Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез лимонных кислот дрожжами Yarrowia lipolytica N1 из этанола в условиях непрерывного культивирования

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез лимонных кислот дрожжами Yarrowia lipolytica N1 из этанола в условиях непрерывного культивирования"

РГ Б ОД

»- " ! 1 >

На правах г .шеи

КАМ30Л0ВА СВЕТЛАНА ВЛАДИСЛАВОВНА'

БИОСИНТЕЗ ЛИМОННЫХ КИСЛОТ ДРОЖЖАМИ УАШША ЫРОЬХТЮА. N1 ИЗ ЭТАНОЛА В УСЛОВИЯХ НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

03.00.23 - Биотехнология

..........—Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

.......

Пущино - 1995

Работа выполнена в Лаборатории окислительного обмена веществ Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Т.В.Финогенова кандидат биологических наук, Н.В.Шишканова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Э.М.Диканская кандидат физ.-мат.наук И.Г.Минкевич

Ведущая организация: Институт микробиологии РАН

_^ащита диссертации состоится " " ^шА . в

час. на заседании специализированного совета Д 002.69.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН по адресу: 142292, г.Пущино Московской обл., Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь специализированного совета

В.М.ВагаОов.

Актуальность работы. До настоящего времени лимонную

кислоту получают с помощью грибов в периодическом режиме культивирования. В последние годы наиболее перспективным рассматривается осуществление процесса в непрерывном режиме, а также использование полупроницаемых мембран с целью удержания биомассы продуцента в ферментере и увеличения эффективности процесса.

В литеретуре мало сведений о синтезе лимонных кислот в условиях непрерывного культивирования. В лабораториях и на фирмах в Англии, Швеции и Финляндии предпринимались попытки разработать процесс непрерывного получение лимонной кислоты с помощью грибов. Но они не привели к положительным результатам, в связи с тем, что грибы трудно культивировать в глубинных условиях и биохимический механизм синтеза кислоты грибами до сих пор не понятен.

Удобной моделью для разработки непрерывного процесса получения лимонной кислоты являются мутантные дрожжи Уаггоиаа Иро1уЫса N 1, полученные в 1972 г. в Отделе биоэнергетики ИБЗЫ АН СССР, преимуществом которых является высокая кислотообразующая активность при их культивировании на различных органических субстратах.

Перспективным субстратом для микробиологического получения ряда веществ является этанол. Использование этанола в качестве субстрата обеспечивает образование продукта, который монет применяться в пищевой и медицинской промышленности. Ранее сообщалось, что дрожжи У.Иро^1са ы 1 при росте на этаноле продуцируют в условиях лимитирования роста клеток практически одну лимонную кислоту (Финогенова и др.,Г979).

В последние время накапливается все больше данных, показывающих, что при культивировании дрожжей на этаноле особую важность приобретают микроэлементы (цинк и железо), которые являются интегральными компонентами многих ферментных систем, участвующих в метаболизме этанола (алкогольдегидрогеназа, зльдегиддегидрогеназа, каталаза, аконитаза, цитохромы и др.) (Ильченко и др.,1994). Показано также влияние концентрации кислорода, концентрации этанола и других факторов на синтез лимонной кислоты и ее изомера - изолимонной кислоты (Мш^епоуа et а1., 1991). Влияние этих факторов очень сложно изучить в условиях периодического культивирования при постоя-

нно меняющейся удельной скорости роста р накапливающихся продуктах метаболизма. Метод непрерывного, культивирования позволяет изучить действие одного фактора при строгом постоянстве всех остальных параметров.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей- работы было изучение возможности получения лимонных кислот из этанола дрожжами в условиях непрерывного культивирования. Но вместе с тем ставилась и практическая задача: выяснить условия культивирования дрожжей, способствующие максимальному биосинтезу лимонных кислот дрожжами и разработать способ непрерывного получения этого продукта. В связи с этой задачей объектом исследования являлся штамм дрожжей Уагго1«1а Прогула N 1, который при росте на различных источниках углерода и энергии в том числе этаноле, продуцирует в условиях лимитирования роста культуры источником азота практически одну лимонную кислоту.

В число основных задач входило:

1) изучение особенностей роста дрожжей У.Иро1у1;3.са N 1 в режиме рН-ауксостата и определение состава среды, оптимальной для роста мутанта;

2) определение условий культивирования штамма-продуцента, оптимальных для получения лимонных кислот в непрерывном режиме;

3) характеристика основных физиологических и биохимических особенностей роста и синтеза лимонных кислот дрожжей У.Иро-1у1;з.са N 1 на среде с этанолом в условиях хемостата;

4) разработка метода получения лимонной кислоты с помощью дрожжей У.Иро1у1;1са N 1 из этанола в условиях непрерывного культивирования.

Научная новизна работы. В данной работе впервые установлена принципиальная возможность направленного синтеза лимонной кислоты дрожжами на среде с этанолом в условиях непрерывного культивирования. В условиях продолжительного непрерывного культивирования (более 1000 час) на среде с этанолом в качестве источника углерода и энергии дрожжи полностью сохраняли свою кислотообразующую активность.

Изучено влияние температуры, рн среды и концентрации органического субстрата на максимальную удельную скорость

роста дрожжей У.Про1у1;д.са N 1 в режиме рН-ауксостата и разработаны питательные среды для роста мутанта и для синтеза лимонных кислот (с ограничивающим рост фактором - азотом).

Изучено влияние условий культивирования (удельной скорости роста, концентрации растворенного кислорода) и состава питательной среды (концентрации углеродного субстрата и микроэлементов цинка и железа) на рост продуцента и процесс кислотообразования в строго контролируемых условиях хемостат-ного культивирования. Показано, что от условий культивирования и природы лимитирующего рост компонента зависит качественный и количественный состав экскретируешх продуктов.

Практическое значение работы. На основании изучения физиолого-биохимических особенностей роста дрожжей Уаггоуаа Иро1уЫса N 1 на среде с этанолом в условиях непрерывного культивирования разработаны рекомендации для управления процессом кислотообразования. Результаты настоящего исследования открывают новые подходы к оптимизации условий получения лимонных кислот дрожжами в периодическом режиме.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на совместных семинарах Лаборатории окислительного обмена веществ и Отдела ферментационной микробиологии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 работы, три работы находится в печати.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы в 4 главах, описания материалов и методов исследования , изложения результатов и их обсуждения в 5 главах, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит ¿¿^страниц машинописного текста, ^ таблиц и рисунков. Библиография включает 194 наименований, из них 117 иностранных работ.

Экспериментальная часть.

Объкт и методы исследования.

В работе использовали специально селекционированный мутантный штамм дрожжей Уаггоиаа Иро1у1;1са N 1. - продуцент лимонных кислот на н-алканах, полученный в 1972 г. Н.В.Шишка-новой путем обработки дрожжей У.Иро1уиоа ВКМ-У-2373 нитро-

зометилмоче виной (Шишканова,1979). Функционирование нитратного и глиоксилатного циклов в клетках мутанта N I в период лимитированного азотом роста культуры и связанного с этим прекращения оттока метаболитов на клеточные синтезы является основной причиной накопления кислот в клетке и последующей экскреции их в среду. Низкая активность аконитат-гидратазы и высокая активность изоцитрат-лиазы обусловливают преимущественный синтез лимонной кислоты дрожжами У.Про1у1;1са N 1 на н-алканах (Финогенова, Глазунова,1982).

Дальнейшие исследования, проведенные в лаборатории показали способность дрожжей У.Иро1уЫса N 1 продуцировать лимонные кислоты при росте на среде с этанолом в условиях дефицита источника азота.

Способ культивирования подбирали в зависимости от конкретных задач.

В режиме рн-ауксос"тата исследовали влияние температуры, рН и. концентрации углеродного субстрата на максимальную удельную скорость роста У.Нро1у1;1са N 1 с целью разработки в дальнейшем сбалансированной питательной среды и выбора оптимальных условий культивирования данного штамма. Состав среды следующий, мг/л): кн2ро4 - 875; (ш4)2зо4 -126; 1^Б047Н20 - 1500,- СаС126Н20 - 126; гпЯ04бН20- 8,1; Ре8047Н20

- 15,0; МпБ045Н20 - 0,2; СиБО^^О - 5,0; дрожжевой экстракт "Б11со" - 0.5 г/л. Этанол (ректификат): 1.0 - 4.0 об %. Во избежание выпадения солей в осадок, компоненты среды подавали в ферментер по четырем каналам.

Непрерывное культивирование проводили в ферментере АНКУМ-2М (СКВ РАН) объемом 10 л с рабочим объемом 5л . Значения рН (4.5 ±0.1), температуры (28 -0.1°С) и р02 (5 -60 % от насыщения) поддерживали автоматически в процессе ферментации. Состав среды следующий, мг/л: (Ш4)2зо4 - 1320; КН2Р04 - 1380; МвБ045Н20 -1400; Ре8047Н20 -14.93; СиБО^^О

- 0.59; СаС126Н20 - 7.13; дрожжевой экстракт "В1Гоо" - 0,5 г/л. В зависимости от, цели эксперимента концентрацию исследуемых параметров варьировали ( ионов гп2+ от 0,2 до 3.5 мг/л; ионов Ре2+ от 0,05 до 10,0 мг/л ) Концентрация этанола в подаваемой среде изменяли от 0,1 до , 4.0 об %. Скорость протока среды варьировали 0,01, 0,05, 0,1 час-1. После

установления постоянной скорости протока ферментацию при каждом режиме продолжали в течение трехкратной смены объема среды в ферментере.

Содержание биомассы определяли весовым методом, концентрацию остаточного этанола и ацетата анализировали методом газожидкостной хроматографии, лимонную кислоту определяли химическим методом, трео-Бэ-изолимонную кислоту определяли энзиматическим методом с КАБР-изоцитратдегидрогеназой.

Содержание ионов цинка и железа в биомассе и культураль-ной жидкости анализировали методом атомно-абсорбционной спектрометрии.

Анализ содержания бежа по Лоури, углерода, водорода и азота (на газовом анализаторе "С,н,ы-1" фирмы "КОУО" ), золы (методом сжигания в муфельной печи), элементного состава биомассы (методом атомно-абсорбционной спектрометрии) проводили в отделе физико-химических и химических методов исследования ИБФМ РАН*

Количество живых и мертвых клеток определяли окрашивание ем клеток раствором примулина, описанным Мейселем с соавт. При микроскопировании в люминесцентном микроскопе суспензии клеток, обработанной примулином, считали живыми те клетки, которые имели четкий люминесцирующий зеленоватым «цветом контур, мертвыми, если вся клетка имела интенсивную желто-зеленую люминесценцию. ,

Для получения бесклеточных экстрактов использовали дезинтеграцию клеток на ИБФМ-прессе.

Количественное содержание цитохромов в интактных клетках определяли по дифференциальным спектрам поглощения. Спектры регистрировали на спектрофотометре "БМтайги"

Определение поглощения кислорода интактными клетками проводили полярографически.

Методы определения активностей ферментов подробно изложены в диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Изучение особенностей роста мутантного штамма дрожжей Уаггоиаа ИроД-уИра N 1 в режиме рН-ауксостата.

В настоящем разделе работы мы остановимся на данных, характеризующих влияние условий культивирования на максимальную удельную скорость роста дрожжей У.Иро1уЬ:1са N 1. Исследование проводили в режиме рН-ауксостата. Режим рН-ауксостата позволяет проводить культивирование микроорганизмов при максимальной удельной скорости роста (Мутафов и др.,1985). В установившемся режиме рН-ауксостатного культивирования все компоненты питательной среды присутствуют в культуральной среде в избытке. Культура растет со .скоростью, практически равной максимальной и это дает возможность исследовать зависимость скорости роста клеток от ряда физико-химических факторов <температуры; рн; р02), а также определить константы ингибирования (к1) компонентами среды.

При исследовании влияния температуры на максимальную удельную скорость роста (Цтах) дрожжей У.Иро1у1;1са N 1 в интервале от 23 до 30° С культивирование проводили при рн 4,5. Показано, что оптимальной для роста мутантного штамма дрожжей У. Провиса N 1 является температура 27 - 28° Повышение температуры до 30° С резко ингибирует рост дрожжей.

Диапазон рн (3,5 - 7,0) при температуре 28 С обеспечивает высокую удельную скорость роста дрожжей (рис.1а). Оптимальные для роста значения рн 4,0 - 5,0. При рН ниже 3,2 рост клеток значительно ингибирован. Данные, представленные на рис.26, показывают, что диапазон рН от 3,5 до 7,0 при температуре 27° С также обеспечивает высокую скорость роста дрожжей.

В результате работы были подобраны условия, обеспечивающие максимальную скорость роста (0,199 ч-1) дрожжей У.Иро1у-Иса N 1 на среде с этанолом в режиме рН-ауксостата: температура 27 - 28° С, рН 4,5 и рассчитан состав оптимальной среды для роста мутанта. Планируемое количество биомассы - 8 г/л.

Лих-

-I

1

рн

Рис.1. Зависимость максимальной удельной скорости роста дрожжей от величины рН ( А - при температуре 27° С и Б - при температуре 28° С).

Следует обратить внимание, что при культивировании у. Иро1у1;з.са N 1 в условиях рН-ауксостата, когда все компоненты, в том числе и источник азота в среде были в избытке, накопления лимонной кислоты в культуральной жидкости не происходило. Следовательно, необходимым условием сверхсинтеза лимонной кислоты является лимитирование роста культуры одним из питательных компонентов. Поэтому в дальнейшей работе использовали состав питательной среды, полученный на основе элементного состава биомассы дрожжей, выращенных в режиме рН-ауксостата, но с ограничивающим рост компонентом - азотом. Исследования проводили в режиме хемостата.

Дальнейшие эксперименты были посвящены путям физиологиче ского регулирования содержания и состава лимонных кислот у дрожжей У.Нро1у1;1са N 1 в режиме хемостата.

2. Влияние условий хемостатного культивирования на параметры роста и синтез лимонных кислот.

Наши эксперименты по влиянию условий непрерывного культивирования позволили выявить следующие закономерности.

Влияние удельной скорости роста.

Данные, представленные в табл.1, показывают, что в уело виях лимитирования роста дрожжей У.Иро1уИса N 1 источником

азота между удельной скоростью роста и синтезом лимонных кислот существует обратная зависимость. Наибольшее количество, лимонных кислот (28,0 г/л) обнаружено при наименьшей ц. 0,01 час-1. Поддержание более низкой ц, технически трудно осуществить. При более высоких удельных скоростях роста (0,05 и 0,1 час-1) содержание лимонных кислот было ниже и составляло 12,0 и 5,9 г/л соответственно. Следует отметить, что снижение содержания лимонных кислот при повышении удельной скорости роста, по-видимому, является общей закономерностью, т.к. подобная корреляция обнаружена и в исследованиях с грибами Aspergillus niger (Sinclair,1979).

Таблица I. Влияние удельной скорости роста на накопление биомассы и синтез лимонных кислот дрожжами

У.Иро1у1;1са N 1 .

Показатели Удельная скорость роста 0,01 0,05 , час 1 0,1

Биомасса, г/л 8,50 7,40 8,00

Азот ост., мг/л 4,00 1,25 6,50

Лимонная кислота, г/л 21,6 10,0 5,40

Изолимонная кислота, г/л 6,40 2,00 0,50

Этанол потреб.,•г/л 46,4 38,71 46,9

Влияние микроэлементов.

Известно, что по своей важности ионы цинка и железа занимают одно из ключевых мест в биологических системах. В частности, железо входит в состав различных компонентов мито-хондриальных цепей переноса электронов, а цинк - в активный центр дрожжевой алкогольдегидрогеназы. Поэтому представлялось целесообразным изучить влияние этих микроэлементов на физиологию дрожжей У.11ро1у1;1са N 1 и синтез ими лимонных кислот при их росте на среде с этанолом.

Следует отметить, что физиологический эффект микроэлементов определяется их содержанием в биомассе, поэтому параметры роста и кислотообразования анализировались не от концентрации микроэлементов в среде, а от содержания в биомассе.

Влияние_ионов_цишса^а_параметры_рос

При исследовании влияния концентрации цинка на физиоло гию дрожжей У.Иро1у1;1са N 1 было показано, что концентрация ионов цинка является эффективным фактором, регулирующим синтез лимонных кислот (табл.2). Содержание ионов цинка, равное 0.2 мг/г, является концентрацией, лимитирующей рост культуры, при этом накопление биомассы составляет 5,5 г/л и синтез лимонных кислот незначителен. Повышение содержания ионов цинка в биомассе до I,б"мг/г сух.биомассы в условиях лимитирования роста клеток "-азотом приводит к увеличению синтеза лимонных кислот в 15 раз и снижению внутриклеточного содержания белка в 1,7 раза по сравнению с этими показателями при лимитировании роста клеток цинком. Дальнейшее повышение содержания ионов цинка в биомассе вызывает резкое снижение синтеза лимонных кислот при малоизменяющейся плотности биомассы.

Таблица 2. Влияние концентрации ионов цинка на накопление

биомассы и синтез лимонных кислот дрожжами

У.Иро1уИса N 1 .

Показатели Исследуемые параметры

Ъп,мг/л 7.П, МГ/Г Биом. Ж илк Этанол

среды сух.в. г/л Г/Л г/л потр.,г/л

0,2 0,2 5,5 0,85 0,39 50,6

0,4 0,23 6,7 5,4 0,5 47,9

1,0 0,28 6,7 17,0 2,0 48,9

1,4 0,5? 6,5 17,2 3,5 51,2

2,5 1,0 8,5 21,6 6,4 47,4

3,0 1,66 7,4 10,0 2,0 38,71

3,5 1,77 6,3 1.9 0 37,57

Ж-лимонная кислота, г/л ИЛК-изолимонная кислота, г/л

Таким образом, наши результаты показали, что потребности дрожжей У.НроД-уЫса N 1 в ионах цинка для роста клеток и синтеза лимонных кислот различны. Повышенная-- потребность дрожжей в цинке, имеющая место при культивировании на этано-

ле, возможно, связана с активированием и/или увеличением количества алкогольдегидрогеназы в клетках дрожжей.

Определена активность алкогольдегидрогеназы (АДГ) показало,что в клетках дрожжей, выросших в условиях различного обеспечения ионами цинка. При лимитировании роста цинком уровень удельной активности АДГ был низким и составлял 0,013 мкмоль/мин на мг белка. "В данном случае лимитирование роста клеток цинком приводило, по-видимому, в первую очередь, к лимитированию синтеза цинк-содержащего фермента алкогольдегидрогеназы. Импульсное внесение дополнительных количеств сульфата цинка снимало эффект лимита и приводило к резкому увеличению активности алкогольдегидрогеназы (в 3 - 4 раза) и подъему биомассы. Это еще раз подтверждает, что повышенная потребность дрожжей в цинке, имеющая место при культивировании на этаноле, связана с функционированием цинк-содержащего фермента - алкогольдегидрогеназы.

Следует отметить, что при лимитирующей рост концентрации ионов цинка :(0,2 мг/г) уровень потребленного этанола несколько выше, чем в условиях лимитирования роста клеток азотом, хотя накопление биомассы и синтез лимонных кислот ниже, чем в условиях лимитирования роста клеток источником азота. В данных условиях в среде культивирования присутствуют следовые количества уксусной кислоты. При импульсном добавлении ионов цинка происходило наряду с увеличением уровня биомассы, резкое увеличение алкогольдегидрогеназной активности, при этом уровень потребленного этанола снижался до 47,9 г/л,

Эти наблюдения, на наш взгляд, являются довольно убедительным примером особо важной роли цинка при выращивании дрожжей на этаноле, на которую следует обратить внимание при составлении минеральных сред и особенно при масштабировании процесса получения лимонных кислот.

Влияние_ионов_железа.

Чтобы подобрать концентрацию железа, оптимальную для накопления лимонных кислот, исследовали следующий диапазон концентраций ионов ?е2+: 0,05 - 10,0 мг/л. Как видно из табл.з, при лимитировании роста клеток ионами железа уровень биомассы составлял 3,9 г/л и синтеза лимонных кислот не

происходило. Слабое функционирование ЦТК, низкий уровень цитохромов позволяет предположить, что при лимитировании роста культуры ионами железа реальным лимитирующим фактором становится метаболически доступная энергия. Повышение концентрации ионов железа в биомассе в условиях лимитирования роста клеток азотом с 0,13 до 2,5 мг/г приводило к повышению образования лимонных кислот в 4 раза. Дальнейшее повышение содержания ионов железа (4.8 - 7.0 мг/г) подавляло синтез лимонных кислот.

Таблица 3. Влияние различных концентраций железа на накопление

биомассы и синтез лимонных кислот дрожжами Уагг<ж1а Иро1у1;д.са N 1.

Показатели Концентрация Ге2+, мг/л

0.05 0,1 0.3 0.7 2,2 3,0 3,5 5,5 10

Содержание Ге2+

в биомассе,мг/г 0.1 0.13 0,15 0,2 0,7 1,5 2,5 4,8 7,0

Биомасса

Ы,мг/л Ж, г/л ИЛК, г/л ЛК+ИЛК

3.9

26.0 О О

5,65 6.7 6.9 6.3 6,8 6,9

1,7 3-1

1,25 3.0 1.05 1.45 3,92 1,65 3,7 24.6

5,5 8,2 18.2 19.3 18,4 21,84 1.0 О

5,23 6,39 8.0 6.96 8,37 10,26 3.0 О

10,23 14,59 26,2 26,3 26,8 32,0 4,0

ы-азот (остаточный) в культуральной жидкости ЛК-лимонная кислота ИЛК- изолимонная кислота

Отмечено также отчетливое влияние содержания ионов железа в биомассе на соотношение лимонной и изолимонной кислот (табл.3). При низком содержании железа (до 0,14 мг/г) образовывались равные количества лимонной и изолимонной кислот (соотношение 1:0,95); при повышении содержания железа от 0,14 до 2,5 мг/г - синтез сдвигался в сторону большего накопления цитрата (2:1); дальнейшее повышение концентрации железа приводило к преимущественному образованию изолимонной кислоты (3-.1).

Изменение направленности биосинтеза лимонных кислот в сторону преимущественного образования одной из кислот (лимон-

ной или изолимонной), возможно, определяется активностью железо-зависимого фермента - аконитат-гидратазы. Дрожжи У.Иро1у1;л.са N 1 имели низкую активность аконитат-гидратазы (0,06 мкмоль /мин на мг белка) в условиях интенсивного синтеза лимонной кислоты (при низком содержании ионов железа в биомассе). В условиях высокого содержания ионов железа (4,8 мг/г), когда синтез лимонных кислот начинает смещаться в сторону преиущественного образования изолимонной кислоты, уровень активности аконитат-гидратазы увеличивается в 10 раз (0.68 мкмоль/мин на мг бежа)

Следует отметить, что в железо-дефицитных клетках, в результате снижения активности еще одного железо-протеида -каталазы, может накапливаться перекись водорода, которая является ингибитором аконитат-гидратазы. Нами показано, что активность каталазы у дрожжей, выращенных в условиях повышенных концентраций железа (4,8 мг/г) , в 1,8 раза больше активности этого фермента, выращенных при низком содержании ионов железа в биомассе.

Таким образом, проведенные исследования показали, что содержание ионов железа в биомассе является важным регулятором синтеза лимонных кислот клеткой и может резко изменить направленность биосинтеза лимонных кислот в сторону преимущественного образования одной из кислот (лимонной или изолимонной), что определяется активностью аконитат-гидратазы -железо-зависимого фермента.

Влияние концентрации этанола.

Известно, что в условиях периодического культивирования концентрация этанола оказывает существенное влияние на биосинтез лимонных кислот дрожжами У.Иро1у1;1са (Фаусек,1992 Представляло интерес исследовать:

1) влияние концентрации этанола в среде на максимальную удельную скорость роста У.Прсау-Ыса N 1 в режиме рН-ауксостата;

2) влияние концентрации этанола на параметры роста и синтез лимонных кислот в условиях хемостата при.лимитировании роста клеток азотом.

Влияние этанола на рост дрожжей исследовали в диапазоне остаточных концентраций от 2,64 до 17,1 г/л. Данные, представленные на рис.2, показывают, что концентрация остаточного этанола выше 2,6 г/л вызывала снижение удельной скорости роста клеток. Пересчет данных о зависимости |хтах от концентрации остаточного этанола по методу обратных величин приведен на рис.2Б. Прямая линия, соединяющая экспериментальные точки, отсекает на оси абсции величину к^, равную II г/л, при которой скорость роста клеток снижается в 2 раза. Линейная зависимость 1/М-тах от остаточной концентрации этанола свидетельствует о том, что торможение скорости роста дрожжей этанолом описывается уравнением неконкурентного торможения энзиматичес ких реакций, т.е. этанол, по-видимому, ингибирует одну энзи-матическую реакцию, наиболее чувствительную к 'его действию.

этанол, г/л этанол, г/л

Рис.2. Зависимость |л и 1/ц от концентрации остаточного этанола.

Вопрос о том, какая реакция является "узким местом", наиболее чувствительным к высоким концентрациям этанола, требует проведения специальных исследований.

В экспериментах по изучению влияния концентрации этанола на синтез лимонных кислот в режиме хемостата было показано, что активный рост дрожжей и интенсивное образование

кислот наблюдается при поддержании остаточной концентрации этаноле в среде на уровне 0,01 - 1,0 г/л (табл.4). Повышение остаточной концентрации этанола от 1,0 до 8,7 не оказывало влияния на рост клеток, но подавляло синтез лимонных кислот.

Таблица 4. Влияние различных концентраций этанола на накопление биомассы и синтез лимонных кислот дрожжами

Уаггоиха Нро1у1;1са N 1.

! Показатели Остаточная концентрация этанола,г/л

0.01 .0,025 1,0 2,8 4,5 5,5 8,7 15,1 18,0

' Биомасса 6,0 6,6 6,5 6,65 6,8 6,8 6,8 5,6 3,6

ЛК, г/л . 12,4 19,2 14,2 5,5 0,7 0 0 0 0

ИЛК, г/л 8,68 9,58 6,4 5,23 0 0 0 0 0

Ацетат,г/л сл 0,25 0,29 0.38 0,52 1.0

ЛК-лимонная кислота

ШШ,- изолимонная кислота

Таким образом, можно высказать предположение, что синтез лимонных кислот более чувствителен к остаточной концентрации этанола, чем рост дрожжей.

Результаты работы показали, что концентрация этанола влияет и на качественный состав синтезируемых продуктов. В диапазоне остаточной концентрации этанола 0,01 - 1,0 г/л дрожжи синтезировали преимущественно лимонную кислоту. При более высоких концентраций этанола (до 2,8 г/л) дрожжи синтезировали приблизительно равные количества лимонной и изолимо-нной кислот. Дальнейшее увеличение концентрации остаточного этанола приводило к торможению синтеза как лимонной, так и изолимонной кислот, и накоплению в культуральной жидкости уксусной кислоты. Как мы полагаем, экскреция уксусной кислоты в среду культивирования является результатом несбалансированности окислительного метаболизма этанола.

Сопоставляя данные об активности ферментов при низких и высоких концентрациях этанола (табл.5), можно предположить, что различия на уровне начальных этапов окисления этанола

определяют направленность биосинтетических процессов. При низкой концентрации этанола отмечены низкие активности алко-гольдегидрогеназы (АДГ) и альдегиддегидрогеназы (АлДГ), между которыми устанавливается равновесие, сопровождающиеся окислением этанола и реализацией первых интермедиатов его метаболизма. В условиях высоких концентраций этанола происходит некоторое возрастание АДГ и резкое снижение активности АлДГ (в 4 - 8 раз).

Таблица 5. Активность ферментов (Е/мг белка) нитратного и глиоксилатного циклов в клетках дрожжей У.11ро1уЬд.са 1 при различных концентрациях этанола.

Ферменты Остаточная концентрация этанола, г/л

0,01 0,025 1.0 2,8 4,5 5,5 8,7 15,1 18,0

АДГ 0 03 0,034 0,04 0,028 0,03 0,04 0,04 0,03 0.03

АлДГ 0 008 0,008 0,005 0,003 0,002 0,002 0,002 0,001 0,001

ЦС I 8 1,8 1,8 1,3 1,2 1,2 1,05 1,0 1,0

АК и 48 и,42 0,38 0,26 0,08 0.08 0,08 0,09 и, 08

НАД-ИДГ 0 '002 0,012 0,02 0,01 0,002 0,002 0,002 0,03 0,03

НАД5-1ЩГЗ 0 3,05 3,12 3,72 3,8 3,91 5,0 7,33 7,68

ЦС-цитрэт-синтаза АК-аконитат-гидратаза АДГ-алкогольдегидрогеназа АлДГ-альдегиддегидрогеназа ИДГ -изоцитратдегидрогеназа

Это вызывает дисбаланс между образованием продуктов начальных этапов окисления этанола и их дальнейшим превращением, в результате чего ацетат накапливается в клетке и выделяется в культуральную жидкость. Это предположение согласуется с имеющимися в литературе представлениями о причине экскреции ацетата (,1опез,1989; Ильченко с соавт. ,1984).

Удаление из обмена части углерода при накоплении ацетата приводит к снижению активности функционирования ЦТК ( уменьшается в 2 раза активность цитрат-синтазы (ЦС), в 6 раз -аконитат-гидратазы (АК).

Обращает на себя внимание увеличение активности фермента НАДФ-изоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИДГ), который обеспечивает регенерацию восстановленного НАДФ, необходимого для биосинтетических процессов. По-видимому, значительная часть Ацетил-СоА, образующегося при потреблении ацетата, поступает не в ЦТК, а в систему биосинтеза жирных кислот. Следствием этого является сравнительно высокий уровень липидов в клетках (II - 13,5 %) в условиях повышенных концентраций этанола. Происходит и увеличение в 3 раза активности АТФ-цитрат-лиазы.

В условиях повышенных концентраций этанола для сброса избыточной энергии начинает работать цианидрезистентный путь переноса электронов.

Влияние концентрации растворенного кислорода.

Рост дрожжей и процесс сверхсинтеза лимонных кислот в значительной степени зависит и от уровня насыщения среды кислородом. Поскольку изменение концентрации ионов железа может оказывать существенное влияние на метаболизм клеток было целесообразно исследовать влияние концентрации растворенного кислорода на физиологию дрожжей У.Иро1уг1са N 1 в условиях низкого (0,2 мг/г) и высокого (2,5 мг/г) обеспечения клеток ионами железа.

При низком содержании железа (0,2 мг/г) и низкой концентрации кислорода в среде (5 % от насыщения) синтеза лимонных кислот не происходит (табл.6).

Повышение концентрации кислорода в среде до 20 и 60 % при содержании железа 0,2 мг/г вызывает увеличение накопления биомассы и резкое повышение содержания лимонных кислот (до 10,96 и 26,62 г/л соответственно). Зависимость плотности биомассы от р02 позволяет предположить, что рост клеток при р02 5 % был лимитирован кислородом.

Таблица 6. Влияние различных концентраций кислорода на накопление биомассы и синтез лимонных кислот дрожжами у.Иро1.уЫса в условиях низкого и высокого обеспечения клеток железом.

Ге2+= 0.2 мг/г

Ре2+ =2.5 мг/г

Показатели

р02)%

5%

20%

60%

5 %

20 % 60

Биомасса,Г/Л 2,88 6,0 7,3 6,88 7,02 6,9

Лимонная кислота,г/л 0 8,2 18,2 5,22 23,2 22,0

Изолимонная кислота,г/ 0' 2,76 8,0 1,0 1,33 10,3

Этанол потр.,г/л 48,6 48,56 47,75 57,2 57,15 53,2

Следует отметить, что внесение в питательную среду '(при р02 5 %) дополнительного количества Гево4 привело к повышению плотности биомассы (до 6,88 г/л) и синтезу лимонных кислот.

Таким образом, при р02 5 % и содержании железа 0,2 мг/г наблюдается двойное лимитирование: и железом, и растворенным кислородом, а, вероятнее всего, - метаболически доступной энергией. В этих условиях отмечается снижение интенсивности основной дыхательной цепи и повышение уровня цианидрезистент-ного дыхания.

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что способность дрожжей У.Иро1уЬ1са N 1 синтезировать лимонные кислоты при росте на среде с этанолом проявляется либо в условиях интенсивной аэрации среды (при низком обеспечении клеток железом ), либо в условиях низкого содержания кислорода при досточно высоком обеспечении клеток железом.

В итоге настоящей работы показана возможность практического получения лимонной кислоты из этанола в условиях непрерывного культивирования дрожжей Уаггоу/1а Нро1уЫса N 1; подобраны условия, обеспечивающие ее максимальное накопление в качестве основного продукта. На основании анализа физио-лого-биохимических особенностей процесса созданы предпосылки для его управления.

Результаты настоящего исследования могут открыть новые подходы к оптимизации условий получения лимонных кислот дрожжами в периодическом режиме, а также к возможности осуществления отливно-доливного метода получения лимонной кислоты из этанола дрожжами У.11ро1у1;1са N 1.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показана принципиальная возможность получения лимонной кислоты с помощью дрожжей из этанола в условиях непрерывного культивирования.

2. Исследовано в режиме рн-ауксостата влияние температуры, рН среды, концентрации этанола на удельную скорость роста мутанта Уаггоиаа Иро1у1;1са N 1, на основе элементного состава биомассы дрожжей в условиях максимальной скорости роста рассчитан состав питательной среды для последующего культивирования дрожжей с целью получения лимонной кислоты.

3. Исследована зависимость роста и синтеза лимонной и изоли-монной кислот в условиях хемостата от концентрации микроэлементов - цинка и железа, концентрации этанола и кислорода. Лимитирование продуцента микроэлементами и концентрацией кислорода в среде вызывает резкое снижение биосинтеза лимонных кислот.

4. Условием направленного биосинтеза лимонных кислот у.Иро-1у-Ыса N 1 из этанола является лимитирование роста источни ком азота. Обнаружена обратнопропорциональная зависимость между удельной скоростью роста продуцента (|х) и удельной скоростью синтеза лимонных кислот. Наиболее высокая интенсивность биосинтеза лимонных кислот достигнута при ц 0,01 час-1.

5. Подобраны оптимальные концентрации гп2+, Ге2+, а также концентрации этанола и кислорода в среде, обеспечивающие максимальную интенсивность биосинтеза лимонных кислот в условиях непрерывного культивирования.

Работы, опубликованные по теме диссертации:

Дедюхина Э.Г., Камзолова C.B., Ерошин В.К. Исследование синтеза липидов и состава биомассы конститутивного продуцента липидов Debaryomyces globosus в условиях непрерывного культивирования. //Микробиология. 1994. Т.63. Вып.6. С. 1007- 1015.

Камзолова C.B., Чистякова Т.И., Дедюхина Э.Г., Шишкано-ва Н.В., Финогенова Т.В. Исследование влияния концентрации этанола на максимальную удельную скорость роста и состав биомассы мутантного штамма Yarrowia lipolytica N 1 . //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1995. Т. 119. N II. С.492 - 496.

Камзолова C.B., Чистякова Т.И., Дедюхина Э.Г., Шишкано-ва Н.В., Финогенова Т.В. Исследование влияния температуры, рн и концентрации этанола на максимальную удельную скорость роста и состав биомассы мутантного штамма Yarrowia lipolytica N 1. //Микробиология, 1996. Т.65. Вып.1. С.47 - 52.

Финогенова Т.В., Камзолова C.B., Шишканова Н.В., Ильченко А.П., Дедюхина Э.Г., Влияние удельной скорости роста и ионов цинка на биосинтез лимонной и изолимонной кисло? дрожками Yarrowia lipolyitica N 1 в условиях непрерывного культивирования. //Прикл.биохимия и микробиол. 1996. Т.32. N I. с.42-50

Камзолова C.B., Шишканова Н.В., Ильченко А.П., Дедюхина Э.Г., Финогенова Т.В. Влияние ионов железа на биосинтез ли монноЙ и изолимонной кислот мутантом Yarrowia lipolytica N I в условиях непрерывного культивирования. //Прикл.биохимия и микробиол. 1996. Т.32. N I. С.50 - 58.

дедюхина Э.Г. Камзолова C.B., Ерошия B.K. Исе • ----

синтеза ^ _ состава биомассы конститутивного продуцента липвдо^ •■ ■ ■ niyoes globosus в условиях непрерывного культи-«шкробиология. 1994. Т.63. Вып.6. С.1007- 1015.

Камзолова C.B., Чистякова Т.И., Дедюхина З.Г., Шишканова II.В., Финогенова Т.В. Исследование влияния концентрации этанола на максимальную удельную скорость роста и состав биомассы мутантного штамма Yarrowia lipolytica N 1. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.1395.

Камзолова C.B., Чистякова Т.И., Дедюхина Э.Г., Шшканова Н.В., Финогенова Т.В. Исследование влияния температуры, pH и концентрации этанола на максимальную удельную скорость роста и состав биомассы мутантного штамма Yarrowia lipolytica N 1. //Микробиология, 1995 (в печати).

Камзолова C.B., Шишканова Н.В., Ильченко А.П., Дедюхина З.Г., Финогенова Т.В. Исследование синтеза лимонных кислот и состава биомассы дрожжей Yarrowia lipolytica N 1 в условиях непрерывного культивирования. //Прикл.биохимия и микробиол. (в печати).

Камзолова C.B., Шишканова Н.В., Ильченко А.П., Дедюхина Э.Г., Финогенова Т.В. Влияние ионов железа на биосинтез лимонных кислот мутанта Yarrowia lipolytica N 1 в условиях непрерывного культивирования. Прикл.биохимия и микробиол. (в печати).