Биосинтез лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica из глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива

Фатыхова, Алина Ринатовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биосинтез лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica из глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica из глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива"

На правах рукописи

ФАТЫХОВА АЛИНА РИНАТОВНА

БИОСИНТЕЗ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ДРОЖЖАМИ УЛЛЛ01У/А ЫРОЬУПСА ИЗ ГЛИЦЕРИН-СОДЕРЖАЩИХ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА БИОДИЗЕЛЬНОГО ТОПЛИВА

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2011

4851686

Работа выполнена в лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Научный руководитель:

доктор биологических наук Моргунов Игорь Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Козловский Анатолий Григорьевич

доктор биологических наук Рукавцова Елена Борисовна

Ведущая организация:

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Защита диссертации состоится «/^» ЬСШЦД^ 2011 г. в 9 час. ¿0 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, проспект Науки, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Автореферат размещен на сайте: http://www.ibpm.ru

Автореферат разослан «■/2011г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук

В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последние десятилетия в связи с удорожанием нефтепродуктов и ухудшением экологической обстановки резко возрос интерес к использованию альтернативных источников топлива, получаемых из растительного сырья, таких как биодизельное топливо. В Евросоюзе к 2030 г. планируется доведение доли биотоплива в общем объеме моторного топлива до 25% (Himmel et al., 2007).

Сырьем для производства биодизельного топлива могут быть различные растительные масла и животные жиры. В ходе процесса триглицериды масел гидролизуются до глицерина и жирных кислот, затем жирные кислоты метилируются, в результате чего образуются их метиловые эфиры, которые и используются в качестве биодизельного топлива. Побочными продуктами производства являются технический глицерин в виде 70-80%-ного водного раствора, остатки масла и свободных жирных кислот. Проблема утилизации глицерин-содержащих отходов становится ключевой в процессе производства биодизельного топлива: на каждую тонну произведенного биодизельного топлива накапливается 100 кг технического глицерина (Дебабов, 2008). В настоящее время ведутся интенсивные поиски возможностей переработки технического глицерина в продукты с высокой стоимостью. Разрабатываются процессы микробиологического получения 1,3-пропандиола, белка и липидов, аминокислот и органических кислот.

Наибольший интерес представляет лимонная кислота (ЛК). Ежегодно в мире производится 1 млн. 400 тыс. тонн JIK с годовым приростом производства 3-5% от существующего уровня (Soccol et al., 2006). Наряду с традиционным использованием JIK в пищевой, химической и фармацевтической промышленности рассматриваются новые направления ее применения, расширяется использование ее натриевой соли в составе синтетических моющих средств в качестве заменителя полифосфатов, опасных для экологии.

Традиционная технология производства JIK из мелассы при помощи мицелиальных грибов Aspergillus niger имеет ограниченную сырьевую базу, является многостадийным и экологически небезопасным процессом. В последние годы в ИБФМ РАН разработаны процессы получения JIK с использованием дрожжей Yarrowia lipolytica из этилового спирта, глюкозы и растительных масел. Возможность использования глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива в качестве источника углерода для роста дрожжей и биосинтеза JIK на момент начала работы не была изучена.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение закономерностей биосинтеза ЛК из глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива у дрожжей Г. Иро1уйса, способов управления их биосинтетической активностью и разработка на этой основе эффективных методов получения ЛК.

В число основных задач входило:

1. Изучение способности дрожжей различной таксономической принадлежности к ассимиляции глицерин-содержащих отходов и синтезу ЛК; отбор продуцентов ЛК;

2. Определение условий культивирования штаммов-продуцентов, оптимальных для получения Ж;

3. Исследование основных физиологических и биохимических закономерностей образования лимонных кислот, а также путей и механизмов их биосинтеза;

4. Изучение особенностей роста дрожжей и синтеза ЛК в периодическом режиме и в условиях отьемно-доливного и непрерывного культивирования (с использованием мембранного модуля).

5. Выбор способа культивирования, обеспечивающего наиболее продолжительный, интенсивный и стабильный синтез Ж из глицерин-содержащих отходов.

Научная новизна работы

Впервые установлена принципиальная возможность направленного синтеза Ж дрожжами в среде с глицерин-содержащими отходами производства биодизельного топлива. Среди изученных организмов штаммы К Про1уИса ВКМ ¥-2373 (704), Г. Иро1уПса N 15 и У. Иро1уИса А-101-1.22 отобраны в качестве наиболее активных продуцентов. Подобраны условия культивирования (рН среды, концентрация растворенного кислорода, концентрация глицерина), обеспечивающие интенсивный синтез ЛК.

Показано, что продукция Ж у ацетат-негативного мутанта К Иро!уИса N 15 происходит вследствие высокой активности цитратсинтазы и резко сниженной активности аконитат-гидратазы.

Практическая значимость работы

Впервые показана возможность использования дешевого возобновляемого субстрата - отходов производства биодизельного топлива для получения ЛК с помощью дрожжей, что делает этот процесс перспективным для реализации в промышленных масштабах. Предложенный процесс в условиях отьемно-доливного культивирования обеспечивает стабильное поддержание концентрации Ж на уровне более 120 г/л в течение 47 суток. Методы получения ЛК из глицерин-содержащих отходов апробированы в полупромышленных масштабах, получены опытные партии Ж,

соответствующей ГОСТ 908-79 и СанПиН 2.3.2.1078-0 (Протокол о проведении процесса биосинтеза и приготовлении опытной партии лимонной кислоты на базе Опытной технологической установки ИБФМ РАН от 20.04.2011; Протокол о проведении испытаний лимонной кислоты на содержание токсичных элементов ООО «ИЛ Тест-Пущино» № 2695 от 25.04.2011).

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на Международных Пущинских школах-конференциях для молодых учёных (2007, 2008, 2010), ежегодных стендовых сессиях ИБФМ РАН (2007-2010), Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, 2008) и Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Кадровое обеспечение развития инновационной деятельности в России» (Москва, 2010).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на страницах, содержит таблицы и рисунков. Список литературы включает^^наименований, из тк^ЛС- публикации в иностранных изданиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы. Объектами исследования являлись 59 природных штаммов дрожжевых организмов, относящихся к родам Candida, Saccharomyces, Debaryomyces, Pichia, Torulopsis и Yarrowia из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН, а также 7 ацетат-негативных мутантов Y. lipolytica из коллекции культур лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН и факультета биотехнологии и пищевой микробиологии Университета естественных наук г. Вроцлав (Польша).

Методы культивирования. В качестве основной среды для выращивания дрожжей использовали минеральную среду Ридер, которую

готовили на дистиллированной воде с добавлением смеси микроэлементов по Буркгольдеру. В качестве источника углерода использовали глицерин или глицерин-содержащие отходы, полученные с завода Rafineria Trzebinia SA (Польша). Условием сверхсинтеза ЛК являлось лимитирование роста культуры азотом. Культивирование проводилось в колбах или ферментерах АНКУМ-2М объемом 3 Л (с исходным объемом среды 1,5 л) или 10 л (с исходным объемом среды 5 л) и в ферментере Biostat В Plus (Германия) объемом 5 л (с исходным объемом среды 1,8 и 2 л). Ферментации проводились при рП=5-5,5, поддерживаемом добавлением NaOH, концентрации растворенного кислорода 55-60% от насыщения и скорости оборотов мешалки 800 об/мин. Глицерин или глицерин-содержащие отходы добавлялись периодически, как указано в тексте диссертации.

Аналитические методы. Рост культур контролировали путем измерения сухой массы дрожжей. Содержание аммонийного азота анализировали с помощью ионометра фирмы «Orion» (США).

Содержание глицерина определяли энзиматическим методом, используя набор стандартных реагентов («Boehringer Manheim», Германия): в основе метода лежит окисление глицерина в сопряженной реакции с глицеролкиназой, /-лактат-дегидрогеназой и пируваткиназой с образованием эквимолярного количества НАДН, которое детектируется при 340 нм.

Концентрацию ЛК и изолимонной кислоты (ИЛК) определяли с помощью ВЭЖХ на колонке Inertsil ODS-3 (250x4мм) («Элсико», Россия) с обращенной фазой. В качестве подвижной фазы использовали 20 мМ Н3Р04. Скорость элюции составляла 1 мл/мин, температура 35°С, детекция проводилась при 210 нм. В качестве стандартов использовали набор органических кислот фирмы «Sigma» (США). Дополнительно Ж определяли химическим методом, а ИЛК -энзиматическим методом.

Содержание полиолов определяли с помощью изократической ВЭЖХ на колонке Aminex НРХ-87Н, 300x78мм («Bio-Rad», США), соединенной с рефрактометром.

Метиловые эфиры жирных кислот анализировали методом газожидкостной хроматографии (Султанович с соавт., 1982). Содержание липидов в биомассе определяли по сумме жирных кислот, используя в качестве внутреннего стандарта гепгадекановую кислоту.

Анализ содержания углерода, водорода и азота на «С, Н, N» анализаторе фирмы «Carlo Erba Strumentazione» (Италия), золы (методом сжигания в муфельной печи) проводили в лаборатории масе-спектрометрии ИБФМ РАН.

Активность ферментов определяли на спектрофотометре UV-160 «Shimadzu» (Япония) в бесклеточных гомогенатах клеток, отобранных в разные фазы роста. Дезинтеграцию дрожжей проводили на планетарной мельнице с помощью стеклянных бус «баллотини» или на прессе Френча. Методы измерения активности ферментов подробно изложены в диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Способность дрожжей продуцировать лимонную кислоту из глицерина,

отбор продуцента

Изучена способность 59 природных штаммов дрожжей, принадлежащих к родам Debaryomyces, Candida, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis и Yarrowia, a также 7 мутантов дрожжей вида Y. lipolytica синтезировать JIK из глицерина.

Для проверки культур был использован экспресс-метод оценки активности кислотообразования на агаризованной среде с мелом. По зонам растворения мела, которые образуются за счет выделения органических кислот, оценивалось кислотообразование. Отбор продуцента проводили в среде с глицерином. Как видно из таблицы 1, все исследуемые штаммы росли в среде с глицерином. Лимитирование роста приводило к экскреции кислот у 41 штамма (40 штаммов вида Y. lipolytica и 1 штамм вида С. paludigena), но у 25 штаммов экскреции не наблюдалось (штаммы, относящиеся к родам Debaryomyces, Candida, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis). Среди дрожжей вида У. lipolytica 8 штаммов не образовывали кислот. 15 штаммов имели зону растворения мела, равную 0,5-2 мм, 9 штаммов - 2,5-4 мм, 3 штамма - 4,5-6 мм, 6 штаммов - 6,58,0 и 7 штаммов имели зону растворения мела выше 8 мм.

Для дальнейшей работы были отобраны природный штамм Y. lipolytica 704 и ацетат-негативные мутанты НГ 40, НГ 80, N 11, N 13, N 15 и А-101-1.22, у которых зона растворения мела была максимальной.

Следует отметить, что тест на агаризованной среде на кислотообразование не дает возможности однозначно сказать какая кислота -J1K или ИЛК накапливается в среде. С целью идентификации кислот, а также для проверки результатов, полученных методом селекции на твердой среде, проводили культивирование отобранных штаммов в жидкой среде Ридер с глицерином в условиях дефицита азота.

Определение биомассы, содержания JIK и ИЖ в культуральной жидкости проводили на 6 суток. Также были рассчитаны соотношение ЛК: ИЛК, выход ЛК от потребленного глицерина (Улк, г/г) и продуктивность биомассы (Р, выраженная как количество ЛК в г, продуцируемое 1 г клеток; г ЛК/г клеток) для каждого варианта эксперимента. Как видно из таблицы 2, штаммы синтезировали одновременно ЛК и ИЛК, соотношение ЛК:ИЛК варьировало от 4:1 до 11:1. Наибольшее накопление ЛК было отмечено у природного штамма Y. lipolytica 704, тогда как мутанты Y. lipolytica N 15 и К lipolytica А-101-1.22 характеризовались наиболее низким содержанием ИЛК. соотношение ЛК:ИЛК составляло 11:1 и 10:1 соответственно. Максимальное значение выхода ЛК от потребленного глицерина (более 50%) было отмечено для Y. lipolytica 704 и мутантов Y. lipolytica N 15 и Y. lipolytica А-101-1.22. Продуктивность биомассы варьировала от 4,1 до 5,9 г ЛК/г клеток и у У. lipolytica 704 была максимальной.

Таблица 1. Кислотообразующая способность дрожжей, растущих на глицерин-содержащей агаризованной среде с мелом в

условиях лимитирования роста азотом

Вид дрожжей D (мм) Вид дрожжей D (мм) Вид дрожжей D (мм)

Candida brumptii ВКМ Y-5 0 Y. lipolytica 69 3 У. Иро1уИса 655 0

С. rugosa ВКМ Y-67 0 Y. lipolytica 76 1 Y. Иро1уйса 666 0

С. olea ВКМ Y-57 0 Y. lipolytica 79 2 У. Иро1уйса 667 8

С. paludigena BKM Y-2443 2,0 Y. lipolytica 86 8 У. Иро1уИса 668 1,5

С. pelliculosa ВКМ Y-118 0 Y. lipolytica 212 8 У. Иро1уПса 670 0,5

С. catenulata ВКМ Y-36 0 Y. lipolytica 214 4 У. Нро1уИса 672 0

С. zeylanoides ВКМ Y-6 0 Y. lipolytica 281 4 К Нро1уИса 681 4,5

С. zeylanoides ВКМ Y-14 0 Y. lipolytica 374/1 3 У. Иро1уНса 683 7

С. zeylanoides ВКМ Y-2324 0 Y. lipolytica 374/3 1,5 К Иро1уИса 694 5

С. zeylanoides ВКМ Y-2595 0 Y. lipolytica 374/4 0,5 У. Иро1уПса 695 3

С. guilliermondii Н-Р-4 0 Y. lipolytica 374/5 2 У. Иро1уНса 704 8,5

Debaryomyces sp. 0 Y. lipolytica 374/6 0 К Иро1уИса 706 7

Pichia besseyi BKM Y-2084 0 Y. lipolytica 374/8 1 К Про1уИса 709 4

Р. media BKM Y-1381 0 Y. lipolytica 387 2 К й\polytica 710 5

P. inositovora BKM Y-2494 0 Y. lipolytica 571 2 У. Иро1уНса 716 2

Saccharomyces cerevisiae BKM Y-381 0 Y. lipolytica 581 1 К Иро1уИса УФ 5 8

Torulopsis candida 127 0 Y. lipolytica 582 2 У. Про1уИса НГ 40 9

T. candida 420 0 Y. lipolytica 585 1 У. Нро1уИса НГ 80 9

Yarrowia lipolytica 12a 0 Y. lipolytica 591 0 У. Иро1уИса N 11 9

Y. lipolytica 9b 3 Y. lipolytica 607 3,5 У. Нро1уИса N 13 10

Y. lipolytica BKM Y-47 0 Y. lipolytica 645 4 У. Иро1уИса N 15 11

Y. lipolytica 68 0 Y. lipolytica 646 1 У. Иро1уйса А-101-1.22 И

Б - зона растворения мела

Таблица 2. Рост и кислотообразование У. Иро1уМса в жидкой среде с глицерином

Организм Биомасса (г/л) Ж (г/л) ИЖ (г/л) Ж:ИЛК ^лк (%) Р (г ЛК/г клеток)

У. Нро1уЧса 704 3,55 21,16 4,43 4,8:1 53,0 5,96

У. Нро1уИса НГ 40 3,94 16,60 3,49 4,8:1 42,0 4,21

У. Нро1уйса НГ 80 3,78 15,44 3,84 4,0:1 39,0 4,1

У. Нро1уИса N 11 3,10 16,64 2,65 6,3:1 42,0 5,36

У. \ipnlyiica N 13 3,45 16,04 3,32 4,8:1 40,0 4,64

У Нро1уИса N 15 3,39 19,08 1,70 11,2:1 55,0 5,33

У. Иро1уИса А-101-1.22 4,10 20,80 2,00 10,4:1 55,0 5,07

Для дальнейшей работы были отобраны природный штамм У. \\polytica 704, характеризующийся максимальным накоплением ЛК и мутанты У. Иро1уИса N 15 и К 1\ра\у1\са А-101-1.22, которые отличаются преимущественным синтезом ЛК.

2. Основные условия и динамика образования лимонной кислоты

При культивировании дрожжей У. \\polyt\ca на полноценных питательных средах образования Ж не происходит. Условием сверхсинтеза Ж является лимитирование роста дрожжей минеральными компонентами среды - азотом, фосфором или серой при одновременном избыточном содержании в среде глицерин-содержащих отходов (результаты подробно изложены в диссертации). Нами исследовано влияние условий культивирования (изменение рН среды, аэрации и концентрации глицерина) на синтез Ж у дрожжей У. Про1уЧса.

Подбор условий проводили для природного штамма У Иро1уйса 704 и мутанта У. Ирочка N 15 в среде с глицерином. На рис. 1 представлены данные о влиянии рН среды, аэрации и концентрации глицерина на биосинтез У. Иро1уйса N 15. Аналогичные результаты получены для У Про1уНса 704, которые подробно изложены в диссертации.

При всех исследованных значениях рН среды (в диапазоне от 3,0 до 8,0) клетки У. Иро1уИса синтезировали ЛК, интенсивное кислотообразование наблюдалось в интервале рН=4,5-6,0, при более низком значении рН (3,0) и более высоких значениях рН (7,0-8,0) накопление ЛК снижалось (рис. 1а).

Биосинтез ЛК в значительной степени зависит от уровня насыщения среды кислородом (рис. 16). Максимальный синтез Ж дрожжами У. Иро1уИса в среде с глицерином происходил при аэрации 0,30 и 0,56 ммоль 02/л/мин, при уменьшении содержания кислорода ниже 0,2 ммоль 02/л/мин биосинтез Ж снижался в 1,5 раза.

12 9 ■ -6 3 ■

3 6 рН среды

12 -I

9 ■

6 •

3 ■

О 0,2 0,4 0,6 аэрация (ммоль 02/л/мин)

12 9 ■

6 3

О 25 50 75 100 глицерин (г/л)

Рис. 1. Влияние рН среды, аэрации и содержания глицерина на синтез Ж у дрожжей К Нро1уИса

На биосинтез ЛК также существенное влияние оказывала концентрация глицерина в среде (рис. 1в). При всех исследованных концентрациях глицерина происходило кислотообразование. Максимальное накопление Ж (11,0 г/л) наблюдалось при содержании глицерина в среде от 20 до 40 г/л, повышение концентрации глицерина свыше 70 г/л снижало биосинтез Ж в 2 раза.

В результате проведенных исследований подобраны условия культивирования, обеспечивающие наибольший синтез Ж дрожжами У. Нро1уИса в среде с глицерином: рН=4,5-6,0, интенсивная аэрация среды (на уровне 0,30 и 0,56 ммоль 02/л/мин) и концентрация глицерина 20-40 г/л. Оптимизация условий культивирования привела к увеличению биосинтеза Ж в 1,8 раза у У. Иро1уИса N 15.

3. Биосинтез лимонной кислоты дрожжами У. lipolytica при росте на глицерин-содержащих отходах

Эксперименты по изучению кислотообразующей активности природного штамма У. lipolytica 704 и мутантов У. lipolytica N 15 и У. lipolytica А-101-1.22 в среде с отходами производства биодизелыюго топлива проводили в ферментере в периодическом режиме. Культивирование природного штамма Y. lipolytica 704 и его мутанта Y. lipolytica N 15 проводили в ферментере АНКУМ-2М объемом 3 л (исходный объем среды 1,5 л) и объемом 10 л (исходный объем среды 5,0 л), мутантного штамма Y. lipolytica А-101-1.22 в ферментере Biostat В Plus объемом 5 л (исходный объем среды 2 л) на минеральной среде Ридер в условиях лимитирования азотом. Данные о динамике роста, потребления азота, глицерин-содержащих отходов и накопления ЛК и ИЛК у исследуемых штаммов представлены на рис. 2.

У. Иро1уНса 704

У. Нро\уИса N 15

У Про1уИса А-101-1.22

Время (ч)

Рис. 2. Динамика роста (•), потребления сульфата аммония (Д) и продукции ЛК (А) и ИЛК (п) у штаммов-продуцентов У.

Про1уИса в среде с глицерин-содержащими отходами

Процесс образования ЛК является трехфазным процессом: в первой фазе происходит активный рост культуры и потребление лимитирующего компонента среды, в это время кислоты практически не образуются. Интенсивный синтез кислот начинается после снижения содержания азота ниже порогового уровня (200 мг/л) и перехода культуры в фазу замедленного роста и далее - в стационарную фазу роста. Синтез кислот продолжается до тех пор, пока в среде присутствует источник углерода.

Различия между штаммами сводились к различиям в количестве накапливаемых ЛК и ИЛК при малоизменяющейся биомассе. У У. Иро!уИса 704 обе кислоты образовывались приблизительно в равном количестве (61,7 г/л ЛК и 46,6 г/л ИЛК), в то время как мутанты синтезировали преимущественно ЛК. На 144 ч роста у Г. Нро1уНса N 15 накопление ЛК составляло 71,0 г/л, и содержание ИЛК было незначительно (5,6 г/л).

Максимальный биосинтез ЛК (112 г/л) с незначительным накоплением ИЛК (7,1 г/л) наблюдался у К Иро1уИса А-101-1.22, соотношение ЛК:ИЛК при этом составляло 15,8:1.

Элементный состав биомассы продуцента У. Иро\уйса А-101-1.22, содержание белка и липидов представлены в таблице 3. В период экспоненциального роста дрожжи накапливали значительное количество белка (26,9% а.с.б.), доля липидов была незначительна (7,4% а.с.б.). Лимитирование роста клеток азотом, наряду с экскрецией ЛК, приводило к четко выраженному изменению направленности биосинтетических процессов: снижению содержания белка (с 26,9% до 15,7%) и увеличению содержания липидов.

Таблица 3. Состав биомассы продуцента У. Иро1уЧса А-101-1.22

Параметры Фаза роста Фаза синтеза Ж

(12 ч) (39 ч) (87 ч)

Содержание компонентов (% а.с.б.)

Белок 26,9 15,7 16,1

Липиды 7,4 11,8 17,8

Углерод 46,6 46,6 48,6

Водород 6,7 7,0 6,7

Азот 4,7 2,9 2,5

Кислород 37,0 36,8 39,9

Энергосодержание биомассы (кДж/г) 18,9 19,6 19,7

Жирно-кислотный состав (% от суммы жирных кислот)

Скм) 20,8 19,2 17,4

12,3 17,5 19,9

С18:0 2,3 3,7 4,1

Сш 28,1 42,6 45,6

С182 36,5 16,4 12,3

Сравнительно высокий уровень липидов (17,8%) в клетках У. Иро1уИса в поздней стационарной фазе (87 ч), по-видимому, был связан с тем, что значительная часть ацетил-КоА, образующегося при потреблении отходов, поступает не в ЦТК, а в систему биосинтеза жирных кислот. Внутриклеточное содержание углерода (46,6 - 48,6%), водорода (6,7 - 7,0%) и кислорода (36,8 -39,9%) изменялось незначительно в ходе культивирования, в то время как содержание внутриклеточного азота снижалось с 4,7% в фазе роста до 2,9% в фазе синтеза. Энергосодержание биомассы увеличивалось с 18,9 до 19,7 кДж/г и коррелировало с накоплением липидов в клетке.

При культивировании на глицерин-содержащих отходах в биомассе продуцента образовывались преимущественно олеиновая (Л9С181), пальмитиновая (С^о), пальмитолеиновая (Л9С16:1) и линолевая (Л9,2С18:2) кислоты. При переходе в стационарную фазу роста наблюдались значительные изменения в жирно-кислотном составе биомассы: содержание линолевой кислоты снижалось с 36,5 до 12,3%, а содержание олеиновой кислоты увеличивалось с 28,1 до 45,6%.

Таким образом, разнообразный химический состав биомассы продуцента, наличие в клетках белка, липидов, витаминов (рибофлавин), ЛК и макроэлементов представляет возможность использования этой биомассы в качестве обогатителя комбикормов.

4. Механизм биосинтеза лимонной кислоты

Для изучения путей биосинтеза ЛК были определены активности ферментов начальных этапов метаболизма глицерина и ЦТК у природного штамма У. Иро!ука 704 и мутанта К Иро1уЧса N 15. Клетки отбирались в фазу экспоненциального роста (кислоты не образовывались) и в стационарную фазу роста (в период активного синтеза лимонных кислот). В таблице 4 представлены данные, полученные при определении активности ферментов.

У обоих штаммов при ассимиляции отходов производства биодизеля активность глицеролкиназы - первого фермента вовлечения глицерина в метаболизм - была на довольно высоком уровне в период экспоненциального роста и снижалась незначительно в период синтеза ЛК. Можно отметить, что активность глицеролкиназы при росте на глицерин-содержащих отходах сопоставима с таковой при росте дрожжей К ¡¡ро1уИса на чистом глицерине (Моргунов, 1994).

Для обоих штаммов характерна высокая активность ключевого фермента цитратсинтазы, ответственного за синтез цитрата, которая также снижалась незначительно в период синтеза ЛК. Активность этого фермента у мутантного штамма была в 1,5 раза выше, чем у природного штамма.

Таблица 4. Активности ферментов у У. Иро1уНса в период синтеза лимонных кислот (мкмоль/мин на мг белка)

Ферменты Y. lipolytica 704 У. lipolytica N 15

Рост Синтез Рост Синтез

Глицеролкиназа 0,105 0,085 0,112 0,091

Цитратсинтаза 1,16 1,11 1,74 1,60

Малатдегидрогеназа 2,0 2,8 3,7 3,8

Аконитат-гидратаза 0,33 0,16 0,12 0,01

Изоцитратдегидрогеназа (НАД+) 0,105 0,12 0,09 0,01

Изоцитратдегидрогеназа (НАДФ+) 0,12 0,125 0,08 0,09

Изоцитрат-лиаза 0,08 0,072 0,089 0,100

Высокой как в ростовой, так и в стационарной фазе, оставалась активность малатдегидрогеназы, фермента, вовлеченного в процесс ресинтеза оксалоацетата. Активность малатдегидрогеназы у мутантного штамма также была значительно выше, чем у Y. lipolytica 704.

Активности цитратсинтазы и малатдегидрогеназы у обоих штаммов значительно превышали активности последующих ферментов цикла: аконитат-гидратазы и изоцитратдегидрогеназ.

Соотношение синтезируемых дрожжами Ж и ИЖ определяется соотношением активностей ферментов цитратсинтазы, аконитат-гидратазы и НАД-изоцитратдегидрогеназы. Высокая активность цитратсинтазы и резко сниженная активность аконитат-гидратазы (в период синтеза снижающаяся еще в 10 раз) приводит к преимущественному синтезу Ж у мутанта Y. lipolytica N 15, в то время как достаточно высокая активность аконитат-гидратазы при одновременно низкой активности НАД-изоцитратдегидрогеназы приводит к экскреции как Ж, так и ИЛК у природного штамма Y. lipolytica 704.

При ассимиляции глицерина ресинтез оксалоацетата может осуществляться за счет карбоксилирования пирувата и фосфоенолпирувата и необходимость в функционировании глиоксилатного цикла, как поставщика оксалоацетата в ЦТК, отсутствует (активность изоцитрат-лиазы в клетках, выращенных на глицерине очень низкая - 0,009 мкмоль/мин на мг белка) (Моргунов, 1994). В литературе имеются сведения о низкой активности изоцитрат-лиазы при росте Y. lipolytica в среде с глюкозой (Ermakova et al., 1986). При росте дрожжей Y. lipolytica на глицерин-содержащих отходах активность изоцитрат-лиазы значительно выше (0,07- 0,1 мкмоль/мин на мг белка). Это может быть обусловлено наличием в отходах жирных кислот, являющихся индукторами ферментов глиоксилатного цикла. Таким образом, глиоксилатный цикл также может быть вовлечен в процесс ресинтеза оксалоацетата при биосинтезе Ж дрожжами из глицерин-содержащих отходов производства биодизеля.

Разработка способа культивирования, обеспечивающего наиболее продолжительный, интенсивный и стабильный синтез лимонной кислоты

Недостатком периодического культивирования является его ограниченная продолжительность.

Таблица 5. Динамика продуктивности культуры при периодическом культивировании У. Иро1уИса А-101-1.22

Время (ч) 24-39 39-61 1 61-86 86-111 111-134 134-144

Чр (г/г-ч) 0,076 0,060 1 0,039 0,034 0,0091 0,006

Продуктивность культуры (яР) К Про1уИса А-101-1.22 (таблица 5), максимальная в начале биосинтеза ЛК, постепенно снижалась в ходе культивирования, что делало нецелесообразным продолжение процесса дольше 6 суток. Возможными причинами снижения синтеза ЛК являлось резкое снижение метаболической активности клеток, а также ингибирующее действие высоких концентраций ЛК. Указанные недостатки периодического культивирования определяли необходимость поиска других способов культивирования, позволяющих продлить активный синтез ЛК.

5.1. Использование мембранного модуля для биосинтеза лимонной кислоты

Одним из перспективных способов увеличения продолжительности микробиологических процессов при получении метаболитов, экскретируемых в культуральную жидкость, является культивирование с использованием мембранного биореактора.

Мембранный биореактор представляет собой ферментер, оснащенный фильтрующим модулем. Данный способ культивирования предоставляет возможность непрерывно удалять образующийся продукт, что особенно важно при его ингибирующем воздействии на продуцент. Вся биомасса продуцента остается в ферментере и продолжает синтезировать продукт. При данном способе культивирования в ферментер подается среда, содержащая субстрат и лимитирующий рост компонент в количестве, обеспечивающим поддержание клеток в активном состоянии, но недостаточном для клеточного роста. В условиях постоянного выведения Ж из культуральной жидкости можно было ожидать увеличения продолжительности ферментации за счет поддержания концентрации ЛК, не ингибирующей метаболизм клеток.

На рис. 3 представлены результаты эксперимента с использованием выносного спирального мембранного модуля. Скорость протока и общая продолжительность ферментации составляли 0,014 ч"1 и 500 ч соответственно.

Интенсивное кислотообразование (96-107 г/л) наблюдалось до 300 ч культивирования. Средняя объемная продуктивность процесса и удельная скорость синтеза ЛК в данный промежуток времени (100-300 ч) поддерживались высокими и составляли 1,42 г/л-ч и 0,64 г/г-ч соответственно.

Время (ч)

Рис. 3. Биосинтез Ж дрожжами У. Иро1уйса А-101-1.22 при использовании мембранного биореактора с фильтрующим модулем: • биомасса, А ПК.

После 300 ч культивирования наблюдалось снижение синтеза ЛК. Снижение скорости образования Ж не было связано с повышением ее концентрации в культуральной жидкости, поскольку в данном эксперименте концентрация ЛК в ферментере поддерживалась на уровне 100 г/л (в условиях периодического культивирования при данной концентрации у У. Нро1уИса А-101-1.22 наблюдалось активное образование Ж).

Таким образом, эксперименты с использованием мембранного модуля показали, что данный метод культивирования дает возможность значительно продлить синтез Ж без снижения скорости кислотообразования.

5.2. Отъемно-доливной метод культивирования

Отьемно-доливной способ культивирования представляет собой процесс, при котором производится отъем культуральной жидкости через определенные промежутки времени, и в ферментер добавляется свежая питательная среда. В сравнении с традиционным периодическим процессом применение отъемно-доливного метода культивирования часто делает процесс более эффективным.

При проведении экспериментов варьировали количество доливаемой среды и длительность циклов, в каждом из которых культивирование осуществляли в периодическом режиме. Были исследованы следующие варианты: огьем-долив 40% или 30% культуральной жидкости с клетками через 3 суток и отьем-долив 20% культуральной жидкости с клетками через 5 суток. Процесс культивирования продуцента У. Чро1уИса А-101-1.22 в режиме огьемов-доливов продолжали в течение 1129 ч (т.е. 47 суток).

На рис. 4 представлены результаты отьемно-доливного метода культивирования. Как видно из рисунка, даже на 886 ч концентрация ЛК была высокой и составляла 119,9 г/л.

75 115 155 195 235 275 315 355 358 398 438 478 518 558 598 638 653 718 783 848 913 978 1043 1108

Время (ч)

Рис. 4 . Биосинтез ЛК дрожжами У. Нро1уИса А-101-1.22 в режиме отьемов-доливов: отьем-долив 40%, продолжительность цикла 3 сут (а); 30%, 3 сут (б); 20%, 5 сут (в). • биомасса, ▲ ЛК

Таблица 6. Биосинтез ЛК У. Нро1уИса А-101-1.22 при культивировании методом отьемов-доливов

Режим Биомасса (г/л) Ж (г/л) ИЛК (г/л) Эритри-тол (г/л) Манни-тол (г/л) Слк (г/л-ч) Чр (г/г-ч) Тик (%)

40% 3 сут 18,1 108,4 7,15 0,50 2,68 0,808 0,047 64,0

30% 3 сут 17,0 124,2 7,20 13,45 3,63 0,850 0,050 77,0

20% 5 сут 16,4 112,6 7,60 45,20 4,75 0,510 0,023 55,0

В таблице 6 представлены содержание биомассы, концентрация ЛК, а также побочных продуктов - ИЛК, эритритола и маннитола, продуктивность культуры, объемная продуктивность процесса (Сж), выход продукта от потребленного субстрата при разных режимах культивирования.

При использовании режима отъем-долив (30% каждые 3 сут) в культуральной жидкости накапливалось 124,2 г/л Ж, и продуктивность ферментера составляла 0,85 г/л-ч; эти показатели на 11% и 20% соответственно были выше, чем при периодическом режиме.

При увеличении количества доливаемой среды с 30% до 40% наблюдалось снижение биосинтеза ЛК (108,4 г/л), что, возможно, было вызвано высокой степенью обновления культуры; при этом производительность ферментера (0,808 г/л-ч) и выход ЛК от потребленного субстрата (0,64 г/г) были выше, чем при периодическом режиме.

Уменьшение количества доливаемой среды с 30% до 20% и увеличение продолжительности цикла с 3 до 5 сут приводило к значительному снижению биосинтеза Ж и увеличению образования полиолов: эритритола (до 45,2 г/л) и маннитола (4,75 г/л).

Экскреция полиолов имела место при росте К Иро1уИса на глицерин-содержащих отходах при всех режимах отъемно-доливного культивирования. Это заставляет предполагать, что выделение полиолов имеет какое-то определенное метаболическое значение. В литературе экскрецию полиолов рассматривают как защитную реакцию клетки на стрессовую ситуацию -избыток ЛК или глицерина (Куто\\чс2 е! а1., 2009). Вполне вероятно, что образование полиолов штаммом К Иро1уИса А-101-1.22 в настоящей работе происходило в ответ на высокие концентрации ЛК в среде.

Во всех вариантах культивирования в режиме отьемов-доливов содержание ИЛК не превышало 7% от суммы лимонных кислот, как и при периодическом режиме.

При культивировании методом отьемов-доливов макроэлементный состав биомассы продуцента, содержание белка и липидов поддерживались

стабильными в течение длительного времени культивирования и соответствовали параметрам фазы активного синтеза ЛК (39 ч) при периодическом режиме.

Аналогичные исследования проведены с мутантным штаммом У. Про1уИса N 15, результаты подробно изложены в диссертации.

В итоге настоящей работы показана возможность практического получения ЛК дрожжами У. Иро1уИса из глицерин-содержащих отходов; подобраны условия культивирования, обеспечивающие максимальную продукцию ЛК; созданы научные основы процесса получения ЛК в периодическом, отъемно-доливном и непрерывном режиме с использованием мембранного модуля.

В таблице 7 представлена сравнительная характеристика различных способов культивирования с использованием трех изучаемых штаммов. При использовании метода отьемов-доливов достигаются более высокие результаты у мутантных штаммов У. Иро1уИса А-101-1.22 и У. Иро1уИса N 15 по сравнению с периодическим культивированием при полном сохранении активности культуры в течение длительного времени. Кроме того, отьемно-доливной способ позволяет снизить расходы сырья, тепло- и электроэнергии за счет сокращения количества необходимого посевного материала и увеличения времени между циклами подготовки и стерилизации ферментера.

Таблица 7. Эффективность процессов биосинтеза Ж из глицерин-содержащих

отходов

Режим Штамм Время (ч) Ж (г/л) ИЛК (г/л) (%) Слк (г/л-ч)

У. Про1уИса 704 144 61,7 46,6 59,0 0,620

Периодический У. Пробка N 15 144 71,0 5,6 90,0 0,890

У. Про1у1ка А-101-1.22 144 112,0 7,1 60,0 0,708

Мембранный модуль' У. \ipolylica А-101 -1.22 500 96-107 6,4 64,0 1,42

Отьемно- У. Иро!уНса N 15 862 145,2 1,9 96,0 0,85

доливной 6 У. Иро1уИса А-101-1.22 1129 124,2 7,2 77,0 0,85

аМембранный модуль в интервале 100-300 ч,

6 Режим отъемов-доливов 30% 3 сут для У. Нро1уНса А-101-1.22 и 30% 4 сут для У. Иро1уИса N15

На основании результатов настоящего исследования могут быть разработаны рекомендации для процесса утилизации глицерин-содержащих отходов производства биодизелыюго топлива и получения из них ЛК и ее соли цитрата натрия.

ВЫВОДЫ

1. Впервые обнаружена способность дрожжевых организмов ассимилировать глицерин-содержащие отходы в качестве источника углерода и энергии и продуцировать в значительных количествах ЛК. В качестве продуцентов отобраны природный штамм У. Иро1уИса 704 и мутанты У. Про1уПса N 15 и У. Чро1уПса А-101-1.22.

2. Созданы научные основы технологии получения ЛК дрожжами У. Иро1уйса из глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива. Подобраны условия культивирования для штаммов К Иро1уНса 704 и У. Иро1уИса N 15, обеспечивающие максимальную продуктивность биосинтеза ЛК в условиях периодического культивирования. Они включали: ограничение роста дрожжей источником азота; стабильное поддержание рН на уровне 4,56,0; интенсивную аэрацию среды (на уровне 0,30-0,56 ммоль 02/л/мин) и содержание глицерина в среде от 20 до 40 г/л.

3. Показано, что при росте на глицерин-содержащих отходах природный штамм К Иро1уаса 704 продуцирует примерно равные количества ЛК и ИЛК. При росте на глицерине доля ИЛК гораздо меньше. Преимущественного синтеза ЛК удалось добиться с применением мутантов У. Иро1у1ка N 15 и К Про1упса А-101-1.22.

4. Биосинтез лимонных кислот биохимически охарактеризован. Высокая активность цитратсинтазы и резко сниженная активность аконитат-гидратазы приводит к преимущественному синтезу ЛК у мутанта У. Иро1уНса N 15, в то время как достаточно высокая активность аконитат-гидратазы при низкой активности НАД-изоцитратдегидрогеназы приводит к экскреции как ЛК, так и ИЛК у природного штамма.

5. В условиях периодического культивирования У. Иро1уИса достигнуты высокие концентрации Ж в среде (110 г/л), но вместе с тем показано, что этот способ культивирования имеет ограниченную продолжительность. Впервые показана принципиальная возможность продолжительного синтеза ЛК из глицерин-содержащих отходов с использованием мембранного модуля.

6. Показано, что отъемно-доливной метод культивирования является наиболее эффективным. Процесс обеспечивает высокую биосинтетическую активность дрожжей (концентрация ЛК на уровне 120 г/л) в течение более 47 суток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи в рецензируемых журналах

1. Фатыхова А.Р., Камзолова С.В., Моргунов И.Г. Биосинтез лимонной кислоты дрожжами на среде с глицерином // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. 2007. Т. 3. № 4. С. 5-13.

2. Камзолова С.В., Фатыхова А.Р., Моргунов И.Г. Биосинтез лимонной кислоты дрожжевыми организмами из глицерин-содержащих продуктов // Биотехнология. 2008. № 5. С. 50-58.

3. Rymowicz W., Fatykhova A.R., Kamzolova S.V., Ryvviñska A., and Morgunov I.G. Citric acid production from glycerol-containing waste of biodiesel industry by Yarrowia lipolytica in batch, repeated batch, and cell recyclc regimes // Applied Microbiology and Biotechnology. 2010. V. 87. № 3. P. 971-979.

4. Kamzolova S.V., Anastassiadis S.G., Fatykhova A.R., Golovchenko N.P., and Morgunov I.G. Strain and process development for citric acid production from glycerol-containing waste of biodiesel manufacture // In: Current Research, Technology and Educational Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology. Ed. A. Méndez-Vilas. Publisher: Formatex Research Center. 2010. V. 2 ISBN (13): 978-84-614-6195-0. P. 1020-1028.

5. Kamzolova S.V., Fatykhova A.R., DedyukhinaE.G., Anastassiadis S.G., and Morgunov I.G. Citric acid production by yeast grown on glycerol-containing waste from biodiesel industry // Food Technology and Biotechnology. 2011. V. 49. № 1. P. 65-74.

Статьи в научных сборниках и других изданиях

1. Фатыхова А.Р., Камзолова С.В., Моргунов И.Г. Использование глицерина в качестве субстрата для роста и синтеза лимонных кислот дрожжей Yarrowia lipolytica // Материалы 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 2007. С. 218.

2. Фатыхова А.Р., Камзолова С.В., Моргунов И.Г. Использование отходов производства биодизеля для микробиологического получения лимонной кислоты // Материалы VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2008. С. 258-261.

3. Фатыхова А.Р., Моргунов И.Г. Синтез лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica при росте на отходах биодизеля // Материалы Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», Москва - Пущино, 2008. С. 179-180.

4. Фатыхова А.Р., Моргунов И.Г. Биосинтез лимонной кислоты из глицерин-содержащих отходов при отъемно-доливном способе культивирования // Материалы 14-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 2010. С. 293-294.

5. Фатыхова А.Р., Римович В., Рывинска А., Камзолова C.B., Моргунов И.Г. Биосинтез лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipoîytica в условиях непрерывного культивирования // Материалы VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2010. С. 173-174.

6. Фатыхова А.Р., Моргунов И.Г. Биоконверсия глицерин-содержащих отходов производства биодизеля в лимонную кислоту // Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Кадровое обеспечение развития инновационной деятельности в России», Москва, 2010. С. 148-150.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность своему научному руководителю д.б.н. И.Г. Моргунову за постоянное внимание и ценные советы. Автор благодарна к.б.н. C.B. Камзоловой, проф. В. Римовичу и д-ру А. Рывинске (Университет естественных наук г. Вроцлав, Польша), д.б.н. Т.В. Финогеновой, к.б.н. Э.Г. Дедюхиной, которые оказывали неоценимую помощь на разных этапах работы, а также всем сотрудникам лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН за помощь и поддержку при выполнении настоящей работы.

Подписано в печать:

05.05.2011

Заказ № 5442 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фатыхова, Алина Ринатовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Глицерин-содержащие отходы производства биодизельного топлива и их 8 возможное применение в микробиологическом синтезе

1.1.1. Глицерин как субстрат для получения микробных метаболитов

1.1.2. Основные пути окисления глицерина

1.2. Микробиологическое получение лимонной кислоты

1.2.1. Лимонная кислота и ее соли, свойства и применение

1.2.2. Продуценты лимонной кислоты

1.2.3. Условия биосинтеза лимонной кислоты

1.2.4. Механизмы биосинтеза лимонной кислоты

1.2.4.1. Механизм биосинтеза лимонной кислоты грибами Aspergillus niger

1.2.4.2. Механизм биосинтеза лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Методика культивирования дрожжей

2.2.1. Подготовка посевного материала

2.2.2. Состав и подготовка основной среды

2.2.3. Методы культивирования дрожжей

2.3. Аналитические методы

2.4. Методы расчета технологических параметров ферментации

2.5. Определение активности ферментов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Способность дрожжей различного таксономического положения 63 синтезировать лимонную кислоту из глицерина, отбор продуцента

3.2. Основные условия и динамика образования лимонной кислоты дрожжами 68 Y. lipolytica

3.2.1. Влияние природы лимитирующего компонента на сверхсинтез лимонной 68 кислоты

3.2.2. Влияния различных факторов на образование лимонной кислоты дрожжами 74 У. \ipolytica в среде с глицерином

3.3. Синтез лимонной кислоты дрожжами У. Иро1уйса в среде с глицерином

3.4. Синтез лимонной кислоты дрожжами У. Цро1уИса в среде с глицерин- 84 содержащими отходами производства биодизельного топлива

3.5. Анализ активности ферментов при биосинтезе лимонной кислоты из 94 глицерин-содержащих отходов дрожжами У. Иро1уНса

3.6. Разработка способа культивирования, обеспечивающего наиболее продолжительный, интенсивный и стабильный синтез лимонной кислоты

3.6.1. Использование мембранного модуля для биосинтеза лимонной кислоты

3.6.2. Отъемно-доливной метод культивирования

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica из глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива"

Актуальность проблемы: В последние десятилетия в связи с удорожанием нефтепродуктов! и ухудшением экологической обстановки резко возрос интерес к использованию альтернативных источников топлива, получаемых из растительного сырья, таких как биодизельное топливо. В Евросоюзе к 2030 г. планируется доведение доли биодизельного топлива в общем объеме топлива до 25% (Himmel et al., 2007).

Наибольший интерес представляет лимонная KH^OTav (JIK). Ежегодно в мире производится 1 млн. 400 тыс. тонн JIK с годовым приростом производства 3-5% от существующего уровня (Soccol et al., 2006). Наряду с традиционным использованием JIK в пищевой, химической и фармацевтической промышленности рассматриваются новые направления ее применения, расширяется использование ее натриевой соли в составе синтетических моющих средств в качестве заменителя^ полифосфатов, опасных для экологии.

Традиционная технология производства JIK из мелассы при помощи мицелиальных грибов Aspergillus niger имеет ограниченную сырьевую базу, является многостадийным и экологически небезопасным процессом. В последние годы в ИБФМ РАН разработаны процессы получения J1K с использованием дрожжей Yarrowia lipolytica из этилового спирта, глюкозы и растительных масел. Возможность использования глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива в качестве источника углерода для роста дрожжей и биосинтеза JIK на момент начала работы не была изучена.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение закономерностей биосинтеза ЛК из глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива у дрожжей У Нро1уНса, способов управления их биосинтетической активностью и разработка на этой основе эффективных методов получения ЛК. •

В число основных задач входило:

2. Определение условий культивирования штаммов-продуцентов, оптимальных для получения ЛК;

4. Изучение особенностей роста дрожжей и синтеза ЛК в периодическом режиме и в условиях отъемно-доливного и непрерывного культивирования (с использованием мембранного модуля).

5. Выбор способа культивирования, обеспечивающего наиболее продолжительный, интенсивный и стабильный синтез ЛК из глицерин-содержащих отходов.

Научная новизна работы. Впервые установлена принципиальная- возможность направленного синтеза ЛК дрожжами в среде с глицерин-содержащими отходами производства биодизельного топлива. Среди изученных организмов штаммы У. Нро1уНса В КМ У-2373 (704), У. Нро1уйса N 15 и 7. Про1уПса А-101-1.22 отобраны в качестве наиболее активных продуцентов. Подобраны условия культивирования (рН среды, концентрация растворенного кислорода, концентрация глицерина), обеспечивающие интенсивный синтез ЛК.

Показано, что продукция ЛК у ацетат-негативного мутанта У. Иро1уйса N 15 происходит вследствие высокой активности цитратсинтазы и резко сниженной активности аконитат-гидратазы.

Практическая значимость работы. Впервые показана возможность использования дешевого возобновляемого субстрата - отходов производства биодизельного топлива для получения ЛК с помощью дрожжей, что делает этот процесс перспективным для реализации в промышленных масштабах. Предложенный процесс в условиях отъемно-доливного культивирования обеспечивает стабильное поддержание концентрации ЛК на уровне более 120 г/л в течение 47 суток. Методы получения ЛК из глицерин-содержащих отходов апробированы в полупромышленных масштабах, получены опытные партииЛК, соответствующей ГОСТ 908-79 и СанПиН 2.3.2.1078-0

Протокол о проведении процесса биосинтеза и приготовлении опытной партии лимонной кислоты на базе Опытной технологической установки ИБФМ РАН от 20.04.2011; Протокол о проведении испытаний лимонной кислоты на содержание токсичных элементов ООО «ИЛ Тест-Пущино» № 2695 от 25.04.2011).

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на Международных Пущинских школах-конференциях для молодых учёных (2007, 2008, 2010), ежегодных стендовых сессиях ИБФМ РАН (2007-2010), Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, 2008) и Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Кадровое обеспечение развития инновационной деятельности в России» (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 139 страницах, содержит 19 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 293 наименований, из них 226 - публикации в иностранных изданиях.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Фатыхова, Алина Ринатовна

114 ВЫВОДЫ

1. Впервые обнаружена способность дрожжевых организмов ассимилировать глицерин-содержащие отходы в качестве источника углерода и энергии и продуцировать в значительных количествах JIK. В качестве продуцентов отобраны природный штамм Y. lipolytica 704 и мутанты Y. lipolytica N 15 и Y. lipolytica А-101-1.22.

2. Созданы научные основы технологии получения J1K дрожжами Y. lipolytica из глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива. Подобраны условия культивирования для штаммов Y. lipolytica 704 и Y. lipolytica N 15, обеспечивающие максимальную продуктивность биосинтеза ЛК в условиях периодического культивирования. Они включали: ограничение роста дрожжей источником азота; стабильное поддержание рН на уровне 4,5-6,0; интенсивную аэрацию среды (на уровне 0,30-0,56 ммоль Ог/л/мин) и содержание глицерина в среде от 20 до 40 г/л.

3. Показано, что при росте на глицерин-содержащих отходах природный штамм Y. lipolytica 704 продуцирует примерно равные количества ЛК и ИЛК. При росте на глицерине доля ИЛК гораздо меньше. Преимущественного синтеза ЛК удалось добиться с применением мутантов Y. lipolytica N 15 и Y. lipolytica А-101-1.22.

4. Биосинтез лимонных кислот биохимически охарактеризован. Высокая активность цитратсинтазы и резко сниженная,активность аконитат-гидратазы приводит к преимущественному синтезу Л К у мутанта Y. lipolytica N 15, в то время как достаточно высокая активность аконитат-гидратазы при низкой активности НАД-изоцитратдегидрогеназы приводит к экскреции как ЛК, так и ИЛК у природного штамма.

5. В условиях периодического культивирования Y. lipolytica достигнуты высокие концентрации ЛК в среде (110 г/л), но вместе с тем показано, что этот способ культивирования имеет ограниченную продолжительность. Впервые показана принципиальная возможность продолжительного синтеза ЛК из глицерин-содержащих отходов с использованием мембранного модуля.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная в литературном обзоре информация свидетельствует о том, что в последние десятилетия в связи с удорожанием нефтепродуктов и ухудшением экологической обстановки резко возрос интерес к использованию альтернативных источников топлива, получаемых из растительного сырья, таких как биодизельное топливо. В странах Евросоюза биодизельное топливо начало производиться с 1992 г. К концу первой половины 2008 г. в странах ЕС было построено 214 заводов по производству биодизельного топлива суммарной мощностью 16 млн. тонн биодизеля в год. На конец 2010 г. в странах ЕС работало 245 заводов по производству биодизеля суммарной мощностью 22 млн. тонн (European Biodiesel Board press release, 2010).

Побочным продуктом производства биодизельного топлива является! технический глицерин; на каждую тонну произведенного биодизеля накапливается 100 кг технического глицерина. Вопрос утилизации глицерин-содержащих отходов занимают одну из ключевых позиций в организации экологически безопасного и экономически эффективного производства биодизельного топлива. Технический глицерин состоит из 70-80%-ного водного раствора глицерина, остатков масла и свободных жирных кислот. Сам по себе он ценности не представляет, но может служить как источник углерода для микробиологического получения практически значимых соединений.

Наибольший интерес представляет ЛК. Из 1 млн. 400 тыс. тонн ЛК, производимой ежегодно в мире, 70% кислоты используется в пищевой промышленности и в производстве напитков, 18% в виде цитрата натрия — для изготовления экологически чистых CMC. Ежегодный прирост производства ЛК в 3-5% определяется использованием цитрата натрия при производстве CMC.

Цель настоящей работы заключалась в изучении закономерностей биосинтеза ЛК из глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива у дрожжей Y. lipolytica, способов/управления их биосинтетической активностью и разработке на этой основе эффективных методов получения ЛК.

В результате исследований впервые показана возможность практического использования глицерин-содержащих отходов для получения ЛК дрожжами Y. lipolytica; подобраны условия культивирования, обеспечивающие, максимальное накопление ЛК в качестве основного продукта. На основании анализа физиолого-биохимических особенностей процесса созданы научные основы технологии получения ЛК. Показано, что процесс можно осуществлять как с природным, так и мутантными штаммами дрожжей.

При этом культивирование можно проводить в трех различных режимах: периодическом, непрерывном с использованием мембранного модуля и отьемно-доливном.

В таблице 19 представлены.различные методы культивирования с использованием трех изучаемых штаммов в сравнении с имеющимися технологиями, разработанными в других лабораториях США, Греции и Польши. Результаты настоящей работы сопоставимы с лучшими результатами, представленными в литературе.

В периодическом режиме удалось достичь преимущественного синтеза JIK с высокими значениями производительности ферментера и выхода с использованием мутантов 7. lipolytica N 15 и 7. lipolytica А-101-1.22. К 144 ч накопление дрожжами 7. lipolytica N 15 JIK, соотношение ЛК:ИЛК, Сдк и Удк составляли 71,0 г/л, 12,7:1, 1,14 г ЛК/л-ч и 90% соответственно. При культивировании Y. lipolytica А-101-1.22 в культуральной жидкости накапливалось 112,0 г/л ЛК, соотношение ЛК:ИЛК составляло 15,8:1. Для сравнения, Y. lipolytica NRRL YB-423 синтезировали 21,6 г/л ЛК с выходом 54 % (Levinson et al., 2007), a Y. lipolytica ACA-DC 50109 - 62,5 г/л ЛК с выходом 56% (Papanikolaou et al., 2002; 2008). В работе польских ученых (Rywinska et al., 2009) мутант 7. lipolytica Wratislavia AWG7 синтезировал 131, 5 г/л ЛК при соотношении ЛК:ИЛК= 29:1, однако выход был ниже (66%) в сравнении с мутантом 7. lipolytica N 15.

Проведено детальное изучение физиологии процесса кислотообразования в периодическом режиме и установлено, что синтез ЛК имеет ограниченную продолжительность. В настоящей работе для продолжительного биосинтеза ЛК и увеличения эффективности процесса успешно применены методы с использованием полупроницаемой мембраны с целью удержания биомассы продуцента и метод отъемов-доливов.

Использование мембранного модуля дает возможность непрерывно удалять, образующийся продукт, что особенно важно при его ингибирующем воздействии на продуцент. Культивирование 7. lipolytica А-101-1.22 в мембранном« биореакторе позволило продлить активный синтез ЛК до 300 ч, в течение этого периода-концентрация ЛК поддерживалась на высоком уровне (96-107 г/л), а выход продукта и производительность ферментера составляли 64% и 1,42 г ЛК/л-ч соответственно. С другими штаммами Y. lipolytica Wratislavia 1.31 и Y. lipolytica Wratislavia AWG7 (Rywinska, Rymowicz, 2010) были получены аналогичные результаты: активный синтез ЛК (96-112 г/л) наблюдался в течение продолжительного времени (более 500 ч).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фатыхова, Алина Ринатовна, Пущино

1. Андреева Е.А., Лирова С.А., Перевезенцев В.ГТ. Влияние величины рН на свойства хемостатной культуры Candida utilis //Прикл. биохим. микробиол. 1975. Т. 11. № 3. С. 317-321.

2. Арзуманов■ Т.Е. Биосинтез лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica. Дисс. канд. биол. наук, Пущино: ИБФМ РАН. 1998.

3. Василов Р.Г. Перспективы развития производства биотоплива в России. Сообщение 1: Биодизель // Вестник биотехнологии. 2007. Т. 3. № 1. С. 47-54.

4. Глазунова Л.М., Финогенова Т.В. Активность ферментов цитратного, глиоксилатного и пентозофосфатного циклов при синтезе лимонных кислот Candida lipolytica И Микробиология. 1976. Т. 35. № 3. С. 444-449.

5. Дебабов В.Г. Биотопливо // Биотехнология. 2008. № 1. С. 3-14.

6. Дедюхина Э.Г., Ерошин В.К. Регуляция синтеза липидов дрожжами в условиях непрерывного культивирования // Усп. микробиол. 1984. С. 19.

7. Ермакова И.Т. Условия и механизм биосинтеза а-кетоглутаровой кислоты при росте дрожжей Candida lipolytica на н-алканах. Автореферат дисс.канд. биол. наук, Пущино: ИБФМ АН СССР: 1970.

8. Ермакова И.Т., Ермоленко Е.А., Финогенова Т.В. Биосинтез а-кетокислот тиаминауксотрофными дрожжевыми организмами при использовании различных источников углерода // Прикл. биохим. микробиол. 1986. Т. 22. №. 3. С. 341-347.

9. Ермакова И.Т., Мандева Р.Д. Экскреция метаболитов дрожжами родов Torulopsis, Pichia, Debariomyces, Hansenula при лимитировании их роста источниками N, Р, S или Mg//Микробиология. 1981. Т. 50. №4. С. 476-481.

10. П.Ермакова И.Т. Определение активности карбоксилирующих ферментов в клетках Candida lipolytica при росте на глюкозе и гексадекане // Микробиология. 1985. Т. 54. В. 4. С. 572-576.

11. Жаболовская Н.А., Агеев Л.М., Петрова Л.Ф. Сравнительная оценка методов количественного определения* лимонной кислоты // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 1968. № 5. С. 22-24.

12. Залашко М.В. Биосинтез липидов дрожжами. Минск: наука и техника, 1971. С. 34-84.

13. Звягильская P.A., Котельникова A.B. Структура и функциональная активность дрожжевых митохондрий // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Биологическая химия. 1991. Т. 36. 172 с.

14. Зякун A.M., Муслаева И.Н., Ашин В.В., Пешенко В.П., Аданин В.М., Машкина Л.П., Матяшова Р.Н., Финогенова Т.В. Гетеротрофная фиксация углекислоты Candida lipolytica и ее роль в биосинтезе лимонной кислоты // Микробиология. 1992. Т. 61. № 4. С. 561-570.

15. Илларионова В.И., Финогенова Т.В., Глазунова Л.М. Изучение влияния условий культивирования на образование лимонной и изолимонной кислот Candida lipolytica на среде с гексадеканом // Прикл. биохим. микробиология. 1975. Т. 11. С. 172-178.

16. Илларионова В.И. Синтез лимонной и изолимонной кислот алкан-окисляющими дрожжами Candida lipolytica II Автореферат дисс.канд. биол. наук. Пущино: ОНТИ НЦБИАН СССР. 1977.

17. Камзолова C.B. Биосинтез лимонных кислот дрожжами Yarrowia lipolytica N 1 из этанола в условиях непрерывного культивирования. Дисс.канд. биол. наук, Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН. 1995.

18. Камзолова C.B., Финогенова Т.В., Лунина Ю.Н., Перевозникова O.A., Миначова Л.Н., Моргунов И.Г. Особенности роста на рапсовом масле и синтеза лимонной и изолимонной кислот у дрожжей Yarrowia lipolytica II Микробиология. 2007. T. 76. № 1. С. 26-32.

19. Карклиньш Р.Я., Пробок A.K. Биосинтез органических кислот. Рига, 1972. 200 с.

20. Карклиньш Р.Я., Лиепиньш Г.К. Микробный биосинтез лимонной кислоты. Рига: Зинатне, 1993. 239 с.

21. Катаева И.А., Ермакова И.Т., Финогенова^ Т.В. Активности тиаминзависимых ферментов у дрожжей Candida lipolytica при росте на глюкозе в условиях избытка и недостатка тиамина// Микробиология. 1986. Т. 55. В. 4. С. 559-563.

22. Козлова Т.М., Медведева Г.А., Глазунова Л.М., Финогенова. Т.В. О структурных изменениях клеток Candida lipolytica при биосинтезе лимонной кислоты // Микробиология. 1982. Т. 51. С. 508-514.

23. Коротченко Н.И., Самохина О.В. Влияние концентрации магния в культуральной среде на потребление дрожжами микроэлементов // Прикл. биохим. и микробиол. 1975. Т. 2. №6. С. 873-875.

24. Крылова Н.И. Пути физиологического регулирования содержания и состава липидов у дрожжей. Дисс.канд. биол. наук, Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР. 1984.

25. Кулаковская Т.В., Матяшова Р.Н., Шишканова Н.В., Финогенова Т.В., Окороков Л. Изменение транспортных активностей вакуолей дрожжей Yarrowia lipolytica в процессе роста на глюкозе // Микробиология. 1993. Т. 62. В. 4. С. 647-653.

26. Лозинов А.Б., Финогенова Т.В. Микробиологический синтез органических кислот из углеводородов нефти // Журнал ВХО им. Д.И.Менделеева. 1972. Т. 17. С. 526-532.

27. Лозинов А.Б., Финогенова Т.В., Глазунова Л.М., Илларионова В.И. Лимитирование роста культуры Candida lipolytica и сверхсинтез некоторых метаболитов // Микробиология. 1974. Т. 43. В. 5. С. 786-790.

28. Лозинов А.Б., Глазунова Л.М., Ермакова И.Т. Активность ферментов нитратного, глиоксилатного и пентозофосфатного циклов при росте дрожжей на гексадекане и глюкозе // Микробиология. 1976. Т. 35. С. 33-39.

29. Мандева Р.Д. Сверхсинтез метаболитов при лимитировании роста дрожжевых культур. Дисс.канд. биол. наук, Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН. 1981.

30. Матяшова Р.Н. Влияние концентрации растворенного в среде кислорода на рост и дыхание дрожжевых организмов и бактерий рода Pseudomonas. Автореферат дисс. канд. биол. наук, Пущино: ИБФМ АН СССР. 1978.

31. Моргунов И.Г. Пути биосинтеза кетокислот из глицерина у дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica. Дисс.канд. биол. наук, Пущино: ИБФМ РАН. 1994.

32. Моргунов И.Г. Метаболическая организация дрожжей Yarrowia lipolytica -продуцентов органических кислот. Дисс.док. биол. наук, Пущино: ИБФМ РАН. 2009.

33. Пескова Е.Б., Шарышев A.A., Финогенова Т.В. Исследование внутриклеточной организации азотного метаболизма у дрожжей Yarrowia lipolytica и Candida maltosa II Прикл. биохим. и микробиол. 1996. Т. 32. С. 421-426.

34. Плетнев М.Ю. Отход производства биодизеля как источник продуктов с высокой добавленной стоимостью // Биотехнология. 2009. № 1. С. 3-10.

35. Рачинский В.В., Тукан Л.И. Влияние концентрации фосфора и азота в питательной среде на потребление фосфора углеводород-окисляющими дрожжами Candida tropicalis //Прикл. биохим. и микробиол. 1973. Т. 9. № 6. С. 818-823.

36. Сахарова З.Р., Работнова И.Л. Физиолого-биохимические свойства хемостатной культуры Bacillus megaterium при различных значениях pH // Микробиология. 1977. Т. 46. В. 4. С. 15-22.

37. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. 345 с.

38. Смирнова З.С., Рябчук В.А., Гавриленко С.А. Влияние условий культивирования на содержание и аминокислый состав белка метанотрофных бактерий // Прикл. биохим. микробиол. 1982. Т. 18. В. 1. С. 23-29.

39. Солодовникова Н.Ю. Роль нуклеотидов в регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот у дрожжей Yarrowia lipolytica. Дисс.канд. биол. наук, Пущино: ИБФМФАН. 1998.

40. Соколов Д.М., Солодовникова Н.Ю., Шарышев А.А., Финогенова Т.В. Роль НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы в биосинтезе лимонной кислоты у дрожжей // Прикл. биохим. микробиол. 1995. Т. 31. № 3. С. 315-320.

41. Соколов Д.М., Солодовникова Н.Ю., Шарышев А.А., Финогенова Т.В. Роль фосфофруктокиназы в регуляции синтеза лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica // Прикл. биохим. микробиол. 1996. Т. 32. С. 315-319.

42. Султанович Ю.А., Нечаев А.П., Барсукова И.А. Авторское свидетельство № 968072 СССР / Б.И. 1982. № 39. С. 136.

43. Трутко С.М., Матяшова Р.Н., Акименко В.К. Влияние деэнергизации и малата на процесс сверхсинтеза лимонных кислот у дрожжей Candida lipolytica II Микробиология. 1993. Т. 62. В. 6. С. 1032-1040.

44. Фаусек Е.А. Физиолого-биохимические особенности биосинтеза изолимонной кислоты дрожками из этанола // Автореферат дисс.канд. биол. наук, Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР. 1991.

45. Федоренко В.Ф. Состояние и развитие производства биотоплива: научный аналитический обзор / В.Ф. Федоренко, Ю.Л. Колчинский, Е.П. Шилова. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2007. 130 с.

46. Финогенова Т.В., Лозинов А.Б., Беликов В.М., Ермакова И.Т., Мунтян Л.Н., Сафонова Э.Н. Образование кетокислот парафинокисляющими дрожжами // Микробиология. 1968. Т. 37. В. 1.С. 38-43.

47. Финогенова Т.В., Мунтян Л.Н., Лозинов А.Б. Относительные потребности в тиамине дрожжей рода Candida, выращиваемых на углеводном и углеводородном питании // Микробиологический синтез. 1969. Т. 7. С. 26-30.

48. Финогенова Т.В., Илларионова В.И., Лозинов А.Б. Образование лимонных кислот дрожжами Candida lipolytica при росте на н-алканах // Микробиология. 1973. Т. 42. С. 790-794.

49. Финогенова Т.В. Биосинтез органических кислот дрожжевыми организмами и его регуляция. Дисс.док. биол. наук, Пущино: ИБФМ АН СССР. 1982.

50. Финогенова Т.В., Глазунова JT.M. Активность ферментов цитратного и глиоксилатного циклов при синтезе лимонной и изолимонной кислот различными штаммами Candida lipolytica//Микробиология. 1982. Т. 51. В. 1. С. 27-33.

51. Финогенова Т.В., Лозинов А.Б., Карклинь Р.Я. Получение'лимонной и изолимонной кислот с помощью дрожжей Candida lipolytica II Биосинтез оксикислот и кетокислот микроорганизмами. Рига, 1984. С. 18-26.

52. Финогенова Т.В., Карклинь Р.Я., Ермакова И.Т., Шишканова Н.В., Пелцмане И.Ж. Способ получения пировиноградной кислоты. Авторское свидетельство № 1249069. 1989.

53. Финогенова Т.В., Моргунов И.Г., Камзолова С.В., Чернявская О.Г. Перспективы производства органических кислот дрожжами Yarrowia lipolytica // Прикл. биохим. микробиол. 2005. Т. 41. № 5. с. 478-486.

54. Чернявская О.Г. Биосинтез 2-оксоглутаровой кислоты дрожжами при росте на этаноле.

55. Автореф. дисс.канд. биол. наук, Пущино: ИБФМ РАН. 1998.

56. Шишканова Н.В. Получение мутантов дрожжей Candida lipolytica 704 // Прикл. биохим. микробиол. 1979. Т. 15. №. 4. С. 555-559.

57. Ahmed S.A., Smith J.E., Anderson J.G. Mitochondrial activity during citric acid production by Aspergillus niger I/ Trans. British. Microbiol. Biotechnol. 1972. V. 59. P. 51-61.

58. Akiyama S. Fermentative production of citric acid from n- paraffins // J. Japan. Oil Chemists Soc. 1974. V. 23. P. 438-444.

59. Akiyma S.I., Suzuki Т., Sumino Y., Nakao Y., Fukuda H. Induction and citric acid productivity of fluoroacetate-sensitive mutant strains of Candida lipolytica // Agric. Biol. Chem. 1973a. V. 37. № 4. P. 879-884.

60. Akiyma S.I., Suzuki Т., Sumino Y., Nakao Y., Fukuda H. Relationship between aconitase hydratase activity and citric acid productivity in fluoroacetate-sensitive mutant strain of Candida lipolytica I/ Agric. Biol. Chem. 1973b. V. 37. № 4. P. 885-888.

61. Anastassiadis S., Aivasidis A., Wandrey C. Fermentationsverfahren zur kontinuierlichen Citronensauregewinnung (Process for the continuous production of citric acid by fermentation), German Patent № P 43 17 488.4-09. 1993.

62. Anastassiadis S. Zymotiki methodos gia tin sinechi paragogi tou kitrikou oxeos; Process for the continuous production of citric acid by fermentation. Greek Patent № 940100098. 1994.

63. Anastassiadis S., Aivasidis A., Wandrey C. Fermentationsverfahren zur kontinuierlichen Citronensauregewinnung (Process for the continuous production of citric acid by fermentation). Austrian Patent № 473/94. 1994.

64. Anastassiadis S., Wandrey C. Process for the continuous production of citric acid by fermentation // US Patent № 08/208,123. 2001.

65. Anastassiadis S., Aivasidis A., Wandrey C. Citric acid production by Candida oleophila under intracellular nitrogen limitation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 60. № 1. P. 81-87.

66. Anastassiadis S., Rehm H.J. Continuous citric acid secretion by a high specific pH dependent active transport system in yeast Candida oleophila ATCC 20177 // Electronic J Biotechnol. 2005. V. 8. №2. P. 147-162.

67. Anastassiadis S., Aivasidis A., Wandrey C. Continuous citric acid fermentation by Candida oleophila under nitrogen limitation at constant C/N ratio // World J. Microbiol. Biotechnol. 2005. V. 21. № 5. P. 125-131.

68. Anastassiadis S., Rehm H.J. Citric acid production from glucose by yeast Candida oleophila ATCC 20177 under batch, continuous and repeated batch cultivation // Electronic J. Biotechnol. 2006. V. 9. № 1. P. 26-39.

69. Anastassiadis S., Morgunov I.G., Kamzolova S.V., Finogenova T.V. Citric acid production patent review // Recent Pat Biotechnol. 2008. V. 2. № 2. P. 107-123.

70. Anfinsen Ch.B. Akonitase from pig heart muscle // In: Methods in enzymology. Eds. Colowics S.P., Kaplan N.O., N.Y. L.: Acade. Press. 1955. V.l. P. 695-698.

71. Aoki M., Pastore G., Park Y. Microbial transformation of sucrose and glucose to erythritol // Biotechnol. Lett. 1993. V. 15. P. 383-388.

72. Arzumanov T.E., Shishkanova N.V., Finogenova T.V. Biosynthesis of citric acid by Yarrowia lipolytica repeated-batch culture on ethanol // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. V. 53. № 5. P. 525-529.

73. Arzumanov T.E., Sidorov I.A., Shishkanova N.V., Finogenova T.V. Mathematic modeling of citric acid production by repeated-batch culture // Enzyme Microb. Technol. 2002. V. 26. № 9. P. 826-833.

74. Ashkan T. N., Adeli M., Vossoughi M. Synthesis of gold nanopartiele necklaces using linear-dendritic copolymers // European Polymer Journal. 2010. V. 48. № 2. P. 165-170.

75. Babel W., Hofmann K.H. The relation between the assimilation of methanol and glycerol in yeast//Arch. Microbiol. 1982. V. 132. P. 179-184.

76. Bae S., Park L.-O. US Patent № 20077163919. 2007.

77. Bal'A M. F. A., Marshall D. L. Organic acid dipping of catfish fillets: Effect on color, microbial load and Listeria monocytogenes II Journal of Food Protection. 1998. V.ll. P. 1470-1474.

78. Bannat I.M., Makkar R.S., Cameotra S.S. Potential commercial application of microbial surfactants // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. V. 53. P. 495-508.

79. Barbirato F., Chedaille D., Bories A. Propionic acid fermentation from glycerol: comparison with conventional substrates // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997a. V. 47. P. 441-446.

80. Barbirato F., Himmi E.H., Conte T., Bories A. 1,3-Propanediol production by fermentation: an interesting way to valorize glycerin from the ester and ethanol industries // Ind Crops Prod. 1998. V. 7. P. 281-289.

81. Barth G., Gaillardin C. Yarrowia lipolytica I I Nonconventional Yeasts in Biotechnology. Berlin: Springer, 1996. P. 313-388.

82. Barth G., Gaillardin C. Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica // FEMS Microbiology Reviews. 1997. V. 19. P. 219-237.

83. Bauer R., Katsikis N., Varga S., Hekmat D. Study of the inhibitory effect of the product dihydroxyacetone on Gluconobacter oxydans in a semi-continuous two-stage repeated-fed-batch process // Bioprocess Biosyst. Eng. 2005. V. 5. P. 37-43.

84. Behrens U., Weissbrodt E, Lehmann W. Zur Kinetik der Citroncns urebildung bei Candida lipolytica H Zeitschrift fur Allgemeine Mikrobiologie. 1978. V. 18. № 8. P. 549-558.

85. Bercovitz A., Peleg Y., Battat E., Rokem J.S., Goldberg I. Localization of pyruvate carboxylase in organic acid-producing Aspergillus strains II Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. №6. P. 1594-1597.

86. Biebl H. Fermentation of glycerol by Clostridium pasteurianum — batch and continuous culture studies // J Ind. Microbiol. Biotech. 2001. V. 27. P. 18-26.

87. Bognolo G. Biosurfactant as emulsifying agents for hydrocarbons // Colloids Surf A. 1999. V. 152. P. 41-52.

88. Bories A., Claret C., Soucaille P. Kinetic study and optimisation of the production of dihydroxyacetone from glycerol using Gluconobacter oxydans II Process Biochem. 1991. V. 26. P. 243-248.

89. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248254.

90. Braun T., Philippsen A., Wirtz S., Borgnia M.J., Agre P., Kuhlbrandt W., The 3.7 A projection map of the glycerol facilitator GlpF: a variant of the aquaporin tetramer // EMBO Rep. 2000. V. 11. P. 183-189.

91. Briffaud J., Engasser M. Citric acid production from glucose. I. Growth and excretion kinetics in a stirred fermentor // Biotcchnol. Bioeng. 1979. V. 21. P. 2083-2092.

92. Burkholder P.R., Mc Veigh J., Moyer D. Vitamin deficiencies in yeast // J. Bacterid. 1944. V. 48. P. 385-389.

93. Burrill G.S. Industrial and Marine Biotechnology: Biotech. Burrill&Company, 2007.

94. Carole T.M., Pellegrino J., Paster M.D. Opportunities in the industrial biobased products industry // Appl. Biochem. Biotechnol. 2004. V. 113-116. P. 872-885.

95. Chang H.N., Chung B.H. US Patent № 4910139. 1990.

96. Cervantes-Chavez J. A., Kronberg F., Passeron S., Ruiz-Hcrrera J. Regulatory role of the PKA pathway in dimorphism and mating in Yarrowia lipolytica II Fungal Genet. Biol. 2009. V. 46. P. 390-399.

97. Cheng K.K., Liu D.H., Sun Y., Liu W.B. 1,3-propanediol production by Klebsiella pneumonia under different aeration strategies // Biotechnol. Lett. 2004. V. 26. P. 911-915.

98. Chi Z., Pyle D., Wen Z., Frear C., Chen S. A laboratory study of producing docosahexaenoic acid from biodicsel-waste glycerol by microalgal fermentation // Process Biochem. 2007. V. 42. P. 1537-1545.

99. Christopher H. S., Xuetong F., Hand A. P., Kimberly B. S. Effect of citric acid on the radiation resistance of Listeria monocytogenes and frankfurter quality factors // Meat Sciencc. 2003. V. 63. P. 407-415.

100. Claret C., Salmon J.M., Romieu C., Bories A. Physiology of Gluconobacter oxydans during dihydroxyacetone production from glycerol // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 41. P. 359-365.

101. Cleland W.W., Johnson M.J. Tracer experiments on the mechanism of citric acid formation by Aspergillus niger II J. Biol. Chem. 1954. V. 208. P. 679-692.

102. Courtright J.B. Different rates of synthesis of glycerolkinase and. glycerophosphate dehydrogenase in Neurospora crassa during induction // Arch. Biochem. Biophys. 1975b. V. 167. P. 34-44.

103. Crolla A., Kennedy K.J. Fed-batch production of citric acid by Candida lipolytica grown on n-paraffins // J. Biotechnol. 2004. V. 110. № 1. P. 73-84.

104. Darbon E., Ito K., Huang H.S., Yoshimoto T., Poncet S., Deutscher J. Glycerol transport and phosphoenolpyruvate-dependent enzyme I- and Hpr-catalyzed phosphorylation of, glycerol kinase in-Thermus flavus // Microbiology. 1999. V. 145. P. 3205-3212.

105. Dawson P.S.S., Graig B.M. Lipids of Candida utilis: changes with growth // Can. J. Microbiol: 1966. V. 12. P. 775-785.

106. Demain A.L. Regulatory mechanisms and the industrial production of microbial metabolites // Lloydia. 1968. V. 31. P. 395-418.

107. Denor P.F., Courtright J.B. Genetic and enzymatic characterization of the inducible glycerol' dissimilatory system of Neurospora crassa//3 Bacteriol. 1982. V. 151. № 2. P. 912-917.

108. Dharmadi Y., Murarka A., Gonzalez R. Anaerobic fermentation of glycerol by Escherichia coli: a new platform for metabolic engineering // Biotechnol. Bioeng. 2006. V. 94. P. 821829.

109. Dilara O., Wayne P. Fungal1« generation of organic acids for removal of lead from contaminated soil // Water, Air, and Soil Pollution. 2007. V. 179. P. 365-380.

110. Dixon G.H., Kornberg H.L. Assay methods for key enzymes of the glyoxylate cycle // Biochem. J. 1959. V. 72. P. 3.

111. Enzminger J.D., Asenjo J.A. Use of cell recyclc in the aerobic fermentative production of citric acid by yeast // Biotechnol. Lett. 1986. V. 8. № 1. P. 7-12.

112. Erickson L.E., Minkevich I.G., Eroshin V.K. Application of mass and energy balance regularities in fermentation // Biotechnol. Bioeng. 2000. V. 67. P. 748-774.

113. European Biodiesel Board Press release. EU biodiesel production growth hits record high in 2005. EBB publishes annual biodiesel production statistics. 2006. Available in http://www.ebb- eu.org/stats.php.

114. Evans C.T., Ratledge C. The physiological significance of citric acid in the control of metabolism in lipid-accumulating yeasts // Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 1985c. P. 85-111.

115. Evans C.T., Scragg A.H., Ratledge C. Regulation of citrate efflux from mitochondria of oleaginous and non-oleaginous yeasts by adenine nucleotides // Eur. J. Biochem. 1983. V. 132. P. 609-615.

116. Fickers P., Benetti P.H., Wache Y., Marty A., Mauersberger S., Smit M.S., Nicaud J.M: Hydrophobic substrate utilisation by the yeast Yarrowia lipolytica ■ and its potential applications // FEMS Yeast Res. 2005. V. 6-7. P. 527-543.

117. Finogenova T.V., Shishkanova N.V., Fausek E.A., Ercmina C.C. Biosynthesis of isocitric acid from cthanolby yeast//Appl: Mikrobiol. Biotechnol. 1991. V. 36. P. 231-235.

118. Finogenova T. V., Morgunov I. G., Kamzolova S. V., Chernyavskaya O. G. Organic acid production by the yeast« Yarrowia lipolytica: a review of prospects // Appl; Bioch. Microbiol. 2005. V. 41-P. 418-425.

119. Francisco M. Eco-friendly jet fuel //Nature Biotechnology. 2007. V. 25. P. 959.

120. Forage R.G., Lin C.C. System mediating aerobic and anaerobic dissimilation of glycerol in Klebsiella pneumoniae NCIB 418 // J Bacteriol. 1982. V. 151. P. 591-599.

121. Fu D., Libson A., Miercke L.J.W., Weitzman C., Nollert P., Krucinski J. Structure of a glycerol conducting channel and the basis for its selectivity // Science. 2000. V. 290. P. 481—486.

122. Fujitani T. Biochemical studies on the mineral components in sake yeast, p III. The basal contents of phosphorus and magnesium in the yeast cells. As a factor controlling the growth // Agr. Biol. Chem. 1966. V. 30. № 6. P. 558-567.

123. Fujitani T. Biochemical studies on the mineral components in sake yeast, p II. The requirements of phosphorus potassium and magnesium by the yeast // Agr. Biol. Chem. 1965. V. 29. № 5. P. 477-485.

124. Furukawa T., Matsuyoshi T., Minoda Y., and Yamada K. Fermentative production of citric acid from n-paraffins by yeast // Journal of Fermentation Technology. 1977. V. 55. P. 356363.

125. Forster A. Citric acid production from sucrose using Sl recombinant strain of the yeast Yarrowia lipolytica II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 75. P. 1409-1417.

126. Gancedo C., Gancedo J.M., Sols A. Glycerol metabolism in yeast // Eur. J. Biochem. 1968. V. 5. P. 165-172.

127. Gancedo C., Llobell A., Ribas J.-C., Luchi F. Isolation and characterization of mutants from Shyzosaccharomyces pombe defective in glycerol catabolism // Eur. J. Biochem. 1986. V. 159. P. 171-174.

128. Gill C.O., Hall M.J., Ratledge C. Lipid accumulation in an oleaginous yeast (Candida 107) growing on glucose in single-stage continuous culture // Appl. Environ. Microbiol. 1977. V. 33. P. 231-239.

129. Gledhill W.E., Hill I.D., Hodson P.H. Citrate production from hydrocarbons,by use of a nonsterile, semicontinuous cell recycle system // Biotechnol. Bioeng. 1973. V. 15. P. 963972.

130. Goldberg D.M, Ellis G. Isocitrate dehydrogenase. In: Bergmeyer HU, editor. Methods of Enzymatic Analysis. Ed 3. New York: Academic Press; 1983. P. 183-190.

131. Goldemberg J: Ethanol for a sustainable energy future // Science. 2007. V. 315. P.* 808-810.

132. Good D.W., Droniuk R., Lawford R.G., Fein J.E. Isolation and characterisation of a Saccharomycopsis lipolytica mutant showing increased production of CA from canola oil // Can. J. Microbiol. 1985. V. 31. P. 436 440.

133. Grcwal H.S., Kalra K.L. Fungal production of citric acid// Biotechnol. Adv. 1995. V. 13. P. 209-234.

134. Grotjohann N., Huang Y., Kowallik W. Tricarboxylic acid cycle enzymes of the ectomycorrhizal basidiomycete, Suillus bovines // Z Naturforsch. 2001. V. 56. P. 334-342.

135. Guillermo A., Jian Y., Ryan H. New biodegradable biocompatible citric acid nano polymers for cell culture growth and implantation engineered by Northwestern University Scientists. Nano patents and innovations, US Patent Application 20090325859. 2010.

136. Gustafsson L. The ATP pool in relation to the production of glycerol and heat during growth of the halotolerant yeast Debaryomyces hansenii //Arch. Microbiol. 1979. V. 126. P. 15-23.

137. Gunzel B., Yonsel S., Deckwer W.D. Fermentative production of 1,3-propanediol from glycerol by Clostridium butyricum up to a scale of 2 m3 // Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 6. P. 289-294.

138. Dhillon G.S., Brar S.K., Verma M., Tyagi, R.D. Recent advances in citric acid bioproduction and recovery // Food Bioprocess. Tech. 2010. DOI: 10.1007/sl 1947-010-03990.

139. Hattori K., Hakko K., Imada O. Effect of ammonium ion on the ratio of citric acid to d-isocitric acid formed from n-paraffin // Journal of Fermentation Technology. 1974. V. 52. № 8. P. 542-550.

140. Hattori K. Suzuki T. Microbial Production of D-arabitol by n-alkane-grown Candida tropicalis // Agric. Biol. Chem. 1974. V. 38. P. 1875-1974.

141. Hao J., Xu F., Liu H., Liu D. Downstream processing of 1,3-propanediol fermentation broth //J Chcm. Technol. Biotcchnol. 2006. V. 81. P. 102-108.

142. Hekmat D., Bauer R., Fricke J. Optimization of the microbial synthesis of dihydroxyacctone from glycerol with Gluconobacter oxydans // Bioprocess Biosyst. Eng. 2003. V. 26. P. 109116.

143. Heller K.B., Lin E.C.C., Wilson T.H. Substrate specificity and transport properties of the glycerol facilitator of Escherichia coli IIJ Bacteriol. 1980. V. 144. P. 274-278".

144. Heretsch P., Thomas F., Aurich A., Krautscheid H., Sicker D., Giannis A. Syntheses with a chiral building block from the citric acid cycle: isocitric acid by fermentation of sunflower oil // Angew Chem. Int. Ed. Engl. 2008. V. 47. P. 1958-1960.

145. Himmi E.H., Bories A., Barbirato F. Nutrient requirements for glycerol conversion to 1,3-propanediol by Clostridium butyricum II Bioresour Technol. 1999. V. 67. P. 123-128.

146. Himmi E.H, Bories A., Boussaid A, Hassani L. Propionic acid fermentation of glycerol and glucose by Propionibacterium acidipropionici and Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. V. 53. P. 435-440.

147. Himmel M.E., Ding S-Y., Johnson D.K., Adney W.S., Nimlos M.R., Brady J.W. Biomass recalcitrance: Engineering plants and enzymes for biofuels production // Science. 2007. V. 315. P. 804-807.

148. Hoffmann K. Assimilation and akkumulation von glycerol durch hefen und scimmelpilze // Biol. Rdsch. 1983. V. 21. P. 265-276.

149. Holz M., Forster A., Mauersberger S., Barth G. Aconitase overexpression changes the product ratio of citric acid production by Yarrowia lipolytica II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. V. 81. № 6. P. 1087-1096.

150. Holdsworth. J., Ratledge C. Lipid turnover in oleaginous yeasts // J. Gen. Microbiol. 1988. V. 134. P.339-346.

151. Hossack J.A., Rose A.H., Dawson P.S.S. Changes in the lipid composition of Candida utilis during the cell cycle // J. Gen. Microbiol. 1979. V. 113. P. 199-202.

152. Ikeno Y., Masuda Y.M., Tanno K., Oomori I., Takahashi N. Citric acid production from various raw materials by yeasts // J/Fermentat. Technol. 1975. V. 53. P.752-756.

153. Imandi S.B., Bandaru V.V.R., Somalanka S.R., Garapati H.R. Optimization of medium constituents for the production of citric acid from byproduct glycerol, using Doehlert experimental design// Enzyme Microb. Technol. 2007. V. 40. P. 1367-1372.

154. Jagannathan V., Singh K. Carbohydrate metabolism on citric acid fermentation. The glycolitic enzymes of Aspergillus niger // Enzymologia. 1953. V. 16. P. 150-156.

155. Johnson D.T., Taconi K.A. The glycerin glut: options for the value-added conversion of crude glycerol resulting from biodiesel production // Environmental Progress. 2007. V. 26. P. 338-348.

156. Jones R. Biological principles for the effects of ethanol // Enzyme Microb. Technol. 1989. V. 11.№ 1. P. 130-151.

157. Kamzolova S.V., Shishkanova N.V., Morgunov I.G., Finogenova T.V. Oxygen requirements for growth and citric acid production of Yarrowia lipolytica II FEMS Yeast Res. 2003. V. 3. № 2. P. 217-222.

158. Kamzolova S.V., Finogenova T.V., Morgunov I.G. Microbiological production of citric and isocitric acids from sunflower oil // Food Technol. Biotechnol. 2008. V. 46. № 1. P. 51-59.

159. Karaffa L., Kubicek C.P. Aspergillus niger citric acid accumulation — do we understand this black box well? // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 61. P. 189 196.

160. Kawasse F.M., Amaral P.F., Rocha-Leao M.H.M., Amaral A.L., Ferreira E.C., Coelho M.A.Z. Morphological analysis of Yarrowia lipolytica under stress conditions through image processing // Bioprocess Biosyst. Eng. 2003. V. 25. P. 371-375.

161. Kets E.P.W., Galinski E.A., De Wit M., De Bont J.A.M., Heipieper H.J. Mannitol, a novel bacterial compatible solute in Pseudomonas putida II J. Bacterid. 1996. V. 178. P. 66656670.

162. Kim E.K., Ambriano J.R., Roberts R.S. Vigorous stationary phase fermentation // Biotechnol. Bioeng. 1987. V. 30. P. 805-908.

163. Kisser M., Kubicek C.P., Rohr M. Influence of manganese on morphology and cell-wall composition of Aspergillus niger during citric acid fermentation,// Arch. Microbiol: 1980. V. 128. P. 26-33.

164. Klingenberg M. Mitochondria metabolite transport // FEBS Lett. 1970. V. 6. № 3. P. 145154.

165. Kornberg A., Pricer W.EJ. Di and triphosphopyridine nucleotide isocitrate dehydrogenase in yeast//J. Biol. Chem. 1951. V. 189. P. 123-126.

166. Kristiansen B., Sinclair'C.G. Production of citric acid in continuous culture // Biotechnol. Bioeng. 1979. V. 21. P. 297-315.

167. Kubicek C.P., Rohr M. Influence of manganese on enzyme synthesis and citric acid accumulation in Aspergillus niger /7 Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1977. V. 4. P. 167173.

168. Kubicek C.P., Rohr M: The role of the tricarboxylic acid cycle in citric acid accumulation by Aspergillus niger //Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1978. V. 5. P. 263.

169. Kubicek C.P., Rohr M. Citric acid fermentation // CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1986. V. 3. P. 331-373.

170. Kubicek C.P., Schrefcrl-Kunar G., Wohrer W., Rohr M. Evidence for a cytoplasmic pathways of oxalate biosynthesis in Aspergillus niger // Appl. Environ. Microbiol. 1988. V. 54. P. 633-637.

171. La Nauze J.M. Aconitase and isocitric dehydrogenase of Aspergillus niger in relation to citric acid production // J. Gen. Microbiol. 1966. V. 44. P. 73-81.

172. Lages F., Silva-Graca M., Lucas C. Active glycerol uptake is a mechanism underlying halotolerance in yeasts: a study of 42 species // Microbiology. 1999. V. 145. № 9. P. 25772585.

173. Lages F., Lucas C. Contribution to the physiological characterization of glycerol active uptake in Saccharomyces cerevisiae II Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1322. № 1. P. 818.

174. Lee P.C., Lee W.G., Lee S.Y., Chang H.N. Succinic acid production with reduced byproduct formation in the fermentation of Anaerobiospirillum succiniciproducens using glycerol as a carbon source // Biotechnol. Bioeng. 2001. V. 72. P. 41—48.

175. Lcvinson W.E., Kurtzman C.P., Kuo T.M. Characterization of Yarrowia lipolytica and related species for citric acid production from glycerol // Enzyme Microb. Technol. 2007. V. 41. P. 292-295.

176. Lewis K.F., Weinhouse S. Studies on the mechanism of citric acid production in Aspergillus niger // J. Am. Chem. Soc. 1951. V. 73. P. 2500-2503.

177. Lin T.G.C. Glycerol dissimilation and its regulation in bacteria // Ann. Rev. Microbiol. 1976. V. 30. P. 535-578.

178. Lin T.G.C. Glycerol utilization and its regulation in mammals // Ann. Rev. Microbiol. 1977. V. 46. P. 765-768.

179. Lodder J. The yeasts, a taxonomic study. Amsterdam.: North Holland Published Company,1970. 1385 p.

180. Lockwood L.B. Organic acid production. In: The filamentous fungi Industrial mycology. Edward Arnold Ltd., London, 1975. V. 1. P. 140-157.

181. Mahler H. R., Cordes E. H. Biological Chemistry, 2nd edn., Harper and Row, New York.1971. P. 295-297.

182. Markham E., Byrne W.J. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. II. Limiting factors of yeast growth // J. Inst. Brew. 1967. V. 73. № 3. P. 271-273.

183. Makri A., Fakas S., Aggelis G. Metabolic activities of biotechnological interest in Yarrowia lipolytica grown on glycerol in repeated batch cultures // Bioresource Technology. 2010. V. 101. P. 2351-2358.

184. Marchal R., Chaude O., Metche M. Production of citric acid from n-paraffines by Saccharomycopsis lipolytica: kinetics and balance of the fermentation // Eur. J. Appl. Microbiol. 1977. V. 4. P. 111-123.

185. Matsuoka M., Ueda Y., Aiba S. Role and control of isocitrate lyase in Candida lipolytica II J. Bacteriol. 1980. V. 144. P. 692-697.

186. May J.W., Sloan J. Glycerol utilization by Schizosaccharomyces pombe: dehydrogenation as the initial step//J. Gen. Microbiol. 1981. V. 123. P. 183-185.

187. May J.W., Marshall J.H., Sloan J. Glycerol utilization by Schizosaccharomyces pombe: phosphorylation of dihydroxyacetone by specific kinase as the second step // J. Gen. Microbiol. 1982. V. 128. P. 1763-1766.

188. Meers J.L., Milsom P.E. Organic acids and amino acids. In: Basic Biotechnology, London: Academic Press. 1987. P. 359-383.

189. Menzel K., Zeng A.P., Deckwer W.D. High concentration and productivity of 1,3-propanediol from continuous fermentation of glycerol by Klebsiella pneumonia // Enzyme Microb. Technol. 1997. V. 20. P. 82-86.

190. Minkevich I.G. Mass-energy balance for- microbial product synthesis Biochemical and cultural aspects // Biotechnol. Bioeng. 1983. V. 25. P. 1267-1293.

191. Minkevich I.G., Eroshin V.K. Productivity and* heat generation of fermentation under oxygen limitation // Folia Microbiol. 1973. V. 18. P. 376-385.

192. Miyata K., Nagahisa M. Some properties of NAD-independent alpha-glycerophosphate dehydrogenase of yeast II Plant Cell Physiol. 1969* V. 10. P. 635.

193. Moresi M. Effect of glucose concentration on citric acid production by Yarrowia lipolytica //J Chem. Technol. Biotechnol. 1994. V. 60. № 4. P. 387-395.

194. Morgunov I.G., Kamzolova S.V., Perevoznikova O.A., Shishkanova N.V., Finogenova T.V. Pyruvic acid production by a thiamine auxotroph of Yarrowia lipolytica II Process Biochemistry. 2004. V. 39. P. 1469-1474.

195. Mu Y., Teng H., Zhang D.J., Wang W., Xiu Z.L. Microbial production of 1,3-propanediol by Klebsiella pneumoniae using crude glycerol biodiesel preparations // Biotechnol. Lett. 2006. V. 28. P. 1755-1759.

196. Netik A., Torres N.V., Riol J-M., Kubicek C.P. Uptake and export of citric acid by Aspergillus niger is reciprocally regulated by manganese ions // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1326. P. 287-294.

197. Nemeth A., Kupcsulik B., Sevella B. 1,3-Propanediol oxidoreductase production with Klebsiella pneumoniae DSM2026 // World J Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 19. P. 659663.

198. Nilsson A., Adler L. Purification and characterization of glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD+) in the salt-tolerant yeast Debaryomyces hansenii II Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1034. №2. P: 180-185.

199. Nitschke M., Costa S.G.V.A, Contiero J. Rhamnolipid surfactants: an update on the general aspects of these remarkable biomolecules // Biotechnol. Prog. 2005. V. 21. P. 1593-1600.

200. Nubel R., Fitts R., Findlay G. US Patent № 4155811. 1979.

201. Osmani S.A., Scrutton M.C. The subcellular localization of pyruvate carboxylase and of some other enzymes in Aspergillus nidulans //Eur. J. Biochem. 1983. V. 133. P. 551.

202. Pachauri N., He B. Value-added utilization of crude glycerol from biodiesel production: a survey of current research activities. 2006. ASABE Paper № 066223. ST. Joseph, Mich.: ASABE.

203. Pandey A., Soccol C.R., Rodriguez-Leon J.A., Nigam P. Production of organic acids by solid-state fermentation. In: Solid-State Fermentation in Biotechnology — Fundamentals and Applications, Asiatech Publishers Inc., New Delhi, India, 2001. P. 113-126.

204. Papanikolaou S., Ruiz-Sanchez P., Pariset B., Blanchard F., Fick M. High production of 1,3- propanediol from industrial glycerol by a newly isolated Clostridium butyricum strain // J Biotechnol. 2000. V. 77. P. 191-208.

205. Papanikolaou S., Chevalot I., Komaitis M., Mar I., Aggelis G. Single Cell Oil (SCO) production by Yarrowia lipolytica growing on an industrial derivative of animal fat in batch cultures // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58. P. 308-312.

206. Papanikolaou S., Aggelis G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture // Bioresource Technology. 2002. V. 82. P. 4344.

207. Papanikolaou S., Muniglia L., Chevalot L, Aggelis G., Marc I. Yarrowia lipolytica as a potential producer of citric acid from raw glycerol // Journal of Applied Microbiology. 2002. V. 92. P. 737-744.

208. Pavlik P., Simon M., Schuster T., Ruis H. The glycerol kinase (GUT1) gene of

209. Saccharomyces cerevisiae: cloning and characterization // Curr. Genet. 1993. V. 24. № 1. P. 21-25.

210. Petitdemange E, Dürr C., Abbad-Andaloussi S., Raval G. Fermentation of raw glycerol tp 1,3-propanediol by new strains of Clostridium butyricum H J. Ind. Microbiol. V. 15. P. 498502.

211. Ramaiah A. Pasteur effect and phosphofructokinase // Curr. Top. Cell. Regul. 1974. V. 8. P. 298-345.

212. Rane K.D., and Sims K. Oxygen uptake and citric acid production by Candida lipolytica Y 1095 // Biotechnol. Bioeng. 1994. V. 43. № 2. P. 131-137.

213. Rane K.D., Sims K. Citric acid production by Candida lipolytica Y 1095 in cell recycle and fed-batch fermenters // Biotechnol. Bioeng. 1995. V. 46. № 4. P. 325-332.

214. Rittmann D., Lindner S.N., Wendisch V.F. Engineering of a glycerol utilization pathway for amino acid production by Corynebacterium glutamicum II Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. P. 6216-6222.

215. Röhr M., Kubicek C.P. Regulatory aspects of citric acid fermentation by Aspergillus niger II Proc. Biochem. 1981. V. 16. P. 34-44.

216. Rose A.H. Production and industrial importance of secondary products of metabolism // In: Secondary products of metabolism. Ed. Rose A.H. Acad. Press. N.Y. London. San-Francisco. 1979. P. 1-34.

217. Ronnow B., Kielland-Brandt M.C. GUT2, a gene for mitochondrial glycerol 3-phosphate dehydrogenase of Saccharomyces cerevisiae H Yeast. 1993. V. 9. № 10. P. 1121-30.

218. Ruch F.E., Lengeier J., Lin C.C. Regulation of glycerol catabolism in Klebsiella aerogenes II J Bacteriol. 1974. V. 119. P. 50-56.

219. Ruiz-Herrera J., Sentandreu R. Different effectors of dimorphism in Yarrowia lipolytica II Arch. Microbiol. 2002. V. 178. P. 477-483.

220. Rymowicz W., Sobieszczanski J. Fermentation" kinetics of citric acid from glucose by Saccharomycopsis lipolytica A-101 // Folia-Microbiol. 1990. V. 34. № 5. P. 441.

221. Rymowicz W., Rywinska A., Zarowska B., Juszczyk P. Citric acid production from raw glycerol by acetate mutants of Yarrowia lipolytica II Chem. Pap. 2006. V. 60. P. 391-394.

222. Rymowicz W., Cibis E. Optimization of citric acid production from glucose syrup by Yarrowia lipolytica using response surface methodology // Electronic Journal of Polish Agricultural University, Biotechnology. 2006. V. 9. № 1. P. 20.

223. Rymowicz W., Rywinska A., G/adkowski W. Simultaneous production of citric acid and erythritol from crude glycerol by Yarrowia lipolytica Wratislavia K1 // Chem. Pap. 2008. V. 62. P. 239-246.

224. Rymowicz W., Rywinska A., Gtadkowski W., Simultaneous production of citric acid and erythritol from crude glycerol by Yarrowia lipolytica Wratislavia K1 // Chem. Pap 2008. V. 62. P. 239-246.

225. Rymowicz W., Rywinska A., Marcinkiewicz M. High-yield production of erythritol from raw glycerol in fed-batch cultures of Yarrowia lipolytica II Biotechnol. Lett. 2009. V. 31. P. 377-380.

226. Rywinska A., Rymowicz W. Citric acid production from raw glycerol by Yarrowia lipolytica Wratislavia 1.31 // Microbial Conversions of Raw Glycerol (Ed: G. Aggelis), Nova Science Publishers Inc., New York, 2009. P. 19-30.

227. Rywinska A., Rymowicz W., Zarowska B., Wojtatowicz M. Biosynthesis of citric acid from glycerol by acetate mutants of Yarrowia lipolytica in fed-batch' fermentation // Food Technol. Biotechnol. 2009. V. 47. P. 1-6.

228. Rywinska A., Rymowicz W. High-yield production of; citric acid by Yarrowia lipolytica on glycerol in repeated-batch bioreactors // J Ind. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 37. № 5. P. 431-435.

229. Rywinska A., Rymowicz W. Continuous production of citric acid from raw glycerol by Yarrowia lipolytica in cell recycle cultivation-// Chem. Papers. 2011. V. 65. № 2. P. 119123.

230. Shancaranand V.S., Lonsane B.K. // Process Biochemistry. 1994. V. 29. №1.P. 29-37.

231. Shimizu J., Ishii K., Nakajima Y. DE 2202701. 1973.

232. Smith J.E., Valenzuela-Perez J., Ng W.S. Changes in activities of the Embden-Meyergof-Parnas and pentose phosphate pathways during the growth cycle of Aspergillus 'niger II Trans. Br. Mycol. Soc. 1971. V. 57. P. 93.

233. Soccol C.R., Vandenberghe L.P.S., Rodrigues C., Pandcy A. New perspectives for citric acid production and application // Food Technol. Biotechnol. 2006. V. 44. P. 141—149.

234. Sols A., Gancedo C., Dela Fuente G. Energy-yielding metabolism in yeasts. In The Yeasts, Edited by A. H. Rose & J. S. Harrison. London and New York: Academic Press. 1979. V. 2. P. 271-307.

235. Sato S. Microbial production and control of cellular growth under high dissolved oxygen concentration // Hakko Kogaku Kaishi. 1990. V. 68. № 5. P. 411-421.

236. Sprague G.F., Cronan J.E. Isolation* and characterization of Saccharomyces cerevisiae mutants defective in glycerol catabolism // J. Bacteriol. 1977. V. 129. № 3. P. 1335-42.

237. Srere P.A. Methods in enzymology. L.J.N.N.Y., LD: Academ. Press. 1969. V. 13. P. 3-11.

238. Stacey J.D. Beverage World. 1977.

239. Stottmeister U., Behrens U., Gohler W. Effect of oxygen partial pressure on citric acid1 synthesis in Saccharomycopsis lipolytica using n-alkanes // Z Allg. Mikrobiol. 1981. V. 21. № 9. P. 677-687.

240. Stottmeister U., Behrens U., Weissbrodt E., Barth G., Franke-Rinker D., Schulze E. Utilization , of paraffins and other noncarbohydrate carbon sources for microbial citric acid synthesis // Z Allg. Mikrobiol. 1982. V. 22. № 6. P. 399^124.

241. Stottmaister U., Behrens U., Weissbrodt E., Weizenbeck E., Duresch R., Kaiser M., Nolte D., Richter H.-P., Schmidt J., Kochmann W., May U., Krebich G., Schoppe G. Patentschrift DD 239 610 A1 (ISSN 0433-6461). 1986.

242. Szabo R., Stofanvkova V. Presence of organic sources of nitrogen is critical for'filament formation and pH-dependent morphogenesis in Yarrowia lipolytica II FEMS Microbiol. Lett. 2002. V. 206. P. 45-50.

243. Tabuci T., Hara S. Conversion of citrate fermentation topolyol fermentation in Candida lipolytica II J. Agric. Chem. Soc. Jpn. 1970. V. 47. P. 485-489.

244. Tom G.D., Viswanath-Reddy M., Howe H:B.Jr. Effect of carbon source on enzymes involved in glycerol metabolism in Neurospora crassa II Arch. Microbiol. 1978. V. 117. № 3. P. 259-63.

245. Torres N. Modelling approach to control of carbohydrate metabolism during citric acid accumulation by Aspergillus niger. I. Model definition and stability of the steady state // Biotechnol. Bioeng. 1994a. V. 44. P. 104-111.

246. Torres N. Modelling approach to control of carbohydrate metabolism during citric acid accumulation by Aspergillus niger. II. Sensitivity analysis // Biotechnol. Bioeng. 1994b. V. 44. P. 112-118.

247. Thorpe R.F., Ratledge C. Fatty acid distribution in triglycerides of yeast grown on glucose or n-alkanes // J. Gen. Microbiol. 1972. V. 72. P.' 151-163.

248. Uwajima T., Akita H., Ito K., Mihara A., Aisaka K., Terada 0. Formation and purification of a new enzyme, glycerol oxidase and stoichiometry of the enzyme reaction // Agricultural and Biological Chemistry. 1980. V. 4. P. 399-406.

249. UyedaK. Phosphofructokinase//Adv. Enzymol. 1979. V. 48. P. 193-244.

250. Van der Walt J.P., Van Arx J.A. The yeast genus Yarrowia gen nov. Antonie van Leewenhoek, 1980. V. 46. P. 517-521.

251. Vandenberghe L.P.S, Soccol C.R., Pandey A., Lebeault J.M. Microbial production of citric acid // Braz. Arch. Biol. Technol. 1999. V. 42. P. 263-276.

252. Viswanath-Reddy M., Pyle J.E., Howe H.B. Purification and properties of NADP-linked glycerol dehydrogenase from Neurospora crassa //Journal of General Microbiology. 1978. V. 107. P. 289-296.

253. Voegele R.T., Sweet G.D., Boos W. Glycerol kinase of Escherichia coli is activated by interaction with the glycerol facilitator // J Bacteriol. 1993. V. 175. P. 1087-1094.

254. Wang Z.X., Zhuge J., Fang H., Prior B.A. Glycerol production by microbial fermentation: a review // Biotechnol. Adv. 2001. V. 19. P. 201-223.

255. Wethmar M., Deckwer W.D. Semisynthetic culture medium for growth and dihydroxyacetone production by Gluconobacter oxydans II Biotechnol Tech. 1999. V. 13. P. 283-287.

256. Wieland O., Suyter M. Glycerokinase; isolierung und eigensohaften des enzyms // Biochem. Z. 1957. V. 329. P. 320-331.

257. Wittlich P., Themann A., Vorlop K.D. Conversion of glycerol to 1,3-propanediol by a newly isolated thermophilic strain // Biotechnol. Lett. V. 23. P. 463-466.

258. Wojtatowicz M., Rymowicz W., Kautola H. Comparison of different strains of the yeast Yarrowia lipolytica for citric acid production from glucose hydrol // Appl Biochem Biotechnol. 1991. V. 31. P. 165-174.

259. Wright S.H., Kippen I., Wright E.M. Effect of pH on the transport of Krebs cycle intermediates in renal brush border membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1982. V. 684. P. 287-290.

260. Wysocki R., Chery C.C., Wawrzycka D„ Van Hulle M., Cornelis R., Thevelein J.M., Tamas M.J. The glycerol channel Fpslp mediates the uptake of arsenite'and antimonite in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Microbiol. 2001. V. 40. № 6. P. 1391-401.

261. Yang J.*, Webb A. R., Ameer G. A. Novel citric acid-based biodegradable elastomers for tissue engineering // Advanced Materials. 2004. V. 16. № 6. P. 511—516.

262. Yang G., Tian J., LI J. Fermentation of 1,3-propanediol by a lactate deficient mutant of Klebsiella oxytoca under microaerobic conditions // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 73. P. 1017-1024.

263. Yazdani S.S., Gonzalez R. Anaerobic fermentation of glycerol: a path to economic viability for the biofuels industry // Current Opinion in Biotechnology. 2007. V. 18. P. 213-219.

264. Yigitoglu M. Production of citric acid by Fungi // J Islamic Acad. Sci. 1992. V. 5. № 2. P. 100-106.

265. Yokoya F. Citric Acid Production // Industrial Fermentation Series, Campinas, SP, Brazil 1992. P. 1-82.

266. Zeikus J.G., Jain M.K., Elankovan P. Biotechnology of succinic acid production and markets for derived industrial products // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51. P. 545552.

267. Zhang G., Wu Y., Qian X., Meng Q. Biodégradation of crude oil by Pseudomonas aeruginosa in the presence of rhamnolipids // J Zhejiang Univ. Sci. 2005. V. 6. P. 725-730.

Информация о работе

Фатыхова, Алина Ринатовна
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Биосинтез лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica из глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Биосинтез лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica из глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы