Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимические особенности биосинтеза изолимонной кислоты дрожжами из этанола

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические особенности биосинтеза изолимонной кислоты дрожжами из этанола"

'"> Г5.Ч

У У'

4ч

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

УДК 532. 282. 23. 017. 7: 577.152. 3

ФАУСЕК Елена Александровна

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БИОСИНТЕЗА И30ЛИМ0НН0Й КИСЛОТЫ ДРОЖЖАМИ ИЗ ЭТАНОЛА (специальность 03. 00. 07 - микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Путано- 1991

А

/

/

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР.

Научный руководитель - доктор биологических наук

Т.К Оиногенова

Официальные оппонентьс

доктор биологических наук

Э. Ы. Диканская кандидат биологических наук Ю. А. Троценко

Ведунье учреждение - Институт микробиологии АН СССР

Защита состоится Т^? .¿Ш-^? 19^2- в /Атас-

на заседании специализированного совета (Д 00.2.69.01) при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, г. Пущино, Московская область

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР

Автореферат разослан 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

В. и. Еагабов

Актуальность проблны. Изолимонная кислота существует в виде четырех стереоизомерных форм, из которых только трео-Бз-форма является природным, биологически активным соединением, интермедиатом цикла трикарбоновых кислот.

Tpeo-Ds-изолимонная кислота (ИЛК) используется как биохимический реактив для диагностики ряда заболеваний, заменяет лимонную кислоту (ЛК) в качестве консерванта пищевых продуктов. Важной областью применения ИЛК может стать клиническая практика, т. к. на основе этой кислоты разрабатывается медицинский препарат для коррекции метаболизма. Кроме того, ИЛК может быть использована в качестве сырья для химического синтеза аскорбиновой кислоты.

Большинство зарубежных фирм производят ИЖ путем химического синтеза, в результате которого образуется смесь стереоизомеров иаолимонной кислоты, содержание Tpeo-Ds-формы в которой не превышает 50%. В СССР ИЖ получают микробиологическим путем из углеводородов нефти, однако применение продукта, полученного из этого субстрата имеет определенные ограничения. Возросшая потребность в ИЛК для пищевой и медицинской промышленности поставила задачу организации производства кислоты из традиционного сырья.

Ранее сообщалось, что дрожжи Candida lipolytics 704 способны синтезировать ИЖ из этанола [Финогенова с соавт. , 1979]. Использование этанола в качестве субстрата гарантирует образование продукта, который может применяться в пищевой и медицинской промышленности.' К моменту постановки настоящей работы закономерности процесса и его механизм не были исследованы. Однако, для разработки микробиологического способа получения любого соединения необходимо знание физиолого-биохимических особенностей процесса, так как это создает предпосылки для его управления.

Список сокращений: ИЛК- изолимонная кислота, Ж-лимонная кислота, УК-уксусная кислота АДГ-алкогольдегидрогеназа, АлДГ-аль-дегиддегидрогеназа, АО-алкогольоксидаза, ЦС-цитратсинтаза, АК-ако-нитат-гидратаза, NAD ИЦДГ - NAD-зависимая изоцитратдегидрогеназа, NADP ИЦДГ - NADP-зависимая изоцитратдегидрогеназа, КГДГ- -кетоглу-таратдегидрогеназа, ИЛ-изоцитрат-лиаза, ЦЕЭ- цепи переноса электронов, ЦСО-цитохром с оксидаза, ЦСП-цитохром с пероксидаза. .

- 2 -

Цель и задачи мсслвдпванмя.

Цель настоящей работы заключалась в изучении физиолого-биохи-мических основ микробиологического способа получения изолимонной кислоты из этанола .

В число основных задач входило:

- изучение способности дрожжей различного таксономического положения синтезировать изолимонную кислоту из этанола;

- определение условий культвирования штамма-продуцента, оптимальных для получения изолимонной кислоты;

- исследование основных физиологических и биохимических особенностей роста дрожжей в среде с этанолом в условиях сверхсинтеза изолимонной КИСЛОТЫ;

- изучение энзимологии окисления этанола.

Научная новизна рабохы. Исследована способность дрожжей различного таксономического положения синтезировать ИЛК и Ж из этанола. Показано, что многие виды дрожжей продуцируют названные кислоты в условиях лимитирования роста азотом, однако подавляющее большинство из них образуют преимущественно ЛК. Способность синтезировать преимущественно ИЛК обнаружена только у 7 из 60 проверенных штаммов. Наиболее активными продуцентами изолимонной кислоты являются дрожжи вида С. Нро1уиса (Уаггочпа Про1уиса).

Впервые изучено влияние условий культивирования (концентрации субстрата, рН, рОа) на рост продуцента (С. Про1уиса 704) в среде с этанолом и процесс кислотообразования. Установлено, что от условий культивирования зависит качественный и количественный состав экскретируемых продуктов (УК, ИЛК и Ж)1.

На основании изучения ферментных систем окисления этанола, динамики активности ферментов цитратного и глиоксилатного циклов, особенностей дыхания и функционирования цепей переноса электронов у двух штаммов дрожжей С. Нро1уИса создано представление о путях превращения этанола" в ИЛК. Ранее эти вопросы не были изучены.

Впервые показано, что у дрожжей С. 11ро1уиса 704 в окислении этанола до ацетальдегида, наряду с АДГ, принимает участие алко-гольоксидаза.

На примере двух штаммов С. Про1уиса - модели активного продуцента ИЛК и модели слабого продуцента ИЛК, установлена корреляция между уровнем активности цитрат-синтазы, аконитат-гидратазы, изо-цитрат-лиазы и интенсивностью процесса кислотообразования.

Выявлены изменения в функционировании основной фосфорилирующей

дыхательной цепи С. Нро1уиса 704, происходящие в процессе роста; отмечен значительный вклад цианидрезистентного дыхания в общее дыхание клеток С. Про1уиса, растущих в среде с этанолом.

Практическая ценность работы. Предложен экспресс-метод, позволяющий быстро оценить кислотообразующую способность большой коллекции дрожжей. Подтверждено, что штамм С. Про1уиса 704 является наиболее активным продуцентом ИЛК из этанола. Показана возможность получения изолимонной кислоты из этанола в условиях периодического культивирования дрожжей С. Про1уиса 704. Подобраны условия культивирования (рН среды, концентрация кислорода, концентрация субстрата) , оптимальные для накопления ИЛК в качестве основного продукта. На основание изучения физиологогбиохимических особенностей роста дрожжей С. Про1у11са в среде с этанолом созданы предпосылки для управления процессом кислотообразования. Результаты настоящего исследования явились основой для разработки микробиологического способа получения изолимонной кислоты из этанола. Показана принципиальная возможность получения ИЛК с помощью иммобилизованных клеток С. Про1уЫса 704. Намечены подходы к созданию биокатализатора пролонгированного действия на основе клеток продуцента, включенных в Са-альгинатный гель. •

Апробация работы. Основные положени диссертации были представлены на конференции молодых ученых ИБФМ АН СССР 1987 г. , Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов" (Путанно, 1989 г.), на совместных семинарах лаборатории окислительного обмена веществ (ЛООВ) и лаборатории "Иммобилизованные микроорганизмы", ЛООВ и лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ АН СССР, на 15 Международном специализированном симпозиуме по дрожжам (Рига, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, одна работа находится в печати.

Структура х объем диссертации. Диссертация изложена на страницах учетного машинописного текста, содержит 14 таблиц, 25 рисунков, состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), обсуждения и выводов. Список литературы содержит источников.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Объект исследования. Основным объектом исследования являлись два природных штамма СапсИйа Про1уиса- С. Про1уиса 704 (ЕКМ У-2373)- активный продуцент изолимонной кислоты из этанола и

С. lipolytics 12а (ЕКМ Y-2366)- слабый продуцент. При изучении кислотообразующей способности дрожжей использовали культуры, полученные из ВКМ ИБФМ АН СССР, а также коллекционные штаммы Лаборатории окислительного обмена веществ ШШ АН СССР (см.табл. 1).

Условна культивирования. Дрожжи выращивали в среде Ридер, приготовленной на бидистиллированной воде с добавлением смеси микроэлементов по Буркгольдеру и О. 3 г/л дрожжевого экстракта ("Difco"). Рост дрожжей лимитировали источником азота ((Nfy)^ SCfy ). Основные эксперименты проводили в ферментере АНКУМ-2М объемом 10 литров при 29°С. Концентрацию этанола, рН, рС^ поддерживали, как указано в тексте (раздел 2.1).

Методы контроля роста, содержании органических кислот и этанола в среда. Рост дрожжей контролировали измерением оптической плотности на ¡КЭК-56 и по весу сухой биомассы. Концентрацию этанола и уксусной кислоты определяли методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе Chrom-5 с пламено-ионизационным детектором."' Использоралась колонка 3. Б х 2. 5 мм с Paropak Q . Температура колонки 160°С, детектора 180°С, испарителя 180°С.

Tpeo-Ds-изолимонную кислоту определяли энзиматическим методом с NADP-изоцитратдегидрогеназой tStern, 1957]. Лимонную кислоту определяли химическим методом [Жаболовская с соавт., 1968].

Определение потребления кислорода интактными клетками проводили в полярографической ячейке со "стационарным электродом, типа электрода Кларка, при t= 28 С, в 0.05 U К-фосфатном буфере рН 6. 0.

Приготовление бесклеточного экстракта м определение активности ферментов. Клетки отделяли от среды центрифугированием при 3000g, t=4° С, 10 минут, промывали 0.9% -ым раствором NaCl, разрушали либо с помощью бус "баллотини" на планетарной мельнице, 3 мин, t=4°C в 250 мМ К-фосфатном буфере, содержащем 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотрейто-ла и 5 мМ фенилметилсульфонилфторида (РКБР), либо продавливанием из замороженного состояния на прессе Френча в буфере того же состава Полученный гомогенат центрифугировали, при 8000g, t=4°C, 15 минут, супернатант использовали для измерения активности ферментов.

Определяли активность цитрат-синтазы (ЦС), аконитат-гидрата-зы (АК), NAD- и NADP-зависимых изоцитратдегидрогеназ (NAD ИЦДГ, NADP ИЦДГ), о^-кетоглутаратдегидрогеназы (КГДГ), изоцитрат-лиазы (ИЛ) [Лозинов с соавт. , 1976], NAD-зависимых алкоголь- и альдегид-дегидрогеназ (АДГ, АлДГ), каталазы [Enzymes and Reserch Biochem.

Catalogue, 1987/19881, цитохром с оксидазы (ЦСО) и цитохром с пе-роксидазы (ДСП) [Yonetani, 19В71. Активность ферментов выражали в мкмолях продукта реакции, образующегося за 1 мин в расчете на 1 мг белка (Е/ мг белка).

Все измерения проводили на двулучевом спектрофотометре "Specord UV VIS" или "Hitachi-356".

Определение активности алкогольоксидазы (АО) проводили в полярографической ячейке со стационарным электродом типа электрода Кларка при t=25°C в 50 мМ K-фосфатном буфере, pH 8.2.

Скорость генерации супероксидных радикалов определяли по образованию адренохрома из эпинефрина после внесения этанола [Misre, Fridovich, 1972]. Изменение ^ регистрировали на

спектрофотометре "Hitachi-356", £=2.96 см^мМГ*

Подробное описание условий анализа активности каждого фермента приведено в диссертации (глава 2).

Электрофорез белков проводили в полиакриламидном геле в неде-натурирущих условиях по методу Davis ( 1964), а также по модифицированному методу Laeirmli (1970). Зоны активности АДГ и АлДГ в гелевых столбиках идентифицировали с использованием тетранитротет-разолия синего. Для выявления зоны активности алкогольоксидазы в качестве акцептора электронов использовали ортодианизидин.

Количествегаюе содерзание цигохроыов типа в, с, а+аЗ в ин-тактных клетках определяли по дифференциальным спектрам поглощения восстановленных дитионитом цитохромов относительно окисленных гидроперекисью. Спектры регистрировали на дифференциальном спектрофотометре "Shimadzu".

ATP определяли биолюминисцентным методом с люцеферин-люцифера-зой [Kimmich et al., 19751.

Белок измеряли по методу Lowry (1951).

Летгады определяли методом Султанович с соавт. (1982).

Цетоды паюСнлязацни. Клетки С. lipolytica 704 иммобилизовали включением в полиакриламидный гель (ПААГ) [Sckryabin, Koscheenko, 19871, хитозан CVorlop, Klein, 1987], поли-Н-винилкапролактам [До-'нова с соавт., 19901, Са-альгинат, зостерин, полигалактуронид [Виске, 1987; Ковалев с соавт. , 1990], а также адсорбировали на гранулы полиуретана Гранулы биокатализатора инкубировали в колбах на качалке (180-200 об/мин), t=29°C.

1. Способность дрожжей различного таксономического положения синтезировать кзоашоннуп кислоту из этанола, отбор продуцента.

Изучена способность 60 штаммов дрожжей, .-принадлежащих 11 родам и 34 видам, синтезировать изолимонную и лимонную кислоты из этанола. Для проверки культур использован экспресс-метод оценки активности кислотообразования по зонам растворения мела, которые появляются за счет выделения органических кислот в процессе роста клеток на агаризованной среде.

Экспресс-метод удобен для быстрой проверки большой коллекции дрожжей, однако не дает ответа на вопрос, какие именно кислоты выделяет тот или иной штамм. С целью идентификации кислот проводили культивирование дрожжей в жидкой среде в колбах на качалке. Содержание изолимонной и лимонной кислот определяли в культураль-ной жидкости через 6 суток культивирования. Рост дрожжей лимитировали источником азота.

В таблице 1 суммированы данные, полученные при определении кислотообразующей способности дрожжей двумя методами: на агаризованной среде Ридер и в жидкой среде с этанолом. Оба метода дали близкие результаты. Культуры, не образующие зон растворения мела, не синтезируют какие-либо кислоты и в жидкой среде. Все штаммы, образующие зоны растворения мела, накапливает в культуральной жидкости ЛК и/или ИЛК. Только один штамм- Candida pelliculosa ВКМ Y-60 выделяет в среду не лимонные, а УК.

Как следует из таблицы 1, способностью синтезировать ЛК и ИЛК из этанола обладают дрожжи, принадлежащие родам Candida (в основном С. lipolytica =Yarrowia lipolytics), Saccharomycopsis, Stephanoascus, Pichia Представители этих родов имеют много общих систематических признаков, а дрожжи С. lipolytica одно время включали в род Saccharomycopsis. Базидиоыицетные дрожжи (род Rhodotorula и Trychosporon), а также дрожжи, склонные к накоплению большого количества липидов (Rh. glutinis, Т. cutaneum, Lipomyces lipofer) не синтезируют лимонных кислот. Штамм С. catenulata ВКМ Y- 65 (=С. ravautii ИБМ1 84), известный как продуцент изоцитрата из глюкозы [Oogaki et al., 19841, оказался неспособным синтезировать какие-либо кислоты при росте в среде с этанолом.

Большинство штаммов, обладающих кислотообразующей способностью, выделяют преимущественно ЛК, и лишь несколько штаммов

Таблица 1.

Биосинтез оргалхческкх кислот дрохжзю! из этанола.

Организм Кислота Организм Кислота

Candida catenulata ВКМ Y-5= С.brumptii ВКМ -5 С. catenulata ВКМ Y-36 С. catenulata ВКМ Y-65= С. ravautii КВ1У 84 нет нет нет C. rugosa BKM Y-67. C. tropical is BKM Y-2435 C. útil is BKM Y-33 Debaryomyces hansenii BKM Y-1040 нет нет нет нет

С. famata ВКМ Y-730= Debaryomyces hansenii нет Endomyces magnusii BKM Y-1079 E.reessii BKM Y-119 нет нет

С. glabrata ВКМ Y-732 нет Kluyveromyces polysporus BKM Y-1524 нет

С. guilliermondii ВКМ Y-916 ИЛК Lipomyces starkeyi BKM Y-1223 нет

С. inconspicua ВКМ Y-740 Ж Pichia alcoholophila BKM Y-292 нет

С. lipolytica 96 P. anómala BKM Y-152 ЛК

(Yarrowia lipolytica) ИЛК P. canadensis BKM Y-50 Ж

С. lipolytica 86 ЛК P. fermentans ME®M 294 Ж

С. lipolytica 12a ВКМ Y-2366 ИЛК P. jadinii BKM Y-2331= C. utilis Ж

С. lipolytica 571 ВКМ Y-2403 нет P. silvícola BKM Y-1224 Ж

С. lipolytica 608 ВКМ Y-2397 нет Rhodotorula flava HB®J 297 нет

С. lipolytica 646 ВКМ Y-2395 нет Rh. glutinis HBJil 319 нет

С. lipolytica 684 ВКМ Y-2380 нет Rh. minuta BKM Y-338 нет

С. lipolytica 696 ВКМ Y-2377 нет Rh. rubra BKM Y-80 нет

С. lipolytica 702 ВКМ Y-2375 нет Saccharomycfipsis crataegensis

С. lipolytica 704 ВКМ Y-2373 ИЛК BKM Y-2210 Ж

С. lipolytica 709 ВКМ Y-2371 нет S. fibuliger BKM Y-1067 Ж

С. lipolytica 710 ВКМ Y-2370 Ж S. malanga BKM Y-2212 Ж

С. lipolytica 715 ВКМ Y-2368 нет S. synaedendra BKM Y-2673 Ж

С. lipolytica 716 ВКМ Y-2367 нет Stephanoascus cifferri BKM Y-1440 Ж

С. pelliculosa ВКМ Y-60 УК Trichosporon cutaneum BKM нет

С. scotti i ВКЫ Y-68 нет Valtomyces lipofer BKM Y-281 ИЖ

ЛК-лимонная кислота, ИЖ-изолимонная кислота, УК-уксусная кислота.

С. Иро1уиса (96, 86, 12а, 704, 716), а также С. &и1Шепюпс]И 916 и Ма11отусез 11роГег 281 синтезируют преимущественно ИЖ Максимальный выход изолимонной кислоты получен у С. Нро1уиса 704. Этот штамм отобран для дальнейшей работы в качестве наиболее активного продуцента изоцитрата.

О способности штамма С. Про1уЫса 704 продуцировать ИЖ из этанола сообпцшось ранее Сйшогенова с соавт., 1979; Шишканова с соавт. , 19813, однако не было сведений о кислотообразующей способности дрожжей других родов и видов. Результаты настоящей работы подтвердили, что штамм С. Нро1уиса 704 действительно является наиболее активным продуцентом ИЖ

2. Условия и динамика синтеза юолимаиной кислоты.

2.1. Условия культивирования продуцента.

Известно, что основным условием биосинтеза ИЖ и Ж дрожжами является лимитирование их роста источником азота. Кроме того, на биосинтез карбоновых кислот оказывают влияние рН среды, концентрация растворенного в среде кислорода и концентрация субстрата

Экспериментально было установлено, что начальная концентрация этанола в среде не должна превышать 15 г/л, так как, при более высоких концентрациях субстрата снижается максимальная удельная скорость роста клеток (уУ шах) ([ этанол] =15 г/л -у!/ тах=0.20 час"1; [этанол] =20 г/л-уУтах=0.18 час1,[этанол] =30 г/л-у1/ тах=0.12 час"1). По мере потребления, этанол периодически добавляли в среду, постоянно поддерживая его концентрацию на уровне, указанном в таблице 2. Представленные данные показывают, что от концентрации этанола в среде в период кислотообразования зависит качественный и количественный состав накапливаемых продуктов. При содержании этанола 0.1- 1. О г/л дрожжи активно синтезируют приблизительно равные количества ИЛК и Ж (ИЖ:Ж= 1:1.2). При увеличении концентрации этанола от 1 до 15 г/л, синтез Ж подавляется и в среде накапливается преимущественно ИЖ (ИЖ:Ж= 2:1). Дальнейшее повышение концентрации этанола до 20 г/л и более приводит к торможению синтеза лимонных кислот и накоплению уксусной кислота гВо всех последующих экспериментах ' концентрацию этанола в период кислотообразования поддерживали в пределах 1-15 г/л.

Чтобы подобрать рН среды, оптимальное для накопления ИЖ, проводили культивирование С. Нро1уиса 704 в средах с различным рН: 4.5, 6.0, 7.0 (табл. 3). Как видно из таблицы, если при данных

значениях рН биомасса дрожжей практически одинакова, то содержание лимонных кислот значительно изменяется. При рН 4.5 дрожжи синтезируют преимущественно ЛК (ИЛК: ЛК=1:1.7). При рН 6.0 в. среде накапливается в основном ИЖ (ИЛК: ЛК=2:1), а при рН 7.0 продукция кислот отсутствует. Эти данные свидетельствуют о высокой лабильности процесса кислотообразования. - Культивирование дрожжей в последующих экспериментах проводили при рН 6.0.

Рост дрожжей и процесс сверхсинтеза лимонных кислот в значительной степени зависят от уровня насыщения среды кислородом (табл.4). При рОя 28-30£ ]Ц тах в 2 раза ниже, чем при рОя 60-65% и рО^ 90-95%. Лимонные кислоты при рО*, 28-30% практически не выделяются. Активный синтез ИЛК и ЛК наблюдается при рО^ 90-95%, однако в этом случае обе кислоты образуются приблизительно в равном количестве (ИЛК: ЛК=1:1.1). Уменьшая содержание кислорода в среде до 60-65% насыщения, удается подавить синтез ЛК (ИЛК: ЛК=2:1) без значительного снижения выхода ИЖ Все последующие эксперименты проводили при рС^ 60-65%.

Таким образом, на основании полученных экспериментальных данных были подобраны условия культивирования штамма-продуцента, оптимальные для биосинтеза ИЛК из этанола: рН 6. О, рОя 60-65%, концентрация этанола- не более 15 г/л в период роста и размножения клеток и 1-15 г /л в период кислотообразования. При таких условиях культивирования содержание ИЖ в культуральной жидкости достигает 60 г/л, выход продукта от массы потребленного субстрата составляет 50-60%.

Известно, что стабилизировать любой микробиологический процесс можно с помощью иммобилизации клеток продуцента. В настоявдэй работе рассмотрена принципиальная возможность получения ИЖ из этанола с помощью иммобилизованных клеток С. Про1уиса 704. Изучены два способа иммобилизации - адсорбция на гранулы полиуретана и включение в гели различной природьс ПААГ, поли-Н-винилкапролактам, зостерин, хитозан, полигалактуронид, Са-альгинат. Перспективные результаты получены при включении клеток продуцента в 2% Са-альгинат, стабилизированный СаС1 . Активность иммобилизованных клеток была не ниже, чем свободных клеток, биокатализатор сохранял стабильность в течение 28 суток.

Таблица 2.

Влияние концентрации этанола на процесс кислотообразования.

Конц. этанола Биомасса Кислоты г/л ИЛК: Ж Выход* в среде в пе- г/л ИЛК ЛК УК ИЛК %

риод биосинтеза кислотг/л

0.1-1.0 13.0 51.3 60.0 0 1:1. 2 65

1.0-5.0 14.7 40.2 20.4 0 2:1 50

5. 0-15.5 14.5 40.4 24.0 0 1.7: 1 49

20-60 14. 5 12.7 9.8 15 1.3: 1 12

Таблица 3.

Влияние pH среды на биосинтез лимонных кислот.

РН Биомасса, Кислоты, г/л Соотношение Выход*

среды г/л ИЖ ЛК ИЛКЖ ИЖ %

4.5 12.7 30 52 1.0:1.7 39.0

Б.О 12.5 57 25 2.3:1. 0 64.6

7.0 12.0 0 1.1 - 0

Таблица 4.

Влияние концентрации растворенного в среде кислорода на рост дрожжей С.Про1у1лса 704 и биосинтез лимонных кислот.

pCjj, JU шах биомасса ИЛК Ж ИЛК: Ж Выход*

час-1 г/л . г/л г/л ИЖ

28-30 0.12 1а0 О 0.5 . - О

60-65 0.23 1&5 40. 2 20.4 2:1 50.0

90-95 0.23 15.0 46.0 51.0 1:1.1 57.0

* выход ИЖ от массы потребленного субстрата

2.2. Динамика роста и образования органических кислот.

При изучении динамики роста и продукции карбоновых кислот в качестве объекта были использованы два штамма С. Нро1у1:1са

-С. lipolytics 704 -активный продуцент изоцитрата, и С. lipolytica 12а-слабый продуцент. Первоначально штамм 12а был отобран в качестве модели непродуцента, т.к. было известно, что он не образует никаких кислот при росте в средах с глюкозой [Финогенова, Катаева, 19891 и н-алканами Сйшогенова, 19823. Однако, анализ кислотообразующей способности дрожжей (табл. 1) показал, что в среде с этанолом штамм 12а синтезирует Ж и ИЖ, но в значительно меньшем количестве, чем штамм 704. Это позволяет рассматривать С. lipolytica 12а как модель слабого продуцента

На рисунке 1 представлена динамика роста (кривые 1) дрожжей С. lipolytica и накопления кислот. В период активного роста оба штамма выделят в среду уксусную кислоту (кривые 5) , которая потребляется в последующие часы культивирования. Накопление ИЖ (столбцы 2) и Ж (столбцы 3) начинается при переходе клеток в стационарную фазу роста, вызванную исчерпанием источника азота из среды (кривые 6). Физиологические различия между штаммами сводятся к различиям в количестве накапливаемых продуктов.

Сравнивая полученные результаты с имеющимися в литературе данными в отношении сверхсинтеза лимонной кислоты из н-алканов и глюкозы [Зиногенова с соавт. , 1973; Глазунова, Финогенова, 1976; Yantada, 1977; Behrens et al. , 19781 можно заключить, что основные закономерности кислотообразования для этих процессов одинаковы. Особенностью роста дрожжей в среде с этанолом является выделение и последующее потребление уксусной кислоты- интермедиата окислительного метаболизма этанола.

3. Сермгина» axretai тачагыалс этапов aazzzoizz! этанола в клетках дрогшей С. lipolytica 7D4.

Использование этанола в качестве субстрата для микробиологического получения ИЖ ставит задачу изучения путей его метаболизма Известно, что в окислении первичных спиртов у дрожжей могут принимать участие АДГ, АО и каталаза [Branden et al., 1975; Bart et al. ,'1979; Duff et al. , 1989; Kawaguchi et al., 1989; Van der Klei et al. , 19911 (схема 1). В настоящей работе изучали возможность участия этих ферментных систем в' метаболизме этанола у С.lipolytica 704. (Анализировали бесклеточные экстракты дрожжей, отобранные в период активного роста)

азот биомасса г/л мг/л уксусная к-та. г/л этанол, г/л

вООт80 г

600

400

из о лимонная, лимонная к-ты, г/л

60 66 72 78 время культивирования (час) азот биомасса, г/л мг/л уксусная к-та, г/л этанол, г/л

800-20

нзолиыонная, лимонная к-ты, г/л

600

400

т 100

18 34 30 36 42 48 54 60 66 72 78 время культивирования (час)

Рис.1. Динамика роста дрожжей С.|[ро1у11са 704 (А) и С.Про1уКса 12а (Б) в среде с этанолом и образования карбоноваых кислот. 1 (^-биомасса, 2 (»)- ИЛК, 3 (■)- ЛК, 4 ф-этанол, 5 УК, 6 (#-)- ааот в среде

-13 - + IH NAD NADH 0 NAD NADH

H

АДГ

АО

-L

1. R-y-H --- R-C-H - --- R-C-OH

H

—^—- R-fi-H ——-- R-ci-OH

АлДГ

NAD+ NADH

АлДГ

NAD+ NADH

lc

3. R-^-H -- R-C-H ----- R-C-OH

H Каталаза АлДГ

Схема 1. Пути окисления первичных спиртов.

1. Об участии АДГ в окислении этанола у С. lipolytica 704 может свидетельствовать востановление NAD бесклеточным экстрактом в присутствии этанола. Однако, приведенные ниже экспериментальные данные указывают на то, что регистрируемое в присутствии этанола восстановление NAD является результатом суммарной реакции АДГ и АлДГ, а в окислении этанола до ацетапьдегида, наряду с АДГ, принимают участие другие ферментные системы: 1) семикарбазид (5 мМ) -соединение, специфически связывающее ацетальдегид, вызывает снижение скорости этанолзависимого восстановления NAD на 40-50%, примерно аналогичное влияние оказывает пиразол (2 мМ)- ингибитор АДГ; 2) АДГ-активность не выявляется методом нативного электрофореза (причиной этого может быть низкая активность фермента); 3) полученные методом ионнобменной хроматографии на DEAE-сефарозе фракции, содержащие АДГ-активность и не обладающие АлДг-активностью, восстанавливают NAD с очень низкой скоростью, что не соответствует высокой скорости восстановления NAD бесклеточным экстрактом.

Ферментными системами, способными окислять этанол до ацеталь-дегида, могут быть АО и каталаза.

2. Ниже представлены экспериментальные данные, подтверждающие, что в окислении этанола у С. lipolytica 704 принимает участие АО:

- бесклеточный экстракт окисляет октанол .(субстрат АО) в аэробных условиях, в анаэробных условиях эта реакция не наблюдается (рис. 2а, б);

- добавление этанола к бесклеточному экстракту вызывает увеличение скорости поглощения кислорода и генерацию супероксидных радикалов (продукта АО- реакции) (табл. 5).

Таблица Б. Поглощение кислорода и генерация супероксидных радикалов бесклеточным экстрактом дрожжей Candida lipolytica 704 при различной концентрации этанола.

Концентрация этанола (М)

0. 05 0. 2 О. 4 О. 6 1. О 1. 5

скорость потребления

нмоль 0/(мин ыг белка) 11.6 14.8 32.3 36.8 51.2 68.5 скорость генерации О'ц

нмоль/( мин мг белка) 9.5 14.2 43.1 69.8 81.0 128.7

NAD (1)

гомогенат октанол

гомогенат октанол а)

о

к

te §

глюкоза (2)

глюкозооксидаза NAD гомогенат этанол (3) 1,2,3 гомогенат

е) г)

гомогенат

дисульфирам

1,2,3 диэтилстильбестрол АДГ 1,2,3 Д) / е)

этанол

гомогенат

*для создания анаэробных условий ислоль-пиразол зовали глюкозооксидаза-каталазную ловушк; 1,2,3 этанол [Краузова с соавт. , 1985].

ж)

Рис. 2. Восстановление NAD бесклеточным экстрактом дрожжей С. lipolytica 704 в различных условиях. (1-NAD, 2- глюкоза, З-глю-козооксидаза, АДГ- коммерческий препарат дрожжевой АДГ. Reanal).

- на электрофореграмме обнаружена зона специфического окрашивания, характеризующего место локализации АО-активности (в качестве субстрата использовали этанол).

Вопрос, является ли участие АО в окислении этанола общим свойством дрожжей с окислительным метаболизмом, или же это особенность штамма С. lipolytlca 704, требует дальнейшего ивучения.

функционирование АО обеспечивает образование %02. В условиях генерации перекиси, т. е., в ассоциации с АО, может проявляться пероксидазная активность каталазы' CKawaguchi et al. , 1989].

3. С целью выяснения возможного участия каталазы в окислении этанола у дрожжей С. lipolytics 704 проводили изучение восстановления NAD в условиях постоянной генерации Hg.Qi. В качестве модельной перекисьгенерирующей системы использовали глюкоза-глюко-зооксидазную систему (рис.2 в-ж). (Функционирование АО в этих условиях невозможно, так как весь кислород связывается глюкозоок-сидазой).

Как видно из данных, представленных на рисунке 2в, при добавлении в реакционную смесь системы, генерирующей перекись, скорость этанолзависимого восстановления NAD возрастает. Семикарба-зид, внесеный на этом фоне (г), вызывает снижение скорости реакции. Аналогичное влияние оказывают специфические ингибиторы АлДГ - дисульфирам и диэтилстильбестрол (д,е). Добавление пиразола приводит лишь к незначительному снижению скорости восстановления NAD (ж). Т.е., в системе, генерируюшэй ЩРя., этанол может окисляться каталазой до ацетальдегида, а регистрируемое восстановление NAD является результатом АлДГ- реакции.

О возможном участии каталазы в окислении этанола у С. lipolytica 704 свидетельствует снижение скорости роста дрожжей в присутствии ингибитора каталазы - 3-амино-1,2,4,-триазола.

Результаты изучения динамики активности этанолокисляющих ферментных систем (рис.3) позволяют'предполагать, что возможной причиной экскреции ацетата является нарушение равновесия между образованием интермедиатов начальных этапов окисления этанола и их дальнейшим превращением вследствие высокой активности этанолокис-ляющих ферментных систем в первые часы культивирования.

Как следует из представленных на рисунке 3 данных, в первые

время культивирования (час)

Рис.3'. Динамика активности этанолокислгющих ферментных систем в бесклеточных экстрактах дрожжей C.lipolytlca 704, растущих в с{*еде с этанолом. 1 (Ф)-АДГ (этанолзависимое восстановление NAD, цифры указывают % ингибирования скорости реакции пиразолом), 2 fe)-A0, 3 бй-хаталаза 4 5 ©-этанол, 6 (Д|-УК, 7 ^-биомасса

асы культивирования (при высокой концентрации спирта в среде, :ривая 5) в окислении субстрата, наряду с АДГ (кривая 1), принима-т участие АО (кривая 2) и, вероятно, каталаза (кривая 3), В этот :ериод отмечена максимальная активность АлДГ (кривая 4) и макси-[альная концентрация ацетата в среде (кривая 6). (Содержание аце-'альдегида в среде не определяли, однако известно, что экскреция щетата свидетельствует о накоплении ацетальдегида [Jones, 1989]). Ipif уменьшении концентрации спирта в среде резко падает активность iO, каталазная активность остается высокой, однако, это скорее ¡видетельствует о нарастании перекисьгенерирующих процессов в летке, чем об участии каталазы в метаболизме субстрата. В этот [ериод снижается скорость этанолзависимого восстановления MAD кривая 1), одновременно резко возрастает чувствительность реакции : пиразолу (цифры на кривой 1). Т.е., АДГ становится, вероятно, !Динственной ферментной системой, осупдэствлящей превращение эта-юла в ацетальдегид. Снижение активности этанолокислящих фермент-шх систем сопровождается потреблением ацетата из среды.

Полученные данные согласуется с существующими в литературе федставлениями о причине экскреции ацетата дрожжами [Jones, .989].

4. Диююзса Ktnsaajcra fepissmiB цяграяюго и ггяоксилзтшго

цг-иаз.

Изучение механизма сверхсинтеза ИЛК из этанола в настоящей заботе ограничено выяснением причин различной интенсивности шслотообразования у штаммов С. lipolytica 704 (активный продубит) и С. lipolytica 12а (слабый продуцент).

Определяли активность ферментов цитратного и глиоксилатного диклов, принимающих участие в образовании и дальнейшем превращении И и ИЛК (табл.6) в период активного роста (фаза роста 1), в фазе замедленного роста (2), ив стационарной фазе, т.е. в период кис-потообразования (3).

Оба штамма в период роста и размножения имеют высокую актив-гость ЦС и АК. После исчерпания источника азота высокий уровень активности этих ферментов сохраняется только у С. lipolytica 704.• В ■тетках С. lipolytica 12а активность ЦС и АК резко снижается и в :тационарной фазе составляет 24-257. от исходной активности. Различия в уровне активности ЦС и АК, очевидно, являются одной из причин различной интенсивности кислотообразования у изучаемых штаммов.

_ 1 о _

Таблица 6.

Активность ферментов (мкмоль/мин мг белка) цитратного и глиоксилатного циклов в клетках дрожжей С. 1 ¡ро1уИса, растущих в среде с этанолом.

Штамм Фаза ЦС АК ЫАО ИАОР КГДГ ИЛ

роста ИЦДГ ИЦДГ

1 2.3 0. 60 0.10 1.2 0.06 0. 26

С. Нро1уиса 2 2.0 0. 48 0.08 0.6 0.05 0.08

704 -3 2.6 0. 90 0.18 0.5 0.11 0.05

1 1.6 0.35 0.05 0.5 0.09 0.60

С. Про1у1Лса 2 1.3 0.06 0.03 0.4 - 0.10

12а '3 0.4 0.06 0.07 0.3 - 0.02

1- период роста и размножения

2- фаза замедленного роста

3- стационарная фаза (период кислотообразования)

Мэжно полагать, что низкая кислотообразующя способность у штамма 12а связана также с более глубокими , чем у штамма 704, изменениями в функционировании глиоксилатного цикла (ГЦ) после исчерпания источника азота из среды. В стационарной фазе у штамма 12а сохраняется только 3.5% от исходного уровня активности (активность в период роста и размножения) ключевого фермента ГЦ- ИЛ, в то время как у штамма 704- 19.2%. Известно, что дрожжи, утрачивающие ИЛ после прекращения роста не способны синтезировать лимонные кислоты С Глазунова, Оиногенова, 1976], очевидно это связано с отсутствием механизма ресинтеза оксалоацетата, необходимого для функционирования ЦТК и образования молекулы ЛК.

Сравнительный анализ активности ферментов у двух штамме» С. Нро1уЫса, обладающих различной кислотообразующей способностью, позволяет считать, что функционирование ЦТК и ГЦ в клетках дрожже] в условиях отсутствия, роста и прекращения оттока метаболитов н; клеточные синтезы является основной причиной накопления ЛК и ИЛК 1 дрожжевой клетке и экскреции их в среду. Интенсивность кислотообразования коррелирует с уровнем активности ЦС, АК и ИЛ.

Одной из причин различной интенсивности кислотообразования у зучаемых штаммов С. lipolytica может бьггь различная направленность зтока Ацетил-СоА. Образуясь при окислении этанола в цитозоле, мо-жула Ацетил-СоА либо переносится ацетил-карнитинтрансферазой че-iз митохондриальную мембрану и вовлекается в ЦТК (превращается в i и ИЛК), либо карбоксилируется и поступает в систему биосинтеза 1рных кислот. У слабого продуцента (штамм 12а), очевидно, преобладает второй процесс, о чем свидетельствует более высокий, чем у гамма 704, уровень липидов: 6% в период активного роста и 21% в гриод продукции лимонных кислот у штамма 12 а, 5. 9% и 9% у штамма D4, соответственно.

5. Особенности дыхаикя и 4yiпартагаровагзя цепей пэретгоса электрофон.

Отмеченные выше изменения, происходящие в процессе роста гожжей на уровне начальных этапов окисления этанола, а также в 'К, должны оказывать влияние на функционирование ЦПЭ. В связи с ■им были рассмотрены некоторые особенности дыхательной системы lipolytica.

ФупкционкрозанЕЭ ЦПЭ. Максимального развития функция основной >сфорилируюаэй цепи митохондрий С. lipolytica 704 достигает в пе-год активного роста клеток (рис.^). На это указывает максимальная ггенсивность дыхания (кривая 2), высокая концентрация цитохромов ша в,с. а+аЗ (кривыеЗ, 4,5), АТР (кривая 6) и максимальная актив->сть ДСО (кривая 7)- терминального переносчика электронов фосфо-шфующей дыхательной цепи.

В фазе замедленного роста резко снижается активность ЦСО, (еньшается содержание митохондриальных цитохромов , одновременно врастает активность ДСП (рис.^Й, кривая 8), которая может выпол-[ть функцию терминального переносчика электронов основной дыха-!Льной цепи. Полученные данные свидетельствуют об изменениях в акционировании основной фосфорилирующей дыхательной цепи, проис-|дящих при снижении концентрации азота (■ и этанола ) в среде, экое сокращение пула АТР в стационарной фазе (период кислотооб-.зования), по-видимому, обусловлено интенсивным использованием [ергии АТР на биосинтеза Ацетил-СоА, который является предшест-•нником Ж и ИЖ

Ннгнбнторпый анализ дыхания. Нечувствительность дыхания кле-« в период активного роста к ротенону- ингибитору NADH-дегидро-

интенсивность

время культивирования (час)

время культивирования (час)

Рис.4. Особенности дыхания и функционирования ЦПЭ в клетках C.lipolytica 704, растущих в среде с этанолом. 1 (^-биомасса, 2 -интенсивность дыхания, 3 АА, 4 (в, 5 (Ай- цитохромы с, в, а+а, 6 АТР, 7 ф-ЦСО, 8 ЦСП J

геназного участка фосфорилирунцей дыхательной цепи может указывать на отсутствие первой, ротенончувствительной, точки сопряжения, а также на то, что основной пул МАЛИ клетки в этот период представлен цитоплазматическим, который окисляется митохондриями с высокой скоростью, минуя первую точку сопряжения. Необходимость быстрой регенерации КАБН, очевидно, обусловлена высокой активностью ферментов начальных этапов окислений этанола, в частности АлДГ. Шяв-ление ротенончувстительной точки сопряжения при замедлении роста культуры, вероятно, связано с уменьшением потока цитоплааматичес-кого МАОН (вследствие снижения активности этанолокисляицих ферментов) и увеличением потока внутримитохондриального ' ИАОН, на что указывает увеличение активности НАЛ-зависимых изоцитратдегидроге-назы ик£-кетоглутаратдегидрогеназы (таблица 6).

Дыхание клеток С. 11ро1уиса 704, растущих в среде с этанолом, в отличие от "глхкозных" и "гексадекановых" клеток I Скногенова, 19821, проявляют низкую чувствительность (15-25% ингибирования) к цианиду- ингибитору ЦСО, что свидетельствует о значительном вкладе цанидрезистентного дыхания в общее дыхание "этанольных" клеток. Причиной этого момэт быть избыток восстановительных эквивалентов, образующихся на уровне первых этапов окисления этанола.

Обнаружена различная чувствительность эндогенного дыхания и дыхания в присутствии этанола к бензгидроксамовой кислоте (ЕГК)-ингибитору терминальной оксидазы цианидрезистентной дыхательной цепи. Если эндогенное дыхание проявляет чувстительность только к высоким концентрациям ингибитора (8-10 мМ), то дыхание в присутствии этанола подавляется на 80-90% 2 мМ ЕГК. Эти данные позволяют предполагать, что либо восстановительные эквиваленты от окисляемого этанола поступают преимущественно в альтернативную' ЦПЭ (тогда как от эндогенного(ых) субстрата(ов) не поступают), либо ЕГК, может оказывать влияние на одну из ферментных систем окисления этанола. Ферментной системой, чувствительной к ЕГК и. способной окислять этанол является каталаза. (Активность каталазы полностью подавляется 1 мМ БГК).

Особенностями дыхания С. Нро1уиса 12а являются: 1) замедление развития функции основной фосфорилирующей дыхательной цепи, связанное, вероятно, с экскрецией и последующим потреблением большого количества ацетата; 2) стимулирование ( а не ингибирова-ние) дыхания цианидом. Различия в чувствительности дыхания активного продуцента (штамм 704) и слабого продуцента (штамм 12а) к

цианиду согласуется с существующими в литературе представлениями о наличии реципрокных отношений между процессом сверхсинтеза метаболитов и развитием цианидрезистентного дыхания САкименко, 1990:.

В итоге настоящей работы показана возможность практического получения ИЛК из этанола в условиях периодического культивирования С. lipolytica 704, подобраны условия, обеспечивающие образование изоцитрата в качестве основного продукта. На основании анализа фи-зполого-биохимических особенностей процесса созданы предпосылки для его управления. Показана принципиальная возможность получения ИЛК с помощью иммобилизованных'клеток продуцента.

ВЫВОДЫ.

1. Изучена способность дролаазй различного таксономического положения синтезировать изолимонную и лимонную кислоты из этанола. Показано, что многие виды родов Candida, •Pichia, Saccharomycopsis, Stephanoascus, Waltomyces, образуют эти кислоты в условиях лимитирования роста азотом, основным продуктом в большинстве случаев является лимонная кислота. Отдельные штаммы С. lipolytica, С. guilliermondii, W. lipofer способные синтезировать преимуирствен-но изолимонную кислоту. В качестве наиболее активного продуцента отобран штамм С. lipolytica 704.

2. Установлено, что условия культивирования продуцента определяй; качественный и количественный состав экскретируемых продуктов (изолимонная, лимонная, уксусная кислоты). Для штамма С. lipolytica 704 подобраны условия культивирования (рН, концентрация этанола и pOjJ, обеспечивающие накопление изоцитрата в качестве основного продукта.

3. На основании анализа активности ферментов вдтратного и глиоксилатного циклов у двух штаммов С. lipolytica - модели активного продуцента изоцитрата и модели слабого продуцента- установлено существование корреляции между уровнем активности цитрат-синтааы, аконитат-гидратазы, изоцитрат-лиазы и интенсивностью кислотообра-аования .

4. Показано, что значительный вклад в общее дыхание клеток С. lipolytica, растущих в среде с этанолом, вносит цианидрезистент-ное дыхание. В фазе замедленного роста и в стационарной фаге обнаружены изменения в митохондриальной дыхательной цепи С. lipolytica 704, связанные, по-видимому, с качественным и количественным изме-

- 23 -

нением потока NADH в митохондрии.

5. На основании изучения этимологии окисления этанола у С. lipolytica 704 показано участие алкогольоксидазы в метаболизме этанола.

6. Полученные физиолого-биохимические данные явились основой микробиологического способа производства изолимонной кислоты из этанола.

7. Впервые показана возможность получения изолимонной кислоты из этанола с помощьd биокатализагора пролонгированного действия, созданного на основе иммобилизованных в Са-альгинат клеток продуцента.

Оипк публикаций ш ютерхалам диссертации.

1. Шишканова Н. R , Еремина С. С., Фаусек Е. А., Финогенова Т. Е Влияние условий культивирования на рост Candida lipolytica 704 на этаноле и на экскрецию лимонных кислот. /Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов", 1989, Пущино, с. 128.

2. Фаусек Е. А. , Шишканова Н. Е , Еремина С. С., Синогенова Т. Е Активности ферментов цитратного и глиоксилатного циклов при росте Candida lipolytica в среде с этанолом и синтезе изолимонной кислоты./Микробиология, 1991, т. 60, в. 1, с. 17-22.

3. Finogenova Т. V. , Shishkanova N. V., FausekE. A., EreminaS. S. Biosynthesis of isocitric acid by yeasts from ethanol./Applied Microbiologie and Biotechnologie, 1991, v. 36,

4. Fausek E. A., Shishkanova N. V. , Ilchenko A. P. , Finogenova Т. V. Biosynthesis of isocitric acid by yeasts from ethanol./Abstr. of 15 th International specialized symposium on yeasts. Riga, 1991, p. 41.

6.II.91 г. Зак. 3689P Тир. 125 экз. Уч.-иад.л. 1.5

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ АН СССР