Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Фармакотоксикологическая оценка экстремофильных дрожжей Yarrowia lipolytica и их использование в качестве средства доставки факторов роста

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Фармакотоксикологическая оценка экстремофильных дрожжей Yarrowia lipolytica и их использование в качестве средства доставки факторов роста"



На правах рукописи

Зылькова Марина Валерьевна

Фармакотоксикологическая оценка экстремофильных дрожжей Уаггоюш Иро1уИса и их использование в качестве средства доставки факторов роста

06.02.03 — ветеринарная фармакология с токсикологией 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 Й мдй ¿013

Казань-2013

005058121

005058121

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» Российской академии медицинских наук и в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности».

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая учреждение:

доктор биологических наук Шевелев Алексей Борисович доктор биологических наук, Тремасов Михаил Яковлевич

профессор

Фяизов Тагнр Хадиевич доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией биохимии и моле-кулярно-генетического анализа Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности» Усенко Виктор Иванович доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой фармакологии и токсикологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН

А л'

Защита состоится 2013 года в _ ч _мин на заседании

диссертационного совета Д 220.012.01 при Федеральном центре токсикологической, радиационной и биологической безопасности (420075, г. Казань, ул. Научный городок - 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Автореферат разослан » 2013 г. и размещен на

официальном сайте «ФЦТРБ-ВНИВИ» vmw.vnivi.ru и на официальном сайте ВАК РФ www.vak.ed.gov.ru

Учёный секретарь уп .

диссертационного совета ^тепанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важной задачей ветеринарной фармакологии и токсикологии является разработка и изучение действия лекарственных веществ на организм животных, стимуляция продуктивности и воспроизводственной способности, профилактика и лечение животных (Иванов A.B. и др., 2006; Антипов В.А. и др., 2007; 2009; Дорожкин В.И., Смирнов A.M. 2008). Народнохозяйственное значение приобретает разработка теоретических основ и практических приемов безопасных и экономически оправданных методов стимуляции роста сельскохозяйственных и промысловых животных (Тремасов М.Я., Иванов A.B. и др., 2006; Тремасов М.Я., Папуниди К.Х. и др., 2012). В качестве средств стимуляторов роста в недавнем прошлом в нашей стране и за рубежом использовался паприн и его различные добавки в составе комбикормов, в виде автолизата в составе регенирированного молока и т.д. (Яцко H.A. и др., 1993; Кузнечик В.И., 1994).

Перспективным объектом, позволяющим добиться прогресса в решении этой задачи являются дрожжи Yarrowia lipolytica, что обусловлено сочетанием в этом организме нескольких уникальных биохимических особенностей (Barth G., Gaillardin С., 1997). За счет наличия пероксисом она способна расти на органических субстратах самого различного биогенного и абиогенного происхождения, включая парафины нефти, коммунальные и промышленные стоки. Обладая мощным аэробным метаболизмом, Y. lipolytica устойчива ко многим агрессивным органическим соединениям, эффективно разрушает ксенобиотики и токсины. В отличие от других видов дрожжей, У. lipolytica обладает высокой алкало - и гапотолерантностью, с высокой эффективностью секретирует белки во внешнюю среду. В течение 10 лет Y. lipolytica использовалась в СССР в качестве биореактора для производства кормового белка для животноводства в качестве субстрата парафинов нефти (паприн или белково-витаминный концентрат, БВК) в результате чего накоплены данные, подтверждающие безопасность и высокую кормовую ценность ее биомассы (Выслоух В.А. и др., 1987; Ибрагимов Ф.Б., Сычев А.Е. и др., 1995). В 2000 г надзорный орган США - Food and Drug Administration включил Y. lipolytica в список заведомо безопасных видов (GRAS), без ограничений пригодных для производства кормовых и пищевых ингредиентов. По данным (Guerzoni М.Е. et al., 2001; Suzzi G. et al., 2001), живые клетки Y. lipolytica присутствуют в традиционных продуктах из регионов Италии. Для Y. lipolytica разработаны удобные генетические маркеры и методы трансформации, полностью определена последовательность генома типового штамма этого организма. В совокупности, все это позволяет применять для исследования Y. lipolytica современные методы транскриптомного и протеомного анализа, конструировать на ее основе рекомбинантные штаммы.

Одним из наиболее перспективных биоактивных пептидов для пероральной доставки является соматолиберин (GHRH), который оказывает положительное влияние на продуктивность сельскохозяйственных животных, в частности, способствует повышению скорости роста и при этом обладает

высокой устойчивостью к протеолизу. До начала работы были получены данные о возможности достижения анаболического эффекта в отношении мышей и поросят соматолиберина свиньи, перорально доставляемого с помощью живых пробиотических штаммов мезофильных бацилл.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилась разработка нового метода получения безопасной кормовой добавки на основе рекомбинантного штамма У. Про1уИса, служащей источником полноценного белка для кормления животных и обеспечивающей ускоренный рост животных за счет анаболического эффекта соматолиберина.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить метаболический потенциал У. \ipolytica для создания эффективной в питательном отношении, дешевой в производстве кормовой добавки, оценив ее способность к детоксикации ингредиентов комбикормов.

2. Изучить фармакологические и токсикологические свойства разработанной кормовой добавки на основе биомассы У. Ыро\уйса.

3. Разработать новую интегративную генетическую систему на основе впервые предложенного промотора стресс-индуцибельного белка УОАС, позволяющую экспрессировать в клетках У. Нро1уНса гетерологичные гены в условиях промышленного производства кормовой добавки.

4. Получить опытный образец кормовой добавки на основе рекомбинантного штамма У. Иро1уйса, несущего ген соматолиберина, и провести его испытания на животной модели.

Научная новизна работы. Впервые показана кормовая эффективность и отсутствие острой и субхронической токсичности, а также раздражающих и аллергизирующих свойств кормовой добавки на основе биомассы У. Нро1уНса, выращенной в условиях активации аэробного метаболизма: метаболический потенциал У \ipolytica обеспечивает детоксикацию низкосортного сырья и повышение его биохимической полноценности. Разработана оригинальная система рекомбинантной экспрессии на основе промотора потенциал-зависимого митохондриального порина УОАС. Впервые получен продуцент соматолиберина свиньи на основе рекомбинантного штамма У. \ipolytica. На модели мышей впервые экспериментально показана возможность достижения анаболического эффекта при пероральном введении вегетативных цельных клеток У. \ipolytica, содержащих зрелую форму ОН1Ш. Доказано, что эти клетки могут рассматриваться в качестве эффективного микроконтейнера для пероральной доставки широкого круга белков и пептидов животным, обеспечивающих их сохранность в условиях высокой протеолитической активности дуоденального и кишечного химуса.

Практическая ценность работы. На примере У. Пробка продемонстрирован универсальный принцип адаптации к стрессам, позволяющей ей эффективно распознавать и метаболизировать ксенобиотики и другие нежелательные компоненты кормовых ингредиентов.

Вновь обнаруженная особенность У. Нро1уИса использована для решения практической задачи: конструирования новой системы доставки биологически

активных пептидов животным. В результате проведенных исследований создана экономически эффективная и безопасная для человека альтернативная к синтетическим стероидным гормонам система на основе живых продуцентов белковых ростовых факторов на базе безопасных микроорганизмов У. lipolytica. Дешевое производство биомассы этого вида дрожжей позволяет обеспечить доступность препарата для массового использования.

Результаты работы могут быть положены в основу новой технологии производства и применения кормовых добавок, обладающих анаболическим эффектом. Кроме того, разработанная технология может быть использована при создании продуцентов других биологически активных соединений на основе У. lipolytica, в частности, антигенов вакцинного назначения для пероральной иммунизации сельскохозяйственных животных и для пероральной доставки в организм различных лекарственных средств.

Апробация материалов диссертации. Основные материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на следующих научных конференциях: Всероссийской конференции молодых ученых и II школы им. академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты», 2006; II съезде микологов России с международным участием «Современная микология в России»; Bari Intern. Symposium on «Mitochondrial, physiology and pathology» IUDMB Sympos. SI Satellite events of the 33th FEBS Congress and 11th IUBMB Athens; научной конференции «Фундаментальные исследования» Пунта Кана 13-22 апреля 2012 гг.

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Результаты способности кормовой добавки на основе биомассы У. lipolytica к детоксикации апитательных ингредиентов комбикормов.

- Фармакотоксикологическая оценка кормовой добавки на основе биомассы У.lipolytica.

- Эффективность новой интегративной генетической системы на основе впервые предложенного промотора стресс-индуцибельного белка VDAC, позволяющего экспрессировать в клетках У. lipolytica гетерологичные гены в условиях промышленного производства кормовой добавки.

Эффективность Y.lipolytica в качестве микроконтейнера для пероральной доставки соматолиберина животным.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 125 страницах компьютерного текста и включают следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 26 рисунками. Список использованной литературы содержит 170 библиографических источников, из них 125 иностранных.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в 2006-2012 гг. в лаборатории биотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова» Российской академии медицинских наук (г. Москва) и отделе токсикологии федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань).

Работа выполнена в рамках НИР по Государственному контракту 14.740.11.1033 от 23.05.2011 г и соглашению №8492 от 07.09.2012 г и госзадания - «Токсикологическая безопасность» (№ госрегистрации 01200202603).

Эксперименты проведены на 196 лабораторных животных. Содержание экспериментальных животных соответствовало действующим Санитарным нормам вивариев, кормление осуществляли согласно общепринятым зоотехническим нормам.

В работе использован штамм Y. lipolyíica POlf (MatA, leu2-270, ura3-302, xpr2-322, axp-2), полученный из коллекции типовых штаммов CIRM-Levures (Франция), где он депонирован под номером CLIB-724. Фенотипическими проявлениями имеющихся в штамме мутаций (отличающих его от дикого типа) является неспособность расти на средах, не содержащих лейцин и урацил, а также способность утилизировать сахарозу. Поддержание штаммов, отбор трансформантов и физиологические эксперименты выполняли на синтетической среде YNB. Получение посевного материала для проведения ферментаций штаммов проводили на полноценной среде YP.

При изготовлении опытных образцов кормовой добавки на основе Y. lipolyíica использовалось промышленное сырье: рыбная мука по 2116-2000 с содержанием общего сырого протеина 57% (ООО «Белком»), мясо-костная мука по ГОСТ 17536-82 с содержанием общего сырого протеина 43% (ООО «Белком») и подсырная молочная сыворотка с содержанием общего сырого протеина 13% (TERE, Эстония). Ингредиенты промышленного назначения суспендировали в воде в концентрации 50-100 г/л, при необходимости добавляли глицерин до 10-20 г/л и минеральные соли, стерилизовали автоклавированием при 0,5 атм в течение 40 мин. рН сред доводили с помощью стерильного раствора 1М NaOH после автоклавирования. Ферментацию вели в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 50 мл среды в течение 48 часов при интенсивной аэрации. Выросшую биомассу собирали центрифугированием при 10000 G в течение 20 мин, осадок суспендировали в минимальном объеме воды, аликвоты суспензии объемом 5 мл распределяли по пенициллиновым флаконам, замораживали с помощью жидкого азота и высушивали на лиофильной сушке. Для определения содержания жизнеспособных клеток 100 мг полученного сухого порошка в стерильных условиях суспендировали в 1 мл воды, делали серию разведений с шагом 10 раз на 5-7 порядков и 100 мкл суспензии высевали на чашки со средой с полноценной YP, рН 5,0.

При проведении физиологических экспериментов засев проводили с использованием свежей посевной культуры (возрастом не более 20 часов), выращенной на среде с тем же рН, что и в основном эксперименте.

Для введения в геном модельного щтамма Y. lipolytica Polf целевых конструкций с репортёрным геном lacZ и геном соматолиберина свиньи SLN (релизинг-фактор гормона роста) были использованы конструкции на базе стандартного вектора pQE30 (Invitrogen), включающие маркер прототрофности по урацилу. Для введения конструкций в хромосому Y. lipolytica, 10 мкг очищенной ДНК плазмидной ДНК конструкции, очищенной из клеток Е. coli, обрабатывали рестриктазой Apal в объеме 100 мкл, сайт которой расположен в пределах кодирующей области фрагмента маркера прототрофности LEU2. После контроля полноты расщепления с помощью электрофореза в агарозном геле, ДНК осаждали изопропанолом и растворяли в минимальном объеме воды, доводя концентрацию до 2-3 мкг/мкл. Препараты добавляли к аликвоте компетентных клеток Y. lipolytica Polf, приготовленных по методике, предложенной в работе (Davidow et al., 1985). Обработанную суспензию клеток высевали на агаризованную синтетическую среду YNB, содержащую лейцин (60 мкг/мл) и глюкозу (2%). Рекомбинантные клоны на основе штамма POlf с введенными репортёрными конструкциями отбирали с помощью трехкратного пассирования на минимальной среде, не содержащей урацила, после чего переносили на полноценную питательную среду.

Определение активности р-гапактозидазы в растворимой клеточной фракции проводили с использованием хромогенного субстрата X-gal (3-бром, 4-хлор, 5-индолил-рО-галактопиранозид).

Для проведения ферментативной реакции на р-галактозидазу в ячейках 96-луночного плоскодонного иммунологического планшета Costar собирали реакционную смесь общим объемом 100 мкл в составе: растворимая фракция клеточного белка культуры Y. lipolytica - 50 мкг общего белка, буфер 25 мМ Трис-НС1, 0,2 М глицин рН 8,3, субстрат 5 мМ (вносится в виде стокового раствора в диметилформамиде с концентрацией 500 мМ объемом 1 мкл на реакционную смесь). Реакцию проводили в течение 1-16 ч при 37°С. Сигнал измеряли на планшетном сканере-спектрофотометре при Х=620 нм, учитывая результат при попадании измеряемого значения А62о в диапазон от 0,1 до 1,0 ед. ОП. Единицу активности р-галактозидазы определяли как количество фермента, вызывающего увеличение поглощения при 620 нм на 1 ОЕ в после инкубации с субстратом в течение 1 ч при 37°С.

Определение содержания соматолиберина свиньи в лизатах рекомбинантных штаммов проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа в варианте Сэндвич.

Изучение кожно-резорбтивного и местно-раздражающего действия кормовой добавки на слизистую оболочку глаза проводили согласно «Методическим указаниям к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций

избирательно действующих веществ в воздухе рабочей зоны» (1980).

Аллергизирующие свойства определяли в соответствии с МУ 1.1.578-96 (97) «Требования к постановке экспериментальных исследований по обоснованию предельно допустимых концентраций промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы», утвержденных Минздравом России (1997).

Фармакотоксикологические исследования проведены совместно со старшим научным сотрудником отдела токсикологии федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» Тарасовой Евгенией Юрьевной, за что выражаем ей благодарность.

По окончании эксперимента проводили взвешивание каждого животного, после чего проверяли гипотезу о наличии статистически значимых различий в массе каждой группы с помощью t-критерия Стьюдента.

Библиографическое описание использованных литературных источников осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 7.1.84.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Изучение острой и субхронической токсичности кормовых добавок на основе рыбной муки и Y. lipolytica

В качестве модельной системы использовали схему ферментации коммерческой рыбной муки лабораторным штаммом Y. lipolytica POlf. При этом мы исходили из оценки рыбной муки, как биологически ценного безопасного кормового ингредиента, способного, однако, вызывать задержку роста животных при избыточном внесении в корм за счет высокого содержания жира. Таким образом, мы ставили цель сопоставить биологическую безопасность биомассы Y. lipolytica, полученную путём ферментации как коммерческой рыбной муки, так и полноценной пептонно-глюкозной среды, с безопасностью самой рыбной муки.

Острую токсичность ферментированной Y. lipolytica POlf рыбной муки (в виде лиофильно высушенной биомассы с содержанием живых клеток 9,8х108 к.о.е./г) изучали в опытах на белых мышах массой 18-20 г и белых беспородных крысах массой 190-220 г обоего пола, разделенных по принципу аналогов на опытные и контрольную группы (по 6 в каждой). В качестве препаратов сравнения использовались нативная коммерческая рыбная мука с содержанием общего сырого протеина 65% (ООО «Белком») и лиофилизированная биомасса Y. lipolytica POlf с содержанием живых клеток 6,7х109 к.о.е./г.

Животным опытных групп однократно внутрижелудочно вводили испытуемые препараты в дозировке 1000; 5000; 10 000 мг/кг - для мышей и 1000; 5000; 15 000; 20 000 мг/кг - для крыс, суспендированные в 0,5 и 5 мл физиологического раствора соответственно. Животным контрольных групп в аналогичном объеме вводили физиологический раствор.

Проведенные опыты показали, что однократное внутрижелудочное введение препаратов в испытываемых дозах не вызывало гибели животных и существенных отклонений от нормального физиологического состояния. Поскольку дозы 10 ООО и 20 ООО мг/кг соответственно для мышей и крыс являются наиболее физиологичными при внутрижелудочном введении, то большие дозы препаратов не вводили. Вследствие этого ЛД50 установить не удалось.

Субхроническую токсичность тех же препаратов оценивали на 40 белых мышах обоего пола с начальной массой 18-20 г и 40 белых беспородных крысах массой 190-220 г, разделенных по принципу аналогов на 4 группы по 10 голов в каждой. Подопытным животным препараты ферментированной и нативной рыбной муки, препарат У. Иро1уйса РОИ" и физиологический раствор вводили внутрижелудочно в объёме не более 0,5 и 5 мл (максимально допустимые для внутрижелудочного введения дозы в сутки соответственно для мышей и крыс). Животным вводили испытываемые препараты внутрижелудочно в течение 28 суток. В связи с невозможностью определения ЛД50, первоначально вводимые дозы для мышей и крыс в первые 4 сут. составили 1000 и 2000 мг/кг соответственно, то есть 1/10 от максимально вводимых. В каждые последующие 4 сут дозу увеличивали в 1,5 раза.

Ежедневное внутрижелудочное введение исследуемых препаратов не вызвало гибели животных опытных групп и существенных отклонений от нормального состояния. Животные всех групп сохраняли удовлетворительный аппетит, имели гладкий и чистый шерстный покров.

В течение эксперимента у животных всех групп наблюдалось постепенное увеличение массы тела. Так, при многократном введении испытуемых препаратов в возрастающих дозах у мышей и крыс 1 и 2 групп (У. Нро1уИса, выращенная на глюкозо-пептонной среде и рыбной муке, соответственно) на 10 сут отмечалось увеличение живой массы в среднем на 14,1; 15,8 (Р<0,01) и 13,8; 14,5% (Р<0,01) соответственно. На 28 сут опыта прирост массы тела у животных этих групп составил соответственно 25,1; 28,3 (Р<0,001) и 24,7; 25,2% (Р<0,001) соответственно. У животных 3 группы (получали нативную рыбную муку) и 4 группы (биологический контроль) соответственно отмечался более низкий прирост массы тела, который составил на 10 сут - 9,1; 9,5 и 9,8; 10,5%, а на 28 сут - 18,6; 19,1 и 21,2; 22,4% соответственно для мышей и крыс.

Гематологические и биохимические показатели крови мышей при многократном введении испытуемых препаратов находились в пределах физиологической нормы.

Однократное (20 г/кг) и многократное (166 г/кг) внутрижелудочное введение испытуемых препаратов не вызывало гибели лабораторных животных. Данное обстоятельство не позволило определить ЛД50 и рассчитать коэффициент кумуляции по показателю «смертельный эффект». Однако, можно предположить, что коэффициент кумуляции (отношение максимально вводимой дозы при многократном введении на максимально вводимую дозу

при однократном введении) составляет 8,3 и по классификации (Потапов и др., 1997) все исследованные препараты можно отнести к веществам, не обладающим кумулятивным действием.

3.2 Изучение раздражающего и аллергизирующего действия кормовой добавки на основе рыбной муки и К Пропса

Местно-раздражающее действие ферментированной У Про1уйса РОК рыбной муки и лиофилизированной биомассы У. Иро1уИса РОК с содержанием живых клеток 6,7x10® к.о.е./г. на кожу изучали на 8 кроликах породы «Шиншилла» и 8 морских свинках. За день до проведения эксперимента у животных на симметричных участках спины по обе стороны от позвоночника тщательно выстригали шерсть размером 6x6 см у кроликов и 2x2 см у морских свинок. На кожу правого бока животных шпателем наносили ферментированную У. Про1уЧса РОК рыбную муку и лиофилизированную биомассу У. Иро1уйса РОК, суспендированную в физиологическом растворе, участок кожи левого бока служил контролем (наносили физиологический раствор). Реакцию кожи регистрировали и оценивали в сравнении с симметричным участком кожи того же животного через 1 и 16 часов.

В течение всего периода наблюдения, каких-либо функциональных нарушений кожи (эритема, отек, изъязвления, изменение местной температуры) на месте нанесения препарата не отмечалось.

В следующей серии опытов в конъюнктивальный мешок правого глаза 12 кроликов, разделенных на 2 опытные и контрольную группы, глазной пипеткой закапывали по 2 капли препаратов, суспендированных в физиологическом растворе. Левый глаз служил контролем (в том же объеме закапывали физиологический раствор). После внесения препаратов и физиологического раствора на 1 мин прижимали слезно-носовой канал у внутреннего угла глаза. Наблюдение за состоянием слизистой оболочки и прозрачности роговицы проводили в течение недели.

После нанесения на слизистую оболочку глаза ферментированной У. Иро1уйса РОК рыбной муки (первая опытная группа) и лиофилизированной биомассы У. Иро1уИса РОК (вторая опытная группа), суспендированных в физиологическом растворе и физиологического раствора (контрольная группа) у животных наблюдалось незначительное слезотечение, исчезающее через несколько минут. В дальнейшем каких-либо признаков раздражения слизистой оболочки глаз, выражающихся в инъецировании сосудов конъюнктивы и гиперемии, не отмечалось, что свидетельствует об отсутствии у препаратов раздражающих свойств.

Аллергизирующие свойства ферментированной У. Иро1уйса РОК рыбной муки и лиофилизированной биомассы У. Иро1уЫса РОК изучали на 15 морских свинках путем постановки провокационной кожной пробы и лабораторного иммунологического теста - реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) после многократных эпикутанных аппликаций.

На выстриженный участок кожи боковой поверхности туловища морских свинок-альбиносов на протяжении 2 недель по 5 раз в неделю равномерным слоем на весь участок аппликации наносили смесь испытываемых препаратов с физиологическим раствором из расчета 30 мг препарата на см2 выстриженного участка площадью 2x2 см. Выявление сенсибилизации проводили через сутки после последней аппликации.

В ходе выявления возможности развития сенсибилизации при постановке провокационной кожной пробы видимых изменений на месте нанесения испытываемых препаратов не отмечалось

Для выявления аллергенных свойств препаратов проводили внутрикожную сенсибилизацию морских свинок массой 250-300 г, разделенных на опытные и контрольную группы по 5 животных в каждой. Подопытным морским свинкам однократно внутрикожно вводили препараты, суспендированные в физиологическом растворе, в дозе 0,1 мл. Контрольным животным вводили в том же объеме стерильный физиологический раствор.

Выявление сенсибилизации проводили через 8 дней, используя специфический агшерготест с клетками крови животных - реакцию специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).

Реакцию расценивали как положительную при лизисе лейкоцитов более

10 %.

На протяжении всего опыта видимых кожных изменений на месте введения препарата не отмечалось.

Показатели РСЛЛ у животных первой опытной группы составили 9,2±0,4%, второй опытной группы - 8,4±0,2% соответственно. В то время как у контрольных животных РСЛЛ составила 4,8±0,3%, что свидетельствует об отсутствии у тестируемых препаратов аллергенных свойств.

3.3 Исследование активности промотора гена УБАС методом транскрипционных репортёров с использованием гена 1асЪ

В ходе предшествующих работ использование метода двумерного электрофореза позволило идентифицировать потенциал-зависимый митохондриальный порин УОАС среди наиболее массовых белков У. Иро1уИса, концентрация которых в клетке увеличивается при культивировании штамма на среде с рН 8,5 по сравнению со средой с рН 5,0. Повышение уровня продукции этого белка на уровне транскрипционного контроля было подтверждено методом ПЦР в реальном времени. Более того, было установлено, что резкая активация продукции белка УОАС является универсальным ответом культуры У. \ipolytica на стрессовые воздействия самой различной природы. По-видимому, накопление белка УОАС во внешней мембране митохондрий является ключевым событием, повышающим активность их аэробного метаболизма. С учётом сказанного было предложено использовать промотор гена УОАС для создания систем экспрессии генов в клетках У. Нро!уИса в условиях культивирования на средах, требующих предварительной инактивации токсических компонентов.

Использование промотора VDAC для гетерологичной экспрессии целесообразно было начать с разработки репортёрной конструкции на основе гена, активность продукта которого в биомассе легко может быть количественно. Для этой цели в нашей работе традиционно был выбран ген ß-галактозидазы Е. coli (lacZ). В качестве объекта сравнения был использован синтетический промотор HP4d (производный от промотора щелочной протеазы XPR2), рассматривающийся в настоящее время как наиболее эффективный для гетерологичной экспрессии в Y. lipolytica.

Промотор гена VDAC был клонирован в виде фрагмента длиной 1055 п.н. с использованием праймеров pVDAC-forl (EcoRI)

(GGGAATTCCACATGCATATAGGATACAT) и pVDAC-revl (BamHI) (GGGGATCCCTGGGTTAGTACGTGTTGCG). Продукт ПЦР обрабатывали рестриктазами EcoRI и BamHI и вводили в состав конструкции pQE3-URA3-HP4d, обработанной теми же рестриктазами. При этом из нее удалялся фрагмент, содержащий промотор HP4d, а взамен вводился промотор гена VDAC. Полученная конструкция получила название pQE-URA3-pVDAC-total.

Клонирование терминатора было проведено с помощью ПЦР со специфическими праймерами следующего состава: Txpr-F (Avril)

CATAAAATGCGAGACCTAGGTAGGCAATTAACAG Txpr-R (Xbal) ATATCTAGAGATCTGAGCGTGAATTATAC

Продукт ПЦР расщепляли по сайтам AvrII-Xbal и клонировали в вектор pQE-URA3-HP4d, расщепленный рестриктазой Xbal. Полученная конструкция была обозначена pQE-URA3-pVDAC-Txpr-totaI.

Ген ß-галактозидазы (LacZ) в составе продукта ПЦР длиной 3080 п.н. клонировали из генома К coli С600 и вводили в состав вектора pQE3-URA3-pVDAC-Txpr по сайтам BamHI-SacII. Для проведения ПЦР на матрице геномной ДНК Е. coli С600 использовали праймеры Lac-forl (GGGATÇÇACCATGATTACGGATTCACTGG) и

Lac-revl (GGCCGCGGTTATTTTTGACACCAGACCAAC).

Конструкция получила название pQE-URA3-pVDAC-LacZ-Txpr-total (рис. 1).

Ned (6)

£ccRI(42i)

dQE- U RA3 - pVDAC - La cZ-Te r total

Smal(6383)

АиЛ (6381)

Xmal(638i)_

Лиа1(6309)

Аи<Д(57б7)' / Aval (¿734) . Psí(568ij

£CCRI(HI24) Aual(i090i) \ ApaLI(l0580) ApaLl (10465) \ LacZ \\

Лиа1(9458)

ChЯ (8 94}) BamHI(8i03) \ VDAC

Audi (7245) EcoRK.7042}

С/с1(7034) \

\ '

JVcdCögol)

Лиа1(8б5) Wed (998) Leu fragment Psi (2055) ffi'fidffl(2059) Reverse Sequencing

JVcd(2732)

rrnB T1 terminator

ytpaLI(3264) OR I

ЛраЫ(з7б2)

ApaLI(5008) Promoter region Forward primer

Рис. 1. Карта-схема конструкции pVDAC-LacZ-Txpr-total, предназначенной для исследования активности промотора гена VDAC в клетках Y. lipolytica с помощью репортёрного гена lacZ Е. coli. Конструкция рассчитана на интеграцию в геномный локус Y. lipolytica LEU2.

Конструкция pHP4d-LacZ-Txpr-total, аналогичная по структуре pVDAC-LacZ-Txpr-total, но содержащая синтетический промотор HP4d вместо VDAC была получена по аналогичной схеме на базе вектора pQE3-URA3-HP4d. Обе конструкции вводили в штамм Polf, проверяли генотип на наличие гена lac'L с помощью ПЦР с праймерами Lac-fori и pUC-for (размер продукта 380 п.н.). Далее по три независимых трансформанта с каждой конструкцией культивировали на средах различного состава, получали растворимую клеточную фракцию и измеряли в ней активность ß-галактозидазы. Результаты измерений представлены в таблице.

Таблица - Активность Р-галактозидазы в растворимой фракции клеточных лизатов рекомбинантных штаммов У. \ipolytica Ро1£ несущих в хромосоме конструкции рНР4с1-Ьасг-Тхрг-Ю1а! (обозначение рНР4(1) и рУЭАС-Ьасг-

Состав среды 24 часа 48 часов 72 часа

НР4с1 УПАС НР4(1 УОАС нР4а УБАС

1. Минеральные соли, 2% глицерин, рН 5,0 0,13 0,07 0,25 0,06 0,21 0,12

2. Минеральные соли, 2% глицерин, рН 8,5 0,32 0,34 0,36 0,43 0,29 0,48

3. Минеральные соли, 2% пептон, 2% глицерин, рН 5,0 0,43 0,04 0,56 0,07 0,39 0,15

4. Минеральные соли, 2% пептон, 2% глицерин, рН 8,5 2,23 1,78 1,96 2,11 1,71 2,34

5. Минеральные соли, 2% глюкоза, рН 5,0 0,19 0,03 0,21 0,05 0,19 0,06

6. Минеральные соли, 2% глюкоза, рН 8,5 0,77 0,92 0,72 1,23 0,65 1,45

7. Минеральные соли, 2% пептон, 2% глюкоза, рН 5,0 0,29 0,05 0,23 0,07 0,21 0,08

8. Минеральные соли, 2% пептон, 2% глюкоза, рН 8,5 2,69 1,24 2,23 1,87 1,94 2,57

9. 10% рыбной муки, рН 5,0 0,33 0,51 0,39 0,67 0,29 0,71

10. 5% рыбной муки, 1% (N114)2804, 2% глицерин, рН 5,0 0,12 0,14 0,24 0,13 0,18 0,23

11.5% костной муки, 1% (ЫН4)2504,2% глицерин, рН 5,0 0,16 0,11 0,19 0,17 0,15 0,15

12. 10% сухой творожной сыворотки, рН 5,0 0,23 0,12 0,27 0,13 0,24 0,13

13. 10% сухой творожной сыворотки, рН 8,5 0,46 1,29 0,56 1,79 0,54 2,02

14. 5% сухой творожной сыворотки, рН 5,0 0,19 0,1 0,24 0,09 0,2 0,11

15. 5% сухой творожной сыворотки, рН 8,5 0,32 1,61 0,41 2,15 1,42 2,79

Полученные данные свидетельствуют о том, что оба выбранных промотора недостаточно активны на средах с кислым рН (5,0), активируясь только при культивировании штаммов при рН 8,5. При этом активность промотора НР4с1 превышает УЭАС на оптимальной для микроорганизма среде с пептоном и глюкозой (среда 8), особенно, в начале ферментации (24 часа). В то же время, при использовании сред со щелочными значениями рН, содержащих высокие концентрации неочищенных компонентов - рыбной

муки и творожной сыворотки (среды 13 и 15), промотор VDAC в три и более раз превосходит по активности HP4d. Превосходство VDAC особенно существенно при длительных временах культивирования - 48 и 72 часа, которые необходимы для достижения высокой плотности культуры и полной детоксикации содержащихся в среде сырьевых ингредиентов клетками Y. lipolytica. Таким образом, вновь предложенный нами промотор VDAC не только превзошел по силе современный синтетический промотор HP4d, но показал свою высокую совместимость с задачами использования культуры Y. lipolytica для биотрансформации и детоксикации неочищенных сырьевых компонентов среды. На следующем этапе работы промотор VDAC был использован для решения практически важной задачи создания продуцента соматолиберина свиньи на базе Y. lipolytica.

3.4 Создание рекомбинантных продуцентов GHRH свиньи

При создании конструкций для экспрессии гена в качестве векторов использовались описанные в предыдущей главе плазмиды pHP4d-LacZ-Txpr-total и pVDAC-LacZ-Txpr-total.

ПЦР-клонирование кодирующей области зрелой формы соматолиберина свиньи SLN было проведено посредством амплификации с использованием праймеров к гену релизинг-фактора гормона роста (рис. 2). Поскольку последовательности генов соматолиберина человека и свиньи кодируют идентичные белковые продукты, это позволило использовать экспрессию гена человеческого происхождения для синтеза SLN свиньи (Bohlen et al., 1983; Эповаидр., 2011).

Праймер SLN 1-Hl GGGGTACCTATGCAGATGCCATCTTCAC

Праймер SLN2-H2 GGGGATCCTATCCCTGCTGCCTGCTCATGA

Рис. 2. Последовательности праймеров для амплификации гена соматолиберина свиньи SLN, кодирующего полноразмерный зрелый гормон, с указанием полученного ПЦР-продукта. Кодирующая область зрелой формы соматолиберина свиньи выделена серым цветом.

С этой целью на матрице геномной ДНК человека был проведен ПЦР с праймерами SLN-H1 и SLN-H2, в результате чего образовался продукт размером 114п.н. После элюции из агарозного геля продукт ПЦР был обработан рестриктазами Kpnl и ВатШ и клонирован в конструкцию pQE-URA3-HP4d-Txpr-Leu2, предварительно расщепленную по одноименным сайтам. В итоге была получена конструкция pQE-URA3-HP4d-SLN-Txpr-Leu2, содержащая ген пептида SLN свиньи (рис. За).

fragment

Рис. 3. Схемы генетических конструкций на базе вектора р<ЗЕ30, использованных для введения гена релизинг-фактора гормона роста свиньи БЬЫ в штамм У. Нро1уйса РОН под контролем синтетических промоторов НР4с1 (конструкция (а) рС>Е-иКАЗ-НР4с1-8ЬЫ-Тхрг-Ьеи2) и УЭАС (конструкция (б) рдЕ-ШАЗ-УОАС-8ЬЫ-Тхрг-Ьеи2).

Для получения конструкции р(ЗЕ-иКАЗ-УРАС-8ЬН-Тхрг-Ьеи2 (рис. 3) было проведено клонирование промотора гена УИАС в виде фрагмента длиной 1071 п.н. с использованием праймеров рУВАС-£эг1 и рУБАС-геу1 на матрице геномной ДНК У. Иро1уПса (рис. 4). Продукт ПЦР обрабатывали рестриктазами С/а/ и 8рк1 и вводили в состав конструкции рС>Е-1Л1АЗ-НР4с1-8Ь№Тхрг-Ьеи2, обработанной теми же рестриктазами. При этом из нее удалялся фрагмент, содержащий промотор НР4<1, а взамен вводился промотор гена УРАС.

Праймер рУРАС-Й>г! СОАТСОАТСАСАТССАТАТАССАТАСАТ Праймер рУРАС-геу! СОаСАТОССТОССТТАОТАСОТОТТОСО

Clal

1 GGATCGATCA CATGCATATA GGATACATTT TGTTGGGGAG AACCGAACAG AGGGGAGAGG AGGTTGCACT GAGCAATCAG ACCATGTGAC CGTTTTTTGA

101 AGGAGATGTG CTGAGAGCGG GGGGCCAGAG ATCATGTGAG GATTTGTTGA GAATCCTATG GGGCCTGCTA GGGCACCATC CAGGCTCCCG CCGCCCTCCC

2 01 TTCGGCCCGA GAAACAAGCT GTAAACCGCT CAGATCAAGC CGCACATATT

TTTGCCCTCC CTACCGCCTC CCACCCGGAC CTTCCTCTGG GCTGTCTTGT

3 01 ATGTTTATGT GGACGTATGG TGTGCGGCAG CTCAATTTTG ATTGGTCGGA

ACCTTAATAA CTTTAGTTGA TCAAGGTGCG TCTACCGTCT TTGTTGCAGT

4 01 CCCCGCCTAC GCCGCAGATT AAAGGAACTA ACTCACCGCA GTGGCTAACG

TAGCTTTTCG CTCCCCGTAA CTTGTCTTCT TTCTCAGCAC АААСАСАСАТ 501 ACACAAACAG TGAGTATAGT CACCGTGGCG ACACAGGCAC AGCGCCATTG AGGCGCCGAA CGCCCTCTCC TCCATTGAAC ACACGCACAT CCACAGTGGC 601 ACTCTCGACT CAATTGCACG TGGCTTGATT CACCTCAACG CAAATTGACA CGCAACCGAG AGGTACCGAG TAACAACCGA GGTGGTGGTT TTGCGATCAA 701 TCGGGCTGCA AACACAGGTG GCGACATTGT CAGCCTGTGA TGTGAGACCC GACAATGGGG CCATTGAGGG TGCCCATCAC GGGTCTCGGT AACCAGCCCA 801 TCGCATTCAT GATGTGTCTT GGGGGGGGGA GGTATCACAG GGTGTGATTG

Т0ТТТТ(ЗСАС СДАСАДДСес ДТСААСАСТА тсасасатсс gcattc.AA.TG 901 стсетстссс стсасааттс аотстатссс стссттсаас тсссасаатс

АСССТСТвСА ССТСАСвАТТ вТТТТТТТСТ САСТСССТСТ ССТОССвССС 1001 ОТ С ТТвАТСА САСССОАААА ССАССТвСТС ААССАТСАТА ACA.CGCAA.CA ССТАСТААСС САСОСАТССС С БрЫ

Рис. 4. Последовательности праймеров для амплификации промотора гена УЭАС, кодирующего потенциал-зависимый анионный канал внешней мембраны митохондрий. Приведена также последовательность полученного

ПЦР-продукта.

Эффективность биосинтеза целевого продукта - соматолиберина рекомбинантными штаммами У. Иро1уНса, несущими конструкции рОЕ-1Ж/\3-УОАС-БЬЫ-Тхрг-Ьеиг и рС>Е-иКАЗ-НР4с1-5ЬН-Тхрг-Ьеи2, оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа в варианте Сэндвич с использованием поликлональных куриных антител. При этом биомасса рекомбинантных штаммов гомогенизировалась, как описано в разделе «Материалы и методы» и использовалась для проведения определений. Результаты тестирования представлены на рис. 5.

■ (1) рЦЕ-иИАЗ-\ФАС-51М-Тхрг-1еи2 (8.5)

■ (2) pQ.E-URA3-VDAC-SLN-Txpr-l.eu2 (5.0) О(З) рЦЕ-иКАЗ-НР4с1-51Ы-Тхрг-1еи2 (8.5) О (4) рСЩ-иКАЗ.Н1>4й-51.М-Тхрг-1.«12 (5.0)

■ (5) раЕ-иЛАЗ-Тхрг-1.еи2 (5.0)

36

48

Рис. 5. Уровень накопления ОНЯН свиньи в растворимой фракции лизата рекомбинантных штаммов У. Нро1уНса, несущих экспрессионные конструкции

с геном зрелого соматолиберина свиньи БЬЫ, и в контрольной группе. Символом * отмечена группа р(ЗЕ-и11АЗ-УВАС-8ЬМ-Тхрг-Ьеи2 (рН 8,5), для которой показано статистически значимое увеличение массы мышей на 20 сутки проведения эксперимента по сравнению с группами, получавшими штаммы р<ЗЕ-иКАЗ-УОАС-8ЬМ-Тхрг-Ьеи2 и рОЕ-1ЖАЗ-НР4с1-8ЬЫ-Тхрг-Ьеи2, выращенные при рН 5,0, и с контрольной группой.

Использованная тест-система иммунохимической детекции соматолиберина свиньи на основе поликлональных антител ^У курицы обладала недостаточной специфичностью и узким диапазоном линейности полезного сигнала, однако ее использование позволило доказать факт наличия целевого пептида в биомассе рекомбинантных штаммов (но не контрольного штамма). Поэтому белковые добавки на основе штаммов, несущих конструкции р(ЗЕ-1Л1АЗ- УБ АС-8Ыч[-Тхрг-Ьеи2 и рС2Е-ШАЗ-НР4с1-8ЬМ-Тхрг-Ьеи2, были использованы в экспериментах по исследованию эффекта пероральной доставки соматолиберина мышам-отьёмышам. Эта тест-система оценки биологического эффекта соматолиберина была разработана в ходе предшествующих работ нашей лаборатории.

Каждое животное ежесуточно получало добавку лиофилизированного препарата, содержащего 107 клеток рекомбинантных штаммов У. Нро1уИса или 106 клеток стандартного препарата В. ИсИет/огтгз В-4161 (pWpr-Le). В качестве отрицательного контроля использовали добавку из лиофилизированной культуры У. Нро1уИса штамма Ро1£ несущего интактный вектор р(ЗЕ-1ЖАЗ-Тхрг-Ьеи2 без гена соматолиберина.

Вне зависимости от рН среды культивирования, препарат на основе штамма с векторной конструкцией рРЕ-1ЖАЗ-НР4с!-8ЬН-Тхрг-Ьеи2 не оказал существенного влияния на скорость роста мышей в пределах использованных дозировок рекомбинантного пробиотика (107 кое в сутки). Наибольший прирост живой массы мышей за период опыта отмечен в группе 2, в которой мыши с кормом получали клетки рекомбинантного штамма У. Про1уИса (с конструкцией р(2Е-и11АЗ-УБАС-81_К-Тхрг-Ьеи2), выращенного при рН 8,5 (табл. 4). При этом на 28 сутки эксперимента отмечалось существенное увеличение массы мышей в данной группе по сравнению со значениями в группах р(ЗЕ-1Л1АЗ- УБ АС-8ЬЫ-Тхрг-Ьеи2 (Р<0,01) и рдЕ-иКАЗ-НР4с1-8ЬМ-Тхрг-Ьеи2 (Р<0,01), в которых мыши получали с кормом клетки рекомбинантных штаммов У. Иро1уйса, выращенных при рН 5,0, и в контрольной группе (Р<0,01).

Таким образом, создание и использование в настоящей работе конструкции р<ЗЕ-1ЖАЗ-УОАС-8ЬМ-Тхрг-Ьеи2 позволило впервые показать роль рН-индуцибельности промотора гена УОАС, кодирующего потенциал-зависимый анионный канал внешней мембраны митохондрий, для экспрессии в дрожжах У. Нро1уИса гена соматолиберина свиньи.

Полученные результаты свидетельствуют о принципиальной возможности достижения анаболического эффекта на лабораторных животных при пероральном введении мышам гормона вНЯН свиньи в составе конструкции рОЕ-иЯАЗ-УОАС-5ЬЫ-Тхрг-Ьеи2 на основе рекомбинантного штамма У. Иро1увса, содержащего рН-индуцибельный промотор УОАС. В условиях проведенного физиологического опыта наибольший прирост живой массы отмечен у животных при использовании рекомбинантных штаммов, выращенных при рН 8,5. Это дает основание считать перспективным проведение дальнейших исследований по оптимизации условий создания

препаратов для пероральной доставки регуляторных пептидов в организм животных с целью стимуляции хозяйственно-ценных качеств, как альтернативы применению инъекционных форм и генно-инженерных технологий.

Полученные результаты свидетельствуют о принципиальной возможности достижения анаболического эффекта на лабораторных животных при пероральном введении мышам гормона вНЯН свиньи в составе конструкции р(ЗЕ-1Л1АЗ- УО АС-БЬМ-Тхрг-Ьеи2 на основе рекомбинантного штамма У. Нро1уИса, содержащего рН-индуцибельный промотор УБАС. В условиях проведенного физиологического опыта наибольший прирост живой массы отмечен у животных при использовании рекомбинантных штаммов, выращенных при рН 8,5. Это дает основание считать перспективным проведение дальнейших исследований по оптимизации условий создания препаратов для пероральной доставки регуляторных пептидов в организм животных с целью стимуляции хозяйственно-ценных качеств, как альтернативы применению инъекционных форм и генно-инженерных технологий.

4 ВЫВОДЫ

1. Разработан метод получения кормовой биомассы У. Про1уИса, показана ее биологическая полноценность, отсутствие острой и субхронической токсичности, аллергизирующих и раздражающих свойств, а также высокая метаболическая активность дрожжей в отношении компонентов сырья, способствующая ускоренной детоксикации и биотрансформации кормовых ингредиентов.

2. Впервые показана высокая эффективность промотора митохондриального потенциал-зависимого порина УБАС для гетерологичной экспрессии в У. Нро1уНса в том числе, при культивировании штаммов на средах с использованием промышленного сырья.

3. С использованием новой экспрессионной системы впервые разработаны продуценты соматолиберина свиньи на основе У. Ирочка.

4. В доклинических испытаниях достигнут анаболический эффект соматолиберина свиньи в составе клеток У.Про1у1ка в отношении мышей, показана эффективность У. Иро1уйса в качестве микроконтейнера для пероральной доставки соматолиберина животным.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предлагается к применению после испытания на сельскохозяйственных животных кормовая добавка на основе рекомбинантного штамма У Иро1уИса, несущего ген соматолиберина (новая интегративная система на основе промотора гена УЭАС), обладающая анаболическим эффектом, а также тест-система для иммунохимической детекции соматолиберина свиньи.

2. Теоретические и практические положения рекомендуется использовать в учебном процессе научно-исследовательских профильных ВУЗов, научно-исследовательских институтов и центров.

6 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зылькова М.В., Гусева М.А., Белякова А.В., Гра О.А., Осипеикова О.В., Филимонова Н.А., Елагина Е.М., Кузьмин П.А., Зарииова Р.С., Шевелев А.Б., Рекомбинантный продуцент соматолиберина свиньи на основе дрожжей Yarrowia lipolytica. Проблемы биологии продуктивных животных. 2012; 2,5-12.

2. Белякова А.В., Гра О.А., Зылькова М.В., Эпова Е.Ю., Плаксина А.Г., Зарипова Р.С., Хасанова А.Р., Филимонова Н.А., Елагина Е.М., Смирнова А.В., Казеева Т.Н., Шевелев А.Б, Алешин В.В. Рекомбинантный продуцент соматолиберина курицы на основе бацилл. Фундаментальные исследования, 2012; 5(2), 401-406.

3. Ковалева М.В., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Попова К.М., Зылькова М.В., Уральская Л.А., Звягильская Р.А. Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей. Биохимия. 2010; 75(3): 365-372.

4. Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Trendeleva Т.А., Zyl'kova M.V., Ural'skaya L.A., Popova K.M., Saris N.E., Zvyagilskaya R.A. Induction of a nonspecific permeabilily transition in mitochondria from Yarrowia lipolytica and Dipodascus (Endomyces) magnusii yeasts. J. Bioenerg Biomembr. 2009; 41(3): 239-249.

5. Epova E., Guseva M., Kovalyov L., Isakova E., Deryabina Y., Zylkova M.. Belyakova A., Shevelev A. Identification of proteins involved in pH adaptation in extremophile yeast Yarrowia lipolytica. "Proteomics applications in biology". Ed. Heazlewood J.L.& Petzold C.J. Intech, Rijeka 2012; Pt 4, Ch 10, 209-225.

6. Некипелова Т.Д., Лыго O.H., Ходот E.H., Кузьмин В.А., Шахматов

B.В., Варгин В.В., Белякова А.В., Зылькова М.В., Спектрально-кинетические характеристики триплетного состояния 7,7,9-триметил-6,7-дигидрофуро[3,2-f] хинолина. Химия высоких энергий, 2012; 46(2), 211-215.

7. Zvyagilskaya R.A., Zyl'kova M.V.. Sukhanova E.I., Kovaleva M.V., Trendeleva T.A. Mitochondrial permeability transition pore (mPTP) in different yeast species is dissimilarly regulated. Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 15th EBEC. Short Reports. Moscow, 2008; p. 32.

8. Зылькова M.B.. Ковалева M.B., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Леин

C.А., Звягильская Р.А. Индукция неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий. Труды 2-го Съезда микологов России с международным участием «Современная микология в России», 2008; 2, 127128.

9. Zvlkova M.V., Sukhanova E.I., Trendeleva T.A., Kovaleva M.V., Zvyagilskaya R.A., More on permeability transition in Yarrowia lipolytica mitochondria. Abstr. Bari Intern. Symposium on «Mitochondrial physiology and pathology» IUBMB Symposium SI Satellite events of the 33th FEBS Congress and 11th IUBMB Athens, 2008; 38.

10. Ковалёва M.B., Суханова Е.И., Зылькова M.B., Романовская М.А., «Окислительный стресс и индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica» Труды Всероссийской конференции молодых ученых и II школы им. академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты». Тезисы докладов. Москва, 2006; 173-174.

Отпечатано с оригинал-макета в типографии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Подписано в печать 22.04.2013 г. Заказ №1303/3 420075, г. Казань, ул. Научный городок - 2 Тел. 8-843-239-53-33www.vnivi.ru

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Зылькова, Марина Валерьевна, Казань

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова» Российской

академии медицинских наук и

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»

На правах рукописи

04201357523

Зылькова Марина Валерьевна

ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭКСТРЕМОФИЛЬНЫХ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTIC А И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ДОСТАВКИ

ФАКТОРОВ РОСТА

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук Шевелев А.Б.

доктор биологических наук, профессор Тремасов М.Я.

Казань-2013

СОДЕРЖАНИЕ

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 5

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10 2.1 Биохимические особенности Уаггоу^1а Иро1уйса и их 10 влияние на применимость этого биологического объекта в микробиологическом производстве

2.2. Адаптация У. Нро1уйса к росту при щелочных значениях рН 14 за счёт модификации системы транспорта метаболитов через внешнюю мембрану

2.3. Исследования физиологических реакций У Ыро1уНса при 20 росте в щелочных условиях методами протеомики

2.4. Универсальные механизмы ответа У. Иро1уПса на 30 различные виды стресса

2.4.1. Функционирование цепи переноса электронов У Иро1уйса при 36 стрессовых воздействиях

2.4.2. Альтернативная оксидаза дыхательной цепи, как фактор 39 адаптации У. Иро1уйса к стрессовым воздействиям

2.4.3. Изменения морфологии клеток У Нро1уйса при адаптации к 42 стрессовым воздействиям

2.4.4. Цитологические особенности У Иро1уНса при ответе на 43

тепловой шок

2.4.5. Цитологические особенности У Нро1уЫса при ответе на 45

химический стресс

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 48

4 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 57

4.1 Изучение острой и субхронической токсичности кормовых 57 добавок на основе рыбной муки и У. Ііроіуїіса

4.2 Изучение раздражающего и аллергизирующего действия 64 кормовой добавки на основе рыбной муки и У. Ііроіуйса

4.3 Биологические испытания на модели мышей опытного 67 образца кормовой добавки, полученной на основе К Ііроіуіїса путём культивирования на средах различного состава

4.4 Исследование активности промотора гена УЭАС методом 72 транскрипционных репортёров с использованием гена La.cZ

4.5 Создание рекомбинантных продуцентов вНЯН свиньи 80

5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 91

6 ВЫВОДЫ 107

7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 108

8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109

Список использованных сокращений

АЕР (ХРИ2)

РАО

Єіс^с

ЄНІШ

МАЬ.БІ-ТОЕ

РВ8

РВ8Т

ТАЕ

ТМВ

УБАС

БВК

ДТТ ЭДТА

ПААГ ПСА

- щелочная секреторная эндопротеиназа У Ііроіуіїса и ее ген;

- Всемирная организация по пищевым продуктам;

- Ы-ацетилглюкозамин;

- соматолиберин, релизинг-фактор гормона роста;

- идентификация белков по спектру масс триптических пептидов, определяемых с помощью масс-спектроскопии;

- физиологический раствор, забуференный фосфатом натрия, рН 7,2;

- физиологический раствор, забуференный фосфатом натрия, рН 7,2, содержащий детергент Т\уееп-20 в концентрации 0,03%;

- буфер для электрофореза нуклеиновых кислот на основе Трис, уксусной кислоты и ЭДТА, рН 8,3;

- 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, хромогенный субстрат пероксидазы, дающий при окислении водорастворимый продукт;

- потенциал-зависимый порин внешней мембраны митохондрий;

- белково-витаминный концентрат (на основе сухой биомассы У Ііроіуйса);

- Дитиотрейтол;

- этилендиаминтетрауксусная кислота, хелатор двух- и поливалентных катионов;

- полиакриламидный гель;

- персульфат аммония.

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. Важной задачей ветеринарной фармакологии и токсикологии является разработка и изучение действия лекарственных веществ на организм животных, стимуляция продуктивности и воспроизводственной способности, профилактика и лечение животных (Иванов A.B. и др., 2006; Антипов В.А. и др., 2007; 2009; Дорожкин В.И., Смирнов A.M. 2008). Народнохозяйственное значение приобретает разработка теоретических основ и практических приемов безопасных и экономически оправданных методов стимуляции роста сельскохозяйственных и промысловых животных (Тремасов М.Я., Иванов A.B. и др., 2006; Тремасов М.Я., Папуниди К.Х. и др., 2012). В качестве средств стимуляторов роста в недавнем прошлом в нашей стране и за рубежом использовался паприн и его различные добавки в составе комбикормов, в виде автолизата в составе регенирированного молока и т.д. (Яцко H.A. и др., 1993; Кузнечик В.И., 1994).

Перспективным объектом, позволяющим добиться прогресса в решении этой задачи являются дрожжи Yarrowia lipolytica, что обусловлено сочетанием в этом организме нескольких уникальных биохимических особенностей (Barth G., Gaillardin С., 1997). За счет наличия пероксисом она способна расти на органических субстратах самого различного биогенного и абиогенного происхождения, включая парафины нефти, коммунальные и промышленные стоки. Обладая мощным аэробным метаболизмом, У. lipolytica устойчива ко многим агрессивным органическим соединениям, эффективно разрушает ксенобиотики и токсины. В отличие от других видов дрожжей, Y. lipolytica обладает высокой алкало - и галотолерантностью, с высокой эффективностью секретирует белки во внешнюю среду. В течение 10 лет Y. lipolytica использовалась в СССР в качестве биореактора для производства кормового белка для животноводства в качестве субстрата парафинов нефти (паприн или белково-витаминный концентрат, БВК) в результате чего накоплены данные, подтверждающие безопасность и

высокую кормовую ценность ее биомассы (Выслоух В.А. и др., 1987; Ибрагимов Ф.Б., Сычев А.Е. и др., 1995). В 2000 г надзорный орган США -Food and Drug Administration включил Y. lipolytica в список заведомо безопасных видов (GRAS), без ограничений пригодных для производства кормовых и пищевых ингредиентов. По данным (Guerzoni М.Е. et al., 2001; Suzzi G. et al., 2001), живые клетки Y. lipolytica присутствуют в традиционных продуктах из регионов Италии. Для Y. lipolytica разработаны удобные генетические маркеры и методы трансформации, полностью определена последовательность генома типового штамма этого организма. В совокупности, все это позволяет применять для исследования Y. lipolytica современные методы транскриптомного и протеомного анализа, конструировать на ее основе рекомбинантные штаммы.

Одним из наиболее перспективных биоактивных пептидов для пероральной доставки является соматолиберин (GHRH), который оказывает положительное влияние на продуктивность сельскохозяйственных животных, в частности, способствует повышению скорости роста и при этом обладает высокой устойчивостью к протеолизу. До начала работы были получены данные о возможности достижения анаболического эффекта в отношении мышей и поросят соматолиберина свиньи, перорально доставляемого с помощью живых пробиотических штаммов мезофильных бацилл.

1.2 Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилась разработка нового метода получения безопасной кормовой добавки на основе рекомбинантного штамма Y. lipolytica, служащей источником полноценного белка для кормления животных и обеспечивающей ускоренный рост животных за счет анаболического эффекта соматолиберина.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи: 1. Изучить метаболический потенциал Y. lipolytica для создания эффективной в питательном отношении, дешевой в производстве кормовой добавки, оценив ее способность к детоксикации ингредиентов комбикормов.

2. Изучить фармакологические и токсикологические свойства разработанной кормовой добавки на основе биомассы У. Ыро1уИса.

3. Разработать новую интегративную генетическую систему на основе впервые предложенного промотора стресс-индуцибельного белка УВАС, позволяющую экспрессировать в клетках У \ipolytica гетерологичные гены в условиях промышленного производства кормовой добавки.

4. Получить опытный образец кормовой добавки на основе рекомбинантного штамма К \ipolytica, несущего ген соматолиберина, и провести его испытания на животной модели.

1.3 Научная новизна работы. Впервые показана кормовая эффективность и отсутствие острой и субхронической токсичности, а также раздражающих и аллергизирующих свойств кормовой добавки на основе биомассы У Нро1уНса, выращенной в условиях активации аэробного метаболизма: метаболический потенциал У. Иро1уйса обеспечивает детоксикацию низкосортного сырья и повышение его биохимической полноценности. Разработана оригинальная система рекомбинантной экспрессии на основе промотора потенциал-зависимого митохондриального порина ЛПЭАС. Впервые получен продуцент соматолиберина свиньи на основе рекомбинантного штамма У. ИроЬуйса. На модели мышей впервые экспериментально показана возможность достижения анаболического эффекта при пероральном введении вегетативных цельных клеток У. Нро1уйса, содержащих зрелую форму СНКН. Доказано, что эти клетки могут рассматриваться в качестве эффективного микроконтейнера для пероральной доставки широкого круга белков и пептидов животным, обеспечивающих их сохранность в условиях высокой протеолитической активности дуоденального и кишечного химуса.

1.4 Практическая ценность работы. На примере У. Нро1уНса продемонстрирован универсальный принцип адаптации к стрессам, позволяющей ей эффективно распознавать и метаболизировать ксенобиотики и другие нежелательные компоненты кормовых ингредиентов.

Вновь обнаруженная особенность Y. lipolytica использована для решения практической задачи: конструирования новой системы доставки биологически активных пептидов животным. В результате проведенных исследований создана экономически эффективная и безопасная для человека альтернативная к синтетическим стероидным гормонам система на основе живых продуцентов белковых ростовых факторов на базе безопасных микроорганизмов Y. lipolytica. Дешевое производство биомассы этого вида дрожжей позволяет обеспечить доступность препарата для массового использования.

Результаты работы могут быть положены в основу новой технологии производства и применения кормовых добавок, обладающих анаболическим эффектом. Кроме того, разработанная технология может быть использована при создании продуцентов других биологически активных соединений на основе Y. lipolytica, в частности, антигенов вакцинного назначения для пероральной иммунизации сельскохозяйственных животных и для пероральной доставки в организм различных лекарственных средств.

1.5 Апробация материалов диссертации. Основные материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на следующих научных конференциях: Всероссийской конференции молодых ученых и II школы им. академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты», 2006; II съезде микологов России с международным участием «Современная микология в России»; Bari Intern. Symposium on «Mitochondrial, physiology and pathology» IUDMB Sympos. SI Satellite events of the 33th FEBS Congress and 11th IUBMB Athens; научной конференции «Фундаментальные исследования» Пунта Кана 13-22 апреля 2012 гг.

1.6 Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.7 Основные положения, выносимые на защиту:

- Результаты способности кормовой добавки на основе биомассы Y. lipolytica к детоксикации апитательных ингредиентов комбикормов.

- Фармакотоксикологическая оценка кормовой добавки на основе биомассы Y. lipolytica.

- Эффективность новой интегративной генетической системы на основе впервые предложенного промотора стресс-индуцибельного белка VDAC, позволяющего экспрессировать в клетках Y. lipolytica гетерологичные гены в условиях промышленного производства кормовой добавки.

Эффективность Y. lipolytica в качестве микроконтейнера для пероральной доставки соматолиберина животным.

1.8 Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 127 страницах компьютерного текста и включают следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 26 рисунками. Список использованной литературы содержит 170 библиографических источников, из них 125 иностранных.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Биохимические особенности Yarrowia lipolytica и их влияние на применимость этого биологического объекта в микробиологическом производстве

В настоящее время экстремофильные дрожжи Y. lipolytica выступают в качестве удобной клеточной модели для исследования механизмов апоптоза и клеточной дифференцировки. Они рассматриваются как один из наиболее перспективных биотехнологических объектов (Barth G., Gaillardin С., 1997). Технологическая перспективность этого вида обусловлена наличием у него нескольких уникальных особенностей. Они способны быстро расти на органических субстратах различного абиогенного и биогенного происхождения, включая промышленные отходы, ингредиенты, загрязеннные ксенобиотиками и микотоксинами, парафины и олефины, а также сточные воды (Hassanshahian М. et al., 2012). В Советском Союзе в течение ряда лет реализовывался проект «Паприн», направленный на создание технологии получения кормового белка на основе биомассы Y. lipolytica, культивируемой на парафинах нефти. Было налажено его широкое производство и разработаны технические условия (ГОСТ 28179-89). Однако в доступной литературе сообщений о Паприне практически нет.

Важная биологическая особенность Y. lipolytica - наличие пероксисом позволяет использовать её для утилизации ксенобиотиков, биоремедиации почвы, для получения кормовой биомассы из малоценного органического сырья, для создания биологических систем очистки воды (Bankar A.V. et al., 2009). Y. lipolytica устойчива ко многим агрессивным органическим соединениям, что позволяет использовать её для их биосинтеза. Одним из примеров такого применения являются созданные на основе Y. lipolytica, сверхпродуценты лимонной и янтарной кислот (ссылка). Y. lipolytica является универсальной моделью для изучения клеточной дифференцировки на примере диморфического перехода, т.е. переключения, в зависимости от условий среды, от дрожжеподобного к истинно мицелиальному росту. Эта

особенность имеет практическое применение, позволяя использовать Y. lipolytica в качестве легко культивируемого и генетически исследованного аналога Candida albicans - дрожжеподобного патогена человека и животных. На модели Y. lipolytica был испытан ряд новых противогрибковых средств, в дальнейшем зарекомендовавших себя для лечения кандидозов. Y. lipolytica обладает высокой способностью к секреции белков во внешнюю среду, достигаеющей 10 г/л. Этот показатель приближает её к секреторному потенциалу метилотрофных дрожжей родов Pichia и Hansenula и принципиально превышает возможности пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Перечисленные уникальные особенности Y. lipolytica привели к решению расшифровать полную геномную последовательность типового штамма этого организма. Соответсвующий проект был реализован ведущей исследовательской группой из Франции, специализирующейся в области фундаментальных и прикладных исследований Y. lipolytica (Dujon В. et al., 2004). Наличие доступной для дальнейших исследований геномной последовательности позволило использовать быстрый и мощный инструмент протеомики в качестве универсального средства для первичной идентификации белков, задействованных в реализации важных особенностей Y. lipolytica. Так, в 2007 году, этим методом были идентифицированы белки Y. lipolytica, принимающие участие в диморфическом переходе (Morin М. et al., 2007). Однако протеомные исследования Y. lipolytica носят фрагментарный характер, будучи нацелены на решение частных прикладных задач. В литературе отсутствуют данные об использовании методов протеомики для вскрытия механизмов уникальной стрессоустойчивости Y. lipolytica. Кроме того, опубликованные работы страдают от методических сложностей подготовки образцов к протемному анализу. Так, в цитировавшейся работе, (Morin М. et al., 2007) для повышения разрешения 2В-электрофореза, анализировались только растворимые белки цитоплазмы и мембранных компартментов. При этом мембранные и клеточностеночные

белки были исключены из рассмотрения, хотя их участие в морфогенезе гиф или дрожжеподобных клеток не вызывает сомнений.

Наряду с перечислеными, одной из интересных особенностей Y. lipolytica является способность без потерь выдерживать кратковременный щелочной стресс и эффективно расти на средах со щелочными значениями pH - вплоть до 10,5 (Zvyagilskaya R. et al., 2004). Активно изучать механизмы переключения генов Y. lipolytica в ответ на изменение pH внешней среды начали с 1997 года, когда появились данные о регуляторном факторе YRimlOl и его мутантных формах (Lamber M. et al., 1997). Этот белок является элементом pH-зависимого транскрипционного контроля. Раньше гомолог YRimlOl - Rimlp был