Биодеградация 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжей Yarrowia lipolytica в присутствии ферригидрита и в условиях полунепрерывного режима культивирования

Хиляс, Ирина Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биодеградация 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжей Yarrowia lipolytica в присутствии ферригидрита и в условиях полунепрерывного режима культивирования
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биодеградация 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжей Yarrowia lipolytica в присутствии ферригидрита и в условиях полунепрерывного режима культивирования"

005050371

На правах рукописи

гк

М I

ХИЛЯС ИРИНА ВАЛЕРЬЕВНА

БИОДЕГРАДАЦИЯ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА КЛЕТКАМИ

ДРОЖЖЕЙ УЛЛЯОИУА ¿/РОЬГГ/СА В ПРИСУТСТВИИ ФЕРРИГИДРИТА И В УСЛОВИЯХ ПОЛУНЕПРЕРЫВНОГО РЕЖИМА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2013

6 МАР 2013

005050371

Работа выполнена на кафедре микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского федерального университета

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук, доцент Зиганшин Айрат Мансурович

доктор биологических наук, профессор Чернов Владислав Моисеевич (ФГБУН "Казанский институт биохимии й биофизики КНЦ РАН", г.Казань)

кандидат биологических наук, доцент Зарипова Сания Кашафовна (ФГБОУ ВПО "Казанский национальный исследовательский технологический

университет г.Казань)

ФГБОУ ВПО "Пермский государственный национальный исследовательский университет", г.Пермь

Защита диссертации состоится «28» марта 2013 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском федеральном университете по адресу: 420008, г.Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при Казанском федеральном университете.

Автореферат разослан «22» февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук ^

3. И. Абрамова

Актуальность проблемы. В последнее время на состояние водных ресурсов оказывают значительное влияние не только разнообразные неблагоприятные природные явления, но и в большей мере промышленная деятельность человека, химизация сельского хозяйства, увеличение производства и применения химически синтезированных соединений, в частности нитроароматических ксенобиотиков. Масштабное использование данных соединений в технологических процессах ведет к увеличению количества отходов (Stenuit, Agathos, 2010; Singh et al., 2012).

Сброс нитроароматических соединений в реки, озера, пруды, лагуны значительно ухудшает их экологический статус, оказывая негативное влияние на живые организмы. Данные отходы могут обладать токсичностью и высокой кумулятивной способностью, а также мутагенным и канцерогенным эффектом (Frische et al., 2002; Lachance et al., 2004). Среди полинитроароматических соединений широкое распространение получил 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ), который в местах производства и применения взрывчатых веществ сохраняется длительное время. В связи с этим, для снижения влияния ТНТ на объекты природной среды и человека, необходимо создание эффективных технологий локальной очистки концентрированных ТНТ-содержащих сточных вод (Wang et al., 2010; Singh et al., 2012).

Биологическая очистка является одним из универсальных методов удаления химических соединений из сточных вод. В связи с тем, что микроорганизмы, в том числе дрожжи, обладают различными ферментативными системами деструкции устойчивых ксенобиотиков, разрабатываются научные основы для их применения в процессах очистки загрязненных объектов. В последние годы большое внимание уделяется разработке биотехнологических методов обезвреживания загрязненных объектов, что в сочетании с физико-химическими подходами сопровождается снижением экологической нагрузки (Stenuit et al., 2005).

Кроме этого, объекты, загрязненные нитроароматическими ксенобиотиками, включают в себя разнообразные компоненты в состав которых может входить железо. В окружающей среде железо в основном представлено железосодержащими минералами, которые обязательно будут вовлечены в реакции трансформации в местах, загрязненных нитроароматическими ксенобиотиками (Borch et al., 2005; Hofstetter et al., 2006; Eyers et al., 2008; Boparai et al., 2010). Однако недостаточно данных, показывающих микробную трансформацию ТНТ в присутствии Fe-содержащих минералов в аэробных условиях, хотя 02 может оказывать существенное влияние на процессы окисления железа (Morgan, Lahav, 2007).

деструкции. В процессе биоремедиации ТНТ-загрязненных природных и сточных вод основное значение имеет степень деградации ТНТ, а также применимость реализуемых технологических схем к экологизации соответствующих промышленных производств.

Цель данной работы — оценить возможность биодеградации 2,4,6-тринитротолуола штаммом дрожжей Yarrow ia lipolytica AN-L15 в присутствии ферригидрита и разработать эффективный способ очистки вод, загрязненных 2,4,6-тринитротолуолом.

Основные задачи исследования:

• изучить влияние железосодержащего минерала ферригидрита на глубину деструкции 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжей Yarrowia lipolytica-,

• охарактеризовать метаболиты биологической трансформации 2,4,6-тринитротолуола в присутствии и в отсутствие ферригидрита;

• выявить образование оксида азота (И) в ходе деструкции 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжей Yarrowia lipolytica и оценить возможность его взаимодействия с активными формами кислорода;

• оценить возможность пространственного разделения и стабилизации последовательных стадий трансформации 2,4,6-тринитротолуола по пути восстановления его ароматического кольца дрожжами Yarrowia lipolytica-,

• оптимизировать технологические параметры процесса многостадийного культивирования дрожжей и разработать эффективную схему очистки вод, за1рязненных 2,4,6-тринитротолуолом, дрожжами Yarrowia lipolytica.

Научная новизна. В настоящей работе показано, что присутствие железосодержащего минерала ферригидрита в среде роста ведет к незначительному снижению скорости трансформации ТНТ штаммом дрожжей Y. lipolytica AN-L15. Однако восстановление ароматического кольца ТНТ с одновременным образованием ТНТ-гидридных комплексов также протекает, как и в системах в отсутствие ферригидрита. Образование гидридных комплексов означает возможность отщепления нитрогрупп от молекулы ТНТ с последующей минерализацией исходного токсиканта. В противоположность исследованиям, в которых показано, что редукция нитрогрупп ТНТ ускорялась в присутствии экзогенного железа, в нашем случае увеличение потенциально токсичных метаболитов нитровосстановления не наблюдалось. Поэтому результаты данной работы означают, что трансформация ТНТ дрожжами через образование гидридных комплексов будет главным путем превращения исходного ксенобиотика даже в присутствии железосодержащих минералов, что будет способствовать минерализации ТНТ в объектах, содержащих повышенное количество Fe.

Методом ЭПР-спектроскопии удалось зафиксировать образование оксида азота (II) в ходе деструкции ТНТ клетками дрожжей Y. lipolytica AN-LIS. Кроме того, рост штамма в присутствии ТНТ сопровождался генерацией супероксидного радикала с возможным последующим формированием пероксинитрита и пероксиазотистой кислоты.

Для адекватного моделирования процесса биодеструкции ТНТ в условиях полунепрерывного культивирования возникла необходимость пространственного разделения и стабилизации последовательных стадий трансформации ТНТ по пути восстановления ароматического кольца. Пространственное разделение, коррелирующее со сдвигами pH среды и с визуализацией специфичных метаболитов, реализовано на базе установки, состоящей из трех биореакторов и соответствующего оборудования. Существенным отличием предлагаемого способа многостадийного культивирования штамма дрожжей Y. lipolytica AN-L15 в присутствии ТНТ является высокая эффективность биодеградации ТНТ и его метаболитов за короткий промежуток времени.

Практическая значимость. Штамм дрожжей Y. lipolytica AN-L15 осуществляет деструкцию ТНТ в присутствии железосодержащего минерала ферригидрита, а также в условиях полунепрерывного режима культивирования, наиболее приближенного к условиям очистки промышленных сточных вод. Устойчивость штамма Y. lipolytica AN-L15 к высоким концентрациям ТНТ (до 880 мкМ) делает его перспективным для биологической очистки промышленных отходов, природных и сточных вод, грунтов, загрязненных нитроароматическими ксенобиотиками.

Применение предлагаемого способа способствует повышению качества и упрощению процесса биоочистки природных и сточных вод, загрязненных токсичными нитроароматическими соединениями (на примере особо устойчивого к разрушению ТНТ), сокращению времени биоремедиации, расширению области применения биотехнологий для очистки экологически опасных объектов, предотвращению загрязнения окружающей среды.

Связь работы с научными программами. Исследования поддержаны ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы" ГК 16.515.11.5043. Авторские исследования получили персональную поддержку: грант Президента РФ для обучения зарубежом (2010-2011), фант "Алгарыш" Правительства РТ (2010), именная стипендия мэра г.Казань за отличную учебу и успехи в научно-исследовательской работе (2008-2009), программа «УМНИК» (Фонд содействия малых форм предприятий в научно-технической сфере, 2011-2012).

Положения, выносимые на защиту.

1. Ферригидрит замедляет процесс трансформации 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжей Yarrowia lipolytica, однако не препятствует разрушению исходного ксенобиотика, что означает возможность осуществления биотехнологического процесса в объектах окружающей среды, обогащенных железом.

2. Установлено, что трансформация 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжей Yarrowia lipolytica сопровождается генерацией NO и

супероксидного радикала с возможным последующим формированием пероксинитрита и пероксиазотистой кислоты. 3. Разработан эффективный многостадийный способ деструкции 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжей Yarrowia lipolytica, наиболее приближенный к условиям очистки промышленных сточных вод.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на международных научных конференциях «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (г.Пермь, 2007), «Ломоносов — 2007, 2009» (г.Москва, 2007, 2009), «История и достижения Казанской химической школы» (г.Казань, 2009), научно-практической конференции «Наука и инновации в решении актуальных проблем города» (г.Казань, 2009), всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2010» (г.Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ.

Благодарности. Автор выражает огромную благодарность заслуженному профессору кафедры микробиологии КФУ Наумовой Римме Павловне. Автор выражает благодарность своему научному руководителю доценту кафедры микробиологии КФУ Зиганшину Айрату Мансуровичу за ценные идеи, внимательное отношение к работе, плодотворное обсуждение полученных результатов. Благодарность выражается профессору Центра инженерии биопленок Университета штата Монтана (США) Герлаху Робину за приглашение автора на стажировку по грантам Президента РФ и «Алгарьпп» Правительства РТ, за предоставление экспериментального оборудования для выполнения части научно-исследовательской работы, за помощь в освоении приборов и методов, в интерпретации результатов. Благодарность выражается коллективу кафедры микробиологии КФУ за возможность получения бесценных навыков, инженеру кафедры радиоэлектроники Института физики Родионову A.A. за плодотворную работу в области ЭПР-спектроскопии, а также Имамутдинову Ф.Н. и Воробьеву Ю.Н.

Автор искренне признателен Министерствам Образования и Науки Российской Федерации и Республики Татарстан за предоставление возможности выполнить часть экспериментальной работы в США. Автор выражает искренюю благодарность семье за всестороннюю поддержку.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 26 рисунка. Цитируемая литература включает 163 источников, из них 159 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штамм дрожжей и условия культивирования. Эксперименты по динамике трансформации ТНТ проводили со штаммом дрожжей Y. lipolytica

AN-L15, выделенным из загрязненных нефтью торфяников (Лангепас, Западная Сибирь). Культуру дрожжей поддерживали в аэробных условиях на агаризованной среде Сабуро, содержащей (г/л дистиллированной воды): глюкозу - 10, пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl — 0.25, агар - 20. Для изучения трансформации ТНТ использовали синтетическую среду, содержащую: глюкозу - 28 мМ, (NH4)2S04 - 7.6 мМ, MgS04 - 2 мМ. Фосфатный буфер (рН от 5.5 до 7.0) стерилизовали отдельно и вносили перед инокуляцией в конечной концентрации 16 мМ. ТНТ вносили из расчета 440 мкМ в растворе этанола (0.8 мл этанола в 30 мл среды). В отсутствие ТНТ в состав синтетической среды также входил этанол в том же количестве.

Для исследования динамики трансформации ТНТ дрожжи Y. lipolytica AN-L15 предварительно культивировали в жидкой среде Сабуро с соответствующим рН, клетки осаждали центрифугированием при 8000xg в течение 10 мин и дважды отмывали K-Na-фосфатным буферным раствором (с соответствующим рН) с последующей инокуляцией синтетических сред с тем же рН в колбах Эрленмейра на 100 мл при объеме среды 30 мл. Клетки дрожжей Y. lipolytica AN-L15 культивировали в аэробных условиях во встряхиваемых колбах (150 об/мин) при +30°С.

Синтез феррпгидрпта и определение концентрации Fe. Ферригидрит (Fe203-H20) был синтезирован путем добавления 6 M раствора NaOH к 3.4% раствору FeCl3 до достижения нейтральных значений рН (Borch et al., 2005). Суспензию ферригидрита вносили в синтетическую среду с ТНТ и без ТНТ в конечной концентрации 358 мг/л (пересчитанной по Fe) с доведением рН среды до конечных значений 5.5 или 7.0, используя 0.5 M НС1. Концентрацию растворенного Fe2+ определяли после фильтрования образцов через 0.2 мкМ фильтры (Spartan 13/0.2 RC; Whatman). 100 мкл отфильтрованного образца добавляли к 400 мкл 0.5 M НС1, перемешивали в течение 10 сек и далее инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем 20 мкл данного раствора вносили в лунку 96-луночного планшета, содержащего 200 мкл раствора феррозина. Изменение интенсивности окраски детектировали при длине волны 562 нм на спектрофотометре Biotek Synergy HT reader (BioTek, Synergy HT).

Установка для биологической очистки среды от ТНТ. На рис. 1 представлена установка для полунепрерывного культивирования дрожжей, где: 1 - первый биореактор; 2 - второй биореактор; 3 - третий биореактор; 4

— резервуар, содержащий жидкую среду с ТНТ; 5, 6, 7 - пробоотборники; 8,9, 10 - воздухоотводы, оснащенные фильтрами; 11, 12, 13 — магнитные мешалки с подогревом; 14, 15, 16, 17 - система трубопроводов; 18, 19, 20, 21

— перистальтические насосы; 22, 23, 24 — система аэрации.

Установка состоит из однолитрового резервуара, содержащего жидкую очищаемую синтетическую среду с ТНТ (440 мкМ), и трех однолитровых стеклянных биореакторов, обернутых алюминиевой фольгой для уменьшения воздействия света. Резервуар и биореакторы последовательно соединены системой трубопроводов и оборудованы перистальтическими насосами

18 19 20 21

Рис. I. Установка для очистки ТНТ-загрязненной среды.

(Masterflex Cole-Parmer) для перекачивания очищаемой среды. Каждый из биореакторов содержал около 200 мл очищаемой среды. После инициации, процесс биотрансформации ТНТ переводили в полунепрерывные условия. Очищаемую жидкость перекачивали по 10 мл в каждый биореактор каждые 2 ч в течение 2 мин. Все биореакторы оснащены системой аэрации, обеспечивающей подачу стерильного воздуха, отводящими воздух каналами с 0.22 мкМ фильтрами, пробоотборниками. Перемешивание очищаемой среды осуществляли магнитными мешалками; процесс биоочистки проводили при температуре +30°С.

Спектрофотометрия в видимой области. Спектрофотометрические измерения проводили на сканирующем двухлучевом спектрофотометре Lambda 35 (Perkin Elmer, USA). Биомассу оценивали по изменению оптической плотности среды с клетками при длине волны 600 нм. Контролем служила лишенная клеток среда.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. ТНТ и продукты его трансформации анализировали высокоэффективной жидкостной хроматографией на хроматографе Series 200 (Perkin Elmer, USA) в обращеннофазовом варианте с использованием колонки Supelcosil octyl С-8 (150 х 4.6 мм; 5 мкМ) с детекцией при 254 и 476 нм (Borch et al., 2004).

Ионная хроматография. Нитрит- и нитрат-ионы определяли с помощью ионного хроматографа Dionex (USA), оснащенного предколонкой IonPac® AG9-HC (4 х 50 мм) и разделительной колонкой IonPac® AS9-HC (4 х 250 мм). Элюцию проводили 9 мМ раствором Na2C03 со скоростью 1 мл/мин. В качестве стандартов для построения калибровочных графиков использовали NaN02 и NaN03.

Электронная парамагнитная резонансная спектроскопия. Оксид азота (II) (NO) определяли в среде с дрожжевыми клетками после внесения КаДЭТК (натрия Ы,К-диэтилдитиокарбамат; 5.8 мМ) и FeS04 (2.6 мМ). Затем инкубировали смесь в течение 30 мин при 37°С. Далее смесь охлаждали и добавляли 0.2 мл свежеперегнанного и предварительно насыщенного водой этилацетата. Полученную смесь интенсивно встряхивали в течение 3 мин и осаждали центрифугированием при 6000xg в течение 8 мин. После этого

органическую фазу вносили в кварцевые трубки с внутренним диаметром 1 мм (Sigma-Aldrich) и регистрировали спектры ЭПР на спектрометре ESP-300 (Bruker, Германия) при комнатной температуре на частоте 9,68 ГГц, мощности СВЧ излучения 50 мВт, амплитуде высокочастотной модуляции 5 Г (Fujii, Berliner, 1999). Контролем служила среда с дрожжами без ТНТ.

Детекцию супероксидного радикала (02~), генерируемого при трансформации ТНТ, осуществляли с использованием гидрофобной свежеприготовленной спиновой ловушки 1-гидрокси-2,2,5,5-тетраметил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты, которую вносили в синтетическую среду с клетками дрожжей в конечной концентрации 1 мМ. Регистрацию спектров ЭПР проводили через 5 мин после внесения ловушки в образец при комнатной температуре на спектрометре ESP-300 (9.78 ГГц, 50 мВт, 1 Г). Среда без ТНТ и клеток была использована в качестве контроля. Супероксидцисмутазу использовали для подавления генерации Ог~ в образце. Ксантин-ксантиноксидазную реакцию использовали в качестве стандартной системы для генерации 02

Рентгеновская дифрактометрия (XRD). Кристаллическую структуру синтезированного минерала ферригидрита, а также изменение структуры ферригидрита в присутствии клеток дрожжей Y. lipolytica AN-L15 определяли с использованием рентгеновского дифрактометра Scintag XGEN 4000 с трубкой Си Ка (45 кВ и 40 мА). Образцы фильтровали через целлюлозно-ацетатный фильтр (0.45 мкм) с помощью вакуумного насоса в анаэробном боксе. После фильтрации мембранные фильтры с образцами высушивали в анаэробных условиях в течение 24 ч. Далее высушенные образцы растирали пестиком в керамической ступке до получения однородного порошка. Полученные образцы сканировали от 5° до 75° со скоростью 0.8°/мин (образцы без клеток дрожжей) и 0.2°/мин (образцы, содержащие клетки дрожжей).

Сканирующая электронная микроскопия. Для визуальной оценки адсорбции ферригидрита на поверхности клеток дрожжей образцы с суспензией клеток Y. lipolytica отбирали после 1ч, 10 ч и 24 ч эксперимента. Затем суспензию клеток дрожжей отмывали деионизированной водой, наносили на предметное стекло и высушивали в течение 15-20 мин. Далее образец фиксировали в смеси 2% параформальдегида и 2.5% глутаральдегида в 0.08 M PIPES буферном растворе (pH 6.8) в течение 12-15 ч при комнатной температуре. После фиксации предметные стекла промывали деионизированной водой 4 раза и дегидратацию клеток проводили поэтапно с использованием серии водно-спиртовых растворов (25%, 50%, 75%, 95% и 100%) (каждый этап 5 мин). После покрытия иридием образцы анализировали на сканирующем электронном микроскопе Zeiss Supra 55VP (Germany). Изображения высокого разрешения получали при ускоряющем напряжении 1 кВ и рабочем расстоянии 3-5 мм.

Химические реактивы. В работе использовали хроматографически чистые препараты ТНТ, 2,4-динитротолуола (2,4-ДНТ), гидроксиламино-

динитротолуолов (2-ГАДНТ и 4-ГАДНТ), амино-динитротолуолов (2-АДНТ и 4-АДНТ) (химические соединения фирмы "AccuStandard", New Haven, США). Все другие химические соединения были приобретены у компании Sigma-Aldrich.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы электронных таблиц. Результаты выражены в виде средних значений плюс-минус стандартное отклонение (п=3).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Трансформация ТНТ клетками дрожжей К lipolytîca в присутствии ферригидрита

Известно, что среда с низким значением рН является оптимальной для роста дрожжей Z lipolytica (Finogenova et al., 2005), поэтому влияние ферригидрита на трансформацию ТНТ клетками Y. lipolytica AN-L15 изначально оценивали в условиях начального рН 5.5. Так, независимо от присутствия ферригидрита фаза задержки роста Y. lipolytica AN-L15 наблюдалась в ТНТ-содержащей среде в сравнении со средой в отсутствие исходного ксенобиотика (рис. 2А и ЗА). Оптическая плотность культуры достигла значений 3.1 (Абоо) после 14 ч культивирования в среде, содержащей минерал и ТНТ (рис. 2А). В отсутствие ферригидрита к 14 ч культивирования оптическая плотность культуры достигла сходных значений (А6оо 2.9) в ТНТ-содержащей среде (рис. ЗА).

Ранее было показано, что Y. lipolytica продуцирует ряд органических кислот в процессе утилизации глюкозы и этанола (Finogenova et al., 2005; Ziganshin et al., 2010). В наших экспериментах, внесение ферригидрита в синтетическую среду сопровождалось задержкой снижения рН среды, что, вероятно, было связано с увеличением буферной емкости среды и/или подавлением синтеза органических кислот клетками дрожжей в присутствии ферригидрита. Однако, несмотря на это, значения рН среды как в присутствии минерала, так и в его отсутствие достигли одинаковых значений к 24 ч культивирования штамма (рис. 2А и ЗА).

Биотрансформация ТНТ в присутствии и в отсутствие ферригидрита дрожжами Y. lipolytica AN-L15 приводила к образованию гидридных комплексов Мейзенхеймера (1-Н~-ТНТ, изомеров 3-Н~-ТНТ и 3,5-2Н~-ТНТ-Н*) с последующей их трансформацией и глубокой деструкцией, а также формированию ГАДНТ и АДНТ. Однако присутствие ферригидрита замедляло скорость трансформации ТНТ (рис. 2 и 3). Метаболиты трансформации ТНТ были установлены методами ВЭЖХ и ионной хроматографии; времена удерживания метаболитов соответствовали таковьм химических стандартов.

Основной путь трансформации ТНТ в присутствии железосодержащего минерала протекал через редукцию его ароматического кольца и приводил к аккумуляции 3-FT-THT с последующим формированием его изомеров 3,5-2Н~ -ТНТН+ и2,4-ДНТ. Максимальная концентрация 3-FT-THT в присутствии

О 2 4 6 Ï 14 12 14 й 18 2D 2 24

0 2 4 в 8 10 12 14

■реям. ч

Рис. 2. Образование продуктов трансформации ТИТ в процессе роста дрожжей Y. lipolytica AN-L15 в присутствии ферригидрита. Символы: (А) рост и динамика рН в присутствии ТНТ; д, рост и а, динамика рН в отсутствие ТНТ. (Б) ТНТ; З-ЬГ-ТНТ (мкМ); Д, 1-Н~-ТНТ; а, сумма других гидридиых комплексов, выраженная как общая площадь их ВЭЖХ-пиков (при 476 нм); ж - сумма ТНТ, 3-1Г-ТНТ, ГАДНТ, АДНТ и 2,4-ДНТ. (В) 2-ГАДНТ; □, 4-ГАДНТ, а, 2-АДНТ; д, 4-АДНТ; х, 2,4-ДНТ, нитрит-ион, о, нитрат-ион (мкМ).

Рис. 3. Образование продуктов трансформации ТНТ в процессе роста дрожжей Y. lipolytica AN-L15 в отсутствие ферригидрита. Символы: (А) рост и, ■ динамика рН в присутствии ТНТ; д, рост и а, динамика рН в отсутствие ТНТ. (Б) ТНТ; □, 3-1Г-ТНТ (мкМ); д, 1-1Г-ТНТ; а, сумма других гидридных комплексов, выраженная как общая площадь их ВЭЖХ-пиков (при 476 нм); ж - сумма ТНТ, 3-Н"-ТНТ, ГАДНТ и 2,4-ДНТ. (В) ш, 2-ГАДНТ; о, 4-ГАДНТ, х, 2,4-ДНТ, нитрит-ион, о, нитрат-ион (мкМ).

минерала была обнаружена после б ч эксперимента и достигла 272 ± 21 мкМ, тогда как в отсутствие минерала количество 3-FT-THT достигло 285 ±18 мкМ на 4 ч культивироваши дрожжей (рис. 2БиЗБ). Образование другого С-1 моногидридного комплекса (1-РГ-ТНТ) также было установлено, но его концентрация в сравнении со всеми другими комплексами оставалась очень низкой (рис. 2Б и ЗБ). Кроме того, в среде с ферригидритом был обнаружен новый ТНТ-гидридный комплекс, однако, его концентрация оставалась очень низкой в сравнении с другими обнаруженными метаболитами.

вреич. ч

Рис. 4. Изменение концентрации Ре1* (мкМ) в ходе редукции ферригидрита. Символы: □, Рег+ в присутствии ТНТ и клеток, Д, Ре2+ в отсутствие ТНТ и в присутствии клеток; о, Ре2+ в присутствии ТНТ и в отсутствие клеток.

Продолжительное культивирование сопровождалось конверсией 3-Н~-ТНТ в 3,5-2НГ-ТНТ-Н+ и 2,4-ДНТ. Однако ингибирование накопления 2,4-ДНТ (13 мкМ) наблюдалось в Бе-содержащей среде по сравнению с экспериментами в отсутствие экзогенного железа, где концентрация 2,4-ДНТ достигала 79 мкМ (рис. 2В и ЗВ).

Формирование 2,4-ДНТ из 3-ЬГ-ТНТ и деструкция изомеров 3,5-21Г-ТНТН+ были ассоциированы с выделением Ы02" и его последующей конверсией в Ж)3~ при низких значениях рН среды. Так, на 8 ч роста дрожжей в присутствии ТНТ и минерала образовалось 65 мкМ Ж>2~. При снижении рН среды ниже 4.5 образовашийся Ы02~ подвергся окислению в Ж)3~(рис. 2В). Дальнейшее разрушение изомеров 3,5-2Н~-ТНТ-Н+ при низких значениях рН среды протекало одновременно с накоплением >Ю3~; его максимальная концентрация (156 мкМ) была зафиксирована на 24 ч эксперимента (рис. 2В). В отсутствие ферригидрита максимальные количества ИОг" (44 мкМ) и Ж)3~ (143 мкМ) бьши обнаружены после 3 ч и 14 ч роста дрожжей, соответственно (рис. ЗВ).

Трансформация ТНТ по пути восстановления нитрогрупп сопровождалась накоплением ГАДНТ. После 12 ч роста дрожжей (в присутствии ферригидрита) было обнаружено 40 мкМ 2-ГАДНТ и 99 мкМ 4-ГАДНТ; сходные результаты в экспериментах без минерала были получены на 8 ч культивирования (35 мкМ 2-ГАДНТ и 100 мкМ 4-ГАДНТ) (рис. 2В и ЗВ). В присутствии Ре-содержащего минерала также были обнаружены АДНТ в небольших количествах (рис. 2В).

На рис. 4 показано, что ферригидрит (в форме Ре3+), внесенный в ТНТ-содержащую среду в отсутствие клеток дрожжей, не подвергался восстановлению до Ре2+. Низкий уровень Ре2+ (0.1 мкМ после 24 ч эксперимента) был зафиксирован в присутствии клеток дрожжей в среде без ТНТ. Напротив, значительное количество Ре2+ накапливалось в процессе трансформации ТНТ клетками дрожжей К Иро1уйса. Максимальная концентрация Ре2+ в таких условиях достигала 3.1 мМ в течение 24 ч эксперимента (рис. 4). Одним из возможных механизмов образования Ре21"

является индукция ферментов в присутствии ТНТ, его метаболитов или других органических соединений. Альтернативный путь редукции Fe3+ -накопление в среде метаболитов глубокой деструкции ТНТ, способных восстанавливать Fe3+ абиотически.

Наши исследования показывают, что внесение ферригидрита в среду снижало темпы преобразования ТНТ штаммом Y. lipolytica AN-L15. Однако в отличие от многих исследований, в которых увеличивалось восстановление нитрогрупп ТНТ в присутствии железа (Hofstetter et al., 1999; Borch et al. 2005), в наших условиях увеличение потенциально токсичных продуктов нитровосстановления не происходило. Основной путь трансформации ТНТ протекал через редукцию ароматического кольца ТНТ, а образование неорганических метаболитов анионной природы являлось прямым доказательством разрушения исходного ксенобиотика.

Таким образом, результаты нашего исследования означают, что трансформация ТНТ дрожжами через формирование гидридных комплексов продолжает оставаться мажорным путем превращения исходного токсиканта даже в присутствии минералов железа. Это будет способствовать полному разрушению ТНТ в водах и почвах, обогащенных железом.

2. Образование оксида азота (II) в процессе деструкции ТНТ клетками Y. lipolytica

С использованием метода ЭПР-спектроскопии в данной работе впервые удалось установить образование NO в ходе трансформации ТНТ клетками Y. lipolytica AN-L15, что указывает на возможность конверсии выделившегося нитрит-иона не только в нитрат-ион, но и также в газообразные формы азота. Контрольные эксперименты при варьировании рН среды не приводили к генерации N0 (рис. 5).

Генерация NO в процессе трансформации ТНТ клетками дрожжей происходила в условиях снижения рН среды (в результате экскреции органических кислот дрожжами). Мы предполагаем, что выделение NO является процессом абиотическим и обусловлено реакцией диспропорционирования нитрит-иона с одновременным образованием NO и нитрат-иона при низких значениях рН среды (Cai et al., 2001). Таким образом, совокупность биотических и абиотических факторов приводила к образованию N02"\ N03~ и NO в качестве азотсодержащих продуктов биотрансформации ТНТ.

3. Рентгеноструктурный анализ ферригидрита

Ферригидрит (Fe203-H20) широко распространен в окружающей среде и существует в виде наночастиц размером 2-7 нм. Выделяют две модификации минерального ферригидрита — 2-линейчатый и 6-линейчатый ферригидрит, которые идентифицируются по числу рентгеновских пиков. Обе формы ферригидрита являются кристаллическими. Методом рентгеновской дифрактометрии можно определить кристаллическую структуру частиц и поведение минерала в определенных условиях

3300 S350 34« use 3300 3350 3*30 М50

Магнитное паче, Г Магнитно« поле. Г

Рис. 5. Спектры ЭПР комплекса Fen(NO)OT3TK)2, полученные в ходе экспериментов. А -синтетическая среда с клетками дрожжей У. lipolytica без ТНТ и ферригидрита (контроль); Б — после 5 ч трансформации ТНТ клетками К lipolytica в отсутствие ферригидрита (начальный рН S.5); В — синтетическая среда с клетками дрожжей Y. lipolytica без ТНТ и с ферригидритом (контроль); Г — после 8 ч трансформации ТНТ клетками К lipolytica в присутствии ферригидрита (начальный рН 5.5). Параметры: частота 9,68 ГГц, мощность СВЧ излучения 50 мВт, амплитуда высокочастотной модуляции 5 Г.

окружающей среды. По положению пиков дифрактограммы определяют кристаллические фазы, присутствующие в образце (Jambor, Dutrizac, 1998; Rhoton, Bigham, 2009).

Метод Ловли и Филлипса (Lovley, Phillips, 1987) позволяет синтезировать ферригидрит 2-линейчатой структуры с характерными двумя мажорными пиками (между 30°-40° и 55°-65°). В нашем случае рентгеновская дифрактометрия показала, что 2-линейчатый ферригидрит был основной фазой после его синтеза (рис. 6А). Дополнительный пик, детектируемый в диапазоне 10°-20° в образцах свежесинтезированного ферригидрита, означает изменение структуры некоторой части минерала на начальных этапах его синтеза (рис. 6А). Наличие данного пика может свидетельствовать как о частичном транзитном переходе 2-линейчатого в 6-линейчатый ферригидрит, так и о параллельном синтезе других оксигидроксидных минералов. Однако их концентрация в сравнении с синтезированным ферригидритом была незначительна.

Рентгеноструктурный анализ ферригидрита, проинкубированного в синтетической среде (рН 7.0) в отсутствие клеток дрожжей в течение 24 ч, позволил выявить образование дополнительных пиков на дифрактограмме (рис. 6Б). Образование данных пиков с одновременным поддержанием мажорной части ферригидрита в форме 2-линейчатой структуры, по-видимому, свидетельствует о дальнейшем транзитном переходе 2-линейчатого ферригидрита в 6-линейчатый ферригидрит и образовании других оксигидроксидов железа со временем (рис. 6Б). Кроме того,

образование дополнительных пиков может быть ассоциировано и с реакцией синтезированного ферригидрита с катионами и анионами, входящими с состав синтетической среды.

эоо -2» 2» I £150 | 100 '-. ВО 1 . ' 250 • Г ¡3150' 1«« 60

о 10 20 ЭО : 50 ' во : 7в в V 0 } Ю ЭП ЭО 40- ' 50 '60 ТО во »ТЬв* Л

2» 1 в 250 ....... г

■|2Я, I2™

ао б 0 10 . 20 30 40:. 50.. .60 ТО 50 0 » о • 10 20 : • ЭО ' 40 бО во ; • 7® й " »ТЫН««»

Рис. 6. Рентгеноструктурный анализ. (А) свежесинтезироваиный ферригидрит, (Б) ферригидрит, проинкубированный в синтетической среде (рН 7.0) в отсутствие клеток дрожжей У. Иро1уИса (24 ч), (В) ферригидрит, проинкубированный в присутствии клеток У. Иро!уИса (24 ч), (Г) ферригидрит, проинкубированный в присутствии клеток У Про1уЧса и ТНТ (24 ч).

Культивирование дрожжей У. Про1уПса в присутствии исходного минерала повлияло на состояние некоторой части внесенного ферригидрита (рис. 6В). Новые пики на дифрактограмме свидетельствуют о его частичном переходе в другие железосодержащие минералы. Это может быть связано, например, со снижением рН среды в результате продукции органических кислот дрожжами, что могло отражаться на структурных изменениях минерала. Дополнительные пики могли принадлежать гётиту, гематиту, маггемиту, а также магнезиоферриту. Визуально наблюдалось изменение окраски минерала с красно-коричневого цвета, характерного для ферригидрита, до преобладания оранжевых оттенков. Это является дополнительным подтверждением образования других железосодержащих минералов.

Появление дополнительных пиков на дифрактограмме после 24 ч инкубирования ферригидрита в среде роста в процессе трансформации ТНТ клетками дрожжей Г. Иро\уИса может быть связано с образованием других железосодержащих минералов (рис. 6Г). Это может быть объяснено, например, влиянием продуктов биотрансформации ТНТ на ферригидрит, а также его редукцией с образованием Ре(П).

4. Электронная микроскопия клеток дрожжей Y. lipolytica, проинкубированных в присутствии ферригидрита

По данным некоторых авторов (Coby, Picardal, 2005), инкубация бактериальных клеток Shewanella putrefaciens 200 в анаэробных условиях в присутствии различных оксигидроксидов железа, а также N02~ и N03" ведет к ингибированию редукции последних и к повышенному образованию оксида азота (I) (N20). Авторы предположили, что данный процесс - это результат взаимодействия некоторой части биогенного Fe(II) (полученного при восстановлении Fe(III)) с N02~ с последующим формированием микрооболочек оксигидроксида железа на поверхности клеток микроорганизмов.

s Fe2+ + i N02- +1Н20 Fe(OH)3{s) + (Coby, Picardal, 2005)

В связи с этим, для определения возможности образования микрооболочек железосодержащих минералов на поверхности строго аэробных дрожжевых клеток Y. Jipolytica, осуществляющих трансформацию ТНТ с образованием N02" и N03~, были проведены электронно-микроскопические исследования. Оказалось, что дрожжи овальной формы, расположенные отдельными или почкующимися клетками, в данных условиях не сорбировали на своей поверхности ферригидрит или двухвалентное железо, образованное в процессе редукции исходного минерала.

Кроме того, в наших экспериментах не было зафиксировано выделение N20 в процессе биотрансформации ТНТ, что было подтверждено методом газовой хроматографии.

5. Генерация супероксидного радикала в процессе трансформации ТНТ клетками Y. lipolytica

Процесс трансформации ТНТ клетками штамма Y. lipolytica AN-L15 протекал с образованием как метаболитов восстановления ароматического кольца, так и нитрогрупп. Первая стадия восстановления нитрогрупп ТНТ сопряжена с образованием ГАДНТ, которые обладают повышенной токсичностью и потенциальной мутагенностью по отношению к живым объектам (Berthe-Corti et al., 1998). Исследования продуктов нитровосстановления ТНТ на цитотоксичность показали, что 2-АДНТ, 4-АДНТ, 2,4-ДАНТ и 2,6-ДАНТ являются менее токсичными, чем исходный ксенобиотик (Lachance et al., 1999). В тесте Эймса на клетках Salmonella spp. ТНТ и продукты его нитровосстановления оказались потенциально мутагенными соединениями (Lachance et al., 1999).

В работе Науменко с соавторами (2008) были исследованы процессы генерации супероксидного радикала в ходе трансформации ТНТ бактериальным штаммом Bacillus cereus ZS18. В связи с токсичностью метаболитов нитроредукции ТНТ, нами была предпринята попытка

идентификации формирования супероксида в процессе биодеградации исходного поллютанта и дрожжевым штаммом Y. lipolytica AN-L15.

На рис. 7 показана динамика образования супероксида во внеклеточном пространстве в процессе биотрансформации ТНТ клетками дрожжей Y. lipolytica в отсутствие ферригидрита (исходная А6Со 0.3). Временная зависимость интенсивности сигнала ЭПР аддукта спиновой ловушки (1-гтздрокси-2,2,5,5-тетраметил-пирролидин-3,4-дикарбоновой

кислоты) с 02'~ коррелировала с формированием метаболитов. Так, начальный этап трансформации ТНТ, инициируемый после внесения клеток дрожжей в среду с ТНТ, сопровождался постепенной аккумуляцией 2-ГАДНТ, 4-ГАДНТ, а также 3-Н~-ТНТ и характеризовался низкой интенсивностью сигнала ЭПР. Наибольшая интенсивность сигнала аддукта спиновой ловушки с 02~ наблюдалась на 12-18 ч культивирования клеток Y. lipolytica с постепенным его снижением к 21 ч. На пик интенсивности генерации супероксида приходилось значительное накопление 2-ГАДНТ, 4-ГАДНТ, 3-Н~-ТНТ и N02~. Дальнейшее культивирование клеток сопровождалось аккумуляцией изомеров 3,5-2Н~-ТНТ-Н+ и их последующим разрушением, а также окислением нитрит-иона в нитрат-ион, что коррелировало со снижением интенсивности сигнала ЭПР (рис. 7).

YYr

» » и?

m лч х:

Рис. 7. (А-Е) Спектры ЭПР аддуктов спиновой ловушки с 02~, генерируемьм в процессе трансформации ТНТ дрожжами в отсутствие ферригидрита. Спектры записаны через (А) 30 мин, (Б) 3 ч, (В) 6 ч, (Г) 12 ч, (Д) 18 Ч, (Е) 21 ч от момента внесения клеток дрожжей в ТНТ-содержащую среду; (Ж) после внесения СОД на 6 ч; (3) эталонный спектр аддукта спиновой ловушки с 02~", полученным в ходе ксантин-ксантиноксидазной реакции (высокая интенсивность); после внесения СОД в реакционную смесь (низкая интенсивность).

Для подтверждения принадлежности линий спектров, полученных в ходе биотрансформации ТНТ, именно к аддукту спиновой ловушки с 02' была поставлена стандартная ксантин-ксантиноксидазная реакция, в которой генерируется супероксид (рис. 73). Внесение супероксиддисмутазы (СОД) как к стандартной реакционной смеси, так и к экспериментальным образцам приводило к ингибированию сигнала (рис. 7Ж и 3). СОД участвует в

реакциях дисмутации супероксида с образованием перекиси водорода и кислорода (Kelm et al., 1997).

Спектры аддукта спиновой ловушки и супероксид аниона указывают на генерацию 02~ во внеклеточной среде в ходе трансформации ТНТ. Предположительно, генерация 02'~ - это результат взаимодействия клеток дрожжей с токсичными соединениями, ТНТ и продуктами его трансформации, сопровождающийся ТНТ-опосредованным оксидативным стрессом. Известно также, что ТНТ может участвовать в образовании активных форм кислорода через образование нитроанионного радикала (Spain, 1995; Kumagai et al., 2004). Генерация супероксида в культуральной жидкости означает возможность участия 02~ в редукции ферригидрита с образованием Fe(II) (Fujii et al., 2006). Возможно также, что NO, образовавшийся в результате реакции диспропорционирования, взаимодействовал с 02~ с формированием более сильного окислителя -пероксинитрита (ONOO") (Vásquez-Vivar et al., 1997).

Схема возможных путей трансформации ТНТ и восстановления ферригидрита в присутствии дрожжевых клеток Yarrowia lipolytica AN-L15 представлена на рис. 8.

6. Многостадийный процесс трансформации ТНТ клетками К lipolytica

Для адекватного моделирования процесса биодеструкции ТНТ клетками Y. lipolytica в условиях полунепрерывного и непрерывного режимов культивирования возникла необходимость пространственного разделения и стабилизации последовательных стадий трансформации ТНТ по пути восстановления его ароматического кольца. Пространственное разделение, коррелирующее со сдвигами рН среды и с визуализацией специфичных метаболитов, реализовано на базе установки, схема которой представлена на рис. 1.

В процессе трансформации ТНТ дрожжевой культурой в условиях полунепрерывного режима культивирования часть среды с клетками удаляли из биореакторов, а освободившийся объем в первом ферментере заполняли свежей ТНТ-содержащей синтетической средой, тогда как в следующие два ферментера поступала очищаемая среда. Таким образом, функционировала сливно-доливная система.

6.1. Первый этап биотехнологического процесса: инициация полунепрерывного культивирования дрожжей в присутствии ТНТ

Деструкцию ТНТ штаммом дрожжей проводили в два этапа. На первом этапе все три биореактора наполняли на 1/5 (-200 мл) синтетической средой (рН 7.0), содержащей ТНТ в концентрации 440 мкМ. Затем включали магнитные мешалки (100-250 об/мин) и систему аэрации (10-50 мл/мин). Во все биореакторы через систему трубопроводов вносили суточную культуру дрожжей Y. lipolytica AN-L15 и культивировали в течение 11-12 ч.

тнт

У. lipotytica Y 4 е" + 2е~

ГАДНТ+ДЦНТ

Fe3*

' 2е~ + 2е'\ ТНТ 3-Н--7НТ

2.4-ДНТ + N02"

3,5-2Н"-ТНТН+ -- ГЮ2-

Глюкоза_®

Этанол

продукты деградации

Fe1* Fe3*

TNT

окислительный

NO and NQ3"

ONOO' + H+

-ONOOH

N03" + H+

Fe2*

Fe3+

Рис.8. Схема возможных путей трансформации ТНТ и восстановления ферригидрига в присутствии дрожжевых клеток Yarrowia lipolytica AN-L15.

Внесение клеток до конечной А6оо 0.3 в первый биореактор вело к убыли ТНТ и накоплению главного метаболита красного цвета - 3-Н~-ТНТ. Максимальное количество образовавшегося 3-НГ-ТНТ было зафиксировано на уровне 266-285 мкМ из 376-382 мкМ трансформированного ТНТ через 1112 ч эксперимента. В первом биореакторе происходило также частичное превращение 3-1Г-ТНТ в ряд других ТНТ-гидридных комплексов, однако, в данном случае их концентрация оставалась незначительной (в диапазоне 2535 absorbance units и была выражена через сумму площадей их ВЭЖХ-пиков). В первом биореакторе на начальном этапе также происходило образование небольшого количества нитрит-иона, концентрация которого варьировала в диапазоне 12-18 мкМ. Из метаболитов нигроредукции ТНТ были обнаружены 2-ГАДНТ и 4-ГАДНТ, концентрация которых достигала 15-20 и 37-45 мкМ, соответственно. При этом рН очищаемой среды поддерживался в диапазоне от 7.0 до 6.5.

Одновременно с началом работы биореактора первой ступени, во второй биореактор, также изначально содержащий среду с ТНТ, вносили

дрожжевую культуру до конечной А6[ю 1.2. В данных условиях максимальное образование 3-Н"-ТНТ (266-285 мкМ) происходило через 6-7 ч культивирования. Следующие 5 ч эксперимента связаны с превращением образовавшегося 3-Н~-ТНТ в желто-оранжевые дигидридные комплексы.

В данных условиях концентрация 3-Н~-ТНТ варьировала в диапазоне 32-45 мкМ, а максимальное количество других гидридных комплексов составило 270-342 absorbance units (выражено через сумму площадей их ВЭЖХ-пиков). Из других продуктов трансформации ТНТ обнаружены 2,4-ДНТ, Ж>2", N03 , ГАДНТ и 4-АДНТ. Во втором биореакторе происходило снижение рН очищаемой среды до уровня 5.6-5.2 вследствие интенсивной продукции дрожжами органических кислот, в частности лимонной, янтарной и пировиноградной кислот. При достижении необходимых условий трансформацию ТНТ клетками Y. lipolytica в биореакторе 2 переводили в полунепрерывный режим.

Одновременно с началом работы двух первых биореакторов в третий биореактор, содержащий среду с ТНТ, вносили дрожжи до конечной А600 2.5. Присутствие повышенной биомассы в третьем биореакторе ускоряло биологический процесс, что сопровождалось быстрой и эффективной трансформацией ТНТ в 3-НГ-ТНТ (максимальное количество на 3-4 ч) и далее З-ЬГ-ТНТ в другие гидридные комплексы Мезенхеймера (максимальное количество на 8-9 ч). Дальнейшая трансформация ТНТ-гидридных комплексов в биореакторе сопровождалась осветлением очищаемой среды и накоплением нитрат-иона (130-153 мкМ), являющегося мажорным азотсодержащем неорганическим продуктом деструкции токсичного ТНТ. В третьем биореакторе происходило снижение рН среды до 3.3 вследствие интенсивного синтеза и экскреции дрожжами органических кислот.

На этом завершали выполнение первого этапа процесса.

6.2. Второй этап биотехнологического процесса: полунепрерывный режим культивирования дрожжей в присутствии ТНТ

На втором этапе биодеструкцию ТНТ проводили в условиях полунепрерывного культивирования дрожжей (после 11-12 ч). Перистальтические насосы позволяли перекачивать ТНТ-загрязненную очищаемую среду из резервуара в последовательно соединенные между собой биореакгоры. Обновление среды в биореакторах проходило за 40 ч, что позволяло эффективнее осуществлять деградацию ТНТ. Пространственное разделение гидридных комплексов Мейзенхеймера вело к большей эффективности деградации ТНТ и уменьшению образования продуктов альтернативного пути - ГАДНТ.

Скорость протока очищаемой среды через биореакторы устанавливали, сохраняя стабильность биологических процессов и обеспечивая пространственное разделение ТНТ-гидридных комплексов в трех биореакторах. Процесс контролировали путем отбора проб через пробоотборники и их последующего анализа и корректировали путем

изменения скорости поступления среды и интенсивности перемешивания (50-250 об/мин). В случае отклонения от допустимого диапазона рН, в среду вносили небольшое количество 10% раствора ИаОН или Н2504, поддерживая оптимальные значения рН в реакторах.

В первом биореакторе формирование мажорного продукта трансформации ТНТ - 3-ЬГ-ТНТ - проходило при слабом росте клеток У. Иро1уПса и слабом снижении рН среды (7.0-6.5). Одновременно с образованием ЗН~-ТНТ было зафиксировано незначительное накопление суммы других гидридных комплексов. Кроме того, параллельно образовывались и интермедиаты нитроредукции исходного ксенобиотика -ГАДНТ. Однако восстановление ароматического кольца ТНТ клетками дрожжей превалировало над редукцией нитрогрупп ТНТ. Так, концентрация 2-ГАДНТ и 4-ГАДНТ в первом реакторе варьировала в диапазоне 15-22 мкМ и 36-44 мкМ, соответственно, в сравнении с 270-288 мкМ 3-Н~-ТНТ в течение 60 ч культивирования дрожжей в условиях полунепрерывного режима. Для этой стадии многостадийного процесса было характерно накопление низкой концентрации нитрит-иона (в пределах 12-20 мкМ). Остаточная концентрация ТНТ в первом биореакторе составила 55-60 мкМ.

Благодаря поддержанию слабокислого и нейтрального значения рН среды в первом реакторе подобраны оптимальные условия для максимального формирования 3-ЬГ-ТНТ, соединения, поддающегося биоминерализации.

Ранее нами было показано, что 3-1Г-ТНТ подвергался спонтанному разложению с обратным образованием ТНТ при низких значениях рН среды. Поэтому, для предотвращения его конверсии обратно в ТНТ при постоянном снижении рН среды в результате жизнедеятельности дрожжей (экскреции органических кислот), была необходима вторая стадия, позволяющая полностью трансформировать 3-ЬГ-ТНТ в остальные более стабильные ТНТ-гидридные комплексы. Для этого во втором реакторе поддерживали необходимое значение рН среды (в диапазоне 5.6-5.2), стимулирующее образование других гидридных комплексов. В случае изменения рН среды от указанного диапазона, необходимый рН поддерживали внесением небольшого количества 10% раствора ЫаОН или Н2804. В случае снижения рН среды ниже указанных значений, 3-Н"-ТНТ частично превращался обратно в ТНТ с последующим образованием исключительно продуктов нитроредукции (ГАДНТ), что уменьшало эффективность биотехнологической схемы деструкции исходного токсиканта.

Третья стадия трансформации ТНТ необходима для полной деструкции всех гидридных комплексов Мейзенхеймера, окисления образовавшегося нитрит-иона в нитрат-ион, а также ковалентного связывания некоторой части ГАДНТ с макромолекулами клеток Г. \ipolynca, что в последующем ведет к снижению токсичности. Оптимальный рН среды в третьем биореакторе составил 3.8-3.3, что способствовало полной деградации дигидридных производных с накоплением нитрат-иона (142-175 мкМ).

Разработанный многостадийный процесс трансформации и деструкции 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжевого штамма Yarrowia lipolytica AN-L15 способен решать проблемы обезвреживания стоков промышленных предприятий, загрязненных токсичными и устойчивыми к минерализации полишпроароматическими ксенобиотиками. Данный способ наиболее приближен к условиям постадийной очистки сточных вод и может быть применен в природоохранной деятельности.

На сегодняшний день данные по непрерывным процессам культивирования микроорганизмов в присутствии ТНТ остаются весьма ограниченными. Из литературных источников известен способ очистки среды от ТНТ иммобилизованными клетками гриба Phanerochaete chrysosporium BKM-F-1767 в биореакторе для непрерывного культивирования (Rho et al., 2001). Однако культура P. chrysosporium нуждалась в продолжительном периоде адаптации к исходному токсиканту и средний уровень минерализации ТНТ (при его исходной концентрации 50 мг/л) известным грибом достигал всего лишь 15,3% после 41 суток культивирования.

В другой работе (Торе et al., 1999) исследована трансформация ТНТ свободными и иммобилизованными клетками Arthrobacter sp. 8929. Авторы показали, что процесс трансформации ТНТ (60 мг/л) протекал в течение 2436 ч с образованием устойчивых аминопроизводных ТНТ без их последующего разрушения. Поэтому для деградации образовавшихся метаболитов необходим подбор других микроорганизмов.

Известен способ удаления ТНТ из биореакторов путем непрерывного культивирования микробных сообществ в жидкой ТНТ-содержащей среде в аэробных, микроаэрофильных и анаэробных условиях (Gunnison et al., 1997). Однако в процессе непрерывного культивирования микробных сообществ в очищаемой среде образовывались ГАДНТ, АДНТ, ДАНТ и азоксинитротолуолы, которые не подвергались биологическому разрушению и накапливались в окружающей среде.

Таким образом, не один из известных способов не ведет к глубокой деструкции исходного ксенобиотика, тогда как в представленной работе процесс биодеградации ТНТ штаммом Y. lipolytica AN-L15 осуществлялся с высокой степенью эффективности. Поэтому исследованный штамм может быть использован для очистки природных и сточных вод, загрязненных соединениями нитроароматической природы.

ВЫВОДЫ

1. Ферригидрит замедлял процесс трансформации 2,4,6-тринитротолуола дрожжами Yarrowia lipolytica, однако, не препятствовал разрушению исходного ксенобиотика.

2. Методом ВЭЖХ идентифицированы продукты восстановления бензольного кольца 2,4,6-тринитротолуола - моно- и дигидридные комплексы Мейзенхеймера, метаболиты нитроредукции -гидроксиламино-динитротолуолы и амино-динитротолуолы, а также 2,422

динитротолуол. Методом ионной хроматографии обнаружены нитрит-ион и нитрат-ион.

3. Методом ЭПР-спектроскопии удалось зафиксировать образование оксида азота (И) в ходе деструкции 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжей Yarrowia lipolytica. Кроме этого, рост клеток Yarrowia lipolytica в присутствии 2,4,6-тринитротолуола сопровождался генерацией супероксидного радикала с возможным последующим формированием пероксинитрита и пероксиазотистой кислоты.

4. Удалось пространственно разделить и стабилизировать последовательные стадии трансформации 2,4,6-тринитротолуола по пути редукции его ароматического кольца дрожжами Yarrowia lipolytica.

5. Пространственное разделение моногидридных и дигидридных комплексов Мейзенхеймера позволило разработать эффективный способ обезвреживания вод, загрязненных 2,4,6-тринитротолуолом, клетками дрожжей Yarrowia lipolytica.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Хиляс И.В. Биодеградация 2,4,6-тринитротолуола гемиаскомицетными дрожжами в условиях непрерывного режима культивирования / И.В. Хиляс, Л.Ф. Сафиуллина, А.А.Родионов, А.М. Зиганшин // Ученые записки Казанского университета. Естественные науки. - 2010. - Т. 152, № 4. - С. 179-189 (Список ВАК - авт. 0.35 п.л.).

2. Khilyas I.V. Effect of ferrihydrite on 2,4,6-trinitrotoluene biodégradation by an aérobic yeast / I.V. Khilyas, A.M. Ziganshin, A.J. Pannier, R. Gerlach // Biodégradation. - 2012. - DOI 10.1007/sl0532-012-9611-4. - P. 1-14 (Список ВАК - авт. 0.5 п.л.).

3. Патент РФ №2437930. Биосенсор для определения 2,4,6-тринитротолуола. Авторы: Хиляс И.В., А.М. Зиганшин, Р.П. Наумова. Заявка №2010132746. Дата заявки 04.08.2010. Положительное решение от

20.07.2011.

4. Патент РФ №2451066. Штамм дрожжей Geotrichum sp., осуществляющий биологическую деградацию 2,4,6-тринитротолуола. Авторы: Зиганшин А.М., И.В. Хиляс, О.Н. Ильинская. Заявка № 2010132747. Дата заявки 04.08.2010. Положительное решение от 09.11.2011.

5. Патент РФ №2453508. Способ биологической очистки воды от 2,4,6-тринитротолуола. Авторы: Хиляс И.В., А.М. Зиганшин. Заявка №2010132748. Дата заявки 04.08.2010. Положительное решение от

03.02.2012.

6. Хиляс И.В. Гидридное восстановление 2,4,6-тринитротолуола несовершенными грибами родов Candida и Geotrichum / И.В. Хиляс, Е.А. Науменко, А.П. Ложкин, А.М. Зиганшин, Р.П. Наумова // Биология -Наука XXI века. 11-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых. Пущино: 2007. — С. 51.

7. Хиляс И.В. Микроорганизмы - деструкторы химических загрязнений в условиях смешанного загрязнения осадков и почв / И.В. Хиляс,

Е.А. Науменко // Ломоносов - 2007. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых. Москва: 2007. - С. 123.

8. Хиляс И.В. Редукция ароматического кольца 2,4,6-тринитротолуола -как путь, ведущий к его разрушению / И.В. Хиляс, A.M. Зиганшин, Е.А. Науменко, Р.П. Наумова // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии. Региональная конференция с международным участием. Екатеринбург - Пермь: 2007. - С. 29-30.

9. Хиляс И.В. Образование восьми различных гидридных комплексов Мейзенхеймера при трансформации 2,4,6-тринитротолуола низшими эукариотами / И.В. Хиляс, A.M. Зиганшин, Р.П. Наумова // Международный экологический форум. Вестник Российской военно-медицинской академии. Санкт-Петербург: 2008.-С. 167.

10. SafiuIIina L.F. Transformation of 2,4,6-trinitrotoluene through the aromatic ring reduction / L.F. SafiuIIina, A.M. Ziganshin, A.P. Lozhkin, I.V. Khilyas, R.P. Naumova // First Interuniversity Conference on Modern Biology «Bionews». - Kazan: 2008. - P. 36.

11. Хиляс И.В. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола низшими эукариотами в условиях непрерывного культивирования / И.В. Хиляс, Л.Ф. Сафиуллина, A.M. Зиганшин // Ломоносов - 2009. XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых. Москва: 2009 - С 174-175.

12. Хиляс И.В. Способ биодеградации ТНТ-загрязненных сточных вод и создание установки для его осуществления / И.В. Хиляс, A.M. Зиганшин^ Р.П. Наумова // Наука и инновации в решении актуальных проблем города. Конференция студентов и аспирантов. Казань: 2009. - С. 26-27.

13. Хиляс И.В. Микробный биосенсор для экспресс-детекции токсичных нитроароматических соединений / И.В. Хиляс, Л.Ф. Сафиуллина, А.М. Зиганшин, Р.П. Наумова II Становление и достижения биохимической школы Казанского Университета. Научно-практическая конференция биохимиков, посвященная памяти проф. В. Г. Винтера (1939-2005) Казань-2009.-С. 118.

14. Хиляс И.В. Оценка токсичности в процессе деструкции 2,4,6-тринитротолуола дрожжами в условиях непрерывного режима культивирования / И.В. Хиляс, Л.Ф. Сафиуллина, A.M. Зиганшин, Р.П. Наумова // III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз-Россия 2010". - Нижний Новгород, 2010. - С. 80-81.

15. Хиляс И.В. Биодеградация 2,4,6-тринитротолуола клетками Yarrowia lipolytica в присутствии ферригидрита / И.В. Хиляс, А.Р. Багманова, Р. Герлах, A.M. Зиганшин // Высокие технологии, экономика, промышленность. - 2012. - Т. 1. - С. 252.

E-mail автора: irina.khilyas@gmail.com 24

Подписано в печать 22.02.2013. Форм. бум. 60x84 1/16. Печ. л. 1,5. Тираж 100. Заказ № 2002/1. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хиляс, Ирина Валерьевна, Казань

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи УДК 579.222

ХИЛЯС ИРИНА ВАЛЕРЬЕВНА

БИОДЕГРАДАЦИЯ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА КЛЕТКАМИ

ДРОЖЖЕЙ УЛКИОЦ'М ЫРОЫПСА В ПРИСУТСТВИИ ФЕРРИГИДРИТА И В УСЛОВИЯХ ПОЛУНЕПРЕРЫВНОГО РЕЖИМА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

03.02.03 - микробиология

ю 00 00

^ СО Диссертация

т** о на соискание ученой степени

СМ кандидата биологических наук

О Я

СМ ю

V см

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент А.М. Зиганшин

Казань-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ 2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1. Нитроароматические соединения, их промышленный синтез и распространение в окружающей среде 12

2. Пути микробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола 15

3. Железосодержащие минералы и их участие в трансформации нитроароматических соединений 18

4. Активные формы кислорода и азота. Участие активных форм кислорода в реакциях трансформации нитроароматических ксенобиотиков и минералов железа 24

5. Технологии, применяемые при ремедиации объектов, загрязненных ароматическими соединениями и тяжелыми металлами 30

6. Процессы биологической трансформации различных ксенобиотиков в биореакторах полунепрерывного и непрерывного функционирования 33

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 40

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 40

1. Штамм дрожжей и условия культивирования 40

2. Синтез ферригидрита и определение концентрации Бе 41

3. Абиотические эксперименты 41

4. Установка для биологической очистки среды от ТНТ 42

5. Спектрофотометрия в видимой области 43

6. Высокоэффективная жидкостная хроматография 43

7. Ионная хроматография 44

8. Газовая хроматография 44

9. Электронная парамагнитная резонансная спектроскопия 45

10. Рентгеновская дифрактометрия (ХЯБ) 45

11. Сканирующая электронная микроскопия 46

12. Химические реактивы 47

13. Статистическая обработка результатов 47 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 48

1. Трансформация ТНТ клетками дрожжей У Иро1уИса в присутствии ферригидрита 48

1.1. Аэробная трансформация ТНТ при начальном рН среды 5.5 48

1.2. Аэробная трансформация ТНТ при начальном рН среды 7.0 54

2. Образование оксида азота (II) в процессе деструкции ТНТ клетками У Иро\уйса 60

3. Рентгеноструктурный анализ ферригидрита 61

4. Электронная микроскопия клеток У Иро1уйса, проинкубированных в присутствии ферригидрита 67

5. Влияние химически синтезированных ГАДНТ, АДНТ и ТНТ-гидридных комплексов на процесс восстановления ферригидрита 68

6. Влияние культуральной жидкости У Иро1уйса, лишенной дрожжевого компонента, на процесс восстановления ферригидрита 71

7. Генерация супероксидного радикала в процессе трансформации ТНТ клетками У \ipolytica 74

8. Многостадийный процесс трансформации ТНТ клетками У Про1уИса 76

8.1. Первая стадия биотехнологического процесса: инициация полунепрерывного культивирования дрожжей в присутствии ТНТ 77

8.2. Вторая стадия биотехнологического процесса: полунепрерывный режим культивирования дрожжей в присутствии ТНТ 79

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 85

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 97

ВЫВОДЫ 100

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 101

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1-ЕГ-ТНТ С-1 моногидридный комплекс Мейзенхеймера 2,4-ДАНТ 2,4-диамино-6-нитротолуол

2.4-ДНТ 2,4-динитротолуол 2,6-ДНТ 2,6-динитротолуол 2,6-ДАНТ 2,6-диамино-4-нитротолуол

2-АДНТ 2-амино-4,6-динитротолуол

2-ГАДНТ 2-гидроксиламино-4,6-динитротолуол

3.5-2Н~-ТНТ С-3, С-5 дигидридный комплекс Мейзенхеймера 3,5-2Н~-ТНТН+ протонированные изомеры С-3, С-5 дигидридного

комплекса Мейзенхеймера

3-Н~-ТНТ С-3 моногидридный комплекс Мейзенхеймера

4-АДНТ 4-амино-2,6-динитротолуол 4-ГАДНТ 4-гидроксиламино-2,6-динитротолуол АФК активные формы кислорода

АХДС антрахинон-2,6-дисульфонат

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ОВП окислительно-восстановительный потенциал

ТАТ 2,4,6-триаминотолуол

ТНТ 2,4,6-тринитротолуол

ТНФ 2,4,6-тринитрофенол, пикриновая кислота

ЭПР электронный парамагнитный резонанс

ХШЗ рентгеновская дифрактометрия

СОД супероксиддисмутаза

ДЭТК ]Ч,1Ч-диэтилдитиокарбамат

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последнее время на состояние водных ресурсов значительное влияние оказывают не только разнообразные неблагоприятные природные явления, но и в большей мере промышленная деятельность человека, химизация сельского хозяйства, увеличение производства и применения химически синтезированных соединений, в частности нитроароматических ксенобиотиков. Масштабное использование данных соединений в технологических процессах ведет к увеличению количества отходов (Bellinaso et al., 2002; Stenuit et al., 2005; Stenuit, Agathos, 2010; Singh et al., 2012).

Сброс нитроароматических соединений в реки, озера, пруды, лагуны значительно ухудшает их экологический статус, оказывая негативное влияние на живые организмы. Данные отходы могут обладать высокой токсичностью и кумулятивной способностью, а также мутагенным и канцерогенным эффектом (Frische, 2002; Lachance et al., 2004). Среди нитроароматических соединений широкое распространение получил 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ), который в местах производства и применения взрывчатых веществ сохраняется длительное время. В связи с этим, для снижения влияния ТНТ на объекты природной среды и человека, необходимо создание эффективных технологий локальной очистки концентрированных ТНТ-содержащих сточных вод (Stenuit et al., 2005; Stenuit, Agathos, 2010; Wang et al., 2010; Singh et al., 2012).

объектов, что в сочетании с физико-химическими подходами сопровождается снижением экологической нагрузки. Пути трансформации и деструкции токсикантов зависят от активности ферментативных систем микроорганизмов-деструкторов (Lenke et al., 2000; Rieger et al., 2002).

Известны механизмы биотрансформации THT по пути восстановления нитрогрупп и по пути восстановления ароматического кольца. Большинство протестированных микроорганизмов осуществляют нитроредукцию ТНТ с образованием гидроксиламино- и аминопроизводных в качестве мажорных метаболитов, известных также высокой устойчивостью к последующему разрушению (Hawari et al., 1999; Tope et al., 1999; Зарипов с соавт., 2004; Sarlauskas et al., 2004). Использование данных микроорганизмов не позволяет проводить обезвреживание ТНТ-загрязненных объектов. Трансформация ТНТ по пути восстановления его ароматического кольца сопровождается образованием серии гидридных комплексов Мейзенхеймера, подвергающихся дальнейшей глубокой деструкции с отщеплением нитрогрупп (French et al., 1998; Рак et al., 2000; van Dillewijn et al., 2008b; Wittich et al., 2009). В ранних работах сотрудников кафедры микробиологии КФУ впервые было показано, что гемиаскомицетные дрожжи Yarrowia lipolytica AN-L15 способны к образованию и последующей деградации ТНТ-гидридных комплексов в условиях периодического культивирования с образованием нитритов и нитратов в качестве минеральных форм азота (Ziganshin et al., 2007; Ziganshin et al., 2010).

Последовательное двухэлектронное восстановление нитрогрупп

молекулы ТНТ с формированием и накоплением моногидроксиламино-

динитротолуолов (ГАДНТ) и моноамино-динитротолуолов (АДНТ)

катализируют нитроредуктазы (Haigler et al., 1994; Alvarez et al., 1995; Oh et

al., 2001). Ферменты данного семейства восстанавливают широкий круг

нитроароматических соединений, в частности нитротолуолы, нитрофенолы,

нитробензолы (Caballero et al., 2005). Известно, что нитроредуктазы даже при

наличии избыточных редуцирующих эквивалентов предпочтительно

восстанавливают нитрогруппы ТНТ с образованием ГАДНТ (Riefler, Smets, 2002; Watrous et al., 2003; Caballero et al., 2005; Kutty, Bennet, 2005). Восстановление ароматического кольца ТНТ с образованием моно- и дигидридных комплексов Мейзенхеймера с одновременной редукцией нитрогрупп исходного ксенобиотика катализируют гидрид-трансферазы семейства флавопротеинов (French et al., 1998; Рак et al., 2000; van Dillewijn et al, 2008b).

Особое место в процессах трансформации ТНТ принадлежит некоторым грибам, что обусловлено секрецией различных внеклеточных ферментов, например лигнинпероксидазы, марганец-зависимой пероксидазы, оксидаз и редуктаз, которые могут быть вовлечены в частичную минерализацию исходного ксенобиотика и его метаболитов (Stahl, Aust, 1993; Michels, Gottschalk, 1994; Scheibner et al, 1997; Eilers et al, 1999; Hawari et al, 1999). Кроме биоремедиации с участием бактерий и грибов, фиторемедиация ТНТ-загрязненных объектов с использованием немодифицированных растений (Adamia et al, 2006; Nepovim et al, 2005) и трансгенных растений (Hannink et al, 2003; van Dillewijn et al, 2008a; Rylott et al, 2011) интенсивно исследуется.

Кроме этого, объекты, загрязненные нитроароматическими

ксенобиотиками, включают в себя разнообразные компоненты, в состав

которых может входить железо. В окружающей среде железо

преимущественно представлено железосодержащими минералами, которые,

несомненно, будут вовлечены в реакции трансформации в местах,

загрязненных нитроароматическими ксенобиотиками (Agrawal, Tratnyek,

1996; Oh et al, 2002; Borch et al, 2005; Hofstetter et al, 2006; Eyers et al, 2008;

Boparai et al, 2010). В некоторых работах были показаны абиотические и

биологические преобразования нитроароматических соединений в

присутствии железа. В более ранней работе показано влияние Fe° на

удаление ТНТ из загрязненной почвы и воды (Hundal et al, 1997). Деградация

ТНТ была достигнута в присутствии Fe° и Н2О2, в то время как обработка Fe°

в сочетании с биологической трансформацией стимулировали накопление аминопроизводных ТНТ. Абиотическое/биологическое восстановление ТНТ в присутствии Fe2+ также было показано (Hofstetter et al., 1999); данный процесс сопровождался накоплением продуктов восстановления нитрогрупп. Borch с соавторами (Borch et al., 2005) показали, что присутствие железосодержащего минерала ферригидрита в культуральной среде стимулировало образование АДНТ в процессе трансформации ТНТ ферментирующим штаммом Cellulomonas sp. strain ES6. Eyers с сотрудниками (Eyers et al., 2008) установили, что штамм Pseudomonas aeruginosa ESA-5 в строго анаэробных условиях восстанавливал нитрогруппы ТНТ в аминогруппы и частично разрушал исходное соединение с аккумуляцией нитритов в среде, содержащей ферригидрит. Однако недостаточно данных, показывающих микробную трансформацию ТНТ в присутствии Fe-содержащих минералов в аэробных условиях, хотя молекулярный кислород может оказывать существенное влияние на процессы окисления железа (Morgan, Lahav, 2007).

Известен ряд работ, посвященный биологической очистке ТНТ-загрязненных вод и в условиях полунепрерывного и непрерывного режимов культивирования (Rho et al., 2001; Pavlostathis, Jackson, 2002; Wang et al., 2010). Однако в данных работах имеется комплекс недостатков, в частности необходимость предварительной адаптации микроорганизмов к высоким концентрациям исходного ксенобиотика, а также отсутствие его глубокой деструкции. В процессе биоремедиации ТНТ-загрязненных природных и сточных вод основное значение имеет степень деградации ТНТ, а также применимость реализуемых технологических схем к экологизации соответствующих промышленных производств.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы состояла в следующем: оценить возможность биодеградации 2,4,6-тринитротолуола штаммом дрожжей Yarrowia lipolytica AN-L15 в присутствии ферригидрита и

разработать эффективный способ очистки вод, загрязненных 2,4,6-тринитротолуолом. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние железосодержащего минерала ферригидрита на глубину деструкции 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжей Уаггом?1а Иро1уйса\

2. Охарактеризовать метаболиты биологической трансформации 2,4,6-тринитротолуола в присутствии и в отсутствие ферригидрита;

3. Выявить образование оксида азота (II) в ходе деструкции 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжей Уаггом?1а Иро1уйса и оценить возможность его взаимодействия с активными формами кислорода;

4. Оценить возможность пространственного разделения и стабилизации последовательных стадий трансформации 2,4,6-тринитротолуола по пути восстановления его ароматического кольца дрожжами Уаггота Иро1уйса\

5. Оптимизировать технологические параметры процесса многостадийного культивирования дрожжей и разработать эффективный способ очистки вод, загрязненных 2,4,6-тринитротолуолом, клетками дрожжей Уаггоч?1а Иро1уйса.

Научная новизна. В настоящей работе показано, что присутствие

железосодержащего минерала ферригидрита в среде роста ведет к

незначительному снижению скорости трансформации ТНТ штаммом

дрожжей У. Иро1уйса А1Ч-Ы5. Однако восстановление ароматического

кольца ТНТ с одновременным образованием ТНТ-гидридных комплексов

также протекает, как и в системах в отсутствие ферригидрита. Образование

гидридных комплексов означает возможность отщепления нитрогрупп от

молекулы ТНТ с последующей минерализацией исходного токсиканта. В

противоположность исследованиям, в которых показано, что редукция

нитрогрупп ТНТ ускорялась в присутствии экзогенного железа, в нашем

случае увеличение потенциально токсичных метаболитов нитровосстановления не наблюдалось. Поэтому результаты данной работы означают, что трансформация ТНТ дрожжами через образование гидридных комплексов будет главным путем превращения исходного ксенобиотика даже в присутствии железосодержащих минералов, что будет способствовать минерализации ТНТ в объектах, содержащих повышенное количество железа.

Методом ЭПР-спектроскопии удалось зафиксировать образование оксида азота (II) в ходе деструкции ТНТ клетками дрожжей Y lipolytica AN-L15. Кроме этого, рост клеток Y lipolytica AN-L15 в присутствии ТНТ сопровождался генерацией супероксидного радикала с возможным последующим формированием более токсичных пероксинитрита и пероксиазотистой кислоты.

Для адекватного моделирования процесса биодеструкции ТНТ в условиях полунепрерывного культивирования возникла необходимость пространственного разделения и стабилизации последовательных стадий трансформации ТНТ по пути восстановления ароматического кольца. Пространственное разделение, коррелирующее со сдвигами рН среды и с визуализацией специфичных метаболитов, реализовано на базе установки, состоящей из трех биореакторов и соответствующего оборудования. Существенным отличием предлагаемого способа многостадийного культивирования штамма дрожжей Y. lipolytica AN-L15 в присутствии ТНТ является высокая эффективность биодеградации ТНТ и его метаболитов за короткий промежуток времени.

AN-L15 к высоким концентрациям ТНТ (до 880 мкМ) делает его перспективным для биологической очистки промышленных отходов, природных и сточных вод, грунтов, загрязненных нитроароматическими ксенобиотиками.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Нитроароматические соединения, их промышленный синтез и распространение в окружающей среде

Производство и использование различных высокоустойчивых токсичных и потенциально мутагенных синтетических соединений приводит к загрязнению воздуха, почв, поверхностных и грунтовых вод. Среди ксенобиотиков опасность для окружающей среды представляют полинитроароматические соединения, которые являются устойчивыми к разрушению и не включаются в биогеохимические циклы (Ез1еуе-]Чипе2 е1 а1., 2001; 81епик а1., 2005).

Большинство нитроароматических соединений нашло практическое применение при производстве взрывчатых веществ, пестицидов, фармакологических препаратов, а также в качестве исходного сырья для получения полиуретановой пены, различных полимеров, текстильных красителей (Кос^еге, Випсе, 2001; Stenuit еХ а1., 2005; ЯоМап е! а1., 2008). Среди взрывчатых нитроароматических соединений в XX веке широкое распространение получили 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ), 2,4,6-тринитрофенол (ТНФ), 1,3,5-тринитробензол (ТНБ), гексанитробензол (рис. 1). Сброс сточных вод предприятими, производящими взрывчатые вещества, в водоемы, а также интенсивное применение данных соединений приводит к распространению загрязнений путем их попадания в почву, осадки, поверхн�

Информация о работе

Хиляс, Ирина Валерьевна
кандидата биологических наук
Казань, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Биодеградация 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжей Yarrowia lipolytica в присутствии ферригидрита и в условиях полунепрерывного режима культивирования - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы