Метаболическая организация окислительных путей у дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцентов органических кислот

Моргунов, Игорь Григорьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Метаболическая организация окислительных путей у дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцентов органических кислот
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболическая организация окислительных путей у дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцентов органических кислот"

09-6 1297

МОРГУНОВ ИГОРЬ ГРИГОРЬЕВИЧ

МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ У ДРОЖЖЕЙ УА1Ш)\У1А ЫРОЬУНСД - ПРОДУЦЕНТОВ ОРГАНИЧЕСКИХ

КИСЛОТ

03.00.04-Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино-2009 г.

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. ПК. Скрябина РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Татьяна Васильевна Финогенова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Миронова Галина Дмитриевна

доктор биологаческих наук, профессор Звягильская Рената Александровна

доктор биологаческих наук, профессор Бурьянов Ярослав Иванович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биофизики клетки РАН

Защита диссертации состоится » ксмЬя 2009 г. в час.

на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущине Московской обл., проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь „

Диссертационного совета --7

доктор биологических наук В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Последние годы характеризуются возрастанием интереса к исследованию («¡конвенционных дрожжей Yarrowia Upolytica, что обусловлено, с одной стороны, их отличием от хорошо изученных дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe в плане их филогенетической эволюции, физиологии и генетики (Barth and Gaillardin, 1996; 1997) и, с другой стороны, широким применением их в биотехнологии. Создан международный центр по координации исследований в данной области; международные конференции, посвященные изучению этих дрожжей, проводятся с 1995 г. каждые три года. Значительные успехи достигнуты в области молекулярной биологии и генно-инженерной экспериментальной биологии У. lipolytics усилиями нескольких европейских научных коллективов к 2004 г. завершено изучение генома дрожжей, и составлена их генетическая карта (Dujon et al., 2004).

Российская группа, входящая в международный консорциум, на приоритетной основе проводит исследование уникальной особенности дрожжей У. Upolytica синтезировать в значительных количествах органические кислоты, липиды и ферменты. Физиологические основы образования этих продуктов у Y. Upolytica изучены достаточно хорошо при использовании к-алканов в качестве источника углерода и энергии. Однако биохимические аспекты ассимиляции источников углерода (и особенно новых возобновляемых субстратов, таких как растительные масла и глицерин) и механизмы сверхсинтеза органических кислот на этих субстратах остаются малоизученными. Все эизиматические исследования по изучению процессов сверхсинтеза органических кислот - интермедиатов ЦТК - проводились на бесклеточных экстрактах дрожжей. Не были изучены физико-химические свойства ключевых ферментов, участвующих в ассимиляции субстратов и процессах сверхсинтеза, и механизмы их тонкой регуляции. Оставалось неизвестным влияние внутриклеточных концентраций метаболитов на регуляцию ферментов, обеспечивающих процесс сверхсинтеза органических кислот. На момент начала работы еще не было доказанным, что в клетке ферменты одного метаболического пути функционируют не разрозненно, а взаимодействуют между собой и со структурными элементами клетки и создают надмолекулярные комплексы -метабояоны. Исследование ферментов, в условиях, максимально приближенных к тем, которые существуют внутри клетки, открывает новые перспективы в понимании механизмов регуляции метаболизма микроорганизмов.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было изучение структурно-функциональной организации путей ассимиляции триглицеридов и глицерина у дрожжей Y. Upolytica и механизмов регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот.

В соответствии с целью были определены следующие задачи:

1. Изучение путей метаболизма триглицеридов растительных масел и глицерина дрожжами У. Upolytica.

2. Исследование механизмов сверхсинтеза органических кислот дрожжами У. Upolytica при различных физиологических условиях (в условиях лимитирования роста клеток тиамином или азотом) на разных субстратах.

3. Выделение и характеристика ключевых ферментов метаболизма триглицеридов и глицерина и сверхсинтеза органических кислот - липазы (КФ 3.1.1.3), глицеролкиназы (КФ 2.7.1.30), цитратсинтазы (КФ 4.1.3.7) и НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41).

4. Изучение надмолекулярной организации ферментов ЦТК и механизмов регуляции у дрожжей. Создание новых представлений о механизмах сверхсинтеза органических кислот.

Научная новизна работы

Впервые установлены пути метаболизма триглицеридов и продуктов их гидролиза у дрожжей У. lipolytica. Первым этапом вовлечения триглицеридов в метаболизм является их гидролиз внеклеточными липазами. Продукты гидролиза триглицеридов - жирные кислоты и глицерин потребляются клетками одновременно. Показано, что вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилирования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-З-фосфат-дегидрогенаэы.

Ключевые ферменты ассимиляции метаболизма триглицеридов и глицерина -липаза и глицеролкиназа выделены, очищены и охарактеризованы.

Изучены механизмы регуляции ключевых ферментов ЦТК, участвующих в процессах сверхсинтеза органических кислот. Цитратсинтаза и НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа из дрожжей У. lipolytica выделены, очищены и охарактеризованы. Исследованы механизмы регуляции этих ферментов интермедиатами ЦТК. Показано, что кинетические свойства цитратсинтазы У. lipolytica в условиях in vitro и in silu существенно различаются. Фермент в условиях in situ оказался значительно более устойчивым к ингибирующему воздействию цитрата и АТФ.

Установлены новые прииципы метаболической организации дрожжей. Новизна предполагаемого подхода состоит в том, что ферменты одного метаболического пути впервые рассматриваются не в качестве отдельных функциональных единиц, а как элементы единого структурно-функционального комплекса. С использованием различных методологических подходов показано взаимодействие между двумя последовательными ферментами ЦТК - цитратсинтазой и малатдегидрогеназой. Фермент-ферментный комплекс образует электростатический субстратный канал для оксалоацетата.

Ферменты ЦТК способны связываться как между собой, так и с внутренней мембраной митохондрий, образуя надмолекулярные комплексы (метаболоны). Такая организация метаболического пути способствует 1) формированию субстратных каналов, при котором субстраты передаются от одного фермента к последующему без выхода в раствор; 1) созданию микроокружения, в котором концентрация субстратов существенно повышается; и 3) эффективной и направленной регуляции клеточного метаболизма.

На примере пероксиеомальной цитратсинтазы впервые показана важность третичной структуры фермента для его функционирования в составе метаболона.

Практическая значимость работы

На основании изучения метаболической организации путей ассимиляции триглицеридов растительных масел и глицерина дрожжей У. lipolytica созданы

научные основы для разработки микробиологических способов получепия иировиноградной и лимонной кислот. Процессы получения лимонной кислоты из рапсового масла и нировиноградной кислоты из глицерина были воспроизведены в полупромышленных масштабах на Опытно-технологической установке ИБФМ РАН.

Разработаны простые оригинальные методы очистки внеклеточной липазы, глицеролкиназы, цитратсинтазы и НАД-зависимой юоцитратдегидрогеназы из У. Нро1уИса. Глицеролкиназа может быть использована для определения глицерина в микробиологической и медицинской практике. На способ получения глицеролкиназы из дрожжей получено авторское свидетельство № 1433980 (1988). Липаза из У. Иро1уИса может применяться в технологических процессах получения ценных жирных кислот из отходов производства растительных масел, а также для замены каталитического метанолиза ферментативным при производстве биодизеля.

Материалы диссертационной работы используются в лекциях для профессорско-преподавательского состава ВУЗов РФ.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: на четырнадцатой конференции "Транспорт и энергетика дрожжей" (Бонн, Германия, 1996), на третьей международной конференции по У. Нро1уИса (Дрезден, Германия, 2002), на 1-ом и 2-ом Конгрессах Федерации европейских микробиологических обществ (Любляна, Словения, 2003 и Мадрид, Испания, 2006), на девятнадцатом международном симпозиуме, посвященном достижениям в микробной безопасности пищевых продуктов (Порторош, Словения, 2004), на втором греческом симпозиуме биотехнологов (Афины, Греция, 2005), на международных конференциях «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" (Минск-Раков, Беларусь, 2006, 2007), на ежегодных международных конференциях Института биотехнологии "Биохимия и биотехнология микроорганизмов - продуцентов органических: кислот" (Авги-Салоники, Греция, 2006 • 2009), а также на ежегодных Отчетных сессиях ИБФМ РАН (1994-2008).

Конкурсная поддержка работы

Исследования проводились в 1985-2009 гг. в Лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН. На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР. Исследования были поддержаны федеральной целевой научно-технической программой "Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники на 2002-2006 гг." (госконтракт № ИФ-15/02-2006), Российским фондом фундаментальных исследований, международным грантом С1ШГ КВО - 10305, и договорами с ООО «Зеленые линии» и ООО «НТМ-ФАРМ».

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором или под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 54 печатные работа, в том числе, 28 статьи (в их числе 3 обзора) из списка журналов ВАК, рекомендуемых для докторских диссертаций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах,

содержит УЗ таблицы и У ? рисунков. Список литературы включает УУЗ наименований, из них Л&Ч- публикации в иностранных изданиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре обсуждаются современные достижения в области изучения неконвенционных дрожжей У. lipolytica, физиологические основы биосинтеза органических кислот - интермедиатов ЦТК, регуляция ключевых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла у микроорганизмов, а также структурно-функциональная организация ферментов матрикса митохондрий.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы. Реактивы, используемые для приготовления минеральных сред, были аналитической чистоты («Реахим», СССР). В работе использовали коммерческие ферментные препараты и биохимические реактивы фирм «Roche» (Германия), «Sigma» (США), «P-L Biochemicals» (США), «Amersham», США), хроматографические материалы были получены от фирмы «Pharmacia» (Швеция).

Микроорганизмы. В работе использовали природные штаммы Y. lipolytica из коллекции культур ИБФМ РАН и мутантные штаммы, полученные пугем комбинированной обработки природного штамма Y. lipolytica 704 (ВКМ Y-2373) ультрафиолетовым облучением и Л'-метил-А'-нитро-Л'-нитрозогуанидином. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae АТСС 26108 (S288C) и бактерии Escherichia coli XLl-Blue, которые использовались для молекулярно-биологических исследований, были получены из коллекции Департамента биохимии Университета Далласа.

Методы культивирования. Дрожжи культивировали в колбах на качалке или в ферментере АНКУМ-2М (Россия) объемом 3 л (исходный объем среды 1,5 л) и объемом 10 л (исходный объем среды 5,0 л) общепринятыми методами в минерально-солевой среде Ридер. Источником углерода и энергии служили рапсовое и подсолнечное масла, глицерин, глюкоза, олеиновая кислота. В ряде случаев рост дрожжей лимитировали тиамином (в случае продукции кетокислот) или азотом (в случае продукции лимонных кислот).

Активность ферментов определяли на спектрофотометре UV-160 «Shimadzu» (Япония) в бесклеточных гомогенатах клеток, отобранных в разные фазы роста. Дезинтеграцию дрожжей проводили на планетарной мельнице с помощью

«баллотини» или на прессе Френча. Методы измерения активности ферментов подробно изложены в диссертации. Единицу активности определяли как количество фермента, катализирующего превращение одного мкмоль субстрата или образование одного мкмоль продукта в минуту (Ед.).

Очистку ферментов проводили с использованием носителей и колонок фирмы «РЬагтпаЫа» (Швеция). Молекулярную массу нативных препаратов ферментов определяли методом гель-фильтрации. Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу субъединиц определяли электрофорезом в 10%-ном ПААГ в присутствии ЗБЭ по модифицированному методу Лэммли (ЬаеттП, 1970). Окрашивание препаратов белка проводилось Соота5.ч1е 11-250.

Экстракция нуклеотидов. НАД и адениновые нуклеотиды экстрагировали кислотой, а НАДН щелочью. Для этого к 20 мл клеточной суспензии, отобранной непосредственно из ферментера, быстро добавляли по 7 мл 0,3 N НС1 или 1 N ЫаОН. Суспензию инкубировали на водяной бане при 50°С в течение 10 мин при постоянном перемешивании, охлаждали и нейтрализовали до рН=7,0. Нейтрализованный экстракт центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин, и супернатант использовали для анализа нуклеотидов. Анализ адениннуклеотидов проводили люциферин-люциферазным методом на люминометре ЬКВ 1261 (Швеция). АМФ и АДФ определяли после энзиматической конверсии в АТФ. Пиридиннуклеотиды определяли циклическим методом на спектрофотометре иУ-160 «БЫтпаёги» (Япония).

Получение пермеабилизованых клеток. Псрмсабилизацию У. ИроШса проводили модифицированным методом УовЫпа й а1. (1979). I г (по сух. весу) клеток суспендировали в 4 мл 100 мМ калий-фосфатного буфера (рН=7,5), содержащего 41) мМ сорбитола. К суспензии клеток добавляли 15 мл толуола. Суспензия аккуратно перемешивалась при 37°С в течение 5 мин и потом охлаждалась на льду. Клетки были собраны центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин, ресуспендированы и отмыты в 20 мМ какодилатпом буфере (рН=7,1), содержащем 400 мМ сорбитола. Клетки, обработанные толуолом, суспендировали в вышеприведенном буфере в конечной концентрации 200 мг клеток/мл.

Связывание цитратсинтазы К Иро1уйса с внутренней мембраной митохондрий. Для выделения митохондрий клетки У. Иро1уИса дважды промывали дистиллированной водой и суспендировали в среде, содержащей 0,9 М сахарозы. 20 мМ фосфатного буфера (рН=6,0), 1 мМ ЭДТА и 3% лиофилизированного желудочного сока виноградной улитки. Суспензию клеток инкубировали с перемешиванием при 29°С в течение 90 мин. Затем клетки дважды промывали средой того же состава без улиточного фермента и центрифугировали при 6000 g 20 мин. Отмытые клетки суспендировали в среде, содержащей 0,5 М манита, 10 мМ фосфатного буфера (рН=7,2), 0,5 мМ ЭДТА и 0,1% БСА.

Суспензию клеток гомогенизировали при 14000 об./мин в течение 20 мин. Клетки центрифугировали при 3000 g 10 мин для удаления неразрушенных клеток и протопластов. Митохондрии осаждали при 7000 £ 10 мин. Осадок митохондрий (10 мг/мл) хранили на льду.

Для удаления внешней мембраны и получения митопластов митохондрии обрабатывали 0,75% раствором дигитонина в течение 10 мин (Огеешшак, 1974). Субмитохондриальные частицы (СМЧ) получали с помощью обработки митопластов ультразвуком (НаскепЬгоск. апс1 Натшоп, 1975). Митопласты (50 мг по белку) суспендировали в 25 мл дистиллированной воды, центрифугировали при 10000 g в

течение 10 мин, ресуспендировали в 1 мл воды и обрабатывали ультразвуком (20 кГц/сек, 40 Ватт) на льду. Обработку повторяли 8 раз по 15 сек и последний раз - 30 сек. Полученный препарат центрифугировали (10000 g. 10 мин) для удаления больших "невывернутых" везикул. СМЧ промывали 2 мМ HEPES буфером, рН=7.0 (буфер А) и собирали центрифугированием при 100 000 g и течение 1 ч.

Для электронного микроскопирования препараты мембран со связанными ферментами помещали на никелевые сетки. После промывки буфером А с 2% альбумином, сетки инкубировали с первичными антителами для цитратсинтазы (30 мин. 4°С). промывали и переносили в смесь вторичных антител, коныогированных с коллоидным золотом (Amcrsham, США), для мечения цитратсинтазы использовали частицы золоти диаметром ¡5 им. После инкубации (30 мин при 4°С) и отмывки, препарат фиксировали в 2% растворе глутарового альдегида, и сетки анализировали на электронном микроскопе ЕМ301 (Phillips. США).

Наличие субстратного канала оксалоацетата внутри комплекса ферментов цитратсинтазы и малатдегидрогеназы было подтверждено с использованием 1) рекомбинантиого дрожжевого белка цитратсинтаза/малатдегидрогеиаза и 2) коммерческих препаратов малатдегидрогеназы (митохондриальной и цитозольной) и цитратсинтазы (фирмы Sigma) методами Hummer-Dreyer хроматография и осаждением комплекса ферментов в полиэтиленгликоле (ПЭГ). Методы анализа подробно изложены в диссертации.

Метаболические эффекты дислогсализации цитратсинтазы определяли в клетках дрожжевых мутантов citl (citl::LEU2) и citlcit2 (citl::LEU2 cit2::URA2), неспособных к росту на ацетате. Методы анализа подробно изложены в диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Пути метаболизма глицерина и растительных масел у К lipolytica

В настоящее время известно два основных пути метаболизма глицерина у

дрожжей:

1) фосфорилирование глицерина пшцеролкииазой (КФ 2.7.1.30) с образованием глицерол-3-фосфатя и последующее дегидрирование до диоксиацетонфосфата ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой (КФ 1.1.99.5) и ПАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой (К.Ф. 1.1,1,8) (фосфорилирующий путь);

2) окисление глицерина глицеролдегидрогеназой (КФ 1.1.1.6) и фосфорилирование образовавшегося диоксиацетона диоксиацетонкииазой (КФ 2.7.1.28) (окислительный путь).

Ранее фосфорилирование глицеролкиназой считалось единственным механизмом вовлечения глицерина в метаболизм дрожжей. Для ряда дрожжей описан окислительный путь, в котором глицерин окисляется до диоксиацетона, и последний фосфорилируется до диоксиацетонфосфата (May and Sloan, 1981 ).

Пути метаболизма глицерина у Y. lipolytica (продуцентов органических кислот) были изучены в сравнении с Candida valida (продуцентом цитохрома с). Результаты определения активности ферментов, катализирующих начальные -этапы как фосфорилирующего, так и окислительного путей метаболизма глицерина, в бееклеточных экстрактах Y. lipolytica и С. valida представлены в табл. 1. Ферменты, катализирующие реакции окислительного пути НАД- и НАДФ-зависимая глицеролдегидрогеназы, диоксиацстонкиназа и глицеролоксидаза не обнаружены в

Таблица 1. Активности ферментов (мкмоль/мин на мг белка) метаболизма глицерина

Фермент Y. lipolytica С. valida

Глицерин Глюкоза Глицерин

Фосфорилирующий путь

Глицеролкиназа ОД 05 0,047 0

Глицерол-З-Ф-дегидрогеназа (НАД'1) 0,052 0,005 0

Глицерол-З-Ф-дегидротеназа (ФАД^) 0,041 0,003 0

Окислительный путь

Глицеролдегидрогеназа (НАД*") 0 и.о. 0,300

Диоксиацетонкиназа 0 и.о. 0,081

Глицеролдегидрогеназа (НАДФ4) 0 И.О. 0

Глицеролоксидаза 0 И.О. 0

грубых экстрактах клеток К lipolytica. Высокие активности пшцеролкиказы, НАД- и ФАД-глицерол-З-фосфат-дегидрогеназ и индуцибелькый характер этих ферментов позволяет предположить, что у Y. lipolytica функционирует только фосфорилирующий путь метаболизма этого субстрата.

Функционирование глицеролдегидрогеназного пути метаболизма глицерина обнаружено у С. valida. В экстрактах этих дрожжей обнаружены глицеролдегидрогеназа и диоксиацетонкиназа, а глицеролкиназа и глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы отсутствовали. Дрожжи С. valida обладают высокой активностью алкогольдегидрогеназы. Поскольку алкогольдешдрогеназа характеризуется широкой субстратной специфичностью, можно было бы предположить, что этот фермент катализирует НАД-зависимое окисление глицерина. Однако это предположение не подтвердилось. С использованием гидрофобной хроматографии удалось четко разделить алкоголь- и глицеролдегидрогеназу. При этом алкогольдешдрогеназа не катализировала НАД-зависимое окисление глицерина, а глицеролдегидрогеназа, в свою очередь, не проявляла алкогольдегидрогеиазиой активности. Исходя из полученных результатов, можно полагать, что у С. valida имеется фермент, специфичный для глицерина и катализирующий его окисление с НАД в качестве кофактора. НАДФ-зависимого окисления глицерина в экстракте изучаемых дрожжей не обнаружено, отсутствовала также и активность глицеролоксидазы.

Такие различия в путях метаболизма глицерина можно объяснить физиологическими особенностями исследуемых дрожжей: Y. lipolytica - строго аэробный организм, в то время как С. valida являются дрожжами бродильного типа. Побочным продуктом при брожении является глицерин. Образование глицерина происходит из-за избытка НАДН, появляющегося при ассимиляции сахара в биомассу (Hofmann, 1983). Глицеролдегидрогеиаза способна катализировать реакцию восстановления диоксиацетона в глицерин при физиологических условиях. Следовательно, можно предположить, что у дрожжей, способных к брожению, в аэробных условиях глицеролдегидрогеназа может отвечать за первый этап ассимиляции глицерина, а при анаэробной ферментации Сахаров служить клапаном для сброса восстановительных эквивалентов, катализируя образование глицерина.

Известно также, что С. valida при роете на глюкозе в условиях дефицита фосфора способны накапливать в среде глицерин (Еремина, Финогенова, 1990), a Y. lipolytica экскретирует в среду не глицерин, а лимонную кислоту (Лозинов, 1974). Способность накапливать в среде глицерин у разных видов дрожжей может бьггь связана с наличием или отсутствием глицеролдегидрогеназы.

Для более детального изучения путей метаболизма глицерина у Y. lipolytica и выяснения механизмов его регуляции глицеролкиназа была выделена, очищена и охарактеризована.

Очистка и свойства глицеролкиназы

Для очистки глицеролкиназы из Y. lipolytica была разработана оригинальная, высокоэффективная методика, на которую было получено авторское свидетельство № 1433980 (1988). Очистка состояла из трех стадий (табл. 2). На первой стадии прогреванием экстракта удаляются менее термостабильные белки. Глицеролкиназа является термостабильным ферментом и выдерживает нагревание до 60° С в течение 10 мин практически без потери активности. В то же время, тепловая обработка позволила избавиться более чем от 50% всего количества балластных белков. После тепловой обработки препарат фермента подвергали дополнительной очистке с помощью ионно-обменной и гидрофобной хроматографии. В результате глицеролкиназа была очищена более чем в 300 раз с выходом 51% и имела удельную активность 17,8 мкмоль/мин на мг белка.

Таблица 2. Очистка глицеролкиназы Y. lipolytica

Стадия очистки Общий белок (мг) Общая активность (Ед.) Удельная активность (мкмоль/мин на мг белка) Выход (%) Степень очистки

Грубый экстракт 1320 77,9 0,059 100 1

Прогрев 510 77,5 0,152 99 2,6

ДЭАЭ-сефароза 32,4 48,6 1,5 62 25,4

Фенил-сефароза 2,3 40,9 17,8 51 301,3

Субклеточная локализация ферментов метаболизма глицерина у У. Иро1уйса и физиологическая роль глицерол-3-фосфат-дегидрогеиаз

Первый этап превращения глицерина - фосфоршшрование - локализован в цитоплазме. Доказательством этого служит тот факт, что 93% активности глицеролкиназы обнаруживалось в растворимой фракции после дифференциального центрифугирования. Следующий этап ассимиляции глицерина - дегидрирование образовавшегося в глицеролкиназной реакции глицерол-3-фосфата - может

катализироваться двумя различными оксидоредуктазами - ФАД-зависимой глидсрол-3-фосфат-дегмдрогеназой и ЫАД-зависимой глицсрол-3-фосфат-дегидрогепазой. ФАД-зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа ассоциирована с фракцией мембранных органелл. Более 75% активности этого фермента при дифференциальном центрифугировании обнаружено во фракции частиц. При этих же условиях примерно 70% активности фумаразы, маркерного фермента митохондрий, определялось в той же фракции. Одинаковый характер распределения этих двух ферментов позволяет предположить, что они ассоциированы с одной субклеточной органеллой.

Более 55% ПАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы связано с фракцией частиц. Примерно также распределяются активности пероксисомальиых ферментов (изоцитрат-лиазы и каталазы).

Теоретически можно предположить три метаболических функции для НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дсгидрогеназы: восстановление диоксиацетон-фосфата для биосинтеза триглицеридов, окисление глиперол-3-фосфата, образовавшегося при ассимиляции глицерина, и поддержание редокс-иотенциала.

Литературные данные о метаболической роли глицсрол-3-фосфат-дегидрогешпы из различных источников немногочисленны и противоречивы. Участие и поддержании редоке-состоянил предполагается для фермента из мышц курицы (Wait and Kaplan, 1972) и дрожжей, ассимилирующих н-алканы (Kawamoto et al., 1979); катаболическая роль - для ферментов из Escherichia coli (Kito and Pizer, 1968), печени курицы (Harding, 1975) и Neurospora crasxa (Courtright, 1975). Биосинтетическая роль обсуждалась для ферментов из Saccharomyces cetevisiae (Holmann. 1983) и Е. coli (Kito and Pizer, 1968).

Десятикратное увеличение активности НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы наблюдалось у У. ¡ipolytica при росте на глицерине, по сравнению с клетками, выращенными на глюкозе (табл. 1). Казалось бы, что основная роль данного фермента в ыетках заключается в дегидрировании глицерол-3-фосфата, образующегося в глицеролшпазной реакции. С другой стороны, японские исследователи предположили, что НАД-зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа вовлечена в глицерол-3-фосфат-диоксиацетон-фосфат-челночнуго систему, функционирующую в алкан-утилизирующих дрожжах. Данная система служит для транспорта восстановительных эквивалентов, образующихся в пероксисомах во время /5-окисления жирных кислот (Kawamoto et al., 1979).

Дрожжи У. Iipolytica, Trichosporon candida и Candida maltosa были выращены на глицерине и гексадекаие, и в бесклеточных экстрактах дрожжей определены активности ферментов начальных этапов метаболизма глицерина. Активности этих же ферментов были определены у С. utilis, не способных ассимилировать н-алканы, и у метанолькых дрожжей С. boidinii, выращенных на глицерине. Также были определены активности ферментов начальных этапов ассимиляции гексадекана. Результаты представлены в табл. 3. Активность НАД-зависимой глицсрол-3-фосфат-дегидрогеназы в клетках дрожжей, выращенных на гексадскане, значительно выше, чем на глицерине.

У дрожжей, не ассимилирующих н-алканы, этот фермент вообще не обнаружен. Активности ферментов, участвующих в метаболизме н-алканов (цитохром Р-450, оксидаза высших спиртов, дегидрогеназы высших альдегидов, ацил-КоА-оксидаза, изоцитрат-лиаза), у всех исследованных дрожжей были выше при росте на гексадекане. В тоже время активность ключевого фермента ассимиляции

Таблица 3. Активности ферментов (мкмоль/мин на мг белка) метаболизма глицерина и н-алканов у дрожжевых организмов

Фермент Y. lipolytica Т. candida С. maltosa С. utillis С. ЪоШпп

глицерин гексадекан глицерин гексадекан глицерин гексадекан глицерин глицерин

Глнцеролкиназа 0,105 0.021 0,121 0,065 0,095 0,029 0,172 0,073

Глицерол-З-Ф-дегидрогеназа (НАД4) 0,052 0,208 0,045 0,275 0,044 0,137 0 0

Глицерол-З-Ф-дегидрогеназа (ФАД*) 0,041 0,040 0,049 0,063 0,032 0,052 0,048 0,027

Цитохром Р-450 0,012 0,045 0,015 0,039 0.010 0,051 0 0

Оксидаза высших жирных спиртов 0,015 0,080 0,044 0,120 0,035 0,153 0 0

Дегидрогеназа высших альдегидов 0,034 0,096 0,075 0,180 0,064 0,179 н.о. н.о.

Ацил-КоА-оксидаза 0,023 0,109 0,056 0,115 0,045 0,120 н.о. н.о.

Изоцитрат-лиаза 0,030 0,089 0,039 0,123 0,042 0.122 н.о. н.о.

н.о. - не определяли

глицерина - глицеролюшазы - выше в клетках дрожжей, выращенных на глицерине. Активность ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы при выращивании дрожжей на глицерине и гексадскане изменялась незначительно. Эти результаты дают возможность предположить, что основная физиологическая роль НАД-зависимой глицерол-З-фосфат-дегидрогеназы связана не с ассимиляцией глицерина, а с метаболизмом н-алканов. В окислении глицерол-3-фосфата, образующегося в глицеролкиназиой реакции, основную роль, по-видимому, играет ФАД-зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа.

Таким образом, у !'. Иро1уНса (рис. 1) вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилироваиия глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицсрол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогсназы.

ГЛИЦЕРИН

Глицерол-З-Ф

г.

Митохондрия Г'лицерол-3-Ф

Диоксианетон-Ф

Диокспацктон-Ф

Глицеральдегвд-Ф

Гликолиз

Рнс. 1. Окисление глицерина у У. Нро1уНса (1 - глицеролкиназа, 2 - глицерол-З-Ф-дегидрогеназа (ФАД), 3 - глицерол-З-Ф- дегидрогеназа (НАД), 4 -триозофосфат-изомераза).

Особенности ассимиляции триглицеридов растительных масел

и продуктов их гидролиза у К Ир/Яуйса

Н2С —О—С—Я] Н2С—- ОН

О Липаза не —О—С —112 *-НС —ОН + 3 СпНззСООН

' ,, ' Олеиновая

Н2С—О—С —ЯЗ Н2С—ОН

II кислота

Глицерин

Триглицсрид

До настоящего времени не были определены механизмы ассимиляции продуктов гидролиза у дрожжевых организмов. Предполагалось, что могут быть реализованы два механизма потребления этих субстратов: одновременное потребление глицерина и жирных кислот или последовательное потребление вначале одного, и потом другого метаболита (т.е. диауксия).

При выращивании дрожжей У. Иро1у(ка в среде с рапсовым маслом в качестве единственного источника углерода, показано, что при потреблении масла на протяжении всего процесса культивирования содержание глицерина в среде сохранялось на одном уровне (0,059 - 0,125 г/л). В процессе культивирования не менялся также и качественный состав внеклеточных липидов (три-, ди-, моноглицеридов) и свободных жирных кислот в среде. Исходя из полученных результатов, высказано предположение, что потребление глицерина и жирных кислот у У. Нро/уКса происходит одновременно. Дополнительным доводом в пользу этого предположения явилось сравнительное изучение активности ферментов в разные фазы роста У. Иро1уИса на подсолнечном масле, глицерине и олеиновой кислоте (табл. 4). При ассимиляции масла с первых часов культивирования (6 ч) наблюдается индукция ключевого фермента метаболизма глицерина - глицеролкиназы, активность которой на 30% снижена в сравнении с активностью фермента у клеток, растущих на глицерине, но существенно выше активности фермента у клеток, растущих на олеиновой кислоте. Также у дрожжей при росте на масле с первых часов индуцировались и ферменты глиоксилатного цикла - изоцитрат-диаза и малат-синтаза, участвующие в метаболизме жирных кислот. В клетках, растущих на олеиновой кислоте, активность изоцитрат-лиазы в 14,7 и малат-синтазы в 10 раз выше в сравнении с клетками, растущими на глицерине.

Таблица 4. Активности ферментов (мкмоль/мин на мг белка) ЦТК и глиоксилатного цикла при росте У. Иро/уИса на различных С-источниках

Источник углерода Время (ч) ГК ЦТК ГЦ

ЦС АК НАД-ИДГ НАДФ-ИДГ ИЛ МС

Масло 6 0,254 2,04 0,92 0,06 0,058 0,089 0,054

12 0,254 2,44 1,02 0,06 0,068 0,109 0,064

24 0,254 1,96 0,87 0,058 0,068 0,093 0,035

Глицерин 6 0,363 0,82 0,33 0,105 0,120 0,009 0,012

12 0,360 0,90 0,43 0,115 0,132 0,009 0,014

24 0,300 0,84 0,42 0,117 0,152 0,01 0,010

Олеаг 6 0,112 1,70 0,53 0,1 0,07 0,133 0,1

12 0,112 1,90 0,53 0,1 0,06 0,134 0,13

24 0,112 1,90 0,52 0,1 0,07 0,144 0,12

ГЦ - глиоксилатный цикл, ГК - глицеролкиназа, ЦС - цитратсинтаза, АК - аконитат-гидратаза, НАД-ИДГ - НАД-зависимая изоцитратдегндрогеназа, НАДФ-ИДГ - НАДФ-зависимая изоцитратдегндрогеназа, ИЛ - изоцитрат-лиаза, МЛ - малат-синтаза

В последующие часы культивирования (12 ч и 24 ч) активность глицеролкиназы у дрожжей при росте на масле поддерживалась на постоянно высоком уровне, что, по-видимому, связано с активным потреблением глицерина, непрерывно образуемого в ходе всего процесса ассимиляции масла. Также активности изоцитрат-лиазы и малат-синтазы сохранялись иа высоком уровне, что, обусловлено активным потреблением образуемых жирных кислот в ходе всего процесса.

Однако необходимо отметить, что одновременное потребление из среды двух субстратов не является типичным для микроорганизмов. Традиционно считается, что микроорганизмы при росте на двух и более субстратах используют преимущественно углеводы, в сравнении с другими источниками углерода. Этот феномен, известный как катаболитиая репрессии, позволяет микроорганизмам более эффективно использовать субстраты, присутствующие в срсде. Модели, описывающие молекулярные механизмы катаболитной репрессии, были разработаны для Е. coli. Дрожжи S. cerevisiae также являются объектами изучения катаболитной репрессии (üancedo, 1992; Enlian and Shuller, 1997). Данный феномен у Y. lipolytica не изучен.

Нами для У. lipolytica обнаружено, что при выращивании на среде, содержащей смесь двух субстратов (глицерин + олеиновая кислота) в течение всего процесса культивирования происходило одновременное потребление из среды и глицерина, и олеиновой кислоты. Ферменты глицеролкиназа, малат-синтаза и изоцитрат-лиаза индуцировались с первых часов роста и их активности сохранялись высокими в течение всего культивирования.

Вместе с тем, на среде, содержащей глюкозу и олеиновую кислоту, в первые 12 ч роста наблюдалось потребление глюкозы, а уровень олеиновой кислоты практически не изменялся. После потребления глюкозы из среды начиналась ассимиляция олеиновой кислоты, сопровождающаяся резким приростом биомассы. Показано, что в первые часы роста активности изоцитрат-лиазы и малат-синтазы были очень низкими, т.е. ферменты репрессировались высокими концентрациями глюкозы в среде. Индукция ферментов, вовлеченных в метаболизм жирных кислот, отмечалась только после 12 ч роста, когда содержание глюкозы снижалось до 2,5 г/л.

Дрожжевая изоцитрат-лиаза рассматривается как конститутивный фермент, подвергающийся катаболитной репрессии (Whitworth and Ratledge, 1975; Evans and Ratledge, 1985; Ermakova et al., 1986; Kubicek el al., 1988). Известно, что фосфоснолпирупат является ингибитором изоцитрат-лиазы у ряда бактерий, грибов и водорослей, и значение Ki для этого соединения очень низкое - 0,13 - 0,20 мМ (Entian and Shuller, 1997; Holdsworth et al., 1988; Barth and Scheuber, 1993). Еще одним ингибитором изоцитрат-лиазы является пируват, значение Ki для этого соединения у С. guillicrmondii равно 0,8 мМ, а у С. tropicalis - 0,5 мМ (Gancedo, 1992).

При выращивании У. lipolytica на среде, содержащей глюкозу и гсксадекан, также наблюдается последовательное потребление субстратов: в первые 14 ч роста происходило потребление глюкозы и содержание гексадекана в среде не изменялось; после 14 ч следовал 4,5 ч лаг-период, когда не происходило потребления азота и гексадекана и далее с 18 ч роста накопление биомассы происходило только за счет потребления гексадекана. Как и в случае со средой, содержащей глюкозу и олеиновую кислоту, в первые часы роста активности изоцитрат-лиазы и малат-синтазы были низкими. Индукция ферментов отмечалась только после 14 ч роста культуры, и оставалась высокой на протяжении дальнейшего процесса культивирования. Можно заключить, что глюкоза или ее метаболиты у У lipolytica

являются репрессорамп ферментов, ответственных за метаболизм других источников углерода, в то время как глицерин является нерепрессирутощим субстратом.

Очистка и свойства липазы у У. lipolytica Таксономическим признаком У. lipolytica является липолитическая активность (Lodder et al, 1972). Еще в 80-е годы в работах Института микробиологии РАН было выдвинуто предположение, что липаза дрожжей С. lipolytica структурно связана с клеточной стенкой (Звягинцева, 1972; Рубан с соавт., 1976). В литературе обсуждается способность дрожжей продуцировать различные типы липаз и зависимость их продукции от состава среды и условий культивирования (Ota et al., 1982; Pereira-Meireles et al., 1997; Pereira-Meireles and Rocha Leao, 2000).

Для отбора продуцента липазы предварительно был проведен скрининг среди 29 штаммов У. lipolytica в чашках с агаризованной средой Lodder, содержащей говяжий жир, и в среде Ридер с рапсовым маслом. Штамм Y. lipolytica 704 отобран в качестве активного продуцента липазы с активностью 2760 Ед./мл (табл. 5). Кроме того, продуцент характеризовался высоким кислотообразованием, содержание лимонной кислоты на 6 сутки при культивировании в колбах составляло 12,7 г/л.

Установлено, что такие факторы, как фаза роста, рН среды, аэрация, концентрация масла, состав питательной среды оказывают существенное влияние на экскрецию липазы. Подобраны условия, обеспечивающие максимальную реализацию липазы в культуральную жидкость: источник углерода - рапсовое или подсолнечное масло, источник азота - смесь пептона (3%) и сульфата аммония (3%). оптимум рН=5,5-6,5, низкая аэрация среды (концентрация кислорода в среде 15-20% насыщения).

Таблица S. Активность липазы и образование лимоиных кислот у дрожжей У. lipolytica

Штаммы Липаза ЛК (г/л) Штаммы Липаза J'lK (г/л)

Метод А Метод Б Метод А Метод Б

У. lipolytica Al "I" 1 1956 3,1 У. lipolytica 681 ++ ISO и.о.

У. lipolytica N15 •++++ 1836 10,0 У. lipolytica 682 ++++ 840 5,1

Y .lipolytica 212 +++ 600 2,7 У. lipolytica 683 lili 1200 4,0

Y .lipolytica 217 +++ 600 2,9 Y. lipolytica 694 +++ 1200 2,8

У. lipolytica 374 +++ 396 2,5 Y .lipolytica 695 +++ 396 1,7

Y. lipolytica 607 +++ 900 3,8 Y.lipolytica 696 ++ 264 и.о.

Y .lipolytica 645 ++++ 756 2,9 Y. lipolytica 702 +++ 396 3,8

У. lipolytica 646 + 264 н.о. У. lipolytica 704 ++++++ 2760 12,7

Y. lipolytica 655 ++ 288 и.о. У. lipolytica 706 ++++ 798 4,1

У. lipolytica 666 + 222 и.о. Y. lipolytica 709 ++++ 420 4,1

У. lipolytica 667 +++ 516 2,7 Y. lipolytica 710 ++++ 840 5,3

Y. lipolytica 668 +++ 798 4,0 Y. lipolytica 711 +++ 600 5,1

У. lipolytica 672 ++++ 120 и.о. У. lipolytica 716 +++ 810 4,4

У. lipolytica 674 ++++ 1680 3,2

Метод А - Липолитическую активность оценивали по зонам помутнения среды, связанным с появлением нерастворимых кальциевых солей жирных кислот, образуемых в ходе гидролиза жира. Метод Б - Активность липазы (Ед./мл) определяли титрометрическим методом у дрожжей при культивировании в жидкой среде Ридер с рапсовым маслом (20 г/л) в качестве источника углерода и энергии.

Метод очистки липазы. Внеклеточная липаза из У. lipolytica 704 при культивировании в среде с рапсовым маслом была очищена за три стадии (табл. б). На первой стадии в связи с отсутствием фермента в фильтрате культурапьной жидкости клетки подвергали солюбилизации 0,2%-ным раствором Triton Х-100 или обрабатывали ультразвуком. На следующей стадии экстракт фракционировали сульфатом аммония (80% от насыщения). Полученный после высаливания осадок растворяли в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН=7,5) и наносили на колонку с фснил-сефарозой. Элюцшо липазы проводили в градиенте сульфата аммония (1-0 М). Фракции, содержащие активность фермента, объединяли и концентрировали на диализной ячейке. В результате внеклеточная липаза была очищеиа более чем в 16,7 раз с выходом 44,21 % и имела удельную активность 1350 мкмоль/мин на мг белка. Очищенная липаза была гомогенна при ультрацентрифугироиапии и электрофорезе.

Таблица 6. Очистка липазы из У. lipolytica

Стадия очистки Общий белок (мг) Общая активность (Ел.) Активность (мкмоль/ми н на мг белка) Выход (%) Степень очистки

Грубый экстракт + УЗ или обработка 0,2% Triton Х-100 25,0 4580,0 183,20 100 1

Осаждение (NH4)2S04 6,6 1634,61 247,67 35,69 3,79

Фенил-сефароза 1,5 2025,0 1350,00 44,21 16,7

Свойства липазы. Липаза из К ¡ipolytica 704 имела молекулярную массу порядка 38 кДа и соответствовала молекулярной массе других штаммов (32-39 кДа) (Ota et al., 1982; Pereira-Meireles et al., 1997). Оптимум pH=8,0, стабильность препарата сохраняется в диапазоне рН=6,0-9,0. Фермент выдерживает инкубацию при 50° С в течение 10 мин. Активность липазы ингибировалась ионами тяжелых металлов и активировалась ионами Mrt2+, Mg2' и Са2+.

2. Механизмы сверхсинтеза органических кислот у У. lipolylica

Биосинтез кетокислот у Y. lipoíytico при росте на глицерине и глюкозе Основным условием сверхсинтеза кетокислот у Y. lipolyíica является лимитирование их роста тиамином при избытке в среде источников углерода, азота и других биогенных элементов (Ермакова, 1971; Лозинов, Финогенова, 1972).

17 штаммов дрожжей, относящихся к роду Candida, были проверены на образование кетокислот при росте и среде с глицерином или глюкозой. Глюкозу очищали от следов витаминов (в том числе тиамина) встряхиванием раствора с активированным углем марки АГС-4. Большинство из исследуемых дрожжей были способны синтезировать пировиноградную кислоту (ПВК) и а-кстоглутаровую кислоту (КГК) как в среде с глицерином, так и в среде с глюкозой. При этом как абсолютное количество накапливаемых в среде кетокислот, так и их соотношение было различным. Для дальнейших исследований как наиболее активный кислотообразователъ выбран штамм У. lipolyíica 374/4.

Дрожжи У. Нро1уИса 374/4 выращивали в среде с разлитыми лимитирующими концентрациями тиамина. В качестве источника углерода использовали глюкозу или глицерин (рис. 2). Накопление биомассы на обоих субстратах было пропорционально количеству внесенного в среду тиамина, причем и на глюкозе, и на глицерине этот прирост был практически одинаков. Однако при этом наблюдались различия в экскреции кетокислот. В среде с глюкозой при повышении концентрации тиамина в пределах исследуемых концентраций повышался выход КГК, в то время как выход пирувата падал. При концентрациях тиамина в среде 1-2,5 мкг/л накапливалась преимущественно ПВК, а при концентрациях 3-5 мкг/л соотношение менялось в пользу КГК. В среде с глицерином при всех исследованных концентрациях тиамина наблюдался преимущественный синтез ПВК, хотя соотношение ПВК/КГК менялось в зависимости от концентрации тиамина.

глицерин

10 п

т Ю

0 2 4 6 8 10 тиамин (мкг/л)

Рис. 2. Влияние концентрации тиамина в среде на кислотообразование у У. Нро1уИса 374/4.

• - Биомасса, А- ПВК, я - КГК

Биосинтетическая активность У. Иро1уИса 374/4 была проверена в ферментере при концентрации тиамина в среде 8 мкг/л, которая обеспечивает накопление 10 г/л биомассы. Накопление кетокислот начинается в фазе замедленного роста и интенсивно продолжается в стационарной фазе. Как на глицерине, так и на глюкозе наблюдается преимущественный синтез ПВК, и на 78 ч в среде с глицерином отмечалось накопление 61,3 г/л ПВК и 10 г/л КГК, а в среде с глюкозой - 41 г/л ПВК и 8 г/л КГК (рис. 3).

Для изучения путей биосинтеза кетокислот были определены активности ферментов начальных этапов метаболизма глицерина и глюкозы, ЦТК и анаплеротических путей. Клетки отбирались в фазу экспоненциального роста (нет кислот), в фазу замедленного роста (начало синтеза кислот) и в стационарную фазу (в период активного синтеза кетокислот) (табл. 7, 8).

Как было отмечено выше, фосфорилирование глицерина до глицерол-3-фосфата с участием глицеролкиназы является единственным путем вовлечения глицерина в метаболизм у У. Нро!уИса. Как видно из табл. 7, активность глицеролкиназы не изменяется в фазе замедления роста, когда начинается синтез

глицерин

24 48 72 Время (ч)

24 48 Время (ч)

Рис. 3. Сверхсинтез кегокислот у У. Иро!уИса 374/4 в условиях дефицита тиамина (культивирование в ферментере). ® - Биомасса, А - ПВК, ■ - КГК

Таблица 7. Активность ферментов (мкмоль/мин на мг белка) путей метаболизма глицерина

ФЕРМЕНТЫ Экспоненциальная фаза Фаза замедления роста Стационарная фаза

Начальные этапы ассимиляции глицерина

Глицеролкиназа 0,105 0,095 0,130

Глицерол-ЗФ-дегстдрогеназа (НАД4) 0,052 0,026 0,023

Глицерол-ЗФ-дегидрагеназа (ФАД1") 0,041 0,085 0,082

/ликолиз

6-фосфофруктокииаза 0,07 0,06 0,05

Фруктозо-бис-фосфатальдолаза 0,105 0,105 0,100

Трлозофосфатизо.чсраэа 0,200 0,170 0,165

Глнцеральдегидфосфатдегидрогеназа 0,120 0,098 0,130

Пируваткиназа 0,350 0,300 0,280

Пиру ватде 1 и дрогеназа 0,120 0,06 0,03

ЦГК

Цитратсинтаза 0,9 0,885 0,825

Изоцитратдегидрогеназа (НАД1) 0,115 0,152 0,195

Изоцитратдегн дрогеназа (Н АДФ^ 0,152 0,250 0,255

2-оксоглутаратдегидрогеназа 0,110 0,024 0,016

Малатдегидроген аза 2,00 2,125 2,55

Анаплеротические пути

Малат-синтетаза 0,014 0,012 0,016

Изоцитрат-лназа 0,009 0,022 0,012

Пируваткарбоксилаза 0,014 0,028 0,053

Пнруватдекарбоксилаза 0,008 0,013 0,0112 ....

даже несколько увеличивается. Наблюдается увеличение активности и НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы. Высокой на всем протяжении культивирования остается активность малатдегидрогеназы. Дефицит тиамина вызывал резкое снижение активности 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса (от 0,11 мкмоль/мин на мг белка в экспоненциальной фазе до 0,016 мкмоль/мин на мг белка при синтезе кетокислот). При добавлении в реакционную смесь тиаминпирофосфата активность 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса увеличивается незначительно (до 0.042 мкмоль/мин мг белка). Причиной этого может быть нарушение биосинтеза фермента, вызванное дефицитом тиамина, или протеолитическое расщепление фермента в отсутствии кофактора кетокислот, и остается на высоком уровне в стационарной фазе. Активность НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы снижается в 2 раза в условиях дефицита тиамина и синтеза кетокислот. В то же время активность ФАД-зависимого фермента возрастает вдвое при замедлении роста культуры, что подтверждает предположение о ключевой роли данного фермента в окислении глицерол-3-фосфата. Активности ключевых ферментов, участвующих в превращении диоксиацетоифосфатата в пируват, - глицеральдегид-фосфат-дегидрогеназы и пируваткиназы - при дефиците тиамина сохраняются на уровне, близком к таковому в период экспоненциального роста. Активность пируватдегидрогеназного комплекса снижается от 0,12 мкмоль/мин мг белка в экспоненциальной фазе до 0,06 мкмоль/мин на мг белка в фазе замедления роста и 0,03 мкмоль/мин на мг белка в стационарной фазе. При этом необходимо отметить, что синтез апофермента в условиях дефицита тиамина в клетке идет с высокой скоростью - активность пируватдегидрогеназы, измеренная при внесении в реакционную смесь пирофосфата, хотя и несколько ниже активности, обнаруживаемой при экспоненциальном росте, но значительно более высока, чем в отсутствии тиаминового кофактора. Активность ключевого фермента Ц'ГК цитратсинтазы незначительно снижается при переходе клеток в стадию синтеза кислот, а активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы.

Окисление глюкозы протекало по механизму гликолиза и пентозофосфатного пути. Для Aspergillus niger показано, что пентозофосфатный путь доминирует над гликолизом в фазу роста (Rohr et al., 1987; Legisa and Kidric, 1989). Для }'. lipolylica характерны и высокие активности гликолитических ферментов (гексокиназы, 6-фосфофруктокиназы, фруктозобисфосфат-альдолазы и пируваткиназы), и высокие активности ферментов пентозофосфатного пути (глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, фосфоглюконатдегидрогеназы и транскетолазы) в фазу роста (табл. 8). При недостатке тиамина в фазе замедления роста активность гексокиназы сохранялась на уровне активности в ростовой фазе и снижалась на 30% в стационарной фазе роста, активность 6-фосфофруктокиназы увеличивалась в 2 раза и удерживалась на этом уровне. Активность фруктозобисфосфат-альдолазы увеличивалась в 2 раза в фазе замедления роста культуры и достигала значения контроля в стационарной фазе роста. Активность пируваткиназы не изменялась в фазе замедления роста и уменьшалась в два раза в стационарной фазе роста, продолжая оставаться на высоком уровне. При дефиците тиамина постепенно снижалась активность глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, достигая в стационарной фазе роста 50% от контроля. Активность фосфоглюконатдегидрогеназы практически не изменялась.

Активность тиаминового фермента - транскетолазы, резко снижалась, и в клетках стационарной фазы составляла только 10% от исходной.

Таблица 8. Активность ферментов (мкмольЛшн на мг белка) метаболизма глюкозы у У. Иро1уНса

ФЕРМЕНТЫ Экспоненциальная Фаза Стационарная

фаза замедления фаза

роста

Пеюпозофосфатпый путь

Глюкозо-б-фосфат-дегидрогеиаза 0.412 0,346 0,246

Фосфоглюконатдегидрогеназа 0,447 0,408 0,402

Транскетолаза 0,427 0,060 0,044

Гликолиз

Гексокиназа 0,359 0,334 0,224

б-фоефофруктокипаза 0,072 0,145 0,154

Фруктозобисфосфатальдолаза 0,058 0,099 0,055

Пируваткнназа 0,1 0,1 0,12

Пи ру ватдегидро геназа 0,151 0,158 0,083

ЦТК

Цитрат-синтаза 0,71 0,631 1.3

Изоцитратдешдрогеназа (НАД) 0,110 0,142 0,257

Изоцитратдегидрогеназа ШАДФ) 0,136 0,142 0,360

2-оксогл утарагдегидротеназа 0,110 0,042 0,010

Малатдегидрогеиаза 2,500 4,70 7,000

Лнаплеротические пути

Малат-сингетаза 0,020 0,018 г 0,011

Изоцитрат-лиаза 0,014 0,016 0,014

Пируваткарбоксилаза 0.067 0,081 0,080

Пируватдекарбоксилаза 0,032 0,036 0,031

Превращение пирувата в ацетил-КоА осуществлялось двумя путями. С одной стороны, гшруват декарбоксилировался до ацетил-КоА при участии пируватдегидрогеназного комплекса, а с другой стороны, пируват декарбоксилировался до ацетальдегида пируватдекарбоксилазой, и ацетальдегид окислялся до ацетата альдегид-дегидрогеназой. Ацетил-КоА-синтетаза катализировала образование Ацетил-КоА из КоА и ацетата.

Удельная активность пируватдегидрогеназного комплекса в фазу роста составляла 0,151 мкмоль/мин на мг белка, сохранялась на этом уровне в фазе замедления роста культуры и уменьшалась в 2 раза в стационарной фазе. Активности пируватдекарбоксилазы, альдегид-дегидрогеназы и ацстил-КоА-синтазы в экстрактах были значительно ниже активности пируватдегидрогеназного комплекса, но сохранялись на том же уровне в процессе синтеза кислот. В клетках стационарной фазы роста активности ферментов ЦТК - цитратсинтазы, аконитазы, НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ и малатдегадрогеназы - увеличивались в 2-3 раза, по сравнению с экспоненциальной фазой роста. Недостаток тиамина вызывал резкое уменьшение активности 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса. Активность этого фермента практически не обнаруживалась в стационарной фазе роста. В эхетршпах У. Иро1уИса довольно высокой была активность пируваткарбоксилазы, которая несколько увеличивалась в условиях недостатка тиамина и синтеза кислот.

Полученные результаты позволяют предположить следующий механизм биосинтеза кетокислот (рис. 4). При лимитировании роста дрожжей тиамином происходит нарушение метаболического потока через тиамин-зависимые ферменты главных путей катаболизма глюкозы и глицерина. Блокирование пируватдегидрогеназного комплекса делает реакцию окислительного декарбоксилирования пирувата узким звеном метаболизма и приводит к экскреции пирувата. Однако, полного блокирования пируватдегидрогеназного комплекса не происходит, и реакция образования ацегил-КоА продолжает функционировать, хотя и с меньшей скоростью, обеспечивая синтез 2-оксоглутарата в ЦТК. Образовавшийся 2-оксоглутарат не окисляется в дальнейших реакциях ЦТК из-за повреждения 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса, вызванного дефицитом тиамина. Результатом разомкнутости цикла на уровне 2-оксоглутаратдегидрогеназы является экскреции в среду кетоглутарата.

Из-за нарушения метаболического потока на уровне этих ферментов, на наш взгляд, клетки испытывают недостаток в восстановительных эквивалентах, что сказывается на работе дыхательной цепи. То есть создается эффект "голодания" по углероду (состояние II по Чансу) (Мецлер, 1980). Для поддержания жизнедеятельности в этих условиях клетки вынуждены активизировать начальные этапы катаболизма глюкозы или глицерина, чтобы получить как можно больший выход энергии именно на этих этапах. Об этом свидетельствуют данные об увеличении активности ряда ферментов первичного окисления глюкозы или глицерина и начальных этапов ЦТК при переходе клеток в фазу активного синтеза кетокислот.

Ресинтез оксалоацетата в этих условиях, вероятно, осуществляется посредством функционирования пируваткарбоксилазной реакции. Определение активности пируват- и ФЭП-карбоксилаз в клетках У. Нро1уИса 704 в период роста на глюкозе показало, что ФЭП-карбоксилаза отсутствует, образование оксалоацетата путем гетеротрофной фиксации С02 осуществляется только вследствие функционирования пируваткарбоксилазьт. Активность этого фермента имеет определенную связь с активностью другого анаплеротического пути глиоксилатного цикла. Участие глиоксилатного цикла в этих процессах практически исключается, т.к. активность изоцитрат-лиазы была низкой.

Рассмотренные выше данные позволяют сделать следующее заключение. Тиамин-ауксотрофные дрожжи У. Нро1у1ка являются перспективными продуцентами органических кислот - КГК и ПВК. Сверхсинтез кетокислот является результатом возникающего дисбаланса между продолжающимся в клетке активным катаболизмом источника углерода и резким падением активности пируватдегидро1-еназы и 2-оксоглутаратдегидрогеназы, вызванным дефицитом доступного кофермента -тиам индифосфата.

ТПФ

Рйб'у'лозо-З-Ф"*-6-Ф-глюконат

ГА-З-Ф— Ри-5-Ф-"> С-7-Ф—=5- Э-4-Кс-5-Ф-

Пентозофосфатный путь: Р-5-Ф-рибозо-5-фосфат, Кс-5-Ф - ксилуяозо-5-фосфат, С-7-Ф -седогедгулозо-7-фосфат, Э-4-Ф - эритрозо-4-фосфат, ГА-З-Ф - глииеральдегид-3-фосфат

Ферменты:

ГК - глицеролкиназа

Г-З-Ф-ДГ - глицерол-З-Ф-дегидрогеназа (ФАД-и НАД-зависимая)

Г-6-Ф -ДГ - глюкозо-б-фосфатдегвдрогеваза

ФГДГ - фосфоглюконатдегвдрогеназа

ТК - транскетоолаза

ГОК ДГ - пируватдегидрогеназа

ЦС - цитратсюггаза

ПВКК - пируваткарбоксилаза

МДГ — малатдегндрогеназа

ИДГ - нзоцитратдегидрогеназа

ОГК ДГ - 2-оксоглутаратдегидрогеназа

ТПФ - тиамиипирофосфат

Глюкоза 1

Глюкозо-б-Ф

Фо\тсгозо-б-Ф

Глицепнн

Глицеоол-З-Ф

Диоксиаиетон-Ф

Малат

ТПФ

Сукиинат ^~

Изоцитрат

ИДГ (НАДФ)/ИДГ (НАД) КГДГ_у

2-ОКСОГП\ГГЯГ»ЯТ

Рис. 4. Механизм биосинтеза кетокислот у У Иро1уиса.

Биосинтез лимонной кислоты на разных источниках углерода

Ранее в работах сотрудников ИБФМ РАН показано, что условием сверхсинтеза лимонной кислоты (ЛК) является лимитирование роста дрожжей минеральными компонентами среды - азотом, фосфором, серой или магнием при одновременном содержании в среде избыточного количества источника углерода (Глазунова, 1977; Илларионова, 1977; Финогенова, 1982). Процесс образования ЛК является трехфазным процессом: в первой фазе происходит активный рост культуры и потребление лимитирующего компонента среды, в это время кислоты практически не образуются. Интенсивный синтез кислот начинается после снижения содержания азота ниже порогового уровня (100 мг/л) и перехода культуры в фазу замедленного роста и далее - в стационарную фазу роста. Синтез кислот продолжается до тех пор, пока в среде присутствует источник углерода, и клетки продуцента остаются жизнеспособными и достаточно активными. Последнее определяется условиями культивирования: рН среды, температурой, аэрацией среды кислородом, составом макро- и микроэлементов. Из-за ауксотрофности У. Иро}уИса по гшримидиновому компоненту молекулы тиамина в среду культивирования необходимо вводить избыточные количества тиамина (Мунтян, 1971).

Сравнительными опытами нами показана зависимость биосинтеза ЛК непосредственно от потребляемого источника углерода. Природный штамм У. Нро1уИса 704 выращивали в идентичных условиях на средах с разными источниками углерода (этанол, подсолнечное масло, глюкоза и глицерин). Сводные данные представлены в табл. 9. Соотношение продуцируемых кислот: ЛК и ее изоформы -трео-£>4-изолимонной кислоты (ИЛК) определяется потреблением С-источиика: в средах с подсолнечным маслом и этанолом образуются примерно равные количества ЛК и ИЛК (соотношение ЛК:ИЛК=1,1:1-1,24:1), в то время как в среде с глюкозой и глицерином накапливается преимущественно ЛК (соотношение ЛК:ИЛК=4,9:1-7,7:1 для глицерина и глюкозы, соответственно).

Таблица 9. Кислотообразование природного штамма У. Иро1уНса 704 на разных источниках углерода

Источник углерода Биомасса ЛК ИЛК Соотношение

(г/л) (г/л) (г/л) ЛК:ИЛК

Этанол 10,0 42,0 40,0 1,1:1

Подсолнечное масло 12,4 68,0 55,0 1,24:1

Глицерин 9,3 68,0 14,0 4,9:1

Глюкоза 9,6 56,9 7,4 7,7:1

Проведено сравнительное определение активности ключевых ферментов биосинтеза ЛК и ее дальнейшего превращения. Результаты представлены в табл. 10. При росте на всех источниках углерода активность цитратсинтазы значительно превышала активности последующих ферментов цикла: аконитат-гидратазы, НАД-изоцитратдегидрогеназы, НАДФ-иэоцитратдегидрогеназы. Очень высокая по сравнению с другими ферментами активность цитратсинтазы, по-видимому, может быть объяснена следующим: в экспоненциальной фазе роста избыточная активность цитратсинтазы компенсируется потребностями клеток в ацетил-КоА для биосинтетических целей. Когда же в условиях дефицита азота процессы биосинтеза

Таблица 10. Активность ферментов (мкмоль/мии на мг белка) у У. Иро1уЧса при росте в среде с различными С-источяиками в условиях лимитирования роста азотом

Ферменты Глюкоза Гллцерин Этанол Масло

Рост Синтез Рост Синтез Рост Синтез Роит Синтез

Цитратсинтаза 0,71 0,62 0,82 0,8 1,24 1,7 2,04 2,7

Аконитат-гидратаза 0,39 0,28 0,33 0,26 0,7 0,6 0,92 0,8

Изоцитратдегидрогеназа (НАД+) 0,110 0,17 0,105 0,12 0,09 0,1 0,06 0,05

Изоцитратдегидрогеназа (НАДФ+) 0,250 0,26 0,12 0,125 0,3 0,3 0,06 0,05

Кетоглутаратдегидрогеназа 0,04 0,05 0,07 0,08 0,12 0,12 0,06 0.06

Малатдегидрогеназа 2,5 3,5 2,0 2,8 2,1 2,1 3,7 3,8

Изоцитрат-лиаза 0,028 0,028 0,009 0,01 0,098 0,1 0,089 0,12

Малат-синтаза 0,024 0,024 0,012 0,014 0,078 0,14 0,054 0,1

Пируваткарбоксилаза 0,067 0,12 0,047 0,049 0,05 0,05 0,07 0,1

снижаются, то процесс расщепления цитрата также тормозится и он экскрстирустся из клетки, т.к. не может быть полностью метаболизирован в ЦТК из-за сравнительно низких активностей последующих ферментов. На всех субстратах активность а-кетоглутаратдегидрогеназы резко понижена по сравнению с активностью предшествующих ферментов, что, очевидно, вызвано тем, что а-кетоглутарат частично идет на биосинтез глютамата и для дегидрирования той его части, которая подвергается дальнейшему метаболизму в ЦТК, требуется гораздо меньшее количество фермента.

При росте У. НроЫюа на глюкозе и глицерине активно функционирует пируваткарбоксилаза. При ассимиляции этанола и подсолнечного масла анаплеротический ресинтез оксалоацетата осуществляется благодаря функционированию глиоксилатного цикла. На масле также обнаружена более высокая в сравнении с "глюкозными" и "глицериновыми" клетками активность цитратсинтазы. Увеличение активности цитратсинтазы при ассимиляции масла, очевидно, связано с дополнительным участием цитратсинтазной реакции в глиоксилатном цикле.

Соотношение накапливаемых кислот (ЛК и ИЛК) определяется, по-видимому, соотношением активностей ферментов цитратсинтазы, аконитат-гидратазы, НАД-изоцитратдегидрогеназы и изоцитрат-лиазы. Повышение активности цитратсинтазы и понижение активности аконитат-гидратазы в дрожжевой клетке приводит к преимущественному накоплению ЛК, в то время как высокая активность аконитат-гидратазы при одновременно низкой активности изоцитратдегидрогеназы приводит к экскреции как ЛК, так и ИЛК. Изоцитрат-лиаза в период преимущественного сверхсинтеза ЛК должна быть высокой и обеспечивать ресинтез оксалоацетата.

Роль аконитат-гидратазы и изоцитрат-лиазы в образовании ЛК обсуждалась и в работах других исследователей (Аклута е! а1., 1973; Ма(зиока е! а1., 1980; Финогенова, 1982). Если наше представление относительно роли аконитат-гидратазы и изоцитрат-лиазы в синтезе кислот справедливо, то, создавая мутантпые штаммы с подавленной

активностью аконнтат-гидратазы, но в то же время высокой активностью изоцитрат-лиазы, можно добиться преимущественного синтеза Ж.

При комбинированном воздействии ультрафиолетового облучения и А'-метил-А'-нитро-УУ-нитрозогуанидина на клетки природного штамма У. Нро1уИса 704 были получены 1500 колоний, из которых на селективных средах с цитратом (ослаблен рост), сукцинатом (есть рост) и малатом (есть рост) селекционированы мутанты, среди которых мутант У. Иро1уИса N 15 с высокой активностью цитратсинтазы и низкой активностью аконитат-гидратазы. У мутанта изоцитрат-лиаза на всех субстратах была высокой и не репрессировалась глюкозой. Мутант У. Иро1уНса N 15 на всех субстратах синтезировал преимущественно ЛК (табл. 11).

Таблица 11. Кислотообразование мутантного штамма У. Ира1уПсаЫ 15 на разных источниках углерода

Источник углерода Мутант N 15

Биомасса ЛК ГИЛК Соотношение

(г/л) (г/л) (г/л) ЛК.-ИЛК

Этанол 10,0 85,0 11 7,7:1

Подсолнечное масло 11,6 108,0 3,4 32:1

Глицерин 9,4 80,0 , 7,5 10,7:1

Глюкоза 9,9 66,0 5 13,2:1

Таким образом, соотношения активностей основных ферментов ЦТК строго закономерны и определяются интенсивностью функционирования связанных с ним метаболических путей (в частности, глиоксилатного цикла) и скоростью использования шггермедиатов цикла в анаболических реакциях. Регуляция соотношений активностей ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла происходит, по-видимому, главным образом, путем контроля синтеза ферментов и зависит от природы С-источника.

Исследование внутриклеточного содержания АТФ, АДФ, АМФ, НАД+ и НАДН н условиях лимитирования роста клеток азотом и сверхсинтеза ЛК показало, что н фазе активного роста дрожжей происходит резкое снижение содержания адениновых пуклеотидов и НАД+(табл. 12). Содержание НАДН изменяется незначительно в течение всего процесса культивирования. Аналогичное снижение содержания адениновых нуклеотидов в период экспоненциального роста наблюдалось и в грибах Иеогозрога сгаяха (Экутап, 1973).

Снижение уровня АТФ может быть обусловлено тем, что активный рост клеток требует повышенных энергетических затрат на биосинтетические цели. Снижение уровней АТФ и АМФ может быть объяснено либо отставанием скорости синтеза этих соединений от скорости роста и деления клеток, либо наличием регуляторного механизма, направленного на поддержание энергетического гомеостаза клетки. Снижение уровня НАД+ по мере перехода культуры в фазу замедленного роста может быть обусловлено снижением окислительной активности клеток. Переход дрожжей в фазу замедленного роста, вызванный исчерпанием азота из среды культивирования, связан с замедлением биосинтетических процессов, а дальнейший выход в

Таблица 12. Концентрация нуклеотидов у Y. lipolytica в условиях лимитирования роста

источником азота

Время культивирования (час) Внутриклеточная концентрация нуклеотидов (мМ)

АТФ АДФ АМФ НАДН НАД

6 1,85 6,2 3,92 3,88 22,02

19 0,85 1,33 0,96 2,32 9,38

27 0,62 1,02 0,33 1,1 4,76

32 1,86 4,42

40 3,15 3,77

Дрожжи выращивали в минеральной среде 1'идер, в качестве источника углерода использовали глюкозу (20 г/л). Насчет концентраций проводился на основе полученных ретультатов и литературных данных по содержанию внутриклеточной воды у дрожжей, согласно которым 1 мг сухого веса (слеток соответствует 4 мкл воды (Botcham and Ratledge, 1979).

стационарную фазу - с их полной остановкой. Изменения в содержании адениновых нуклеотидов в период синтеза JIK приводят к резкому увеличению соотношения АТФ/АМФ, которое играет важную ре^ляторную роль в клетках микроорганизмов (Atkinson, 1977; Knowles, 1977).

Очистка и свойства цитратсинтазы

Метод очистки цитратсинтазы состоит из трех стадий: высаливания сульфатом аммония, гидрофобной и ионообменной хроматографии; процедура суммирована в табл. 13. На стадии высаливания происходит освобождение от значительного количества белка. Отмечено снижение содержания общего белка в 7 раз, выход фермента составляет 77%. В ходе гидрофобной хроматографии, где в качестве носителя использовалась октил-сефароза, основная часть балластного белка сходила острым пиком, когда эшоция велась 0.5 M сульфатом аммония в 0,1 M калий-фосфатном буфере. Цитратсинтаза элюировалась 0,1 M калий-фосфатным буфером. Выход фермента после этой стадии составил 28%. Значительная очистка фермента достигалась на стадии ионообменной хроматографии. Используя ДЭАЭ-сефарозу в качестве носителя, удалось увеличить удельную активность цитратсинтазы с 26,3 до 161,2 мкмоль/мин на мг белка. Согласно литературным данным удельная активность цитратсинтазы, которую удалось достичь в ходе очистки цитратсинтазы из липидных дрожжей Candida 107 (Boulton and Ratledge, 1980) составляет 22,3 мкмоль/мии на мг белка, выход - 56%, степень очистки 34. Сходная с полученной нами удельная активность очищенного фермента из пекарских дрожжей - 160 мкмоль/мин на мг белка, при этом выход составляет 5,7% (Parvin and Atkinson, 1968).

Свойства цитратсинтазы. Выделенная нами цитратсинтаза имеет молекулярную массу порядка 70 кДа и состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой порядка 40 кДа. Сходную молекулярную массу имеет фермент из Pénicillium spicidisporum (Mahlen, 1972). Молекулярная масса цитратсинтазы из Aspergillus niger равна 80 кДа (Kubicek and Rohr, 1978).

Таблица 13. Очистка цитратсинтазы из дрожжей У. lipolytica

Стадии очистки Объем (мл) Общий белок (мг) Активность Выход (%) Степень очистки

Общая (Ед.) Удельная (мкмоль/мин на мг белка)

Грубый экстракт 200 2000 5600 2,8 100 1

Высаливание (55-90%) 50 300 4290 14,3 77 5

Гидрофобная хроматография 600 60 1578 26,3 28 9

Ионообменная хроматография 90 9 1451 161,2 26 57

Исследование термостабильных свойств цитратсинтазы показало, что фермент выдерживает инкубацию при 50°С в течение 10 мин, сохраняя 90% активности, прогрев до 60UC и более ведет практически к полной потере активности.

Цитратсинтаза более активна при щелочных значениях pH, максимальную активность фермент проявляет при р№=8,5. Такой же оптимум pH для фермента из А. nigar (Kubicek and Rohr, 1978). Цитратсинтаза из липидных дрожжей Candida 107 (Boultoii and Ratledge, 1980) и из Е. coli (Weitzman, 1969) максимально активна при рН=8,0. Для цитратсинтазы из пекарских дрожжей отмечается широкий диапазон рН=7,0-8,0 (Parvin and Atkinson, 1968; Weitzman and Danson, 1976), в котором фермент проявляет высокую активность, со слабым максимумом при рН=7,5.

Цитратсинтаза У. lipolytica, как и фермент из других источников, обладает большим сродством к ЩУК, чем к ацетил-КоА (Km для ЩУК равна 5 мкМ, для ацетил-КоА-10 мкМ). Несмотря на то, что, согласно Вейпман и Дансок (Weitxman and Danson, 1976) у дрожжей не наблюдается иигибировапия цитратсинтазы никотинамидными нуклеотидами, мы показали ингибирование фермента из У. lipolytica 1 мМ НАДН на 10% и 1 мМ НАДФН на 45%. Также как и у традиционных продуцентов ЛК грибов A. niger (Kubicek et al., 1995) АТФ ингибирует цитратсинтазу У. lipolytica, а цитрат в концентрации 10-15 мМ ингибирует активность очищенного фермента на 50% и в концентрации 50 мМ - на 80%.

Очистка и свойства НАД+-завнснмой изоцнтратдегидрогеназы

Разработанная нами процедура очистки НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАД-ИЦДГ) состояла из четырех стадий. Как видно из табл. 14, после первых двух стадий удалось избавиться от значительного количества балластных белков (общий белок снизился более чем в 18 раз при 67% выходе НАД-ИЦДГ). В процессе гидрофобной хроматографии НАД-ИЦДГ связывалась с октил-сефарозой при концентрации сульфата аммония 2 М. После промывки колонки и выхода несвязавшихся белков, фермент элюировали 1 М раствором сульфата аммония. На заключительном этапе фермент очищали с помощью гель-фильтрации на

Таблица 14. Очистка НАД '-зависимой шоцитратдегидрогеназы из У. Upolylica

Стадия очистки Общий белок (мг) Общая активность (Ед.) Удельная активность (мкмоль/мин на мг белка) Выход (%)

Бееклеточный экстракт 760 129,2 0,17 100

Высаливание (NHJoSO^ 248 104,16 0,42 81

Осаждение кислотой 40,5 86,27 2,13 67

Октил-сефароза 12,3 62,12 5,05 48

Гель-фильтрация 1,82 40,05 22 31

колонке с сефарозой-СЬ4В. В результате НАД-ИЦДГ была очищена в 129 раз с выходом 31%; гомогенный препарат фермента имел удельную активность 22 мкмоль/мин на мг белка.

Свойства ИДГ. Молекулярный вес порядка 400 кДа. Фермент состоит из 8 идентичных субъединиц по молекулярной массе. Октамерами являются и НАД-ИЦДГ из пекарских дрожжей (Barnes et al., 1972) и дрожжей Rhodosporidium toruloides (Evans and Ratledge, 1985).

Максимальную активность в 100 мМ калий-фосфатном буфере НАД-ИЦДГ проявляла при рН=7,2-7,6. В глициновом буфере (100 мМ) рН-оптимум был сдвинут в щелочную область (рН=8,5-9,0). Фермент термолабилен. При прогревании НАД-ИЦДГ в течение 10 мин при температуре выше 30"С происходила быстрая инактивация.

Для выявления возможных регуляторов НАД-ИЦДГ было проверено влияние ряда метаболитов на активность фермента. Ключевые интермедиаты ЦТК (оксалоацетат 10 мМ, цитрат 10 мМ, сукцинат 10 мМ, фумарат 10 мМ, малат 10 мМ, глиоксилат 10 мМ, 2-оксоглутарат 10 мМ, глутамат 10 мМ) оказывали слабое влияние на активность НАД-ИЦДГ. Примечательно отсутствие ингибирования фермента 2-оксоглутаратом.

Отсутствие ингибирования фермента промежуточными метаболитами выявило необходимость детального изучения регуляции НАД-ИЦДГ нуклеотидами, пулы которых, по нашим данным, претерпевают существенное изменение при культивировании У. Upolylica в условиях сверхсинтеза органических кислот. Для изучения влияния нуклеотидов определяли кинетические параметры фермента. Расчет производился с помощью компьютерной программы.

Для определения параметров фермента по отношению к НАД+ измеряли активность фермента в зависимости от концентрации НАД*. Все остальные компоненты брались в избытке. Расчет производился по уравнению Хилла. Константа Михазлиса для НАД* составила 136 мкМ. Коэффициента Хилла равен 1,06, что говорит об отсутствии кооперативности при связывании субстрата реакции НАД с ферментом.

При определении кинетических параметров НАД-ИЦДГ по отношению ко второму субстрату - изоцитрату, необходимо учитывать возможное влияние АМФ на его связывание с ферментом. Корнбергом и Прайсом установлено, что НАД-ИЦДГ дрожжей обнаруживает абсолютную потребность в АМФ (Kornberg and Pricer, 1959).

Дальнейшие исследования показали, что НАД-ИЦДГ содержит аллостерический центр для связывания АМФ и взаимодействие АМФ с этим центром повышает сродство фермента к изоцитрату (Evans and Ratledge, 1985; Gabriel and Plaut 1990).

Нами было проведено измерение активности фермента в зависимости от концентрации изоцитрата при отсутствии и наличии АМФ (1 мМ и 0,025 мМ) в реакционной среде. Расчет производился по уравнению Уэбба, в котором заложена возможность анализа влияния эффектора на связывание субстрата с ферментом.

Константа Мнхаэлиса для изоцитрата в отсутствии АМФ равна 581 мкМ. АМФ усиливает сродство фермента к изоцитрату, не влияя на Vniax. НАД-ИЦДГ обладает низким сродством к эффектору АМФ (Ка = 995 мкМ). По нашему мнению, в условиях сверхсшггеза лимонных кислот, когда пул АМФ существенно снижается, это факт имеет принципиальное значение. Однако необходимо учитывать полученные данные об отсутствии влияния АМФ на фермент при концентрациях изоцитрата более 1 мМ. Коэффициент Хилла для изоцитрата и АМФ равен 4,164 и 1,99!, соответственно, что свидетельствует о высокой кооперативности при связывании изоцитрата и АМФ с ферментом.

Согласно литературным данным, сильным ингибитором НАД-ИЦДГ дрожжей (даже при насыщающих концентрациях АМФ и изоцитрата) является АТФ (Evans and Ratledge, 1985). При исследовании, проведенном рацее на частично очищенном ферменте из У. lipolytica, также было показано ингибирующее действие АТФ па НАД-ИЦДГ (Соколов с соавт., 1995). Однако в этой работе использовались концентрации АТФ (до 10 мМ), которые значительно превосходят физиологические концентрации АТФ (табл. 12), рассчитанные нами на основе экспериментальных данных для клеток У. lipolytica. В наших исследованиях сравнение кинетических параметров фермента в двух экспериментах (без АТФ и с добавлением АТФ) выявило отсутствие ннгибирукяцего воздействия АТФ. Ингибированис не наблюдалось и в эксперименте по изучению зависимости активности НАД-ИЦДГ от концентрации АМФ при разных концентрациях АТФ. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что регуляция НАД-И1ЩГ у У. lipolytica осуществляется in vivo не соотношением АТФ/АМФ, а уровнем АМФ в клетке.

В проводимых ранее исследованиях с дрожжами показано, что НАДН является важным ре^лятором активности НАД-ИЦДГ (Evans and Ratledge, 1985; Соколов с соавт., 1995). Ингибирование происходит из-за снижения скорости диссоциации комплекса фермент-НАДН что, в свою очередь, определяется соотношением НАД/НАДИ в клетке. В случае с У. lipolytica показано также, что НАДН является сильным ингибитором. Он уменьшает сродство фермента к НАД1", действуя как конкурентный ингибитор. Константа связывания для 11АДН равна 63 мкМ. т.е. фермент обладает большим сродством к конечному продукту реакции, нежели к субстрату. На основании этого, очевидно, что регуляция НАД-ИПДГ в клетках дрожжей может осуществляться изменением соотношения НАДН/НАД+ Увеличение этого соотношения in vitro приводило к полному ингибированию фермента.

Биохимический механизм сверхсинтеза органических кислот у У. lipolytica

Очевидно, что для процесса синтеза лимонных кислот из глюкозы важно o6ecnc4CFine высокой концентрации глюкозы и создание потока углерода через гликолиз (рис. 5). Одна га ключевых реакций гликолиза катализируется б-фосфофруктокиназой (ФФК) (К.Ф. 4.1.2.13). ФФК является ключевым регуляторным ферментом гликолиза практически у всех организмов, включая дрожжи (Salas et al.,

Глюкоза Н+

Рис. 5. Биохимический механизм синтеза лимонной кислоты у У. Иро!уОса

1965), и увеличение концентрации цитрата по механизму отрицательной обратной связи ингибирует активность ФФК и, в целом, снижает скорость трансформации субстрата через гликолиз.

Проведенное нами исследование регуляториых свойств частично очищенной ФФК у Г. lipolytica — продуцентов лимонных кислот в сравнении с С. maltosa (дрожжами-непродуцегггами) показало, что ФФК у У. lipolytica была менее чувствительна к ингибированмю цитратом по сравнению с дрожжами-непродуцентами. Подобная устойчивость ФФК к действию цитрата не отмечалась ни для традиционных продуцентов ЛК грибов A. nigev, ни для лшшдкых дрожжей (у которых цитрат является предшественником в биосинтезе липидов) (Habison et al., 1983; Evans and Ratledge, 1984). Ионы ЫНГ (10 мМ) существенно повышали активность ФФК у >'. lipolytica (в 3 раза) и эффективно противодействовали ингибирующему действию цитрата. АТФ в концентрации 5 мМ не оказывал ингибирующего действия на активность ФФК, однако при совместном действии с цитратом ингибирукмций эффект высоких концентраций АТФ резко возрастал.

Однако понимание механизма синтеза ЛК у У. lipolytica не может быть полностью сведено только к нсрегулируемости ФФК цитратом. Факт активного синтеза JIK при росте на этаноле, н-алканах и маслах (исключающих участие ФФК) свидетельствует как раз о том, что механизм сверхсинтеза лимонных кислот не может быть сведен только к особой регулируемости одного из ферментов гликолиза.

На основании полученных данных может быть предложен следующий механизм сверхсинтсза органических кислот у У. lipolytica. В условиях лимитирования роста источником азота изменяется энергетическое состояние клеток - резко снижается уровень АМФ, АДФ и НАД, в результате чего происходит возрастание соотношений АТФ/АМФ и НАДН/НАД+, что приводит к накоплению в этих условиях энергетических и восстановительных эквивалентов. Такая ситуация, в первую очередь, приводит в блокировке ЦТК на уровне НАД-ИЦДГ. Первоначальным фактором, определяющим снижение активности этого фермента выступает падение содержания АМФ, который является аллостерическим активатором этого фермента и к которому НАД-ИЦДГ имеет низкое сродство. В условиях накопления изоцитрата этот эффект может нивелироваться. Однако в результате происходящего далее повышения соотношения НАДН/НАД+ происходит усиление ингибирования фермента. В результате этого образуются избыточные количества изоцитрата и, через аконитазное равновесие, цитрата и выделение этих метаболитов из ¡слетки.

Напротив, в условиях лимитирования роста дрожжей тиамином клетки находятся в состоянии низкой обеспеченности энергетическими и восстановительными эквивалентами. НАД-ИЦДГ активна вследствие высокого содержания в клетках АМФ и низкого соотношения НАДН/НАД+, а также отсутствия ингибирующего воздействия 2-оксоглутарата. Блокирование метаболического потока осуществляется на уровне тиаминзависимых ферментов: 2-оксоглутаратдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы. Поэтому в среду культивирования выделяются пиру ват и 2-оксоглутарат.

3. Надмолекулярная организация ЦТК

После разрушения эукариотических клеток и последующего дифференциального центрифугирования ферменты обнаруживаются как в различных фракциях осадка, так и в надосадочной жидкости. Надосадочная жидкость содержит так называемые "растворимые" ферменты, т.е. ферменты, которые могут быть экстрагированы водными растворами в виде отдельных единиц, сохраняющих каталитическую активность. Относительная легкость выделения и кристаллизации сделала эти белки популярными объектами исследований, и большая часть наших сведений о структуре и функциях ферментов получена именно при изучении растворимых ферментов.

Согласно современным представлениям ферменты ЦТК внутри нативных митохондрий способны связываться между собой и с поверхностью мембран, образуя высокоорганизованные комплексы (Srere, 1985). Для обозначения комплексов, объединяющих ферменты одного метаболического пути, П. Шрере предложил термин метаболой (Srere, 1985; Robinson and Srere, 1985). Организация ферментов в метаболоны дает клетке некоторые кинетические преимущества в сравнении с системой со свободными ферментами (Welch, 1977; Spivey and Merz, 1989). Одно из возможных преимуществ состоит в том, что непосредственная близость ферментов, ответственных за последовательные шаги метаболического пути, предотвращает выход интермедиата в раствор, где он может быть использован другими ферментами в других метаболических последовательностях.

Изучение регуляции цитратсинтазы К lipolytica в условиях in situ

Как показано в предыдущих разделах, дрожжи У. lipolytica в условиях лимитированного роста Moiyr накапливать в среде 100 г/л ЛК и более. Активный транспорт для цитрата у У. lipolytica не обнаружен (Кулаковская с соавт., 1993; 1994). Если же цитрат транспортируется из клетки способом простой или облегченной диффузии, то в условиях сверхсинтеза внутриклеточная концентрация цитрата может достигать значительных величин. Это может ингибировать активности ферментов, участвующих в синтезе цитрата. В частности, нами показано, что цитрат в концентрации 10-15 мМ ингибирует активность очищенной цитратсинтазы (ЦС) на 50%, а в концентрации 50 мМ-на 80%. Если бы внутри клетки концентрация цитрата была такой же, как в среде культивирования, ЦС проявляла бы лишь небольшую часть от максимальной активности. В таких условиях эффективный синтез цитрата вряд ли был бы возможен. Также нами было показано ингибирование очищенного препарата ЦС из У. lipolytica АТФ.

Очевидно, что внутри клетки существуют определенные защитные механизмы, предохраняющие ферменты от ингибирующего действия высоких концентраций метаболитов. Было сделано предположение о том, что внутриклеточное микроокружение ЦС делает ее менее чувствительной к ингибирующему влиянию интермедиатов ЦТК. Для проверки этого предположения было проведено сравнительное изучение кинетических свойств ЦС в условиях in vitro и in situ (с пермеабилизованными клетками).

Показано, что ЦС пермеабилизованных клеток менее чувствительна к ингибирующему влиянию цитрата и АТФ, по сравнению с ферментом в бесклеточном экстракте. В условиях in situ цитрат в концентрации 300 мМ ингибировал ЦС только на 50%, в то время как в условиях in vitro цитрат в концентрации 50 мМ ингибировал

ЦС на 80%. Ингибирующий эффект АТФ па ЦС пермеабилизованных клеток был также менее выражен.

Подобные эффекты не могли быть объяснены изменениями кинегических свойств ЦС в условиях in situ. Км для ацетил-ICoA очищенной ЦС и фермента в пермеабилизованных клетках составляла 5 и 7 мкмоль, соответственно; Км для оксалоацетата в условиях in situ была в 4 раза выше, чем в очищенном препарате и составляла 40 мкмоль. Следовательно, в клетке возможно существование структурно-физиологической организации ферментов ЦТК по типу метаболоиа.

Связывание цитратсинтазы с внутренней мембраной митохондрий

В данном разделе работы нами продемонстрирована способность ЦС, выделенной из Y. lipofytica, связываться с внутренней мембраной митохондрий этих дрожжей. Сорбция ЦС из раствора на "вывернутые" субмитохондриалькые частицы (СМЧ) и митопласты оценивалась посредством измерения активности ЦС в указанных препаратах. После инкубации мембран с раствором ЦС, б I % ЦС осаждалось с препаратом СМЧ. Связывание фермента с СМЧ является специфичным, так как ЦС не взаимодействовала с интактными митопласгами, т.е. с внешней стороной внутренней мембраны. На специфичность связывания ЦС с СМЧ указывало и то, что оно практически не изменялось с увеличением ионной силы и рН среды.

Кроме физико-химических подходов, для демонстрации связывания ЦС с СМЧ был использован иммунноцитохимический метод (рис. 6).

Частица коллоидного золота

СМЧ

Рис. 6. Связывание ЦС с внутренней мембраной митохондрий.

А - схема мечения ЦС антителами с частицами коллоидного золота Б - электронная микросколия СМЧ с метками коллоидного золота

СМЧ последовательно обрабатывали в растворе ЦС., в растворе первичных антител и вторичных антител, меченных коллоидным золотом. Метка коллоидного золота обнаруживалась па мембранах СМЧ, предварительно инкубированных с ЦС. В

качестве контроля препараты мембран, не обработанные ЦС, инкубировали с антителами; на этих препаратах частицы коллоидного золота не обнаруживались.

Таким образом, полученные результаты показывают, что ЦС внутри митохондрий может находиться не в свободной форме в растворе, а способна связываться с внутренней мембраной, сохраняя при этом свою специфическую активность.

Фермент-ферментные взаимодействия между цитратсинтязой и малатдегидрогеназой в полиэтиленгликоле

Необходимо отметить, что существует ряд методологических проблем в демонстрации фермент-ферментных взаимодействий. Большинство этих взаимодействий очень слабо, и это часто приводит к разрушению метаболонов во время изоляции комплекса при сильном разбавлении или изменениях в ионной силе буфера.

Целью данного раздела работы являлось изучение возможности образования комплекса между митохондриальными ферментами ЦС и малатдегидрогеназы (МДГ) в присутствии неионного детергента - полиэтиленгликоля (ПЭГ).

Использование растворов неионных полимеров, таких как ПЭГ, моделирует условия митохондриального матрикса. Для регистрации фермент-ферментного взаимодействия между ЦС и митохондри&пьным или цитоппазматическим изоферментами МДГ (мМДГ или цМДГ, соответственно) применяли метод фронтальной равновесной гель-фильтрации в ПЭГ. Колонка 8ирегс1ех Б-200 была уравновешена 10 мМ калий фосфатным буфером (рН=8,0), содержащим 10% ПЭГ. На колонку наносили мМДГ, объем фронтальной элюции мМДГ' составлял 15 мл (рис. 7).

0,2 0,1 0

ю 20 зо

Номер фракции 12 3 4

1 « 1 I 4

6 8 10 12 14 16 18 20 Объем, мл

Рис. 7. Влияние ЦС на профили элюции в присутствии 10% ПЭГ мМДГ (А) и цМДГ (В) на колонке £ирегс!ех 200, уравновешенной фосфатным буфером с ЦС. Колонка Зирегс1ех 200 была калибрована с помощью молекулярных

маркеров (I - тироглобулин (669 кДа), 2 - апоферритин (443 кДа), 3 - ЦС (100 кДа) и 4 - миоглобин (17,6 кДа) в присутствии 10% ПЭГ (С). Стрелки указывают объем элюции калибровочных белков в 100 мМ фосфатном буфере без ПЭГ.

Затем колонку уравновешивали с тем же буфером, содержащим 0,2 мг/мл ЦС. На колонке, уравновешенной ЦС, объем фронтальной элюции мМДГ понижался до 5 мл. То есть мМДГ элюировалась в объеме, соответствующем белку с большей молекулярной массой, чем молекулярная масса свободного фермента. Это позволяло предположить образование комплексов между молекулами ЦС и мМДГ. Аналогичные эксперименты были проведены с цМДГ. Комплексов между ЦС и цМДГ не образовывалось, цМДГ элюировались в одном и том же объеме вне

зависимости от отсутствия или присутствия ЦС на колонке. Таким образом, снижение объема фронтальной элюции мИДГ в присутствие ЦС демонстрирует специфическое взаимодействие между мМДГ и ЦС. Необходимо отметить, что ферменты, по-видимому, формируют комплексы, состоящие из нескольких молекул. Объем элюции мМДГ в присутствие ЦС был меньше, чем объем элюции калибровочного белка с наибольшей молекулярной массой - тироглобулина (М.м.=669 кДа).

Также было проведено изучение комплексов ЦС/МДГ в ПЭГ, образцы комплексов ЦС/МДГ (с концентрациями белков 2 мг/мл) инкубировали в средах с различными концентрациями ПЭГ (0-30%) и ионной силы (10 мМ КН2Р04 или 200 мМ КН2Р04) в течение 2 мин. После этого диссоциацию комплекса ЦС/МДГ оцепивапи как уменьшение плотности суспенции при 650 нм (рис. 8). Следует отметить, что комплексы ЦС/МДГ быстро диссоциируют при инкубации без добавления ПЭГ (ОГ1 при 650 нм быстро понижается). Однако, когда твердо-фазную суспензию ЦС/МДГ инкубировали в присутствии 30% ПЭГ при низкой ионной силе (10 мМ КН2Р04) изменения в мутности суспензии не было обнаружено. Увеличение в ионной силе (200 мМ КИ2РО4) при 30% ПЭГ вызывало диссоциацию комплекса ЦС/мМДГ. Однако в течение первых 2-х мин (время, требуемое для кинетических измерений) большинство комлексов ЦС/.мМДГ (около 90 %) находились в твердофазном состоянии даже при высокой ионной силе.

Аналогичные эксперименты провели с комплексом ЦС/цМДГ, и также было показано, что твердо-фазные комплексы ЦС/цМДГ были стабильны в присутствии 30% ПЭГ далее при высокой ионной силе. Такие условия делают возможным изучать кинетические свойства этих комплексов.

А Б

10мМ КН2РОЛ + 30%ПЭГ юмМ КН3Р04 + 3<Й4ГОГ

Время, сек Время, сек

Рис. 8. Влияние концентрации ПЭГ и ионной силы на диссоциацию комплексов между ЦС и мМДГ (А) и ЦС и цМДГ (Б).

Чтобы показать кинетические преимущества комплекса ЦС/МДГ, ассоциированного в ПЭГ, мы использовали два фермента - "ловушки" - аспартат-аминотраисферазу (ААТ) и оксалоацетат-декарбоксилазу (ОАДК). Общим субстратом для этих ферментов является оксадоацетат (ОАА), следовательно, в сопряженных реакциях ААТ и ОАДК могут конкурировать за субстрат с ЦС (рис. 9).

ПИРУВАТ

ОАА-декарбоксилаза

Ацетил-КоА КоА

МАЛАТ -► ОАА -► ЦИТРАТ

Цитратсинтаза

Малатдегидрогеназа Глутамаг ^ а-Кетоглугарат ^

Аспартатамино-трансфераза

АСПАРТАТ

Рнс. 9. Схема конкурентных взаимоотношений МДГ/ЦС, ААТ и ОАДК за ОАА.

В сопряженных системах мы проверяли полноту превращения малата до цитрата через ОАА, катализируемое ферментами МДГ и ЦС. Сначала в реакционную смесь, содержащую манат, НАД, глутамат, ацетил-КоА и ЦС/мМДГ или ЦС/цМДГ добавляли избыточное количество ААТ. Затем тот же эксперимент повторяли с ОАДК. Концентрации ферментов - 0,2 Ед./мл ЦС, 0,4 Ед./мл мМДГ или цМДГ и ! О Ед./мл ААТ или ОАДК. Результаты представлены на рис. 10.

Начальная скорость сопряженной реакции в 20% ПЭГе была в 4 раза меньше по сравнению с реакционной смесью без ПЭГ (контроль). Концентрация ПЭГ, изоформы МДГ (мМДГ или цМДГ) и ионная сила показывали различное кинетическое поведение сопряженных систем ЦС/мМДГ и ЦС/цМДГ с ААТ. В случае реакционной смеси без ПЭГ (т.е. когда не образуется фермент-ферментного комплекса МДГ/ЦС), скорость сопряженной реакции (т.е. образование коэнзима А), была снижена до 2628% от контроля в присутствии ААТ, что демонстрировало хорошее улавливание ОАА ферментом - "ловушкой". В 30% ПЭГ скорость сопряженной реакции снижалась только на 40% в присутствии ААТ для комплекса ЦС/мМДГ, и только - на 78% в комплексе ЦС/цМДГ.

Результаты свидетельствовали о том, что ОАА не выходил в реакционную смесь из комплекса, образуемого мМДГ и ЦС, а передавался с одного фермента на последующий. Следовательно, можно предположить наличие субстратного канала для ОАА внутри комплекса мМДГ/ЦС. В тоже время, внутри комплекса цМДГ/ЦС, ОАА не удерживался и мог быть захвачен ферментом-"ловушкой". То есть в данной системе субстратный канал для ОАА между цМДГ и ЦС отсутствовал.

Увеличение ионной силы (добавлением КН2Р04 до концентрации 200 мМ) приводило к 3-х кратному снижению скорости сопряженной реакции с ААТ в комплексе ЦС/мМДГ. При высокой ионной силе ОАА, образованный в маладегидрогеназной реакции, не передавался на активный центр ЦС, а выходил в раствор и превращался в реакции с ААТ. Это могло свидетельствовать о том, что

ЦС-мМДГ

ЦС-цМДГ

ШмМКЩ'О* ШмМКНзГО* 200мМ Ш2Р04 0%ПЭГ 30% ПЭГ 30% ПЭГ

10 мМ КН2РО.1 10 мМ КН,РО„ 200 ыМ КТЫ'О., 0% ГИГ 30% ПЭГ 30% ПЭГ

Рис. 10. Влияние ААТ и ОАДК па сопряженную реакцию, катализируемую мМДГ или

ЦМДГ.

субстратный канал для ОАА внутри комплекса ЦС/мМДГ имеет электростатическую природу. Подобные результаты были получены и с другим ферментом - "ловушкой" -ОАДК. Можно было предположить, что причина снижения чувствительности ЦС/мМДГ к ферментам - "ловушкам" заключается в том, что диффузия ОАА из ферментных комплексов в ПЭГ затруднена. Однако мы показали, что твердо-фазный комплекс ЦС/цМДГ проявляет такую же чувствительность к ААТ и ОАДК, как и свободные ферменты. Поэтому можно сделать вывод, что внутри комплекса, образуемого ЦС и мМДГ, существует специфический субстратный канал, по которому ОАА передается с активного центра одного фермента на активный центр другого без выхода в раствор. Это может предоставлять клетке кинетические преимущества, так как субстрат одного метаболического пути не может быт захвачен ферментами другого пути и выведен из метаболического потока.

Субстратный канал для ОАА внутри слитого белка ЦС-МДГ

Возможность существования субстратного канала для ОАА между ЦС и МДГ была проверена нами при изучении слитого белка, содержащего два дрожжевых митохоцдриальных фермента, - ЦС и МДГ. Выл сконструирован рекомбинантный белок (рис. 11), в котором С-конец ЦС слит с N-концом МДГ. Полученная плазмида pODC29/ЦС1/МДП кодировала последовательность из шести гистидииовых остатков CS1, линкера (Gly-Ser-Gly) и MDH1. Для наработки фыожн-протеина вектор рОПС29/ЦС1/МДГ1 был трансформирован в Е. coli BL21/DE3.

Рекомбинантный белок ЦС/МДГ был очищен с помощью хроматографии на никель-агарозе и последующей гель-фильтрации. Удельные активности в очищенном препарате составляли 71 мкмоль/мин на мг белка для ЦС и 910 мкмоль/мин на мг белка для МДГ

Праймер 3

\ Ваш Н1

Н- мдг

рМДГ

Праймер 4

Праймер 1 \

Эас 1

ЦС

Праймер 2

/ Ваш Н1

рСШС29ЛДС1

Бас 1

Ват Н1

| ЦС МЛГ 1

(Ар) Н 1 У* •

рСЮС29 ЦС1/МДГ

ЦС, Линкер МЛГ .

440 441 1 2

Ьув Абп 01у Эег й1у Туг Ьуз • ААв ААС ОбА ТСС СйА ТАТ ААА

316 317 Эег Ьуя

-АйТ ААА ТАй -3'

Рис. 11. Схема конструирования слитого фыожек-белка ЦС/МДГ.

ААТ (Ед.)

слитый белок ЦС-МДГ -»-ЦС+МДГ

-о- слитый белок ЦС-МДГ+200 мМ КН2Р04

Наличие пространственной близости между ЦС и МДГ в слитом белке позволяло предположить формирование комплекса между ферментами и, как следствие,

возникновение внутри этого комплекса субстратного канала для ОАА. Сопряженную реакцию проводили также, как в случае с комплексами ферментов в ПЭГ. Слитый белок был менее чувствителен к влиянию ААТ по сравнению со свободными ферментами (рис. 12).

Рис. 12. Влияние ААТ на сопряженную реакцию, катализируемую свободными ферментами ЦС и МДГ и слитым белком ЦС/МДГ.

При проведении сопряженной реакции в условиях высокой ионпой силы кривые зависимости скорости реакции от концентрации ААТ были практически одинаковы как для слитого белка, так и для свободных ферментов. Полученные результаты могут служить подтверждением предположения о наличие электростатического канала для ОАА внутри комплекса, образуемого ЦС и МДГ.

Метаболические эффекты дислокализации цитратеннтазы в клетках дрожжей

В клетках млекопитающих ЦС, по-видимому, локализована исключительно в митохондриях. В клетках дрожжей и растений, второй изофермент, локализованный в пероксисомах, вовлечён в глиоксилатный цикл. В дрожжах Saccharomyces cerevisiae активности митохондриальной и внемитохондриальной ЦС кодируются определенными ядерными генами, СГГ1 (Suissa el al., 1984) и CIT2 (Kim et al., 1986; Rosenkrantz et al., 1990), соответственно. Пероксисомальная локализация Cit2p опосредована наличием С-терминальиого трипептида SKI, (Lewin et al, 1990; McCammon et al., 1990; Singh et al., 1992). Белок Citlp, на 81% идентичный гю аминокислотному составу Cit2p, имеет на С-конце трипептид SKN, который определяет митохондриальную локализацию белка. Кроме того, показано, что третий ген СП'З кодирует вторую митохондриальную изоформу ЦС у S. cerevisiae, но условия функционирования и экспрессии cit3p не были объяснены (Jia et al., 1997). Мутант с делецией гена CIT2 абсолютно жизнеспособен и не проявляет каких-либо особых фенотипических отличий от родительского типа. Мутант, лишенный CIT1, не растёт в среде с ацетатом в качестве единственного источника углерода. Это представлялось неожиданным, поскольку внутренняя мембрана митохондрий обеснечена транспортёром цитрата (Chapell and llaaroff, 1967), который позволяет Cit2p замещать Citlp.

Целью данного раздела работы было дальнейшее изучение идеи о мультиферментиом комплексе внутри ЦТК и оценка способности изоферментов, катализирующих одну и ту же реакцию, но имеющих структурное различие, функционировать в альтернативных клеточных компартментах и метаболических путях.

Мы исследовали способность белка Citlp, обычно обнаруживаемого в митохондриях, функционировать в цитозоле, и способность белка Cit2p, обычно обнаруживаемого в пероксисомах, функционировать в митохондриях. Более того, мы очистили белки Citlp, Cit2p и митохондриальную малатдегидрогеназу (Mdhlp) с тем, чтобы проверить способность Citlp и Cit2p взаимодействовать in vitro с Mdhlp в твердо-фазном комплексе в присутствии ПЭГ, как это было проведено с коммерческими ферментами в предыдущем разделе.

Дрожжевые ««//-мутанты Acitl и двойкой мутант AcitlAcit2 были не способны расти в среде, содержащей ацетат в качестве единственного источника углерода. Путем трансформации в них встроены плазмиды: pRS-C-CJTl кодирует нативный белок Citlp; pRS-C-SLSClTl- белок Citlp без SKN, ответственной за локализацию в митохондрии; pRS-E-SLSCITl- мультикопийный Citl без SKN; pRS-C-LSC.IT2SSKL -белок Cit2p без SKL, pRS-C-LSCIT2SKN - белок Cit2p с SKN вместо SKL.

Селекцию трансформантов проводили в синтетической полноценной среде с глюкозой без триптофана и проверяли их на способность к росту в среде с ацетатом (рис. 13); 1) трансформант не восстанавливал способности к росту на ацетате при экспрессии CIT2, не способной проникать в митохондрии; 2) при экспрессии в

Генотип

U7 -1. к/ Ii ill At il J \i It I V. II-bill .1. il_' и ill .1, Il2 .11 ill At II-

.1.11/ Л. nJ |.RS <• t.SOTJSKN 4P

Piic. 13. Способность трансформированных штаммов восстанавливать рост на среде с ацетатом.

мутантном штамме CIT2 с лидерной последовательностью способность к росту на ацетате восстанавливалась.

Описанные выше результаты показали, что цитозольный белок Cit2p, когда локализован в митохондриях, способен метаболически подражать митохондриальному белку Citlp. Согласно идеи мультиферментого комплекса ЦТК, эти данные позволяют предположить, что как Cit2p, так и Citlp, могут встраиваться в этот комплекс.

Для проверки способности дрожжевых ферментов ЦС, митохондриальной (Citlp) и цитозольной (Cit2p) локализации, взаимодействовать с дрожжевой митохондриальной МДГ (Mdhlp) в присутствии ПЭГ, кодирующие области генов CIT1, С1Т2, и MDH1 клонировали в бактериальный вектор pPROEX-1 (где они были встроены в рамку считывания с 5'-конца в последовательность, кодирующую шесть последовательных гистидиновых остатка). Все три гистидин-меченных белка были экспрессированы в бактериях и очищены на никель-агарозе. Как показано на рис. 14, как Cit2p, так и Citlp взаимодействовали с Mdhlp в присутствии 14% ПЭГ, и это даёт основание предположить, что пероксисомальная изоформа ЦС, при дислокации в митохондрии, может принимать участие в работе мультиферментного комплекса ЦТК.

Способность двух изоферментов ЦС замешать друг друга внутри пространственной структуры требует того, чтобы эти два белка проявляли высокое структурное сходство их внешней поверхности. На рис. 15 представлены молекулярные поверхности изоформ ЦС в трёх различных положениях.

На этих моделях чётко видно, что два изофермента имеют высокое сходство в структуре внешней поверхности, так, что они почти неразличимы друг от друга. Существует подавляющее сходство между двумя электростатическими профилями этих двух изоферментов.

Плазмнда

pks-t•-< '! гi hks с .si .sc тп

i>Ks-i; si.-scn i plis e • i .sen :.iSKi-

Рост на ацетате

—Citlp+Mdhlp Cit2p+Mdhlp -ü-Citlp+bCA -О- Cit2p+BCA

Концентрация Citlp или Cit2p (мг/мл)

Рис. 14. Способность Cit2p взаимодействовать с Mdhlp в ПЭГ. Смеси белков, содержащих 0,2 мг/мл либо Mdhlp или БСА (в качестве негативного контроля) инкубировали в присутствии избыточных количеств Citlp или Cit2p в течение 1 ч при 10° С в 500 мМ фосфатном буфере (рН=7,0), содержащем 14% ПЭГ. Мутность суспенции была оценена спектрофотомегрически при 650 им.

Рис. 15. Структура поверхностей и электростатические заряды ЦС1 и ЦС2.

Красные области - положительно-заряженные участки; синие -отрицательно заряженные участки. Каждый белок представлен в трех ориентациях, полученных последовательным вращением молекул па 90 0 Стрелка указывает на активный центр.

Одно из возможных преимуществ организации ферментов в метаболоны состоит в том, что непосредственная близость ферментов, ответственных за последовательные шаги метаболического пути, увеличивает утечку интермедиата именно через этот путь и предотвращает выход интермедиата в раствор, где он может быть использован другими ферментами в других метаболических путях.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлены пути метаболизма триглнцеридов растительных масел у дрожжей У. lipolytica. Фермент, осуществляющий гидролиз масел до глицерина и жирных кислот, - внеклеточная липаза (КФ 3.1.1.3) выделена, очищена и охарактеризована. Продукты гадролиза - глицерин и жирные кислоты потребляются клетками одновременно. Глицерин не подавляет потребления и катаболизма жирных кислот, что подтверждено физиологическими данными и анализом уровня акгивиости ферментов катаболизма глицерина и глиоксилатного цикла.

2. Установлено, что вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилирования глицсролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы. Глицеролкиназа (КФ 2.7.1.30) из

У. lipolytica выделена, очищена и охарактеризована. Оригинальный метод получения глицеролкиназы защищен авторским свидетельством и имеет практическое применение.

3. Метод получения пировиноградной кислоты из глицерина биохимически охарактеризован. Сведения о механизмах регуляции ферментов биосинтеза пировиноградной кислоты у У. lipolytica необходимы для практического получения продукта.

4. Биосинтез лимонной кислоты у дрожжей У. lipolytica на разных субстратах охарактеризован биохимически. Изучена роль двух ключевых ферментов -цитратсинтазы (КФ 4.1,3.7) и НАД+-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41). Оба фермента выделены их клеток продуцента, очищены и охарактеризованы. Исследованы механизмы регуляции этих ферментов интермедиатами ЦТК. Показано, что свойства цитратсинтазы в условиях in vitro и in situ существенно различаются; фермент in situ оказался более устойчивым к ингибирующему воздействию цитрата и АТФ.

5. Установлены новые принципы метаболической организации дрожжей. Между ферментами существуют фермент-ферментные взаимодействия. Такие взаимодействия выявлены между двумя последовательными ферментами ЦТК -цитратсинтазой и малатдегидрогеназой. Фермент-ферментный комплекс образует электростатический субстратный канал для оксалоацетата. На примере пероксисомалыюй цитратсинтазы впервые показана важность третичной структуры фермента для его функционирования в составе метаболона.

6. Ферменты ЦТК способны связываться как между собой, так и с внутренней мембраной митохондрий, образуя надмолекулярные комплексы (метаболоны). Такая организация метаболического пути способствует: 1) формированию субстратных каналов, при котором субстраты передаются от одного фермента к последующему без выхода в раствор; 2) созданию микроокружения, в котором концентрация субстратов существенно повышается и 3) эффективной и направленной регуляции клеточного метаболизма.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзоры

1. Anasstasiadis S., Morgunov I.G., Kamzolova S.V., Fmogenova T.V. Citric acid production patent review II Recent Patents on Biotechnology. 2008. V. 2. N 3. P. 103-120.

2. Anasstasiadis S., Kamzolova S.V., Morgunov I.G. and H.J. Rehm. Comparative study of the effect of iron on citrate-producing yeast growing on different substrates // In: Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology. Eds. Antonio Mendez-Vilas. 2007.V. 1. P. 308-314.

3. Финогенова T.B., Моргунов И.Г., Камзолова С,В., Чернявская О.Г. Перспективы производства органических кислот дрожжами Yarrowia lipolytica //Прикл. биохим. микробиол. 2005. Т. 41. N 5. С. 478-486.

Статьи в рецензируемых журналах

4. Ермакова И.Т., Моргунов И.Г. Пути метаболизма глицерина у дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica II Микробиология. 198&. Т. 57. N 4. С. 533-537.

5. Моргунов И.Г., Ермакова И.Т. Механизм биосинтеза пировиноградной кислоты из глицерина дрожжами Yarrowia lipolytica И Микробиология. 1989. Т. 58. N 1.С. 26-30.

6. Моргунов И.Г., Ильченко А.П., Шарышев А.А. Ферменты метаболизма глицерина у дрожжей Candida lipolytica II Биохимия. 1991. Т. 56. N 2. С. 258266.

7. Ильченко А.П., Фаусек Е.А., Моргунов И.Г., Шишканова Н.В., Финогенова Т.В. Возможные пути окисления этанола в клетках дрожжей Candida lipolytica //Микробиология. 1994. Т. 63. N 3. С. 442-449.

8. Моргунов И.Г., Шарышев А.А., Микулинская О.В., Соколов Д.М., Финогенова Т.В. Выделение, очистка и некоторые свойства цитрат-синтазы дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica - продуцентов лимонной кислоты // Биохимия 1994. Т. 59. N 9. С. 1320-1329.

9. Моргунов И.Г., Ильченко А.П. Выделение, очистка и некоторые свойства глицеролдегидрогеыазы// Биохимия. 1995. Т. 60. N 6. С. 883-891.

10. Моргунов И.Г., Чернявская О.Г., Финогенова Т.В. О механизме биосинтеза 2-оксоглутаровой кислоты из этанола тиаминауксотрофными дрожжами Yarrowia lipolytica II Микробиология. 1995. Т. 64. N 4. С. 442-445.

11. Моргунов И.Г., Шарышев А.А., Пескова Е.Б., Финогенова Т.В. Митохондриальная апьдегиддегидрогеназа этанол-ассимилирующих дрожжей Candida maltosa Н Биохимия. 1996. Т. 61. N 1. С. 131-141.

12. Белова Л.Л., Соколов АЛ., Моргунов И.Г., Троценко Ю.А. Очистка и характеристика цитрат-синтазы из Methylobacterium extorguens -метилотрофного продуцента полигидроксибутирата // Биохимия. 1997. Т. 62. N 1.С. 71-76.

13. Shatalin К., Morgunov I., Srere P.A. Electostatic channeling between citrate synthase and malate dehydrogenase fussion protein II FASEB J. 1997. V. 11. N 9. P. 928.

14. Morgunov I., Srere P.A. Interactions between citrate synthase and malate dehydrogenase. Substrate channeling of oxaloacetate // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. N 45. P. 29540-29544.

15. Velot Ch., Lebretoti S., Morgunov 1., Usher K., Srere P. Metabolic studies on mislocalized mitochondrial and peroxisomal citrate synthase in yeast Saccharomyces cerevisiae //Biochemistry. 1999. V. 38. P. 16195-16204.

16. Finogenova T.V., Kamzoiova S.V., Dedyukhina E.G., Shishkanova N.V., Il'chenko A.P., Morgunov I.G., Chernyavskaya O.G., Sokolov A.P. Biosynthesis of citric and isoeitric acids from ethanol by mutant Ycirrowia lipolytica N 1 under continuous cultivation //Appl Microbiol Biotechnol. 2002. V. 59. N4-5. P. 493-500.

17. Kamzoiova S.V., Shishkanova N.V., Morgunov I.G. and Finogenova T.V. (2003) Oxygen requirements for growth and citric acid production of Yarrowia lipolytica // FEMS Yeast Research. 2003. V. 3. P. 217-222.

18. Morgunov I.G., Kamzoiova S.V., Perevoznikova O.A., Shishkanova N.V., Finogenova T.V. Pyruvic acid production by a thiamine auxotroph of Yarrowia lipolytica II Process Biochemistry. 2004. V. 39. P. 1469-1474.

19. Моргунов И.Г., Солодовникова Н.Ю., Шарышев A.A., Камзолова С.В., Финогенова Т.В. Регуляция НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы у цитрат-продуцируюших дрожжей Yarrowia lipolytica // Биохимия. 2004. Т. 69. N 12. С. 1391-1398.

20. Моргунов И.Г., Камзолова С.В., Соколов А.П., Финогенова Т.В. Выделение, очистка и некоторые свойства НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцентов органических кислот // Микробиология. 2004. Т. 73. N 3. С. 300-306.

21. Morgunov I.G., Kondrashova M.N., Kamzoiova S.V., Sokolov A.P., Fedotcheva N.I., Finogenova T.V. Evidence of the glyoxylate cycle in the liver of newborn rats // Med. Sei. Monit. 2005. V. 1. P. 1-4.

22. Kamzoiova S.V., Morgunov I.G., Aurich A., Perevoznikova O.A.. Shishkanova N.V., Stottmeister U., Finogenova T.V. Lipase secretion and citric acid production in Yarrowia lipolytica yeast grown on animal and vegetable fat // Food Technol. Biotechnol. 2005. V. 43. N 2. P. 113-122.

23. Kondrashov F.A., Koonin E.V., Morgunov I.G.,_Finogenova T.V. and Kondrashova M.N. Evolution of glyoxylate cycle enzymes in Metazoa: evidence of multiple horizontal transfer events and pseudogene formation // Biology Direct. 2006. V. 1. P.l-31.

24. Камзолова С.В., Финогенова Т.В., Лунина Ю.Н., Перевозникова O.A., Миначова Л.Н., Моргунов И.Г. Особенности роста на рапсовом масле и синтеза лимонной и изолимонной кислот у дрожжей Yarrowia lipolytica II Микробиология. 2007. Т. 76. N 1. С. 26-32.

25. Kamzoiova S.V., Morgunov LG., Finogenova T.V. Microbiological production of citric and isocitric acid from sunflower oil // Food Technol. Biotechnol. 2008. V. 46. N 1. P. 51-59.

26. Финогенова T.B., Пушус И.Ф., Камзолова C.B., Лунина Ю.Н., Монастырская С.Е., Моргунов И.Г., Воронин A.M. Получение мутангных штаммов Yarrowia lipolytica - продуцентов лимонной кислоты из глюкозы // Прикл. биохим. микробиол. 2008. Т. 44. N 2. С. 197-202.

27. Камзолова С.В., Фатыхова А.Р., Моргунов И.Г. Биосинтез лимонной кислоты дрожжевыми организмами из глицерин-содержащих продуктов // Биотехнология. 2008. N 5. С.1-7.

28. Morgunov I.G., Kamzolova S.V. The binding of citrate synthase and malatc dehydrogenase with the inner mitochondrial membrane // J. Biomol. Struct. Dyn. 2009. V. 26. M 6. P. 870-871.

Статьи в научных сборниках и других изданиях

29. Моргунов И.Г. Метаболизм глицерина у дрожжей Candida lipolytica // Сборник "Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов". Рига. 1987. С. 146.

30. Моргунов И.Г., Ильченко А.П., Ермакова И.'Г. Способ получения глицерол-киназы. Алт. свид. N 1433980.1988.

31. Morgunov l.G, Regulation of" citrate synthase of yeast Yarrowia lipolytica in situ and in vitro // Proceedings of the 14th Small Meeting on Yeast Transport and Energetics. Bonn, FRG. 1996. P. 62.

32. Morgunov l.G. Organization and regulation of enzymes involved in organic acids biosynthesis by yeast Yarrowia lipolytica // Abstract Book of Third Yarrowia lipolytica International Meeting "Cell Biology and Biotechnology of a nonconventional yeast". Dresden, Germany. 2002. P. 64.

33. Morgunov LG. Regulation of enzymes involved in organic acid biosynthesis by yeast Yarrowia lipolytica // Abstract Book of Is1 FEMS Congress of European Microbiologists. Ljubljana, Slovenia. 2003. P. 342.

34. Morgunov I.G., Kamzolova S.V., Finogenova T.V. Biotechnological potential of the yeast Yarrowia lipolytica. Abstract Book of 2"d FEMS Congress of European Microbiologists. Madrid, Spain. 2006. P. 196.

Подписано в печать: 26.08.2009

Заказ № 2619 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www. autoreferat.ru

r. ft

2008154654

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Моргунов, Игорь Григорьевич

I. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Состояние вопроса

1.3. Цель и задачи исследования

1.4. Научная новизна работы

1.5. Практическая значимость работы

1.6. Апробация работы

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Физиолого-биохимические особенности Yarrowia lipolytica

1.1. История изучения и распространение в природе

1.2. Ассимиляция источников углерода

Глава 2. Секреция органических кислот - интермедиатов ЦТК

2.1. Микробный биосинтез органических кислот

2.2. Лимонная и трео-1).у-изолимонная кислоты

2.3. Пировиноградная кислота

2.4. а-Кетоглутаровая кислота

Глава 3. Организация и регуляция ЦТК и глиоксилатного цикла у микроорганизмов

3.1. Биохимия образования лимонной кислоты грибами Aspergillus niger

3.2. Физиологические основы биосинтеза лимонных кислот у Y. lipolytica

3.3. Физиологические основы биосинтеза кетокислот у Y. lipolytica

3.4. Характеристика ключевых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла у микроорганизмов

Глава 4. Структурно-функциональная организация метаболических путей

4.1. Компартментализация и регуляция метаболических путей

4.2. Надмолекулярные ферментные комплексы

4.3. Связывание ферментов с клеточными мембранами

4.4. Метаболические каналы внутри надмолекулярных ферментных комплексов

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 5. Материалы и методы исследования

5.1. Микроорганизмы и условия выращивания

5.2. Аналитические методы

5.3. Определение активности ферментов

5.4. Субклеточное фракционирование дрожжей

5.5. Очистка ферментов глицеролкиназы, липазы, цитратсинтазы и НАДзависимой изоцитратдегидрогеназы

5.6. Пермеабилизация клеток Y. lipolylica

5.7. Связывание цитратсинтазы Y. lipolylica с внутренней мембраной митохондрий

5.8. Иммунноэлектронная микроскопия

5.9. Хроматография Hummer-Dreyer

5.10. Осаждение комплекса цитратсинтазы/малатдегидрогеназы полиэтиленгликоле и проведение сопряженных реакций с ферментами "ловушками"

5.11. Методика исследования метаболических эффектов нарушения локализации цитратсинтазы у дрожжей

5.12. Получение слитого белка цитратсинтазы/малатдегидрогеназы 120 IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 6. Пути метаболизма глицерина, растительных масел и глюкозы Y. lipolylica

6.1. Пути метаболизма глицерина

6.2. Субклеточная локализация ферментов метаболизма глицерина

6.3. Очистка и свойства глицеролкиназы

6.4. Физиологическая роль глицерол-3-фосфат-дегидрогеназ

6.5. Особенности ассимиляции триглицеридов растительных масел и продуктов их гидролиза

6.6. Очистка и свойства липазы

6.7. Особенности регуляции ключевых ферментов метаболизма глюкозы у Y. lipolylica

6.8. Индукция ферментов глиоксилатного цикла у Y. lipolylica и в органах млекопитающих

Глава 7. Сверхсинтез органических кислот дрожжами Y lipolytica

7.1. Механизмы свсрхсинтеза пировиноградной и а-кетоглутровой кислот при росте в среде с глицерином, глюкозой и этиловым спиртом

7.2. Механизмы сверхсинтеза лимонных кислот на различных источниках углерода

7.3. Очистка и свойства цитратсинтазы

7.4. Очистка и свойства НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы

7.5. Биохимический механизм сверхсинтеза лимонной кислоты из глюкозы у 205 Y. lipolytica

Глава 8. Надмолекулярная организация ЦТК

8.1. Изучение регуляции цитратсинтазы Y. lipolytica в условиях in situ

8.2. Связывание цитратсинтазы Y. lipolyiica с внутренней мембраной митохондрий

8.3. Фермент-ферментные взаимодействия между цитрагсинтазой и малатдегидрогеназой в полиэтиленгликоле

8.4. Субстратный канал оксалоацетата внутри слитого белка цитратсинтазы/малатдегидрогеназы

8.5. Метаболические эффекты дислокализации цитратсинтазы в клетках дрожжей

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метаболическая организация окислительных путей у дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцентов органических кислот"

1.1. Актуальность проблемы

Последние годы характеризуются возрастанием интереса к исследованию неконвенционных дрожжей Yarrowia lipolytica, что обусловлено, с одной стороны, их отличием от хорошо изученных дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe в плане их филогенетической эволюции, физиологии и генетики (Barth and Gaillardin, 1996; 1997) и, с другой стороны, широким применением их в биотехнологии. Создан международный центр по координации исследований в данной области; международные конференции, посвященные изучению этих дрожжей, проводятся с 1995 г. каждые три года. Значительные успехи достигнуты в области молекулярной биологии и генно-инженерной экспериментальной биологии Y. lipolytica; усилиями нескольких европейских научных коллективов к 2004 г. завершено изучение генома дрожжей, и составлена их генетическая карта (Dujon et al., 2004).

Российская группа, входящая в международный консорциум, на приоритетной основе проводит исследование уникальной особенности дрожжей Y. lipolytica синтезировать в значительных количествах органические кислоты, липиды и ферменты. Физиологические основы образования этих продуктов у V. lipolytica изучены достаточно хорошо при использовании н-алканов в качестве источника углерода и энергии. Однако биохимические аспекты ассимиляции источников углерода (и особенно новых возобновляемых субстратов, таких как растительные масла и глицерин) и механизмы сверхсинтеза органических кислот на этих субстратах остаются малоизученными. Все энзиматические исследования по изучению процессов сверхсинтеза органических кислот -интермедиатов ЦТК - проводились на бесклеточных экстрактах дрожжей. Не были изучены физико-химические свойства ключевых ферментов, участвующих в ассимиляции субстратов и процессах сверхсинтеза, и механизмы их тонкой регуляции. Оставалось неизвестным влияние внутриклеточных концентраций метаболитов на регуляцию ферментов, обеспечивающих процесс сверхсинтеза органических кислот. На момент начала работы еще не было доказанным, что в клетке ферменты одного метаболического пути функционируют не разрозненно, а взаимодействуют между собой и со структурными элементами клетки и создают надмолекулярные комплексы — метаболоны. Исследование ферментов, в условиях, максимально приближенных к тем, которые существуют внутри клетки, открывает новые перспективы в понимании механизмов регуляции метаболизма микроорганизмов.

1.2. Состояние вопроса

Основная часть исследований по изучению физиологии У. lipolylicu проводились на клетках, выращенных на сахарах или парафинах нефти. Внимание исследователей было привлечено к изучению путей ассимиляции //-алканов, а также к изучению возможностей микробиологического получения ценных метаболитов из этих субстратов.

В последнее время возрастает интерес к использованию в процессах биосинтеза возобновляемых источников углерода, а также отходов промышленных производств. Такие субстраты как триглицериды растительных масел и глицерин могут быть успешно использованы для получения ряда микробных метаболитов, в частности органических кислот. Пути метаболизма глицерина, жиров и жирных кислот у дрожжей Г. lipolylica оставались неизученными. Не были разработаны процессы биосинтеза органических кислот из этих субстратов.

К началу настоящей работы было известно, что лимитирование роста дрожжей У. lipolytica компонентами питательной среды приводит к экскреции клетками органических кислот - метаболитов ЦТК. При лимитировании роста источником азота дрожжи накапливали в основном лимонную и изолимопную кислоты, а при лимите по тиамину - пирови-ноградную и а-кетоглутаровую кислоты (К lipolytica являются тиаминауксотрофными). По своей способности к сверхсинтезу исследованные штаммы дрожжей существенно различались. В результате многолетних исследований' были селекционированы активные штаммы - продуценты лимонных кислот и кетокислот. Были отработаны условия культивирования дрожжей, позволяющие достигать высокой интенсивности биосинтеза и получать органические кислоты в больших концентрациях (80-120 г/л) (Финогенова с соавт., 2005).

Экспериментально доказано, что сверхсинтез пирувата и а-кетоглутарата при недостатке тиамина в среде связан со снижением в клетках дрожжей активности пируват-и а-кетоглутаратдегидрогеназного комплексов, в состав которых входит тиаминпирофосфат (Софронова с соавт., 1976). Сверхсинтез лимонной и изолимонной кислот объяснялся более высокой активностью цитратсинтазы по сравнению с активностями последующих ферментов ЦТК, участвующих в превращениях цитрата и изоцитрата (аконитазы, НАД- и НАДФ- зависимых изоцитратдегидрогеназ и др.) (Финогенова, 1982). Установлено и еще одно непременное условие протекания процессов биосинтеза - анаплеротический ресинтез оксалоацетата, необходимого для осуществления цитратсинтазной реакции. В условиях сверхсинтеза цитрата, изоцитрата и а-кетоглутарата, происходящего при культивировании дрожжей У. lipolytica на //-алканах, ацетате, или этаноле, даже при полном прекращении роста культуры, активно функционировал глиоксилатный цикл, обеспечивающий ресинтез оксалоацетата (Ермакова, Финогенова, 1971; Глазунова, 1977; Глазунова, Финогенова, 1976), а при росте на глюкозе ресинтез оксалоацетата осуществляется при участии пируваткарбоксилазы (Ермакова, 1985).

Вместе с тем многие биохимические аспекты механизма сверхсинтеза органических кислот и возможности его регуляции оставались невыясненными. Необходимо отметить, что все энзиматические исследования по изучению процессов сверхсинтеза органических кислот проводились на бесклеточных экстрактах дрожжей. Ключевые ферменты, ответственные за начальные этапы ассимиляции субстрата и ферменты ЦТК из дрожжей Y. lipolytica, не были выделены и очищены. Следовательно, не были изучены физико-химические свойства этих ферментов и механизмы их тонкой регуляции. Оставалось неизвестным влияние внутриклеточных концентраций метаболитов на регуляцию ферментов, обеспечивающих процесс • сверхсинтеза органических кислот.

Большая часть наших сведений о регуляции, структуре и функциях ферментов получена именно при изучении очищенных препаратов. При этом ферменты" исследуются в условиях, кардинально отличающихся от тех, в которых они существуют внутри клеток и органелл, в отсутствии естественного микроокружения. В последние годы одной из основных тенденций развития биохимии является переход от изучения отдельных метаболических реакций и изолированных биомолекул к исследованию сложных внутриклеточных систем. Становится очевидным, что ферменты в клетке находятся в условиях, сильно отличающихся от разбавленных растворов, в которых они обычно изучаются in vitro (Фридрих, 1986). В частности, многие экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ферменты, функционально объединенные в едином метаболическом пути, способны образовывать упорядоченные мультиферментные ансамбли, называемые метаболонами (Srere, 1985; Курганов, 1992). Организация ферментов в метаболой может представлять некоторые кинетические преимущества для клетки. Одно из таких преимуществ состоит в формировании субстратных каналов внутри комплексов, где интермедиаты последовательных ферментативных реакций передаются с активного центра одного фермента непосредственно на активный центр другого. Функционирование таких каналов предотвращает выход интернедиатов в раствор, где они могут быть захвачены фермен тами других метаболических путей. Изучение фермент-ферментных взаимодействий дает возможность получить новые данные о регуляции клеточного метаболизма.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Моргунов, Игорь Григорьевич

VI. ВЫВОДЫ

1. Впервые установлены пути метаболизма триглицеридов растительных масел у дрожжей Y. lipolytica. Фермент, осуществляющий гидролиз масел до глицерина и жирных кислот, - внеклеточная липаза (КФ 3.1.1.3) выделена, очищена и охарактеризована. Продукты гидролиза — глицерин и жирные кислоты потребляются клетками одновременно. Глицерин не подавляет потребления и катаболизма жирных кислот, что подтверждено физиологическими данными и анализом уровня активности ферментов катаболизма глицерина и глиоксилатного цикла.

2. Установлено, что вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилирования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дсгидрогеназы. Глицеролкиназа (КФ 2.7.1.30) из Y. lipolytica выделена, очищена и охарактеризована. Оригинальный метод получения глицеролкиназы защищен авторским свидетельством и имеет практическое применение.

3. Метод получения пировиноградной кислоты из глицерина биохимически охарактеризован. Сведения о механизмах регуляции ферментов биосинтеза пировиноградной кислоты у Y. lipolytica необходимы для практического получения продукта.

4. Биосинтез лимонной кислоты у дрожжей Y. lipolytica на разных субстратах охарактеризован биохимически. Изучена роль двух ключевых ферментов - цитратсинтазы (КФ 4.1.3.7) и НАД+-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41). Оба фермента выделены их клеток продуцента, очищены и охарактеризованы. Исследованы механизмы регуляции этих ферментов интермедиатами ЦТК. Показано, что свойства цитратсинтазы в условиях in vitro и in situ существенно различаются; фермент in situ оказался более устойчивым к ингибирующему воздействию цитрата и АТФ.

5. Установлены новые принципы метаболической организации дрожжей. Между ферментами существуют фермент-ферментные взаимодействия. Такие взаимодействия выявлены между двумя последовательными ферментами ЦТК - цитратсинтазой и малатдегидрогеназой. Фермент-ферментный комплекс образует электростатический субстратный канал для оксалоацетата. На примере пероксисомальной цитратсинтазы впервые показана важность третичной структуры фермента для его функционирования в составе метаболона.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основной задачей настоящего исследования являлось было изучение структурно-функциональной организации путей ассимиляции триглицеридов и глицерина у дрожжей Y. lipolytica и механизмов регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот.

В число основных задач входило: изучение путей метаболизма триглицеридов растительных масел и глицерина дрожжами Y. lipolytica; 2) исследование механизмов свсрхсинтеза органических кислот дрожжами Y. lipolytica при различных физиологических условиях (в условиях лимитирования роста клеток тиамином или азотом) на разных субстратах; 3) выделение и характеристика ключевых ферментов метаболизма триглицеридов и глицерина и сверхсинтеза органических кислот - липазы (КФ 3.1.1.3), глицеролкиназы (КФ 2.7.1.30), цитратсинтазы (КФ 4.1.3.7) и НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41); изучение надмолекулярной организации ферментов ЦТК и механизмов регуляции у дрожжей и создание новых представлений о механизмах сверхсинтеза органических кислот.

Для выяснения путей ассимиляции глицерина нами в первую очередь были определены активности ферментов метаболизма глицерина (фосфорилирующего пути при участии глицеролкиназы и окислительного пути при участии глицеролдегидрогеназы). Высокие активности глицеролкиназы, глицерол-3-фосфатдегидрогеназ и ипдуцибельпый характер этих ферментов, а также отсутствие других ферментов ассимиляции глицерина позволяет предположить, что у дрожжей Y. lipolytica функционирует только фосфорилирующий путь метаболизма этого субстрата. Долгое время фосфорилирование глицеролкиназой считалось единственным механизмом вовлечения глицерина в метаболизм дрожжей. Затем для ряда дрожжей был описан окислительный путь, в котором глицерин окисляется до диоксиацегона, и последний фосфорилируется до диоксиацетонфосфата (May and Sloan, 1981).

Начальным этапом ассимиляции триглицеридов у дрожжей является их гидролиз внеклеточными липазами с образованием глицерина и ненасыщенных жирных кислот, которые появляются в ростовой фазе (Fickers et al., 2005). До настоящего времени не были определены механизмы ассимиляции продуктов гидролиза у дрожжевых организмов. Предполагалось, что могут быть реализованы два механизма потребления этих субстратов: одновременное потребление глицерина и жирных кислот или последовательное потребление вначале одного, и потом другого метаболита (т.е. диауксия).

При выращивании дрожжей Y. lipolytica в среде с рапсовым маслом в качестве единственного источника углерода, показано, что при потреблении масла на протяжении всего процесса культивирования содержание глицерина в среде сохранялось на одном уровне (0,059 — 0,125 г/л). В процессе культивирования не менялся также и качественный состав внеклеточных липидов (три-, ди-, моноглицеридов) и свободных жирных кислот в среде. Исходя из полученных результатов, высказано предположение, что потребление глицерина и жирных кислот у Y. lipolytica происходит одновременно. Дополнительным доводом в пользу этого предположения явилось сравнительное изучение активности ферментов в разные фазы роста Y. lipolytica на подсолнечном масле, глицерине и олеиновой кислоте. При ассимиляции масла с первых часов культивирования (6 ч) наблюдается индукция ключевого фермента метаболизма глицерина -глицеролкиназы, активность которой на 30% снижена в сравнении с активностью фермента у клеток, растущих на глицерине, но существенно выше активности фермента у клеток, растущих на олеиновой кислоте. Также у дрожжей при росте на масле с первых часов индуцировались и ферменты глиоксилатного цикла — изоцитрат-лиаза и малат-синтаза, участвующие в метаболизме жирных кислот. В клетках, растущих на олеиновой кислоте, активность изоцитрат-лиазы в 14,7 и малат-синтазы в 10 раз выше в сравнении с клетками, растущими на глицерине. В последующие часы культивирования (12 ч и 24 ч) активность глицеролкиназы у дрожжей при росте на масле поддерживалась на постоянно высоком уровне, что, по-видимому, связано с активным потреблением глицерина, непрерывно образуемого в ходе всего процесса ассимиляции масла. Также активности изоцитрат-лиазы и малат-синтазы сохранялись на высоком уровне, что, обусловлено активным потреблением образуемых жирных кислот в ходе всего процесса.

Однако необходимо отметить, что одновременное потребление из среды двух субстратов не является типичным для микроорганизмов. Традиционно считается, что микроорганизмы при росте на двух и более субстратах используют преимущественно углеводы, в сравнении с другими источниками углерода. Этот феномен, известный как катаболитная репрессия, позволяет микроорганизмам более эффективно использовать субстраты, присутствующие в среде. Модели, описывающие молекулярные механизмы катаболитной репрессии, были разработаны для Е. coli. Дрожжи S. cerevisiae также являются объектами изучения катаболитной репрессии (Gancedo, 1992; Entian and Shuller, 1997). Данный феномен у Y. lipolytica не был изучен.

Нами для Y. lipolytica обнаружено, что при выращивании на среде, содержащей смесь двух субстратов (глицерин + олеиновая кислота) в течение всего процесса культивирования происходило одновременное потребление из среды и глицерина, и олеиновой кислоты. Ферменты глицеролкиназа, малат-синтаза и изоцитрат-лиаза индуцировались с первых часов роста и их активности сохранялись высокими в течение всего культивирования.

Дрожжевая изоцитрат-лиаза рассматривается как конститутивный фермент, подвергающийся катаболитной репрессии (Whitworth and Ratledge, 1975; Evans and Ratledge, 1985; Ermakova et al., 1986; Kubicek et al., 1988). Известно, что фосфоенолпируват является ингибитором изоцитрат-лиазы у ряда бактерий, грибов и водорослей, и значение Ki для этого соединения очень низкое - 0,13 - 0,20 мМ (Entian and Shuller, 1997; Holdsworth et al., 1988; Barth and Scheuber, 1993). Еще одним ингибитором изоцитрат-лиазы является пируват, значение Ki для этого соединения у С. giiiUiermondii равно 0,8 мМ, а у С. tropicalis - 0,5 мМ (Gancedo, 1992).

При выращивании Y. lipolytica на среде, содержащей глюкозу и гсксадекан, также наблюдается последовательное потребление субстратов: в первые 14 ч роста происходило потребление глюкозы и содержание гексадекана в среде не изменялось; после 14 ч следовал 4,5 ч лаг-период, когда не происходило потребления азота и гексадекана и далее с 18 ч роста накопление биомассы происходило только за счет потребления гексадекана. Как и в случае со средой, содержащей глюкозу и олеиновую кислоту, в первые часы роста активности изоцитрат-лиазы и малат-сингазы были низкими. Индукция ферментов отмечалась только после 14 ч роста культуры, и оставалась высокой на протяжении дальнейшего процесса культивирования. Можно заключить, что глюкоза или ее метаболиты у Y. lipolytica являются репрессорами ферментов, ответственных за метаболизм других источников углерода, в то время как глицерин является нерепрессирующим субстратом.

Для изучения физико-химических характеристик и механизмов регуляции процессов ассимиляции глицерина и растительных масел были получены элктрофоретически гомогенные препараты глицеролкиназы и внеклеточной липазы LIP2.

Изучение физико-химических и кинетических свойств глицеролкиназы дрожжей Y. lipolytica показало, что фермент имел молекулярную массу 200 кДа, проявлял максимальную активность при рН=10,0, являлся термостабильным, ингибировался 0,5 мМ АМФ на 50 % и, был нечувствителен к фруктозо-1,б-бисфосфату. Глицеролкиназа может быть использована для определения глицерина в микробиологической и медицинской практике. На способ получения глицеролкиназы из дрожжей получено авторское свидетельство № 1433980 (1988).

Изучение физико-химических свойств внеклеточной липазы дрожжей Y. lipolytica показало, что фермент имел молекулярную массу порядка 38 кДа. Молекулярная масса липазы из других штаммов Y. lipolytica составляет 32-39 кДа (Ota et al. 1982; Pereira-Meireles et al. 1997). Оптимум pH=8,0, стабильность препарата сохраняется в диапазоне рН=6,0-9,0. Исследование термостабильных свойств липазы показало, что фермент выдерживает инкубацию при 50° в течение 10 мин. Активность липазы ингибировалась ионами тяжелых металлов, и активировалась ионами Mn2+, Mg2+ и Ca2f. Полученные результаты могут использоваться для создания конкурентоспособного биотехнологического процесса производства липаз эффективных, в частности, для использования в пищевой промышленности при переэтерификации растительных массл в целях повышения качества продуктов питания, а так же в легкой и медицинской промышленности, при производстве биодизельного топлива. Использование липаз в различных технологических процессах значительно повышает экологичность производства и производительность труда, расширяет возможности для эффективной переработки различных жиросодержащих отходов сельского хозяйства и пищевой промышленности. Применительно к липазе LIP2 Y. lipolytica зарубежом показана, в частности, высокая эффективность ее использования в технологических процессах получения ценных жирных кислот из отходов производств растительных масел, а также для замены каталитического метанолиза ферментативным при производстве биодизеля.

С одной стороны способность Y. lipolytica ассимилировать возобновляемые субстраты и с другой стороны гибкость метаболизма дрожжей, позволяет широко изучать этот организм в зависимости от различных физиологических условий.

Дрожжи Y. lipolytica выращивали при лимитировании роста клеток тиамином в средах с глицерином или глюкозой. Показано, что при лимитировании роста дрожжей тиамином происходит нарушение метаболического потока через тиамин-зависимые ферменты главных путей катаболизма глюкозы и глицерина: в "глюкозных" клетках тиамин-зависимый фермент пентозофосфатного пути транскетолаза является первой "мишенью" при дефиците тиамина, в то время как у "глицериновых" клеток первой "мишенью" является пируватдегидрогеназный комплекс. Блокирование пируватдегидрогеназного комплекса делает реакцию окислительного декарбоксилирования пирувата узким звеном метаболизма и приводит к экскреции пирувата. Однако, полного блокирования пируватдегидрогеназного комплекса не происходит, и реакция образования ацетил-КоА продолжает функционировать, хотя и с меньшей скоростью, обеспечивая синтез 2-оксоглутарата в ЦТК. Образовавшийся 2-оксоглутарат не окисляется в дальнейших реакциях ЦТК из-за повреждения, вызванного дефицитом тиамина. Результатом разомкнутое™ цикла на уровне 2-оксоглутаратдегидрогеназы является экскреции в среду кетоглутарата.

Из-за нарушения метаболического потока на уровне пируватдегидрогеназного комплекса и 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса, на наш взгляд, клетки испытывают недостаток в восстановительных эквивалентах, что сказывается на работе дыхательной цепи. То есть создается эффект "голодания" по углероду (состояние II по Чансу) (Мецлер, 1980). Для поддержания жизнедеятельности в этих условиях клетки вынуждены активизировать начальные этапы катаболизма глюкозы или глицерина, чтобы получить как можно больший выход энергии именно на этих этапах. Об этом свидетельствуют данные об увеличении активности ряда ферментов первичного окисления глюкозы или глицерина и начальных этапов ЦТК при переходе клеток в фазу активного синтеза кетокислот.

Ресинтез оксалоацетата, осуществляется посредством функционирования пируваткарбоксилазной реакции. Определение активности пируват- и ФЭП-карбоксилаз в клетках природного штамма Y. lipolytica 704 в период роста на глюкозе показало, что ФЭП-карбоксилаза отсутствует в клетках изучаемых организмов, образование оксалоацетата путем гетеротрофной фиксации СО2 осуществляется только вследствие функционирования пируваткарбоксилазы. Активность этого фермента имеет определенную связь с активностью другого анаплеротического пути — глиоксилатного цикла. Участие глиоксилатного цикла в этих процессах практически исключается, т.к. активность ИЛ была низкой.

Практическим резульатом данного направления работы явилась разработка метода получения пировиноградной кислоты из глицерина с помощью Y. lipolytica. Пировиноградная кислота является ценным биохимическим реактивом, а также может быть использована в качестве предшественника при производстве аминокислот -тирозина, аланина, триптофана, и лекарственного вещества диоксифенилаланина.

При лимитировании роста клеток азотом дрожжи Y. lipolytica показывают совершенно другой физиологический ответ - экскрецию лимонной и изолимонной кислот, что является на наш взгляд следствием различного воздействия лимитирующих факторов на клеточный метаболизм. При росте Y. lipolytica на всех изучаемых источниках углерода (глицерин, глюкоза, растительные масла) активность цитратсинтазы значительно превышала активности последующих ферментов ЦТК: аконитат-гидратазы, НАД-изоцитратдегидрогеназы, НАДФ-изоцитратдегидрогеназы. Очень высокая по сравнению с другими ферментами активность цитратсинтазы, по-видимому, может быть объяснена следующим: в экспоненциальной фазе роста избыточная активность цитратсинтазы компенсируется потребностями клеток в ацетил-КоА для биосинтетических целей. Когда же в условиях дефицита азота процессы биосинтеза снижаются, то процесс расщепления цитрата также тормозится и он экскретируется из клетки, т.к. не может быть полностью метаболизирован в ЦТК из-за сравнительно низких активностей последующих ферментов. При росте Y. lipolytica на глюкозе и глицерине активно функционирует пируваткарбоксилаза. При ассимиляции подсолнечного масла анаплеротический ресинтез оксалоацетата осуществляется благодаря функционированию глиоксилатного цикла. На масле также обнаружена более высокая в сравнении с "глюкозными" и "глицериновыми" клетками активность цитратсинтазы. Это резкое увеличение активности цитрат-синтазы при ассимиляции масла, очевидно, связано с дополнительным участием цитрат-сишазной реакции в глиоксилатном цикле.

Соотношение накапливаемых кислот (J1K и ИЛК) определяется, по-видимому, соотношением активностей ферментов цитратсинтазы, аконитат-гидратазы, НАД-изоцитрат-дегидрогеназы и изоцитрат-лиазы. Повышение активности цитратсинтазы и понижение активности аконитат-гидратазы в дрожжевой клетке приводит к преимущественному накоплению лимонной кислоты, в то время как высокая активность аконитат-гидратазы при одновременно низкой активности изоцитратдегидрогеназы приводит к экскреции как лимонной кислоты, так и изолимонной кислоты. Изоцитрат-лиаза в период преимущественно сверхсинтеза лимонной кислоты должна быть высокой и обеспечивать ресинтез оксалоацетата. Эти представления относительно роли аконитатгидратазы и изоцитрат-лиазы в синтезе были учтены при получении мутантных штаммов: был селекционирован мутант Y. lipolytica N 15 с модифицированным глиоксилатным циклом и характеризующийся высокой активностью цитратсинтазы и низкой активностью аконитат-гидратазы. У мутанта изоцитрат-лиаза на всех субстратах была высокой и не репрессировалась интермедиатами начальных путей окисления субстратов. Мутант изменял соотношение лимонных кислот в сторону преимущественного накопления лимонной кислоты на всех субстратах.

Таким образом, соотношения активностей основных ферментов ЦТК строго закономерны и определяются интенсивностью функционирования связанных с ним метаболических путей (в частности, глиоксилатным циклом) и скоростью использования интермедиатов цикла в анаболических реакциях. Регуляция соотношений активностей ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла происходит, по-видимому, главным образом, путем контроля синтеза ферментов.

Для изучения физико-химических характеристик и механизмов регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот были получены элктрофоретически гомогенные препараты НАД-изоцитратдегидрогеназы и цитрат-синтазы.

Изучение регуляторных свойств НАД-зависимой изоцитрат-дегидрогеназы (НАД-ИЦДГ) дрожжей Y. lipolytica проводилось ранее на грубом препарате фермента, из которого методом гель-фильтрации удалялись низкомолекулярные соединения (Соколов с соавт., 1995). Очистка, изучение свойств и кинетических параметров, описанные в данной работе, проведены нами впервые. Фермент имеет молекулярный вес порядка 400 к/Да и состоит из 8 идентичных по молекулярной массе субъединиц. Окгамерами являются и изучавшиеся ранее НАД-ИЦДГ из Saccharomyces cerevisiae (Barnes et al., 1972) и дрожжей Rhodosporidium toruloides (Evans and Ratledge, 1985).

Для выявления возможных регуляторов НАД-ИЦДГ мы проверили влияние ряда метаболитов на активность ферментов. Ключевые интермедиаты ЦТК (оксалоацетат, цитрат, сукцинат, фумарат, малат, глиоксилат, 2-оксоглутарат, глутамат) оказывали слабое влияние на активность НАД-ИЦДГ. Важным результатом проведенного исследования является подтверждение отсутствия ингибирования активности фермента НАД-ИЦДГ дрожжей Y. lipolytica 2-оксоглутаратом. Этот факт показан ранее на грубых препаратах фермента (Соколов с соавт., 1995). Однако ему не придавалось должного внимания. Между тем как при сверхсиитезе кетокислот отсутствие ингибирования НАД-ИЦДГ 2-оксоглутарагом объясняет активную работу этого фермента. В липидных дрожжах это соединение - сильный ингибитор НАД-ИЦДГ (Evans and Ratledge, 1985).

Отсутствие ингибирования НАД- ИЦДГ промежуточными метаболитами выявило необходимость детального изучения регуляции НАД-ИЦДГ нуклеотидами, пулы которых, по нашим данным претерпевают существенное изменение при культивировании Y. lipolytica в условиях сверхсинтеза ЛК. АМФ выступает в роли положительного эффектора НАД-ИЦДГ, усиливая сродство последнего к субстрату реакции изоцитрату и не влияет на Vmax реакции. Это характерно для фермента НАД-ИЦДГ всех изучавшихся ранее дрожжей (Hathaway and Atkinsonm 1963; Atkinson et al. 1965; Evans and Ratledge, 1985; Gabrial and Plaut, 1990). НАД-ИЦДГ дрожжей Y. lipolytica аналогично ферменту пекарских дрожжей (Hathaway and Atkinson, 1963) и, в отличие от фермента липидных дрожжей (Evans and Ratledge, 1985), не проявлял абсолютной зависимости от АМФ. При концентрациях изоцитрата близких к 1 мМ и более фермент достигал максимальной скорости без добавления АМФ в реакционную смесь. В условиях сверхсинтеза лимонных кислот, когда происходит образование избыточных количеств изоцитрата, этот факт мог бы поставить под сомнение возможность блокировки ЦТК па уровне НАД-ИЦДГ в результате снижения АМФ. Полученные нами данные по отсутствию ингибирования фермента дрожжей Y. lipolytica физиологическими концентрациями АТФ ставят под сомнение возможность регуляции фермента соотношением АТФ/АМФ, которое возрастает в клетках дрожжей Y. lipolytica при исчерпании азота из среды. Следует отметить, что именно увеличению соотношения АТФ/АМФ отводилась главная роль в снижении активности НАД-ИЦДГ у "липидных" и "цитратных" дрожжей (Marchal et al., 1977; Mitshushima et al., 1978; Evans and Ratledge, 1985; Соколов с соавт.? 1995).

Тем не менее, на наш взгляд первой причиной, приводящей к снижению активности НАД-ИЦДГ, является все-таки снижение уровня АМФ. Фермент обладает низким сродством к эффектору (Km для АМФ равна 995 мкМ), а при приближении к моменту исчерпания азота из среды культивирования концентрация изоцитрата внутри клеток, скорее всего еще не превышает нормального значения, между тем как уровень АМФ к этому моменту уже претерпевает значительное снижение.

Как отмечалось выше, фермент НАД-ИЦДГ дрожжей Г. lipolytica не ингибируется физиологическими концентрациями АТФ (до 0,5 мМ). Для пекарских дрожжей было показано отсутствие ингибирования АТФ (1,5 мМ) на активность ИЦДГ. Кривая зависимости активности фермента от концентрации изоцитрата без добавления каких-либо адениловых нуклеотидов в реакционную смесь практически полностью совпадала с таковой после добавления АТФ (Nichols et al., 1994). Ранее, при исследовании влияния АТФ на активность НАД-ИЦДГ "цитратных" и "липидных" дрожжей, использовались достаточно большие концентрации АТФ (до 10 мМ) (Evans and Ratledge, 1985; Соколов с соавт., 1995). Наблюдавшийся в этих случаях эффект ингибирования АТФ мог быть следствием либо конкуренции за ионы Mg , которые необходимы для образования истинного субстрата реакции, либо просто стерических помех со стороны АТФ для связывания эффектора АМФ.

Таким образом, снижение активности НАД-ИЦДГ в результате увеличения соотношения АТФ/АМФ, наблюдавшееся in vitro вследствие увеличения доли АТФ, возможно в клетках дрожжей Y. lipolytica только за счет снижения доли АМФ в этом соотношении.

Сильным ингибитором НАД-ИЦДГ Y. lipolytica является другой конечный продукт реакции - НАДН. Ингибирующее действие НАДН на дегидрогеназы, участвующие в образовании этого соединения широко известно. Ингибирование продукта происходит в результате снижения скорости диссоциации конечного продукта НАДН из каталитического центра фермента, что в свою очередь определяется соотношением НАДН/НАД+ в клетке. Аналогично пекарским дрожжам (Barnes et al., 1972) НАД-ИЦДГ дрожжей Y. lipolytica имеет большее сродство к НАДН, чем к НАД+. НАДН -конкурентный ингибитор.

Таким образом, в условиях сверхсинтеза лимонных кислот, когда в клетках Y. lipolytica происходит увеличение соотношения НАДН/НАД+, блокирование ЦТК на уровне НАД-ИЦДГ после исчерпания источника азота из среды культивирования определяется именно этим фактором. При сверхсинтезе кетокислот соотношение НАДН/НАД+ снижается и тем самым создаются благоприятные условия для работы НАД-ИЦДГ.

Следует также заметить, что ингибировании НАД-ИЦДГ в условиях сверхсинтеза лимонных кислот на более поздних этапах возможно и в результате воздействия цитрата. Известно, что в митохондриях липидных дрожжей происходит повышение соержания цитрата до 50 мМ при лимитировании их роста источником азота (Evans and Ratledge, 1985). В нашей работе цитрат (10 мМ) оказывал слабое влияние на активность фермента, однако в работе Соколова с соавт. (1995) цитрат показан сильным ингибитором фермента (40 мМ цитрата подавляли активность фермента на 80%). Учитивая сложность взаимодействия цитрата с НАД-ИЦДГ у пекарских дрожжей (Gabriel and Plaut, 1991), вопрос об участии цитрата в регуляции НАД-ИЦДГ дрожжей Y. lipolytica наждается в специальном исследовании.

Изучение физико-химических и кинетических свойств цитратсинтазы (ЦС) у

Y. lipolytica показало, что фермент имеет молекулярную массу порядка 70 кДа и состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой порядка 40 кДа. Сходную молекулярную массу имеет фермент из Penicillium spiculisporum (Mahlen, 1972). Молекулярная масса цитратсинтазы из Aspergillus niger равна 80 кДа (Kubicek and Rohr, 1978). Сильными ингибиторами фермента ЦС Y, lipolytica являются цитрат, НАДН, НАДФН и АТФ. Если учесть, что дрожжи Y. lipolytica в условиях лимитированного роста могут накапливать в среде 100 г/л J1K и более, и цитрат транспортируется из клетки способом простой или облегченной диффузии (Кулаковская с соавт., 1993; 1994), то в условиях сверхсинтеза внутриклеточная концентрация цитрата может достигать значительных величин. Это может ингибировать активности ферментов, участвующих в синтезе цитрата. В частности, нами показано, что цитрат в концентрации 10 - 15 мМ ингибирует активность очищенной ЦС на 50%, а в концентрации 50 мМ - на 80%. Если бы внутри клетки концентрация цитрата была такой же, как в среде культивирования, ЦС проявляла бы лишь небольшую часть от максимальной активности. В таких условиях эффективный синтез цитрата вряд ли был бы возможен. Также нами было показано ингибирование очищенного препарата ЦС из Y. lipolytica АТФ.

Очевидно, что внутри клетки существуют определенные защитные механизмы, предохраняющие ферменты от ингибирующего действия высоких концентраций метаболитов. Было сделано предположение о том, что внутриклеточное микроокружение ЦС внутри делает ее менее чувствительной к ингибирующему влиянию интермедиатов ЦТК. Для проверки этого предположения было проведено сравнительное изучение кинетических свойств ЦС в условиях in vitro и in situ.

ЦС пермеабилизованных клеток менее чувствительна к ингибирующему влиянию цитрата и АТФ, по сравнению с ферментом в бесклеточном экстракте. В условиях in situ цитрат в концентрации 300 мМ ингибировал ЦС только на 50% , в то время как в условиях in vitro цитрат в концентрации 50 мМ ингибировал ЦС на 80%. Ингибирующий эффект АТФ на ЦС пермеабилизованных клеток был также менее выражен. Подобные эффекты не могли быть объяснены изменениями кинетических свойств ЦС в условиях in situ. Км для ацетил-КоА очищенной ЦС и фермента в пермеабилизованных клетках составляла 5 и 7 мкмоль, соответственно; Км для оксалоацетата в условиях in situ была в 4 раза выше, чем в очищенном препарате и составляла 40 мкмоль. Следовательно, в клетке возможно существование структурно-физиологической организации ферментов ЦТК по типу метаболона (Srere, 1985; Robinson and Srere, 1985).

Организация ферментов в метаболоны дает клетке некоторые кинетические преимущества в сравнении с системой со свободными ферментами (Welch, 1977; Spivey and Merz, 1989). Одно из возможных преимуществ состоит в том, что непосредственная близость ферментов, ответственных за последовательные шаги метаболического пути, предотвращает выход интермедиата в раствор, где он может быть использован другими ферментами в других метаболических последовательностях.

Среди митохондриальных ферментов цикла Кребса показаны взаимодействия между шестью из восьми возможных ферментов: фумараза с митохондриальной малатдегидрогеназой (mMDT) (Beeckmans et al., 1989), мМДГ с ЦС (Halper and Srere, 1977; Tornpa et al. 1987; Merz et al., 1987; Datta, Merz, Sorivey, 1985; Lindblah et al., 1994), сукцинил-КоА-синтетаза с кетоглутарат-дегидрогеназным комплексом (Porpaczy, Sumegi, Alkonyi, 1983), митохондриальная аконитат-гидратаза с ЦС (Srere et al. 1997), НАД-зависимая изоцитрат-дегидрогеназа с митохондриальной аконитат-гидратазой (Tviska et al. 1986), НАД-зависимая изоцитрат-дегидрогеназа с кетоглутарат-дегидрогеназным комплексом (Porpaczy, Sunegi, Alkonyi, 1987). Кроме того, показано, что эти ферменты связываются с внутренней мембраной митохондрий, в то время как изоформы из других компартменгов клетки не обладают способностью связываться с внутренней мембраной митохондрий (Srere etal., 1997).

Однако имеется ряд методологических проблем в демонстрации in vitro фермент-ферментных взаимодействий. Большинство этих взаимодействий неустойчивы, и изоляция комплексов приводит к их диссоциации вследствии эффекта разбавления и изменения ионной силы среды.

В настоящей работе с использованием различных методологических подходов продемонстрировано взаимодействие между двумя последовательными ферментами ЦТК - митохондриальной цитратсинтазой (ЦС1) и митохондриальной малатдегидрогеназой (мМДГ) и их связь со структурными элементами клетки.

Был сконструирован фыожен-протеин, состоящий из дрожжевых ЦС1 и мМДГ. Предполагалось, что взаимное ориентирование двух молекул ферментов, находящихся в непосредственной близости друг от друга, может создать некоторые кинетические преимущества для системы ЦС1/мМДГ, по сравнению с отдельно функционирующими ферментами в растворе. Фыожен-протеин ЦС1/мМДГ и свободные ферменты ЦС и МДГ были проанализирован в присутствии ААТ - фермента "ловушки" оксалоацетата. ААТ была менее эффективным ингибитором в реакции, катализируемой фьюжен-протеином по сравнению со свободными ферментами, что позволяет предположить, что внутри комплекса существует субстратный канал для оксалоацетата.

Также для перодоления методологических проблем в демонстрации in vitro ферм ент-ферментных взаимодействий между ЦС и МДГ использовались неионные полимеры. Благодаря своей способности к связыванию диполей воды, раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) является более удачной средой для формирования комплекса ферментов, чем водные буферные растворы. Инкубация ферментов в растворе ПЭГ при определенных условиях позволяет получить достаточно стабильные фермент-ферментные комплексы. Для демонстрации взаимодействия между ЦС и МДГ использовали метод фронтальной гель-фильтрации. Метод заключается в пропускании одного фермента через гель-фильтрационную колонку, уравновешенную раствором другого фермента. Так как молекулярная масса комплекса больше молекулярной массы свободных ферментов, то по величине объема элюции можно судить о наличии или отсутствии комплексообразования. В этих опытах мы наблюдали также пониженную чувствительность компелкса ЦС/ММДГ к ААТ. Более того мы наблюдали сниженную чувствительность комплекса ЦС/мМДГ и к другому ферменту "ловушки" -ОАДК. Из этих результатов можно предположить, что причина снижения чувствительности ЦС/мМДГ к ферментам - "ловушки" ААТ и ОАДК заключается в том, что диффузия ОАА через комплекс ЦС/мМДГ затруднена. Однако мы показали, что твердо-фазный комплекс ЦС/цМДГ проявляет такую же чувствительность к ААТ и ОАДК, как и к свободным ферментам. Поэтому мы можем сделать вывод, что кинетические преимущества комплекса ЦС/мМДГ связаны с функционированием субстратного канала для ОАА от мМДГ к ЦС.

Наши данные о связывании цитратсинтазы с внутренними мембранами митохондрий поддерживают идею надмолекулярной организации ферментов, которая реализуется в большинстве случаев в виде ферментных ансамблей, для поддержания которых необходимы мембраны и структурные белки.

Серьезные исследования ферментных ансамблей осуществлены в Институте белка РАН (А.С. Спирин и А.Г. Рязанов). По представлениям А.Г. Рязанова и А.С. Спирина (Spirin and Ajtkozhin, 1985; Ryazanov, 1988; Ryazanov et al., 1988; Спирин, 1989; Рязанов, Спирин, 1988, 1989), адсорбированные ферменты могут обеспечивать компартментализацию метаболитов у поверхности субклеточных структур, на которых адсорбированы эти ферменты. Модель, предложенная этими авторами и названная "эстафетой у поверхности", учитывает возможность прямой передачи интермедиата из активного центра одного фермента в активный центр следующего фермента данного метаболического пути. Результатом действия ферментов по эстафетному механизму будет то, что интермедиа™ метаболического пути остаются вблизи поверхности. При этом продукты ЦТК - электроны в форме восстановительных эквивалентов (НАДН и ФАДН2) могут передаваться на белки дыхательной цепи, также ассоциированные с внутренней мембраной митохондрий.

Такая организация метаболического пути в ЦТК может создавать ряд преимуществ для клетки: 1) создается возможность для формирования "субстратных каналов", при котором субстраты передаются от одного фермента пути к последующему, без выхода в раствор, где они могут быть захвачены ферментами других метаболических путей; 2) внутри комплексов ферментов создается микроокружение, в котором концентрация субстратов может существенно повышаться даже при наличии ограниченного числа молекул этих субстратов и 3) клетка имеет возможность эффективно и направленно регулировать собственный метаболизм.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Моргунов, Игорь Григорьевич, Пущино

1. Акименко В.К. Альтернативные оксидазы микроорганизмов. М.:Наука, 1989. 262 с.

2. Акименко В.К., Головченко Н.П. Об отсутствии сопряжения между переносом элктронов по альтернативному пути циапидрезистентных митохондрий и образованием мембранного потенциала//Биохимия. 1989. Т. 43. С. 935-936.

3. Акименко В.К., Меденцев А.Г. О появлении цианидрезистентного дыхания у дрожжей Candida lipolytica // Микробиология. 1989. Т. 45. С. 146-150.

4. Акименко В.К., Финогенова Т.В., Ермакова И.Т., Шишканова Н.В. Цианиддрезистентное дыхание у Candida lipolytica и сверхсинтез лимонных кислот // Микробиология. 1989. Т. 48. С. 632-638.

5. Глазунова JI.M. Сравнительное изучение активности основных ферментов цикла трикарбоновых кислот, глиоксилатного цикла и пентозофосфатного пути при росте дрожжевых организмов на глюкозе и на гексадекане. Канд. дисс., Пущино, 1977.

6. Глазунова JI.M., Финогенова Т.В., Лозинов А.Б. О механиезме образования дрожжами Candida lipolityca а-кетоглутаровой кислоты // Микробиология. 1973. Т. 42. № 4. С. 627-631.

7. Глазунова Л.М., Финогенова Т.В. Активность ферментов цитратного, глиоксилатного и пентозофосфатного циклов при синтезе лимонных кислот Candida lipolytica // Микробиология. 1976. Т. 35. В. 3. С. 444-449.

8. Ермакова И.Т. Условия и динамика образования а-кетоглутаровой кислоты при росте тиамингетеротрофных дрожжей Candida lipolytica на н-гексадекане // Прикл. биохим. микробиол. 1970а. Т. 6. N 4. С. 388-395.

9. Ермакова И.Т. Условия и механизм биосинтеза а-кетоглутаровой кислоты при росте дрожжей Candida lipolytica на н-алканах. Автореферат дисс. канд.биол.наук. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 19706.

10. Ермакова И.Т. Определение активности карбоксилирующих ферментов в клетках Candida lipolytica при росте на глюкозе и гексадекане // Микробиология. 1985. Т. 54. В. 4. С. 572-576.

11. Ермакова И.Т., Финогенова Т.В. Участие глиоксилатного цикла в обмене веществ алкан-окисляющих дрожжей Candida lipolytica при биосинтезе а-кетоглутарата // Микробиология. 1971. Т. 40. N 2. С. 223-230.

12. Ермакова И.Т., Розенфельд С.М., Новаковская Н.С., Неклюдова Л.В., Дислер Е.Н. Влияние концентрации азота на синтез кетокислот дрожжами рода Candida, растущими на средах с гексадеканом // Прикл. биохим. микробиол. 1969. Т. 5. N 3. С. 252-255.

13. Ермакова И.Т., Мюллер П., Финогенова Т.В., Лозинов А.Б. Кинетика роста дрожжей Candida lipolytica и биосинтез а-кетокислот при дефиците тиамина в средах с различными источниками углерода // Микробиология. 1979а. Т. 48. N 5. С. 849852.

14. Ермакова И.Т., Финогенова Т.В., Лозинов А.Б. Влияние условий культивирования на рост дрожжей Candida lipolytica и биосинтез а-кетокислот в условиях дефицита тиамина//Микробиология. 19796. Т. 48. N 6. С. 1004-1010.

15. Ермакова И.Т., Мандева Р.Д. Экскреция метаболитов дрожжами родов Torulopsis, Pichia, Debariomyces, Hansenula при лимитировании их роста источниками N, Р, S или Mg // Микробиология. 1981. Т. 50. N 4. С. 476-481.

16. Ермакова И.Т., Ермоленко Е.А., Финогенова Т.В. Биосинтез а-кетокислот тиаминауксотрофными дрожжевыми организмами при использовании различных источников углерода//Прикл. биохим. микробиол. 1986. Т. 22. N 3. 341-347.

17. Ермакова И.Т., Шишканова Н.В., Пелцмане И.Ж., Финогенова Т.В., Карклинь Р.Я. Способ получения пировиноградной кислоты //Авт. свид. N 1321064. 1987.

18. Ермакова И.Т., Шишканова Н.В., Пелцмане И.Ж., Финогенова Т.В., Карклинь Р.Я. Штамм дрожжей Candida lipolytica ВКМ Y-2402D продуцент а-кетоглутаровой кислоты //Патент No 1369276. 1993.

19. Жаболовская Н.А., Агеев Л.М., Петрова Л.Ф. Сравнительная оценка методов количественного определения лимонной кислоты // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 1968. N 5. С. 22 24.

20. Звягильская Р.А. Особенности энергетического обмена дрожжевых организмов // Автореферат дисс.докт. биол. наук. 1983.

21. Звягильская Р.А., Котельникова А.В. Дыхательная цепь дрожжевых митохондрий // Успехи биол. химии. 1989. Т. 30. С. 154-181.

22. Звягильская Р.А., Котельникова А.В. Структура и функциональная активность дрожжевых митохондрий // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Биологическая химия. 1991. Т. 36. 172 с.

23. Звягинцева И.С., Ушаков В.М. Некоторые данные о локализации липазы Candida lipolytica 11 Микробиология. 1972. Т. 41. С. 713-716.

24. Звягинцева И.С., Питрюк И.А. Липиды и липазы некоторых дрожжей // Микробиология. 1976. Т. 3. С. 470-474.

25. Зякун A.M., Муслаева И.Н., Ашин В.В., Пешенко В.П., Аданин В.М., Машкина Л.П., Матяшова Р.Н., Финогенова Т.В. Гетеротрофная фиксация углекислоты Candidalipolytica и ее роль в биосинтезе лимонной кислоты // Микробиология. 1992. Т. 61. N 4. С. 561-570.

26. Иерусалимский Н.Д., Андреева Е.А., Лирова С.А., Ермакова И.Т. Окисление углеводородов дрожжами // Прикл.биохимия и микробиол. 1965. Т. 1. С. 601-605.

27. Илларионова В.И. Сиитез лимонной и изолимонной кислот алкан!окисляющими дрожжами Candida lipolytica II Автореферат дисс.канд. биол. наук, Пущино: ОНТИ Г1НЦ РАН. 1977.

28. Илларионова В.И., Финогенова Т.В., Глазунова Л.М. Изучение влияния условий культивирования па образование лимонной и изолимонной кислот Candida lipolytica на среде с гексадеканом // Прикл. биохим. микробиология. 1975. Т. 11. С.172-178.

29. Илларионова В.И., Шишканова Н.В., Хафербург Д., Финогенова Т.В. Эмульгирующая активность дрожжей при росте на нормальных алканах // Микробиология. 1984. Т.53. В. 3. С. 423-426.

30. Ильченко А.П., Мауэсбергер С., Матящова Р.Н., Лозинов А.Б. Индукция цитохрома Р-450 при росте дрожжевых организмов на различных субстратах // Микробиология. 1980. Т. 49. С. 452-458.

31. Ильченко А.П., Чернявская О.Г., Шишканова Н.В., Финогенова Т.В. Особенности метаболизма дрожжей Yarrowia lipolytica при синтезе из этанола а-кетоглутаровой и лимонной кислот // Микробиология. 2001. Т. 70. № 2. С. 189-195.

32. Камзолова С.В. Биосинтез лимонных кислот дрожжами Yarrowia lipolytica N 1 из этанола в условиях непрерывного культивирования // Автореферат дисс.канд. биол. наук, Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН. 1995.

33. Карклиныд Р.Я., Пробок А.К. Биосинтез органических кислот. Рига: 1972. 200с.

34. Карклиныл Р.Я., Лиепиньш Г.К. Микробный биосинтез лимонной кислоты. Рига: Зинатне. 1993. 240 с.

35. Катаева И.А., Финогенова Т.В. Активность ферментов основных путей обмена глюкозы в клетках тиаминдефицитных дрожжей Candida lipolytica при синтезе кетокислот // Биохимия. 1987. Т. 52. N 5. С. 850-855.

36. Катаева И.А., Ермакова И.Т., Финогенова Т.В. Активности тиаминзависимых ферментов у дрожжей Candida lipolytica при росте на глюкозе в условиях избытка и недостатка тиамина // Микробиология. 1986. Т. 55. N 4. С. 559-563.

37. Кондрашова М.Н. Структурно-функциональная организация Цикла трикарбоновых кислот // Биохимия. 1991. Т.56. N 3. С. 388-404.

38. Кондрашова М.Н., Родионова М.А. Реализация глиоксилатного цикла в тканях животных. //ДАН СССР. 1971. Т. 196. N 5. С. 1225-1227.

39. Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В. Проявление стресса на уровне митохондрий, их стимуляция гормонами и регуляция //Ж. общ. биол. 1984. Т. 46. С. 123-131.

40. Котельникова А.В., Звягильская Р.А. Особенности регуляции цикла трикарбоновых кислот у дрожжей и других микроорганизмов //В кн.: Успехи биологической химии 1979. Т. 20. С. 214-228.

41. Краузова В.И., Шарышев А.А. Исследование субклеточного распределения ферментов начальных этапов окисления н-алканов в клетках дрожжей Candida maltosa II Биохимия. 1987. Т. 52. N 4. С. 599-606.

42. Кулаковская Т.В., Матящова Р.Н., Петров В.В., Куранова Е.В. АТФаза плазматической мембраны не участвует в процессе выхода лимонной кислоты из клеток дрожжей Yarrowia lipolytica П Микробиология. 1994. Т. 63. N 1. С. 23-28.

43. Курганов Б.И. Физико-химические проблемы ферментативного катализа // Под ред. Я.М. Колотыркина. М.: Наука. 1984. Т.5. С.180-219.

44. Курганов Б.И. Физико-химические механизмы регуляции активности ферментов // М.: Наука. 1992. 62 С.

45. Курганов Б.И., Лобода Н.И. Регуляция активности ферментов в адсорбционных ферментных системах. Теоретические модели // Биоорган, химия. 1977. Т. 3. С. 1407-1419.

46. Курганов Б.И., Любарев А.Е. Сборка мультиферментных комплексов как путь создания управляемых систем // Биомолекулярная электроника и проблемы самосборки надмолекулярных структур. Пущино. 1987. С. 83-89.

47. Курганов Б.И., Любарев А.Е. Гипотетическая структура комплекса ферментов гликолиза (гликолитического метаболона), формирующегося на мембране эритроцитов // Молек. биол. 1988. Т. 22. N 6. С. 1599-1605.

48. Курганов Б.И., Любарев А.Е. Принципы организации и функционирования микрокомпартмента метаболона//Биохимия. 1989. Т. 54. № 5. С. 716-718.

49. Курганов Б.И., Любарев А.Е. Проблемы биохимической организации // Биохимия. 1991. Т. 56. N 1. С. 19-31.

50. Курганов Б.И., Чеботарева Н.А. Адсорбция ферментов структурными белками мышц // Успехи биол. химии. Изд.-во Наука. 1989. С. 46-67.

51. Курганов Б.И., Сугробова Н.П., Мильман Л.С. // Молекулярная биология. 1986.Т.20. С.41-52.

52. Лозинов А.Б., Финогенова Т.В. Микробиологический синтез органических кислот из углеводородов нефти//Журнал ВХО им. Д.И.Менделеева. 1972. Т. 17. С. 526-532.

53. Лозинов А.Б., Ермакова И.Т. Образование кетокислот при росте тиамингетеротрофных дрожжей Candida lipolytica на различных н-алканах и монокарбоновых кислотах // Микробиол. пром-сть. 1970. вып. 4. С. 3-7.

54. Лозинов А.Б., Финогенова Т.В., Илларионова В.И., Ермакова И.Т., Есипов С.Е. Способ получения изолимонной кислоты. Авторское свидетельство N 305187. Бюлл. открытий и изобретений N 18. 1971.

55. Лозинов А.Б., Финогенова Т.В., Глазунова Л.М., Илларионова В.И. Лимитирование роста культуры Candida lipolytica и сверхсинтез некоторых метаболитов // Микробиология. 1974. Т. 43. В 5. 786-790.

56. Лозинов А.Б., Глазунова Л.М. Ермакова, И.Т. Активность ферментов нитратного, глиоксилатного и пентозофосфатного циклов при росте дрожжей на гексадекане и глюкозе // Микробиология. 1976. Т. 35. С. 33-39.

57. Любарев А.Е., Курганов Б.И. Надмолекулярная организация ферментов цикла трикарбоновых кислот//Молек. биол. 198. Т. 21. N 5. С. 1286-129.

58. Любарев А.Е., Курганов Б.И. Принципы пространственно-временной организации клеточного метаболизма // Успехи современной биологии. 1989. Т. 108. С. 19-35.

59. Мандева Р.Д., Ермакова И.Т., Мельникова О.Ф., Финогенова Т.В., Лозинов А.Б. Условия и динамика экскреции цитрата, изоцитрата и полиолов при росте дрожжей на глюкозе // Микробиология. 1981. Т. 50. С. 636-644.

60. Меденцев А.Г., Акименко В.К. Изучение цианидрезистептного дыхания дрожжей Candida lipolytica II Микробиология. 1977. Т. 46. С. 197-202.

61. Мецлер Д. Химические реакции в живой клетке. Т 2. 1980. М.; Мир. 606с.

62. Мунтян Л.Н. Содержание тиамина в клетках Candida lipolytica при выращивании на глюкозе и глицерине // Микробиология. 1971а. Т. 40. N 6. 1005-1009.

63. Мунтян Л.Н., Илларионова В.А., Финогенова Т.В. Потребность в некоторых витаминах граппы В дрожжей рода Candida, способных окислять н-алканы // Прикл. биохимия и микробиол. 19716. Т.7 В. 4. С. 410-415.

64. Одинцова Н.В. Микробиологические методы определения витаминов // М.: Наука. 1979.287 с.

65. Петров В.В. Изучение транспорта ионов и метаболитов в везикулы плазматических мембран дрожжей Saccharomyces carlsbergensis // Дис.канд.биол.наук, 1987.

66. Поглазов Б.Ф., Ливанова Н.Б., Островская М.В. Взаимодействие актина с киназой фосфорилазы // ДАН СССР. 1982. Т. 263. N 1. С. 221-224.

67. Рубан Е. А. Микробные липиды и липазы.// М., 1977.

68. Рязанов А.Г., Спирин А.С. Компартментализация биохимических процессов на полирибосомах и других субклеточных структурах // Успехи биол. химии. 1988. Т. 29. С. 3-44.

69. Рязанов А.Г., Спирин А.С. Организация ферментов на внутриклеточных структурах: эстафета у поверхности // Биохимия. 1989. Т. 54. N 5. С. 709-716.

70. Соколов Д.М., Солодовникова Н.Ю., Шарышев А.А., Финогенова Т.В. Роль НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы в биосинтезе лимонной кислоты у дрожжей // Прикл. биохим. микробиол. 1995. Т. 31. N3. С. 315-320.

71. Софронова М.Б., Глазунова Л.М., Мунтян Л.Н., Финогенова Т.В., Лозинов А.Б. Активность а-кетоглутаратдегидрогеназы у Candida lipolytica при биосинтезе а-кетоглутаровой кислоты // Микробиология. 1976. Т. 45. N 2. С. 266-268.

72. Софронова М.Б., Глазунова Л.М., Мунтян Л.Н., Финогенова Т.В., Лозинов А.Б. Активность пируват- и а-кетоглутаратдегидрогеназы при росте дрожжевых организмов на глюкозе и на гексадекане // Микробиология. 1979. Т. 48. N 3. с. 396-399.

73. Спирин А.С. Энергетика и динамика белоксинтезирующего аппарата // В кн. : Успехи биол. химии. 1988. Изд.-во Наука. С. 3-25.

74. Султанович Ю.А., Нечаев А.П., Барсукова И.А. Авторское свидетельство № 968072 СССР/Б.И. 1982 г. №39.С.136.

75. Трутко С.М., Меденцев А.Г., Коробов В.П., Акименко В.К. Цианидрезистентное дыхание бактерий и его взаимосвязь с избыточным синтезом метаболитов // Микробиология. 1984. Т. 52. С. 21-28.

76. Трутко С.М., Матяшова Р.Н., Акименко В.К. Влияние деэнергизации и малата на процесс сверхсинтеза лимонных кислот у дрожжей Candida lipolytica II Микробиология. 1993. Т. 62. N6. С. 1032-1040.

77. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. Общие принципы торможения. М.: Мир. 1966. Пер. с англ. 862 с.

78. Фаусек Е.А. Физиолого-биохимические особенности биосинтеза изолимонной кислоты дрожжами из этанола // Автореферат дисс.канд. биол. наук. ОНТИ НЦБИ АН СССР. 1991.

79. Финогенова Т.В. Биосинтез органических кислот дрожжевыми организмами и его регуляция // Докт. диссертация. 1982. ИБФМ АН СССР. - Пущино.

80. Финогенова Т.В. // Метаболизм алканов и сверхсинтез продуктов микроорганизмами. /Под ред. Финогеновой Т.В. и Шарышева А.А. Пущино, ОНТИ НЦБИ, 1991. С. 96-114.

81. Финогенова Т.В., Глазунова JI.M. Активность ферментов цитратного и глиоксилатного циклов при синтезе лимонной и изолимонной кислот различными штаммами Candida lipolytica // Микробиология. 1982. Т. 51. N 1. С. 27-33.

82. Финогенова Т.В., Мунтян Л.Н., Лозинов А.Б. Относительные потребности в тиамине дрожжей рода Candida, выращиваемых на углеводном и углеводородном питании // Микробиологический синтез. 1969. Т. 7. С. 26-30.

83. Финогенова Т.В., Беликов В.М., Ермакова И.Т., Мунтян Л.Н., Лидеман Л.Ф., Корчемная Ц.Б., Лозинов А.Б. Образование органических кислот при окислении н-парафинов дрожжевыми организмами // Прикл. биохим. микробиол. 1966. Т. 2. N 2. С. 156-162.

84. Финогенова Т.В., Лозинов А.Б., Беликов В.М., Ермакова И.Т., Мунтян Л.Н., Сафонова Э.Н. Образование кетокислот парафинокисляющими дрожжами // Микробиология. 1968. Т. 37. N 1. С. 38-43.

85. Финогенова Т.В., Илларионова В.И., Лозинов А.Б. Образование лимонных кислот дрожжами С. lipolytica при росте на н-алканах // Микробиология. 1973. Т. 42. С.790-794.

86. Финогенова Т.В., Карклинь Н.Я., Ермакова И.Т., Шишканова Н.В., Пелцмане И.Ж. Способ получения пировиноградной кислоты//Авт. свид. N 1249069. 1989.

87. Финогенова Т.В., Шишканова Н.В., Катаева И.А. Сравнительное изучение дрожжей Candida lipolytica с различной способностью продуцировать цитрат // Микробиология. 1989. Т. 58. N 3. С. 387 392.

88. Финогенова Т.В., Моргунов И.Г., Камзолова С.В., Чернявская О.Г. Перспективы производства органических кислот дрожжами Yarrowia lipolytica // Прикл. биохим. микробиол. 2005. Т. 41. N 5. С. 478-486.

89. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. М.: Мир. 1986. Пер. с англ. 374 с.

90. Шишканова Н.В. Цитологическая перестройка дрожжевых клеток в условиях сверхсинтеза кислот. В сб.: Метаболизм алканов и сверхсинтез продуктов микроорганизмами. Пущино. 1991. С. 126-131.

91. Шноль С.Э., Ермакова Е.А., Франк Г.М. Методологические и теоретические проблемы биофизики. М.: Наука, 1979. С. 78-89.

92. Agius L., and Sherratt H.S.A. Channeling in Intermediary Metabolism. Portland Press, London. 1996.

93. Agrawal P.K., Bhatt C.S., and Viswanathan L. Inhibition of fungal NADP-isocitrate dehydrogenase by citric acid // Zeitschrift fur Allgemeine Microbiologic. 1983. V. 23. P. 403406.

94. Ahmed S.A., Smith J.E., Anderson J.G. Mitochondrial activity during citric acid production by Aspergillus niger // Trans. British. Microbiol. Biotechnol. 1972. V. 59. P. 51-61.

95. Aiba S., and Matsuoka M. Citrate production from n-alkane by Candida lipolytica in reference to carbon fluxes in vivo // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1978. V. 5. P. 247-261.

96. Aiba S., and Matsuoka M. Identification of metabolic model: citrate production from glucose by Candida lipolytica//Biotechnol. Bioeng. 1979. V. 21. P. 1373-1387.

97. Aiba S., and Matsuoka M. Identification of metabolic model: Citrate production from glucose by Candida lipolytica // Biotechnol. Bioeng. 1979. V. XXI. P. 1373-1386.

98. Akiyama S. Fermentative production of citric acid from n- paraffins // J. Japan. Oil Chemists Soc. 1974. V. 23. P. 438-444.

99. Akiyma S.I., Suzuki Т., Sumino Y., Nakao Y., and Fukuda H. Induction and citricacid productivity of fluoroacetate-sensitive mutant strains of Candida lipolytica II Agric. Biol. Chem. 1973a. V. 37. N 4. P. 879-884.

100. Anastassiadis S. Zymotiki methodos gia tin sinechi paragogi tou kitrikou oxeos; Process for the continuous production of citric acid by fermentation // Greek Patent No. 940100098 (24.02.1994). 1994.

101. Anastassiadis S., Rehm H.J. Continuous citric acid secretion by a high specific pH dependent active transport system in yeast Candida oleophila ATCC 20177 11 Electronic J. Biotechnol. 2005a. V. 8. N 2

102. Anastassiadis S., Rehm H.J. Citric acid production from glucose by yeast Candida oleophila ATCC 20177 under batch, continuous and repeated batch cultivation // Electronic J. Biotechnol. 2005b. V. 9. N 1

103. Anastassiadis S., and Wandrey C. Process for the continuous production of citric acid by fermentation// US Patent No. 08/208,123 (03/08/1994). 2001.

104. Anastassiadis S., Aivasidis A., and Wandrey C. Fermentationsverfahren zur kontinuierlichen Citronensauregewinnung // German Patent 4317488.4-09. 1993.

105. Anastassiadis S., Aivasidis A., and Wandrey C. Citric acid production by Candida strains under intracellular nitrogen limitation//Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 60(1-2). P. 81-87.

106. Anastassiadis S., Aivasidis A., and Wandrey C. Continuous citric acid fermentation by Candida oleophila under nitrogen limitation at constant C/N ratio // World J. Microbiol. Biotechnol. 2005. V. 21. N 5. P. 125-131.

107. Anton D.L., DiCosimo R., Witterholt V.G. Process for the preparation of pyruvic acid. WO patent 9500656. 1995.

108. Anton D.L., DiCosimo R., Witterholt V.G. Production of pyruvic acid using permeabilized transformants of Hansenula polymirpha and Pichiapastoris wchich express glycolate oxidase and catalase. US patent 5538875. 1996.

109. Arese P., Bosia A., Pescarmona G.P., Till U. 2,3-Diphosphoglycerate synthesis by human white ghosts // FEBS Lett. 1974. V. 49. P. 33-36.

110. Arnold H., Pette D. Binding of glycolitic enzymes to structure proteins of the muscle // Eur. J. Biochem. 1968. V. 6. P. 163-171.

111. Arnold H., Pctte D. Binding of aldolase and triosephosphate dehydrogenase to F-astin and modification of catalytic properties of aldolase // Eur. J. Biochem. 1970. V. 15. P. 360-366.

112. Arts E., Kubicek C.P. and Rohr M. Regulation of phosphofructokinase from Aspergillus niger: effect of fructose-2?6-bisphosphate on the action of citrate, ammonium ions and AMP // J. Gen. Microbiol. 1987. V. 133. N 5. P. 1195-1199.

113. Atkinson D.E. Citrate and the citrate cycle in the regulation of energy metabolizm // Bichemical society symposia. 1968. № 27. P. 23-40.

114. Atkinson D.E. Cellular Energy Metabolism and its Regulation // New York, San Francisco and London, Academic Press, 1977.

115. Atkinson D.E.,Hathaway J.A., Smith E.C., Kinetics of regulatory enzymes. J.Biol. Chem. 1965. V.240. P.2682-2690.

116. Attwood M. ATP-citrate lyase activity in fungal extracts // Antonic van Leeuwenhoek J. Microbiol. Serol. 1973. V. 39. P. 539-544.

117. Babel W., Hofmann K.H. The relation between the assimilation of methanol and glycerol in yeast//Arch. Microbiol. 1982. V. 132. P. 179-184.

118. Backman L., Johansson G. Enzyme-enzyme complexes between aspartate amintransferase and malate dehydrogenase from pig geart muscle // FEBS Lett. 1976. V. 65. P. 39-43.

119. Barns S.M., Lane D.J., Sogin M.L., Bibeau C., and Weisburg W.G. Volutionary relationships among pathogenic Candida species and relatives // J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 2250-2255.

120. Barnes L.D., Kuehn G., Atkinson D.E. Yeast diphosphopyridine nucleotide specific isocitrate dehydrogenase. Purification and some properties // Biochemistry. 1971. V. 10. № 21. P. 3939-3944.

121. Barnes L.D., Mc Guire J.J., Atkinson D.E. Yeast diphosphopyridine nucleotide specific isocitrate dehydrogenase. Regulation activity and unidirectional catalysis // Biochemistry. 1972. V. 11. P. 4322-4329.

122. Barth G., Gaillardin C. Yarrowia lipolytica //Nonconventional Yeasts in Biotechnology. Berlin: Springer, 1996. P. 313-388.

123. Barth G., Gaillardin C. Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica // FEMS Microbiology Reviews. 1997. V. 19. P. 219-237.

124. Barth G. and Kunkel W. Alcohol dehydrogenase (ADH) in yeast. II. NAD+- and NADP+-dependent alcohol dehydrogenases in Saccharomycopsis lipolytica //Z. Allg. Mikrobiol. 1979. V. 19. P. 381-390.

125. Barth G., and Scheuber T. Cloning of the isocitrate lyase gene (JCL1) from Yarrowia lipolytica and characterization of the deduced protein // Mol. Genet. 1993. V. 241. P. 422-438.

126. Barth G., and Weber H. Improved conditions for mating of the yeast saccharomycopsis lipolytica //Z. Allg. Microbiol. 1984. V. 24. P. 403-405.

127. Barth G., and Weber H. Improvement of sporulation in the yeast Yarrowia lipolytica // Antonie van Leewenhoek. 1985. V. 51. P. 167-177.

128. Barth G., and Weber H. Genetic analysis of the gene ICL1 of the yeast Yarrowia lipolytica //Yeast. 1987. V. 3. P. 255-262.

129. Bassel J., and Mortimer R.K. Genetic and biochemical studies on n-alkane non-utilizing mutants of Saccharomycopsis lipolytica // Curr. Genet. 1982. V. 5. P. 77-88.

130. Bati N., Hammond E. G., Glatz B. A. Biomodification of fats and oils: Trials with Candida lipolytica // J. Am. Oil Chem. Soc. 1984. V. 61. P. 1743-1746.

131. Batke J., Asboth G., Lakatos S., Schmitt В., Cohen R. Substrate-induced dissociation of glyceol-3-phosphate dehydrogenase and its complex formation with fructose-bisphosphate aldolase // Eur. J. Biochem. 1980. V. 107. P. 389-394.

132. Beeckmans S., Van Driessche E., and Kanarek L. The visualization by affinity electrophoresis of a specific association between the consecutive citric acid cycle enzymes fumarase and malate dehydrogenase // Eur. J. Biochem. 1989. V. 183. P. 449-454.

133. Behrens U., Weissbrodt E, and Lehmann W. Zur Kinetik der Citronens urebildung bei Candida lipolytica II Zeitschrift fur Allgemeine Mikrobiologie. 1978. V. 18. N 8. P. 549-558.

134. Behrens U., Fiedler S. Recovery of pyruvate. East German Patent 135213. 1979.

135. Behrens U., Schulze E., Weissbrodt E., and Scheffel B. Zur Kinetik der Nebenproduktbildung bei der sberproduktion von Citronens ure durch Saccharomycopsis lipolytica II Acta Biotechnol. 1981. V. 7. N. 2. P. 179-183.

136. Behrens U., Thiersch A., Weissbrodt E. and Stottmeister U. Particularities in the kinetics of growth and citric acid accumulation by Saccharomycopsis lipolytica II Acta Biotechnol. 1987. V. 7. N 2. P. 179-183.

137. Bergmeyer H.-U., Holz G., Kauder E.M., Mollering H., Wieland O. Kristallisierte glycerokinase aus Candida mycoderma II Biochem. J. 1961. V. 333. P. 471-480.

138. Bercovitz A., Peleg Y., Battat E., Rokem J.S., Goldberg I. Localization of pyruvate carboxylase in organic acid-producing Aspergillus strains II Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56(6). P.1594-1597.

139. Besnainou В., Gianin D., Sahut C. Method for producing pyruvic acid by fermentation. EP patent 312453. 1989.

140. Blanchin-Roland S., Cordero Otero R., and Gaillardin C. Two upstream UAS control expression of the XPR2 gene encoding an extracellulr alkaline protease in the yeast Yarrowia lipolytica. Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 327-338.

141. Bogin E. and Wallace A. The inhibition of lemon citrate-condensing enzyme by ATP // Biochim. Biophys. Acta. 1966. V. 128. N 1. P. 190-192.

142. Botham P.A. and Ratledge C. A biochemical explanation for lipid accumulation in Candida 107 and other oleaginous microorganisms // J. Gen. Microbiol. 1979. V. 114. P. 361375.

143. Boulton C.A., and Ratledge. C. Regulatory studies on citrate synthase in Candida 107. an oleaginous yeast 11 J. Gen. Microbiol. 1980. V. 121. P. 441-447.

144. Boulton C.A., and Ratledge. C. Correlation of lipid accumulation in yeasts with possession of ATP:citrate lyase // J. Gen. Microbiol. 1981a. V. 127. P. 169-176.

145. Boulton C.A., and Ratledge. C. ATP: citrate lyase the regulatory enzyme for lipid biosynthesis in Lipomyces starkeyi? II J. Gen. Microbiol. 1981b. V. 127. P. 423-426.

146. Boulton C.A., and Ratledge. C. Partial purification and some properties of ATP: citrate lyase from oleaginous yeast Lipomyces starkeyi II J. Gen. Microbiol. 1983a. V. 129. P. 28632869.

147. Boulton C.A., and Ratledge. C. Use of transition studies in continuous cultures of Lipomyces starkeyi, oleaginous yeast, to investigate the physiology of lipid accumulation // J. Gen. Microbiol. 1983b. V. 129. P. 2871-2876.

148. Boulton C.A., and Ratledge. C. Cryptococcus terricolus, an oleaginous yeast re-examined // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1984. V. 20. P. 72-76.

149. Bowes I. Citric acid production in Aspergillus niger // Ph.D. thesis, University of Strathclyde, Glassgow, 1980. P. 4-62.

150. Bowes I. and Mattey M. Effect of manganese and magnesium ions onmitochnodrial NADP dependent isocitrate dehydrogenase from Aspergillus niger // FEMS Microbiol. Lett. 1979. V. 6. P. 219.

151. Brent L.G. and Srere P. A. The interaction of yeast citrate synthase with yeast mitochondrial inner membranes // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. N 1. P. 319-325.

152. Briffaud J., and Engasser M. Citric acid production from glucose. I. Growth and excretion kinetics in a stirred fermentor// Biotechnol. Bioeng. 1979. V. 21. P. 2083-2092.

153. Bronstein W.W., Knull H.R. Interaction of muscle glycolytic enzymes with thin filament proteins. // Can. J, Biochem. 1981 V. 59. N 7. P. 494-499.

154. Bryun. J. An intermediate product on the oxidation of hexadecene-1 by Candida lipolytica // Kon. Ned. Acad. Wetensch. Proc. Se. C. 1954. V. 57. P. 41-44.

155. Bublitz C., Kennedy E.P. A note of the asymmetrical metabolism of glycerol // J. Biol. Chem. 1954. V. 211. N2. P. 963-967.

156. Bucher Т., Pfleiderer G. Pyruvate kinase from muscle // In: Methods in enzymology. Ed. Colowick S.P., Kaplan N.O. -N.Y.: Academ: Press. 1955. V. I. P. 435-440.

157. Bulow L. Characterization of an artificial bifunctional enzyme R-galactosidase/ gallactoldnase prepared by gene fusion // Eur. J. Biochem. 1987. V. 163. P. 443-448.

158. Burkholder P.R., Mc Veigh J., Moyer D. Vitamin deficiencies in yeast // J. Bacteriol. 1944. V. 48. P. 385-389.

159. Careri G., Gratton E., Yung P.-H., Rupley J.A. Correlation of IR spectroscopic, heat capacity, dia-magnetic susceptibility and enzymatic measurements of lisozyme powde // Nature. 1980. V. 284. P. 572-573.

160. Chan M.F., Stachow C.S., and Sanwal B.D. The allosteric of NAD-specific isocitrate dehydrogenase from Aspergilli./ Can. J. Biochem., 1965, 43,111.

161. Chernyavskaya O.G., Shishkanova N.V., Ilchenko. A.P., Finogenova T.V. Synthesis of alpha-ketoglutaric acid by Yarrowia lipolytica yeast grown on ethanol // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. V. 53. N 2. P. 152-158.

162. Cirigliano M.C., and Carman G.M. Isolation of bioemulsifier from Candida lipolytica// Appl. Environ. Microbiol. 1984. P. 1154-1155.

163. Cirigliano M.C., and Carman G.M. Purification and characterization of liposan. a bioemulsifier from Candida lipolytica// Appl. Environ. Microbiol. 1985. P. 1171-1174.

164. Cooper B. Microbial manufacture of pyruvic acid from D-(-)-lactic acid. DE patent 3733157. 1989.

165. Courtright J.B. Intracellular localization and properties of glyccrolkinaseand glycerophosphate dehydrogenase in Neurospora crassa // Arch. Biochem. Biophys. 1975a. V. 167. P. 21-33.

166. Courtright J.B. Different rates of synthesis of glycerolkinasc and glycerophosphate dehydrogenase in Neurospora crassa during induction// Arch. Biochem. Biophys. 1975b. V. 167. P. 34-44.

167. Crolla A., and Kennedy K.J. Optimization of citric acid production from Candida lipolytica Y-1095 using n-paraffin // J. Biotechnol. 2001. V. 89. N 1. P. 27-40.

168. Crolla A., and Kennedy K.J. Fed-batch production of citric acid by Candida lipolytica grown on n-paraffins // J. Biotechnol. 2004. V. 110. N 1. P. 73-84.

169. Crueger W., and Crueger A. Biotechnologie Lehrbuch der angewandten Mikrobiologic. Oldenbourg Verlag GmbH. Mtinchen. Wien. Oldenburg. ISBN 3-486-28403-7. 1989. chapter 8 -Organische Sauren. P. 127-141.

170. Dagher S.M., Hultin H.O. Association of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with the particulate fraction of chicken skeletal muscle // Eur. J. Biochem. 1975. V. 55. P. 185192.

171. Datta A., Merz J.M., Spivey H.O. Substrate channeling of oxaloacetate in solidstate complexes of malate dehydrogenase and citrate synthase // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. N 28. P. 15008-15012.

172. Davidow L.S., Apostolakos D., O'Donnell M.M., Proctor A.R., Ogrydziak D.M., Wing R.A., Stasko I., and De Zeeuw J.R. Integrative transformation of the yeast Yarrowia lipolytica // Curr. Genet. 1985. V. 10. P. 39-48.

173. Dawson M.W. and Maddox I.S. Evidence for nitrogen catabolitc repression during citric acid production by Aspergillus niger under phosphate-limited growth // Biotechnol. Bioengin. 1989. V. 33. P. 1500-1504.

174. Does A.L., Bisson L.F. Comparison of glucose uptake kinetics in different yeasts // J. Bacteriol. 1981. V. 171. N 3. P. 1303-1308.

175. Denor P.F., Courtright J.B. (1982) Genetic and enzymatic characterization of the inducible glycerol dissimilatory system of Neurospora crassa. J Bacteriol. 1982. V. 151(2). P. 912-917.

176. Dixon N.M., James E.W., Lovitt R.W., Kell D.B. Electromicrobialtransformations using the pyruvate synthase system of Clostridium sporagenes H Bioelectrochem. Bioeng. 1989. V. 21. P. 245-259.

177. D'Souza S.F., and Srere P. A. Cross-linking of mitochondrial matrix proteins in situ II Biochim. Biophys. Acta. 1983a. V. 724. P. 40-51.

178. D'Souza S.F., and Srere P. A. Binding of citrate synthase to mitochondrial inner membranes // J. Biol. Chem. 1983b. V. 258(8). P. 4706-4709.

179. Duntze W., Neumann D., Gancedo J.M., Atzpodien W., Holzer H. Studies on the regulation and localization of the glyoxylate cycle enzymes in Saccharomyces cerevisiae II Eur. J. Biochem. 1969 . V. 10(1). P. 83-89.

180. Ehmann J.D., Hultin H.O. Substrate inhibition of soluble and bound lactate dehydrogenase (isoenzyme 5) // Arch. Biochem. Biophys. 1973. V. 154. P. 471-475.

181. Eisenberg A., Seip J.E., Gavagan J.E., Payne M.S., Anton D.L., DiCosimo R. Pyruvic acid production using methylotrophic yeast transformants as catalyst // J. Mol. Catal. В Enzymatic. 1997. V. 2. P. 223-232.

182. Elcock A.H., and McCammon J. A. Evidence for electrostatic channeling in a fusion protein of malate dehydrogenase and citrate synthase. Biochemistry. 1996. V. 35. P. 1265212658.

183. Enzminger J.D., and Asenjo J. A. Use of cell recycle in the aerobic fermentative production of citric acid by yeast// Biotechnol. Lett. 1986. V. 8(1). P. 7-12.

184. Estabrook R.W., Williamson J.R., Frenkel R., Maitra P.K. The fluorimetric determinatin of mitochondrial adenine and pyridine nucleotides. Methods in ezymology. 1968.V.12.P.474-482.

185. Evans C.T. and Ratledge C. A comparison of the oleaginous yeast, Candida curvata, grown on different carbon sources in continuous and batch culture 11 Lipids. 1983a. V. 18. P. 623-629.

186. Evans C.T. and Ratledge C. Biochemical activities during lipid accumulation in Candida curvata II Lipids. 1983b. V. 18. P. 630-635.

187. Evans C.T. and Ratledge C. Effect of nitrogen source on lipid accumulation in oleaginous yeast//J. Gen. Microbiol. 1984a. V. 130. P. 1693-1704.

188. Evans С.Т. and Ratledge С. Effect of nitrogen metabolism on lipid accumulation by Rhodosporidium tondoides CBS 14 // J. Gen. Microbiol. 1984b. V. 130. P. 1705-1710.

189. Evans C.T. and Ratledge C. Phosphofructokinase and the regulation of the flux of carbon from glucose to lipid in the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides II J. Gen. Microbiol. 1984c. V. 130. P. 3251-3264.

190. Evans C.T. and Ratledge C. The role of the mitochondrial NAD+; isocitrate dehydrogenase in lipid accumulation by the oleginous yeast Rhodosporidium toruloides CBS14. Can.J. Microbiol. 1985a. V. 31. P. 845-850.

191. Evans C.T. and Ratledge C. Possible regulatory role of ATP; citrate lyase, malic enzyme ahd AMP deaminase in lipid accumulation by RhodosporidiumCBSl4. Can. J. Microbiol 1985b.V.31.P. 1000-1005.

192. Evans C.T. and Ratledge C. The physiological significance of citric acid in the control of metabolism in lipid-accumulating yeasts. Biotechnol. Genet. End.Rev. 1985c.V.3. P.85-111.

193. Evans C.T., Scragg A.H., and Ratledge C. Regulation of citrate efflux from mitochondria of oleaginous and non-oleaginous yeasts by adenine nucleotides // Eur. J. Biochem. 1981. V. 132. P. 609-615.

194. Evans C.T., Scragg A.Ii., and Ratledge C. A comparative study of citrate efflux from mitochondria of oleaginous and non-oleaginouus yeast// Eur. J. Biochem. 1983. V. 130. P. 195204.

195. Fahien L.A., and Smith S. The enzyme-enzyme complex of transaminase and glutamate dehydrogenase // J. Biol. Chem. 1974. V. 249(9). P. 2696-2703.

196. Fahien L.A., and Kmiotek E. Precipitation of complex between glutamate dehydrogenase and mitochondrial enzymes // J. Biol. Chem. 1979. V. 264. P. 12303-12312.

197. Fahien L.A., and Chobanian M.C. Kinetic advantages of multienzyme complexes involving aminotransferases // In: Channeling in Intermediary Metabolism. L.Agius and H.S. Sherratt. eds. Portland Press. London. 1997. P. 219-236.

198. Fahien L.A., Davis J.M., Laboy J. Interactions between pyruvate carboxylase and other mitochondrial enzymes. J. Biol. Chem. 1993. V. 268(24). P. 17935-17942.

199. Feir H.A. and Suzuki I. Pyruvate carboxylase of Aspergillus niger kinectic study of a biotin-containing enzyme // Can. J. Biochem. 1969. V. 47. P. 697.

200. Fickers P., Benetti P.H., Wache Y., Marty A., Mauersberger S., Smit M.S., Nicaud J.M. Hydrophobic substrate utilisation by the yeast Yarrowia lipolytica. and its potential applications // FEMS Yeast Res. 2005. V. 6-7. P. 527-543.

201. Frankel D.C. Carbohydrate metabolism // The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces; Metabolism and Gene Expression, Ed. By Strathern J.N., Janes E.W. and Broach J.R., New York; Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. P. 1-37.

202. Franke-Rinker D., and Behrens U. Enzymatische Untersuchungen zur Citrat-Isocitrat-Akkumulation bei Hefen // Die Nahrung. 1979. V. 23(9/10). P. 891-897.

203. Friedrih P., Apro-Covacs V.A., Solti M. Study of metabolite compartmentation in erythrocyte glycolysis // FEBS Lett. 1977. V. 84. P. 183-186.

204. Fukui S. and Tanaka A. Yeast peroxisomes // Trends in Biochem. Sci. 1979a. V. 4. P.249.

205. Fukui S. and Tanaka A. Peroxisomes of alkane-and methanol-grown yeasts. Mctabolic functions and practical applications // J. Appl. Biochem. 1979b. V. 1. P. 171-201.

206. Fukui S. and Tanaka A. Metabolism of n-alkanes by yeasts // Adv. Biochem. Eng. 1981. V. 19. P. 217-226.

207. Furukawa Т., Matsuyoshi Т., Minoda Y., and Yamada K. Fermentative production of citric acid from n-paraffins by yeast// Journal of Fermentation Technology. 1977. V. 55. P. 356-363.

208. Gabriel J., Plaut G. Structural reguirements for the binding of AMP to the aliosteric site of NAD- specific isocitrate dehydrogenase from baker's yeast // Biochemistry. 1990. V.29. P.3528-3533.

209. Gabriel J. L., Plaut C.W.E. Kinetic regulation of yest NAD-specific isocitrate dehydrogenase by citrate //Biochemistry. 1991. V.30. P.2594-2599.

210. Gaillardin C., and Heslot H. Genetic engineering in Yarrowia lipolytica// J. Basic Microbiol. 1988. V. 28. P. 161-174.

211. Gaillardin С., Foumier P., and Sylvestre G. Mutants of saccharomycopsislipolytica defective in lysine catabolism // J. Bacteriol. 1976. V. 125. P. 48-57.

212. Gaillardin C., Ribet A.M., and Heslot H. Integrative transformation of the yeast Yarrowia lipolytica //Curr. Genet. 1985. V. 10. P. 49-58.

213. Gancedo C., Gancedo J.M., Sols A. Glycerol metabolism in yeast // Eur. J. Biochem. 1968. V. 5. P. 165-172.

214. Garlid K.D. Agueous-phase structure in cells and organelles // In Cell-Associated Water. Drost-Hansen W., Clegg J. eds. Academic Press. New York. 1979. P. 293-361.

215. Goldman R., and Katchalski E. Kinetic behaviour of a two-enzyme membrane carrying out a consecutive set of reactions // J. Theor. Biol. 1971. V. 32. P. 2430257.

216. Good D.W., Droniuk R., Lawford R.G., Fein J.E. Isolation and characterisation of a Saccharomycopsis lipolytica mutant showing increased production of CA from canola oil // Can. J. Microbiol. 1985. V. 31. P. 436 440.

217. Gorringe D.M., Moses V. Organization of the gllycolitic enzymes in Esherichia coli II Int. J. Biol. Macmomol. 1980. V. 2. P. 161-173.

218. Gorringe D.M., Moses V. International Journal of Biological Macromolecules. 1980.V.2. P. 161-173.

219. Grazi E., Trombetta G. Yje aldolase-substrate intermadiates and their interaction with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in a reconstructed glycolitic system // Eur. J. Biochem. 1980. V. 107. P. 369-373.

220. Grewal H.S., and Kalra K.L. Fungal production of citric acid II Biotechnology advances. 1995. V. 13(2). P. 209-234.

221. Groves P., Clare J.J., and Oliver S.G. Isolation and characterization of a double stranded RNA virus-like particle from the yeast Yarrowia lipolytica. Curr. Genet. 1983. V. 7. P. 185-190.

222. Grunnet N., Lundquist F. Kinetics of glycerol kinases from mammalian liver and Candida mycoderma // Eur. J. Biochem. 1967. V. 3(1). P. 78-84.

223. Guerzoni M. E., Lanciotti R., and Cocconcelli P.S. Alteration in cellular fatty acid composition as a response to salt acid oxidative and thermal stresses in Lactobacillus helveticus //Microbiology. 2001. V. 147. P. 2255-2264.

224. Gustafsson L. The ATP pool in relation to the production of glycerol and heatduring growth of the halotolerant yeast Debaryomyces hansenii// Arch. Microbiol. 1979. V. 126. P. 15-23.

225. Habison A., Kubicek C.P., and Rohr M. Phosphofructokinase as a regulatory enzyme in citric acid producing Aspergillus niger// FEMS Microbiol. Lett. 1979. V. 5. P. 39-42.

226. Habison A., Kubicek C.P., and Rohr M. Partial purification and regulatory properties of phosphofructokinase from Aspergillus niger // Biochem. J. 1983. V. 209. P. 669-676.

227. Hackenbrock C.R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. V. 61. P. 598-605.

228. Hagihara Т., Mischina M., Tanaka A., and Fukui S. Utilization of pristane by the yeast Candida lipolytica. Fatty acid composition of pristane-grown cells // Agric. Biol. Chem. 1977. V. 41. P. 1745-1748.

229. Halper L., Srere P.A. Interaction between citrate synthase and mitochondrial malate dehydrogenase in the presence of polyethylene glycol // Arch. Biochem. Biophys. 1977. V. 184. P. 529-534.

230. Harding J.W.Jr., Pyeritz E.A., Morris H.P., White H.B. Proportional activities of glycerol kinase and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in rat hepatomas // Biochem. J. 1975. V. 148(3). P. 545-50.

231. Hathaway J. A. and Atkinson D.E. The effect of adenylic acid on yeast nicotinamode dinucleotide isocitrate dehydrogenase, a possible metabolic control mechanism // J. Biol. Chem. 1963. V. 238. P. 2875-2881.

232. Hathaway J.A. and Atkinson D.E. Kinetics of regulatory enzymes: effect of adenosine triphosphate on yeast citrate synthase //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965. 20. P. 661-665.

233. Hattori К., Hakko K., and Imada O. Effect of ammonium ion on the ratio of citric acid to d-isocitric acid formed from n-paraffin // Journal of Fermentation Technology. 1974. V. 52(8). P. 542-550.

234. Hayashi S., Lin E.C.C. Purification and properties of glycerol kinase from Escherichia coli //J. Biol. Chem. 1967. V. 242. P. 1030-1035.

235. Heslot H. Genetics and genetic engineering of the industrial yeast Yarrowia lipolytica// Adv. Biochem. Eng.Biotechnol. 1990. V. 43. P. 43-73.

236. Hess В., Boiteux A. Heterologous enzyme-enzyme interactions //In: Protein-protein Interactions. Springer-V. Berlin. Heidelberg. 1972. P. 271-297.

237. Hess В., Boiteux A., Kruger J. Cooperation of glyeolitic enzymes // Adv.

238. Enzyme Regul. 1969. V. 7. P. 149-167.

239. Hirai M., Ohtani E., Tanaka A., Fukui S. Glucose-phosphorylating enzymes of Candida yeasts and their regulation in vivo II Biochim Biophys Acta. 1977. V. 480(2). P. 357-66.

240. Hoffmann K. Assimilation and akkumulation von glycerol durch hefen und scimmelpilze //Biol. Rdsch. 1983. V. 21. P. 265-276.

241. Hoist B. Lunde C. Lages F. Oliveira R. Lucas C. Kielland-Brandt MC. GUP1 and its close homologue GUP2. encoding multimembrane-spanning proteins involved in active glycerol uptake in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Microbiol. 2000. V. 37(1). P. 108-24.

242. Holzschu D.L., Chandler F.W., Ajello L., and Ahearn D.G. Evaluation of industrial yeasts for pathogenicity. Sabouraudia. 1979. V. 17. P. 71-78.

243. Hossain M., Brooks J.D., and Maddox I.S. The effect of the sugar source on citric acid production by Aspergillus niger II Microbiol. Biotechnol. 1980. V. 19. P.393-397.

244. Jagannathan V. and Singh K. Carbohydrate metabolism on citric acid fermentation. The glycolitic enzymes of Aspergillus niger // Enzymologia. 1953. V. 16. P. 150-156.

245. Kamzolova S.V., Shishkanova N.V., Morgunov I.G., and Finogenova T.V. Oxygen requirements for growth and citric acid production of Yarrowia lipolytica II FEMS Yeast Res. 2003. V. 3(2). P. 217-222.

246. Kawamoto S. Yamada T. Tanaka A. Fukui S. Distinct subcellular localization of NAD-linked and FAD-linked gIycerol-3-phosphate dehydrogenases in n-alkane-grown Candida tropicalis//FEBS Lett. 1979. V. 97(2). P. 253-256.

247. Kawasaki K., Yokota A., Tomita E. L. Tryptophan production by a pyruvic acid-producing Escherihic coli strain carrying the Enterobacter aerogenes tryptophanase gene // J. Ferment. Biocng. 1996. V. 82. P. 604-606.

248. Keith. A.D. The Agueous Cytoplasm // Marcel Dekker. New York. 1979.

249. Kemp G.D., Dickinson F.M., and Ratledge C. Light sensitivity of the n-alkane-induced fatty alcohol oxidase from Candida tropicalis and Yarrowia lipolytica // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. V. 32. P. 461-464.

250. Keys D.A. and McAlister-Henn L. Subunit structure, expression and function of NAD(H)- specific isocitrate dehydrogenase in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacterid. 1990. V.172. P.4280-4287.

251. Kirimura K., Hirowatari Y., Usami S. Alterations of respiratory systems in Aspergillus niger under the conditions of citric acid fermentation // Agric. Biol. Chemistry. 1987. V. 51. P. 1299-1301.

252. Kiuchi M., Mori N., Tabei H., Kadoma V. Pyruvic acid production by Torulopsis etchellsii. JP patent 6214789. 1987a.

253. Kiuchi M., Mori N., Takami I., Monma M., Tabei. H. Pyruvate production by a halophilic yeast Torulopsis etchellsii II J. Jpn. Soc. Food Sci. Technol. 1987b. V. 33. P. 579-584.

254. Klasson Т.К., Clausen E.C., and Gaddy J.C. Continuous fermentation for the production of citric acid from glucose // Appl. Biochem. Biotechnol. 1989. V. 20/21. P. 491-505.

255. Klingenberg M. Mitochondria metabolite transport // FEBS Lett. 1970. V. 6(3). P. 145154.

256. Klug M.J., and Markovetz A.J. Degradation of hydrocarbons by members of the genus Candida. II. Oxidation of n-alkanes and L-alkenes by Candida lipolytica// J. Bacteriol. 1967. V. 93. P.1847-1852.

257. Knowles C.J. Microbial metabolic regulation by adenine nucleotide pools. Symposia Society General Microbiology. 1977. V.27.P.24-283.

258. Kochetov G.A., Nikitushkina L.I., Chernov N.N. A complex of functionallybound enzymes: Transketolase and glyceraldehydephophate dehydrogenase // Biochem. Biophyis. Res. Commun. 1970. V. 40. P. 873-879.

259. Koning W., Harder W., Dijkhuizen L. Glycerol metabolism in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha: phosphorylation as the initial step // Arch. Microbiol. 1987. V. 148(4). P. 314-320.

260. Kornberg A. Isocitrate dehydrogenase of yeast (DPN) // Methods Enzymol. Ed. Colowick S.P. and Kaplan N.O., New York and London, Academoc Press. 1955. V. 1. P. 705-709.

261. Kornberg A. and Pricer W.E.J. Di and triphosphopyridine nucleotide isocitratc dehydrogenase in yeast // J. Biol. Chem. 1951. V. 189. P. 123-126.

262. Kristiansen В., and Charley. R. Continuous process for production of citric acid // In: Advances in Biotechnology. 1981. V. 1. P. 221-227.

263. Kristiansen В., and Sinclair C.G. Production of citric acid in batch culture // Biotcchnol. Bioeng. 1978. V. 20. P. 1711-1722.

264. Kristiansen В., Mattey M., and Linden J. Citric acid biotechnology // Kristiansen В., Mattey M. and Linden J. eds. Taylor and Francis. London. UK. 1998. 250 p.

265. Kubicek C.P., and Rohr M. Influence of manganese on enzyme synthesis and citric acid accumulation in Aspergillus niger //Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1977. V. 4. P. 167-173.

266. Kubicek C.P., and Rohr M. The role of the tricarboxylic acid cycle in citric acid accumulation by Aspergillus niger //Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1978. V. 5. P. 263.

267. Kubicek C.P., and Rohr M. Regulation of citrate synthase from the citric acid accumulating fungus Aspergillus niger II Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 615. P. 439-445.

268. Kubicek C.P., and Rohr M. Aconitase and citric acid fermentation by Aspergillus niger II Appl. Environ. Microbiol. 1985. V. 50(5). P. 1336-133.

269. Kubicek C.P., and Rohr M. Citric acid fermentation // CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1986. V. 3(4). P. 331-373.

270. Kubicek С.P., Hampel W. and Rohr M. Manganese defieienee leads to elevatedamino acid pool in citric acid accumulating Aspergillus niger // Arch. Microbiol. 1979. V. 123. N l.P. 73-79.

271. Kubicek C.P., Zehentgruber O., and Rohr M. An indirect method for studying the fine control of citric acid fermentation by Aspergillus niger //Biotechnol. Lett. 1979. V. l.P. 47.

272. Kubicek C.P., Zehentgruber O., Elkalak L.II. and Rohr M. Regulation of citric acid production by oxygen: Effect of dissolved oxygen tension on adenylate levels and respiration // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1980. V. 9. P. 101-117.

273. Kubicek C.P., Witteveen C.F.B., and Visser J. Regulation of organic acid production by Aspergilli II In: The Genus Aspergillus. Powell K.A. ed. Plenum Press. New York. 1994. P. 35145.

274. Kurganov B.I. Adsorption of periferal enzymes to membrane anchor proteins // J. Theor. Biol. 1984. V. 11 l.P. 707-723.

275. Kurganov B.I. Control of enzyme activity in reversibly adsorptive enzyme systems // Organized Multienzyme Systems. N.Y.: Acad. Press. 1985a. P. 241-270

276. Kurganov B.I. Organized multienzyme systems: Catalytic properties // Ed. G.R. Welch. N.Y. Acad. Press. 1985b. P. 241-270.

277. Kurganov B.I. The role of multienzyme complexes in integration of cellular metabolism //J. Theor. Biol. 1986. V. 119. P. 445^155.

278. Kurganov B.I. Enzyme dynamics and regulation // Ed. P.B. Chock et al. В.: Springer. 1987a. P. 175-180.

279. Kurganov B.I. Metabolism and development of the nervous system // Ed. S. Tucek. Prague: Academia. 1987. P. 269-272.

280. Kurganov B.I., Sugrobova N.P., Mil'man L.S. Supramolecular organization of glycolytic enzymes // J. Theor. Biol. 1985. V. 116. P. 509-526.

281. Kurischko C., and Weber. H. Temporal relationship of diploidization and haplodization in the yeast Yarrowia lipolytica//J. Basic Microbiol. 1986. V. 3. P. 137-144.

282. Dall M., Nicaud J.-M., Treton B.Y., and Gaillardin C.M. The 3-phosphoglycerate kinase gene of the yeast Yarrowia lipolytica de-represses on gluconeogenic substrates // Curr. Genet. 1996. V. 29. P. 446-456.

283. Y., Chen. J., Liang D.F., Lun S.Y. Effect of nitrogen source and nitrogen concentration on the production of pyruvate by Torulopsis glabrata // J. Biotechnol. 2000. V. 81. P. 27-34.

284. Ma H., Kubicek C.P., Rohr M. Metabolic effects of manganese deficiency in Aspergillus niger: evidence for increased protein degradation // Arch. Microbiol. 1985. 141(3). P. 266-268.

285. MacGregor J.S., Singh V.N., Davoust S., Melloni E., Pontremoli S., Horecker B.L. Evidence for formation of a rabbit liver aldolase-rabbit liver fructose-1.6-bisphosphate complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 3889-3892.

286. Mahlen A. Purification and some properties of citrate synthase from Penicillhun spiculisporum И Eur. J. Biochem. 1972. V. 29 (1). P. 60-66.

287. Marchal R., Chaude O., and Metche M. Production of citric acid from n-paraffines by Saccharomycopsis lipolytica: Kinetics and Balance of the Fermentation // Eur. J. Appl. Microbiol. 1977. V. 4. P. 111-123.

288. Masters C.J. Metabolic control and the microenvironment // Curr. Top. Cell. Regul. 1977. V. 12. P. 75-105.

289. Masters C.J. Interactions between soluble enzymes and subcellular structure // Trends Biochem. Sci. 1978. V. 3. P. 206-208.

290. Masters C.J., Winzor D.L. Physicochemical evidence against the concept of an interaction between aldolase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase // Arch. Biochem. Biophys. 1981. V. 209. P. 185-190.

291. Matoba S., Fukuyama J., Wing R.A., and Dgrydziak D.M. Intacellular precursors and secretion of alkaline extracellular protease of Yarrowia lipolytica// Mol. Cell. Biol. 1988. V. 8. P. 4904-4916.

292. Mattey M. Citrate regulation of citric acid production by Aspergillus niger И FEMS Microbiol. Lett. 1977. V. 2. P. 71-74.

293. Mattey M. The production of organic acids // Crit. Rev. Biotechnol. 1992. V. 12. P. 87132.

294. Mattey M., Bowes I. Citrate regulation of NADP-specific isocitratc dehydrogenase of Aspergillus niger II Biochem. Soc. Trans. 1978. V. 6. P. 1224-1226.

295. Matsuoka M., Ueda Y., Aiba S. Role and control of isocitrate lyase in Candida lipolytica /I J. Bacteriol. 1980. V. 144. P. 692-697.

296. Matsuoka M., Himeno Т., and Aiba S. Characterization of Saccharomycopsis lipolytica mutants that express temperature-sensitive synthesis of isocitrate lyase // J. Bacteriol. 1984. V. 157. P. 899-908.

297. Mausberger S., Boehmer A., Schunk W.-H., and Muller H.-G. Cytochrome P-450 of the yeast Yarrowia lipolytica II Abs. of Internat. Symposium on Cytochrome P-450 of Microoorganisms. Berlin. 1991. P. 63.

298. Mausberger S., Drechsler H., Oehme G., and Muller H.-G. Substrate specifity and stereoselectivity of fatty alcohol oxidase from the yeast Candida maltosa // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. V. 37. P. 66-73.

299. McCowen S.M., Sellers J.R., Rhibbs P.V. Characterization of fructose-1.6-diphosphate-insensetive catabolic glycerol kinase of Pseudomonas aerugenosa // Curr. Microbiol. 1987. V. 14. P. 323-327.

300. McKay I.A. Growth of fermentative and non-fermentative yeast in normal yoghurt, stored in polystyrene cartons // Int. J. Food Microbiol. 1992. V. 15. P. 383-388.

301. Meixner-Monori В., Kubicek C.P., and Rohr M. Pyruvate kinase from Aspergillus niger: a regulatory enzyme in glycolysis? // Can. J. Microbiol. 1984. V. 30. P. 16-22.

302. Meixner-Monori В., Kubicek C.P., Habison A., Kubicek-Pranz E.M., and Rohr M. Presence and regulation of the a-ketoglutarate dehydrogenase multienzyme complex in the filamentous fungi Aspergillus niger // J. Bacteriol. 1985. V. 161. P. 265.

303. Meixner-Monori В., Kubicek C.P., Harrer W., Schreferi G. and Rohr M. NADP-specific isocitrate dehydrogenase from the citric acid accumulating fungus Aspergillus niger// Biochem. J. 1986. V. 236. P. 549-557.

304. Melnick R.L., Hultin H.O. Studies on the nature of the subcellular localization of lactate dehydrogenase and glyceraIdehyde-3-phosphate dehydrogenase in chicken skeletal muscle II J. Cell. Physiol. 1973. V. 81. P. 139-148.

305. Mitchell C.D., Mitchell W.B., Hanahan D.J. Enzyme and hemoglobinretention in human erythrocyte stroma// Biochim. Biophys. Acta. 1965. V. 104. P. 348-358.

306. Mitsushima K., Shinmyo A., Enatsu N. Respiration activity in mitochondria prepared from cells Candida lipolytica at different growth phases // J. Ferment. Technol. 1976. V. 54. P. 863-871.

307. Mitsushima K., Shinmyo A., Enatsu N. Control of citrate and 2-oxoglutarate formation in Candida lipolytica mitochondria by adenine nucleotides // Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 538. P. 481-492.

308. Miyata R., Yonehara N., Yomoto K. Manufacture of pyruvic acid from L-tartaric acid with Pseudomonasputida. JP Patent 61216695. 1986.

309. Miyata R., Yonehara Т., Yomoto K. Manufacture of pyruvic acid with Torulopsis species. JP Patent 63258586. 1988a.

310. Miyata R., Yonehara Т., Yomoto K. Manufacture of pyruvic acid with Torulopsis species. JP Patent 63258587. 1988b

311. Miyata R., Tsutsui H., Yonehara T. Manufacture of pyruvic acid with Torulopsis species. JP Patent 0155185. 1989a.

312. Miyata R., Tsutsui H., Yonehara T. Manifacture of pyruvic acid with aminooxyacetic acid-resistant Toridopsis species. JP Patent 0155186. 1989b.

313. Miyata R., Yonehara Т., Yotsumoto K., Tsutsui H. Preparing pyruvic acid fermentation with Torulopsis species. WO Patent 8901523. 1989c.

314. Miyata R., Yonehara Т., Tsutsui H. Method for producing pyruvic acid by fermentation. US patent 4971907. 1990.

315. Miyata R., Igarashi H., Yonehara T. Manufacture of pyruvic acid with (halogenated)pyruvic acid-resistant microorganisms. JP Patent 2000078996. 2000.

316. Montet D., Ratomahenina R., Galzy P., Pina M., Graille J. A study of the influence of the growth media on the fatty acid composition in Candida lipolytica DIDDENS and LODDER // Biotcchnol. Lett. 1985. V. 7. P. 733-736.

317. Moore G.E., Gadol S.M., Robinson J.B., Srere P.A. Binding of citrate synthase and malate dehydrogenase to mitochondrial inner membranes: Tissue distribution and metabolic effects // Biochem. Biophys. Res. Communic.1984. V. 121(2). P. 612-618.

318. Moresi M. Effect of glucose concentration on citric acid production by Yarrowia lipolytica Hi. Chem. Technol. Biotechnol. 1994. V. 60(4). P. 387-395.

319. Mori N., Jitsunari K., Yoshida M., Kitamoto Y., Ichikawa Y. Pyruvic acidproduction from gluconic acid by Pseudomonas stutzeri II Tottori Daigaki Nogakubu Kenkyu Hokoku. 1987. V. 40. P. 15-20.

320. Morugichi M. Fermentative production of pyruvic acid from citrus peel extracts by Debaryomyces coudertii II Agric. Biol.Chem.1982. V. 46. P. 955-961.

321. Moriguchi M., Shuto K., Hashimoto T. Production of pyruvic acid from saccharified citrus peel extracts by dried cells of Debaryomyces coudertii II J. Ferment. Technol. 1984. V. 62. P. 243-248.

322. Mowbray J., Moses V. The tentative identification in Escherichia coli of a multienzyme complex with glycolytic activity // Eur. J. Biochem. 1976. V. 66(1). P. 25-36.

323. Murphy G.L., and Perry J.J. (1984) Assimilation of chlorinated alkanes by hydrocarbon-utilizing fingi // J. Bacteriol. 1984. V. 160. P. 1171-1174.

324. Naumova E., Naumov G., Fournier P., Nguyen H.V., and Gaillardin. C. Chromosomal polymorphism of the yeast Yarrowia lipolytica and related species: electrophoretic karyotyping and hybridization with cloned genes // Curr. Genet. 1993. V. 23. P. 450-454.

325. Neilson N.E. The presence of aconitase and aconitic hydratase in Aspergillus niger // J. Bacteriol. 1956. V. 71. P. 356.

326. Nilsson A. Adler L. Purification and characterization of glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD+) in the salt-tolerant yeast Debaryomyces hansenii II Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1034(2). P. 180-185.

327. Nyns E.J., Auquere J.P., Chiang N., and Wiaux A.l. Comparative growth of Candida lipolytica on glucose and n-hexadecane //Nature. 1967. V. 215. P. 177-188.

328. Ogrydziak D.M. Production of alkaline extracellular protease by Yarrowia lipolytica // CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1988. V. 8. P. 177-187.

329. Ogrydziak D.M. Yeast extracellular proteases// Crit. Rev. Biotechnol. 1993. V. 13. P. 155.

330. Ogrydziak D.M., and Mortimer R.K. Genetics extracellular protease production in Saccharomycopsis lipolytica//Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 87. P. 621-632.

331. Okoshi H., Sato S., Mukataka S., and Takahashi J. (1987) Citric acid production by Candida tropicalis under high dissolved oxygen concentrations // Agric. Biol. Chem. 1987. V. 51(1). P. 257-258.

332. Osmani S.A. and Scrutton M.C. The subcellular localization of pyruvate carboxylase and of some other enzymes in Aspergillus nidulans // Eur. J. Biochem. 1983. V. 133. P. 551.

333. Ota Y., Oikawa S., Morimoto Y., Minoda Y. Purification and some properties of cell-bound lipase from Saccharomycopsis lipolytica // Agric. Biol. Chem. 1982. V. 46. P. 2885-2893.

334. Ottaway J.H. Simulation of metabolic events // Teclin. Life Sci. B2/II: Techn. Metabol. Res. B. 1979. V.219. P. 1-27.

335. Ovadi J. Cell Architecture and Metabolic Channeling // R.G. Landes. Springer-Verlag. Austin. New York. Berlin. Heidelberg. London. Paris. Tokyo. Hong Kong. Barcelona. Budapest. 1995.

336. Ovadi J., Keleti T. Kinetic evidence for interaction between aldolase and D-glyceraldehyde-3-phisphate dehydrogenase // Eur. J. Biochem. 1978. V. 85. P. 157-161.

337. Ovadi J., and Saks V. On the origin of intracellular compartmentation and organized metabolic systems //Molec. Cell. Biochem. 2004. V. 256/257. P. 5-12.

338. Ovadi J., Srere P.A. Macromolecular compartmentalization and channeling. Intern. Rev. Cytol. 2000. V. 192. P. 255-280

339. Ovadi J., Salerno C., Keleti Т., Fasella. P. Physico-chemical evidence for the interaction between aldolase and glyceraldehyde-3-phisphate dehydrogenase // Eur. J. Biochem. 1978. V. 90. P. 499-503.

340. Pagot Y., Endrizzi A., Nicaud J.M., Belin J.M. Utilization of an auxotrophic strain of the yeast Yarrowia lipolytica to improve y-decalactone production yields //Lett. Appl. Microbiol. 1997. V. 25. P. 113-116.

341. Papanikolaou S., and Aggelis G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture // Bioresource Technology. 2002. V. 82. P. 43-44.

342. Papanikolaou S., and Aggelis G. Modeling lipid accumulation and degradation in Yarrowia lipolytica cultivated on industrial fats // Curr. Microbiol. 2003a. V. 46(6). P. 398-402.

343. Papanikolaou S., and Aggelis G. Selective uptake of fatty acids by yeast Yarrowia lipolytica. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2003b. V. 105. P. 651-655.

344. Patthy L., Vas M. Aldolase-catalysed inactivation of glyceraldehyyde-3-phosphate dehydrogenase//Nature. 1978. V. 276. P. 94-95.

345. Pavlik P., Simon M., Schuster Т. Ruis H. The glycerol kinase (GUT1) gene of Saccharomyces cerevisiae: cloning and characterization // Curr. Genet. 1993. V. 24(1-2). P. 2125.

346. Peters 1.1., and Nelson F.E. Factors influencing the production of lipase by Mycotorula lipolytica//J. Bacteriol. 1948a. V. 55. P. 589-591.

347. Peters 1.1., and Nelson F.E. Preliminary characterization of the lipase of Mycotorula lipolytica II J. Bacteriol. 1948b. V. 55. P. 593-600.

348. Pette D. Cytosolic organization of carbohydrate-metabolism enzymes in cross-striated muscle // Biochem. Soc. Trans. 1978. V. 6. P. 9-11.

349. Petit T„ Gancedo C. Molecular cloning and characterization of the gene IIXK1 encoding the hexokinase from Yarrowia lipolytica II Yeast. 1999. V. 15(15). P. 1573-84.

350. Persson L.-O., and Srere P.A. Purification of the mitochondrial citrate transporter in yeast. Biochem. Biophys. Res. Coramun. 1992. V. 183. P. 70-76.

351. Pignede G., Wang H.J., Fidalej F., Seman M., Gailaardin C., Nicaud J.M. Autocloning and amplification of LIP2 in Yarrowia lipolytica II Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66(8). P. 3283-3289.

352. Pignede G., Wang H., Fudalej F., Gallardin C., Seman M., Nicaud J.M. Characterization of an extracellular lipase encoded by LIP2 in Yarrowia lipolytica // J. Bacteriol. 2002. V. 182(10). P. 2802-2810.

353. Pfitzner F., Kubichek C., Rohr M. Presence and regulation of ATP:citrate lyase from the citric acid producing fungus Aspergillus niger II Arch. Microbiol. 1987. V. 147. P. 88-91.

354. Pontremoli S., Melloni E., Salamino F., Sparatore В., Michetti M., Singh V.N., Horecker B.L. Evidence for an interaction between fructose-1.6-bis-phosphatase and fructose-1.6-bis-phosphate aldolase//Arch. Biochem. Biophys. 1979. V. 197. P. 356-363.

355. Poritz M.A., Siegel V., Hansen W., and Walter P. Small ribonucleoproteins in

356. Schizosaccharomyces pombe and Yarrowia lipolytica homologous to signal recognition particle //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 4315-4319.

357. Porpaczy Z., Sumcgi В., and Alkonyi I. Association between the a-ketoglutaratc dehydrogenase complex and succinate thiokinase // Biochem. Biophys. Acta. 1983. V. 749. P. 172-179.

358. Porpaczy Z., Sumcgi В., and Alkonyi I. Interaction between NAD-dependent isocitrate dehydrogenase, a-ketoglutarate dehydrogenase complex and HADH:ubiquinone oxidoreductase //1. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 9509-9514.

359. Ramaiah A. Pasteur effect and phosphofructokinase // Curr. Top. Cell. Regul. 1974. V. 8. P. 298-345.

360. Ramakrishnan C.Y., Martin C.V. The enzymatic synthesis of citric acid by cell-free extracts of Aspergillus niger. Can. J. Biochem. Physiol. 1954. V. 32. P. 434-439.

361. Ramakrishnan C.V., Steel R., Lentz C.P. Mechanism of citric acid formation and accumulation in Aspergillus niger. Arch. Biochem. Biophys. 1955. V. 55. P. 270-273.

362. Rane K. D., and Sims K.A. Production of citric acid by Candida lipolytica Y1095: Effect of glucose concentration on yield and productivity // Enzyme Microb. Technol. 1993. V. 15(8). P. 646-651.

363. Rane K.D., and Sims K. Oxygen uptake and citric acid production by Candida lipolylica Y 1095 // Biotechnol. Bioeng. 1994. V. 43(2). P. 131-137.

364. Rane K.D., and Sims K. Citric acid production by Candida lipolytica Y 1095 in cell recycle and fed-batch fermenters // Biotechnol.Bioeng. 1995. V. 46 (4). P. 325-332.

365. Ratledge C. Lipids and Fatty acids // Econom. Microbiol. / Eds. Rose A.H. New York and London, Academic Press. 1978. V. 2. P. 263-301.

366. Ratledge C. and Botham P. A. Pathway of glucose metabolism in Candida 107, a lipids-accumulating yeast//J. Gen. Microbiol. 1977. V. 102. P. 391-395.

367. Ratledge C. And Gilbert S.C. Carnitine acetyltransferase activity in oleagenous yeasts // FEMS Microbiol.Lett. 1985. V. 27. P. 273-275.

368. Rehm H.-J. Industrielle Mikrobiologie. P. II. AufL. Springer Verlag. Berlin. Heidelberg. New York. 1980.

369. Reiser J., GlumoffV., Ochsner U.A. and Fiechter A. Molecular analysis of the' Trichosporon cutaneum DSM 70698 argA gene and its use for DNA-mediated transformations // J. Bacteriol. 1994. V. 176(10). P. 3021-3032.

370. Richards F.M. The interpretation of protein structures: Total volume, groupvolume distributions and packing density // J. Mol. Biol. 1974. V. 82. P. 1-14.

371. Robinson J.B., and Srere P.A. Organization of Krebs tricarboxylic acid cycle enzymes in mitochondria//J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 10800-10805.

372. Rohr M. A century of citric acid fermentation and research // Food Technology and Biotechnology. 1998. V. 36. P. 163-171.

373. Rohr M., Kubicek C.P. Regulatory aspects of citric acid fermentation by Aspergillus niger II Proc. Biochem. 1981. V. 16. P. 34-44.

374. Rohr M., Zehentgruber O., Christian P. Kinetics of biomass formation and citric acid production by Aspergillus niger in pilot plant scale // Biotechnol. Bioeng. 1981. V. 23. P. 24332445.

375. Roiha H., Shuster E.O., Brow D.A., and Guthrie C. snRNAs from budding yeasts: phylogenetic comparisons reveal extensive size variation // Gene. 1989. V. 82. P. 213-222.

376. Ronnow В. Kielland-Brandt MC. GUT2, a gene for mitochondrial glycerol 3-phosphate dehydrogenase of Saccharomyces cerevisiae II Yeast. 1993. V. 9(10). P. 1121-30.

377. Rose Л.Н. Production and industrail importance of secondary products of metabolism // In: Secondary products of metabolism. Ed. Rose A.H. Acad.Press. N.Y. London. San-Francisco. 1979. P.1-34.

378. Roufs J.B. Pyruvate: does it amd edurance and burn more fat? // Muscle Fitness. 1996. V. 57. P. 195-197.

379. Rupcic J., Blagovic В., and Marie V. Cell lipids of the Candida lipolytica yeast grown on methanol // J. Chromatography A. 1996. V. 755(1). P. 75-81.

380. Ryazanov A.G. Organization of soluble enzymes in the cell. Relay at the surface. FEBS Lett. 1988. V. 373. P. 1-4.

381. Ryazanov A.G., Ashmarina L.I., and Murinetz V.I. Association of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with mono-and polyribosomes of rabbit reticulocytes // Eur. J. Biochem. 1988. V. 171. P. 301-305.

382. Saeki H. Manufacture of pyruvic acid with Yarrowia. JP patent 09252790. 1997.

383. Sakurai A., Imai H., and Sakakibara M. Effect of oxygen tension on citric acid production by surface culture // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1996. V. 82(5). P. 519-521

384. Schmid-Berger N., Schmid В., Barth G. Yltl. a highly repetitive retrotransposon in the genome of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica//J. Bacteriol. 1994. V. 176(9). P. 24772482.

385. Schrier S.L. Organization of enzymes in human erythrocyte membranes //Am. Physiol. 1966. V. 210. P. 139-143.

386. Schrier S.L. ATP synthesis in human erythrocyte membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1967. V. 135. P. 591-598.

387. Shigene Т., Nakahara T. Production of pyruvic acid from 1.2-propanediol by Pseudomonas sp. strain TB-135 which does not require thiamine // Biotechnol. Lett. 1991. V. 13. P. 821 -826.

388. Sols A. and Salas M.L. Phosphofructokinase // Methods Enzymol. Ed. Wood W.A, New York and London Academic Press. 1966. V. 9. P. 436-442.

389. Spirin A.S., and Ajtkozhin M.A. Informsomes and polyribosome-associated proteins in eucaryotes // Trends Biochem. Sci. 1985. V. 10. P.l62-165.

390. Sprague G.F. Cronan J.E. Isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae mutants defective in glycerol catabolism // J. Bacteriol. 1977. V. 129(3). P. 1335-42.

391. Srere P.A. Citrate cleacage enzyme // Methods Enzymol., Ed. Colowick S.P. and Kaplan N.O., New York and London Academic Press. 1962. V. 5. P. 641-644.

392. Srere P.A. Enzyme concentrations in tissues // Science. 1967. V. 158. P. 936-937. Srere P. A. The citrate enzymes: their structure, mechanisms and biological functions // Curr. Top. Cell. Regul. 1972. V. 5. P. 229-283.

393. Srere P. A. The infrastructure of the mitochondrial matrix // Trends Biochem. Sci. 1980. V. 5. P. 120-121.

394. Srere P.A. Protein crystals as a model for mitochondrial matrix proteins // Trends Biochem. Sci. 1981. V. 6. P. 4-7.

395. Srere P.A. The metabolon//Trends Biochem. Sci. 1985. V. 10. P. 109-110. Srere P. A. Complexes of sequential metabolic enzymes // Annu. Rev. Biochem. 1987. V. 56. P. 89-124.

396. Srere P.A. Macromolecular interactions: tracing the roots // Trends Biochem. Sci. 2000. V. 25. P. 150-153.

397. Srere P.A., and Estabrook. R.W. Microenvironments and metabolic compartmentation. Academic Press. New York. 1978.

398. Srere P.A., and Mosbach K. Metabolic compartmentation : Symbiotic, organella^ multienzymatic, and microenvironmental // Annu. Rev. Microbiol. 1974. V. 28. P. 61-83.

399. Srere P.A., Mattiasson В., Mosbach K. An immobilized three-enzyme system: A model for microenvironmental compartmentation in mitochondria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. V. 70. P. 2534-2538.

400. Srere P., Jones M.E., and Mathews C. Structural and organizational aspects of mctabolic regulation // UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology. New Series. 1990. Vol 134. Alan R. Liss. New York.

401. Srere P.A., Sherry D.A., Malloy C.R., and Sumegi B. Channeling in the Krebs tricarboxylic acid cycle // In: Channeling in Intermediate metabolism. Ed. by L. Agius and H.S.A. Sherratt. Portland Press. Miami. 1997. P. 201-218.

402. Srivastava D.K., and Bernhard S.A. The mechanism of transfer of NADH dehydrogenases//Biochemistry. 1985. V. 24. P. 623-628.

403. Srivastava D.K., and Bernhard S.A. Biophysical chemistry of metabolic reaction sequences in concentrated enzyme solution and in the cell // Annu. Rev. Biophys. Chem. 1987. V. 16. P. 175-204.

404. Stanko R.T., Tietze D.L., Arch J.E. Body composition, energy utilization, and nitrogen metabolism with a 4.25-MJ/d low-energy diet supplemented with pyruvate // Am. J. Clin. Nutr. 1992. V. 56. P. 630-635.

405. Stottmeister U. Behrens U. Gohler W. Effect of oxygen partial pressure on citric acid synthesis in Saccharomycopsis lipolytica using n-alkanes // Z Allg Mikrobiol. 981. V. 21(9). P. 677-87 (German)

406. Stottmaister U., Behrens U., Wcissbrodt E., Weizenbeck E., Duresch R., Kaiser M., Nolte D., Richter H.-P., Schmidt J., Kochmann W., May U., Krebich G. and Schoppe G. Patentschrift DD 239 610 Al (ISSN 0433-6461). 1986.

407. Strick C.A., James L.C., O'Donell M.M., Gollaher M.G., Franke A.E. The isolation and characterization of the pyruvate kinase-encoding gene from the yeast Yarrowia lipolylica II Gene. 1982. V. 118(1). P. 65-72.

408. Sumegi В., and Alkonyi I. A study on the physical interaction between the pyruvate dehydrogenase complex and citrate synthase. Biochim. Biophys. Acta. 1983. V. 749. P. 163-171.

409. Sumegi В., Gilbert H.F., and Srere P.A. Interaction between citrate synthase and thiolase // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 188-190.

410. Tabuchi Т. Relationships between citrate fermentation and cell propagation in

411. Candida lipolytica II Nihon-nogei-kagaku-kaishi (Tokyo). J. Agric. Chem. Soc. Jap. 1973. V. 47. P. 479-484.

412. Tabuchi Т., Tanaka M., Tahara Y., and Abe M. Studies on organic acid fermentation in yeasts. Part V. Production of citric acid from n-paraffins by yeasts. (Nippon Nogei Kagaku Kaishi) //J. Agr. Chem. Soc. (Japan). 1970. V. 44. P. 562-566.

413. Takao S., Tanida M. Pyruvic acid production by Schizophyllum commune II J. Ferment. Technol. 1982. V. 62. P. 277-280.

414. Ting H.Y., Jacobson E.L., Jacobson M.K. Regulation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate leveles in yeast. Arch.Bichem. Biophis. 1977.V. 183.P.98-104.

415. Tom G.D. Viswanath-Reddy M. Howe H.B.Jr. Effect of carbon source on enzymes involved in glycerol metabolism in Neurospora crassa II Arch Microbiol. 1978. V. 117(3). P. 259-63.

416. Tomita F., Yokota A. Manufacture of pyruvic acid with pyruvic acid-producing mutant Escherichia. JP patent 05137568. 1993.

417. Tompa P., Batke J., Ovadi J., Welch G.R., and Srere P. A. Quantitation of the interaction between citrate synthase and malate dehydrogenase // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 60896092.

418. Torres N.V., Voit E.O., and Gonzalez-Alcon C. Optimization of nonlinear biotechnological process with linear programming: application to citric acid production by Aspergillus niger II Biotechn. Bioengin. 1995. V. 49. P. 247-258.

419. Treton B.Y., and Heslot H. Etude de quelques proprietes de l"accnitase de la levure Saccharomycopsis lipolytica // Agric. Biol. Chem. 1978. V. 42. P. 1201-1206.

420. Treton B.Y., Le Dall M.T., and Heslot H. Virus like particles from the yeast Yarrowia lipolytica//Cuit. Genet. 1985. V. 9. P. 279-284.

421. Tsugawa R., Nakase Т., Koyabashi Т., Yamashita K., and Okumura S. Fermentation of n-paraffins by yeast // Agr. Biol. Chem. 1969. V. 33. P. 929-938.

422. Yajime Y., Sakuratani N., Ando M., Inoue H. Production of pyruvic acid. JP patent 61227789.1986.

423. Yanai Т., Tsunekawa H., Okamura K., Okamoto R. Manufacture of pyruvic acid with Debaryomyces. JP Patent 0600091. 1994.

424. Yanase H., Mori N., Masuda M., Kita K., Shimao M., Kato N. Pyruvate production by Enterococcus casseliflavus A-12 from gluconate in an alkaline medium // J. Fermenr Bioeng. 1992. V.73. P.287-291

425. Yarrow D. Four new combinations in yeasts // Ant. Van Lceuwenhoek. 1972. V. 38. P. 357-360.

426. Yokota A., Takao S. Pyruvic acid production by lipoic acid auxotrophs of Enterobacter aerogenes II Agric. Biol. Chem. 1989. V. 53. P. 705-711.

427. Yokota A., Shimiza H., TerasawaY., TakaokaN. Pyruvic acid production by a lipoic acid auxotroph of Escherichia coli W1485 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994a. V. 41. P. 638-643.

428. Yokota A., TerasawaY., Takaoka N., Shimiza PI., Tomita F. Pyruvate production by an Fl-ATPase-defective mutant of Escherichia coli II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994b. V. 58. P. 2164-2167.

429. Yonehara Т., Yomoto K. Pyruvic acid manufacture by Torulopsis. JP patent 62275688.1987a.

430. Yonehara Т., Yomoto K. Microbial production of pyruvic acid and its enhancement by thiamine. JP patent 62275689. 1987b

431. Uchio R., Hirose Y., Node I. Fermentative production of pyruvic acid. JP patent 74132291. 1974a.

432. Uchio R., Maeyashiki I., Okada H. Fermentative production of pyruvic acid. JP patent 74102894. 1974b.

433. Uchio R., Hirose Y. Fermentative production pf purivuc acid. JP patent 7582284. 1975.

434. Uchio R., Kikuchi K., Enei H., Hirose Y. Process for producting pyruvic acid by fermentation. US Patent 3993543. 1976.

435. Van der Walt J.P., and Van Arx J.A. The yeast genus Yarrowia gen nov// Antonie van Leewenhoek. 1980. V. 46. P. 517-521.

436. Van Heerikhuizen H., Ykema A., Klootwijk J., Gaillardin C., and Ballas C. Heterogenety in the ribosomal family of the yeast Yarrowia lipolytica; cloning and analysis of two size classes of repeats // Gene. 1985. V. 39. P. 213-222.

437. Welch G.R. On the free energy "Cost of Transition" in intermediary metabolic processes and the evolution of cellular infrastucture // J. Theor. Biol. 1977a. V. 68. P. 267-291.a general synthesis // Prog. Biophys. Molec. Biol. 1977b. V. 32. P. 103-191.

438. Welch G.R. Organized Multi-enzyme Systems: Catalytic Properties. Academic Press. New York. 1985.

439. Welch G.R. The Fluctuating Enzyme. Wiley. New York. 1986.

440. Welch G.R., and Clegg J.S. The Organisation of Cell Metabolism. Plenum Press. New York. 1986.

441. Wickerman L.J., Kurtzman C.P., and Herman A.I. Sexual reproduction in Candida lipolytica//Science. 1970. V. 167. P. 1141.

442. Wilson J.E. Brain hexokinase // J. Biol. Chem. 1968. V. 243. P. 3640-3647. Wilson J.E. Ambiguitous enzymes: Variations in intracellular as a regulatory mechanism // Trends Biochem. Sci. 1978. V. 3. P. 124-125.

443. Wolf K. Non-Convential yeast in biotechnology. A Handbook. Springer. Berlin. Heidelberg. Nw York. 1996.

444. Wysocki R. Chery C.C., Wawrzycka P. Van Hulle M., Cornelis R„ Thevelein J.M., Tamas M.J. The glycerol channel Fpslp mediates the uptake of arsenite and antimonite in Saccharomyces cerevisiae II Mol.Microbiol. 2001. V. 40(6). P. 1391-401.

Информация о работе

Моргунов, Игорь Григорьевич
доктора биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Метаболическая организация окислительных путей у дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцентов органических кислот - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы