральной характеристике пестицида. В течение 7 суток установлен видимый рост численности штамма Тм4 на среде с пестицидом ТМТД в качестве единственного источника углерода.

4. Выделен штамм Тм4, который относится к виду Pseudomonas putida. Применение агротехнических приемов (полив, рыхление, перемешивание), а также внесение штамма Pseudomonas putida Тм4 способствуют быстрой деградации ксенобиотика. Указанный штамм может быть рекомендован как деструктор пестицида ТМТД для практического применения.

5. Обнаружено, что водные вытяжки проб почвы, загрязненных пестицидом ТМТД, оказывают острое токсическое действие на тест-объект Daphnia magna. Тестируемая водная вытяжка не оказывает острого токсического действия на тест-объект при внесение в почву биодеструктора пестицида ТМТД - штамма Pseudomonas putida Тм4.

6. Установлено, что присутствие в почве пестицида ТМТД оказывает отрицательное воздействие на прорастание семян, рост и развитие корней пшеницы. Добавление в почву биодеструктора пестицида ТМТД - штамма Pseudomonas putida Тм4, приводит к снижению степени фитотоксичности чернозема обыкновенного.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В случаях загрязнения чернозема обыкновенного, возникшего при внесении завышенных доз пестицида ТМТД, длительном применении на одном и том же участке, нарушении сроков и технологии внесения, при аварийных ситуациях, рекомендуется вносить в почву биодеструктор пестицида ТМТД (штамм Pseudomonas putida Тм4).

2. Для устранения загрязнений почв пестицидом ТМТД рекомендуется с помощью агротехнических приемов (увлажнение, аэрация, внесение удобрений) активизировать деятельность аборигенной микрофлоры с целью повышения детоксикационного потенциала почвы.

3. Для повышения самоочищающей способности почв от загрязнения пестицидом ТМТД, рекомендуется проводить мероприятия по восстановлению плодородия и повышению биоэнергетического потенциала почв с целью активизации роста и размножения микроорганизмов и усиления их минерализационной деятельности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тугаева Т.А. Влияние пестицидного загрязнения на численность почвенных микроорганизмов / Г.Г. Решетов, Т.А. Тугаева // Модернизация экономики и общества России в условиях кризиса мирохозяйственных отношений: Сборник научных трудов по итогам НИР Саратовского государственного социально-экономического университета в 2011 году. -Саратов, 2012,-4.1.-С. 162.

2. Тугаева Т.А. Выделение из чернозема обыкновенного микроорганизмов-деструкторов пестицида тетраметилтиурамдисульфида / Г.Г. Решетов, Т.А. Тугаева // Вавиловские чтения - 2012: Материалы Международной

научно-практической конференции, посвященной 125-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова. - Саратов: ИЦ Наука, 2012. - С. 299-300.

3. Тугаева Т.А. Микроорганизмы-биодеструкторы пестицида тетраметил-тиурамдисульфида / Т.А. Тугаева // Инновационное развитие в экономике, социологии, образовании, юриспруденции, управлении проектами, медицине, экологии: Сборник научных статей по итогам Международной заочной научно-практической конференции, 23-24 ноября 2012 года. - СПб.: Изд-во «КультИнформПресс», 2012. - С. 183-186.

4. Тугаева Т.А. Экотоксикологическая оценка чернозема обыкновенного с использованием семян пшеницы / Т.А. Тугаева // Научная дискуссия: вопросы физики, химии, биологии: Сборник научных статей по итогам V Международной заочной научно-практической конференции. - М.: Изд-во «Международный центр науки и образования», 2012. - С. 83-88.

5. Тугаева Т.А. Биодеградация пестицида ТМТД в лабораторных условиях / Т.А. Тугаева // Европейские прикладные науки: современные подходы в научных исследованиях, труды 1-й Международной научно-практической конференции, 17-19 декабря 2012 года. - Штутгарт, Германия. - 2012. - С. 8-11.

6. Тугаева Т.А. Определение фитотоксичности чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом тетраметилтиурамдисульфидом / Г.Г. Решетов, Т.А. Тугаева // Научная жизнь. - Саратов, 2012. - №4. - С. 139-146.

7. Тугаева Т.А. Эффективность метода микробной деструкции пестицида тетраметилтиурамдисульфида / Г.Г. Решетов, Т.А. Тугаева // Вестник Саратовского государственного социально-экономического университета. - 2012. - №5. - С. 220-223.

8. Тугаева Т.А. Выделение микроорганизмов-деструкторов пестицида ТМТД из черноземных почв / Г.Г. Решетов, Т.А. Тугаева // Вестник Саратовского госагроунивсрситета им. Н.И. Вавилова. — 2013. — №3. — С. 42-44.

9. Тугаева Т.А. Влияние пестицида ТМТД на численность микроорганизмов в черноземных почвах / Г.Г. Решетов, Т.А. Тугаева // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. -2013. -№4. - С. 25-28.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Подписано в печать 15.05.2013

Гарнитура Times. Печать Riso. _Усл. печ. л. 1,22. Тираж 100 экз. Заказ 0123_

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ИП «Экспресс тиражирование» 410005, Саратов, Пугачёвская, 161, офис 320 Е 27-26-93

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тугаева, Татьяна Александровна, Саратов

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Саратовский государственный социально-экономический университет»

На правах рукописи

04201359594 0'

ТУГАЕВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

БИОЛОГИЧЕСКАЯ РЕМЕДИАЦИЯ ЧЕРНОЗЕМНЫХ ПОЧВ ПОВОЛЖЬЯ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПЕСТИЦИДОМ ТЕТРАМЕТИЛТИУРАМДИСУЛЬФИДОМ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

доктор сельскохозяйственных наук

профессор Решетов Г.Г.

Саратов - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................4

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.................................................10

1.1. Загрязнение почв пестицидами.............................................. 10

1.2. Классификация пестицидов.....................................................20

1.2.1. Классификация пестицидов по объектам применения.........21

1.2.2. Классификация пестицидов по воздействию на организмы...23

1.2.3. Классификация пестицидов по химическому составу..........25

1.3. Влияние пестицидов на почвенную биоту.................................28

1.4. Микробиологическая деградация пестицидов............................34

1.5. Разложение пестицидов в почвах.............................................41

1.6. Характеристика пестицида тетраметилтиурамдисульфида и его биодеструкция...................................................................47

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......52

2.1. Характеристика объекта исследований.....................................52

2.2. Материалы исследований......................................................54

2.3. Методики проведения исследований........................................56

2.3.1. Методика подготовки почв к исследованиям....................56

2.3.2. Методика внесения пестицида в пробы почв и метод последовательных разведений почвенной суспензии..........57

2.3.3. Методика выделения и определения численности почвенных микроорганизмов....................................... 58

2.3.4. Методы выделения доминирующих видов микроорганизмов из почв............................................60

2.3.5. Методика определения способности использования почвенными микроорганизмами углерода и энергии

из органического ксенобиотика.....................................62

2.3.6. Методика изучения деструктивной активности микроорганизмов. Идентификация штаммов деструкторов............................................................64

2.3.7. Методика определения токсичности водных вытяжек из почв по смертности дафний..........................................65

2.3.8. Методика определения фитотоксичности загрязненных

почв на проростках пшеницы.........................................69

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..........73

3.1. Микробиологическая активность черноземных почв...................73

3.2. Влияние пестицида тетраметилтиурамдисульфида на численность основных групп почвенных микроорганизмов...........................78

3.3. Получение микроорганизмов - деструкторов пестицида ТМТД......86

3.4. Идентификация штамма деструктора пестицида ТМТД...............92

3.5. Получение опытных образцов суспензии деструктора ТМТД..........94

3.6. Оценка эффективности ремедиации чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД, методами биотестирования......96

3.6.1. Оценка эффективности ремедиации по экотоксикологическому исследованию на гидробионтах......96

3.6.2. Исследование фитотоксического эффекта загрязненной почвы на проростках пшеницы.....................................101

3.7. Теоретические аспекты эколого-экономической эффективности исследуемого метода биоремедиации.......................................112

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................115

ВЫВОДЫ....................................................................................120

Список сокращений и условных обозначений.......................................122

Список использованной литературы...................................................124

Приложения.................................................................................141

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одной из серьезных современных экологических проблем является загрязнение природных объектов органическими пестицидами, обладающими высокой токсичностью и персистентностью. Интенсивное применение химических средств защиты растений привело к тому, что они рассматриваются в числе самых опасных синтетических поллютантов (Ермаков и др., 2001; Ананьева, 2003; Попов и др., 2003). По многочисленным данным их применение приводит к подавлению не только вредных организмов, но и большинства других видов. Пестициды ухудшают качество почв, так как убивают живые организмы, которые участвуют в почвообразовательных процессах и поддерживают плодородие почв.

Установлена огромная роль микроорганизмов в поддержании экологического равновесия. Многочисленные формы микроорганизмов обладают способностью включать в обмен веществ ксенобиотики, то есть использовать их в конструктивном и энергетическом метаболизме клетки (Квеситадзе, 2002).

В результате использования микроорганизмов-деструкторов происходит не только очистка почвы от ксенобиотиков, но и повышение плодородия почвы, восстановление ее основных функций, так как именно микроорганизмы осуществляют в почве разложение растительных и животных остатков, превращая их в новые органические вещества, которые при взаимодействии с минеральными компонентами придают почве все ее специфические свойства (Мотузова, Безуглова, 2007).

Следовательно, изучение микробиологического способа очистки почвы от пестицидов чрезвычайно актуально. В связи с этим ведутся поиски штаммов микроорганизмов-деструкторов для различных видов пестицидов. Микробная деградация токсикантов, осуществляемая за счет ферментных систем, является обнадеживающим подходом для деструкции органических токсикантов. По

многочисленным данным биологические методы восстановления загрязненных почв требуют намного меньше затрат для своего применения, чем известные небиологические технологии, что объясняет актуальность проводимых исследований по разработке и применению на практике биотехнологических способов очистки почв, загрязненных пестицидами.

Пестицид тетраметилтиурамдисульфид (ТМТД) нашел широкое применение на всей территории Российской Федерации, в том числе и в Саратовской области в связи с низкой стоимостью и эффективностью использования. Поэтому, проведенные исследования по определению влияния пестицида ТМТД на почвенные микроорганизмы на примере чернозема обыкновенного, а также определение способности микроорганизмов из этих почв к биодеструкции пестицида ТМТД имеет важное научно-теоретическое и практическое значение.

Степень разработанности проблемы. Вопросы влияния пестицидов на почвенные микроорганизмы и их микробная деструкция составляют значительную часть зарубежных исследований в области почвенной микробиологии, отечественными авторами им отводится меньшее внимание.

В основном работы проводились по определению влияния различных пестицидов на общую численность, видовой состав и структуру почвенных организмов и их чувствительность к пестициду. Имеются данные ряда зарубежных авторов, таких как F.W. Breazeale (1970), A.C. Guar (1977), К.Н. Domsh (1984), Р.Н. Don и J.M. Pemberton (1985), J.S. Bridges и C.R. Dempsey (1988), A. Brokamp и В. Happe (1997), F.R.J. Schmidt (1997), L.B. Taiwo и В.A. Oso (1997), M. Biziuk (2001), D. Fournier, A. Halasz, J. Spain, P. Fiurasek и J. Hawari (2002), A. Fließbach и P. Mäder (2004), A.B. Caracciolo (2005), M. Cycoñ и Z. Piotrowska-Seget (2009) и др.

Среди отечественных авторов 20 века следует отметить H.H. Мельникова (1980), A.B. Полякову (1985), М.Ф. Овчинникову (1987), А.Б. Азаматову (1988), И.М. Габрилович (1988), Д.Г. Звягинцева (1989), Г.Ф. Лебедеву, В.И. Агапова, Ю.Н. Благовещенского и В.П. Самсонову (1990), Ю.В. Круглова (1991), O.E.

Марфенину (1991), М.А. Анисимову (1997), H.A. Куликову (1999), Л.А. Федорова (1999), A.B. Яблокова (1999) и др.

Воздействие различных пестицидов на почвенные микроорганизмы и их микробная деструкция исследованы в трудах современных отечественных ученых, таких как Н.Д. Ананьева (2001), П.А.Чиров (2002), О.Ю. Ксенофонтова (2004), О.П. Бурхан (2010). Исследования по поиску микроорганизмов-биодеструкторов пестицида ТМТД ранее были проведены и отражены в работе A.B. Колупаева (2010). Однако объектом исследования служила дерново-подзолистая почва, которая по своим характеристикам значительно отличается от чернозема обыкновенного.

Учитывая количество вносимых и уже имеющихся в биосфере пестицидов, следует отметить необходимость детального изучения существующей проблемы. Актуальность, теоретическая и практическая значимость обусловили выбор темы, определили цель, задачи и структуру исследования.

Цель работы - изучение влияния пестицида тетраметилтиурамдисульфида на численность основных групп микроорганизмов чернозема обыкновенного и поиск штаммов микроорганизмов-деструкторов этого пестицида.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести экспериментальные лабораторные исследования по изучению влияния различных доз пестицида ТМТД на численность актиномицетов, гетеротрофных бактерий и плесневых грибов.

2. Выделить устойчивые и доминирующие виды микроорганизмов из чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД.

3. Выявить штаммы деструкторов пестицида ТМТД и произвести их идентификацию.

4. Изучить деструктивную активность выделенных штаммов микроорганизмов.

5. Определить эффективность микробиологической ремедиации чернозема обыкновенного методами биотестирования.

Научная новизна. Впервые изучено влияние различных концентраций пестицида ТМТД, широко используемого в настоящее время в сельскохозяйственной области, на рост и размножение микроорганизмов в обыкновенных черноземах. Выделен штамм микроорганизма-деструктора пестицида ТМТД из аборигенной микрофлоры чернозема обыкновенного, который способен использовать пестицид в процессе жизнедеятельности. Проведена его идентификация на основании изучения фенотипических признаков. Изучена деструктивная активность штамма бактерий, выделенного из чернозема обыкновенного.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость исследования заключается в том, что основные ее результаты способствуют расширению знаний в области ремедиации черноземных почв, загрязненных пестицидом тетраметилтиурамдисульфидом, определяя специфику влияния данного пестицида на почвенные микроорганизмы, способности выделения из аборигенной микрофлоры штамма-деструктора.

В работе впервые даны характеристики воздействия различных доз пестицида ТМТД на численность актиномицетов, плесневых грибов и гетеротрофных бактерий чернозема обыкновенного. Вид гетеротрофных бактерий Pseudomonas putida выделен из аборигенной микрофлоры почвы как наиболее устойчивый к пестицидному загрязнению. Штамм Pseudomonas putida Тм4 рекомендован как деструктор пестицида ТМТД для использования в целях очистки чернозема обыкновенного от его загрязнения.

Основные положения и научные выводы, разработанные и обоснованные автором, приняты к использованию в Федеральной целевой программе «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации на 2009-2013 годы».

Результаты диссертационного исследования используются в производственной деятельности предприятия ООО «ЭкоХим» для

осуществления рекультивации территорий, загрязненных пестицидами (в том числе ТМТД), что подтверждается актом о внедрении.

Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных ученых по вопросам влияния пестицидов на почвенные микроорганизмы и их микробной деструкции. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы.

При проведении исследования и изложения материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа.

Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволил обеспечить объективность полученных выводов и результатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Снижение численности актиномицетов, плесневых грибов и увеличение численности гетеротрофных бактерий зависит от загрязнения чернозема обыкновенного различными концентрациями пестицида ТМТД.

2. Различные штаммы микроорганизмов-деструкторов ТМТД, используют пестицид как косубстрат или как единственный источник углерода. Ряд штаммов бактерий Pseudomonas putida обладают наивысшим деструкционным потенциалом.

3. Степень токсичности чернозема обыкновенного, загрязненного пестицидом ТМТД устанавливается по смертности дафний в почвенной вытяжке и по изменению всхожести семян и длины корней проростков пшеницы.

Апробация результатов исследований. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на: Международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова (Саратов, 2012); Международной заочной научно-

практической конференции «Инновационное развитие в экономике, социологии, образовании, юриспруденции, управлении проектами, медицине, экологии» (Санкт-Петербург, 2012); V Международной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы физики, химии, биологии» (Москва, 2012); конференции «Модернизация экономики и общества России в условиях кризиса мирохозяйственных отношений» по итогам научно-исследовательской работы Саратовского государственного социально-экономического университета (Саратов, 2012); конференции «Экология и общество в условиях глобальной конкуренции: инновационные пути развития» по итогам научно-исследовательской работы Саратовского государственного социально-экономического университета (Саратов, 2013); V региональной научной конференции «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» в СГУ имени Н.Г. Чернышевского (Саратов, 2013).

Публикации. Результаты исследований изложены в 9 печатных работах, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Личный вклад автора. Соискателем проведен анализ полученных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость.

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный социально-экономический университет» на кафедре экологии и безопасности жизнедеятельности.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, двух глав экспериментальной части, включающих объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включает 16 рисунков и 19 таблиц. Список литературы включает в себя 178 источников.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Загрязнение почв пестицидами

Сельскохозяйственное использование почвенного покрова обеспечивает основное производство пищи для человека. Возможность получения высоких урожаев определяется сочетанием различных приемов земледелия: агротехнических, мелиоративных, противоэрозионных мероприятий, химизацией сельского хозяйства и т.д. (Марфенина, 1991).

Вторая половина XX века характеризуется развитием одного из основных направлений научно-технического прогресса - химизацией сельского хозяйства, под которой понимают комплекс мероприятий по широкому и планомерному использованию химических средств и методов (пестицидов и удобрений) для увеличения урожая культурных растений и повышения качества сельскохозяйственной продукции, продуктивности животных, защиты организмов от вредителей и болезней, улучшения свойств почв (Оценка и регулирование...., 1996).

В почву вносятся огромные дозы минеральных удобрений и физиологически активных веществ, к которым следует отнести средства защиты растений. Различные агротехнические мероприятия: механические обработки, севообороты, удобрение и химические средства защиты растений (пестициды) оказывают существенное влияние на микрофлору почвы (Круглов, 1991).

Для борьбы с вредителями, сорняками, грибковыми заболеваниями и другими болезнями растений, кустарников, деревьев используют химические средства, общее название которых - пестициды. Пестициды (от лат. реэиз -зараза, саес1о - убивать) - это группа химических веществ, обладающих токсическими свойствами по отношению к различным живым организмам (Прикладная экология, 2002).

Пестициды - это ядохимикаты по борьбе с грибковыми болезнями растений (фунгициды), с бактериями (бактерициды), с сорняками (гербициды), с вредными насекомыми (инсектициды), моллюсками (лимациды), с круглыми червями (нематоциды), грызунами (зооциды), с тлями (афициды). К гербицидам относятся также арборициды, применяемые для уничтожения нежелательной древе