Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности субклеточной локализации и регуляции ферментов метаболизма глюкозы у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты YARROWIA LIPOLYTICA

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности субклеточной локализации и регуляции ферментов метаболизма глюкозы у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты YARROWIA LIPOLYTICA"

на правах рукописи

! . .- - ..... - - "

* соколов дмитрий михайлович

ОСОБЕННОСТИ СУБКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ И РЕГУЛЯЦИИ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ У ДРОЖЖЕЙ-ПРОДУЦЕНТОВ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ УАШЮША ЫРОЬУТССА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ ____

диссертации на соискание ученой степени ------кандидата биологических наук

Пущино - 1995 г.

Работа выполнена в Лаборатории окислительного обмена веществ Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Т.В.Финогенова; кандидат биологических наук А.А.Шарышев

доктор биологических наук, профессор Р.А.Звягильская; доктор биологических наук, профессор Ю.А.Троценк'о

ВНИИ синтез белок РАН (г.Москва)

Защита диссертации состоится 1995 г. в час, на заседании

специализированного совета Д 002.69.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН по адресу: 142292, г.Пущино Московской обл., Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан В^б' г.

Ученый секретарь

специализированного совета В.М.Вагабов

Актуальность проблемы. Лимонная кислота является важным биотехнологическим продуктом и широко используется в пищевой и фармацевтической промышленности.

Лимонная -кислота занимает ключевую позицию в промежуточном метаболизме всех живых клеток. Кроме хорошо известного окисления цитрата в ЦТК, он также является источником ацетил-СсА и оксалоацетата, необходимых для многих биосин-тегических процессов (Goodwin, 196S; Lowenstein, 1968) и действует как положительный и отрицательный регулятор некоторых ключевых ферментов первичного метаболизма (Srere, 1965). Концентрация такого важного метаболита находится пол строгим контролем в клетке. Однако существует ряд организмов, которые накапливают в среде лимонную кислоту в значительном количестве (Финогенова, Илларионова, Лозинов, 1973; Rohr, Kubicek, 1981).

Сановными продуцентами лимонной кислоты являются мицелиальные грибы Aí,pcr¿illus niger (Kubicek, Rohr, 1986; Mattey, 1992) и дрожжи Candida lipolytka (Финогенова, Илларионова, Лозинов, 1973). В последнее время все больше внимания уделяется микробиологическому способу получения лимонной кислоты с использованием дрожжей С. lipolytica. Необходимым условием активного процесса кислоторбра-зования является лимитирование роста дрожжей одним из компонентов среды -источником азота, фосфора, серы или Mg2* (Лозинов с соавт., 1974). В разработанных технологиях микробиологического синтеза лимонной кислоты наиболее часто используется лимитирование роста клеток дрожжей источником азота.

Дрожжи проявляют разные физиологические ответы при лимитировании роста клеток источником азота в условиях избытка углеродного субстрата. Дрожжи Candida hpoiyticu экскрешруют в среду лимонную кислоту, "липидные" дрожжи (Lipomyces ¡cra\pontí, Apiotrichwn curvatum, Rhodotorula glutinis и др.) накапливают значительные количества эндогенных липидов - до 70% от сухого веса (Evans, Ratledge, 1985с). Можно выделить также группу так называемых дрожжей-"непродуцентов" (С. maltosa, С. boidinii, С. utilis), которые при аналогичных условиях культивирования не синтезируют ни значительного количества липидов, ни лимонной кислоты. Биохимическая основа подобных различий в физиологических ответах на лимитирование роста источником азота до сих пор остается невыясненной. Для понимания процесса сверхсинтеза лимонной кислоты необходимо знать какие ферменты участвуют в биосинтезе лимонной кислоты, где они локализованы и как регулируются. ^

Метаболические пути синтеза лимонной кислоты из глюкозы у дрожжей достаточно хорошо изучены. Однако данные о наличии ряда ферментов (АТФ-цитратлиазы, малик-фермента) противоречивы (Evans, Ratledge, 1985с; Финогенова с соазт., 1989). Неизвестна также субклеточная локализация ключевого фермента анаплеротических путей - пируваткарбоксилазы, играющего решающую роль в непрерывном процессе синтеза лимонной кислоты.

Процесс сверхсинтеза лимонной кислоты, по-видимому, возможен лишь при ограничении одной из реакций ЦТК, Имеющиеся в литературе данные о регуляции ферментов ЦТК у дрожжей (Marchai et al, 1977; Evans, Ratledge, 1985c) позволяют предположить участие НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы в процессе накопления в культуральной среде лимонной кислоты.

Для непрерывного синтеза лимонной кислоты необходим активно функционирующий гликолиз. В то же время известно, что фосфофруктокиназа, ключевой фермент гликолиза, ингибируется цитратом (Sols et al, 1971; Evans, Ratledge, 1984c). Таким образом, вопрос о том, каким образом осуществляется гликолитический контроль у кислотообразущих штаммов до сих пор остается невыясненным.

Цель и задачи исследования. С учетом вышеизложенного цель нашей работы заключалась в изучении субклеточной локализации ферментов у дрожжей при росте на глюкозе и исследовании регуляции ключевых ферментов.

Для реализации указанной цели решались следующие задачи:

1) исследование субклеточной локализации пируваткарбоксилазы, АТФ-цит-ратлиазы, малик-фермента, НАДФ-изоцитратдегидрогеназы у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты, "липидных" дрожжей и дрожжей-"непродуцентов";

2) исследование регуляции НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы у дрожжей-продуцентов (Yarrowia lipolytica) и "непродуцентов" (Candida maltosa) лимонной кислоты;

3) исследование регуляции фосфофруктокиназы у дрожжей-продуцентов (Yarrowia lipolytica) и "непродуцентов" (Candida maltosa) лимонной кислоты.

Научная новизна работы. Исследована субклеточная локализация ферментов у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты, дрожжей, накапливающих значительное количество липидов и дрожжей-"непродуцентов" - не синтезирующих ни значительного количества лимонной кислоты, ни липидов в условиях лимитирования роста источником азота на среде с глюкозой. Результаты исследований позволили выяснить особенности субклеточной локализации ферментов и дали возможность по-новому взглянуть на направленность метаболических потоков в клетках дрожжей с учетом компартментализации процессов; выявлены биохимические отличия дрожжей, синтезирующих лимонные кислоты, от группы дрожжей, накапливающих при аналогичных условиях не лимонную кислоту, а липиды.

В результате сравнительного исследования регуляторных свойств НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы и фосфофруктокиназы у • дрожжей Y. lipolytica и С maltosa выявлены важные особенности регуляции ферментов у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты. Показано, что фосфофруктокиназа дрожжей Y. lipolytica менее чувствительна к ингибированию цитратом по сравнению с ферментом из С. maltosa. Различная устойчивость фосфофруктокиназ к действию цитрата определяет различия в способности к сверхсинтезу лимонной кислоты из

глюкозы. На основе проведенных исследований предложена схема субклеточной локализации и регуляции ферментов метаболизма глюкозы у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты Y. lipolytica .

Практическая ценность работы. Исследование субклеточной локализации и регуляции ферментов у дрожжей-продуцентов и непродуцентов лимонной кислоты позволило глубже понять механизм сверхсинтеза лимонной кислоты с учетом компартмептализации процессов, а также особенностей регуляции ферментов в клетках дрожжей при росте на глюкозе и создать научные предпосылки для улучшения технологии производства лимонной кислоты.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на сессиях научных работ ИБФМ РАН в 1992, 1993 гг, на совместных семинарах лаборатории окислительного обмена веществ и лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ РАН.

Публикации. По материалам работы опубликовано 3 печатные работы, одна работа принята к печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа содержит '^'страниц машинописного текста, включая /О таблиц, /^рисунков. Список литературы содержит /^¿источников (из них /сМ- зарубежные).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Объекты исследований. Объектами исследования при изучении регуляторных свойств НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы и фосфофруктокина-зы являлись штаммы дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica 704 (Y-2373) - активный продуцент лимонной кислоты и Candida maltosa, не накапливающий ни значительного количества лимонной кислоты, ни липидов при лимитировании роста источником азота.

Изучение субклеточной локализации ферментов проводили у разных групп дрожжей, проявляющих различные физиологические ответы при лимитировании роста источником азота. Наряду с "цитратными" дрожжами-продуцентами лимонной кислоты, Y. lipolytica 704 (Y-2373) и Y. lipolytica 695 (Y-2378), объектами исследований являлись так называемые "лилидные" дрожжи и дрожжи-"непродуцен-ты". "Липидные" дрожжи Lipomyces tetrasporus (Y-2490), Apiotrichum curvatum (Y-20509), Rhodotomla glutinis (Y-749) в отличие от "цитратных" дрожжей сверхпроду-цируют не лимонную кислоту, а липиды - до 70% (от сух. веса). Дрожжи-"непроду-центы" - Candida utilis, C.boidinii, Cmaltosa в аналогичных условиях культивирования не синтезируют ни значительного количества лимонной кислоты, ни липидов.

В ряде экспериментов использовали штаммы дрожжей-продуцентов лимонной кислоты - К Иро1уиса 212 (У-2412), К ИроЬцка 374 (У-2410), а также штаммы дрож-жей-"непродуцентов" лимонной кислоты У. Цро1уНса 194 (мутантный штамм), У. Иро-¡уйса 12а (У-2366). Все штаммы дрожжей были получены из коллекции культур микроорганизмов ВКМ ИБФМ РАН.

2. Культивирование микроорганизмов. Для культивирования дрожжей использовали минеральную среду Ридер с уменьшенным (в 5 раз) количеством азота [(МН4)2804 - 0,6 г/л] (см.Материалы и методы). В качестве источника углерода использовалась глюкоза (2%). Культивирование дрожжей проводили в лабораторном ферментере АНКУМ-2М с автоматическим поддержанием рН (6,0), при температуре 29°С и концентрации кислорода (р02 - 60%); объем среды - 6 л. Рост дрожжей контролировали по величине оптической плотности клеточной суспензии при 600 нм,

3. Получение бесклеточных экстрактов. Клетки дрожжей собирали в конце экспоненциальной фазы роста и осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин и затем дважды отмывали 1%-ным ЫаС1.

а) Для получения бесклеточного гомогената клетки дрожжей ресуспендировали в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,2), содержавшим 1 мМ ЭДТА, в соотношении 1:1 (осадок:буфер) и разрушали с помощью стеклянных бус "баллотини" (100150 мкм) на шаровой мельнице при 1000 об/мин в течение 3 мин. При этом происходило разрушение не только целых клеток, но и субклеточных органелл. Оболочки клеток и неразрушенные клетки удаляли центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. Полученный супернатант использовали как суммарный бесклеточный гомогенат для измерения ферментативных активностей.

б) При получении бесклеточного гомогената, используемого для частичной очистки ферментов и удаления низкомолекулярных соединений, клетки дрожжей ресуспендировали в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,2), содержавшим 1 мМ ЭДТА и 100 мг/л РМЗИ в соотношении 1:3 (осадок:буфер). Разрушение клеток проводили на Френч-прессе при 35 МПа. Оболочки клеток и неразрушенные клетки удалялись центрифугированием при 20000 8 в течение 30 мин.

4. Субклеточное фракционирование дрожжей. Для проведения субклеточного фракционирования клетки дрожжей собирали в середине экспоненциальной фазы центрифугированием при 5000 об/мин 10 мин; затем клетки дважды промывали 1% ЫаС1. Для получения протопластов отмытые клетки суспендировали в среде 81 (содержащей 1 М сорбитол, 0,5 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-НС1, 10 мМ НЕРЕБ, рН= 7,8). В среду вносили цистеин (50 мМ) для "разрыхления" клеточной стенки и инкубировали клетки при комнатной температуре в течение 20 мин. После переосаждения клетки дрожжей суспендировали в среде 81, содержащей "улиточный фермент" (полученный в результате лиофилизации желудочного сока виноградной улитки), из расчета 1 г "улиточного фермента" на 10 г отмытых клеток в

инкубировали при комнатной температуре на магнитной мешалке, поддерживая рН(5,0-5,5) до образования 80-90% протопластов (контролируя этот процесс микроскопически). Полученные протопласты дважды отмывали средой 81, переосаждая при 5000 об/мин 10 мин. Осадок протопластов суспендировали в 75 мл среды 51. Далее проводили осмотический лизис протопластов, добавляя к суспензии протопластов 75 мл среды 52 (0,25 М сорбитол). Для восстановления тоничности среды через 5 мин добавляли 75 мл среды БЗ (1,75 М сорбитол). Лизат фракционировали дифференциальным центрифугированием. Неразрушенные протопласты и ядра осаждали при 2500 g и 3500 g в течение 10 мин. Полученный бесклеточный гомогенат центрифугировали 20 мин при 20000 Осадок, содержащий митохондрии, суспендировали в 15-20 мл среды 31. В результате субклеточного фракционирования получали фракции митохондрий и цитозоля. Качество разделения фракций проверяли измерением активности маркерных ферментов.

Разделение фракций считалось удовлетворительным если не менее 90% активности фумарат-гидратазы, маркерного митохондриального фермента было локализовано во фракции митохондрий, а активность глюкозо-бФ дегидрогеназы, маркерного фермента цитозоля, не менее чем на 90% находилась во фракции цитозоля.

5. Определение активности Феомеятоа Активности ферментов определялись на спектрофотометре БЫп^ги иУ-160 в термостатируемой кювете при температуре 30°С.

При участии в реакции НАД(Ф) или НАД(Ф)Н в реакционную смесь добавляли КСИ (1 мМ) для ингибирования окисления НАД(Ф)Н в дыхательной цепи. Измерение активностей ферментов при исследовании субклеточной локализации ферментов проводили в присутствии тритона Х-100 (0,025%).

Методики определения активностей НАД-изоцитратдегидрогеназы, НАДФ-изоцитратдегидрогеназы, фосфофруктокиназы, малик-фермента, глюкозо 6-фосфат-дегидрогеназы, пируваткарбоксилазы, фумарат-гидратазы, АТФ-цитратлиазы подробно изложены в диссертационной работе (см. Материалы и методы).

6. Частичная очистка НАД-изоиитратдегидрогеназы и Дюсфоруктокиназы. Для изучения регуляторных свойств НАД-изоцитратдегидрогеназы и фосфофруктокиназы проводили частичную очистку ферментов и удаление низкомолекулярных соединений (возможных активаторов и ингибиторов ферментов) из бесклеточного экстракта (см.Материалы и методы).

7. Аналитические методы. Определение лимонной кислоты в культуральной жидкости проводили химическим методом (Жаболовская с соавт., 1968). Определение глюкозы в культуральной жидкости проводили энзиматическим методом (Мешкова, Северин, 1979). Определение содержания ионов ЫН4 + проводили салициловым методом (1{еагс1оп, & а1, 1966). Белок определяли с биуретовым реактивом (Мешкова, Северин, 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ ПРИ РОСТЕ ДРОЖЖЕЙ

НА ГЛЮКОЗЕ

Для выяснения механизма сверхсинтеза лимонной кислоты дрожжами К lipofytica было проведено исследование субклеточной локализации ферментов у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты, "липидных" дрожжей, а также у дрожжей-"непродуцентов".

1Л. Субклеточная локализация анаплеротнческого фермента пируваткарбокснлазы

При интенсивном биосинтезе лимонной кислоты необходимо активное функционирование анаплеротнческого пути, пополняющего запас предшественника -оксалоацетата. Единственной реакцией, обеспечивающей синтез оксалоацетата у дрожжей, при росте на глюкозе является пируваткарбоксилазная реакция.

Сравнительное изучение субклеточной локализации пируваткарбокснлазы у дрожжей, проявляющих разные физиологические ответы при лимитировании по азоту, показало, что фермент находится в цитозоле (табл.1), а не в митохондриях, как это считалось ранее (Evans et al, 1983; Evans and Ratledge, 1984a). Причем, цитозольная локализация пируваткарбокснлазы отмечена для всех типов исследовании х дрожжей: продуцентов лимонной кислоты, продуцентов липидов и дрожжей-"непродуцентов" (табл.1).

Согласно литературным данным (Evans and Ratledge, 1985с) пируваткарбокси-лаза "липидных" дрожжей и дрожжей-"непродуцентов" имеет типичную митохон-дриальную локализацию, как и пируваткарбоксилаза животных.

Активность пируваткарбокснлазы определяли как радиохимическим, так и энзиматическим методом. Было установлено, что использование энзиматичесхого метода определения активности пируваткарбокснлазы правомерно лишь для дрожжей с низкчй пируватдекарбоксилазной активностью. Данные, полученные радиохимическим методом, более адекватно отражают реальную -активность пируваткарбокснлазы, поскольку при этом фиксируется именно скорость включения бикарбоната.

При лимитировании роста источником азота активность пируваткарбокснлазы у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты (Y.lipofytica) не изменяется, в отличие от дрожжей-"непродуцентов" (C.maltosa), у которых активность анаплеротнческого фермента снижалась практически до нуля. У дрожжей-"непродуцентов" отсутствуют процессы активного синтеза в условиях лимитированного роста источником азота и, следовательно, отсутствует необходимость в функционировании анаплеротических путей.

Табл.1. Субклеточная локализация ферментов у дрожжей при росте на глюкозе (распределение между фракциями в %).

пируваткар- АТФ- цитрат малик НАД-изоцитрат НАДФ-изоцитрат глкжозо-бФде- фумарат-

Вид дрожжей боксилаза лиаза фермент дегидрогеназа дегидрогеназа гидрогеназа* гидратаза"

ЦИТ. МИТ. цит. мит. ЦИТ. МИТ. цит. мит. цит. мит. цит. мит. цит. мит.

"ЛИПИДНЫЕ"

Ырошусез

{еЦаБропв 94 3 104 2 98 4 2 99 91 6 106 9 1 96

"ЦИТРЛТ11ЫЕ"

У.Нро1уИса 704 112 2 95 3 0 0 2 96 72 35 98 10 4 99

У.1фо1уП'са 695 100 3 96 9 0 0 3 97 73 31 100 8 0 95

"НЕПРОДУЦЕНТЫ"

С.ЬоЫшм 101 2 0 0 0 0 3 98 74 28 94 3 0 99

С.та1Ю5,1 102 2 0 0 0 0 0 108 81 21 102 2 4 87

С.ШИю 103 0 0 0 0 0 7 84 62 33 101 4 0 92

Примечание: * - маркерный фермент цитозоля; - маркерный фермент митохондрий; мит. - фракция митохондрий; цит. - фракция цитозоля.

LZ Наличие АТФ-цитратлиазы в клетках дрожжей и субклеточная локализация

фермента

Процессы биосинтеза лимонной кислоты и липидов в клетке тесно связаны. Для биосинтеза липидов ацетил-СоА должен поступить в цитозоль. Существуют два основных пути переноса ацетил-СоА через митоховдриальную мембрану: 1) в виде ацетил-карнитина; и 2) в составе цитрата. Первый путь реализуют "нелипидные" дрожжи в результате действия карнитинацетилтрансферазной реакции (Ratledge, Gilbert, 1985). Второй путь осуществляется в клетках "липидных" дрожжей и в клетках животных (Botham and Ratledge, 1979). Таким образом, у "липидных" дрожжей основным донором цитозольного ацетил-СоА является цитрат. Митохон-дриальный цитрат транспортируется в цитозоль через цитрат/малат-транслоказу и далее расщепляется в реакции с АТФ-цитратлиазой до оксалоацетата и ацетил-СоА {Boulton and Ratledge, 1981а).

Наличие АТФ-цитратлиазы считается характерным биохимическим признаком "липидных" дрожжей (Boulton and Ratledge, 1981а; 1981b). В экспериментах по периодическому культивированию дрожжей было найдено, что АТФ-цитратлиаза, ключевой фермент "липидных" дрожжей, также присутствует у всех исследованных штаммов дрожжей Y. lipofytica (продуцентов и непродуцентов лимонной кислоты). В то же время АТФ-цитратлиаза не обнаруживается у дрожжей-"непродуцентов" С maltosa, С. utilis, С boidinii (табл.1). Исследование субклеточной локализации АТФ-цитратлиазы показало, что этот фермент как у "цитратных", так и у "липидных" дрожжей является цитоплазматическим (табл.1).

Таким образом, у "цитратных" дрожжей также как и у "липидных" предшественником цитозольного ацетил-СоА, используемого при биосинтезе липидов, является цитрат, расщепляемый АТФ-цитратлиазой. По-видимому, "цитратные" дрожжи занимают промежуточное положение между "лнпидными" и "нелипидными" дрожжами. Обладая активностью АТФ-цитратлиазы, "цитратные" дрожжи все же синтезируют меньшее количество липидов (до 17% от сух. веса) по сравнению с "липидными" дрожжами (до 70% от сух. веса). Возможно биосинтез липидов у "цитратных" дрожжей лимитируется недостаточным синтезом НАДФН.

1.3. Субклеточная локализация НАДФ-изоцитратдегидрогеназы и малик-

фермента

При биосинтезе липидов кроме структурного предшественника - ацетил-СоА необходим НАДФН. Следует отметить, что в клетках дрожжей в отличие от клеток животных отсутствует трансгидрогеназа - фермент, осуществляющий прямую конверсию НАДН в НАДФН (Lagunas, Concedo, 1973; Bruinenberg et al, 1983a). Поскольку внутренняя митохондриальная мембрана непроницаема для восстановленных пиридиннуклеотидов (Von lagan, Klingenberg, 1970), то синтез НАДФН должен

роисходить в том же компартменте, что и синтез липидов - в цитозоле.

Существует несколько путей биосинтеза НАДФН в клетке при росте на чюкозе. Кроме пентозофосфатного пути, НАДФН может поступать в результате )ункционирования НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы.

Локализация НАДФ-изоцитратдегидрогеназы "липидных" дрожжей существен-о отличается от локализации этого фермента у "цитратных" дрожжей и дрожжей-непродуцентов" (таблЛ). Так, у "липидных" дрожжей НАДФ-изоцитратдегидро-гназа локализована исключительно в цитозоле, тогда как у "цитратных" дрожжей и рожжей-"непродуцентов" фермент распределяется между фракциями цитозоля и :итохондрий в соотношении примерно 2,5:1. По-видимому, цитозольная локализация 1АДФ-зависнмой изоцитратдегидрогеназы обеспечивает более интенсивный синтез 1АДФН, необходимого для биосинтеза липидов. Другим источником НАДФН в летке может выступать реакция с участием малик-фермента.

Малик-фермент осуществляет в цитозоле НАДФ-зависимое окислительное екарбоксилирование малата с образованием пирувата и углекислоты. Полагают, что алик-фермент может поддерживать баланс между скоростью выхода цитрата, интезом НАДФН и биосинтезом липидов (Evans, Ratledge, 1985с). Ни в "цитратных" рожжах, ни в дрожжах-"непродуцентах" не проявляется активность малик-фермента габл.1). У всех проверенных штаммов "липидных" дрожжей присутствовал малик-юрмент (табл.1). Отсутствие малик-фермента у "цитратных" дрожжей и наличие его "липидных" дрожжей является важным биохимическим признаком "липидных" рожжей. Возможно, именно отсутствие малик-фермента у "цитратных" дрожжей риводит к дефициту НАДФН, препятствует синтезу значительных количеств ипидов и, в конечном счете, приводит к несбалансированному синтезу цитрата.

Таким образом, цитозольная локализация НАДФ-зависимой изоцитратдегидро-гназы и наличие малик-фермента являются отличительными биохимическими ризнаками "липидных" дрожжей при сравнении их с "цитратными". По-видимому, ти особенности организации метаболизма "липидных" дрожжей делают возможным нтенсивный биосинтез липидов, синтезируя достаточное количество НАДФН в летке.

На основании проведенных исследований предлагается схема (рис.1), тражающая субклеточную локализацию ферментов метаболизма глюкозы у цитратных", "липидных" и дрожжей-"непродуцентов". Таким образом, происхож-ение митохондриального оксалоацетата у "цитратных" дрожжей нам представляется ледующим: оксалоацетат образуется в реакции с цитозольной пируваткарбоксилазой, атем восстанавливается до малата в реакции с цитозольной малатдещдрогеназой. [алее, малат поступает в митохондрии в обмен на цитрат при участии итрат/малатного переносчика и вновь окисляется уже митохондриальной малат-егидрогеназой до оксалоацетата.

Рис.1. Субклеточная локализация ферментов у "нитратных" дрожжей (К lipofytica), "липидных" дрожжей (Ltetrasporus) и дрожжей-"непродуцентов" (С maltosa, С boidinii и С. utilis). (—) - общие метаболические пути;

(----) - метаболические пути, характерные для "цитратных" дрожжей; (—•) - метаболические пути, характерные для "липидных" дрожжей; (=) - метаболические пути, характерные для дрожжей-"непродуцентов"; КАТ - карнитин-ацетшггрансфераза; ЦМТ - цитрат/малат транслоказа.

2. РОЛЬ НАД-ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В БИОСИНТЕЗЕ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ У ДРОЖЖЕЙ

Имеющиеся в литературе данные о регуляции ферментов ЦТК у дрожжей [MarchaI et al., 1977; Evans, Ratledge, 1985c) позволяют предположить участие НАД-швисимой изоцитратдегидрогеназы (НАД-ИЦДГ) в процессе сверхсинтеза лимонной сислоты.

Для понимания особенностей метаболизма дрожжей-иродуцентов лимонной <ислоты проведено сравнительное исследование регуляторных свойств НАД-ИЦДГ у 1рожжей-продуцентов лимонной кислоты У. Upolytica и дрожжей-"непродуцентов" Г. maltosa. Поскольку в условиях перехода в стационарную фазу при лимитировании эоста источником азота резко изменялось энергетическое состояние клетки (Marchai 't а!., 1977; Выкат, Ratledge, 1979), было важно проверить влияние адениловых гуклеотидов (АМФ и АТФ) на активность НАД-ИЦДГ.

2.1. Зависимость активности НАД-ИЦДГ от различных концентраций изоцитрата и АМФ

Активность НАД-ИЦДГ зависела от присутствия АМФ, Скорость НАД-ИЦДГ реакции имела S-образный характер в зависимости от концентрации изоцитрата. При небольших концентрациях изоцитрата (менее 0,5 мМ) АМФ значительпо увеличивал активность, но при насыщающих концентрациях изоцитрата (5 мМ) АМФ не влиял на Vmax. Скорость НАД-ИЦДГ реакции фермента по-прежнему достигала VmaK при насыщающих концентрациях изоцитрата даже при полном отсутствии АМФ в реакционной среде.

Таким образом, АМФ увеличивает сродство фермента к субстрату, но не влияет на максимальную скорость реакции для фермента из обоих штаммов. Обе НАД-ИЦДГ проявляют активность при полном отсутствии АМФ (даже при ненасыщающих концентрациях изоцитрата).

2.2. Влияние различных метаболитов на активность НАД-изоцитратдегидрогеназы

АТФ является сильным ингибитором НАД-ИЦДГ у обоих штаммов. Этот факт может играть ключевую роль в регуляции активности НАД-ИЦДГ при лимитировании роста азотом. Ингибирование НАД-ИЦДГ АТФ не снималось насыщающими концентрациями изоцитрата или АМФ у дрожжей Y. Upolytica. В то х<е время у С. maltosa ингибирование АТФ уменьшалось при увеличении концентрации АМФ. Так, степень ингибирования фермента 4 мМ АТФ при 0,1 мМ и 1 мМ АМФ составляла 84% и 34% соответственно. Однако увеличение концентрации изоцитрата не снижало степень ингибирования фермента АТФ у С maltosa.

Тот факт, что АМФ по-разному влияет на степень ингибирования НАД-ИЦЦ АТФ у исследуемых дрожжей подтверждается характером зависимости скорост ферментативной реакции в условиях ингибирования 5 мМ АТФ от концентраци АМФ. Возрастающие концентрации АМФ снимали ингибирование НАД-ИЦЦ С maltosa и не влияли на активность фермента Y. lipolytica.

Табл.2. Влияние метаболитов на активность НАД-ИЦДГ.

Активность, %

Ингибитор Концентрация, мМ _

У. lipolytica С maltosa

нет 100* 100*

1 87 80

атф 4 67 62

10 25 14

0,1 91 96

надн 0,2 62 61

0,4 58 55

5 91 97

Цитрат 10 73 74

20 46 70

40 21 42

1 102 98

2-оксоглутарат 5 87 79

10 82 76

nh4+ 1 100 97

10 85 82

Примечание: 100% активности - 0,56 Е/мг белка (У. lipolytica) и 0,40 Е/мг белка (С maltosa) с 1 мМ АМФ и 1мМ изоцитрата.

Известно, что при лимитировании роста источником азота уровень АМФ i клетке уменьшается главным образом в результате двух реакций фосфорилирования АМФ и дезаминирования АМФ (Evans, Ratledge, 1985b). Пр] синтезе лимонной кислоты дрожжами Y. lipolytica концентрация изоцитрата в клетк

акже возрастает и НАД-ИЦДГ могла бы быть активна даже в отсутствие АМФ, днако возросший уровень АТФ ингибирует активность фермента. Таким образом, в 'словиях накопления лимонной кислоты регуляция НАД-ИЦДГ определяется не ■ровнем АМФ, а уровнем АТФ в клетке.

Влияние АТФ, НАДН, цитрата, <<-кетоглутлрата и Nfi4 + на активность 1!АД-1ЦДГ представлено п табл.2. Исследование НАД-ИЦДГ из дрожжей Y. lipulyticn и maltosa показало, что фермент слабо ингибиропался конечным продуктом - sf-кето-лутаратом. Ионы NH4+ не влияли на активность фермента. НАД-ИЦДГ пнгибиро-илась двумя другими ключевыми метаболитами - цитратом и НАДН (табл.2). Ггепень ингибирования НАД-ИЦДГ нитратом била несколько выше у дрожжей •'. lipohtica. по сравнению с С maltosa.

Лимитирование роста дрожжей источником азотл присидиг к уьеличению ■оот»рг7!?1пгя ^TФ/ЛМФ и уровня НАДН я клетке (Roultoit, Ruílcdge, 19o3b; Marchai ч al., 1977). АТФ и НАДН ингибируют активность НАД-ИЦДГ, что приводит к скоплению цитрата, повышенные концентрации которого еще больше усиливают •шгибирование фермента. Ингибирование фермента АТФ не снимается шсыщающими концентрациями изоцитрата, происходит блокировка метаболического тути на уровне НАД-ИЦДГ у дрожжей У. lipolytica и С maltosa. Таким образом, НАД-ИЦДГ регулирует начальный этап процесса биосинтеза лимонной кислоты, ариводя к увеличению концентрации цитрата; далее регуляция, по-видимому, ху!;;сгтвляе1ся на уровне фосфофруктокиназы.

X РОЛЬ ФОСФОФРУКТОКИНАЗЫ В РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ДРОЖЖАМИ YARROWU Llí'OlATICA

Известно, что фосфофруктокиназа является ключевым регуляторным ферментом гликолиза практически у всех организмов, включая дрожжи (Uycda, 1979; l'rankel, 1982). Колее того, на уровне фосфофруктокиназы обеспечивается согласованное функционирование цикла трикарбоновых кислот и гликолиза. Увеличение концентрации цитрата по механизму отрицательной обратной свяли ингибирует активность фосфофруктокиназы и, в целом, снижает скорость трансформации субстрата через гликолиз.

Для выяснения особенностей регуляции биосинтеза лимонной кислоты дрожжами Y. lipolytica проводили сравнительное изучение регуляции фосфофруктокиназы у дрожжей-продуцентов (Y. lipolytica) и непродуцентов (С. maltosa) лимонной кислоты.

ЗЛ, Ингибирование фосфофруктокиназы цитратом и АТФ

Действие различных эффекторов на активность фосфофруктокиназы изучали при разных концентрациях АТФ: неингибирующей (0,5 мМ), при которой активность

фермента была близкой к максимальной и ингибирующей (5 мМ), при которо; происходило частичное ингибирование активности, причем концентрация Ф-бФ был насыщающей - 2 мМ.

Влияние цитрата на активность фосфофруктокиназы дрожжей-продуценто цитрата (У. lipofytica) и дрожжей-"непродуцентов" (С maltosa) исследовали диапазоне концентраций от 5 до 80 мМ. Цитрат в концентрации до 10 мМ н приводил к значительному снижению активности фермента у изучаемых видо дрожжей. Однако дальнейшее увеличение концентрации цитрата вызывало резко снижение активности фосфофруктокиназы у С maltosa. При концентрации цитрат, 40 мМ фермент из Y. lipofytica сохранял более 50% от исходной активности, тогд; как активность фосфофруктокиназы С maltosa снижалась до 8%. Даже npi концентрации цитрата 80 мМ активность фермента из Y. lipofytica сохранялась н; уровне 20%.

По-видимому, устойчивость фосфофруктокиназы к ингибированию цитратоь играет решающую роль в процессе биосинтеза его дрожжами Y. lipofytica, позволя: активно метаболизировать глюкозу до цитрата и накапливать его в значительны; количествах.

АТФ (5 мМ) оказывал слабое ингибирующее действие на активность фосфо фруктокиназы у обоих исследуемых штаммов дрожжей, однако при совместно* действии с цитратом ингибирующий эффект АТФ резко возрастал (табл.3). Этс подтверждает известный ранее факт о возможности синергизма между действие» цитрата и АТФ (Ogawa, 1985).

3.Z Влияние NH4 + и АМФ

Ионы NH4+ (ЮмМ) существенно повышали активность фосфофруктокиназы -для Y. lipofytica в 3 раза и для С maltosa в 4 раза (табл.3), Кроме этого, ионы NH4 + эффективно противодействовали ингибирующему действию цитрата.

АМФ (2 мМ) незначительно повышал активность фосфофруктокиназы С maltosa и не влиял на активность фермента Y. lipofytica (табл.3). АМФ снимал ингибирование цитратом фосфофруктокиназы С maltosa. Активирующий эффект АМФ был особенно заметен при ингибирующей концентрации АТФ 5 мМ. Увеличение активности фосфофруктокиназы в этом случае происходило более, чем в 15 раз (табл.3). В отличие от фосфофруктокиназы из С maltosa фермент Y. lipofytica не активировался АМФ в условиях ингибирования цитратом (табл.3).

Активирующий эффект АМФ при ингибировании цитратом известен давно (Sois, Salas, 1966), однако факт нечувствительности фосфофруктокиназы к действию АМФ, наблюдаемый у дрожжей У. lipofytica, был отмечен лишь для "липндных" дрожжей (Evans, Rat\edge, 1984с).

Табл.3. Влияние цитрата, АМФ и NH4 + на активность фосфофруктокиназы (в %).

К lipolytica С. maltosa

Эффекторы АТФ АТФ

0,5 5,0 0,5 5,0

Контроль 100* 100* 100** 100"

Цитрат, 20мМ 85 23 45 4

АМФ, 2мМ 97 61 115 75

Цитрат + АМФ 80 22 91 65

NH4 + , ЮмМ 286 165 390 192

Цитрат + NH4 + 135 93 122 82

- 100% активности (Y. lipotytica) = 0,28 Е/мг белка (0,5 мМ АТФ) и 0,20 Е/мг 1елка (5,0 мМ АТФ) при 2,0 мМ Ф-6Ф;

* - 100% активности (С maltosa) = 0,25 Е/мг белка (0,5 мМ АТФ) и 1,22 Е/мг белка (5,0 мМ АТФ) при 2,0 мМ Ф-6Ф.

Исследование фосфофруктокиназы у дрожжей-продуцентов цитрата показало, reo фермент менее чувствителен к ингибировагопо цитратом по сравнению с [юсфофруктокшгазой из С. maltosa. Это имеет решающее значение при биосинтезе шмонной кислоты. В итоге механизм сверхсинтеза лимонной кислоты дрожжами lipolytica представляется следующим. Лимитирование роста дрожжей источником ¡зота приводит к увеличению соотношения АТФ/АМФ в клетке. Поскольку АТФ шшбирует активность НАД-ИЦДГ, при этом происходит накопление цитрата, ювышенные концентрации которого еще больше усиливают ингибирование НАД-ЩДГ. В то же время, повышенные концентрации изоцитрата не снимают шгибирование фермента АТФ, происходит блокировка метаболического пути на ■ровне НАД-ИЦДГ у дрожжей X lipolytica и С maltosa. Цитрат выходит из штохондрий в цитозоль (в обмен на малат) и ингибирует активность фосфо-Ьруктокиназы дрожжей С. maltosa, прекращая метаболизм субстрата через гликолиз. Эднако, повышенная устойчивость фосфофруктокиназы дрожжей Y. lipolytica к гнгибированию цитратом, по-видимому, делает возможным активное функциояирова-(ие фермента и всего гликолитического пути. Дрожжи продуценты цитрата фодолжают активно метаболизировать глюкозу, синтезируя лимонную кислоту, огда как у дрожжей-"непродуцентов" метаболическая активность резко снижается. Таким образом, биохимические различия в регуляции фосфофруктокиназы у ;рожжей продуцентов и непродуцентов лимонной кислоты приводят к разным физиологическим ответам при лимитировании роста источником азота.

выводы

1) Исследована субклеточная локализация ферментов метаболизма глюкозы дрожжей-продуцентов лимонной кислоты, "липидных" дрожжей и дрожжей-"непр| дуцентов". В отличие от существовавших ранее представлений установлено, ч: пируваткарбоксилаза локализована в цитозоле, а не в митохондриях у bcí изученных штаммов дрожжей.

2) Выяснено, что у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты и дрожже) "непродуцентов" НАДФ-изоцитратдегидрогеназа локализована как в цитозоле, так в митохондриях в отличие от "липидных" дрожжей, у которых фермент локализовг исключительно в цитозоле.

3) Установлено, что наличие малик-фермента свойственно только "липидных дрожжам; , у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты и дрожжей-"непродуцентов данный фермент отсутствует.

4) Показано, что АТФ-цитратлиаза, характерный фермент "липидныл дрожжей, присутствует также в клетках всех исследованных штаммов дрожже Yarrowia lipolytica и локализован в цитозоле.

5) Исследованы регуляторные свойства НАД-изоцитратдегидрогеназы дрожже Yarrowia lipolytica и Candida maltosa. Выяснено, что активность фермента у обои штаммов дрожжей при избытке изоцитрата регулируется главным образом уровне АТФ, а не АМФ.

6) Показано, что фосфофруктокиназа дрожжей Yarrowia lipolytica мене чувствительна к ингибированию цитратом по сравнению с ферментом из Candid maltosa. По-видимому, различная устойчивость фосфофруктокиназ к действию цитре та определяет различия в способности к сверхсинтезу лимонной кислоты из глюкозы

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Д.М.Соколов, Н.Ю.Солодовникова, А.А.Шарышев, Т.В.Финогенова. 199Í Роль НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы в биосинтезе лимонной кислоты дрожжей. Прикладная биохимия и микробиология, т.31, вып.З, с.315-320.

2. Д.М.Соколов, Н.Ю.Солодовникова, А.А.Шарышев, Т.В.Финогенова. 199i Роль фосфофруктокиназы в регуляции синтеза лимонной кислоты дрожжами Yarro wia lipolytica. Прикладная биохимия и микробиология, т.31, вып.6.

3. И.Г.Моргунов, О.В.Микулинская, А.А.Шарышев, Д.М.Соколов, Т.В.Финоге нова. 1994. Выделение, очистка и некоторые свойства цнтат-синтазы дрожжей Yarro wia (Candida) lipolytica - продуцента лимонной кислоты. Биохимия, 59(9), 1320-1329

4. Д.М.Соколов, А.А.Шарышев, Т.В.Финогенова. 1995. Особенности субклеточ ной локализации ферментов метаболизма глюкозы у разных групп дрожжей Биохимия, (в печати). ¿€>//"^УЗ- / fti"?