Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль нуклеотидов в регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот у дрожжей Yarrowia lipolytica

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Солодовникова, Наталия Юрьевна, Пущино

4 " & - / п у,

/ ' ^ »„7 / л"' ^

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

ИМ. Г.К. СКРЯБИНА

На правах рукописи УДК 577.171

СОЛОДОВНИКОВА НАТАЛИЯ ЮРЬЕВНА

РОЛЬ НУКЛЕОТИДОВ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ СВЕРХСИНТЕЗА ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ У ДРОЖЖЕЙ Уаггота Про1уИса

03.00.04. - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н.,проф. Т.В. Финогенова к.б.н. А.А. Шарышев

л

ПУЩИНО 1998 г.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................... 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................... • • 9

ГЛАВА 1. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДРОЖЖЕЙ Уагго\ую Про1уПса, ПРОДУЦЕНТОВ ОРГАНИЧЕСКИХ

9

КИСЛОТ...................................................................................................

1.1. Сверхсинтез лимонных кислот дрожжами при выращивании

9

на глюкозе...............................................................................................

1.1.1. Физиологические особенности синтеза

9

лимонных кислот .......................................................................................

1.1.2. Биохимические особенности процесса сверхсинтеза лимонных

10

кислот ....................................................................................................

1.1.2.1. Ферментные системы, участвующие в метаболизме глюкозы

дрожжами................................................................................................. И

1.1.2.2. Изменение биоэнергетического состояния клеток дрожжей

14

в условиях лимитирования роста культуры источником азота..............................

1.2. Сверхсинтез кетокислот дрожжами Уатжга Ыро1уИса

при выращивании на глюкозе ....................................................................... ^

ГЛАВА 2. НАД^-ЗАВИСИМАЯ ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗА

И ЕЕ РЕГУЛЯЦИЯ У ДРОЖЖЕЙ................................................................ 19

2.1. Характеристика НАД^-гооцигратдегидрогеназы............................................ 19

2.2. Влияние метаболитов на НАД^-изоцитратдегидрогеназу................................. 21

2.3. НАД^-изоцитратдегидрогеназа и энергетический обмен.................................. 24

ГЛАВА 3. МЕТАБОЛИЗМ ИСТОЧНИКА АЗОТА У ДРОЖЖЕЙ........................... 25

3.1. Ассимиляция аммония дрожжами............................................................. 26

3.2. Активность ферментов начальных этапов азотного метаболизма

ло

у дрожжей.................................................................................................

3.3. Субклеточная локализация ферментов азотного метаболизма .......................... 30

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ................................................................. 32

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................32

4Л. Объект исследования............................................................................................................................................................32

4.2. Культивирование дрожжей..............................................................................................................................................32

4.3. Методика контроля роста биомассы......................................................................................................................33

4.4. Определение органических кислот в культуральной жидкости....................................................33

4.5. Определение концентрации ионов аммония в

33

культуральной жидкости..............................................................................

4.6. Определение концентрации глюкозы в

34

культуральной жидкости...............................................................................

4.7. Измерение интенсивности дыхания и ингибиторный анализ ......................................................34

4.8. Экстракция нуклеотидов....................................................................................................................................................35

4.9. Определение адениловых нуклеотидов................................................................................................................35

4.10. Определение пиридиннуклеотидов........................................................................................................................36

4.11. Получение бесклеточных гомогенатов..............................................................................................................37

4.12. Субклеточное фракционирование..........................................................................................................................38

4.13. Определение активности ферментов....................................................................................................................39

4.13.1. НАД^-зависимая изоцитратдегидрогеназа...............................................................39

4.13.2. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа........................................................................................................................39

4.13.3. Фумарат-гидратаза..........................................................................................................................................................40

4.13.4. НАД'-зависимая глутаматдегидрогеназа....................................................................................................40

4.13.5. НАДФ+-зависимая глутаматдегидрогеназа..............................................................................................40

4.13.6. Аланинаминотрансфераза........................................................................................................................................40

4.13.7. Аспартатаминотрансфераза......................................................................40

4.13.8. Глутаминсинтетаза..........................................................................................................................................................41

4.14. Очистка НАД^-зависимой изоцитратдегидрогеназы ..........................................................................41

4.15. Определение молекулярного веса и субъединичного

состава НАД^-зависимой изоцигратдегидрогеназы........................................................................................42

4.16. Определение концентрации белка........................................................................................................................42

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................... 44

ГЛАВА 5. ДИНАМИКА АДЕНИЛОВЫХ И ПИРИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ Уаггомш 1лро1уПса В УСЛОВИЯХ СВЕРХСИНТЕЗА

ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ.......................................................................... 44

5Л. Рост дрожжей У. Иро1уйса 704 на глюкозе

в условиях лимитирования источником азота ................................................... 44

5.2. Интенсивность дыхания и чувствительность

к цианиду при лимитировании роста дрожжей источником азота........................... 4(>

5.3. Экстракция нуклеотидов.......................................................................... 47

5.4. Внутриклеточное содержание адениловых нуклеотидов

при лимитировании роста дрожжей источником азота..........................................

5.5. Внутриклеточное содержание НАД* и НАДН 53 при лимитировании роста дрожжей источником азота..........................................

5.6. Рост дрожжей Y. lipolytica 704 на глюкозе при

лимитировании тиамином........................................................................... ^5

5.7. Интенсивность дыхания и чувствительность

57

к цианиду в условиях лимитирования роста дрожжей тиамином............................. J'

5.8. Внутриклеточное содержание адениловых и пиридиновых

57

нуклеотидов в клетках дрожжей, лимитированных тиамином................................ J'

ГЛАВА 6. МЕТАБОЛИЗМ ИСТОЧНИКА АЗОТА

У ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica..................................................................... 62

6.1. Динамика активностей ферментов начальных этапов

метаболизма азота....................................................................................... ^2

6.2. Локализация ферментов азотного обмена.................................................... 63

ГЛАВА 7. ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ НАД+-ЗАВИСИМОЙ

ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica............................ 66

7.1. Очистка НАД^-изоцитратдегидрогеназы...................................................... 66

7.2. Характеристика НАД^-изоцитратдегидрогеназы............................................ 69

7.3. Влияние метаболитов на активность НА Д+-из о цитр атд ег идр о геназ ы................. 72

7.4. Кинетическое поведение и регуляция НАД^-изоцигратдегидрогеназы................ 73

7.5. Зависимость скорости реакции от концентрации НАД^................................... 73

7.4.2. Зависимость скорости реакции от концентрации изоциграта

и влияние АМФ.......................................................................................... 74

7.4.3. Влияние АТФ на кинетические параметры фермента.................................... 77

7.4.4. Ингибирование БАД^-изоцитратдегидрогеназы НАДН................................. 79

ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................................... 82

8.1. Сравнение обеспеченности клеток дрожжей Y.lipolytica энергетическими и восстановительными эквивалентами

в условиях сверхсинтеза лимонных и кетокислот............................................... 82

8.2. Метаболизм источника азота у дрожжей -

продуцентов органических кислот..................................................................

8.3. Регуляция НАД+-зависимой изоцитратдегидрогеназы дрожжей

Yarrowia lipolytica ....................................................................................... ^7

8.4. Биохимический механизм сверхсинтеза органических кислот

дрожжами Y. lipolytica на глюкозе................................................................... 90

ВЫВОДЫ................................................................................................. 93

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................. 95

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время дрожжи Yarrowia lipolytica являются наиболее изучаемым видом из группы "нетрадиционных" дрожжей (Barth & Gaillardin, 1997). Такой интерес связан, во-первых, с принципиальным отличием этой группы дрожжей от хорошо изученных в отношении филогенетической эволюции, физиологии, генетики и молекулярной биологии дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe. Во вторых, дрожжи Y. lipolytica секретируют в большом количестве ряд метаболитов (органические кислоты, внеклеточные белки), что делает их привлекательным объектом для разработки биотехнологических процессов получения этих метаболитов.

В Лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов (ранее Лаборатория окислительного обмена веществ) ведутся работы по исследованию процессов сверхсинтеза органических кислот (лимонной, изолимонной, пировиноградной и 2-оксоглутаровой) дрожжами Y.lipolytica при использовании разных источников углерода. Сверхсинтез лимонной и изолимонной кислот происходит при ограничении роста дрожжей источником азота. Если среда культивирования является дефицитной по тиамину, то выделяются пировиноградная и 2-оксоглутаровая кислоты. Физиологические основы образования этих продуктов дрожжами изучены достаточно хорошо, однако биохимический механизм сверхсинтеза кислот до конца не ясен.

Сверхсинтез метаболитов микроорганизмами возможен при блокировании метаболического потока на каком-либо участке и нарушении согласованного функционирования катаболинеских и анаболических путей. При этом место блокирования метаболического потока определяется природой лимитирующего фактора и его специфическим воздействием на клеточный метаболизм.

Проводившиеся ранее исследования показали, что лимитирование роста дрожжей Y. lipolytica тиамином приводит к значительному снижению активности тиаминзависимой

2-оксоглутаратдегидрогеназы. Активность тиаминзависимой пируватдегидрогеназы также снижается, но в меньшей степени (Катаева с соавт., 1986; Катаева и Финогенова, 1987). Лимитирование роста дрожжей источником азота прежде всего должно сказываться на метаболизме азотсодержащих соединений. Однако сверхсинтез лимонных кислот, являющихся интермедиатами ЦТК, возможен при ингибировании НАД^-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАД-ИЦЦГ). Очевидно, что в условиях сверхсинтеза кетокислот этот фермент должен активно работать, чтобы обеспечить образование 2-оксоглутарата.

НАД-ИЦЦГ эукариот - это крупный алло стер ический фермент, регуляция которого определяет интенсивность функционирования ЦТК. При этом, важным фактором регуляции является энергетическое состояние клеток. По мнению некоторых исследователей, лимитирование роста дрожжей источником азота, приводящее к остановке биосинтеза азотсодержащих соединений, вызывает накопление в клетках АТФ и НАДН, которые в этих условиях не используются на биосинтетические цели (Evans & Ratledge, 1985с). Такая ситуация должна отрицательно сказываться на работе НАД-ИЦДГ.

Следует отметить, что в литературе имеются данные по содержанию адениловых нуклеотидов и изменению соотношения АТФ/АМФ в дрожжах Y.lipolytica (Marchai et al, 1977; Mitshushima et al., 1978) и в так называемых "липидных" дрожжах (Botham & Ratledge., 1979; Boulton & Ratledge., 1983; Evans et al., 1983) при ограничении их роста источником азота. Однако эти данные противоречивы. Определение содержания пиридиновых нуклеотидов в этих условиях у дрожжей, к сожалению, не проводилось. О содержании адениловых и пиридиновых нуклеотидов в клетках дрожжей Y.lipolytica в условиях сверхсинтеза кетокислот также ничего не известно.

Регуляция НАД-ИЦДГ у "липидных" дрожжей (Evans et al., 1983; Evans & Ratledge, 1985a) и дрожжей Y.lipolytica (Marchai et al., 1977; Mitshushima et al., 1978; Соколов с

соавт., 1995а) изучалась ранее на грубых или частично очищенных препаратах. Исследователи единодушно сходятся во мнении об определяющей роли соотношения АТФ/АМФ в регуляции активности этого фермента. Однако, существует противоречие по влиянию 2-оксоглутарата на активность НАД-ИЦДГ, Таким образом, для объяснения механизма сверхсинтеза органических кислот дрожжами У. Нро1уЫса необходима очистка и изучение кинетических параметров этого фермента. Кроме того, нам представляется необходимым исследование азотного метаболизма в клетках дрожжей УНро1уИса при ограничении их роста источником азота, так как есть непосредственная связь между процессом сверхсинтеза лимонных кислот и метаболизмом азотсодержащих соединений, к числу которых относятся и нуклеотиды.

На основании вышеизложенного целью настоящего исследования являлось изучение биохимического механизма сверхсинтеза органических кислот дрожжами У. Иро1уНса.

В задачи исследования входило:

1) сравнительное изучение динамик АТФ, АДФ, АМФ, НАДН и НАД* в клетках дрожжей У.Нро1уИса в условиях сверхсинтеза лимонных кислот и сверхсинтеза кетокислот при выращивании на глюкозе;

2) изучение азотного обмена в клетках дрожжей У. Иро1уИса при использовании глюкозы в качестве источника углерода;

3) выделение и характеристика НАД1-зависимой изоцитратдегидрогеназы дрожжей У.Иро1уИса, исследование механизмов ее регуляции.

Научная новизна работы. Исследована динамика адениловых и пиридиновых нуклеотидов в дрожжах У. Нро1уйса в условиях сверхсинтеза органических кислот. Установлено принципиальное отличие процессов сверхсинтеза лимонных кислот и сверхсинтеза кетокислот в обеспеченности клеток дрожжей восстановительными и

энергетическими эквивалентами. Показано, что процесс сверхсинтеза лимонных кислот сопровождается значительным снижением внутриклеточного содержания адениловых и пиридиновых нуклеотидов, однако соотношения АТФ/АМФ и НАДН/НАД* возрастают после исчерпания источника азота из среды культивирования. Процесс сверхсинтеза кетокислот происходит в условиях снижения соотношений АТФ/АМФ и НАДНХНАД*. Исследована динамика и субклеточная локализация ферментов азотного обмена у дрожжей Y.lipolytica в условиях лимитирования их роста источником азота. Проведено детальное исследование кинетических и регуляторных свойств очищенной до гомогенного состояния НАД-ИЦЦГ дрожжей Y.lipolytica. Показано отсутствие ингибирующего воздействия физиологических концентраций АТФ на активность этого фермента, что позволило сделать заключение о регуляции фермента in vivo уровнем АМФ, а не соотношением АТФ/АМФ. Показано отсутствие ингибирования НАД-ИЦЦГ 2-оксоглутаратом и глутаматом. Предложен биохимический механизм сверхсинтеза органических кислот дрожжами Y.lipolytica. Ключевая роль отводится регуляции НАД-ИЦДГ уровнем АМФ и соотношением НАДН/НАД+ в клетках.

Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований создано представление о механизмах тонкой регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот дрожжами Y.lipolytica, которое может бьггь использовано для разработки или усовершенствования процессов промышленного получения лимонных или кетокислот дрожжами.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конкурсе научных работ ИБФМ РАН, декабрь 1995 г.; на конференциях молодых ученых г.Пущино в мае 1996 г. и апреле 1998 г.; на Втором съезде Биохимического общества, г.Москва, май 1997г.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ДРОЖЖЕЙ Уаггом>1а Иро1уПса, ПРОДУЦЕНТОВ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ

1.1. Сверхсинтез лимонных кислот дрожжами при выращивании на

глюкозе

1.1.1. Физиологические особенности синтеза лимонных кислот

О способности дрожжей У. Иро1уНса к сверхсинтезу лимонной кислоты известно около тридцати лет. За это время были проведены определенные исследования физиологических и биохимических особенностей этого процесса. Так, известно, что условием сверхсинтеза лимонных кислот является лимитирование роста дрожжей минеральными компонентами среды - азотом, фосфором, серой или магнием, при одновременном содержании в среде избыточного количества источника углерода и тиамина (Лозинов и Финогенова, 1972; Лозинов с соавт., 1974; Финогенова с соавт., 1973). Необходимость введения в среду культивирования избыточного количества витамина В1 определяется ауксотрофностью данных дрожжей по пиримидиновому компоненту молекулы тиамина (Финогенова с соавт., 1969).

При отработке процессов сверхсинтеза лимонных кислот дрожжами У.Нро1уИса оказалось, что удобнее всего в качестве лимитирующего рост фактора использовать азот. Поэтому все дальнейшие исследования проводились в условиях ограничения роста сульфатом аммония - источником азота. Дрожжи У.Нро1уИса могут использовать в качестве источника углерода широкий ряд субстратов. Исследование процессов сверхсинтеза лимонных кислот дрожжами велись с использованием я-алканов (главным образом гексадекана), этанола и глюкозы в качестве единственных источников углерода. Соответственно проводилось изучение метаболизма этих соединений в дрожжевых клетках.

Изучение динамики роста и накопления лимон