Изменение биологической активности чернозема выщелоченного при внесении 2,4,6-тринитротолуола

Кормильцева, Инна Петровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменение биологической активности чернозема выщелоченного при внесении 2,4,6-тринитротолуола
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изменение биологической активности чернозема выщелоченного при внесении 2,4,6-тринитротолуола"

На правах рукописи

КОРМИЛЬЦЕВА ИННА ПЕТРОВНА

ИЗМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЧЕРНОЗЕМА ВЫЩЕЛОЧЕННОГО ПРИ ВНЕСЕНИИ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА

03.02.03 - Микробиология

4847137

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 МАЙ 2011

Казань-2011

4847137

Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Куриненко Борис Михайлович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Селивановская Светлана Юрьевна

Доктор биологических наук Коксин Владимир Петрович

Ведущая организация:

Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН

Защита состоится «9» июня 2011г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д.212.081.08 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при Казанском государственном университете.

Автореферат разослан « > мая 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интенсивное развитие военного комплекса и применение в качестве основы большинства взрывчатых веществ 2,4,6-тринитротолуола привели к значительному загрязнению отдельных территорий. Время загрязнения некоторых из них датируется периодом Второй Мировой войны [Lewis et al., 2004; Wilkstrom et al., 2000]. Места концентрации загрязнения обладают дополнительным повреждающим воздействием и проблема не ограничивается контаминацией только территорий, на которых расположены или располагались военные объекты. На производстве и при детонации заряда загрязнению подвергается также атмосферный воздух, который потом становится источником вторичного загрязнения почв. При миграции ксенобиотика происходит попадание ТНТ в грунтовые воды, а с ними — в крупные водоемы [Boopathy, 2000].

Главным компонентом ландшафта, депонирующим ксенобиотики, является почвенный покров. Зачастую ТНТ находится даже в тех почвах, где присутствовать не должен и где его нахождение невозможно объяснить. Нитроароматические углеводороды, включая ТНТ, как стойкие органические соединения внесены в списки приоритетных загрязнителей, как Европейского сообщества (ЕС), так и Агентства по охране окружающей среды США (ЕРА) [Яковлева Е.В. с соавт., 2008].

Очевидно, назрела необходимость разработки эффективных и безопасных методов ремедиации загрязненных ТНТ почв. Для надежного теоретического и прикладного обоснования методов ремедиации необходимо знание о влиянии ТНТ на биологическую активность почвы.

В доступной нам литературе приводятся попытки оценки биологической активности почв, загрязненных ТНТ. Эти работы фокусируются преимущественно на отдельных биохимических процессах. Например, было показано, что в почвах длительно или относительно недавно загрязненных ТНТ даже при низком уровне загрязнения угнетаются основные ферментативные активности (дегидрогеназная и азотфиксирующая активности) [Gong et al, 1999; Siciliano et al., 2000]. К сожалению, в литературе приводятся данные по одноразовому определению тех или иных параметров биологической активности почвы [Travis et al., 2007]. Мы считаем, что исследования подобного рода должны проводиться в течение продолжительного срока, только они имеют теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи исследования.

Провести интегральную оценку изменения биологической активности чернозема выщелоченного после внесения 2,4,6-тринитротолуола (ТНТ) in vitro.

В задачи исследования входило:

1. Оценить влияние 2,4,6-тринитротолуола на эколого-трофические группы микроорганизмов и микробную биомассу почвы;

2. Оценить изменения активности ферментов, азотфиксации и дыхания после загрязнении почвы 2,4,6-тринитротолуолом;

3. Охарактеризовать качественное и количественное изменение структуры комплекса микромицетов и оценить устойчивость к 2,4,6-тринитротолуолу микромицетов, занимающих в популяции загрязненной ксенобиотиком почвы доминирующее положение;

4. Оценить генотоксические свойства почвы, загрязненной 2,4,6-тринигротолуолом;

5.Охарактеризовать динамику содержания в загрязненной почве 2,4,6-тринитротолуола, экстрагируемого водой и ацетонитрилом, а также основных продуктов его метаболизма.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование динамики изменения основных параметров биологической активности почвы, контаминированной тринитротолуолом. Установлено, что из исследованных групп микроорганизмов наиболее чувствительными к ТНТ оказались нитрификаторы и денитрификаторы.

Впервые показано, что при высоких загрязняющих концентрациях ТНТ (100 и 200 мг/хг) в почве возрастает интенсивность процессов минерализации. Впервые в загрязненных ТНТ почвах проанализированы два класса ферментов - оксидоредуктазы и гидролазы. Продемонстрирована большая чувствительность последних, в особенности уреазы, к загрязнению концентрациями ТНТ свыше 50 мг/кг. Кроме того, показана высокая чувствительность микромицетов. Расчет частоты встречаемости микромицетов в загрязненных образцах обнаружил доминирование небольшого количества устойчивых штаммов, среди которых - возбудители заболеваний растений и условно патогенные для человека микромицеты.

Определено содержание экстрагируемой фракции поллютанта и его основных метаболитов в динамике, а также на протяжении всего периода наблюдений проведено изучение генотоксичности почвенных экстрактов.

Практическая значимость работы. Полученные в работе данные предполагают их применение при диагностировании интенсивности почвенного загрязнения 2,4,6-тринитротолуолом. Высокая чувствительность к загрязнению ТНТ гидролаз и микромицетов и зависимость частоты встречаемости последних от степени загрязнения может быть использована для оценки интенсивности загрязнения.

Установлено, что при отсутствии возобновляемого загрязнения ТНТ и содержания его в почве в количестве не более 100 мг/кг аборигенная микрофлора способна справиться с токсическим стрессом. При наличии в почве ТНТ в количестве, превышающем его растворимость, на первом этапе

целесообразно проведение предварительной ремедиации с использованием инженерно-экологических методов.

Положения, выносимые на защиту.

• Антропогенное загрязнение 2,4,6-тринитротолуолом приводит к изменению количественного соотношения членов бактериального сообщества чернозема выщелоченного, а также к изменению активности ферментов почвы. Главными мишенями воздействия 2,4,6-тринитротолуола являются денитрифицирующие и нитрифицирующие бактерии, а также гидролитические ферменты почвы (уреаза и протеаза).

• Внесение 2,4,6-тринитротолуола в чернозем выщелоченный нарушает структуру комплекса микромицетов в сторону снижения его разнообразия за счет элиминации типичных редких и случайных родов и возрастания частоты встречаемости (ЧВ) родов, содержащих фитопатогенные микромицеты.

• Внесение 2,4,6-тринитротолуола в чернозем выщелоченный сопровождается как сорбцией, так и восстановительной трансформацией ксенобиотика вследствие чего количество экстрагируемого 2,4,6-тринитротолуола в течение эксперимента снижается.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на III международной конференции «Микробное разнообразие: нынешняя ситуация, стратегия взаимодействия, битехнологический потенциал» (ICOMID 2008) (Пермь-Н.Новород-Пермь, 2008), XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха «Microbial enzymes in biotechnology and medicine» (Kazan, 2009), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы изучения биоты Южного Урала и сопредельных территорий» (Орск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 19 рисунков. Цитируемая литература включает 184 источника, из них 84 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служил чернозем выщелоченный, отобранный на территории Буинского района Республики Татарстан. Образцы почвы отбирали с соблюдением правил асептики и помещали в стерильные пергаментные пакеты. Агрохимические показатели почвы следующие: содержание гумуса -5,2%, азота - 0.425%, рН почвенной вытяжки — 7.3.

Оценка биологической активности почв осуществлялась по показателям ферментативной активности, активности азотфиксации и дыхания, численности основных эколого-трофических групп бактерий, качественному и количественному составу микроскопических грибов.

Определение численности бактерий и микромицетов проводили общепринятыми методами посева почвенной суспензии на селективные питательные среды [Методы..., 1991]. Численность микроорганизмов учитывали: утилизирующие органические формы азота - на мясо-пептонном агаре (МПА); утилизирующие минеральные формы азота - на среде Гаузе, образующие эндогенные споры — на смеси МПА и сусло агара (СА) после пастеризации при 70-80°С, денитрификаторы — на жидкой среде Гильтая, нитрификаторы — на жидкой среде Виноградского для первой фазы нитрификации. Численность микроорганизмов пересчитывали на вес абсолютно сухой почвы [Теппер, 2004].

Активность каталазы определялась титрометрическим методом по Колешко, дегидрогеназы - колориметрическим методом с трифенилтетразолийхлоридом (ТТХ), уреазы - колориметрически с реактивом Несслера, протеазы -колориметрически с пересчетом на глицин [Хазиев, 2005]. Активность азотфиксации определяли ацетиленовым методом, респираторную активность -газохроматографически [Гарусов с соавт., 1999]. Биомассу микроорганизмов определяли методом прямого счета в люминесцентном микроскопе по Звягинцеву иКожевину [Методы..., 1991].

Учёт микроскопических грибов проводили на подкисленной среде Чапека и на картофельно-глюкозном агаре (КГА). Родовой состав микромицетов вели по соответствующим определителям. Кривые рангового распределения были построены на основе показателя частоты встречаемости (ЧВ). Для штаммов микромицетов, характеризующихся высокой ЧВ, в чистой культуре была определена радиальная скорость роста [Кураков, 2001].

С целью выявления общих закономерностей воздействия определенной дозы ТНТ на экологическое состояние почв использовали интегральный показатель биологического состояния (ИПБС) почвы. ИПБС рассчитывали по следующим показателям: численность основных эколого-трофических групп бактерий, ферментативные активности, азотфиксация и респираторная активность почвы [Колесников с соавт., 2006].

Генотоксичность почвенной вытяжки была определена в тесте Эймса и БОБ-хромотесте [Ильинская, Маргулис, 2005].

Содержание доступного ТНТ и его метаболитов в ходе эксперимента определяли методом ВЭЖХ.

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Office Excel 2007. Микробиологические показатели представлены в виде средних и медианных значений. Характеристикой разброса служили стандартное отклонение и 2,5 и 97,5 персентили для медианных значений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Количественный анализ физиологических групп микроорганизмов. Чувствительность и высокая индикационная способность микроорганизмов позволяют избрать их в качестве инструмента мониторинга антропогенных изменений [Денисова с соавт., 2005; Бадмаев, Дорошкевич, 2006; Стахурлова с соавт., 2007].

Проведенные исследования показали, что внесение ТНТ в различных концентрациях не привело к существенному снижению численности группы микроорганизмов, использующих минеральный азот (рис. 1А). Воздействие тротила проявлялось в «сбое» сукцессионных циклов. Чем выше была внесенная концентрация ксенобиотика, тем более выраженным было смещение сукцессионных волн относительно незагрязненного образца.

Как видно из рисунка 1Б, на бактерии, потребляющие органический азот, тринитротолуол, напротив, оказал выраженное токсическое действие. Проявлялось это, прежде всего, в снижении количества КОЕ, высеваемых на МПА. Для этой группы бактерий отмечен дозо-зависимый эффект; низкие концентрации ТНТ оказали на гетеротрофные бактерии менее значительное влияние по сравнению с высокими. При концентрациях тротила 20 и 50 мг/кг почвы количество бактерий данной группы варьировало в пределах 2,713,9* 106 кл/г абсолютно сухой почвы (а.с.п.). Внесение в почву более высоких концентраций тротила (100 и 200 мг/кг) привело к достоверному снижению численности гетеротрофных бактерий на протяжении всего опыта, за исключением 5-х суток.

Активность минерализационных процессов в почве оценивается величиной коэффициента микробиологической минерализации. Как следует из анализа динамики коэффициента, при загрязнении чернозема тринитротолуолом происходит интенсификация минерализационных процессов в почве (табл. 1). При этом, чем выше концентрация внесенного ксенобиотика, тем сильнее происходит нарастание процессов минерализации (значения на 12100% выше контрольных).

При загрязнении почвы тринитротолуолом влияние его на группу спорообразующих бактерий было аналогичным по характеру влияния на аммонификаторы (рис. 1В). Для концентраций 100 и 200 мг ТНТ/кг почвы ингибирующий эффект за весь опыт составил в среднем 24 и 52% соответственно. Стоит отметить, что воздействуя по пути снижения численности спорообразующих бактерий, ТНТ в то же время не повлиял на ход сукцессии сообщества.

700 5 600 ■ 500 ■ 400 ■ § 300 • § 200 н 100 о

. 20

I 15 [ 10

! 5 О

5 7 14 □ 0 О20 П50

21 28 сутки

250 л

6 200 я)

150

§ 100 ■

3 50 ■ н

та,

5 7 14

□ О Р20 Н50 В

21 28 сутки

УД

ово.

5 7 14 □ О О 20 Ы50

21 28 сутки

.700 §600 ¿500 "".400 5 300 §200 100 О

Ч 15 &

^ 10 §

я 5 2

Аь

1 5 7 14 □ О И 100 Н200

21 28 сутки

О 1

250 п

Ч 200

^150

§100 О

ё 50

5 7 14 21

□ 0 0 100 0200 В

сутки

5 7 14 21 28 □ О □ 100 0 200 сутки

Рис. 1 Численность актинобактерий (А), аммонификаторов (Б), спорообразующих бактерий (В) при внесении ТНТ. Примеч.: зд. и далее 0, 20, 50, 100 и 200 - концентрации ТНТ (мг/кг).

Известно, что нитрифицирующие и денитрифицирующие бактерии играют важную роль в формировании и поддержании азотного режима почв. Нитрифицирующие бактерии являются агрономически важной группой микроорганизмов. Снижение их численности является одним из проявлений отрицательного воздействия на почву [Абашеева с соавт., 2001; Завьялова, Митрофанова, 2008; Киреева с соавт., 2001; Колесников с соавт., 2007].

Изменение коэффициента минерализации при внесении ТНТ

Время, сутки Внесенное в почву количество ТНТ (мг/кг):

0 20 50 100 200

0 1.4 0.9 1 1.2 1.2

1 0.3 0.3 0.4 0.5 0.9

5 1 0.4 0.6 0.8 1.2

7 0.5 0.6 0.7 0.9 0.7

14 0.5 0.9 1 1.5 1.3

21 0.2 0.4 0.4 1 1.5

28 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4

По сравнению с остальными группами нитрифицирующие бактерии оказались очень чувствительны к токсическому действию ТНТ. При концентрации ксенобиотика 20 мг/кг почвы их численность не отличалась от контрольного образца на 5-, 7- и 21-е сутки (рис. 2А). При концентрации 50 мг/кг почвы количество бактерий приближалось к значениям в незагрязненном образце только на 5-е сутки, на 7-, 14- й 21-е сутки отмечена существенная разница по сравнению с вариантом без ТНТ. Высокие концентрации ТНТ (100 и 200 мг/кг) оказали на нитрификаторы более пролонгированное и выраженное негативное воздействие, снизив их численность в первую половину опыта более чем вдвое.

и 30 -|

ез

и 20 -

о 10 -

0 -

в 70

о та 60 ■

и 50 ■

5 40 -

30 ■

20 -

* 10 -

¿к

га и 20

о 10

ша.

5 7 14 □ 0 П20 П50

21 28 сутки

с 70 -I 3 60 ■ ^ 50 ■

5 40

» 30

2 20 ■

* 10

5 7 14 □ 0 0100 0200 Б

21 28 сутки

ш.

1 5 7 14 □ 0 1320 £850

21 28 сутки

1 5 7 14 21 28 □ 0 П100 П 200 сутки

Рис. 2 Влияние ТНТ на нитрификаторы (А) и денитрификаторы (Б).

Важным этапом превращения азотсодержащих веществ в почве является восстановление окисленных форм, т.е. денитрификация. Динамика изменения численности денитрифицирующих бактерий отражена на рис. 2Б. В течение всего эксперимента, за исключением 7-х суток, в образцах, загрязненных ксенобиотиком, количество денитрификаторов было ниже, чем в контроле и степень снижения почти не зависела от концентрации ТНТ. Снижение количества денитрифицирующих бактерий происходило более чем на 30%, что говорит о нарушении тротилом сбалансированности содержания различных форм азота в почве.

Итак, в целом влияние ТНТ на эколого-трофические группы проявлялось в токсичности его высоких концентраций (100 и 200 мг/кг), которые приводили к снижению численности всех исследованных групп. Исключение составили только бактерии, развивающиеся за счет минеральных форм азота. Для них, а также для денитрификаторов и гетеротрофов, отмечено смещение хода сукцессионных волн, которое также считают одним из проявлений токсичности контаминантов [Ваккеров-Коузова, 2005]. К завершению периода наблюдений (28 сутки) для большинства исследованных групп бактерий отмечается тенденция восстановления их количества во всех почвах, содержащих ТНТ.

2. Биомасса микроорганизмов почвы

Биомасса и структура сообщества являются еще одним индикаторным свойством микробных сообществ [Каширская с соавт., 2009].

Как показали результаты прямого микроскопирования, в почве контрольного образца доминирующим компонентом является вегетативный мицелий. Биомасса бактерий в незагрязненной почве варьировала в пределах 0,7-2,5*10"5 г/г, в загрязненных образцах - от 0,5 до 2,4*10"5 г/г и биомасса микромицетов - от 39 до 70,2* 10"5 г/г в контроле, от 7,8 до 54,6* 10"5 г/г в почве с ТНТ (табл. 2, 3). Именно мицелий оказался наиболее чувствителен к действию загрязнителя, до 14-х суток опыта его содержание в почве с ТНТ было достоверно ниже по сравнению с контролем. Только к окончанию опыта наметилась тенденция восстановления биомассы микромицетов, которая наиболее заметна была в образце, содержащем 20 мг ТНТ/кг.

При изучении динамики сухого веса бактериального населения при внесении 20 и 50 мг ТНТ/кг почвы было установлено отсутствие достоверного отличия биомассы бактерий от незагрязненного образца. При высоких концентрациях ксенобиотика (100 и 200 мг/кг) биомасса была меньше по сравнению с контролем в среднем на 30-33%. Меньшее по сравнению с микромицетами угнетение развития бактерий увеличивает соотношение биомассы этих микроорганизмов в пользу бактерий.

Биомасса бактерий и микромицетов после внесения ТНТ (20 и 50 мг/кг)

Время, сутки Биомасса, г*10"5/ г почвы

Биомасса бактерий Биомасса микромицетов

0 20 50 0 20 50

0 1,03 1,03 1,04 53,6 46,8 41,7

1 2,49 2,40 2,28 70,2 54,6 45,6

5 1,56 1,29 1,20 39,0 31,2 23,4

7 2,12 2,00 1,98 66,1 39 31,2

14 1,00 1,01 0,89 42,9 46,8 25,5

21 0,88 0,90 0,80 54,6 48,36 40,6

28 0,74 0,76 0,65 58,5 50,7 43,7

Табл. 3

Биомасса бактерий и микромицетов после внесения ТНТ (100 и 200 мг/кг)

Время, сутки Биомасса, г* 10"5 / г почвы

Биомасса бактерий Биомасса микромицетов

0 100 200 0 100 200

0 1,03 1,10 1,36 53,6 45,6 43,9

1 2,49 2,09 1,85 70,2 33,5 25,7

5 1,56 1,20 0,82 39,0 16,4 7,8

7 2,12 1,78 1,57 66,1 27,3 26,2

14 1,00 0,56 0,70 42,9 23,4 19,5

21 0,88 0,48 0,53 54,6 33,5 27,3

28 0,74 0,48 0,50 58,5 37,4 30,4

3. Анализ динамики ферментативных активностей. Количественные изменения, происходящие в микробном ценозе загрязненных почв, не всегда отражают изменения ее биологической активности. Ферментативная активность почв обусловлена не только различным содержанием микроорганизмов, но и их разнообразием и физиологической активностью. Поэтому для биомониторинга почв предпочтительнее совместное изучение микробиологических и ферментативных процессов [Барашцук, Хамова, 2008].

При исследовании динамики окислительно-восстановительных ферментов - каталазы и дегидрогеназы - было установлено, что до 7-х суток эксперимента образцы достоверно не отличались по уровню активностей (рис. ЗА, Б). Однако и позднее ТНТ не оказывал значительного ингибирующего эффекта ни на каталазу, ни на дегидрогеназу. Максимальное ингибирование

активности ферментов составило 15-28% (с максимумом на 14-е сутки) в случае каталазы и 50-56% (с максимумом на 21-е сутки) в случае дегидрогеназы.

В почве обнаруживаются гидролитические ферментные системы, осуществляющие превращение азотсодержащих органических веществ. Важным диагностическим показателем интенсивности процессов мобилизации почвенного азота служит активность ферментов азотного цикла - протеазы и уреазы [Бадмаев, Дорошкевич, 2006]. Известно, что ароматические соединения оказывают на протеолитическую активность почв ингибирующее действие [Киреева с соавт., 2001]. Наши результаты подтверждают данное положение: в почвенных образцах с высокой концентрацией ТНТ (100 и 200 мг/кг) происходит подавление активности протеазы с начала опыта (рис. 4А). Однако внесение 20 мг ТНТ/кг почвы уже к 5м суткам вызвало повышение активности фермента на 75% по сравнению с образцом без ТНТ, и до 21 суток включительно активность протеазы была выше, чем в контроле. При внесении 50 мг ТНТ активность протеазы превышала уровень активности фермента в незагрязненном образце только на 21 сутки эксперимента.

Ингибирование активности почвенной уреазы при загрязнении ТНТ наблюдалось при всех испытанных концентрациях, за исключением 20 мг/кг (рис. 4Б). Это способствовало уменьшению и без того невысокой обеспеченности данного типа почвы минеральными соединениями азота. Самая высокая активность фермента в загрязненной почве наблюдалась к завершению опыта (28 сутки) в образце, содержащем 20 мг ТНТ/кг.

^ к

h g2

1 о

8 2,5

Э"

~ 2 1-0 ¿ а

¡w

¿ i -

% о

7 14 21 □ 0 П20 D50 Б

28 сутки

- s<

2 ÍS5 ef4

s §2 1

8 2,5

t ?

иО ¿

Я5

S W

i i |о,5

£ 0

7 14 21 □ 0 0100 0200 Б

28 сутки

□ 0 Ш0 S50

28 сутки

□ 0 □ 100 0200

28 сутки

Рис. 3 Активность дегидрогеназы (А) и каталазы (Б) при внесении ТНТ

0,3 Л

мд,

21 28

сутки

□ О СШ В50 ПО 0 100(2200

Рис. 4 Активность протеазы (А) и уреазы (Б) при внесении ТНТ Таким образом, на гидролазы тринитротолуол оказал более выраженное токсическое действие. Крайне чувствительной к загрязнению тротилом оказалась уреаза. На момент 1-х суток активность фермента снизилась в среднем на 35-63%. Для протеазы такой же уровень ингибирования был достигнут только при внесении высоких доз поллютанта.

0 5 10 15 20 25 30 Рис. 5 Активность азотфиксации при внесении ТНТ сутки Внесенное в почву количество ТНТ (мг/кг): -»-0 20 -♦-50 —® • 100 -«-200

Исследование азотфиксации (рис. 5) показало, что загрязнение почвы тротилом в концентрации 20 мг/кг достоверно не изменяет количество связанного азота. Внесение 50 и 100 мг ТНТ приводило к сглаживанию осцилляции нитрогеназной активности, как это было отмечено для

актинобактерий и денитрификаторов. Внесение 200 мг ТНТ /кг приводило не только к сглаживанию флуктуаций активности нитрогеназы, но и к ее достоверному ингибированию на протяжении всего эксперимента.

В целом, к 28-м суткам эксперимента в уровне ферментативной активности загрязненных ТНТ почв не было достоверных отличий от незагрязненной почвы для дегидрогеназы, каталазы и протеазы (за исключением образца, содержащего 200 мг ТНТ/кг). Для уреазы и нитрогеназы по уровню"активности все без исключения образцы были сравнимы с контрольными.

Интегральным показателем биохимической активности почвы служит эмиссия С02 [Симонов, Андросов, 2008]. При измерении субстрат-индуцированного и базального дыхания было определено, что на 5-е сутки интенсивность выделения С02 как в контроле, так и в опыте была минимальной (рис. 6). Позднее происходило увеличение выделения С02 и его максимальные значения наблюдались на 21-е сутки. К 28-м суткам опытные варианты, содержащие все исследованные концентрации ТНТ, по показателю индуцированного дыхания достоверно не отличались друг от друга, в то время как базальное дыхание в загрязненной почве оказалось на 50-60% меньше по сравнению с незагрязненной. Отсутствие продолжительного ингибирования базального и индуцированного дыхания, а также снижение коэффициента микробного дыхания до 1 уже к 5-м суткам (рис. 6), позволяют сделать вывод о том, что, в целом, ТНТ не обнаружил выраженного влияния на уровень эмиссии диоксида углерода.

Базальное дыхание (V

Индуцированное дыхание (VSm)

я*

-Й: (Ч

о и (S

1 к°

30 сутки

Коэффициент микробного дыхания (QR)

30 сутки

5 10 15 20

Внесенное в почву количество ТНТ —0 ---20 -—50 —- 100 -» 200 Рис. 6 Скорости базального, субстрат-индуцированного коэффициент микробного дыхания почвы в присутствии ТНТ

дыхания и

4. Интегральный показатель биологического состояния почвы

Для оценки степени нарушения экологических функций почвы нами был использован интегральный показатель биологического состояния (ИПБС) почвы. Данный показатель позволяет оценить совокупность биологических показателей, интегрировать их относительные значения, абсолютные значения которых не могут быть суммированы [Колесников с соавт., 2009].

Степень снижения ИПБС напрямую зависела от концентрации ксенобиотика, внесенного в почву (рис. 7). При максимальной нагрузке поллютанта (200 мг/кг) в течение всего периода исследований наблюдалось стойкое снижение интегрального показателя более чем на 35%. Влияние остальных концентраций носило волнообразный характер с максимальным снижением в первую неделю и на 21 сутки со стремлением к восстановлению к окончанию эксперимента.

—■—0 -*-20 —50 100 -» 200

Рис. 7 Изменение ИПБС почвы после внесения ТНТ 5. Структура комплекса микромицетов при воздействии ТНТ

Чисто количественная оценка действия антропогенных факторов на сообщество не может считаться достаточной. В связи с этим нами была проведена оценка качественных изменений комплекса микромицетов.

Родовой состав грибов в незагрязненной почве (табл. 4) был представлен 41 различным родом. Своеобразие комплекса заключалось в отсутствии доминантов, только у рода Pénicillium ЧВ превысила 60%.

При наименьшей нагрузке поллютанта (20 мг/кг) разнообразие штаммов сократилось на 25%. По мере возрастания концентрации ТНТ на фоне продолжающегося уменьшения количества родов, которое происходило за счет исчезновения редких и случайных родов (рис. 8, 9), постепенно увеличивалась доля доминирующих и типично частых родов.

В образцах, содержащих более существенные концентрации ксенобиотика - 50 и 100 мг/кг — не были обнаружены следующие грибы: Wardomyces, Zygosporium, Halobyssus, Absidia, Nigrospora, Scolecobasidium и роды Scedosporium, Mucor, Monocillium, Doratomyces (табл. 4). Следует отметить, что одновременно увеличилась ЧВ возбудителей заболеваний Cephalosporium и Fusarium и микромицетов родов Aspergillus и Sporotrichum.

120

й " g 40 -

20 -

0 ■

0 5 10 15 20 25 30

Внесенное в почву количество ТНТ (мг/кг): сутки

К Внесенное количество ТНТ (мг/кг):

20 50 100 200

Absidia - 28 Absidia -28

Acremonium - 8 Acremonium - 8

Altemaria - 12 Alternaria - 12

Aspergillus - 20 Aspergillus - 28 Aspergillus - 36 Aspergillus -48 Aspergillus -12

Aureobasidium-% Aureobasidium -8

Cephalosporium Cephalosporium- Cephalosporium- Cephalosporium Cephalosporium

-24 20 28 -40 -64

Chaetomium - 16 Chaetomium -20 Chaetomium -16 Chaetomium -8

Cladosporium-20 Cladosporium-t

Coniothyrium-20 Coniothyrium -20 Coniothyrium-% Coniothyrium 16

Doratomyces - 8 Doratomyces- 8 Cuhularia Cuhularia

Funseceae - 16 lunata -8 lunata-20

Fusarium-24 Fusarium-36 Fusarium-68 Fusarium-1)! Fusarium-100

Geomyces Geomyces Geomyces Geomyces Geomyces

pannorus-56 pannorus-56 pannorus -52 pannorus -80 pannorus-J00

Sporotrichum Sporotrichum Sporotrichum Sporotrichum Sporotrichum

pruinosum-40 pruinosum-56 pruinosum-64 pruinosum-80 pruinosum-100

Geotrichum -24 Geotrichum-20 Gilmaniella -20

Halobyssus -16 Halobyssus -16

Hormiscium -56 Hormiscium-AS Hormiscium-52 Hormiscium-32 Hormiscium-20

Humicola -28 Humicola-20 Humicola-\6 Humicola-\2 Humicola -16

Microascus -28

Monocittiwn -44 Monocilliurn -24 Monocilliurn -8

Mortierella -52 Mortierella -36 Mortierella -40 Mortierella- 20 Mortierella-2 0

Mucor -8 Mucor -8 Mucor-8

Nigrospora-\6 Nigrospora-16

Ostracoderma -8 Paecilomyces-

Paecilomyces- 48 Paecilomyces-A0 Paecilomyces-36 28

Penicillium -68 Penicillium -68 Penicülium-6% Penicillium -64 Penicillium-16

Phialophora- 16

Pulularia-20

Scedosporium-20 Scedosporium-20 Scedosporium-B Rhinocladium-

Sclerotinia -8 28

Sepidonium-2 0 Scolecobasidium - Ramichoridiwn

Scolebasidium- 20 20 -24

Scopuloriopsis36 Scopulariopsis-A0 Scopulariopsis-44 Scopulariopsis -

Sporotrichum-36 Sporotrichum-A0 Sporotrichum-40 SporotrichumAA SporotrichumAA

Stemphilium -8 Sepidonium-\6

Trichoderma-36 Trichoderma -40 Trichoderma-36 Trichoderma-36 Trichoderma-AA

Trichotecium-%

Tilocladium-%

Ulocladium -8

Verticillium -8 Verticillium-\2

Wardomyces- 8 Wardomyces -8

Zygosporium-8 Zygosporiiun -8

Жирным выделены роды микромицетов, проявившие устойчивость к загрязнению ТНТ

В почве, содержащей 200 мг/кг ТНТ, количество родов уменьшилось по сравнению с контрольным вариантом на 25. Вместе с тем, появились, ранее не обнаруженные представители родов Rhinocladium, Ramichoridium и Gilmaniella, Fusidium, Culvularia. В образце, загрязненном максимальной концентрацией ксенобиотика, ЧВ некоторых из фитопатогенных родов достигла 100%. Следствием возрастания ЧВ вышеперечисленных родов стало увеличение доли микроорганизмов, обладающих фитотоксическими свойствами. В дальнейшем это может привести к накоплению микотоксинов и усугублению негативного эффекта загрязнителя [Гузев с соавт., 1985].

Одним из подходов характеристики структуры комплекса микромицетов является анализ соответствия относительного распределения ЧВ микромицетов различным математическим моделям [Кураков, 2001; Левин, Гузев, 1987]. Распределение по ЧВ в почвенных образцах с 20 и 50 мг ТНТ/кг, несмотря на выявленные изменения, было близко к каноническому лог-нормальному типу (рис. 9 а, б). Для образцов, загрязненных 100 и 200 мг ТНТ/кг почвы, было характерно распределение по типу геометрического ряда (рис. 9 в, г).

Таким образом, возрастание концентрации ТНТ приводит к нарушению состава микробоценоза, а именно к размножению нескольких устойчивых форм, которые дают скачок численности. Для понимания этих процессов была исследована радиальная скорость роста этих микромицетов. Для определения радиальной скорости роста были отобраны микромицеты, относящиеся к родам Fusarium, Aspergillus и 2 штамма — к роду Pénicillium. Изучаемые культуры различаются как по абсолютным значениям скоростей роста, так и по пределам толерантности к ТНТ. Более высокая (в 2-6 раз) средняя линейная скорость роста Fusarium sp. указывает на выраженность г-стратегических свойств. Благодаря свойствам r-стратега микромицеты рода Fusarium оказались более устойчивы к действию 2,4,6-тринитротолуола.

Как и Aspergillus sp., Pénicillium sp.2 оказался не способен расти при концентрациях 100, 150 и 200 мг/л ксенобиотика. Однако при концентрациях 20 и 50 мг/л ТНТ, скорость роста Aspergillus sp. была выше практически в 2 раза скорости роста Pénicillium sp.2. Из исследованных микромицетов устойчивостью средней степени обладал Pénicillium sp.I, колонии которого росли при всех исследованных концентрациях тринитротолуола. Fusarium sp. благодаря высокой скорости роста образовывал колонии при всех исследованных концентрациях ксенобиотика, за исключением 200 мг/л. Торможение микромицета было наименьшим по сравнению с микромицетами других родов (рис. 10). Таким образом, при воздействии ТНТ на почву, сообщество микромицетов обогащается штаммами микромицетов, обладающими свойствами г-стратегов.

номер рода

Рис. 8 Ранговое распределение частоты встречаемости (ЧВ) микромицетов в незагрязненном образце (логарифмическая шкала).

номер рода номер рода

Рис. 9 Ранговое распределение частоты встречаемости микромицетов в образцах, содержащих ТНТ:

(а) 20 мг/кг; (б) 50 мг/кг; (в) 100 мг/кг и (г) 200 мг/кг.

Для оценки действия тротила в отношении микромицетов были использованы два показателя: ED50 — представляющий собой концентрацию вещества, необходимую для 50% подавления роста колоний грибов и ED95 — представляющий концентрацию вещества, необходимую для практически полного подавления роста колоний грибов.

Как видно из рис. 11, по чувствительности указанные микромицеты можно расположить следующим образом: Aspergillus sp. > Pénicillium sp.l > Pénicillium sp.2 > Fusarium sp.

1 2 Концентрации ТНТ (мг/л):

@0 И20 О50 0100 Е3150 "200

Рис. 10 Влияние ТНТ на радиальную скорость роста (Кг) доминирующих микромицетов

Fusarium Pénicillium Aspergillus Pénicillium sp. sp. 1 sp. sp. 2

микромицеты

Рис.

11 Чувствительность доминирующих микромицетов к 2,4,6-тринитротолуолу 6. Оценка генотоксических свойств почвенных экстрактов

Для интегральной оценки здоровья почвы мы исследовали генотоксичность почвы, загрязненной тринитротолуолом. При оценке способности индуцировать мутации у тестерного штамма Salmonella typhimurium ТА 100 при воздействии опытных образцов почвенной вытяжки значимого превышения числа ревертантов выявлено не было (рис. 12).

SOS-хромотест (рис. 13) также показал отсутствие генотоксичности у почвенного экстракта за исключением максимальной нагрузки ксенобиотика в момент его внесения. Таким образом, при загрязнении почвы тринитротолуолом в диапазоне концентраций 20-200 мг/кг почвы доступная для живых организмов часть ксенобиотика не проявляет мутагенной активности ни в тесте Эймса, ни в SOS-хромотесте.

Внесенное в почву количество ТНТ (мг/кг): □ К (вода) ВО И20 050 В 100 «200

сутки

Рис. 12 Оценка генотоксичности почвенных экстрактов в тесте Эймса

к к я и

>Л

К О 0,00 2 о

2,5 -| 2 -1,5 -

0,5 -

О 15 28 сутки

Внесенное в почву количество ТНТ (мг/кг): —•—О -*-20 —♦—50 —•■ 100 —» 200

Рис. 13 Индукция БОЗ-ответа водными экстрактами почвы, содержащими

ТНТ

7. Динамика содержания 2,4,6-тринитротолуола и его метаболитов

Как видно из табл. 5 А, Б, в ходе инкубирования концентрация ТНТ, определенная в водном и ацетонитрильном почвенных экстрактах, постоянно снижалась. Как показывает анализ полученных данных, доступной оставалось небольшая часть внесенного ТНТ. Так, через несколько часов после внесения водой удавалось извлечь 2,8-3,7% (из образцов с 20 и 50 мг ТНТ) и не более 15,5% (из образцов с 100 и 200 мг ТНТ) от внесенного количества ТНТ. Уже на 15 сутки в образцах почв, в которые было внесено 20 и 50 мг ТНТ, он не детектировался в водных экстрактах. То же было на 28 сутки в образцах, содержащих 100 и 200 мг ТНТ. Для ацетонитрильных экстрактов количество экстрагированного ТНТ, вначале равное 27-39% к окончанию опыта составляло 3,5-6,15% (табл. 5 Б).

Определение продуктов метаболизма показало, что среди них основными оказались 4-аминодинитротолуол (4-АДНТ) и 220

аминодинитротолуол (2-АДНТ). Снижение количества экстрагируемого ТНТ сопровождалось повышением концентрации 2-АДНТ и 4-АДНГ (табл. 6А, Б).

Таблица 5

Содержание 2,4,6-тринитротолуола, экстрагируемого водой (А) и

Время, сутки Внесенное в почву количество ТНТ (мг/кг):

0 20 50 100 200

0 0 0.56 1.85 15.5 23.51

15 0 0 0 2.64 2.93

28 0 0 0 0 0

Время, сутки Внесенное в почву количество ТНТ (мг/кг):

0 20 50 100 200

0 0 6.47 19.61 27.33 58.89

15 0 2.59 7.47 7.44 30.68

28 0 0 1.75 6.15 10.46

Таблица 6

Содержание основных метаболитов ТНТ в водных (А) и

Время, Внесенное в почву количество ТНТ (мг/кг):

сутки 0 20 50 100 200

0 0 0/0* 2,92/9,1 7,4/14,3 19,3/2,1

15 0 0 0 0/1,3 2,3 / 8,2

28 0 0 0 0 0/1,8

♦Примечание: 2-аминодинитротолуол / 4- аминодинитротолуол

Время, Внесенное в почву количество ТНТ (мг/кг):

сутки 0 20 50 100 200

0 0 0/0 0/0 0,3 / 0,9 1,1/0,9

15 0 2,8 / 6,9 2,8 / 6,6 31,6/67,5 45,9/100

28 0 5,5/11,4 0,8/1,5 1,8/2,5 51,3/146

Из проведенных исследований экспериментального загрязнения чернозема выщелоченного 2,4,6-тринитротолуолом следует, что воздействие ТНТ на биологическую активность почвы не проявлялось в жестком и непреодолимом подавлении какой-либо группы микроорганизмов. К окончанию периода наблюдений большинство показателей, составляющих биологическую активность загрязненной почвы, продемонстрировало способность к восстановлению. Исключение составил только опытный вариант, содержащий

200 мг ТНТ/кг почвы, моделирующий очаг загрязнения, содержащий кристаллический ТНТ. Экстраполируя результаты исследований на загрязнение ТНТ in situ можно сделать вывод, что при отсутствии возобновления загрязнения из-за растворения кристаллов тротила в очаге загрязнения сообщество микроорганизмов почвы способно справиться с токсическим стрессом.

ВЫВОДЫ

1. Степень резистентности эколого-трофических групп микроорганизмов почвы к 2,4,6-тринитротолуолу убывает в ряду: актинобактерии > спорообразующие бактерии > аммонификаторы > нитрификаторы > денитрификаторы > микромицеты. Коэффициент минерализации увеличивается в диапазоне концентраций 50-200 мг ТНТ/кг в 1,3-7,5 раза по сравнению с контролем. 2,4,6-тринитротолуол оказывает негативное влияние~на биомассу бактерий почвы только в концентрации 200 мг/кг, снижая ее на 25-47%. В диапазоне концентраций 50-200 мг/кг 2,4,6-тринитротолуол отрицательно влияет на развитие микромицетов, уменьшая их биомассу на 37-60%.

2. 2,4,6-тринитротолуол ингибирует отдельные этапы цикла азота, снижая интенсивность азотфиксации, разложения мочевины и аммонификации белков, но не приводит к существенному снижению активности каталазы, дегидрогеназы и не снижает интенсивность дыхания.

3. 2,4,6-тринитротолуол оказывает отрицательное воздействие на иерархическую структуру комплекса микромицетов, снижая разнообразие комплекса и увеличивая долю родов, содержащих фитопатогенные, сапротрофные и условно патогенные для человека микромицеты - Aspergillus, Fusarium, Cephalosporium.

4. Водные экстракты почвы, загрязненной 2,4,6-тринитротолуолом, обладали слабой способностью индуцировать SOS-ответ у тестерного штамма Escherichia coli PQ37 только в концентрации ксенобиотика 200 мг/кг в момент его внесения. В тесте Эймса мутагенные эффекты водных экстрактов почвы, загрязненной 2,4,6-ТНТ (20-200 мг/кг), не обнаружены.

5. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии установлено, что непосредственно после внесения в почву 2,4,6-тринитротолуол на 60-70% связывается с ее компонентами. Количество экстрагируемого ацетонитрилом ксенобиотика в течение месяца снижается от 30-40% до 0-6%, что связано с его сорбцией и частичной микробной трансформацией, зарегистрированной по увеличению содержания продуктов нитровосстановления.

6. Проведенные исследования позволяют заключить, что при отсутствии возобновления загрязнения сообщество микроорганизмов способно справиться с токсическим стрессом, вызванным загрязнением почвы 2,4,6-тринитротолуолом в концентрации, не превышающей 100 мг/кг почвы. При наличии в почве ТНТ в количестве, превышающем его растворимость, на первом этапе целесообразно проведение предварительной ремедиации с использованием инженерно-экологических методов.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Шинкарев А. А. Подготовка экспериментальных образцов почвы при изучении внутрипочвенной трансформации 2,4,6-тринитротолуола / А.А. Шинкарев, И.П. Демидова. Г.Ю. Яковлева, В.Н. Будников, Б.М. Куриненко // Ученые записки Казанского государственного университета. - 2008. - Т. 150, кн. З.-С. 103-111.

2. Кормильцева И.П. Влияние 2,4,6-тринитротолуола на биологическую активность чернозема выщелоченного / И.П. Кормильцева, Г.Ю. Яковлева, А.В. Гарусов, Н.Г. Захарова, Б.М. Куриненко // Вестник ОГУ. - 2010. - № 6 (112). -С. 119-124.

3. Kurinenko В.М. The toxic action of 2,4,6-trinitrotoluene on Pseudomonas fluorescens B-346 / B.M. Kurinenko, G.Yu. Yakovleva, R.E. Davidov, I.P. Demidova // Microbial diversity: current situation, conservation strategy and biotechnological potential: Proceedings of III International conference. - Perm, 2008. - P.169.

4. Yakovleva G.Y. Reduction of 2,4,6-trinitrotoluene toxic effect in relation to Bacillus subtilis SKI under glutathione / G.Y. Yakovleva, I.P. Demidova. R.R. Hamzina, N.V. Subbotina, N.V. Kalacheva, B.M. Kurinenko // Abstracts of the XIV International Conference «Microbial enzymes in biotechnology and medicine».-Kazan, 2009. - P.84.

5. Demidova I.P. Dynamics of nitrogenase activity in soil under 2,4,6-trinitrotoluene pollution / I.P. Demidova, N.A. Arbuzova, S.S. Zemskaya, G.Y.Yakovleva, N.G. Zaharova, B.M. Kurinenko // Abstracts of the XIV International Conference «Microbial enzymes in biotechnology and medicine».-Kazan, 2009. - P. 74.

6. Кормильцева И.П. Динамика' протеазной и уреазной активностей чернозема выщелоченного при загрязнении 2,4,6-тринитротолуолом / И.П. Кормильцева, Н.Г. Захарова, Г.Ю. "Яковлева, Б.М. Куриненко // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. - М.: МАКС Пресс, 2009. - С.90.

7. Кормильцева И.П. Реакция микромицетов чернозема выщелоченного на загрязнение 2,4,6-тринитротолуолом / И.П. Кормильцева, Г.Ю. Яковлева, Н.Г. Захарова, Б.М. Куриненко // V Всероссийская конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой»: материалы конференции. - Саратов: Научная книга, 2010. - С. 57.

8. Кормильцева И.П., Изменение структуры комплекса микромицетов чернозема выщелоченного при внесении 2,4,6-тринитротолуола in vitro / И.П. Кормильцева, Г.Ю. Яковлева, Н.Г. Захарова, Б.М. Куриненко // Всероссийская научно-практическая конференция «Актуальные проблемы изучения биоты Южного Урала и сопредельных территорий»: Материалы конференции - Орск: Издательство ОГТИ, 2010 - С. 31.

Отзывы на автореферат просим высылать по адресу:

420008 г. Казань, ул. Кремлевская, 18, Казанский университет, Отдел аспирантуры, Ученому секретарю Диссертационного совета Д 212.081.08 Абрамовой Зинаиде Ивановне.

Факс: (843) 238-76-01

Подписано в печать 4.05.2011 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Казанского университета Тираж 100 экз. Заказ 2/5

420008, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел.: (843) 233-73-59, 292-65-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кормильцева, Инна Петровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОПАСНОСТЬ 2,4,6 -ТРИНИТРОТОЛУОЛА.

1.1.1 Масштабы загрязнения окружающей среды.

1.1.2 Токсическое действие 2,4,6-тринитротолуола на млекопитающих и человека.

1.1.3 Токсические эффекты 2,4,6-тринитротолуола в отношении бактерий

1.2 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА С ПОЧВОЙ.

1.2.1 Сорбционные процессы в почве.

1.2.2 Гумификация ТНТ в почве.

1.2.3 Обзор способов ремедиации почв, загрязненных 2,4,6-тринитротолуолом.

1.3 ПОКАЗАТЕЛИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ОЦЕНКЕ АНТРОПОГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ НА ПОЧВУ.

1.3.1 Бактерии азотного цикла при различных антропогенных воздействиях.

1.3.2 Показатели микробной биомассы почв.

1.3.3 Ферментативная активность почв как один из самых чувствительных показателей загрязнения.

1.3.4 Азотфиксирующая и дыхательная активности в почве.

1.3.5 Структура комплекса микромицетов почвы как показатель антропогенного воздействия.

РЕЗЮМЕ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Описание объектов.

2.2 Внесение 2,4,6-тринитротолуола в почву.

2.3 Определение численности почвенных микроорганизмов методом посева

2.3.1 Подготовка почвенного материала для посева.

2.3.2 Определение численности почвенных микроорганизмов методом посева на твердые среды.

2.3.3 Определение численности нитрифицирующих и денитрифицирующих бактерий на жидких средах.

2.3.4 Определение различных групп почвенных микроорганизмов на специфических питательных средах.

2.4 Количественный учет микроорганизмов почвы прямым микроскопическим методом.

2.5 Ферментативные активности почвы.

2.5.1 Определение каталазной активности.

2.5.2 Определение дегидрогеназной активности почвы.

2.5.3 Определение уреазной активности почвы.

2.5.4 Определение протеолитической активности почвы.

2.6 Определение активности азотфиксации в почве ацетиленовым методом

2.7 Определение дыхания почвы с применением метода газовой хроматографии.

2.8 Структура комплекса микромицетов.

2.9 Определение токсичности ТНТ для микромицетов.

2.9.1 Выделение чистой культуры микромицетов.

2.9.2. Ход анализа.

2.9.3 Расчёт ЕО50, ЕБ95 графическим способом.

2.10 Генотоксичность почвенной вытяжки.

2.10.1 Определение генотоксичности в тесте Эймса.

2.10.2 Определение генотоксичности в БОБ-хромотесте.

2.11 Расчет интегрального показателя биологического состояния почвы.

2.12 Высоко эффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) ТНТ и продуктов его трансформации.

2.13 Статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Оценка воздействия 2,4,6-тринитротолуола на эколого-трофические группы микроорганизмов.

3.1.1 Оценка действия 2,4,6-тринитротолуола на бактерии, потребляющие минеральные и органические формы азота.

3.1.2 Оценка влияния 2,4,6-тринитротолуола на коэффициент минерализации.

3.1.3 Влияние 2,4,6-тринитротолуола на спорообразующие бактерии.

3.1.4 Действие 2,4,6-тринитротолуола на численность нитрифицирующих и денитрифицирующих бактерий.

3.2 Динамика биомассы почвенных микроорганизмов под влиянием ТНТ

3.3 Исследование активности ферментов.

3.3.1 Изменение каталазной активности в загрязненной почве.

3.3.2 Действие 2,4,6-тринитротолуола на дегидрогеназу почвы.

3.3.3 Протеазная активность загрязненной почвы.

3.3.4 Реакция уреазной активности почвы на загрязнение 2,4,6-тринитротолуолом.

3.4. Оценка азотфиксирующей активности.

3.5 Динамика респираторной активности.

3.6 Динамика интегрального показателя биологического состояния чернозема выщелоченного при загрязнении 2,4,6-тринитротолуолом.

3.7 Структура комплекса микромицетов.

3.7.1 Оценка качественных изменений в родовом составе комплекса.

3.7 2 Изменение коэффициентов Жаккара и Серенсена.

3.7.3 Радиальная скорость роста микромицетов при различных концентрациях 2,4,6-тринитротолуола.

3.7.4 Изучение жизнеспособности микромицетов.

3. 8 Оценка генотоксических свойств почвенных экстрактов в тесте Эймса и 808-хромотесте.

3. 9 Динамика содержания в почве 2,4,6-тринитротолуола.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменение биологической активности чернозема выщелоченного при внесении 2,4,6-тринитротолуола"

Актуальность проблемы. Интенсивное развитие военного комплекса и применение в качестве основы большинства взрывчатых веществ 2,4,6-тринитротолуола привели к значительному загрязнению отдельных территорий. Места концентрации загрязнения не ограничиваются контаминацией только территорий, на которых расположены или располагались военные объекты или происходили военные действия: Они являются почвенным реактором непрерывного действия, источником вторичного загрязнения территорий, находящихся за пределами исходного загрязнения. Причиной распространения загрязнения является миграция ксенобиотика с грунтовыми водами. Кроме того, на производстве 2,4,6-тринитротолуола и при детонации заряда загрязнению подвергается атмосферный воздух, который потом также становится источником вторичного загрязнения почв [Boopathy, 2000; Gorontzy et al., 1994; Martinetz and Rippen, 1996].

Результатом присутствия высокотоксичного и персистентного взрывчатого соединения ТНТ в подземных водах, почве, воздухе и осадочных породах стало экстенсивное загрязнение по всему миру и на сегодняшний день ТНТ представляет собой один из важнейших загрязнителей окружающей среды [Lewis et al, 2004; Halasz et al., 2002]. В Европе всю серьезность проблемы только начали осознавать. В Российской Федерации данные о содержании тринитротолуола и других взрывчатых веществ в почве не придаются огласке, поэтому о масштабах загрязнения в нашей стране остается только догадываться.

Главным компонентом ландшафта, депонирующим ксенобиотики, является почвенный покров. Зачастую ТНТ находится даже в тех почвах, где присутствовать, казалось бы, не должен и где его нахождение невозможно объяснить. Не подозревая о токсичности таких почв или же не придавая этому должного внимания, поля отводят под сельскохозяйственное использование. Основная опасность мероприятий на контаминированной 7 почве таится в том, что выращенная на ней продукция может в конечном итоге наносить вред здоровью человека.

В доступной нам литературе приводятся попытки оценки биологической активности почв, загрязненных ТНТ. Однако эти работы фокусируются на отдельных биохимических процессах. Например, было показано, что в почвах длительно или относительно недавно загрязненных ТНТ даже при низком уровне загрязнения угнетаются ферментативные активности (дегидрогеназная и азотфиксирующая активности) [Gong et al., 1999; Siciliano et al., 2000]. К сожалению, в литературе приводятся данные по одноразовому определению тех или иных параметров биологической активности почвы [Travis et al., 2007]. Мы считаем, что исследования подобного рода должны проводиться в течение продолжительного срока, только они имеют теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи исследования. Цель работы — провести интегральную оценку изменения биологической активности чернозема выщелоченного после внесения 2,4,6-тринитротолуола in vitro.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:

2. Оценить изменения активности ферментов, азотфиксации и дыхания после загрязнения почвы 2,4,6-тринитротолуолом;

3. Охарактеризовать качественное и количественное изменение структуры комплекса микромицетов и оценить устойчивость к 2,4,6тринитротолуолу микромицетов, занимающих в популяции загрязненной ксенобиотиком почвы доминирующее положение;

4. Оценить генотоксические свойства почвы, загрязненной 2,4,6-тринитротолуолом;

5.Охарактеризовать динамику содержания в загрязненной-почве 2,4,6-тринитротолуола, экстрагируемого водой и ацетонитрилом, а также основных продуктов его метаболизма.

Научная новизна работы. Впервые исследована динамика изменения всех основных параметров биологической активности почвы, контаминированной тринитротолуолом. Установлено, что из исследованных групп микроорганизмов наиболее чувствительными к ТНТ оказались нитрификаторы и денитрификаторы.

Впервые показано, что при высоких загрязняющих концентрациях ТНТ (100 и 200 мг/кг) в почве возрастает интенсивность процессов минерализации.

Впервые в загрязненных ТНТ почвах проанализированы два класса ферментов - оксидоредуктазы и гидролазы. Продемонстрирована большая чувствительность последних, в особенности уреазы, к загрязнению концентрациями ТНТ свыше 50 мг/кг. Кроме того, показана высокая чувствительность к ТНТ микромицетов. Расчет частоты встречаемости микромицетов в загрязненных образцах обнаружил доминирование небольшого количества устойчивых родов, среди которых - возбудители заболеваний растений и условно патогенные для человека микромицеты.

В работе определено содержание экстрагируемой фракции поллютанта и его основных метаболитов в динамике, а также на протяжении всего периода наблюдений проведено изучение генотоксичности почвенных экстрактов.

Научная и практическая значимость работы. Полученные в работе данные предполагают их применение при диагностировании интенсивности 9 почвенного загрязнения 2,4,6-тринитротолуолом. Высокая чувствительность к загрязнению ТНТ гидролаз и микромицетов и зависимость частоты встречаемости последних от степени загрязнения может быть использована для оценки интенсивности загрязнения.

Установлено, что при отсутствии возобновления загрязнения ТНТ и содержания его в почве в количестве не более 100 мг/кг аборигенная микрофлора способна справиться с токсическим стрессом. При наличии в почве ТНТ в количестве, превышающем его растворимость, на первом этапе целесообразно проведение предварительной ремедиации с использованием инженерно-экологических методов.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кормильцева, Инна Петровна

выводы

1. Степень резистентности эколого-трофических групп микроорганизмов почвы к 2,4,6-тринитротолуолу убывает в ряду: актинобактерии > бактерии, образующие эндогенные споры > аммонификаторы > нитрификаторы > денитрификаторы > микромицеты. Коэффициент минерализации-увеличивается в диапазоне концентраций 50200 мг ТНТ/кг в 1,3-7,5 раза по сравнению с контролем. 2,4,6-тринитротолуол оказывает негативное влияние на биомассу бактерий почвы только в концентрации 200 мг/кг, снижая ее на 25-47%. В диапазоне концентраций 50- 200 мг/кг 2,4,6-тринитротолуол отрицательно влияет на развитие микромицетов, уменьшая их биомассу на 37-60%.

2. 2,4,6-тринитротолуол ингибирует отдельные этапы цикла азота, снижая интенсивность азотфиксации, разложения мочевины, и аммонификации белков, но не приводит к существенному снижению активности каталазы, дегидрогеназы и не снижает интенсивность дыхания.

4. Водные экстракты почвы, загрязненной 2,4,6-тринитротолуолом, обладали слабой способностью индуцировать SOS-ответ у тестерного штамма Escherichia coli РОЗ 7 только в концентрации ксенобиотика 200 мг/кг в момент его внесения. В тесте Эймса мутагенные эффекты водных экстрактов почвы, загрязненной 2,4,6-ТНТ (20-200 мг/кг), не обнаружены.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенных нами исследований экспериментального загрязнения чернозема выщелоченного 2,4,6-тринитротолуолом можно сделать вывод, что воздействие ТНТ на биологическую активность почвы не проявлялось в жестком и непреодолимом подавлении какой-либо группы микроорганизмов. К окончанию периода наблюдений (28-е сутки) большинство из исследованных показателей, составляющих биологическую активность загрязненной почвы, продемонстрировало способность к восстановлению. Исключение составляли параметры биологической активности опытного варианта, содержащего ТНТ в концентрации 200 мг/кг почвы. Этот опытный образец моделирует очаг загрязнения, поскольку растворимость ТНТ при 20°С равна 130 мг/л. Экстраполируя результаты наших исследований на загрязнение тринитротолуолом in situ можно сделать вывод, что при отсутствии возобновления загрязнения из-за растворения кристаллов тротила в очаге загрязнения, сообщество микроорганизмов почвы способно справиться с токсическим стрессом.

Полученные нами результаты экспериментального исследования, представленные выше, и данные литературы позволяют сделать некоторые прогнозы о возможных последствиях загрязнения ТНТ на биогенность почвы. Данные литературы [Boileau et al., 1987; Gorontzy et al, 1994] свидетельствуют о том, что в исследованных очагах загрязнения in situ концентрация ТНТ может достигать 10 г/кг почвы в виде кристаллов довольно крупного размера (свыше 3 мм) [Radtke et al., 2002]. Очевидно, что при растворении кристаллов, которое может затянуться на десятилетия, загрязнение будет постоянно возобновляться и не исключено, что благодаря переносу ТНТ почвенными водами ареал загрязнения будет расширяться. Вследствие этого возможен перманентный стресс микроорганизмов, что приведет к снижению уровня её биогенности.

На территориях, загрязняемых за счет переноса ТНТ почвенными водами, ТНТ может находиться в адсорбированной (недоступной) и доступной для микроорганизмов форме. Как показали наши исследования, в составе микробных эколого-трофических групп имеются микроорганизмы, способные эффективно противостоять токсическому действию ТНТ. Например, актинобактерии, численность которых почти не снижалась в присутствии ТНТ. Территории, подвергшиеся вторичному загрязнению, могут очищаться от ТНТ актинобактериями в течение времени, необходимого для растворения кристаллического ксенобиотика в первичном очаге загрязнения. В этом случае загрязнение может быть устранено, однако, не без негативных последствий. Увеличение доли актиномицетов в сообществе с течением времени может привести к обеднению почвы питательными веществами, вследствие чего также возможно снижение уровня биогенности почвы.

Таким образом, при наличии экстремального уровня загрязнения почвы тротилом с очагами кристаллического ТНТ очевидна необходимость ремедиации, основная направленность которой должна быть ориентирована на эти первичные очаги загрязнения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кормильцева, Инна Петровна, Казань

1. Бабаев, М.П. Оценка биологической активности почв субтропической зоны Азербайджана Текст. / М.П. Бабаев, Н.И. Оруджева // Почвоведение. 2009.- №.10. - С. 1248-1255.

2. Бадмаев, А.Б. Влияние осадков городских сточных вод на биологическую активность аллювиальной дерновой почвы Текст. / А.Б. Бадмаев, С.Г. Дорошкевич // Агрохимия. 2006. — №1. - С.62-66.

3. Барайщук, Г.В. Влияние экологически безопасных биологически активных препаратов на биологическую активность почвы при выращивании черенковых саженцев Текст. / Г.В. Барайщук, О.Ф. Хамова // Агрохимия. 2008.- №10. - С. 40-47.

4. Белых, Л.И. Распределение полициклических ароматических углеводородов в системе почва-растение Текст. / Л.И. Белых // Почвоведение. 2009. - №9. - С. 1083-1089.

5. Благовещенская, Г.Г. Микробные сообщества почв и их функционирование в условиях применения средств химизации Текст. /Г.Г. Благовещенская, Т.М. Духанина // Агрохимия. 2004. - №2. - С. 80-88.

6. Благодатская, E.B. Влияние свинца на дыхание и биомассу микроорганизмов серой лесной почвы в многолетнем полевом эксперименте Текст. / Е.В. Благодатская, Т.В. Пампура, Т.Н. Мякшина, Е.Д. Демьянова // Почвоведение. 2006. - №5. - С. 559-568.

7. Благодатская, Е.В. Оценка устойчивости микробных сообществ в процессе разложения поллютантов в почве Текст. / Е.В. Благодатская, Н.Д. Ананьева // Почвоведение. 1996. - №11. - С. 1341-1346.

8. Благодатский, С.А. Микробная биомасса и кинетика роста микроорганизмов в черноземах при различном сельскохозяйственном использовании Текст. / С.А. Благодатский, И.Н. Богомолова, Е.В Благодатская // Микробиология. -2008. Т.77, №1. - С.113-120.

9. Богородская, A.B. Состояние микробных комплексов почв лесных экосистем после пожаров и дефолиации древостоев непарным шелкопрядом Текст. / A.B. Богородская, Ю.Н. Баранчиков, Г.А. Иванова // Почвоведение. 2009. - №3. - С. 337-345.

10. Ваккеров-Коузова, Н.Д. Экологическая оценка влияния азобензола на бактериальное разнообразие дерново-подзолистой почвы Текст. / Н.Д. Ваккеров-Коузова // Почвоведение. 2005. - №11. - С. 1353-1356.

11. Возняковская, Ю.М. Биологические показатели как индикаторы состояния почвенного плодородия Текст. / Ю.М. Возняковская // Почвоведение. 1988. - №7. - С. 9-16.

12. И.Войнова-Райкова, Ж. Микроорганизмы и плодородие Текст. / Ж. Войнова-Райкова, В. Ранков, Г. Амкова // М., 1986. 120с.

13. Галиулин, Р.В. Дегидрогеназная активность почвы, загрязненной пестицидами Текст. / Р.В. Галиулин, P.A. Галиулина // Агрохимия. -2001. №9. - С. 85-89.

14. Галиулин, Р.В. Ферментативная индикация загрязнения почв тяжелыми металлами Текст. / Р.В. Галиулин, P.A. Галиулина // Агрохимия. 2006. - №11. - С. 84-95.

15. Галстян, А.Ш. Ферментативная активность почв Армении Текст. / А.Ш. Галстян // Ереван, 1974. №9. - 259с.

16. Гарусов, A.B. Газохроматографический метод анализа в биомониторинг почвы Текст. / A.B. Гарусов, Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова // Казань: Изд. КГУ, 1999. С.26-36.

17. Головченко, A.B. Влияние нефти на численность, биомассу и жизнеспособность грибов в верховых торфяниках Текст. / A.B. Головченко, JI.M. Полянская // Микробиология. 2001. - Т. 70, №1. — С. 111-117.

18. Гришко, В.Н. Сообщества актиномицетов рода Streptomyces в почвах, загрязненных тяжелыми металлами Текст. / В.Н. Гришко, О.В. Сыщикова // Почвоведение. 2009. - №2. - С.23 5-243.

19. Гродницкая, И.Д. Микробные сообщества и трансформация соединений углерода в болотных почвах таежной зоны (Томская область) Текст. / И.Д. Гродницкая, М.Ю. Трусова // Почвоведение. -2009. №9.-С. 1099-1107.

20. Гузев, B.C. Влияние минерального азота на конкурентные отношения микроорганизмов в почве Текст. / B.C. Гузев, Х.Ш. Намир, Г.И. Селецкий, Д.Г. Звягинцев // Вестн. Моск. ун-та. Сер 17, Почвоведение, 1985. №1. — С.40-46.

21. Даденко, Е.В. Изменение ферментативной активности при хранении почвенных образцов Текст. / Е.В. Даденко, К.Ш. Казеев, С.И. Колесников, В.Ф. Вальков // Почвоведение. 2009. - №12. — С. 14811486.

22. Денисова, Т.В. Изменение биологических свойств чернозема обыкновенного после воздействия гамма-излучения Текст. / Т.В. Денисова, К.Ш. Казеев, С.И. Колесников, В.Ф. Вальков // Почвоведение. 2007. - №9. - С. 1095-1103.

23. Добровольская, Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. — М.: ИКЦ «Академкнига», 2002. 282с.

24. Евдокимова, Г.А. Биологическая активность рекультивированных промышленных отвалов в условиях северной тайги Текст. / Г.А. Евдокимова, В.В Калмыкова // Агрохимия. — 2008. №1. — С. 63-67.

25. Звягинцев, Д.Г. Проблемы и методы биологической диагностики почв Текст. / Д.Г. Звягинцев // Москва: Наука, 1979. С. 175-188.

26. Звягинцев, Л.Г. Теоретические основы экологической оценки микробных ресурсов почв Текст. / Д.Г. Звягинцев, Т.Г. Добровольская, JIM. Полянская // Почвоведение. 1994. - №4. - С. 46-47

27. Звягинцев, Д.Г. Микробиологические и биохимические показатели загрязнения свинцом дерново-подзолистой почвы Текст. / Д.Г Звягинцев, A.B. Кураков, М.М. Умаров, 3. Филип // Почвоведение. -1997.-№9.-С. 1124-1131.

28. Зб.Зиганшин, A.M. Восстановление ароматического кольца 2,4,6-тринитротолуола как путь его деградации Текст.: автореф. дис. . канд. биол. наук / A.M. Зиганшин; Казанский гос. ун-т. Казань, 2007. -24с.

29. Ильинская, О.Н. Краткосрочные тест-системы для определения генотоксичности / О.Н. Ильинская, А.Б. Маргулис // Казань: Изд-во Казан, ун-та, 2005. — 31 с.

30. Путинская, Г.А. Устойчивость микробных сообществ почвы под озимой пшеницей при разных агротехнологиях ее выращивания Текст. / Г.А. Путинская, А.Д. Остапенко, Е.И. Андреюк // Микробиол. журн. -1990.-Т. 55, №2.-С. 3-5.

31. Карамова, Н.С. Мутагеннаяактивность 2,4,6 тринитротолуола: роль метаболизирующих ферментов Текст. / Н.С. Карамова, О.Н. Ильинская, О.Б. Иванченко // Генетика микроорганизмов. - 1994. -т.ЗО, №7. - С. 898-902.

32. Карамова, Н.С. 2,4,6-тринитротолуол и 2,4-диамино-6-нитротолуол: отсутствие геЫ-зависимого мутагенеза? / Н.С. Карамова, И.И. Мынина, Г.Г. Гараева, О.Б. Иванченко, О.Н. Ильинская Текст. // Генетика. 1995. - т. 31, №5. - с. 617-621.

33. Карягина, Л.А. Влияние различных систем удобрений на микробиологический режим дерново-подзолистой почвы Текст. / JI.A. Карягина, E.H. Воробьева // Почвоведение. — 1990. — №11. — С. 65-69.

34. Канцельсон, P.C. Исследование микрофлоры целинных и окультуренных почв Карельской АССР Текст. / P.C. Канцельсон, В .В. Ершов // Микробиология. 1957. - Т.26. - №4. - С. 468-476.

35. Каширская, H.H. Микробная биомасса подкурганных и современных почв степной зоны Нижнего Поволжья Текст. / H.H. Каширская^ Т.Э. Хомутова; Т.С. Демкина, В.А. Демкин // Почвоведение. 2009. - №5. -С.581-587.

36. Киреева, H.A. Биологическая активность загрязненных нефтью и рекультивируемых торфяно-глеевых почв республики Коми Текст. / H.A. Киреева, Г.Ф. Рафикова, Т.Н. Щемелинина, М.Ю. Маркарова // Агрохимия. 2008. - №8. - С.68-75.

37. Киреева, H.A. Биологическая активность нефтезагрязненных почв. Текст. / H.A. Киреева, В.В. Водопьянов, A.M. Мифтазова. // Уфа: Гилем, 2001. -376с.

38. Колесников, С.И. Влияние загрязнение нефтью и нефтепродуктами на биологическое состояние чернозема обыкновенного Текст. / С.И. Колесников, К.Ш. Казеев, M.JI. Татосян, В.Ф. Вальков // Почвоведение. -2006.-№5.-С. 616-620.

39. Колесников, С.И. Изменение эколого-биологических свойств чернозема обыкновенного при загрязнении тяжелыми металламивторого класса опасности Текст. / С.И Колесников, А.В. Евриенова, К.Ш. Казеев, В.Ф. Вальков // Почвоведение. 2009; - №.8. - С. 10071013.

40. Колешко, О.И. Биологическая активность торфяно-болотнош почвы, обогащенной минеральным? грунтом Текст. / О.И. Колешко, Н.Г1. Иванов, Н.В. Ронкина, А.С. Чубаков // Микробиол. журн. 1988; -Т.50, №1. - G. 11-14.

41. Конева, II.Д. Динамика численности и структуры бактериального комплекса почвы при внесении азобензола Текст. / Н.Д. Конева, Ю.В Круглов //Микробиология. -2001. Т.70, №4. - С. 552-557.

42. Кураков А.В. Методы выделения и характеристики комплексов микроскопических грибов наземных экосистем Текст. / А.В. Кураков; Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова. -Москва: МАКС Пресс, 2001. 92с. ISBN 5 - 317 - 00233 - 8.

43. Кураков, А.В. Сапрофитные микромицеты ризопланы томатов, огурцов дерново-подзолистой почвы и их способность подавлять фузариозную инфекцию корней Текст. /А.В. Кураков, Н.В. Костина // Почвоведение. 1998. - №2. - С. 193-199.

44. Куриненко, Б.М. Особенности токсического эффекта 2,4,6 -тринитротолуола в отношении Bacillus subtilis SKI Текст. / Б.М. Куриненко, Г.Ю. Яковлева, Н.А. Дениварова, Ю.В. Абреимова // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. - Т.39, №2. - С. 194-198.

45. Куриненко, Б.М. Чувствительность различных штаммов Escherichia coli к токсическому действию 2,4,6 — тринитротолуола Текст. / Б.М.

46. Куриненко, H.A. Дениварова, Г.Ю. Яковлева // Прикл. биохимия и микробиология. 2005. - Т.41, №1. - С. 53-57.

47. Кутузова, P.C. Микробиологическая характеристика дерновых почв центрально поймы Северной Двины Текст. / P.C. Кутузова, Н.И. Воробьев, М.В. Гамова, JI.A. Попова, Ю.В. Круглов // Почвоведение. -2009.-№2.-С. 244-254.

48. Левин, C.B. Действие тяжелых металлов на микробную систему серозема обыкновенного Текст. / C.B. Левин, B.C. Гузев // Вестн. Моск. ун-та, сер. Почвоведение. 1987. - №2. - С.48-53.

49. Литвин, В.Ю. Механизм устойчивого сохранения возбудителя чумы в окружающей среде (новые факты и гипотезы) Текст. / В.Ю. Литвин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - №4. - С. 26-31.

50. Маслова, И .Я. Воздействие содержащих серу аэротехногенных вещества на некоторые агрохимически значимые процессы и свойства почв Текст. / И.Я. Маслова // Агрохимия. 2008. №6. - С. 80-94.

51. Масютенко, Н.П. Влияние удобрений, типа севооборота, экспозиции склона и вида угодий на динамику содержания микробной биомассы в черноземе типичном Текст. / Н.П. Масютенко, О.В. Нагорная, О.В. Лукьянчикова // Агрохимия. 2009. - №5. - С.49-54.

52. Марфенина, O.E. Микроскопические грибы при антропогенном воздействии на почву Текст. / Мирчинк ТТЛ Почвоведение. — 1988. -№9.-С. 107-112.

53. Матаруева, И.А. Об оценке микробиологической активности дерново-подзолистых почв Текст. / И.А. Матаруева // Почвоведение. — 1998. -№1. С. 78-87.

54. Методы почвенной микробиологии и биохимии Текст. / Под ред. Звягинцева Д.Г. М.: Изд-во МГУ, 1991. 304с.

55. Минеев, В.Г. Практикум по агрохимии Текст. / В.Г. Минеев // Москва: Изд. МГУ. 1989. - 304с.

56. Миненко, А.К. Влияние дозанекса на биологическую активность почв Текст. / А.К. Миненко, JI.A. Пеньков // Агрохимия. 1981. - №8. - С. 105-109.

57. Наумов, A.B. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола лактобациллами с образованием токсичных гидроксиламинопроизводных Текст. / А.В.Наумов, Е.С.Суворова, A.M. Воронин, С.К. Зарипова, Р.П. Наумова // Микробиология. 1999. - Т.68, №1. - С. 65-71.

58. Наумова, Р.П. Бактериальная восстановительная трансформация ароматических нитросоединений Текст. / Р.П. Наумова, H.H. Амерханова, Т.О. Белоусова // Микробиология. 1982. - Т.51. - №5. - С. 735-739.

59. Наумова, Р.П. Микробный метаболизм неприродных соединений Текст. / Р.П. Наумова // Казань: Изд. КГУ, 1985. С. 196-226.

60. Наумова, Р.П. Превращение 2,4,6-тринитротолуола под действием микроорганизмов Текст. / Р.П. Наумова, Т.О. Белоусова, P.M. Гилязова // Прикладная биохимия и микробиология. 1982а. - Т.18, №1. - С. 85-90.

61. Пивень, П.Я. Влияние удобрений на урожайность овощных культур в севообороте и биологическую активность дерново-подзолистой почвы Текст. / П.Я. Пивень, М.И. Гришкевич, JI.A. Карягина, H.A. Махайловская, Г.В. Мороз // Агрохимия. 1987. - №2. - С. 49-53.

62. Полянская, JI.M. Содержание и структура микробной биомассы как показатель-экологического состояния почв Текст. / JI.M. Полянская, Д.Г. Звягинцев // Почвоведение. 2005. - № 6. - С. 706-714.

63. Пуртова, JI.H. Влияние гербицидов на процессы гумусообразования и микробиологическую активность лугово-бурых отбеленных почв приморья Текст. / JI.H. Пуртова, JI.H. Щапова, Н.М. Костенков, Г.В. Ковалева // Агрохимия. 2008. - №1. - С. 26-35.

64. Сальникова, H.A. Микробные сообщества аллювиальных почв Дельты Волги Текст. / H.A. Сальникова, JI.M. Полянская, З.Н. Тюгай,

65. A.JI. Сальников, М.А. Егоров // Почвоведение. 2009. - №1. — С. 64-70.

66. Саттон, Д. Определитель патогенных и условно патогенных грибов: справочное издание / Д. Саттон, А. Фотергилл, М. Ринальди. Пер. с англ. - М.: Мир, 2001. - 486с.

67. Селивановская, С.Ю. Микробиологические процессы в серой лесной почве при обработке компостом из осадка сточных вод Текст. / С.Ю. Селивановская, В.З. Латыпова, JI.A. Губаев // Почвоведение. 2006. -№4.-С. 495-501.

68. Симонов, В.Ю. Влияние фунгицидов различных химических групп на микробную популяцию и биохимическую активность почвы Текст. /

69. B.Ю. Симонов, Г.К. Андросов // Агрохимия. 2008. -№11.- С.72-75.

70. Соколенко, A.B. Морфология и ферментативная активность некультивируемых форм холерных вибрионов Текст. / A.B. Соколенко, B.C. Каграманов, JI.E. Асеева, О.С. Бурша, С.Р. Саямов // Микробиология. 2002. - №5. - С. 15-21.

71. Сорокин, Н.Д. Экспериментальная оценка устойчивости почвенного микробоценоза при химическом загрязнении Текст. / Н.Д. Сорокин, И.Д. Гродницкая, O.A. Шапченкова, С.Ю. Евграфова // Почвоведение. -2009. -№6. -С. 701-707.

72. Стахурлова, Л.Д. Биологическая активность как индикатор плодородия черноземов в различных биоценозах Текст. / Л.Д.

73. Стахурлова, И.Д. Свистова, Д.И. Щеглов // Почвоведение. — 2007. — №6. С.769-774.

74. Степанов, АЛ. Оценка интенсивности дыхания, азотфиксирующей и денитрифицирующей активности горно-луговых альпийских почв северо-западного Кавказа Текст. / А.Л. Степанов, В.Г. Онипченко // Почвоведение. 1989. - №2. - С. 55-56.

75. Степанов, АЛ. Характеристика биологической активности микробного комплекса городских почв Текст. / А.Л. Степанов, H.A. Манучарова, A.B. Смагин, A.C. Курбатова, А.Д. Мягкова, В.Н. Башкин // Почвоведение. 2005. - №8. - С. 978-983.

76. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии Текст. / Е.З. Теппер В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева; под ред. В.К. Шильниковой // Учебн. пособие для вузов. 5-е изд., перераб. и доп. — М.: Дрофа, 2004. - 256с.

77. Фрунзе, Н.И. Интенсивность выделения диоксида углерода из чернозема карбонатного при внесении удобрений Текст. / Н.И. Фрунзе // Агрохимия. 2007. - №2. - С. 43-48.

78. Хазиев, Ф.Х. Методы почвенной энзимологии Текст. / Ф.Х. Хазиев // Москва: Наука, 2005. 252с.

79. Хамова, О.Ф. Биологическая активность лугово-черноземной почвы при длительном применении удобрений в условиях орошения Текст. / О.Ф. Хамова, B.C. Бойко // Агрохимия. 1997. - №7. - С. 20-23.

80. Чимитдоржиева, И.Б. Влияние лантана на биологическую активность и экологическую устойчивость аммонифицирующих и нитрифицирующих микроорганизмов в вегетационных опытах Текст. /

81. И.Б. Чимитдоржиева, В.Ц. Цыдынов, Н.Е. Абашеева // Агрохимия. -2009. -№3.- С. 60-65.

82. Шатохина, С.Ф. Особенности функционирования основных азоттрансформирующих групп микроорганизмов в черноземе южном при различных системах удобрения Текст. / С.Ф. Шатохина, С.И. Христенко, Л.И. Лапта // Агрохимия. 2000. - №9. - С. 35-40.

83. Широких, И.Г. Комплекс микромицетов в ризосфере озимой ржи на дерново-подзолистой почве Текст. / И.Г. Широких, Е.К. Шишегова, О.В. Мерзаева // Микробиология. 2005. - №9. - С.51-55.

84. Щапова, Л.Н. Влияние удобрений и извести на микробиологическую активность почв Текст. / Л.Н. Щапова // Агрохимия. 2005. - №12. -С. 11-21.

85. Юркова, Н.Е. Оценка функционального состояния почв Московского зоопарка по микробиологическим показателям Текст. / Н. Е. Юркова, A.M. Юрков, A.B. Смагин // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 17. -Почвоведение. - 2008. - №3. - С. 39-43.

86. Яковлева, Г.Ю. Особенности токсического действия 2,4,6-тринитротолуола на штаммы Bacillus siibtilis SKI и Pseudomonas fluorescens B-3468 Текст.: дисс. . канд. биол. наук 03.00.07.

87. Защищена 24.04.03 / Г.Ю. Яковлева; Казанский гос. ун-т. Казань, 2003.-109л.

88. Яковлева, Е.В. Биоаккумуляция полициклических ароматических углеводородов в системе почва-растение Текст. / Е.В. Яковлева, В.А. Безносиков, Б.М. Кондратенок, Д.Н. Габов, М.И Василевич // Агрохимия. 2008. - №9. - С.66-74.

89. Якутин, М.В. Биомасса и активность микроорганизмов пойменных почв средней Оби Текст. / М.В. Якутии // Почвоведение. 1994. -№12.-С. 70-76.

90. Adrian, N.R. Stimulating the naerobic biodegradaton of explosives by the addition of hydrogen or electron donors that produce hydrogen Text. / N.R. Adrian, C.M. Arnett, R.F. Hickey // Water Research. 2003. - №37. -P. 3499-3507.

91. Anderson, J.P.E. A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils Text. / J.P.E. Anderson, K.N. Domsch // Soil Biol. Biochem, 1978. V.10. - №3 - P. 215-221.

92. Anshou, Z.A. Clinical study of trinitrotoluene cataract Text. / Z. Anshon // Polish Journ. Of Occupan. Medicine. 1990. - 3, № 1. - P. 171176.

93. Aronstein, B.N. Effect ofsurfactants at low concentrations on the desorption andbiodegradation of sorbed aromatic compound in soil.Environ Text. / B.N. Aronstein, Y.M. Calvillo, M. Alexander // Sei. Technol 1991. -№25.-P. 1728-1731.

94. Boileau, J. Explosives Text. / J. Boileau, C. Fauquigonon, Napoly // Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, VCH, Weinheim. 1987.-P. 145-172.

95. Boopathy, R. Bioremediation of explosives contaminated soil Text. / R. Boopathy // International Biodeterioration & Biodegradation.- 2000. № 46. —P. 29-36.

96. Boopathy, R. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by Desulfovibrio sp. (B* strain) Text. / R. Boopathy, C.F. Kulpa, M. Wilson // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. - 39, №2. - P. 270-275.

97. Boopathy, R. Biotransformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by co-metabolism with various co-substrates: a laboratory-scale study Text. / R. Boopathy, C. Kulpa, J. Manning, C. Montemagno // Bioresource Technology. 1994. -№47. - P. 205-208.

98. Boopathy, R. A laboratory study of the bioremediation of TNT-contaminated soil using aerobic/anoxic soil slurry reactor Text. / R. Boopathy, J.F. Manning, J. Kulpa // Water Environment Research. 1998. -№70.-P. 80-86.

99. Bruns-Nagel, D. Identification of oxidized TNT metabolites in soil samples of a former ammunition plant Text. / D. Bruns-Nagel, T.C. Schmidt, O. Drzyzga, E. von Low, K. Steinbach // Environ. Sei. Poll. Res. -1999.-№6(1).-P. 7-10.

100. Caron, G. Effect of dissolved organic carbon on the environmental distribution of non-polar organic compounds Text. / G. Caron, I. H. Suffet, T. Belton // Chemosphere. 1985. - №14. - P. 993-1000.

101. Clark, B. Evaluation of bioremediation methods for the treatment of soil contaminated with explosives in Louisiana Army Ammunition Plant, Minden, Louisiana Text. / B. Clark, R. Boopathy // J. of Hazardous Materials. 2007. - 143. - P. 643-648.

102. Dodard, S.G. Ecotoxicity characterization of dinitrotoluenes and some of their reduced metabolites Text. / S.D. Dodard, A.Y. Renoux, J. Hawari, G. Ampleman, S. Thiboutot, G.I. Sunahara // Chemosphere.- 1999. V.38. -№9.-P. 2071-2079.

103. Dubin, M. Effect of 5-nitroindole on adenylate energy charge, oxidative phosphorylation, and lipid peroxydation in rat hepatocytes Text. / M. Dubin, A. Biscard, P. Carrizo, A. Stoppani, S. Villami // Biochem. Pharmacjl 1994. - 48, №7. - P. 1483-1492.

104. Duque, E. Construction of a Pseudomonas hybrid strain that mineralizes 2,4,6-trinitrotoluene Text. / E. Duque, A. Haidour, F. Godoy, J.L. Ramos // J. Bacteriol. 1993. - 175, № g. - P.2278-2283.

105. Elovitz, M.S. Sediment-mediated reduction of 2,4,6-trinitrotoluene and fate of the resulting aromatic (poly)amines Text. / M.S. Elovitz, E.J. Weber // Environ.Sci. Technol. 1999. - № 33 (15).- P. 2617-2625.

106. Fernando, T. Biodegradation of TNT (2,4,6-trinitrotoluene) by Phanerochaete chrysosporium Text. / T. Fernando, J.A. Bumpus, S.D. Aust // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - 56, №6. - P. 1666-1671.

107. Frische, T. Ecotoxicological evaluation of in situ bioremediation of soils contaminated by the explosive 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) / T. Frische // Environmental Pollution. 2003. - № 121. - P. 103-113.

108. Fu Min Hong. Desorption and biodégradation of sorbed styrene in soil and aquifer solids Text. / Fu Min Hong, M. Hilary, A. Martin // Environ. Toxicol, and Chem. 1994. - 13, № 5. - P. 749-753.

109. George, I. Effect of 2,4,6-trinitrotoluene on soil bacterial communities Text. / I. George, Laurent Eyers, Benort Stenuit, Spiros N. Agathos // J Ind Microbiol Biotechnol. 2007. - № 12. - p. 1-12.

110. Gilbert; E.E. TNT Text. / E.E. Gilbert // Encyclopedia of Explosives and Related Items, US. 1980. - P. 235-T287.

111. Gong; P. Ecotoxicological effects of hexañydro-1,3¡,5-trinitro-1,3,5-triazine on soil microbial activitie Text. / P. Gong, J. Hawari, G.I. Sunahara // Environmental Toxicology, Chemistry. 2001. - V. 20, Issue 5. - p.947-951.

112. Gorontzy, T. Microbial degradation of explosives and related compounds Text. / T. Gorontzy, O. Drzyzga, M. Kahl, D. Bruns-Nagel, J. Breitung // Crit. Rev. Microbiol. 1994. - № 20. P. 265-284.

113. Hampton, M.L. Cost and design for application of composting and biosluny treatment of explosives-contaminated soils Text. / M:L. Hampton, W.E. Sisk // Emerging Technologies in Hazardous Waste Management IX. -1997.-p. 252-258.

114. Harvey, P. Veratril alkogol as a mediator and the role of radical cations in lignin biodegradation by Phanerochaeta chrysosporium Text. / P. Harvey, H. Schoemaker, J. Palmer // FEBS Lett. 1986. - V.195. - №2.1. P.242-248.

115. Hatzinger, P.B. Effect of aging of chemicals in soil on their biodegradability and extractability Text. / P.B. Hatzinger, M. Alexander // Environ.Sci.Technol. 1995. - №29. - P. 537-545.

116. Hecht, S. The possible role of nitroarenes in human cancer Text. / S. Hecht, K. El-Bayoumu // Plenum Press. 1990. - P. 309-316.

117. Honeycutt, M.E. Cytotoxicity and mutagenicity of 2,4,6-trinitrotoluene and its metabolites. Text. / M.E. Honeycutt, A.S. Jarvis, V.A. McFarland // Ecotoxicol. Environ. Saf. 1996. - №35 (3). - P.282-287.

118. Jiang, Q.G. The reductive activation of trinitrotoluene in the rat liver, brain kidney and testes Text. / Q.-G. Jiang, J. Cui // Journ. Health Toxicol. -1987.-V.l.-№1.-P. 37-39.

119. Jie, Li. Persistent ethanol drinking increases liver injury inducted by trinitrotoluene explosure: an in plant case-control study Text. / Li. Jie, J. Quan-Guan, Zh. Wei-Dong // Human and Experim. Toxicology. 1991. -V.10, №2. - P. 405-409.

120. Kilian, P.H. Exposure to armament wastes and leukemia: a case-control study within a cluster of AML and CML in Germany Text. / P.H. Kilian, S. Skrzypek, N. Becker, K. Havemann, // Leuk. Res. 2001. - №25 (10).-P. 839-845.

121. Klausmeier, R.E. The effect of trinitrotoluene on microorganisms Text. / R.E. Klausmeier, J.L. Osmon, D.R. Walls, Developments in Industrial Microbiology 1973. №15. - P. 309-317.

122. Lachance, B. Citotoxic and genotoxic effects of energetic compounds on bacterial and mammalian cells in vitro Text. / B. Lachance, P.Y. Robidoux, J. Hawari, G. Ampleman, S. Thiboutot, G.I. Sunahara // Mutat. Res. 1999. - V.444. - №1. - P. 25-39.

123. Lewis, T.A. Bioremediation of soils contaminated with explosives Text. / T.A. Lewis, D.A. Newcombe, R.L. Crawford // J. Environ. Manage. -2004.-№70.-P. 291-307.

124. Lewtas, J. Nitroarenes: their detection, mutagenicity and occurrence in the environment Text. / J. Lewtas, M. Nishioka //Plenum Press. 1990. -P. 61-72.

125. Martinetz, D. Handbuch der Rustungsaltlasten. Text. / D. Martinetz, G. Rippen // Ecomed, Landsberg. 1996.

126. Neal, R.A. Anaerobic biotransformation of explosives in aquifer slurries amended with ethanol and propylene glycol Text. / R.A. Neal, Clint M.A // Chemosphere. 2007. - V. 66. - P. 1849-1856.

127. Nipper, M. Development of marine toxicity data for ordnance compounds Text. / M. Nipper, R.S. Carr, J.M. Biedenbach, R.L. Hooten, K. Miller, S. Saepoff// Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2001. - V.41. - №3. -P. 308-318.

128. Nyanhongo, G.S. Incorporation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) transforming bacteria into explosive formulations Text. /G.S. Nyanhongo, N. Aichernig, M. Ortner, W. Steiner, G.M. Guebitz // Journal of Hazardous Materials. 2009. - № 165. - P. 285-290.

129. Pal, B. Database assessment of pollution control in the military explosives and propellants production industry Text. / B. Pal, M. Ryon // Res. and Develop. 1985. - №6202. - 158p.

130. Pennington, J.C. Adsorption and desorption of 2,4,6-trinitrotoluene by soils Text. / J.C. Pennington, W.H. Patrick // J. Environ. Qual. 1990. - № 19-P. 559-567.

131. Pennington, J.C. Fate of 2,4,6-trinitrotoluene in a simulated compost system Text. / J.C. Pennington, C.A.Hayes, K.F. Myers, M. Ochman, D. Gunnison, D.R. Felt, E.F. McCormick // Chemos 1995. - №30 (3) - P. 429-438.

132. Radtke, C.W. Effect of particulate explosives on estimation contamination at a historical explosives testing areas Text. / C.W. Radtke, D. Gianotto, F.F. Roberto // Chemosphere. 2002. - No 46. - P. 3-9.

133. Remberger, M. Biotransformations of chloroguaiaeols,chlorocatechols, and chloroveratroles in sediments Text. / M. Remberger, A. Allard, A.H. Nelson // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - № 51. - P. 552-558.

134. Robertson, B.K. Jjemba Enhanced bioavailability of sorbed 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by a bacterial consortium Text. / B.K. Robertson, K. Patrick // Chemosphere. 2005. - V.58. — P. 263-270.

135. Robidoux, P.Y. Acute toxicity of 2,4,6-trinitrotoluene in earthworm {Eisenia andrei) Text. / P.Y. Robidoux, J. Hawari, S. Thiboutot, G. Ampleman, G.I. Sunahara // Ecotoxicol. Environ. Saf. 1999. - V.44. - №3. -P. 311-321.

136. Ryon, M. Water quality criteria for 2,4,6-trinitrotoluene Text. / M. Ryon, M. Ross // Regulatory Toxicol, and Pharmacol. — 1990. — 11, № 1 — P. 104-113.

137. Sabbioni, G. Hemoglobin binding of nitroarenes and quantitative structural-activity relationships Text. / G. Sabbioni // Chem. Res. Toxicol. -1994. 7, № 2. - P. 267-274.

138. Sabbioni, G. Determination of hemoglobin adducts in workers exposed to 2,4, 6-trinitrotoluene Text. / G. Sabbioni, J. Wei, YY. Liu // J. Chromatogr. B. Biomed. Appl. 1996. - 682, № 2. - P. 243-248.

139. Sheremata, T.W. Fate of 2,4,6-trinitrotoluene and its metabolites in natural and model soil systems Text. / T.W. Sheremata, G.Ampleman, A. Halasz, J. Hawari, L. Paquet, S. Thiboutot // Environ. Sei. Technol 1999. -№33 (22). - P. 4002-4008.

140. Simini, M. Evaluation of soil toxicity at Joliet army ammunition plant Text. / M. Simini, R. Checkai, C. Phillips, R. Wenstel // Environm.toxicology and chemistry. 1995. - 14, № 4. - P. 623-630.

141. Smets, B.F. TNT biotransformation: when chemistry confronts mineralization Text. / B.F. Smets, H. Yin, A. Esteve-Nunez // Appl Microbiol Biotechnol. 2007. - №76. - P. 267-277.

142. Taylor, S. TNT particle size distributions from detonated 155-mm howitzer rounds Text. / S. Taylor, A. Hewitt, J. Lever, C. Hayes, L. Perovich, P. Thorne, C. Daghlian // Chemosphere. 2004. -№ 55. - P. 357367.

143. Tobias, F. Soil microbial parameters and luminescent bacteria assays as indicators for in situ bioremediation of TNT-contaminated soils Text. / F Tobias, H. Hoper // Chemosphere. 2003. - V. 50. P. 415^127.

144. Tokiwa, H. Mutagenicity and carcinogenicity of nitroarenes and their sources in the environment Text. / H. Tokiwa, Y. Ohnishi // Plenum Press. 1990.-P. 23-61.

145. Travis, E.R. Microbial and plant ecology of a long-term TNT-contaminated site Text. / E.R. Travis, N.C. Bruce, S.J. Rosser // Environmental Pollution. V. 153, № 1. - 2007. - P. 119-126.

146. Vigue, B.W. The Next Big Thing / B.W. Vigue, S.S. Koenigsberg // Pollution Engineering. №3. - 2002. - p.1-8.

147. Vila, S. Fate of RDX and TNT in agronomic plants M Text. / S. Vila, F. Lorber-Pascal // Laurent Environmental Pollution. 2007. - V.148 - P. 148-154.

148. Wang, C-J Interaction of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) and 4-amino-2,6-dinitrotoluene with humic monomers in the presence of oxidative enzymes Text. / C-J Wang, S. Thiele, J-M. Bollag // Arch Environ Contain Toxicol. 2002. - №42 P. 1-8.

149. Weber Roland, W.S. 2,4,6-Trinitrotoluene tolerance and biotransformation potential of microfungi isolated from TNT-contaminated soil Text. / W.S. Weber Roland, D.C. Ridderbusch, Heidrun Anke // Mycol. Res. 2002. - V. 106, № 3. - P. 336-344.

150. White, P.A. Mutagens in contaminated soil: a review Text. / P.A. White, L.D. Claxton // Mutation Research 567. 2004. - p. 227-345/

151. Widrig, D.L. Bioremediation of TNT-contaminated soil: a laboratory study Text. / D.L. Widrig, R. Boopathy, J.F. Manning // Environmental toxicology and Chemistry. 1997.-№16.-P. 1141-1148.

152. Wise, D.L. Bioremediation of Contaminated Soils Text. / D.L. Wise, D.J. Trantolo, E.J. Cichon, H.I. Inyang, U. Stottmeister, M. Dekker // New York, Basel, 2000. 257p.

153. Wietse, de Boer Interactions between saprotrophic basidiomycetes and bacteria Text. / Wietse de Boer, Annemieke van der Wal // British Mycological Society Symposia Series. Volume 28. - 2008. - P. 143-153.

154. Won, W.D. Toxicity and mutagenicity of 2,4,-6-trinitrotoluene and its microbial metabolites Text. / W.D. Won, L.H. DiSalvo, J. Ng // Appl. Environ. Micro-biol. 1976. - 31, № 4. - P. 576-580.

155. Zitting, A. Acute toxic effects of trinitrotoluene on rat brain, liver and kidney: role of radical production Text. / A. Zitting, G. Szumanska, J. Nickels, H. Savolainen // Arch. Toxicol. 1982. - V.51. - №1. - P. 53-64.

Информация о работе

Кормильцева, Инна Петровна
кандидата биологических наук
Казань, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Изменение биологической активности чернозема выщелоченного при внесении 2,4,6-тринитротолуола - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы