Биосинтез янтарной кислоты дрожжами из этанола

Юсупова, Алсу Ильдаровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биосинтез янтарной кислоты дрожжами из этанола
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез янтарной кислоты дрожжами из этанола"

На правах рукописи

ЮСУПОВА АЛСУ ИЛЬДАРОВНА

БИОСИНТЕЗ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ ДРОЖЖАМИ ИЗ ЭТАНОЛА

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

4852270

Пущино - 2011

4852276

Работа выполнена в лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Научный руководитель: доктор биологических наук

Моргунов Игорь Григорьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Миронова Галина Дмитриевна

кандидат биологических наук Ермакова Инна Тихоновна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится « 2011 г. в часов Уъллт\.

на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, проспект Науки, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат размещён на сайте: http://www.ibpm.ru

Автореферат разослан 2011г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Янтарная кислота (Ж) широко используется в химической промышленности в качестве исходного сырья для производства различных четырехуглсродных соединений; на её основе получают биодеградируемые полимеры, применяемые при производстве пищевых плёнок и упаковок, средств личной гигиены и одноразовой посуды. В пищевой промышленности ЯК применяется в качестве пищевой добавки, подкислителя и консерванта. В последние годы ЯК стала применяться в здравохранении. Исследованиями научной школы М.Н. Кондрашовой (ИТЭБ РАН) показало, что ЯК является сигнальным веществом, связывающим энергетическую и гормональную системы организма. На основании этих исследований разработан ряд биологически активных добавок и лекарственных средств на основе ЯК. Производство ЯК ежегодно возрастает не менее, чем на 10% (Sauer et al., 2008).

В настоящее время ЯК получают методом химического синтеза из малеиновой кислоты или ее ангидрида, с использованием дорогостоящего катализатора ванадия. Известно, что малеиновая кислота и соединения ванадия являются клеточными ядами, и даже небольшие их примеси резко снижают качество Ж. Также для получения ЯК используется процесс термического разложения янтаря и его очистки путем многократной перекристаллизации; однако этот процесс является дорогостоящим.

В последние годы наиболее перспективным рассматривается микробиологический синтез ЯК, при котором произведенный продукт характеризуется высокой чистотой и по своему конформерному составу близок к природной субстанции. По оценке специалистов замена химического метода получения ЯК на микробиологический снизит не только риск загрязнения окружающей среды, но и увеличит производство ЯК с 16 до 270 ООО т/год, что, в свою очередь, может существенно расширить сферы применения ЯК и химических соединений, полученных на её основе.

В литературе имеется мало сведений о сверхсинтезе Ж микроорганизмами. В лабораториях США, Китая и Франции предпринимались попытки разработать промышленный процесс получения Ж с помощью различных генетически-модифицированных мутантных штаммов анаэробных бактерий Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Escherichia coli и Mannheimia succiniciproducens при их росте на углеводах. Эти работы не привели к положительным результатам в связи с тем, что мутанты со временем теряли свою кислотообразующую активность. Имеются данные о сверхсинтезе ЯК у аэробных организмов - дрожжей и грибов (Sato et al., 1972; Ермакова, Мандева, 1981), но дальнейшего развития эти исследования не получили. Большая потребность в Ж при всей сложности её химического синтеза, делает проблему разработки микробиологического способа её получения весьма актуальной.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение закономерностей синтеза Ж дрожжами из этанола и разработка способа получения и выделения этого продукта.

В число основных задач входило:

1. Изучение способности дрожжей различного таксономического положения синтезировать ЯК;

2. Определение условий культивирования дрожжей, оптимальных для получения ЯК;

3. Исследование физиолого-биохимических особенностей роста дрожжей в среде с этанолом в условиях сверхсинтеза ЯК;

4. Разработка микробиологического способа получения ЯК из а-кетоглутаровой кислоты (КГК) с участием тиаминауксотрофных дрожжей Yarrowia lipolytica;

5. Разработка метода выделения и очистки препарата ЯК высокой чистоты;

6. Сравнение биологической активности полученного препарата с коммерческими синтетическими препаратами.

Научная новизна работы

Впервые установлена принципиальная возможность направленного синтеза ЯК дрожжами из этанола при лимитировании их роста источником азота; отобраны наиболее активные продуценты Candida zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5; оптимизированы условия культивирования (рН среды, концентрация растворенного кислорода) и состав питательной среды (концентрации азота, этанола и микроэлементов), обеспечивающие максимальный синтез ЯК.

Показано, что сверхсинтез ЯК у С. zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5 обусловлен особенностью функционирования глиоксилатного цикла, в частности высокой активностью ферментов цитратсинтазы, аконитат-гидратазы и изоцитрат-лиазы.

Впервые разработан принципиально новый способ получения ЯК, включающий последовательный микробиологический синтез КГК из этанола тиаминауксотрофными дрожжами Y. lipolytica ВКМ Y-2412 и ее дальнейшее эквимолярное окисление до ЯК под воздействием перекиси водорода. Разработана схема выделения Ж из культуралыюй жидкости и очистка её до высокой чистоты.

Практическая значимость работы

Предложенный микробиологический способ получения ЯК может заменить дорогостоящий химический синтез. Ж, полученная данным способом, обеспечивает требуемый уровень чистоты и биологической активности, позволяющий использовать её в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве (протокол о проведении процесса биосинтеза и приготовлении опытной партии янтарной кислоты на базе Опытной технологической установки ИБФМ РАН от 20.04.11, протокол о проведении испытаний янтарной кислоты на содержание токсичных элементов ООО «ИЛ Тест-Пущино» № 2695 от 25.04.11, отчёт о проведении доклинических испытаний ГОУ ВПО РГМУ Росздрава№ 22/10 от 15.04.10).

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на Международных Пущинских школах-конференциях для молодых учёных (2007, 2008, 2010), ежегодных стендовых сессиях ИБФМ РАН (2007-2009), Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, 2008), Первом научно-ирактическом симпозиуме «Научная молодёжь - биотехнологии России», (Пущино, 2008), Российском молодёжном инновационном конвенте (Москва, 2008), Форуме молодых учёных и 35-ом FEBS конгрессе (Гётеборг, Швеция, 2010).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 12 печатных работ, в том числе, 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, вьшодов, списка цитируемой литературы, приложений. Работа изложена на ^/страницах, содержит таблицы и 7г~рисунков. Список литературы включает наименований, из них /¿^ - публикации в

иностранных изданиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы. Объектами исследования служили 32 штамма дрожжей, относящихся к родам Candida, Saccharomyces, Yarrowia, Debaromyces, Pichia и Torulopsis (табл. 1). Все штаммы были получены из музея лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН.

Состав среды культивирования. Дрожжи выращивали в минеральной среде Ридер следующего состава (г/л): (NH^SC^ - 3; MgS04"7H20 - 0,7; Ca(N03)2 - 0,4; NaCl - 0,5; KH2P04 - 1,0; K2HP04 - 0,1; микроэлементы по Буркгольдеру (Burkholder et al., 1944) (мг/мл): f - 0,1, В+ - 0,01, Mn2+ - 0,01, Zn2+ - 0,03, Cu2+ - 0,01, Mo2+ - 0,01, Fe2+ - 0,05. В качестве источника витаминов в среду вносили (мг/л): тиамин - 0,5, биотин - 0,001, пантотенат - 0,5, инозит - 10, никотиновую кислоту - 1,0, пиридоксин - 0,5. Источником углерода в экспериментах служил этиловый спирт ректификованный из пищевого сырья по ГОСТ Р 51652-2000. Этанол во всех опытах давали дробно в количестве, обеспечивающем его постоянное присутствие в среде. Концентрации этанола, (NH4)2S04, ZnS04 и тиамина изменялись в зависимости от целей эксперимента и указаны в тексте.

Методы культивирования. Культивирование в зависимости от целей исследования проводили в пробирках и колбах на качалке или в ферментёре АНКУМ-2М. Для отбора продуцентов Ж культивирование дрожжей проводили при 29 °С в больших пробирках (20 х 2 см) с 5 мл среды Ридер. Периодическое культивирование дрожжей на качалке (180-200 об/мин) проводили при температуре 29 °С в колбах объемом 750 мл с 50 мл среды Ридер. Значение рН

поддерживали на уровне 5,0-6,0 систематическим внесением 5-10% раствора NaOH или КОН. Для выращивания дрожжей в ферментёре в режиме периодического культивирования использовали 10-л аппараты АНКУМ-2М с 5 л среды Ридер в условиях поддержания следующих параметров на постоянном уровне: температура 29 °С для дрожжей С. catenulata ВКМ Y-5 и С. zeylanoides В KM Y-2324, и 30 °С для дрожжей Y. Upofytica ВКМ Y-2412, рН среды на уровне значения 5,0 для дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides-, рН=3,5 для дрожжей Y. lipolytica, концентрация растворенного кислорода р02 55-60% насыщения.

Анализ метаболитов. Рост культур контролировали путем измерения веса сухой биомассы или по величине оптической плотности клеточной суспензии. В культуральной жидкости проводили определение содержания этанола методом газожидкостной хроматографии и азота с использованием ионометра. Содержание органических кислот определяли на HPLC хроматографе (LKB, Швеция) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В качестве стандартов использовали набор органических кислот фирмы Sigma (США) и Реахим (Россия). Содержание отдельных органических кислот дополнительно анализировали энзиматическими методами.

Выделение целевого продукта. ЯК из фильтрата культуральной жидкости дрожжей Y. lipolytica экстрагировали этанолом и выделяли в кристаллическом виде. Последовательность операций подробно изложена в диссертации.

Методы определения активностей ферментов подробно изложены в диссертации.

Определение активности дыхания. В работе использовали митохондрии из печени крыс Вистар. Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования. Суспензию митохондрий, содержащую 60 мг/мл белка, хранили на льду. Дыхание митохондрий регистрировали на полярографе при 26 °С кислородным электродом типа Кларка. Мембранный потенциал митохондрий измеряли с использованием чувствительного электрода тетрафенилфосфония.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Скрининг дрожжей н отбор продуцентов ЯК та этанола в условиях лимитирования роста азотом

В задачу данного раздела работы входило: в сравнительном аспекте на представителях большого числа разных видов дрожжей выяснить, может ли Ж экскретироваться из клетки в макроколичествах. Были изучены 32 штамма дрожжей, относящихся к разным видам и родам (Debaromyces, Candida, Pichia, Saccharomyces, Yarrowia и Torulopsis). В качестве основного субстрата был выбран этиловый спирт. Использование этанола в качестве субстрата обеспечивает образование продукта, который может применяться в пищевой и медицинской промышленности.

Ранее И.Т. Ермаковой и Р. Мандевой (1981) было обнаружено, что ЯК образуется только в условиях лимитирования роста дрожжей азотом, поэтому дрожжи культивировали в аэрируемых на качалке пробирках в условиях лимитирования роста азотом. Концентрацию азота подбирали с таким расчетом,

чтобы биомасса не превышала 2 г/л во избежание лимитирования роста кислородом. Этанол вносили дробно (1-2 г/л) по мере потребления.

Анализ метаболитов, накопившихся в культуральной жидкости, проводили через 24 ч после перехода культуры в стационарную фазу. Состав метаболитов, выделяющихся при лимитировании роста азотом у исследованных дрожжей, представлен в табл. 1. Большинство исследуемых штаммов (29 из 32) экскретировали ЯК в среде с этанолом. Однако количество ЯК у исследуемых штаммов было различно: 18 штаммов экскретировали ЯК в количестве менее 0,1 г/г клеток, 9 штаммов - от ОД до 0,5 г/г клеток и два штамма - С. zeylanoid.es ВКМ У-2324 и С. са!епи1аШ ВКМ У-5 обладали наибольшей продукцией ЯК (1,2 и 1,5 г/г клеток, соответственно).

Таблица 1. Биосинтез органических кислот дрожжами из этанола

Организм ЯК УК ЛК ИЖ КГК ЯбК ФК

(г/г) (г/г) (г/г) (г/г) (г/г) (г/г) (г/г)

Candida catenulata ВКМ Y-5 1,50 0,1 0,2 0,3 0,3 0,6 0,08

С. mvcoderma ВКМ Y-240 0,10 0,1 0 0 0,3 0,1 0,08

С. rugosa ВКМ Y-67 0 од од 0,01 4,2 0 0,07

С. patudigena ВКМ Y-2443 0,40 0,5 0 0 0,5 0,3 0,07

С. utilis ВКМ Y-74 0,42 0,1 1,0 од 0,3 0,45 0,10

С. utilis 766 0,10 0,1 0 од 0,5 0,1 0,12

С. zeylanoides ВКМ Y-6 0,50 0,45 0 0,1 0,5 0,5 0,13

С. zeylanoides BKMY-14 0,10 ОД 0 0,1 0,4 0,1 0,10

С. zeylanoides ВКМ Y-2324 1,20 0,1 0 0,1 0,3 0,8 0,08

С. zeylanoides ВКМ Y-1543 0,10 од 0 од 0,3 0,4 0,07

С. zeylanoides ВКМ Y-2595 0,43 0,1 0 0,1 0,5 0,3 0,06

С. valida ВКМ Y-934 0 0,1 0 од 0,5 ОД 0,01

Debaromyces sp. 0,10 0,1 0 0 0,1 од 0,10

Kluyveromyces wickerhamii ВКМ Y-589 0,08 0,6 од 0 0,2 0,1 0,05

Pichia anómala BKM Y-118 0,10 0,1 0 0 0,4 0,1 0,07

P. besseyi BKM Y-2084 0,45 од 0,4 0,2 0,4 0,3 0,03

P. media BKM Y-1381 0,10 од 0,4_ од 0,3 0,1 0,04

P. guilliermondii H-P-4 0,45 од 0,08 1,0 од 0,4 0,07

Р. кuilliermondii 916 0,09 0,5 0,34 1,1 0,15 од 0,05

P. inositovora BKM Y-2494 0,38 0,09 0,5 0,1 1,3 0,4 0,05

Saccharomyces cerevisiae BKM Y-381 0,08 0,5 0,3 од 0,3 од 0,06

Torulopsis candida 127 0,07 0 0,45 од 0 0,1 0,07

T. candida 420 0,10 0,4 0,3 од 0 0,1 0,08

Yarrowia lipolylica 12a (BKM Y-2366) 0,09 од 0 0 0,5 ОД 0,06

Y. lipolylica BKMY-47 0,45 од 0,5 0,3 0,4 0,3 0,10

Y. lipolytica 69 0,50 0,1 1,2 0,4 0,3 0,4 0,12

Y. lipolytica BKM Y-5 7 0,07 0,1 од од 0,5 ОД 0,06

Y. lipolytica 212 (BKM Y-2412) 0,09 од 0,3 0,4 0,4 од 0,20

Y. lipolytica 374/4 0,08 од од 0,01 0,4 ОД 0,02

Y. lipolytica 585 0 0,08 од 0,3 0,3 0,1 0,08

Y. lipolytica 695 0,10 од 0,5 0,1 0,4 0,1 0,10

Y. lipolytica 704 (BKM Y-2373) 0,10 0 1,5 2,0 0,3 0,4 0,08

Кислоты: Ж-янтарная, УК - уксусная, Ж - лимонная, ИЖ - изолимонная,

КГК- а-кетоглутаровая, ЯбК - яблочная, ФК - фумаровая.

Наряду с ЯК накапливались и другие органические кислоты, все они относятся к ннтермедиатам основных метаболических путей окислительного обмена этанола (уксусная кислота, кислоты ЦТК - лимонная, изолимонная, а-кетоглутаровая, яблочная и фумаровая).

Два штамма С. zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5 обладали наибольшей продукцией ЯК и были отобраны для дальнейшей работы в качестве продуцентов. О способности дрожжей С. zeylanoides продуцировать Ж из этанола сообщалось ранее И.Т. Ермаковой и Р. Мандевой (1981), однако не было сведений о кислотообразующей способности других родов и видов.

2. Условия и динамика синтеза ЯК у С. zeylanoides и С. catenulata

Известно, что при культивировании микроорганизмов в условиях лимитирования роста клеток азотом существует прямая зависимость между концентрацией лимитирующего компонента в среде и плотностью биомассы (Pirt, 1975). При исследовании потребности дрожжей С. catenulata в азоте показано, что при лимитировании роста азотом линейная зависимость плотности биомассы от концентрации сульфата аммония в среде имела следующий вид: Y = 4,35х + 0,673, где Y - биомасса, г/л; х - концентрация сульфата аммония, г/л.

Использование этанола в качестве субстрата роста создаёт определённые трудности из-за токсичности этого соединения для клеток дрожжей. Высокие концентрации этанола влияют на функционирование ферментных систем клетки, тормозят рост и, в некоторых случаях, вызывают гибель микробной клетки. Особенностью роста дрожжей в среде с этанолом является экскреция ацетата, возможной причиной которой является дисбаланс между активностями алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназы и алкогольоксидазы, что установлено для продуцентов лимонной кислоты. Указывается на важное влияние цинка, интегрального компонента алкогольдегидрогеназы, на метаболизм этанола (Ильченко с соавт., 1994; Камзолова, 1995). В связи с вышеизложенным представлялось важным подобрать оптимальную концентрацию этанола и цинка, при которой углеродной поток будет направлен не на экскрецию ацетата, а в ЦТК.

Влияние этанола на рост дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides исследовали в диапазоне концентраций этанола от 0,2 до 24,0 г/л на полноценной питательной среде.

Данные, представленные на рис. 1, показывают, что у С. catenulata максимальная удельная скорость роста (цтах) наблюдалась при концентрации этанола, равной 0,24),8 г/л. Для С. zeylanoides максимальные значения цшах обнаружены в более широком диапазоне концентраций этанола (0,2 - 2,4 г/л). При повышении концентрации этанола выше 4 г/л у обоих штаммов было отмечено значительное снижение удельной скорости роста. Для последующей работы было рекомендовано дробное внесение этанола в среду культивирования не выше 1,0 г/л для С. catenulata и 3,0 г/л для С. zeylanoides.

6 12 18 Этанол (г/л)

Рве. 1. Зависимость максимальной удельной скорости роста С. сагепиЫа (о) и С. геукгпоМез (м) от содержания этанола в среде.

При исследовании влияния цинка на рост дрожжей и синтез Ж было показано, что концентрация ионов цинка является эффективным фактором, регулирующим рост клеток и синтез ЯК (табл. 2). У С. zeylanoid.es концентрация ионов ЪхР ниже 0,2 мг/л лимитировала рост культуры, накопление биомассы составляло менее 1,0 г/л, и синтез ЯК отсутствовал. Повышение концентрации ионов Ъ^* в среде с 0,2 мг/л до 1,0 мг/л приводило к увеличению биомассы и синтезу ЯК. Дальнейшее повышение концентрации ионов ЪкР до 20,0 мг/л вызывало снижение синтеза ЯК. При концентрации ионов гп2+, равной 26 мг/л, синтез ЯК был ингибироваи. Концентрация ионов Ъ^*, равная 0,4 мг/л, была оптимальной для роста С. :еу1апоМез и продукции ЯК. Для С. са!епи1аШ обнаружен более широкий диапазон концентраций ионов Тп * (0,02 - 200 мг/л), оптимальных для роста клеток и биосинтеза Ж. Наибольшая продукция Ж наблюдалась при концентрации ионов 2п1+, равной 26 мг/л.

Таблица 2. Влияние ионов цинка на накопление биомассы и синтез Ж дрожжами

Ъп1* (мг/л)

0,02 [ ОД 1 0,2 | 0,4 | 1,0 | 5,0 [ 10.0 | 20 | 26 [ 50 | 75 | 200 | 300

С. геу1апо1ск1

Биомасса (г/л)

ЯК (г/л)

УЯк (%)

Ж (г/г клеток)

0,3

0,9

2,5

1.0

2,7

3,2

1,2

2,6

3,1

1,2

2,5

1,0

2,0

1,0

2,0

1,6

0,8

1,5

0,7

0,5

0,3

ОД

н.о.

С. сМепиЫа

Биомасса (г/л)

ЯК (г/л)

УЖ(%)

1 Ж (г/г клеток)

2,0

1,0

3,0

1,0

3,0

1,0

3,1

3,7

1,2

ЗД

3,7

1,2

3,2

4,5

1,4

3,2

4,5

1,4

3,2

4,5

1,4

3,2

4,7

1,5

3,3

4,2

1,3

3,3

1,0

3,1

2,2

0,7

2,6

Дрожжи выращивали в колбах в условиях лимитирования роста азотом 6 суток

Эти наблюдения, на наш взгляд, являются довольно убедительным примером особо важной роли цинка при выращивании дрожжей на этаноле, на которую следует обратить внимание при составлении минеральных сред и, особенно при масштабировании процесса получения ЯК.

При исследовании влияния аэрации на рост дрожжей С. сШепиШа и синтез ЯК было показано, что в условиях высокой аэрации среды (при культивировании в колбах с 50 мл среды) клетки синтезировали в 1,8 раза больше ЯК, чем в условиях с низким содержанием кислорода (100 мл) при малоизменяющейся плотности биомассы (табл. 3). При лимите кислорода в среде (200 мл) накопления ЯК не происходило. Таким образом, синтез ЯК у С. сШепиЫа зависел от интенсивности аэрации культуры кислородом.

Таблица 3. Влияние аэрации на накопление биомассы и синтез Ж у С. catenulata

Параметры Объем среды в колбе (мл)

200 100 | 50

Уровень кислорода в среде

0,24 ммоль СУл мин 0,3 ммоль Од/л мин 0,56 ммоль 02/л мин

Биомасса (г/л) 2,8 2,9 3,0

ЯК (г/л) 0 1,5 4,5

Уж(%) 0 26,0 50,0

Ж (г/г клеток) 0 0,5 1,5

Дрожжи выращивали в колбах в условиях лимитирования роста азотом 6 суток

Результаты оптимизации условий роста и кислотообразования дрожжей С. zeylanoides и С. catenulata легли в основу эксперимента в условиях глубинного периодического культивирования в 10-ти л ферментере АНКУМ-2М с контролируемыми значениями температуры, рН и р02. Культивирование проводили в условиях высокой аэрации (р02 55-60% от насыщения); содержание цинка (ZnSO,-6H20) составляло 2,678 г/л для С. catenulata и 0,033 г/л для С. zeylanoides; концентрация сульфата аммония составляла 6 г/л. Этанол в среду культивирования вносили дробно по 1,0 г/л для С. catenulata и 3,0 г/л для С. zeylanoides по мере потребления. Данные о динамике роста, потребления азота и накопления Ж и яблочной кислоты представлены на рис. 2.

В период активного роста клеток выделение ЯК в среду не наблюдалось. Экскреция ЯК начиналась в фазе замедления роста (после 15 ч) и при переходе клеток в стационарную фазу, вызванную исчерпанием азота из среды; на 68 ч С. catenulata продуцировали 5,2 г/л, а С. zeylanoides - 9,4 г/л ЯК. Одновременно с ЯК накапливалась яблочная кислота в соотношении 1,3 : 1,0 для С. catenulata и 1,1: 1,0 для С. zeylanoides, что делало продолжение процесса нецелесообразным.

Выход Ж (Уж), характеризующий количество Ж (г), образуемой при потреблении 100 г этанола, составлял 32,6% для С. catenulata и 39,0% для С. zeylanoides. Согласно литературным данным значение Уж у другого штамма С. brumptii IFO 0731- продуцента Ж в среде с н-алканами составлял 67% (Sato et al., 1972).

С. catenulata С. zeylanoides

Время (ч) Время (ч)

Рис. 2. Динамика роста (•), потребления сульфата аммония (о) и продукции Ж (А) и яблочной кислоты (■).

Данные, характеризующие эффективность процессов роста и синтеза ЯК у дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides представлены в табл. 4. Выход клеток по массе (Yx/s), характеризующий количество биомассы (г), образуемой при потреблении 100 г этанола, составлял 67% у С. catenulata и 63% у С. zeylanoides. Максимальная удельная скорость роста дрожжей (Цпих) составляла 0,35 ч* для С. catenulata и 0,31 ч1 для С. zeylanoides.

Однако, поскольку равные количества различных углеродных субстратов имеют разную энергетическую ёмкость, неправомерно сравнивать значения полученные при культивировании дрожжей на разных субстратах. Поэтому для оценки эффективности кислотообразования использовали также показатель энергетического выхода ЯК (т|ж). Параметр Т1ж характеризует долю энергии использованного субстрата (этанола), перешедшего в ЯК. Значение Т|як вычисляли на основании теории материально-энергетического баланса (Minkevich, 1983; Erickson et al., 2000).

Таблица 4. Рост и биосинтез Ж у дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides

Параметры С. catenulata С. zeylanoides

Выход биомассы (Гж) (%) 67,0 63,0

Максимальная удельная скорость роста (цтах) (ч"1) 0,35 0,31

Ж (г/л) 5,2 9,4

Выход Ж (Уяк) (%) 32,6 39,0

Энергетический выход (ляк) (%) 14,8 17,8

Яблочная кислота (г/л) 4,0 8,8

/йгео-0(5)-изолимонная кислота (г/л) 1,0 1,7

Значения т|да у С. caíemilala к С. zeylanoides составили 14,8% и 17,8%, соответственно, и сопоставимы с величиной 18,7%, полученной для штамма С brumptii IFO 0731 при росте на н-алканах (Sato et а!., 1972).

3. Участие глиоксилатного цикла в биосинтезе ЯК из этанола

При росте на этаноле у дрожжей наряду с ЦТК активно функционирует глиоксилатный цикл (ГЛЦ), который предположительно может служить дополнительным источником образования ЯК в дрожжевой клетке.

С целью доказательства высокой значимости ГЛЦ в биосинтезе ЯК проведено определение активности ферментов ЦТК и ГЛЦ у С. catenulata в период роста (12 ч) и продукции ЯК (48 ч) (рис. 3). Установлено, что для дрожжей характерна высокая активность цитратсинтазы, особенно в условиях синтеза ЯК (3,45 Ед./ мг белка). Клетки С. catenulata в период роста и синтеза ЯК имели также высокую активность аконитат-гидратазы, осуществляющей взаимопревращения цитрата в изоцитрат.

В метаболизме изоцитрата могут принимать участие НАД- и НАДФ-зависимые изоцитратдегидрогеназы и изоцитрат-лиаза. НАД-изоцитрат-дегидрогеназа проявляла довольно низкую активность как в фазе роста, так и при синтезе ЯК (0,03 Ед./мг белка), НАДФ-зависимый фермент имел активность в 3 раза выше.

3,5 3

Активность 2,5 фермента (мкмоль

1 S

продукта/мин мг 1 >-белка) 1

0,5 0

Рост Синтез

Г» ЦС Е АК ■ НАД-ИЦДГ в НАДФ-ИЦДГ ■ кгдг а ицл □ мс

Рис. 3. Активности ферментов ЦГК и ГЛЦ у С. сШепиШа при росте на этаноле в условиях синтеза ЯК. Активности ферментов определяли в бесклеточных гомогенатах, содержащих ферменты, как цитоплазмы, так и митохондрий.

ЦС - цитратсинтаза, АК - ахонитат-гидратаза, НАД- и НАДФ-ИЦДГ - изоцитрат-дегидрогеназа, КГДГ - кетоглутаратдегидрогеназа, ИЦЛ - изоцитрат-лиаза, МС -малат-синтаза.

Низкая активность НАД-изоцитратдегидрогеназы в ЦТК уже предполагает и низкую активность последующего фермента кетоглутаратдегидрогеназы (0,01 -0,02 Ед./мг белка). Низкая активность НАД-изоцитратдегидрогеназы и кетоглутаратдегидрогеназы позволяют заключить, что эти ферменты не играют существенной роли в метаболизме этанола у С. ссИепиШа, и по-видимому, сукцинат не может образовываться через ЦТК.

Одним из основных источников образования сукцината должна являться изоцитрат-лиазная реакция; действительно, активность изоцитрат-лиазы сохранялась на высоком уровне в экспоненциальной фазе и поддерживалась достаточно высокой в период синтеза ЯК (0,64 Ед./мг белка).

Дополнительным доводом в пользу предположения основной роли ГЛЦ в образовании ЯК явилось сравнительное изучение активности изоцитрат-лиазы у 11 штаммов дрожжей, способных к продукции ЯК на этаноле. Дрожжи культивировали в аэрируемых условиях на качалке и колбах с 50 мл среды при температуре 28-30 "С в условиях лимитирования роста азотом. Активность изоцитрат-лиазы определяли через 24 ч после перехода культуры в стационарную фазу в условиях синтеза ЯК. В качесгве контроля использовали рост этих штаммов на глюкозе, когда синтез ЯК был незначительный (табл. 5). У всех штаммов при росте на этаноле активность изоцитрат-лиазы была существенно выше активности фермента у клеток, растущих на глюкозе.

Рассмотренные выше данные позволяют сделать заключение, что сверхсинтез ЯК у исследуемых дрожжей является результатом активного функционирования ГЛЦ на среде с этанолом.

Таблица 5. Активность изоцитрат-лиазы при росте дрожжей на этаноле и глюкозе

Организм Этанол Глюкоза

ЯК Изоцитрат- ЯК Изоцитргг-

(г/г) лиаза (г/г) лказа

(Ед./мг белка) (Ед./мг белка)

С. сШепиШа ВКМ У-5 1,50 0,640 0,05 0,036

С. раШ^епа ВКМ У-2443 0,40 0,211 0,01 0,020

С. 1¿Н/м ВКМ У-74 0,42 0,423 0,02 0,019

С. :еу1апЫ<кз ВКМ У-6 0,50 0,650 0,01 0,050

С. :гу!апо1<1е* ВКМ У-2324 1,20 0,727 0,05 0,040

С. :еу1апо1(к! ВКМ У-2595 0,43 0,560 0,02 0,030

Р. Ье^еу! ВКМ У-2084 0,45 0,706 0,01 0,087

Р. йыИИегтопеШ Н-Р-4 0,45 0,803 0,01 0,078

Р. ¡по51(о\ога ВКМ У-2494 0,38 0,700 0,01 0,078

У. Иро1уИса ВКМ У-47 0,45 0,475 0,02 0,030

У. Прайса 69 0,50 0,500 0,02 0,028

4. Метод получения ЯК с использованием дрожжей Y. lipolytica

Поскольку при практическом получении ЯК из культуральной жидкости дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides возникли затруднения с очисткой целевого продукта от других органических кислот, и оптимизация условий роста и состава питательной среды не позволила повысить продуктивность синтеза ЯК у исследуемых штаммов дрожжей, целью следующего раздела работы явилось изучение других подходов к получению Ж с использованием дрожжей.

Известна химическая реакция декарбоксилирования КГК до ЯК под воздействием Н2О2 и КМПО4:

СООН -СН2-СН2-СО-СООН + Н202 = СООН -СН2-СН2-СООН + С02 + Н20

Сравнительно недавно показано, что декарбоксилирование КГК при окислительном стрессе в присутствии перекиси водорода приводит к образованию Ж, которая затем активно окисляется в митохондриях (Fedotcheva et al.s 2006). Данный процесс позволяет шунтировать ЦТК в условиях окислительного стресса.

Представляло интерес изучить возможность практического применения данной реакции декарбоксилирования КГК до ЯК в присутствии окислителя перекиси водорода для разработки микробиологического способа получения Ж.

В рамках выполнения этой задачи был отобран штамм-продуцент КГК; проверена возможность проведения реакции декарбоксилирования КГК до ЯК в фильтрате культуральной жидкости, и разработан двухстадийный способ получения Ж из этанола, включающий микробиологический синтез КГК тиаминауксотрофными дрожжами Y. lipolytica и ее дальнейшее химическое окисление до Ж под воздействием перекиси водорода.

Дрожжи вида Y. lipolytica были выбраны для получения КГК из-за отсутствия у них способности синтезировать пиримидиновую часть молекулы тиамина. При дефиците тиамина происходит резкое снижению активности а-кетоглутаратдегидрогеназы, содержащей тиаминпирофосфат в качестве кофактора, и в результате этого большая часть образующейся КГК выделяется из клетки в культуральную жидкость.

Среди изученных тиаминауксотрофных дрожжей штамм Y. lipolytica 212 (ВКМ Y-2412) отобран как наиболее активный продуцент. На рис. 4 представлена динамика роста Y. lipolytica 212 и накопления КГК.

В первые сутки культивирования происходило размножение клеток и увеличение биомассы, после чего культура переходила в фазу замедления роста, вызванную исчерпанием из среды тиамина. В этот момент происходило начало синтеза КГК. После 6 суток скорость биосинтеза КГК заметно снижалась, и к концу культивирования (8 суток) в культуральной жидкости накапливалось 14,9 г/л (102 мМ/л) КГК.

Время (сутки)

Рис. 4. Динамика роста дрожжей К \ipolyiica 212 (•) и образования КПС (Д) в среде с этанолом.

Образец культуральной жидкости, содержащий КГК в концентрации 14,9 г/л (102 мМ/л), инкубировали в течение 1 ч в присутствии различных концентрации Н202. Сравнительный анализ НРЬС-хроматограмм стандартных растворов ЯК и КГК (а), образцов культуральной жидкости до инкубации (б) и после инкубации в течение 1 ч в присутствии разных концентраций Н202 (в, г) представлен на рис. 5. В культуральной жидкости до инкубации обнаружен только пик КГК (14,9 г/л; время 8.33 мин) (б), в то время как в присутствии 100 мМ/л Н202 наряду с пиком КГК обнаруживается пик ЯК (время 9.73 мин) (в), т.е. при окислении 7,1 г/л (48 мМ/л) КГК образуется 3,39 г/л (29 мМ/л) ЯК.

¡д-^ 9 73 мин ! .33 мин А

Л"

Время элюции (мин)

Рис. 5. Сравнительный анализ НРЬС-хроматограмм стандартных растворов Ж и КГК (а), образцов культуральной жидкости до инкубации (б) и после инкубации в течение 1 ч в присутствии разных концентраций Н202: 100 мМ/л Н202 (в) и 560 мМ/л Н202 (г).

При инкубации фильтрата культуральной жидкости с 560 мМ/л Н202 в культуральной жидкости обнаружен только пик ЯК (время 9.73 мин) (г), т.е. наблюдается полное окисление 14,9 г/л (102 мМ/л) КГК до ЯК, концентрация которой составила 12 г/л (102 мМ/л).

Ниже приведены данные о динамике образования ЯК у У. lipolytica 212 в присутствии Н202(рис. 6). Дрожжи выращивали в присутствии 100 мМ/л Н202, которая вносилась периодически и не ингибировала рост клеток. Увеличение концентрации Н202 в среде до 750 мМ/л приводило к снижению жизнеспособности клеток на 50%, а при 1100 мМ/л Н202 рост клеток был ингибирован (данные не представлены).

Культивирование дрожжей в присутствии 100 мМ/л Н202 практически не влияло на рост продуцента, в то время как процесс кислотообразования был значительно изменен. Процесс в присутствии Н202 шел с постоянной скоростью кислотообразования в течение длительного времени (8 сут), к концу культивирования концентрация Ж составляла 16,4 г/л (140 мМ/л) ЯК.

Таким образом, в присутствии Н202 эффективность образования ЯК увеличивалась на 37% с 12 г/л ЯК (при культивировании дрожжей без Н202 и последующей обработки ею КГК до Ж) до 16,4 г/л ЯК (при культивировании дрожжей в присутствии Н202).

Процесс получения ЯК из КГК в среде с этанолом в присутствии Н202 был проведен в 10-ти литровом ферментере АНКУМ-2М в условиях лимитирования роста клеток тиамином. В качестве контроля проводили культивирование дрожжей Y. lipolytica 212 без добавления Н202. При культивировании дрожжей Y. lipolytica 212 без добавления Н202 (рис. 7а) на 8 суток культивирования концентрация КГК составляла 60,8 г/л (416 мМ/л). Содержание других органических кислот было незначительным. При обработке фильтрата культуральной жидкости с Н202 концентрация ЯК составила 49,1 г/л (416 мМ/л).

1111

2 3 4 5 6 7

Время (сутки)

Рис. 6. Динамика роста (•), образования КГК (Л) и ЯК (Ж) у К. Пропса 212 в среде с этанолом в присутствии Н202. Стрелки указывают время добавления 100 мМ/л Н202 (общее количество 400 мМ/л).

Культивирование дрожжей V. Про1уИса 212 в присутствии Н2О2 не оказывало заметного влияния на накопление биомассы, однако процесс кислотообразования был более интенсивным (рис. 76). В ходе культивирования в несколько приемов была внесена Н202 (560 мМ/л), при которой происходило частичное окисление КГК до ЯК; На 8 сутки культивирования в присутствии Н202 в культуральной жидкости накапливалось 60,8 г/л КГК и 14,3 г/л ЯК с незначительным содержанием других кислот.

Следует отметить, что имелись некоторые трудности с проведением процесса культивирования дрожжей в присутствии Н202 (при окислении КГК до ЯК происходило образование углекислого газа и пенообразование), что с технологической точки зрения мешало проведению процесса в ферментёре. Поэтому дальнейшая работа по полному окислению КПС до ЯК проводилась уже в фильтрате культуральной жидкости, а не в ферментёре.

При инкубации фильтрата культуральной жидкости с Н202 наблюдалось полное окисление 60,8 г/л (416 мМ/л) КГК до Ж (на НРГС-хроматограмме обнаружен только пик Ж); суммарная концентрация Ж (14,3 г/л + 49,1 г/л) составила 63,4 г/л (537 мМ/л).

Таким образом, в данном разделе работы была показана принципиальная возможность получения ЯК из КГК при культивировании дрожжей У. Чро1уИса 212 в присутствии Н202. Такой способ получения ЯК позволил повысить эффективность процесса на 29% (с 416 мМ/л до 537мМ/л ЯК) в сравнении с культивированием дрожжей без Н202.

По-видимому, в отсутствие Н202 накопление КГК в среде тормозит функционирование ЦТК и синтез КГК в этом цикле.

012345678 012345678

Время (сутки) Время (сутки)

Рис. 7. Динамика роста (•) К lipolytica 212 и образования ЯК (А) и КГК (Д) без добавления перекиси водорода (а) и в присутствии перекиси водорода (б). Стрелками указано добавление Н202.

Показано ингибирование кетоглутаратом мультиферментного комплекса ЦТК цитратсинтаза/малатдегидрогеназа (Fabien et al., 1988). Процесс в присутствии Н202 позволяет непрерывно удалять часть образующейся КГК и снимать ее ингибирующее воздействие на продуцент.

5. Выделение ЯК из пермеата и очистка до высокой чистоты

Разработанный метод выделения Ж базировался на относительно хорошей растворимости этой кислоты в органических растворителях. Последовательность операций сводилась к разложению остаточных количеств перекиси водорода, обесцвечиванию нативного раствора, его подкислению минеральной кислотой и концентрированию. ЯК экстрагировали этанолом, спирт отгоняли и остаток перекристаллизовывали. Чистота получаемого продукта (процентное содержание ЯК в препарате) - 99,9%. Температура плавления 187-188 °С сопоставима с литературными данными (тр 185-191 °С, Fluka 2005/2006).

6. Сравнение биохимических свойств ЯК

Исходя из предположения, что ЯК, образуемая в результате декарбоксилирования КГК перекисью водорода, может отличаться по своим биохимическим свойствам от ЯК, образуемой в ЦТК, проверили влияние продукта на основные функции митохондрий. В качестве эталона применяли Ж фирмы Sigma, обычно используемую в биохимических исследованиях. Сравнение двух препаратов проводили по таким параметрам, как АДФ-стимулируемое дыхание, поскольку АДФ обладает большим влиянием на скорость дыхания митохондрий по сравнению с субстратом; дыхательный контроль (изменение скорости дыхания с изменением концентрации АДФ) и чувствительность к малонату - инибитору дыхания митохондрий.

В табл. 6 представлены параметры дыхания митохондрий печени крыс при использовании в качестве субстратов окисления коммерческой Ж (Sigma) и Ж, произведённой в ИБФМ в результате настоящей работы. Как видно из табл. 6, различия между ними минимальны в отношении скорости АДФ-стимулируемого дыхания (179,6 нг ат О/мин для коммерческой ЯК фирмы Sigma и 171,1 нг ат О/мин для Ж, синтезируемой микробиологическим способом). Препарат ИБФМ имеет более высокий дыхательный контроль (на 8%) и большую чувствительность к малонату (на 29%).

Идентичность коммерческой Ж (Sigma) и ЯК, произведенной в ИБФМ, подтверждается и данными по сравнению их влияния на мембранный потенциал митохондрий.

Таблица 6. Сравнение биохимических показателей ЯК

Параметры Ж (ИБФМ) Ж (Sigma)

Скорость дыхания (нг ат О/мин) при добавлении 0,2 мМ АДФ 171,1 179,6

Дыхаггельный контроль 3,9 3,6

% ингибирования малонатом (1мМ) 36,0 25,6

Этот метод позволяет тестировать более низкие концентрации субстрата и регистрировать сдвиги в степени энергизации митохондрий по изменению величины трансмембранного электрохимического потенциала ионов водорода Дцн+ на внутренней мембране митохондрий.

Величину мембранного потенциала оценивали по аккумуляции липофнльного катиона тетрафенилфосфония (ТФФ+) с помощью ионселективного мембранного электрода. Сигнал с ТФФ+-чувствительного электрода через иономер поступал на регистрационный потенциометр. Ингибирование процесса дыхания проводили с помощью малоната и ротенона. Из рис. 8 видно, что оба препарата оказывали одинаковый эффект при равных концентрациях и малонат в равной степени ингибировал окисление обоих препаратов ЯК, снижая мембранный потенциал до одного и того же уровня.

Концентрация ТФФ+ мкМ

0,9 0,8 0,7 -0,6 0,5 0,4 0,3

ол ■ 0,1 ■ 0

Ротенон

Малонат

200

600

800

400 Время (с)

Рис. 8. Сравнение мембранного потенциала митохондрий при окислении Ж (ИБФМ) (1) и коммерческой Ж (Sigma) (2).

После снижения мембранного потенциала ротеноном при ингибировании эндогенного дыхания добавление Ж по 50 мкМ приводило к градуальному повышению потенциала. Таким образом, при низких концентрациях Ж различия между препаратами минимальны. Это означает, что Ж, как продукт, образуемый окислением КГК перекисью водорода, транспортируется в митохондрии и эффективно окисляется сукцинатдегидрогеназой.

В итоге настоящей работы показана возможность практического получения ЯК из этанола при культивировании дрожжей; подобраны условия, обеспечивающие максимальную продукцию ЯК; разработан процесс получения и выделения ЯК; проведено испытание влияния полученного препарата на основные функции митохондрий. Полученный препарат Ж может применяться в сельском хозяйстве, медицине и пищевой промышленности, где предъявляются высокие требования к чистоте используемых продуктов.

ВЫВОДЫ

1. Установлена способность дрожжей различного таксономического положения синтезировать янтарную кислоту из этанола. Показано, что многие виды родов Candida, Pichia, Yarrowia образуют, наряду с другими органическими кислотами, янтарную кислоту в условиях лимитирования роста азотом. Наиболее активными продуцентами янтарной кислоты являлись штаммы Candida zeylanoides ВКМ Y-2324 и Candida catenulata В KM Y-5.

2. Показано, что условия культивирования продуцентов (концентрация растворенного кислорода, азота, этанола и ионов Zn2+) определяют качественный и количественный состав экскретируемых веществ. Для продуцентов С. zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5 подобраны оптимальные условия для роста и синтеза янтарной кислоты: высокая аэрация среды; содержание этанола не выше 1,0 г/л для С. catenulata и 3,0 г/л для С. zeylanoides; повышенное содержание ионов цинка - 0,4 мг/л для С. zeylanoides и 26,0 мг/л для С. catenulata.

3. Показано, что сверхсинтез янтарной кислоты у С. zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5 обусловлен особенностью функционирования глиоксилатного цикла. В условиях лимитирования роста азотом сохраняется высокая активность ферментов цитратсинтазы, аконитат-гидратазы, и изоцитрат-лиазы, обеспечивающих образование Ж.

4. Разработан двухстадийный способ получения янтарной кислоты из этанола, включающий микробиологический синтез а-кетоглутаровой кислоты тиаминауксотрофными дрожжами Yarrowia lipolytica 212 (ВКМ Y-2412) и ее дальнейшее химическое декарбоксилирование до янтарной кислоты под воздействием перекиси водорода. Максимальная концентрация янтарной кислоты составила 63,4 г/л.

5. Разработан способ выделения янтарной кислоты, включающий стадии разложения остаточных количеств перекиси водорода, подкисления и концентрирования культуральной жидкости, экстракции янтарной кислоты этанолом и дальнейшей её перекристаллизации с целью очистки до высокой чистоты.

6. Высокое качество полученного препарата и его соответствие квалификации "biochemical grade" подтверждено результатами исследования его окисления митохондриями животных в сравнении с коммерческим препаратом фирмы Sigma.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Юсупова А.И., Камзолова С.В., Козырева Т.М., Моргунов И.Г. Биосинтез янтарной кислоты дрожжами из этилового спирта Н Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2006. Т. 2. №4, С. 7-13.

2. Kamzolova S.V., Yusupova A.I., Vinokurova N.G., Fedotcheva N.I., Kondrashova M.N., Finogenova T.V., Morgunov I.G. Chemically assisted microbial production of succinic acid by the yeast YarrovAa lipolytica grown on ethanol // Applied Microbiology and Biotechnology. 2009. V. 83. № 6. P. 10271034.

3. Kamzolova S.V., Yusupova A.I., Dedyukhina E.G., Chistyakova T.I., Kozyreva T.M. and Morgunov I.G. Succinic acid synthesis by ethanol-grown yeast // Food Technology and Biotechnology. 2009. V. 47. № 2. P. 144-152.

4. Yusupova A.I., Kamzolova S.V., Vinokurova N.G., Morgunov I.G. Process for the production of succinic acid by Yarrowia lipolytica yeast // The FEBS Journal. 2010. V. 277. Suppl. 1. P. 303.

Статьи в научных сборниках н других изданиях

1. Юсупова А.И., Камзолова С.В., Винокурова Н.Г., Козырева Т.М., Моргунов И.Г. Биосинтез янтарной кислоты микроорганизмами // Материалы VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2008. С. 256-258.

2. Юсупова А.И., Камзолова С.В. Скрининг дрожжевых организмов-продуцентов янтарной кислоты // Материалы Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», Москва -Пущино, 2008. С. 185-186.

3. Юсупова А.И., Камзолова С.В., Моргунов И.Г. Получение янтарной кислоты с использованием дрожжей Yarrowia lipolytica II Материалы 12-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 2008. С. 235-236.

4. Юсупова А.И., Камзолова С.В., Моргунов И.Г. Биосинтез а-кетоглутаровой кислоты и янтарной кислоты из и-алканов у дрожжей Yarrowia lipolytica // Материалы 12-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 2008. С. 236.

5. Камзолова С.В., Юсупова А.И., Винокурова Н.Г., Федотчева Н.И., Кондрашова М.Н., Финогенова Т.В. Микробиологический способ получения янтарной кислоты // Материалы пятого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Москва, 2008. С. 65-66.

6. Юсупова А.И., Моргунов И.Г., Камзолова C.B., Фатыхова А.Р., Лунина Ю.Н. Микробиологический способ получения янтарной кислоты // Материалы российского молодёжного инновационного конвента, Москва, 2008. С. 70-71.

7. Юсупова А.И., Моргунов И.Г. Влияние условий культивирования на рост С. catenulata ВКМ Y-5 и С. zeylanoides ВКМ Y-2324 - продуцентов янтарной кислоты // Материалы 14-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 2010. С. 308-309.

8. Юсупова А.И., Камзолова C.B., Винокурова Н.Г., Моргунов И.Г. Биосинтез янтарной кислоты из л-ал капов // Материалы VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2010. С. 181-182.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор искренне признательна сотрудникам, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: д.б.н. Кондрашовой М.Н., к.б.н. Федотчевой Н.И. (ИТЭБ РАН), д.б.н. Финогеновой Т.В., к.б.н. Дедюхиной Э.Г., Винокуровой Н.Г., к.б.н. Самойленко В.А., к.б.н. Чистяковой Т.И., Фетисову В.В., а также всем сотрудникам лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов (ИБФМ РАН, г. Пущино).

Особую благодарность автор выражает своим наставникам и учителям - д.б.н. Моргунову И.Г. и к.б.н. Камзоловой C.B. за постоянное внимание и поддержку.

Подписано в печать:

03.05.2011

Заказ № 5443 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юсупова, Алсу Ильдаровна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микробиологический синтез органических кислот

1.2. Янтарная кислота, её характеристика и применение

1.3. Продуценты янтарной кислоты и условия их культивирования

1.3.1. Дрожжи-продуценты янтарной кислоты

1.3.2. Грибы-продуценты янтарной кислоты

1.3.3. Бактерии-продуценты янтарной кислоты

1.4. Механизмы биосинтеза янтарной кислоты

1.5. ■ Этанол, как субстрат для получения янтарной кислоты

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Объекты исследования

2.2. Культивирование дрожжей

2.2.1. Состав и подготовка основной среды

2.2.2. Подготовка посевного материала

2.2.3. Методы культивирования дрожжей

2.3. Метод получения янтарной кислоты из культуралыюй жидкости дрожжей

У. Ъро1уИса ^З

2.3.1. Сепарирование биомассы и получение пермеата культуральной жидкости

2.3.2. Обработка пермеата перекисью водорода

2.3.3. Выделение целевого продукта

2.4. Аналитические методы

2.4.1. Методы контроля роста дрожжей

2.4.2. Определение концентрации этанола и аммонийного азота

2.4.3. Определение концентрации органических кислот

2.4.4. Определение концентрации изолимонной, а-кеюглутаровой и янтарной 46 кислот энзиматическим методом

2.4.5. Определение содержания липидов

2.5. Определение активности ферментов

2.6. Методы определения выживаемости клеток У. Иро1уйса

2.7. Биохимическая характеристика препарата янтарной кислоты

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Биосинтез янтарной кислоты у дрожжей С. са(епи1Ша и С. 2ву1апоШез

3.1.1. Скрининг дрожжей и отбор штаммов-продуцентов янтарной кислоты на среде с этанолом

3.1.2. Оптимизация условий культивирования и состава питательной среды для дрожжей С. сШепиШа и С. геу1апо1с1е$

3.1.2.1. Влияние концентрации сульфата аммония на рост дрожжей С. сШепиШа

3.1.2.2. Влияние концентрации этанола на рост дрожжей С. сШепиШа и С. геу1апо1с1е$

3.1.2.3. Влияние концентрации цинка на рост дрожжей С. сШепиШа и С. геу1апо1с1ех и накопление янтарной кислоты

3.1.2.4. Влияние аэрации на рост дрожжей С. сШепиШа и накопление янтарной кислоты

3.1.3. Динамика роста С. сШепиШа и С. zeylanoid.es и экскреция метаболитов

3.1.4. Динамика накопления запасных веществ у дрожжей С. сШепиШа и С. 2еу1апо1йез

3.1.5. Участие глиоксилатного цикла в биосинтезе янтарной кислоты из этанола

3.2. Метод получения янтарной кислоты с использованием дрожжей Г. Иро1уйса

3.2.1. Отбор продуцента и условия биосинтеза а-кетоглутаровой кислоты дрожжами

3.2.2. Реакция декарбоксилирования а-кетоглутаровой кислоты до янтарной кислоты в культуральной жидкости

3.2.3. Влияние перекиси водорода на выживаемость Г. Иро1уИса 212 и количество образуемой янтарной кислоты из а-кетоглутаровой кислоты

3.2.4. Культивирование дрожжей У. Иро1уйса 212 в присутствии перекиси водорода

3.2.5. Культивирование дрожжей У. Иро1уНса 212 в ферментере с целью наработки янтарной кислоты

3.3. Выделение ЯК из культуральной жидкости дрожжей У. Иро1уНса

3.4. Биохимическая характеристика препарата янтарной кислоты

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 92 ВЫВОДЫ 95 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96 Приложение 1 117 Приложение 2 118 Приложение

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДГ — алкогольдегидрогеназа

АК — аконитат-гидратаза

АлДГ - альдегиддегидрогеназа

АО - алкогольоксидаза

АТФ - аденозинтрифосфат

ГЛЦ - глиоксилатный цикл

ИДГ - изоцитратдегидрогеназа

ИЛК - трео-Вз(+)-изолимонная кислота

КГК — а-кетоглутаровая кислота

ЛК - лимонная кислота

МДГ - малатдегидрогеназа

НАД(Н) - никотинамидадениндинуклеотид (восстановленный)

НАДФ(Н) - никотинамидадениндинуклеотидфосфат (восстановленный)

ПВК — пировиноградная кислота

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

УК - уксусная кислота

ЦС - цитратсинтаза

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

Ф - фумараза

ФЕП - фосфоенолпируват

ФК — фумаровая кислота

ЯК — янтарная кислота

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез янтарной кислоты дрожжами из этанола"

Актуальность проблемы

Янтарная кислота (ЯК) широко используется в химической промышленности в качестве исходного сырья для производства различных четырехуглеродных соединений; на её основе получают биодеградируемые полимеры, применяемые при производстве пищевых плёнок и упаковок, средств личной гигиены и одноразовой посуды. В пищевой промышленности ЯК применяется в качестве пищевой добавки, подкислителя и консерванта. В последние годы ЯК стала применяться в здравохранении. Исследованиями научной школы М.Н. Кондрашовой (ИТЭБ РАН) показано, что ЯК является сигнальным веществом, связывающим энергетическую и гормональную системы организма. На основании этих исследований разработан ряд биологически активных добавок и лекарственных средств на основе ЯК. Производство ЯК ежегодно возрастает не менее, чем на 10% (Sauer et al., 2008).

В настоящее время ЯК получают методом-химического синтеза из малеиновой кислоты или ее ангидрида, с использованием дорогостоящего катализатора ванадия. Известно, что малеиновая кислота и соединения ванадия являются клеточными ядами, и даже небольшие их примеси резко снижают качество ЯК. Также для получения ЯК используется процесс термического разложения янтаря и его очистки путем многократной перекристаллизации; однако этот процесс является дорогостоящим.

В последние годы наиболее перспективным рассматривается микробиологический синтез ЯК, при котором произведенный продукт характеризуется высокой чистотой и по своему конформерному составу близок к природной субстанции. По оценке специалистов замена химического-метода получения'ЯК на микробиологический снизит не только риск загрязнения окружающей среды, но и увеличит производство ЯК с 16 до 270 ООО т/год, что, в свою очередь, может существенно расширить сферы применения ЯК и химических соединений, полученных на её основе.

В литературе имеется мало сведений о сверхсинтезе ЯК микроорганизмами. В лабораториях США, Китая и Франции предпринимались попытки разработать промышленный процесс получения ЯК с помощью различных генетически-модифицированных мутантных штаммов анаэробных бактерий Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Escherichia coli и Mannheimia succiniciproducens при их росте на углеводах. Эти работы не привели к положительным результатам в связи с тем, что мутанты со временем теряли свою кислотообразующую активность. Имеются данные о сверхсинтезе ЯК у аэробных организмов - дрожжей и грибов (Sato et al., 1972; Ермакова, Мандева, 1981), но дальнейшего развития эти исследования не получили. Большая потребность в. ЯК при всей сложности её химического синтеза, делает проблему разработки микробиологического способа её получения весьма актуальной.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение закономерностей синтеза ЯК дрожжами из этанола и разработка способа получения и выделения этого продукта. В число основных задач входило:

1. Изучение способности дрожжей различного таксономического положения синтезировать ЯК;

2. Определение условий культивирования дрожжей, оптимальных для получения ЯК;

4. Разработка микробиологического способа получения ЯК из а-кетоглутаровой кислоты (КГК) с участием тиаминауксотрофных дрожжей Yarrowia lipolytica',

5. Разработка метода выделения и очистки препарата ЯК высокой чистоты;

6. Сравнение биологической активности полученного препарата с коммерческими* синтетическими препаратами.

Научная новизна работы'

Впервые установлена'принципиальная возможность направленного, синтеза ЯК дрожжами из этанола при лимитировании их роста источником азота; отобраны наиболее активные продуценты Candida zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5; оптимизированы условия культивирования (рН среды, концентрация растворенного кислорода) и состав питательной среды (концентрации азота, этанола и микроэлементов), обеспечивающие максимальный синтез ЯК.

Впервые разработан принципиально новый способ получения ЯК, включающий последовательный микробиологический синтез КГК из этанола тиаминауксотрофными дрожжами1 Y. lipolytica ВКМ Y-2412 и ее дальнейшее эквимолярное окисление до ЯК под воздействием перекиси водорода. Разработана схема выделения ЯК из культуральной жидкости и очистка её до высокой чистоты.

Практическая значимость исследования «

Предложенный микробиологический способ получения ЯК может заменить дорогостоящий химический синтез. ЯК, полученная данным способом, обеспечивает требуемый уровень чистоты и биологической активности, позволяющий использовать её в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве (протокол о проведении процесса биосинтеза и приготовлении опытной партии янтарной кислоты на базе Опытной технологической установки ИБФМ РАН от 20.04.11, протокол о проведении испытаний янтарной кислоты на содержание токсичных элементов ООО «ИЛ Тест-Пущино» № 2695 от 25.04.11, отчёт о проведении доклинических испытаний ГОУ ВПО РГМУ Росздрава № 22/10 от 15.04.10).

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на Международных Пущинских школах-конференциях для молодых учёных (2007, 2008, 2010), ежегодных стендовых сессиях ИБФМ РАН (2007-2009), Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, 2008), Первом научно-практическом симпозиуме «Научная молодёжь — биотехнологии России», (Пущино, 2008), Российском молодёжном инновационном конвенте (Москва, 2008), Форуме молодых учёных и 35-ом РЕВБ конгрессе (Гётеборг, Швеция, 2010). '

Структура и объём диссертации

Диссертационная - работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений. Работа изложена на 124 страницах, содержит 17 таблиц и 17 рисунков. Список литературы включает 251 наименований, из них 177 — публикации в иностранных изданиях.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Юсупова, Алсу Ильдаровна

ВЫВОДЫ

2. Показано, что условия культивирования продуцентов (концентрация растворенного кислорода, азота, этанола и ионов Zn2+) определяют качественный и количественный состав экскретируемых веществ. Для продуцентов С. zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5 подобраны оптимальные условия для роста и синтеза янтарной кислоты: высокая аэрация среды; содержание этанола не выше 1,0 г/л для С. catenulata и 3,0 г/л для С. zeylanoides-, повышенное содержание ионов цинка - 0,4 мг/л для С. zeylanoides и 26,0 мг/л для С. catenulata.

4. Разработан способ получения янтарной кислоты из этанола, включающий микробиологический синтез а-кетоглутаровой кислоты тиаминауксотрофными дрожжами Yarrowia lipolytica 212 (ВКМ Y-2412) и ее дальнейшее химическое декарбоксилирование до янтарной кислоты под воздействием перекиси водорода. Максимальная концентрация янтарной кислоты составила 63,4 г/л.

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В итоге настоящей работы.показана возможность практического получения ЯК из этанола при культивировании дрожжей.

В результате исследований было установлено, что способность к экскреции ЯК характерна для многих видов дрожжей, относящихся к родам Candida, Debaromyces, Pichia, Yarrowia, Kluyveromyces, Torulopsis и Saccharomyses при росте в среде с этанолом.

В качестве наиболее активных продуцентов ЯК были отобраны штаммы С. zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5 и с ними проводилась дальнейшая работа по подбору условий культивирования оптимальных для роста и накопления ЯК.

Следует отметить, что использование этанола в качестве источника углерода для культивирования создаёт определённые трудности из-за токсичности этого соединения для клеток дрожжей. Поэтому исследовали влияние этанола на рост дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides в широком дипазоне концентраций. Было установлено, что этанол следует вносить в среду культивирования дробно в количестве не превышающем 1,0 г/л для С. catenulata и 3,0 г/л для С. zeylanoides.

При исследовании потребности дрожжей С. catenulata в азоте была получена линейная зависимость между плотностью биомассы и концентрацией сульфата аммония в среде, которая имела следующий вид: Y = 4,3 5х + 0,673. Использование данной зависимости может быть полезной при масштабировании процессов культивирования дрожжей с целью определения концентрации азота для получения запланированной рабочей биомассы в ферментере.

В дальнейших экспериментах была показана важная роль цинка, который входит в активный центр НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы — первого фермента окисления этанола. Было определено, что различные концентрации цинка в среде оказывают влияние на рост и синтез ЯК дрожжами. Так, у С. zeylanoides концентрация ионов Zn2+ ниже 0,2 мг/л лимитировала рост культуры, и синтез. ЯК отсутствовал. Концентрация ионов Zn , равная 0,4 мг/л, была оптимальной для роста С. zeylanoides и продукции ЯК. Дальнейшее повышение концентрации ионов цинка вызывало снижение накопления биомассы и синтеза ЯК. Для С. catenulata обнаружен более широкий I диапазон концентраций ионов Zn (0,02 — 200 мг/л), оптимальных для роста клеток и биосинтеза ЯК. Наибольшая продукция ЯК наблюдалась при концентрации ионов Zn2+, равной 26 мг/л.

Установлено, что важным фактором, влияющим на рост дрожжей и синтез ЯК, является аэрация, и активное кислотообразование наблюдается в условиях интенсивной аэрации среды.

При проведении» процесса ферментации в оптимальных условиях в аппаратах АНКУМ-2М на 68 ч роста С. сШепиШа экскретировали 5,2 г/л ЯК, а С. 2еу1апо'к1е>ч — 9,4 г/л ЯК. Выход ЯК для С. сШепиШа и С. геу1апо1с1ех составлял 32,6% и 39% соответственно. В значительных количествах в качестве побочного продукта происходило накопление яблочной кислоты. Эти данные указывали на активное функционирование ГЛЦ в продукции ЯК из этанола.

Действительно, было установлено, что активности ферментов ЦТК - НАД-изоцитратдегидрогеназы и кетоглутаратдегидрогеназы были низкими, а активность изоцитрат-лиазы (ключевого фермента ГЛЦ) сохранялась на высоком уровне в экспоненциальной фазе и поддерживалась достаточно высокой в период синтеза ЯК (0,64 Ед./мг белка).

Также проводили сравнительное изучение активности изоцитрат-лиазы у 11 штаммов дрожжей, способных к продукции ЯК на этаноле. В качестве контроля использовали рост этих штаммов на глюкозе, когда синтез ЯК был незначительный. У всех штаммов при росте на этаноле активность изоцитрат-лиазы была существенно выше активности фермента у клеток, растущих на глюкозе. Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение, что сверхсинтез ЯК у исследуемых дрожжей являлся результатом активного функционирования ГЛЦ на среде с этанолом.

Следующим этапом работы явилась разработка метода получения ЯК, включающий синтез КГК с использованием дрожжей У Иро1уНса 212 и её дальнейшее окисление до ЯК в присутствии перекиси водорода.

Был отобран продуцент КГК - дрожжи У. Нро1уИса 212, и подобраны условия, которые обеспечивали максимальное кислотообразование штамма при росте в среде с этанолом: высокая аэрация среды и рН=3,5-6,0.

Была также проверена и доказана возможность проведения реакции декарбоксилирования КГК до ЯК в фильтрате культуральной жидкости и подобрана концентрация перекиси водорода (100 мМ/л), которая не ингибировала рост дрожжей.

На базе опытной технологической установки ИБФМ РАН проведена апробация процессов биосинтеза КГК из этанола дрожжами Уаггоц>1а Иро1уНса 212 и ее дальнейшее химическое декарбоксилирование до ЯК под воздействием перекиси водорода. Проведено три цикла биосинтеза ЯК в ферментерах объемом 10 - 100 л, а также выделения и очистки ЯК. Накопление продукта при биосинтезе составило около

63 г/л, выход готового продукта, соответствующего требованиям СанПиН 2.3.2.1078-0 после выделения и очистки в среднем составил 55%. (Приложение 1); чистота кристаллов ЯК составила 99,9%.

На заключительном этапе работы препарат ЯК сравнивали по биохимическим параметрам с ЯК фирмы Sigma. Было показано, что различия между препаратом ЯК, полученным нами и коммерческим препаратом ЯК фирмы Sigma минимальны.

В связи с тем, что ЯК планировалось использовать в доклинических испытаниях, эта кислота была проанализирована на содержание токсичных элементов аккредитованной организацией ООО «ИЛ ТЕСТ-ПУЩИНО». Установлено, что их содержание в препарате было в 5-10 раз ниже ПДК (Приложение 2).

Также на базе Испытательного лабораторного центра Российского государственного медицинского университета (г. Москва) было проведено изучение острой токсичности и характера вредного действия ЯК на организм животных. Было сделано заключение о том, что ЯК является малоопасным веществом при введении в желудок лабораторным животным (4 класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76), не обладает кожно-резорбтивным действием, оказывает раздражающее действие на кожу и слизистые оболочки. Сенсибилизирующее действие кислоты не обнаружено. Предварительное введение в желудок белым мышам ЯК в дозе 1000 мг/кг оказывало антигипоксическое действие (Приложение 3).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юсупова, Алсу Ильдаровна, Пущино

1. Арзуманов Т.Е. Биосинтез лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica. Автореферат дисс.канд. биол. наук, Пущино: ИБФМ РАН. 1998.

2. Бирюкова E.H., Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. Устойчивость дрожжей Yarrowia lipolytica к окислительному стрессу // Микробиология. 2006. Т. 75. № 3. С. 293-298.

3. Богданова Л.А., Жеребкер Е.М., Косяков Н.И., Маевский Е.И. Клинический опыт применения препаратов янтарной кислоты (Янтавита и Митомина) // Российский биомедицинский журнал Medline.ru. 2001. СТ. 21. С. 127-128.

4. Буткевич B.C., Тимофеева А.Г. Влияние отдельных минеральных элементов питательной среды на образование кислот грибом Asp. niger II Микробиология. 1935. Т. 4. №4. С. 489-494.

5. Винокурова Н.Г., Романова И.Б., Раминя Л.О., Карклинь Р.Я. A.c. № 1524486 // Б.И'.1996. № 32. С. 252.7. , Веселов И.Я., Гололобав А.Д., Давидов- Е.Р., Елисеева Л.Г., Латышева H.H.,

6. Рачинский В.В., Уваров И.П. Влияние гетеротрофной фиксации углекислоты.на активность ферментов дрожжей Candida при выращивании на н-алканах и глюкозе // Прикл. биохим. микробиол. 1974. Т. 10. С. 697-703.

7. Глазунова Л.М., Финогенова Т.В., Лозинов А.Б. О механизме образования дрожжами Candida lipolytica а-кетоглутаровой кислоты // Микробиология. 1973. Т. 42. №4. С. 627-631.

8. Дедюхина Э.Г., Чистякова Т.И., Ерошин В.К. Влияние концентрации цинка или магния в питательной среде на максимальную удельную скорость роста дрожжей в режиме рН-ауксостата // Микробиология. 1989. Т. 58. В. 4. С. 672674.

9. Дэвис Д., Дж. Джованелли, Т. Рис. Биохимия растений, пер. с англ. А. А Бундель и др. Москва: «МИР». 1966. С. 193-195.

10. Ермакова И;Т., Розенфельд С.М., Новаковская Н.С., Неклюдова Л.В., Дислер Е.Н.' Влияние концентрации азота на синтез кетокислот дрожжами рода Gandida,растущими на средах с гексадеканом // Прикл. биохим. микробиол. 1969. Т. 5. № 3. С. 252-255.

11. Ермакова И.Т. Условия и динамика образования а-кетоглутаровой кислоты при росте тиамингетеротрофных дрожжей Candida lipolytica на н-гексадекане // Прикл. биохим. микробиол. 1970. Т. 6. № 4. С. 388-395.

12. Ермакова И.Т. Условия и механизм биосинтеза а-кетоглутаровой кислоты при росте дрожжей С. lipolytica на н-алканах // Автореферат дисс.канд. биол. наук, Пущино: ИБФМ АН СССР. 1971а.

13. Ермакова И.Т. Финогенова Т.В. Участие глиоксилатного цикла в обмене веществ алканокисляющих дрожжей Candida lipolytica при биосинтезе а-кетоглутаровой кислоты // Микробиология. 19716. Т. 71. № 2. С. 223-226

14. Ермакова И.Т., Финогенова Т.В., Лозинов А.Б. 1979 Влияние условий культивирования на рост дрожжей С. lipolytica и биосинтез а-кетоглутаровой кислот в условиях дефицита тиамина // Микробиология. 1979. Т. 48. №.6. С. 1001-1010.

15. Ермакова И.Т., Мандева Р.Д. Экскреция метаболитов дрожжами родов Torulopsis, Pichia, Debaromyces и Hansenula при лимитировании их роста источниками N, Р, S или Mg // Микробиология. 1981. Т. 50. С. 476-481.

16. Ермакова И.Т., Ермоленко Е.А., Финогенова Т.В. Биосинтез а-кетокислот тиаминауксотрофными дрожжевыми организмами при использовании различных источников углерода // Прикл. биохим. микробиол. 1986. Т. 22. № 3. 341-347.

17. Ермакова И.Т., Шишканова Н.В., Пелцмане И.Ж., Финогенова Т.В., Карклинь Р.Я. A.c. № 1369276. // Б.И. 1996. № 32. С. 251.

18. Ерошин В.К. Основы материально энергетического баланса роста микроорганизмов. ■ В сборнике Лимитирование и ингибирование микробиологических процессов. 1980. Пущино. С. 34-55.

19. Илларионова В.И., Глазунова Л.М., Шишканова Н.В., Финогенова Т.В., Лозинов А.Б. A.c. № 849780 // Б.И. 1983. № 3. С. 10.

20. Ильченко А.П., Чернявская О.Г. Финогенова Т.В. Метаболизм этанола у дрожжей Yarrowia и Torulopsis (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. №5. С. 487-494.

21. Камзолова C.B. Биосинтез лимонных кислот дрожжами Yarrowia lipolytica N1 из этанола в условиях непрерывного культивирования // Автореферат дисс.канд. биол. наук, Пущино: ОНТИ ПНЦ. 1995.

22. Козлова Т.М., Медведева Г.А., Глазунова Л.М., Финогенова Т.В. О структурных изменениях клетки Candida lipolytica при биосинтезе лимонной кислоты // Микробиология. 1981. Т. 50. № 3. С. 508-514.

23. Кондрашова М.Н. Гормоноподобное действии янтарной кислоты // Вопр. биол. мед. фармац. химии. 2002. Т. 1. С. 7.

24. Кошелева H.A., Смирнова Л.С., Байкова JI.A. Биосинтез а-кетоглутаровой кислоты у микроорганизмов•// Известия АН' СССР, серия биологическая. 1967. № 1. С. 74-90.

25. Краткая химическая энциклопедия, под ред. Кнунянц И.Л., М., 1963, С. 552.

26. Кулаковская Т.В., Матяшова Р.Н., Петров В.В., Куранова Е.В. АТФаза плазматической мембраны не участвует в процессе выхода лимонной кислоты из клеток дрожжей Yarrowia lipolytica // Микробиология. 1994. Т. 63. С. 23-28.

27. Латашко В.М., Музыченко Г.Ф., Бадовская Л.А., Кульневич В.Г., Кондрашова М.Н. Получение фармакопейной янтарной кислоты и,её солей // В. кн. Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. 1997. Пущино. С. 289-293.

28. Ленинджер А. Биохимия: молекулярные основы структуры и функций клетки: пер. с англ.- М.: издательство «Мир». 1974. 956 с.

29. Ленинджер А. Биохимия. Пер. с англ. Баева A.A. изд. «Мир». 1976. 970 с.

30. Лозинов А.Б., Финогенова Т.В., Илларионова В.И., Ермакова И.Т., Есипов С.Е. A.c. №305187 // Б.И. 1971. № 18. С. 81.

31. Лозинов-А.Б., Финогенова Т.В., Шишканова Н.В:, Илларионова В.И., Карклинь Р.Я., Пелцмане И.Ж., Раминя Л.О., Лука В.Т., Кестарис Б.Я. A.c. № 695230 // Б.И. 1982. №23. С. 307.

32. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий // Биохимия. 2001. Т. 66. № 5. С. 592 609.

33. Маевский Е.И., Розенфельд A.C., Зякун А.М., Кондрашова М.Н. Сукцинат аммония как средство коррекции ацидоза в условиях рабочей гипоксии // Российский биомедицинский журнал Medline.ru. 2001. Т. 2. СТ. 19. С. 114.

34. Мандева Р. Д. Сверхсинтез метаболитов при лимитировании роста дрожжевых культур // Автореферат дисс.канд. биол. наук, Пущино: ИБФМ АН СССР. 1981.

35. Мандева Р.Д., Ермакова И.Т., Мельникова О.Ф., Финогенова Т.В., Лозинов А.Б. Условия и динамика экскреции цитрата, изоцитрата и полиолов при росте дрожжей на глюкозе // Микробиология. 1981. Т. 50. С. 636-644

36. Мельникова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К.,Бондарь И.А., Круговых Н.Ф.,Труфакин В.А. В кн. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. Москва: Слово. 2006. 553 с.

37. Моргунов И.Г., Ермакова И.Т. Механизм биосинтеза пировиноградной кислоты из глицерина дрожжами Yarrowia lipolytica II Микробиология. 1989. T. 58. С. 2630.

38. Моргунов И.Г., Ильченко А.П., Шарышев A.A. Ферменты метаболизма глицерина у дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica II Биохимия. 1991. T. 56. № 2. С. 258-266.

39. Моргунов И.Г., Шарышев A.A., Микулинская О.В., Соколов Д.М., Финогенова Т.В. Выделение, очистка, и некоторые свойства цитрат-синтазы дрожжей

40. Yarrowia (Candida) lipolytica — продуцентов лимонной кислоты // Биохимия.1994. Т. 59. С. 975-981.

41. Моргунов И.Г., Чернявская О.Г., Финогенова Т.В. О механизме биосинтеза 2-оксоглутаровой кислоты из этанола тиаминауксотрофными дрожжами Y. lipolytica II Микробиология. 1995. Т.64. № 4. С. 442-445.

42. Моргунов И.Г., Солодовникова Н.Ю., Шарышев A.A., Камзолова C.B., Финогенова Т.В. Регуляция НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы у цитрат-продуцирующих дрожжей Yarrowia lipolytica II Биохимия. 2004. Т.69. № 12. С. 1391-1398.

43. Мутафов С.Б. О повышенной потребности дрожжей в цинке при их культивировании на среде с этанолом // Докл. Болгарской акад. наук. 1985. Т. 28. № 12. С. 1681-1684.

44. Петров В.В. АТР-зависимый транспорт сукцината в везикулы плазматических мембран дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Вестник биотехнологии. 2006. Т. 2. №2. С. 17-20.

45. Прескот С. Техническая микробиология. Пер. с англ. / С. Прескот, С. Дэн. Ред.: А. А. Имшенецкий; пер.: М. Г. Бражникова. Москва: Издательство иностранной литературы, 1952. 723 с.

46. Романова И.Б., Винокурова Н.Г., Кувичкина Т.Н., Раминя Л.О., Карклинь Р.Я. A.c. № 1707983 // Б.И. 1996. № 32. С. 253.

47. Романова И.Б., Ленских Г.В., Шишканова Н.В., Ежов В.А., Троицкая Л.В., Термхитарова И.Г. A.c. № 960036 // Б.И. 2000. № 11. С. 266.

48. Сингх Н. Н. Начальные этапы окисления первичных спиртов в клетках дрожжей, растущих на различных субстратах // Автореферат дис. . канд. биол. наук. Пущино: ИБФМ РАН: 1995.

49. Скоупс Р. Методы очистки белков. Москва: Мир.1985. 358 с.

50. Солодовникова Н.Ю. Роль нуклеотидов в регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот у дрожжей Yarrowia lipolytica II Автореферат дис. . канд. биол. наук. Пущино: ИБФМ РАН. 1998.

51. Султанович Ю.А., Нечаев А.П., Барсукова И.А. Авторское свидетельство № 968072 СССР / Б.И. 1982 г. № 39. С. 136.

52. Фаусек Е.А. Физиолого-биохимические особенности биосинтеза изолимонной кислоты дрожжами из этанола // Автореферат дис. . канд. биол. наук. Пущино: ИБФМ АН СССР. 1991а.

53. Фаусек Е.А., Шишканова Н.В., Еремина С.С., Финогенова Т.В. Активности ферментов цитратного и ггиоксилатного циклов при росте Candida lipolytica на среде с этанолом и синтезе изолимонной кислоты // Микробиология. 19916. Т. 60. № 1. С. 17-22.

54. Финогенова Т.В., Илларионова В.И., Лозинов А.Б. Образование лимонных кислот дрожжами С. lipolytica при росте на н-алканах // Микробиология. 1973. Т. 42. С. 790-794.

55. Финогенова Т.В: Биохимия и физиология микроорганизмов. Пущино: НЦБИ АН СССР. 1975. С. 21-24.

56. Финогенова Т.В. Биосинтез органических кислот дрожжевыми организмами и его регуляция // Автореферат дисс. . докт. биол. наук. Пущино: ИБФМ АН СССР. 1982.

57. Финогенова Т.В., Глазунова Л.М. Активность ферментов цитратного и глиоксилатного циклов при синтезе лимонной и изолимонной кислот различными штаммами Candida lipolytica // Микробиология. 1982. Т. 51. № 1. С. 27-33.68

Информация о работе

Юсупова, Алсу Ильдаровна
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Биосинтез янтарной кислоты дрожжами из этанола - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы