Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гидролиз и модификация липидов с применением липолитических ферментов дрожжей Candida rugosa и Yarrowia lipolytica

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Гидролиз и модификация липидов с применением липолитических ферментов дрожжей Candida rugosa и Yarrowia lipolytica"

На правах рукописи

ЧАН ТХИ ТХУ хыонг

ГИДРОЛИЗ И МОДИФИКАЦИЯ ЛИПИДОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA RUGOSA И YARROW1A LI POL YTICA

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических па\ к

005541177

г 8 НОЯ 2013

Казань-2013

005541177

Работа выполнена на кафедре пищевой биотехнологии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет» (ФГБОУ ВПО КНИТУ)

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор, Гамаюрова Валентина Семеновна

Официальные оппоненты:

Хамагаева Ирина Сергеевна

доктор технических наук, профессор,

ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный

университет технологий и управления»,

заведующий кафедрой института

пищевой инженерии и биотехнологии, г. Улан-Удэ

Минзанова Салима Тахиятулловна

кандидат технических наук, доцент,

ФГБУН «Институт органической и физической

химии им. А.Е. Арбузова» Казанского научного центра

Российской академии наук,

старший научный сотрудник

технологической лаборатории

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Уфимский государственный нефтяной технический университет»

Защита диссертации состоится « 18 » декабря 2013 года в 14°° часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.02 при Казанском национальном исследовательском технологическом университете по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, д. 68, зал заседаний Ученого совета (А-ЗЗО).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского национального исследовательского технологического университета.

Автореферат разослан «.-/9» //-/ 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Степанова Светлана Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Липазы - это гетерогенные катализаторы, которые работают на поверхности раздела фаз. Они играют важнейшую роль в жизнедеятельности всей биоты и находят применение в различных отраслях промышленности, прежде всего пишевой, особенно в масложировой отрасли, фармацевтической, химической, кожевенной, текстильной, производстве моющих средств и медицине.

Потребность в липазах испытывает сельское хозяйство, особенно высокопродуктивное животноводство для производства кормовых добавок. Находят применение липазы в области охраны окружающей среды, в частности, для очистки стоков мясной, масло-жировой промышленности, которые труднее всего подвергаются другим видам очистки.

Разумеется, различные области применения требуют наличия липолитических ферментов с различными свойствами, прежде всего по селективности, по степени чистоты, устойчивости к различным факторам - температура, рН, способность сохранять ферментативную активность длительное время, способность к иммобилизации на различных матрицах и т.д. Таким образом, необходим широкий спектр липолитических ферментов. К сожалению, в России в промышленном масштабе практически не производятся липолитические ферменты, хотя потребность в них велика и приходится закупать дорогие зарубежные ферментные препараты, что сдерживает их широкое применение. Одной из причин такого положения является особенность свойств нативных липаз. Это гетерогенный катализатор, требующий подбора сложных сред, в которых наиболее эффективно он будет работать. Субстрат должен быть доступным для катализатора, для этого нужны эмульгаторы, часто органические растворители, причем те, которые бы не ингибировали фермент. Нативные липазы обычно обладают низкой термостабильностью, невысокими скоростями реакций в условиях, отличающихся от оптимальных, что требует практически во всех случаях разработку методов иммобилизации липолитических ферментов.

Таким образом, поиск новых продуцентов липаз и создание на их основе липолитических ферментных препаратов, обладающих различными свойствами по специфичности, устойчивости в различных средах, пригодных для решения разнообразного круга задач является одной из актуальных проблем биотехнологии. Разработка технологии промышленного получения липолитических ферментных препаратов требует решения целого комплекса серьезных экспериментальных задач на всех уровнях от лаборатории до производства.

Другая важная проблема, которая существует в пищевой промышленности - это модификация жиров с целью придания им определенных физико-химических и биологических свойств: нужной консистенции, пластичности, твердости, определенных технологических свойств, прежде всего стабильности, повышение пищевой и биологической ценности. Достигается это обычно регулированием жирно-кислотного состава жиров. Существующие методы модификации жиров, физические и химические, имеют ряд ограничений и недостатков. Наиболее перспективным в этом отношении считается ферментативный катализ. Но для применения ферментативного катализа с целью модификации жиров нужен не только широкий ассортимент липолитических ферментов, но и знание их жирно-кислотной специфичности. Обе эти проблемы - расширение спектра липолитических ферментов и выявление жирно-кислотной специфичности известных и новых ферментных препаратов, являются важнейшими и актуальными проблемами в биотехнологии.

* В руководстве диссертационной работой принимала участие к.т.н., доцент кафедры пищевой биотехнологии Зиновьева М.Е.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Исследования и ' разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» по госконтракту № 01201252915 от 28.02.2012 г.

Цель и задачи исследования. Исследование ферментативного гидролиза липидов различного происхождения в системе вода - масло в отсутствии химических эмульгаторов с использованием в качестве катализатора липазы из Candida rugosa (Type VII, производство Японии) и изучение условий проведения данного процесса.

Получение нового липолитического ферментного препарата на базе культуры дрожжей Yarrowia (Candida) ¡ipolytica Y-3153 (АТСС 34088) и выявление его особенностей.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

1) Выявление особенностей ферментативного гидролиза преимущественно монокислотных растительных масел (касторовое и оливковое) и рыбьего жира ферментным препаратом Candida rugosa в системах без эмульгаторов.

2) Установление жирно-кислотной специфичности ферментного препарата из Candida rugosa на примере гидролиза рыбьего жира и перспективы применения этого ферментного препарата для получения индивидуальных жирных кислот.

3) Разработка состава питательной среды для повышения липолитической активности дрожжей Yarrowia lipolytica с целью получения нового ферментного препарата -комплекса липаз, продуцируемых данным штаммом дрожжей.

4) Установление свойств липаз дрожжей Yarrowia lipolytica, возможности иммобилизации и способности к гидролизу и модификации жиров и выявление жирно-кислотной специфичности этого ферментного препарата.

Научная новизна. Впервые показано, что ферментный препарат из Candida rugosa может использоваться для гидролиза оливкового и касторового масел без применения эмульгатора, что облегчает последующее выделение жирных кислот (соответственно олеиновой и рицинолевой).

Впервые исследована жирно-кислотная специфичность ферментного препарата из Candida rugosa на примере гидролиза рыбьего жира и обнаружено, что фермент не способен гидролизовать ацильные остатки низкомолекулярных насыщенных жирных кислот до Спои, напротив, проявляет высокую специфичность при гидролизе ацильных остатков пентадециловой (С,5 0) и бегеновой кислот (С;2о), что делает его перспективным для получения этих дефицитных высших жирных кислот.

Разработан состав питательной среды для культивирования продуцента липазы дрожжей Yarrowia lipolytica, позволяющий при снижении затрат на сырьевые компоненты среды повысить липолитическую активность культуры в 3,2 раза по сравнению с средой, рекомендованной по паспортным данным.

Подобраны оптимальные условия для получения нового иммобилизованного препарата липазы на базе дрожжей Yarrowia lipolytica и показана его жирно-кислотная специфичность при гидролизе рыбьего жира.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы при получении олеиновой и рицинолевой кислот с использованием ферментативного гидролиза, протекающего при умеренных температурах, атмосферном давлении и в отсутствии эмульгатора, что обеспечивает простоту аппаратурного оформления процесса.

Полученный новый ферментный препарат на базе продуцента Yarrowia lipolytica может служить основой для дальнейшей пилотной разработки отечественного препарата липазы. Показана его пригодность для модификации жиров.

Достоверность полученных результатов. Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.

Апробация работы. Результаты работы доложены на: XII Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2012), Всероссийской молодежной научной школе «Биоматериалы и наноматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности» (Казань, 2012), VII Московском международном конгрессе «Биотехнология, состояние и перспективы развития» (Москва, 2013).

Публикации. По теме диссертационной работы имеется 9 публикаций, из них: 4 статьи в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации и 5 тезисов.

Лнчный вклад автора. Автор проводила все экспериментальные работы по теме диссертации, принимала участие в обсуждении результатов работы, написании и оформлении статей.

Обьем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и библиографического указателя (152 наименований источников). Работа изложена на 134 страницах текста, включает 24 таблицы и 30 рисунков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве катализатора гидролиза растительных масел (касторового, оливкового) и рыбьего жира, использовался коммерческий ферментный препарат липазы из Candida rugosa (активность - 300-400 Ед/мг белка по оливковому маслу, производство — Япония). Гидролиз масел липазой из Candida rugosa в системе вода - масло осуществлялся следующим образом: для получения водно-масляной эмульсии использовался высокоскоростной пищевой диспергатор Philips Xeniumk 700 (перемешивание осуществлялось в течение 5-7 мин.). Сухой ферментный препарат липазы (15-60 мг) вносился в 30 мл эмульсии вода - масло. Реакция осуществлялась при температуре 30-50 °С с перемешиванием (число оборотов - 100-200 об/мин) в течение 1-48 часов. Количество выделившихся в ходе реакции жирных кислот определялось методом титрования.

Разделение продуктов гидролиза осуществлялось методом холодной рафинации. Определение качественного и количественного состава высших жирных кислот способом газожидкостной хроматографии проводилось на хроматографе GC-2010.

Липолитическая активность дрожжей Yarrowia lipolylica определялась модифицированным методом Ота-Ямада, а концентрация белка в культуральной жидкости -биуретовым методом.

Все эксперименты проводились в 3-12 повторностях. Результаты обрабатывались с помощью пакета статистических программ «Statistica».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Растительные масла и продукты их переработки могут служить источником различных промышленно важных веществ. Получение свободных жирных кислот методом химического гидролиза растительных масел сопровождается образованием побочных темноокрашенных продуктов, протекает при высокой температуре и часто, при повышенном давлении. Ферментативный гидролиз в отличие от химического гидролиза,

5

протекает в мягких условиях. Предлагаемый в данной работе способ гидролиза в отсутствии эмульгаторов упрощает технологию целевого продукта, снижает количество побочных продуктов и облегчает процесс выделения целевых жирных кислот, а применяемый катализатор обеспечивает экологическую безопасность процесса.

Оливковое и касторовое масла представляют интерес, как масла, в которых преобладает определенная жирная кислота (олеиновая и рицинолевая) и, эти масла, соответственно, могут служить сырьем для их получения.

В работе также исследован гидролиз рыбьего жира, что в свою очередь позволило изучить специфичность липаз по отношению к жирно-кислотным остаткам различного строения и дало возможность получения модифицированных липидных продуктов с повышенной пищевой ценностью.

1 Гидролиз касторового масла ферментным препаратом липазой из Candida rugosa в системе вода - масло без эмульгатора

В настоящее время, возрос интерес исследователей к рицинолевой кислоте, так как, она имеет доступную сырьевую базу (источником ее служит касторовое масло, которое содержит до 85 % рицинолевой кислоты), а наличие оптически активного C¡2 центра, делает ее перспективным субстратом для получения хиральных полифункциональных соединений. Кроме того, рицинолевая кислота представляет интерес для медицины, так как обладает эффективным бактерицидным, противовоспалительным и противогерпети-ческим действием.

Жирно-кислотный состав используемого субстрата - касторового масла, был определен методом газожидкостной хроматографии. Данные представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Жирно-кислотный состав касторового масла

№ Жирные кислоты Содержание, %

1 Рицинолевая кислота 82,5

2 Линолевая кислота 8,0

3 Олеиновая кислота 7,4

4 Пальмитиновая кислота 1,9

5 Эйкозеновая кислота -0.1

6 Линоленовая кислота -0,1

В результате исследований экспериментально определены оптимальные условия проведения процесса гидролиза касторового масла с применением в качестве катализатора коммерческого ферментного препарата липазы из Candida rugosa: температура 45 °С, соотношение масло:вода = 40:6, количество фермента - 1 мг/мл, частота вращения перемешивающего устройства - 200 об/мин. Наибольшая глубина гидролиза касторового масла достигнута к 16 часам и составляет 47 % (таблица 2).

При вышеуказанных оптимальных условиях гидролиза, с целью увеличения глубины гидролиза, проводилось дробное добавление воды в реакционную среду через определенные промежутки времени, что приводит к снижению выхода жирных кислот.

Таблица 2 - Влияние параметров проведения гидролиза касторового масла на

выход жирных кислот

Параметры Выход жирных кислот, мкМ/мл и %

1 час ! 2 часа 3 часа 4 часа

мкМ/мл | % і мкМ/мл | % мкМ/мл 1 % мкМ/мл %

Соотношение иасло:вода

40:2 38±4 1,36 86±8 3,07 146±5 5,21 194±5 6,93

40:5 87±6 3.11 174±10 6,21 262±6 9,36 338±4 12,07

40:6 62±6 2,21 190±5 6,79 318±2 11,36 422±5 15,07

40:7 70±6 2.50 198±5 7,07 302±3 10,79 414±5 14,79

Темпе ратура, °С

37 і 62±6 2,21 190±5 6,79 318±2 11,36 422±5 15,07

40 | 70±4 2,50 238±3 8,50 330±5 11,79 430±4 15,36

45 130±3 4,64 310±5 11,07 410±5 14,64 502±2 17,93

50 78±2 2,97 214±2 1 7,64 319±3 11,36 430±2 15,36

Количество фермента, мг/мл

0,7 62±2 2.21 218±2 7,79 306±5 10,93 354±Ю 12,64

1,0 62±6 2,21 190±5 6,79 318±2 11,36 422±5 15,07

1.3 | 54±7 1,93 198±8 7,07 330±1 11,79 446±2 15,93

Скорость перемешивания, об/мин

100 30±2 1,07 114±3 4,07 250±5 8,93 314±5 11,21

150 130±3 4,64 310±5 11,07 410±5 14,64 502±2 17,93

200 171±2 |6,11 352±5 | 12,57 488±5 17,43 566±5 20.21

С целью дальнейшего повышения выхода целевого продукта исследовано влияние на процесс гидролиза касторового масла введения в реакционную смесь неорганических солей и их оксидов, а также органических растворителей.

Анализ полученных данных показал, что при добавлении хлоридов кальция и магния активирующий эффект наблюдается уже при низких концентрациях солей и максимальный положительный эффект составляет порядка 3 % при концентрации СаС12 0,02 М/л и около 5 % при концентрации М£С12 0,03 М/л. При дальнейшем повышении концентрации хлорида кальция (больше 0,05 М/л) наблюдается ингибирующий эффект. Увеличение концентрации хлорида магния свыше 0,1 М/л ведет к нарастанию ингибиро-вания, но этот процесс происходит медленнее, чем при использовании хлорида кальция. Степень влияния хлоридов кальция и магния на глубину гидролиза также зависит от продолжительности реакции. Максимальный выход продуктов достигается при внесении СаС12 через 12 часов и для MgCl2 через 18 часов реакции.

Хлорид цинка дает хороший активирующий эффект в течение первого часа проведения реакции при малых концентрациях (0,01 М/л), но с увеличением его концентрации свыше 0,05 М/л и с возрастанием времени процесса наблюдается эффект ингибирования.

При введении оксидов кальция, магния и цинка при концентрациях (0,01-0,2 М/л) наблюдается ингибирование ферментативного гидролиза.

Гидролиз касторового масла в используемой системе затруднен его высокой вязкостью. Для устранения этого фактора, мешающего процессу, проведены исследования по влиянию органических растворителей на гидролиз касторового масла. Изучения показали, что введение в среду органических растворителей (хлороформ, диэтиловый эфир, петролейный эфир) оказывает положительный эффект только на начальных этапах процесса гидролиза, в дальнейшем они замедляют процесс, вероятно, за счет ингибирования фермента.

2 Гидролиз оливкового масла ферментным препаратом липазой из Candida rugosa в системе вода - масло без эмульгатора

Оливковое масло является естественным субстратом для липаз, поэтому интересно рассмотреть как проходит гидролиз данного субстрата в системе без эмульгатора. Оливковое масло содержит до 85 % мононенасыщенной олеиновой кислоты, кроме того оливковое масло содержит линолевую (до 17 %) и линоленовую (до 0,5 %) кислоты, которые являются полиненасыщенными.

Одним из наиболее перспективных способов получения свободных ненасыщенных жирных кислот из триглицеридов можно считать ферментативный гидролиз, не приводящий к окислению двойных связей ненасыщенных жирных кислот и не загрязняющий окружающую среду.

В данной работе, изучено влияние различных параметров на процесс гидролиза оливкового масла. Данные приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Влияние параметров проведения ферментативного гидролиза

Параметры Выход жирных кислот, мкМ/мл и %

1 час ! 2 часа 3 часа і 4 часа

мкМ/мл 1 % ; мкМ/мл 1 % мкМ/мл ; % І мкМ/мл 1 %

Содержание воды, %

60 1581±26 49,40 2087±34 65.22 2300±86 1 71,88 2332±82 72,88

50 1528±48 47,75 2141±49 66,91 2454±23 ! 76,69 2547±23 79,59

40 1269±19 39,66 1757±29 54,91 1945І27 60,78 2177±69 68,03

Температура, °С

30 1518±28 47,44 2013±27 ! 62,91 2418=25 75,56 ! 2463±35 76,97

37 1528±48 47,75 2141±49 66,91 2454±23 76,69 ¡ 2547±23 79,59

40 1535±34 47,97 2025±23 63,28 2420=37 75,63 j 2510±31 78,44

45 1401±39 43,78 1816±34 ; 56,75 2065±22 64,53 і 2148±42 67,13

Количество фермента, мг/мл

0,5 1136±25 35,50 1719±66 53.72 2034±82 63,56 2197±97 68,66

1,0 1528±48 47,75 2141±49 66,91 2454=23 76,69 2547±23 79,59

1,5 1980±84 61,88 2424±34 75,75 2473±39 77,28 2600±26 і 81,25

2,0 1211±45 37,84 2448=34 76,50 2156±32 67,38 2295±48 ! 71,72

Скорость перемешивания, об/мин

100 658±22 20,56 ! 1258*43 ! 39,31 1631±28 50,97 1945±45 60,78

150 869±34 27,16 1510±35 47,18 1914=41 59,81 2186±22 68,34

200 1211±45 37,84 2448±34 76,50 2156±32 67,38 2295±48 71,72

Изучение процесса ферментативного гидролиза оливкового масла в среде без эмульгатора показало, что наибольшая глубина гидролиза достигается при следующих условиях: температура 37°С, содержание воды в системе вода - масло 50 %, количество вносимого фермента 1,5 мг/мл, скорость перемешивания 200 об/мин. Гидролиз масла липазой из Candida rugosa в установленных условиях протекает интенсивно в отличие от гидролиза касторового масла. Максимальный выход жирных кислот наблюдается уже через 4 часа гидролиза оливкового масла и составляет 2600 мкМ/мл или 81 %.

3 Гидролиз рыбьего жира ферментным препаратом липазой из Candida rugosa в системе вода — масло без эмульгатора

Если оливковое и касторовое масла являются преимущественно однокислотными растительными маслами с содержанием соответственно олеиновой и рицинолевой кислоты до 85 %, то рыбий жир имеет сложный жирно-кислотный состав, причем полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), входящие в его состав, особенно

ш-З-ПНЖК, считаются наиболее легко усваиваемыми организмом человека. Известно, что ПНЖК семейства со-3 являются биологическими предшественниками эйкозаноидов, обеспечивающих в значительной степени состояния здоровья человека. В связи с этим рыбий жир относится к лечебно-профилактическим продуктам.

Для выяснения жирно-кислотной специфичности фермента липазы из Candida rugosa и возможности получения высших жирных кислот исследован гидролиз рыбьего жира с помощью этого фермента.

В таблице 4 представлен жирно-кислотный состав аптечного рыбьего жира марки «Янтарная капля» в соответствии с требованиями ТУ 9197-005-45111441-08, определенный методом хроматографии.

Таблица 4 - Жирно-кислотный состав рыбьего жира

№ Тривиальные названия Систематические названия Содержание, %

1 Каприновая Декановая (Сню) 0,0427

2 Лауриновая Додекановая (С12 0) 0,0804

3 Тридекановая Тридекановая (Сіз о) 0,0366

4 Миристиновая Тетрадекановая (Сн-о) 6,2603

5 Миристолеиновая Цис 9-тетрадеценовая (Cm) 0,2356

6 Пентадециловая Пентадекановая (С15 0) 0,4681

7 Пальмитиновая Гексадекановая (С|6 0) 18,2336

8 Пальмитолеи новая Цис 9-гексадеценовая (Сіб і) 9,7859

9 Тетрадеценовая Цис 5-тетрадеценовая (См і) 0,9686

10 Стеариновая Октадекановая (С|8 0) 4,0145

11 Олеиновая Октадеценовая (Cig ¡) 25,2706

12 Линолевая Цис 9,12-Октадекадиеновая (C|g 2) 4,6815

13 Линоленовая Цис 9,12,15-Октадекатриеновая (Сів 3) 1,7676

14 Арахиновая Эйкозановая (С20 о) 3,2733

15 Гондоиновая Цис 11-Эйкозановая (С201) 6,9909

16 Бегеновая Докозановая (С29 о) 12,3593

17 Эруковая Цис 13-Докозеновая (С221) 5,5304

Результаты экспериментальных исследований гидролиза рыбьего жира с помощью липазы из Candida rugosa в системе без химического эмульгатора, представлены в таблице 5.

Установлено, что наиболее эффективно гидролиз протекает при следующих условиях: температура 37 °С, содержание воды в системе 50 % об, количество вносимого фермента 1 мг/мл, скорость перемешивания 200 об/мин. Показано, что гидролиз проходит интенсивно в течение 4 часов, дальнейшее увеличение продолжительности реакции до б часов мало меняет выход жирных кислот (ЖК). Максимальный выход ЖК через 4 часа составил 1012 мкМ/мл или 33 % от общего содержания кислот в рыбьем жире.

Таблица 5 - Влияние параметров проведения гидролиза рыбьего жира на выход

Параметры Выход жирных кислот, мкМ/мл и %

1 час 2 часа | 3 часа 4 часа

мкМ/мл і % мкМ/мл 1 % ¡ мкМ/мл ¡ % мкМ/мл І %

Содержание волы, %

60 613±2,3 20,10 823±1,4 26,98 910±1,2 29,84 950±0,7 31,15

50 664±0,6 21,77 855±8,6 28,03 969±0,8 31,77 1012±1,6 33.18

40 415±2,6 13,61 629±2,5 20,62 739±1,6 24,23 І 811±1,8 26,59

Температура, °С

30 562±3,2 18,43 805±4,1 26,39 931±1,8 30,52 976±5,2 32,00

37 664±0,6 21,77 855±8,6 28,03 969±0,8 31,77 1012±1,6 33,18

40 616±2,9 20,20 841±2,5 27,57 950±4,5 31,15 976±3,9 32,00

45 500±1,8 16,39 676±2,9 22,16 836±3,7 27,41 964±4,6 31,61

Количество фермента, мг/мл

0,5 1 400±2,7 13,11 564±1,9 18,49 677±2,1 22,20 748±2,0 24,52

1,0 664±0,6 21,77 855±8,6 28,03 969±0,8 31,77 1012±1,6 33,18

1,5 644±1,7 21,11 772±1,4 25,31 911±0,4 29,87 970±1,5 31,80

Применяемая нами система не содержит химических эмульгаторов и может быть быстро разделена на жировую и водную фазы с помощью центрифугирования или отстаивания, при этом фермент остается в водной фазе. Изучена возможность повторного применения липазы из Candida rugosa. Согласно данным, представленным в таблице 6, при повторном применении ферментного препарата, его активность не снижается.

Таблица 6 - Возможность повторного применения ферментного препарата

Концентрация жирных кислот, мкМ/мл

Первичный гидролиз Повторное применение фермента

969,0±0,8 978,0±0,7

В таблице 7 представлены ВЖК-продукты гидролиза рыбьего жира, полученные при оптимальных условиях гидролиза ферментом из Candida rugosa, выделенные методом холодной рафинации и проанализированные методом хроматографии.

№ Тривиальные Фактическое Расчетное содержание Разница, %

названия содержание кислот, % кислот, %

1 Миристиновая 4,1662 2,0659 2,1003

2 Пентадециловая 32.1413 0,1545 31,9868

3 Пальмитиновая 9,9839 6,0171 3,9668

4 Пальмитолеиновая 3,9011 3,2293 0.6718

5 Тетрадеценовая 0,7408 0,3196 0,4212

6 Стеариновая 3,4142 1,3248 2,0894

7 Олеиновая 12,4696 8,3393 4,1303

8 Линолевая 1,9514 1,5449 0,4065

9 Линоленовая 0,6987 0,5833 0,1154

10 Арахиновая 3,8711 1,0802 2,7909

11 Гондоиновая 6,8399 2,3070 4,5329

12 Бегеновая 13,7764 4,0786 9,6978

13 Эруковая 6,0453 1,8250 4,2203

В таблице 7 приведена графа расчетного содержания ЖК при условии равноценного гидролиза всех кислот и с учетом глубины гидролиза 33 %. Разница между фактическим и расчетным содержанием кислот в продуктах гидролиза может служить относительной мерой жирно-кислотной специфичности фермента по отношению к соответствующим жирным кислотам.

Анализ этих данных показывает, что ферментный препарат из Candida rugosa не гидролизует ацильные остатки низших насыщенных ЖК - каприновая, лауриновая, тридекановая (Сюо, С|2о> Сп о), а также миристолеиновую кислоту (Ci4 i), поскольку эти кислоты отсутствуют в продуктах гидролиза. Гидролиз начинается с ацильного остатка миристиновой кислоты (См о) и затрагивает ацильные остатки всех остальных кислот до С22- Хуже всего ферментный препарат гидролизует ацильные остатки полиненасыщенных жирных кислот - линолевая (Cjg2) и линоленовая (С|83). Неожиданно оказалось, что самой высокой способностью к гидролизу ферментным препаратом Candida rugosa обладают ацильные остатки насыщенных пентадециловой и бегеновой кислот (С, 5 о и С22 о), так как их содержание в продуктах гидролиза резко возрастает. Таким образом, ферментный препарат из Candida rugosa можно рассматривать как перспективный катализатор при гидролизе рыбьего жира для получения дефицитных пентадециловой и бегеновой кислот.

4 Получение ферментного препарата с использованием дрожжей Yarrowia lipolytíca Y-3153 (АТСС34088)

Диморфные аскомицетные дрожжи Yarrowia lipolylica являются перспективным объектом для получения промышленно ценной липазы. Состав питательной среды оказывает большое влияние на уровень биосинтеза липаз микроорганизмами. В данной работе исследован состав питательной среды для повышения липолитической активности дрожжей Yarrowia ¡ipolytica Y-3153 (АТСС 34088).

Рассмотрено влияние концентрации глюкозы и времени культивироваия на рост и липолитическую активность культуры Yarrowia ¡ipolytica при использовании традиционных сред, без добавления липидных индукторов. Показано, что с увеличением концентрации глюкозы в среде с 5 до 20 г/л максимальные рост культуры и липолити-ческая активность наблюдаются при концентрации глюкозы 20 г/л. Это соответствует паспортным данным на этот штамм. Однако, если рост культуры возрастает с увеличением времени культивирования, то липолитическая активность с повышением времени снижается, причем наиболее значительно это снижение при более низких концентрациях глюкозы 5 и 10 г/л, приблизительно в 5 раз.

Микробные липазы являются индуцируемыми ферментами. Индукторами обычно являются субстраты, на которые действует данный фермент или продукты их гидролиза, а также некоторые аналоги этих соединений. Действие индукторов зависит от вида и штамма микроорганизма и также от природы самого индуктора.

В качестве индукторов биосинтеза липазы дрожжами Yarrowia Iipolytica, изучены следующие виды масел - оливковое, льняное и касторовое. Выбор этих масел обусловлен их различным жирно-кислотным составом.

Влияние выбранных индукторов биосинтеза липазы исследовалось при использовании питательных сред с различным содержанием глюкозы от 0 до 20 г/л.

При концентрации глюкозы 20 г/л, как указанной в паспорте для этого штамма, введение индукторов (оливкового и льняного масел) не приводит к повышению липолитической активности липазы. Однако, на всех этапах культивирования с добавлением оливкового и льняного масел наблюдается значительное улучшение рост культуры по

11

сравнению с контролем. С увеличением времени культивирования только внесение касторового масла приводит к повышению липолитической активности и снижению концентрации биомассы.

С уменьшением концентрации глюкозы в среде культивирования до 10 г/л, после 24 часов культивирования, рост липолитической активности наблюдается при внесении всех используемых липидных индукторов примерно в 2 раза выше, чем в контроле. Максимальный прирост биомассы обеспечивает введение оливкового и льняного масел в среду культивирования. Установлено, что при снижении концентрации глюкозы в питательной среде с 20 до 5 г/л, эффективность липидных индукторов возрастает. Полученные результаты представлены в таблице 8.

При концентрации глюкозы в питательной среде 5 г/л, скудость питательной среды приводит к тому, что уже через 18 часов культивирования все индукторы способствуют росту липолитической активности. Через 24, 48 часов культивирования оливковое и льняное масла, как наиболее пригодные источники питания, дают максимальные приросты липолитической активности, почти в 8 раз выше контроля. Полученные результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8 - Влияние вида индуктора на рост и липолитическую активность

культуры Уаггота Ііроіу/іса при концентрации глюкозы 5 г/л

Вид индуктора Липолитическая активность, Ед/мл к. ж. Концентрация белка, мг/мл к.ж. АСБ, г/л Удельная активность, Ед/мг белка к.ж. Относительная активность, Ед/мг АСБ

Время культивирования - 12 часов

Контроль 57±1 6,56 2,98 8,64 19,03

Оливковое масло 17±0 6,41 5,43 2,59 3,10

Льняное масло 17±0 6,49 6,39 2,57 2,67

Касторовое масло 47±1 6,78 3,35 6,88 13,95

Время культивирования - 18 часов

Контроль 42±1 6,56 3,36 6,35 12,42

Оливковое масло 78=1 7,22 5,88 10,84 13,31

Льняное масло 60±1 7,88 6,85 7,55 8,77

Касторовое масло 55±1 7,00 4,59 7,85 12,05

Время культивирования - 24 часа

Контроль 15±0 4,21 3,79 3.57 3,96

Оливковое масло 75±1 6,34 6,96 11,82 10,81

Льняное масло 62±1 5,24 6,70 11,77 9,22

Касторовое масло 43±1 4,73 4,66 9,17 9,29

Время культивирования - 36 часов

Контроль 17±0 4,65 3,71 3,57 4,48

Оливковое масло 80±1 6,41 7,75 12,47 10,32

Льняное масло 80±1 5,83 8,02 13,72 9,95

Касторовое масло 45±1 4,58 4,25 9,81 10,56

Время культивирования - 48 часов

Контроль 13±0 5,09 3,43 2,61 3,87

Оливковое масло 102±1 5,68 7,64 17,89 13,33

Льняное масло 103±1 5,61 7,07 18,39 14,58

Касторовое масло 37±0 4,58 3,53 8,04 10,40

Состав питательной среды; глюкоза 5 г/л, пептон 10 г/л и дрожжевой автолизат 5 мл/л

Все используемые липидные компоненты, кроме касторового масла, являются не только индукторами, увеличивающими продукции липазы, но и используются культурой для роста.

Этот вывод подтверждается экспериментами с выращиванием культуры в питательных средах с отсутствием глюкозы. Наилучшие результаты по росту биомассы и липолитической активности дают также льняное и оливковое масла, хотя эти показатели значительно ниже тех, которые получены в средах с присутствием глюкозы.

Большое влияние на биосинтез липазы оказывает не только вид индуктора, но и его концентрация в среде культивирования. Установлено, что для роста культуры Уаггота I\polytica и биосинтез ею липазы оптимальным является содержание в питательной среде (5 г/л глюкозы, 10 г/л пептон, 5 мл/л дрожжевой автолизат) оливкового масла в концентрации 1 %.

Важным фактором, определяющим интенсивность накопления липаз микроорганизмами, является источник азота в среде выращивания. Исследовано влияние следующих соединений на биосинтез липазы культурой дрожжей Уаггоша Иро1уЧса\ сульфат аммония, мочевина, пептон, необезжиренная соевая мука, обезжиренная соевая мука.

Рекомендуемая в паспорте культуры среда культивирования в качестве источника азота предлагает пептон в концентрации 10 г/л. Но данный источник азота является дорогостоящим. Поэтому предприняты попытки заменить пептон на более дешевые минеральные источники азота, такие как сульфат аммония и мочевина. Но как показали исследования, неорганические источники азота не используются культурой для роста и выработки липазы.

В таблице 9 представлены данные по влиянию концентрации пептона на рост и липолитическую активность дрожжей Уа/тоича Иро1уИса.

Таблица 9 - Зависимость липолитической активности и роста культуры _ Уагго\у\а Иро1уНса от концентрации пептона_

Время культивирования, ч Концентрация пептона, г/л ЛА, Ед/мл к.ж. АСБ, г/л

24 10 80,0±1,6 6,5

20 і 115,0±2,4 8,5

30 70,0±1,4 10,2

48 10 112,0±2,4 7,4

20 85ДЫ.6 і 10.3

30 53,0±1,2 ! 11,9

Состав среды: оливковое масло - I % об, глюкоза - 5 г/л. дрожжевой автолизат - 5 мл/л пептон -10-30 г/л

Как видно из представленных данных, увеличение концентрации пептона до 20 г/л, приводит к возрастанию липолитической активности на 30 % по сравнению с исходной. Дальнейшее же повышение концентрации пептона, хотя и приводит к увеличению концентрации биомассы, но не оказывает положительного влияния на липолитическую активность культуры.

По литературным данным, высокая липолитическая активность при культивировании различных видов микроорганизмов наблюдается на средах богатых сложными органическими соединениями, такими как кукурузная мука, соевая мука и др. В связи с этим в работе исследовалось влияние как необезжиренной, так и обезжиренной соевой муки на липолитическую активность дрожжей Уштомча Иро1уйса. Результаты приведены на рисунке 1.

160 й 120

80

40

■

20 30

Концентрация, г/л

О Полножирная соевая мука В Обезжиренная соевая мука

40

Рисунок 1 — Зависимость липолитичсской активности культуры дрожжей Кяггон>/я Нро1уИса от концентрации источников азота в среде культивирования. Состав среды: оливковое масло - 1 % об, глюкоза - 5 г/л, дрожжевой автолизат - 5 мл/л

Установлено, что введение полножирной соевой муки в оптимальной концентрации (30 г/л) эффективнее, чем использование пептона в качестве источника азота, так как липолитическая активность при этом выше примерно в 1,15 раза, по сравнению с использованием пептона.

Как видно из представленных данных, оптимальной концентрацией обезжиренной соевой муки является - 40 г/л. При этом наблюдается максимальная липолитическая активность культуры, которая составляет 153 Ед/мл к.ж.

ПАВ являются хорошими индукторами биосинтеза липазы для различных микроорганизмов. ПАВ в составе питательной среды при культивировании продуцентов липаз могут оказывать разностороннее действие, и непосредственно на клетки, и на доступность нерастворимого в воде липидного индуктора для микроорганизма, и на процесс выделения фермента из клеток, и, возможно, на сам фермент.

Результаты по влиянию твина-20 на биосинтез липазы дрожжами Уаггомча \ipo\ytica при использовании различных органических источников азота (пептон, полножирная соевая мука, обезжиренная соевая мука) представлены в таблице 10.

Таблица 10 - Зависимость биосинтеза липазы дрожжами Уагго\\>'ш Иро/уИса от

Источники азота Концентрация твина - 20, мг/мл Липолитическая активность, Ед/мл к.ж.

0(контроль) 100±2

1,0 35±1

Пептон в концентрации 20 г/л 0,1 67±2

0,01 115±2

0,001 125±3

0,0001 103 ±2

0,00001 100±2

0,0 (контроль) 105±2

1,0 60±1

Полножирная соевая 0,1 75±1

мука в концентрации 0,01 120±4

30 г/л 0,001 187±4

0,0001 165±4

0,00001 110±2

0,0 (контроль) 153±4

Обезжиренная соевая мука в концентрации 40 г/л 1,0 121±4

0,1 190±4

0,01 200±5

0,001 210±5

0.0001 155±4

Наибольший прирост липолитической активности наблюдается при использовании в качестве источника азота соевой муки и обезжиренной соевой муки при добавлении твина-20 в концентрации 0,001 мг/мл.

Таким образом, наиболее высокая липолитическая активность при культивировании дрожжей Yarrowia lipolylica наблюдается на среде следующего состава: оливковое масло - 1 % об, глюкоза - 5 г/л, дрожжевой автолизат - 5 мл/л, обезжиренная соевая мука - 40 г/л, твин-20 - 0,001 мг/мл. При использовании данной среды удалось повысить липолитическую активность культуры в 3,2 раза по сравнению со средой, рекомендованной по паспортным данным.

5 Выделение липаз из дрожжей Yarrowia lipolytica

Для выделения липазы из культуральной жидкости дрожжей Yarrowia lipolylica в работе использовались методы осаждения органическими растворителями и неорганическими солями. Результаты исследований показали, что неорганические соли (сульфат аммония, хлорид кальция) в любой степени насыщения не вызывали осаждения фермента из культуральной жидкости.

При использовании органических растворителей для осаждения липазы установлено, что наиболее высокая липолитическая активность липазы сохранялась при использовании этанола в качестве осаждающего агента. Однако, из-за высокого ингибирующего и денатурирующего влияния этанола на целевой фермент через 24 часа осаждения липаза потеряла свою активность.

6 Иммобилизация липазы дрожжей Yarrowia lipolytica в агаровый гель

Для сохранения активности липазы и получения препаратов с удлиненным сроком хранения была исследована иммобилизация культуральной жидкости, содержащей липазу в гель агара.

Ранее показано, что иммобилизация липазы из Candida rugosa в гель агара в присутствии хлористого кальция (0,8 М/л) позволяет повысить активность фермента. Кроме того, хлористый кальций является электростатическим модификатором и увеличивает прочность агарового геля. В связи с этим определена оптимальная концентрация хлорида кальция (0,2 М/л), позволяющая сохранить липолитическую активность

Рисунок 2 - Влияние концентрации СаСЬ на активность иммобилизованной липазы Yarrowia lipolytica

Полученный препарат хранился при температуре 4 °С. Установлено, что активность иммобилизованной липазы сохранялась в течении двух недель без изменения. Увеличение времени хранения препарата приводит к медленному снижению активности, потеря которой к концу 21-х суток составляет 17 % по сравнению с исходной активностью.

препарата при иммобилизации (рисунок 2).

Концентрации СаС12, М/л

7 Проведение гидролиза иммобилизованным препаратом липазы \arrowia Ііроіуґіса оливкового масла

Установлено, что полученный иммобилизованный препарат липазы из Уаггохчіа Ііроіуііса способен осуществлять гидролиз оливкового масла и рыбьего жира в системах с использованием различных эмульгаторов и без них.

8 Модификация рыбьего жира ферментным препаратом из Уаггон'іа Ііроіуйса и установление его жирно-кнслотной специфичности

Модификацию рыбьего жира проводили в следующих условиях: температура 37 °С, соотношение масло:вода = 50:50, количество фермента - 0,9 г/мл, скорость перемешивания - 200 об/мин.

Жирно-кислотный состав модифицированного липидного продукта, полученного при использовании иммобилизованного ферментного препарата Уаггота ПроІуИса был определен методом газожидкостной хроматографии, представлен в таблице 11.

№ Тривиальные названия Фактическое содержание ВЖК в модифицированном продукте, % Содержание этих кислот в исходном рыбьем жире, %

1 Миристиновая 7,0950 6,2603

2 Миристолеиновая 0,2855 0,2356

3 Пентадециловая 0,3726 0,4681

4 Пальмитиновая 22,2118 18,2336

5 Пальмитолеиновая 9,3038 9,7859

6 Тетрадеценовая 1,1895 0,9686

7 Стеариновая 3,4382 4,0145

8 Олеиновая 28,1467 25,2704

9 Линолевая 4,4084 4,6815

10 Линоленовая 3,1281 1,7676

11 Гондоиновая 2.4840 6,9909

12 Бегеновая 14,4842 12,3593

13 Эруковая 3,4521 5,5304

Анализ показал, что по жирно-кислотной специфичности препарат полученный на основе дрожжевой липазы культуры Yarroma ¡ipolylica отличается от ферментного препарата Candida rugosa. Так, фермент Yarrowia lipolyüca гидролизует ацильные остатки насыщенных жирных кислот С,оо - С,з;о и арахиновой кислоты (С2оо), так как они полностью отсутствуют в модифицированном жире. Кроме того, снижается содержание других насыщенных кислот пентадециловой (С^ о) и стеариновой кислоты (С,8о)- Из ненасыщенных кислот в модифицированном жире увеличивается содержание олеиновой (С]8|) и линоленовой КИСЛОТ (Сю), но снижается содержание эруковой кислоты (С221), что является важным положительным фактором, так как присутствие эруковой кислоты в жирах не желательно, поскольку она относится к токсичным кислотам и ее высокое содержание в маслах делает их не пригодными для пищевых целей. Эруковая кислота содержится в семенах некоторых растений, в частности рапса. Рапсовое масло с высоким содержанием эруковой кислоты пригодно только для технических целей.

Таким образом, полученный нами ферментный препарат Yarrowia lipolytica позволяет модифицировать рыбий жир, увеличивая его пищевую и биологическую ценность за счет снижения содержания в нем некоторых менее ценных насыщенных жирных кислот и эруковой кислоты и увеличения содержания линоленовой са-З-ПНЖК.

Ферментный препарат Candida rugosa более пригоден для проведения гидролиза рыбьего жира и выделения ценных пентадециловой и бегеновой кислот. Пентадециловая кислота используется в качестве растворителя в лакокрасочной промышленности, а в Японии под названием «пентадекан» применяется, как ингредиент шампуней, уменьшающих выпадение волос. Бегеновая кислота широко используется в современной косметике (увлажняющие и защитные кремы, бальзамы, кондиционеры для волос и др.). Получается бегеновая кислота из бегенового масла из семян Moringa oleífera.

9 Технологические аспекты получения лнполнтического препарата на базе дрожжей Yarrowia lipolytica

Проведенные исследования по разработке состава питательной среды для культивирования дрожжей позволяют не только повысить липолитическую активность дрожжей в 3,2 раза, но и значительно более чем в 5 раз снизить затраты на сырье.

На основании проведенных исследований предложена следующая принципиальная схема получения ферментного препарата на основе культуры дрожжей (рисунок 3).

| Утилизация^отходо^^^І

Рисунок 3 - Блок-схема процесса получения ферментного препарата

Посевной материал выращивают на плотной питательной среде: сусло-агар с содержанием Сахаров 5-5,5 %, в течение 24 часов при температуре 30 °С. При необходимости получения большого количества посевного материала культура пересевается на жидкую среду - сусло с содержанием Сахаров 5-5,5 % и выращивается в течение 24 часов при температуре 30 °С.

Основная ферментация проводится на жидкой питательной среде следующего состава: оливковое масло - 1 % об, глюкоза - 5 г/л, дрожжевой автолизат - 5 мл/л,

обезжиренная соевая мука - 40 г/л, твин-20 - 0,001 мг/мл. Основная ферментация осуществляется при следующих параметрах: температура культивирования 30 °С, скорость вращения мешалки 250 об/мин в течение 24 часов. Объем посевного материала составляет 10 % от объема питательной среды. По окончании культивирования биомасса продуцента отделяется от культуральной жидкости методом фильтрования или центрифугирования, сгущается, высушивается и далее используется как кормовая добавка. Осветленная культуральная жидкость используется как источник фермента для повторного получения иммобилизованного препарата липазы. Иммобилизацию проводят методом включения липазы в агаровый гель, содержащий 0,2 М/л хлористого кальция.

Схема разработана с учетом оптимальных параметров процесса. Данная технологическая схема реализована в лабораторном масштабе. Получен опытный образец в количестве 1 кг, представляющий собой иммобилизованный препарат с липолнтической активностью 50 Ед/г.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен подбор и оптимизация условий проведения гидролиза касторового и оливкового масел липазой из Candida rugosa в системе вода - масло без внесения химического эмульгатора. Выход жирных кислот при оптимальных условиях достиг максимального значения 47 % за 16 часов проведения процесса гидролиза для касторового масла и 81 % за 4 часа гидролиза оливкового масла.

2. Показано, что гидролиз рыбьего жира с использованием в качестве катализатора липазы из Candida rugosa протекает с максимальным выходом жирных кислот 33 % от общего содержания кислот в рыбьем жире. Впервые установлена жирно-кислотная специфичность ферментного препарата при гидролизе рыбьего жира. При этом липаза из Candida rugosa показала высокую специфичность к гидролизу ацильных остатков пента-дециловой и бегеновой кислот (С|5о и С220), что позволяет считать этот ферментный препарат перспективным для использования его при ферментативном гидролизе рыбьего жира с целью выделения дефицитных пентадециловой и бегеновой кислот.

3. Установлено, что культура дрожжей Yarrowia lipolytica увеличивает продукцию липазы при снижении в питательной среде глюкозы до 5 г/л при введении индуктора оливкового масла, а при использовании в питательной среде синтетических источников азота продукция липазы отсутствует. Разработан состав питательной среды, позволяющий повысить липолитическую активность дрожжей Yarrowia lipolytica до 210 Ед/мл, что в 3,2 раза выше чем при использовании питательной среды, указанной в паспорте культуры. Оптимальный состав среды: оливковое масло - I % , глюкоза - 5 г/л, дрожжевой автолизат - 5 мл/л, обезжиренная соевая мука - 40 г/л, твин-20 - 0,001 мг/мл.

4. Изучен процесс иммобилизации липазы дрожжей Yarrowia lipolytica в агаровый гель. Ферментативная активность нового препарата иммобилизованного в гель агара при введении в гель хлорида кальция в концентрации 0,2 М/л составляет 50 Ед/г. Показано, что иммобилизованный препарат способен осуществлять гидролиз оливкового масла и имеет высокую хранимоспособность, потеря активности за 21 день хранения составляет 17 %.

5. Выявлена жирно-кислотная специфичность и способность нового ферментного препарата из Yarrowia lipolytica к модификации рыбьего жира, приводящая к повышению его биологической ценности за счет снижения содержания в нем некоторых малоценных низших насыщенных кислот (С10о-С|3о)- эруковой кислоты и увеличения содержания со-З-ПНЖК.

6. Составлен лабораторный технологический регламент и выпущена опытная партия нового иммобилизованного ферментного препарата на базе дрожжей Yarrowia lipolytica. Использование разработанного состава питательной среды позволяет снизить затраты на сырье более чем 5 раз. Полученный иммобилизованный препарат отличается повышенной стабильностью при хранении по сравнению с нативной липазой.

Основное содержание диссертации изложено в публикациях: В рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Gamayurova V.S. Features of the enzymatic hydrolysis of castor oil / V.S. Gamayurova, ME. Zinov'eva, H.T.T. Tran // Catalysis in Industry. - 2013. - V. 5. - № 3. -P. 269-273.

2. Пути активации ферментативного гидролиза касторового масла / Чан Т.Т. Хыонг, B.C. Гамаюрова, М.Е. Зиновьева, К.Л. Шнайдер // Вестник Казанского технологического университета.-2012.-Т. 15.-№9.-С. 154-158.

3. Зиновьева М. Е. Влияние источника углерода и индукторов на рост и липолити-ческую активность дрожжей Yarrowia lipolytica / М.Е Зиновьева, Чан Т.Т. Хыонг, B.C. Гамаюрова // Вестник Казанского технологического университета. - 2013. - N° 7. -С. 168-172.

4. Влияние состав питательной среды на липолитическую активность дрожжей Yarrowia lipolytica / В.С Гамаюрова, М.Е Зиновьева, Чан Т.Т. Хыонг, A.B. Васильева // Бутлеровские сообщения. -2013. - Т. 35. -№ 9. - С. 71-77.

Прочие публикации и материалы конференций:

5. Чан Т.Т. Хыонг. Влияние органических растворителей и неорганических солей на ферментативный гидролиз касторового масла в бездетергенных эмульсиях / Чан Т.Т. Хыонг, В.С Гамаюрова, М.Е Зиновьева // Пищевые технологии и биотехнологии: тез. докл. XII Международ, конф. Молодых ученных. - Казань: Изд-во «Отечество», 2012. -С. 148.

6. Чан Т.Т. Хыонг. Влияние источника углерода и вида индуктора на активность липазы из Yarrowia lipolytica Y-3I53 / Чан Т.Т. Хыонг, В.С Гамаюрова, М.Е Зиновьева// Пищевые технологии и биотехнологии: тез. докл. XII Международ, конф. Молодых ученных. - Казань: Изд-во «Отечество», 2012. - С. 147.

7. Ферментативный гидролиз оливкового масла в системе без эмульгатора / Н. В. Степанова, М. Е Зиновьева, В. С Гамаюрова, Чан Т. Т. Хыонг // Пищевые технологии и биотехнологии: тез. докл. XII Международ, конф. Молодых ученных- Казань: Изд-ео «Отечество», 2012.-С. 141.

8. Чан Т.Т. Хыонг. Изучение влияния источника углерода и индуктора на рост и биосинтез липазы дрожжами Yarrowia lipolytica Y-3153 i Чан Т.Т. Хыонг, В.С Гамаюрова, М.Е Зиновьева // Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности: тез. докл. Всероссийской молодежной научной школы. - Казань: Изд-во «Отечество», 2012.-С. 13.

9. Enzymatic hydrolysis and interesterification of vegetable oils /7 V.S. Gamajurova, M.E. Zinovjeva, K.L. Schnayder, Tran Thi Thu Huong// Biotechnology: state of the art and prospects of development: congress proceedings, part 2 VII Moscow international congress, 2013.-P. 54-55.

Заказ £Ь5Г

Тираж 100 экз.

Офсетная лаборатория Казанского национального исследовательского технологического университета

420015, Казань, К.Маркса, 68

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата технических наук, Чан Тхи Тху Хыонг, Казань

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования Казанский национальный исследовательский технологический университет

На правах рукописи

0^201451866

ЧАН ТХИ ТХУ ХЫОНГ

ГИДРОЛИЗ И МОДИФИКАЦИЯ ЛИПИДОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA RUG OS А И YARROWIA LIPOLYTIC А

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель -доктор химических наук, профессор Гамаюрова Валентина Семеновна

Казань - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................5

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................10

1.1 Общая характеристика липаз.......................................................10

1.1.1 Структура липаз и механизм действия липаз................................10

1.1.2 Свойства липаз......................................................................14

1.1.3 Источники получения липаз.....................................................17

1.1.4 Факторы, влияющие на биосинтез липаз микроорганизмами............19

1.1.5 Иммобилизация липаз.............................................................24

1.1.6 Применение липаз.................................................................27

1.2 Ферментативные гидролиз и переэтерификация липидов..................33

1.2.1 Ферментативный гидролиз липидов...........................................33

1.2.2 Ферментативная переэтерификация липидов................................37

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...............................................42

2.1 Материалы.............................................................................42

2.1.1 Объект исследования.............................................................42

2.1.2 Ферментные препараты..........................................................42

2.1 .ЗСубстраты............................................................................43

2.1.4 Компоненты для приготовления питательной среды......................43

2.1.5 Реактивы и растворители.........................................................44

2.2 Методы исследования...............................................................44

2.2.1 Гидролиз растительных масел и рыбьего жира ферментными препаратами липаз в системе вода — масло.................................................44

2.2.2 Определение активности липаз (модифицированный метод Ота-Ямада)........................................................................................46

2.2.3 Выращивание посевного материала Уаггом1а \ipolytica...................47

2.2.4 Выращивание дрожжей Yarrowia Iipolytica на жидкой питательной среде................................................................................................47

2.2.5 Изучение влияния источника углерода и липидного индуктора на липолитическую активность и рост культуры Yarrowia Iipolytica.....................48

2.2.6 Изучение влияния источника азота на липолитическую активность и рост культуры Yarrowia lipolytica.............................................................48

2.2.7 Изучение влияния ПАВ на липолитическую активность и рост культуры Yarrowia lipolytica....................................................................48

2.2.8 Осаждение липазы из культуральной жидкости дрожжей Yarrowia lipolytica............................................................................................49

2.2.9 Иммобилизация ферментного препарата липазы Yarrowia lipolytica...49

2.2.10 Получение калиевых солей жирных кислот................................50

2.2.11 Определение качественного и количественного состава высших жирных кислот методом газожидкостной хроматографии.............................50

2.2.12 Обработка полученных результатов..........................................51

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..................................52

3.1 Ферментативный гидролиз касторового масла системе вода - масло без эмульгатора с использованием в качестве катализатора липазы из Candida rugosa..............................................................................................................................52

3.2 Ферментативный гидролиз оливкового масла в системе вода - масло без эмульгатора с использованием в качестве катализатора липазы из Candida rugosa...............................................................................................69

3.3 Ферментативный гидролиз рыбьего жира в системе вода - масло без эмульгатора с использованием в качестве катализатора липазы из Candida rugosa...............................................................................................74

3.4 Получение ферментного препарата с использованием продуцента Yarrowia (Candida) lipolytica Y-3153 (АТСС 34088)......................................84

3.4.1 Влияние источника углерода и индукторов на рост и липолитическую активность Yarrowia lipolytica.................................................................84

3.4.2 Влияние источника азота и стимулятора на рост и липолитическую

активность Yarrowia lipolytica...............................................................100

3.4.3 Выделение липаз из дрожжей Yarrowia lipolytica.........................108

3.4.4 Иммобилизация липаз из Yarrowia lipolytica...............................110

3.4.5 Проведение гидролиза иммобилизованным препаратом липазы Yarrowia lipolytica оливкового масла........................................................113

3.4.6 Модификация рыбьего жира ферментным препаратом Yarrowia lipolytica и установление его жирно-кислотной специфичности.....................114

3.4.7 Технологические аспекты получения липолитического препарата на базе дрожжей Yarrowia lipolytica............................................................116

ВЫВОДЫ.................................................................................118

Список использованных источников................................................120

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Липазы - это гетерогенные катализаторы, которые работают на поверхности раздела фаз. Они играют важнейшую роль в жизнедеятельности всей биоты и находят применение в различных отраслях промышленности, прежде всего пищевой, особенно в масложировой отрасли, фармацевтической, химической, кожевенной, текстильной, производстве моющих средств и медицине.

Потребность в липазах испытывает сельское хозяйство, особенно высокопродуктивное животноводство для производства кормовых добавок. Находят применение липазы в области охраны окружающей среды, в частности, для очистки стоков мясной, масло-жировой промышленности, которые труднее всего подвергаются другим видам очистки.

Разумеется, различные области применения требуют наличия липолити-ческих ферментов с различными свойствами, прежде всего по селективности, по степени чистоты, устойчивости к различным факторам - температура, рН, способность сохранять ферментативную активность длительное время, спосоность к иммобилизации на различных матрицах и т.д. Таким образом, необходим широкий спектр липолитических ферментов. К сожалению, в России в промышленном масштабе практически не производятся липолитические ферменты, хотя потребность в них велика и приходится закупать дорогие зарубежные ферментные препараты, что сдерживает их широкое применение. Одной из причин такого положения является особенность свойств нативных липаз. Это гетерогенный катализатор, требующий подбора сложных сред, в которых наиболее эффективно он будет работать. Субстрат должен быть доступным для катализатора, для этого нужны эмульгаторы, часто органические растворители, причем те, которые бы не ингибировали фермент. Нативные липазы обычно обладают низкой термостабильностью, невысокими скоростями реакций в условиях, отличающихся от

оптимальных, что требует практически во всех случаях разработку методов иммобилизации липолитических ферментов.

Таким образом, поиск новых продуцентов липаз и создание на их основе липолитических ферментных препаратов, обладающих различными свойствами по специфичности, устойчивости в различных средах, пригодных для решения разнообразного круга задач является одной из актуальных проблем биотехнологии. Разработка технологии промышленного получения липолитических ферментных препаратов требует решения целого комплекса серьезных экспериментальных задач на всех уровнях от лаборатории до производства.

Другая важная проблема, которая существует в пищевой промышленности -это модификация жиров с целью придания им определенных физико-химических и биологических свойств: нужной консистенции, пластичности, твердости, определенных технологических свойств, прежде всего стабильности, повышение пищевой и биологической ценности. Достигается это обычно регулированием жирно-кислотного состава жиров. Существующие методы модификации жиров, физические и химические, имеют ряд ограничений и недостатков. Наиболее перспективным в этом отношении считается ферментативный катализ. Но для применения ферментативного катализа с целью модификации жиров нужен не только широкий ассортимент липолитических ферментов, но и знание их жирно-кислотной специфичности. Обе эти проблемы - расширение спектра липолитических ферментов и выявление жирно-кислотной специфи-чности известных и новых ферментных препаратов, являются важнейшими и актуальными проблемами в биотехнологии.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» по госконтракту № 01201252915 от 28.02.2012 г.

Цель и задачи исследования. Исследование ферментативного гидролиза липидов различного происхождения в системе вода — масло в отсутствии

химических эмульгаторов с использованием в качестве катализатора липазы из Candida rugosa (Type VII, производство Японии) и изучение условий проведения данного процесса.

Получение нового липолитического ферментного препарата на базе культуры дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica Y-3153 (АТСС 34088) и выявление его особенностей.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

1) Выявление особенностей ферментативного гидролиза преимущественно монокислотных растительных масел (касторовое и оливковое) и рыбьего жира ферментным препаратом Candida rugosa в системах без эмульгаторов.

2) Установление жирно-кислотной специфичности ферментного препарата из Candida rugosa на примере гидролиза рыбьего жира и перспективы применения этого ферментного препарата для получения индивидуальных жирных кислот.

3) Разработка состава питательной среды для повышения липолитичес-кой активности дрожжей Yarrowia lipolytica с целью получения нового ферментного препарата - комплекса липаз, продуцируемых данным штаммом дрожжей.

4) Установление свойств липаз дрожжей Yarrowia lipolytica, возможности иммобилизации и способности к гидролизу и модификации жиров и выявление жирно-кислотной специфичности этого ферментного препарата.

Научная новизна. Впервые показано, что ферментный препарат из Candida rugosa может использоваться для гидролиза оливкового и касторового масел без применения эмульгатора, что облегчает последующее выделение жирных кислот (соответственно олеиновой и рицинолевой).

Впервые исследована жирно-кислотная специфичность ферментного препарата из Candida rugosa на примере гидролиза рыбьего жира и обнаружено, что фермент не способен гидролизовать ацильные остатки низкомолекулярных насыщенных жирных кислот до Спои, напротив, проявляет высокую специфичность при гидролизе ацильных остатков пентадециловой (С15 0) и бегеновой кислот

(С?2:о)? чт0 делает его перспективным для получения этих дефицитных высших жирных кислот.

Разработан состав питательной среды для культивирования продуцента липазы дрожжей Yarrowia lipolytica, позволяющий при снижении затрат на сырьевые компоненты среды повысить липолитическую активность культуры в 3,2 раза по сравнению с средой, рекомендованной по паспортным данным.

Подобраны оптимальные условия для получения нового иммобилизованного препарата липазы на базе дрожжей Yarrowia lipolytica и показана его жирно-кислотная специфичность при гидролизе рыбьего жира.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы при получении олеиновой и рицинолевой кислот с использованием ферментативного гидролиза, протекающего при умеренных температурах, атмосферном давлении и в отсутствии эмульгатора, что обеспечивает простоту аппаратурного оформления процесса.

Полученный новый ферментный препарат на базе продуцента Yarrowia lipolytica может служить основой для дальнейшей пилотной разработки отечественного препарата липазы. Показана его пригодность для модификации жиров.

Достоверность полученных результатов. Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.

Апробация работы. Результаты работы доложены на: XII Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2012), Всероссийской молодежной научной школе «Биоматериалы и наноматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности» (Казань, 2012), VII Московском международном конгрессе «Биотехнология, состояние и перспективы развития» (Москва, 2013).

Публикации. По теме диссертационной работы имеется 9 публикаций, из них: 4 статьи в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации и 5 тезисов.

Личный вклад автора. Автор проводила все экспериментальные работы по теме диссертации, принимала участие в обсуждении результатов работы, написании и оформлении статей.

Хроматографические анализы были проведены на ОАО «Казанский Масло-Экстракционный завод» совместно с Кузнецовым Б.А.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и библиографического указателя (152 наименований источников). Работа изложена на 134 страницах текста, включает 24 таблицы и 30 рисунков.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика липаз

Липазы или, в соответствии с систематическим названием, триацилглицеро-лацилгидролазы (гидролазы эфиров глицерина) относятся по номенклатуре ферментов к третьему классу гидролаз первого подкласса и имеют систематический номер К.Ф ЗЛ.1.3. Особенность работы этих ферментов заключается в том, что сами ферменты растворимы в воде, а субстраты (жиры) в воде нерастворимы и для осуществления акта катализа требуют эмульгирования или диспергирования в воде. Для эмульгирования используются природные или синтетические эмульгаторы, при этом активность фермента может значительно изменяться в зависимости от природы эмульгатора.

Липолитические ферменты играют исключительно важную роль в обмене липидов всех живых организмов. Они способствуют переносу липидов от одного организма к другому. В организме они участвуют в процессах отложения и мобилизации жира, используемого в качестве энергетического резерва клетки; кроме того, включаясь в метаболизм внутриклеточных липидов, они принимают участие в функционировании биологических мембран. Липазы являются важными биокатализаторами из-за их отличных биохимических и физиологических свойств [1].

1.1.1 Структура липаз и механизм действия липаз

По типу укладки полипептидной цепи липазы относятся к белкам, построенным из нерегулярно чередующихся а-спиралей и (3-листов. З-О структура показывает основные схемы сворачивания липаз (семейство а и (3-структурированных гидролаз). Эта группа ферментов является одной из крупнейших групп структурно-связанных ферментов с различными каталитическими функциями [2-8]. Уста-

новлено большое число 3-D структур бактериальных и грибковых липаз, таких как панкреатическая липаза, липаза из гриба Geotrichum candidum, гриба Rhizo-mucor miehei [9-12].

С помощью программы BioEdit версия 7.0.5 было определено содержание различных типов аминокислот в первичной структуре липаз различного происхождения [13]. Таким образом, максимальное количество аминокислотных остатков у липаз микробного происхождения имеется в молекуле энзима, выделенного из Staphylococcus haemolyticus (711), а минимальное — из Serratia proteamacilans (255). Для липазы Staphylococcus hyicus (16,23%) и Pseudomonas aeryginosa (14,7%) характерно наибольшее количество положительно и отрицательно заряженных аминокислот, а для Aspergillus niger (5,37%) и Rhizopus stolonifer (7,41%) - наименьшее. Максимальное количество серосодержащих аминокислот наблюдалось у Rhizopus microsporus, среднее процентное содержание у представленных липаз колеблется в интервале 0,49-3,85% .

Молекулярная масса липаз изменяется в диапазоне от 19 кДа до 90 кДа. Их вторичная структура, как правило, состоит из нескольких (до восьми) параллельных ß листов (ßl-ß8), соединенных а спиралями (до шести) [8,11].

Увеличение мобильности фермента в процессе образования фермент-субстратного комплекса, достигается в результате способности четвертичной структуры липазы сохранятся за счет гидрофобных «сил сцепления», что доказано результами экспериментов по ИК-спектроскопии отдельных субъединиц липаз. Четвертичная структура фермента участвует в регуляции каталитической активности за счет взаимодействия субъединиц [14,15].

Каталитический центр липаз состоит из боковых цепей, содержащих три аминокислотную каталитическую триаду Ser-His-Asp/Glu, и идентичен с серино-вым протеазам. Особенностью этого активного центра является то, что он не находится на поверхности белка, вместо этого, он полностью закрыт структурой, похожей на крышку, состоящей из а-спирали, и не доступен субстрату. Есть гипотеза, что липазы подвергаются значительному конформационному изменению после адсорбции на поверхности раздела фаз масло-вода, открывающему субс-

трату доступ к активному центру. Другое важное конформацион