Разработка основы биопрепарата для деструкции жиров

Поскрякова, Наталья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка основы биопрепарата для деструкции жиров
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка основы биопрепарата для деструкции жиров"

□03057375

На правах рукописи

ПОСКРЖОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА ОСНОВЫ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ ЖИРОВ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2007

003057375

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра РАН в рамках темы «Ферменты и метаболиты почвенных и ризосферных микроорганизмов» (номер государственной регистрации ГР№ 01200210612)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Логинов Олег Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологичеких наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович

кандидат биологических наук, доцент Петухова Надежда Ивановна

Ведущая организация: Российский химико-технологический

университет им. Д.И. Менделеева

Защита состоится «18» мая 2007 г. в 14.00 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.136.01 при Инспгтуте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, Проспект Октября, 69, тел/факс: 8 (347) 235-62-47, e-mail: ib@anrb.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра i

РАН и на официальном сайте АН РБ по адресу.'ЬЦр: // vvww.anrb.ru/inbio/dissovet Автореферат разослан «-/££>> апреля 2007 г. Ученый секретарь

Регионального диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

Р.В. Уразгильдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Развитие пищевых предприятий и расширение сети быстрого питания в России за последние годы, сделало особенно актуальным решение проблемы очистки сточных вод предприятий пищевой промышленности от жиров, масел, белков и других органических загрязнений. Другой серьезной проблемой является удаление отложения жиров в канализационных системах предприятий и утилизация жира в жироуловителях.

Состояние водной среды, особенно в индустриально развитых регионах, заставляет разрабатывать и вводить в действие все более жесткие нормативы на сброс загрязнений в водоемы и городские коллекторы. Одним из перспективных способов решения этих проблем является биоферментная технологи разложения органических веществ, в том числе жиров и растительных масел на локальных очистных сооружениях, находящихся непосредственно на предприятиях (Молоканов с соавт., 2005; Новохатко, Михельсон, 2006).

Биоферментные технологии по разложению и утилизации жиров в сточных водах основаны на использовании микробных липаз и микроорганизмов, способных к их продуцированию. Однако, на рынке Российской Федерации представлены лишь несколько препаратов зарубежного происхождения.

Таким образом, поиск активного продуцента липаз, который мог бы стать основой отечественного биопрепарата для локальной очистки жиросодержащих сточных вод, является весьма актуальным.

Цель исследования. Выделение новых штаммов микроорганизмов, обладающих высокой липолитической активностью, и их изучение в качестве основы биопрепарата для деструкции жиров.

Задачи исследования.

1. Выделить из природных и техногенных мест обитания новые штаммы липолитически активных микроорганизмов.

2. Подобрать оптимальные питательные среды для культивирования изучаемых штаммов с максимальным выходом липазы.

■• 3. Определить ■ спектр • окислительной • активности • исследуемых микроорганизмов в отношении растительных и животных жиров, а также углеводородов различных классов.

4. Определить эффективность использования липолитически активных микроорганизмов для биологической очистки жиросодержащих сточных вод.

Научная новизна. Выделена и идентифицирована группа новых штаммов бактерий рода Serratia, проявляющих высокую липолитическую активность: Serratia marcescens ИБ 2-1, Serratia marcescens ИБ 2-2, Serratia species ИБ 1, Serratia species ИБ 3-1, Serratia species ИБ 3-3.

Для каждого штамма подобрана оптимальная питательная среда, на которой биосинтез липазы максимален. Выявлено, что штаммы S. marcescens ИБ 2-2 и Serratia sp. ИБ 3-1 проявляют липазную активность намного превышающую показатели, известные для бактерий этого рода.

Практическая значимость.

Предложены новые штаммы Serratia sp. ИБ 3-1 и S. marcescens ИБ 2-2, которые могут быть использованы в качестве продуцентов липолитических ферментов (Решения Роспатента о выдаче Патентов РФ от 1.03.2007 и от 11.04.2007, соответственно).

S. marcescens ИБ 2-2 и Serratia sp. ИБ 3-1 для разработки биопрепарата для очистки жиросодержащих сточных вод.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на III Всероссийской научной internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 2004), Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в Перечень ВАК, рекомендованных для соискателей ученой степени, и 2 патента Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части (5 глав), заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 115 страницах, содержит 17 таблиц и 17 рисунков. Список использованной литературы включает 144 наименования, из них 71 на русском языке.

Благодарности. Автор выражает огромную признательность за неоценимую помощь при обсуждении результатов работы с.н.с., к.т.н. H.H. Силищеву. Автор сердечно благодарит за помощь и консультации сотрудников лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН с.н.с., к.б.н. Н.Ф. Галимзянову и с.н.с., к.б.н. Т.Ф. Бойко. Автор выражает благодарность старшему научному сотруднику лаборатории молекулярной биологии и генетики Института биохимии и генетики УНЦ РАН, к.б.н. Баймиеву А.Х.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований являлись штаммы липолитически активных микроорганизмов, выделенные из активного ила биологических очистных сооружений Пермского мясокомбината в лаборатории биологически активных веществ Института биологии Уфимского научного центра РАН. Качественное определение липолитической активности, позволяющее установить наличие липазы, проводили на твердых жирах (бараньем и свином), окрашенных нильским голубым сернокислым (Методы общей бактериологии, 1984).

Определение культуральных и физиолого-биохимических характеристик культур проводили по стандартным методикам (Практикум..., 1976; Методы общей бактериологии, 1984).

Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили на основании Определителя бактерий Берджи (1997) и путем секвенирования фрагментов гена 16S рРНК.

Липолитическую активность Микробной биомассы определяли по модифицированному методу Ota и Yamada (Ota et. al., 1966). Титр культуры определяли посевом на мясо-пептонный агар (МПА).

Синтез липаз изучали на средах с различными источниками углерода (соевая мука (ТУ - 9146-002-43327088-00), свиной и бараний жиры) и органического азота (пептон, дрожжевой экстракт, автолизат пивных дрожжей).

Окислительную активность исследуемых микроорганизмов определяли по выделению углекислого газа. Культивирование микроорганизмов проводили в колбах объемом 500 мл. В качестве питательной среды использовали 250 мл минеральной среды (К2НР04 - 1 г; (NH4)2S04- 5 г; вода дистиллированная - 1 л) с добавлением 1% источника углерода и 5 мл суточной культуры микроорганизмов с содержанием клеток 1,0Т09 КОЕ/мл. С помощью компрессора-дозатора со скоростью 520 мл/мин в герметично закрытые колбы подавали стерильный атмосферный воздух. Воздух, прошедший через колбу с микроорганизмами, окисляющими субстрат, улавливали поглотителем

углекислого газа, в качестве которого использовали 200 мл 0,1 и. NaOH. Из колб с поглотителем посуточно отбирали аликвоту 10 мл и оттитровывали 0,1 н. HCl. Окислительную активность определяли по количеству образовавшегося углекислого газа, оттитрованного кислотой. В качестве контроля использовали колбы, не засеянные микроорганизмами. Длительность эксперимента составляла 3 суток.

Процесс биодеградации растительных и животных жиров исследуемыми микроорганизмами осуществляли на минеральной среде Раймонда. В ряде экспериментов в качестве дополнительных компонентов питательной среды вносили соевую муку (в концентрациях 0-2,5 мас.%) и автолизат пивных дрожжей (в концентрациях 3-9 мас.%). Жиры и масла вносили в количестве 1 мас.%. Микроорганизмы культивировали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на качалке при температуре 35°С, со скоростью вращения 180 об/мин в течение 16-96 часов. Инокулят вносили в виде суточной культуры микроорганизмов с содержанием клеток 3,0-109 КОЕ/мл. Остаточное содержание жиров определяли весовым методом после экстракции гексаном (Bridoux et al., 1994).

Статистическую обработку результатов проводили, используя t-критерий Стьюдента на 5% уровне значимости. Полученные данные статистически обрабатывались с помощью программы Microsoft Excel-2002.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Скрининг и определение фенотипических характеристик новых штаммов продуцентов липазы

Из образцов активного ила биологических очистных сооружений Пермского мясокомбината было выделено 18 штаммов бактерий, обладающих липолитической активностью. Наиболее активные из них были идентифицированы как Serratia marcescens (ИБ 2-1, ИБ 2-2) и Serratia species (ИБ 1, ИБ 3-1, ИБ 3-3). Все штаммы депонированы в коллекцию микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН.

2. Исследование липолитической активности бактерий р. Serratia

Изучена динамика липолитической активности исследуемых штаммов бактерий р. Serratia на питательных средах различного состава. Для каждого штамма были проанализированы 14 питательных сред, среди которых мясо-пептонный бульон (МПБ), среда Раймонда с добавлением твердых жиров (свиного, бараньего), среды с различным содержанием соевой муки и дрожжевого экстракта (табл. 1).

Таблица 1.

Состав питательных сред, использованных для изучения биосинтеза липазы бактериями р. Serratia (мас.%)

Наименование компонента среды Номе р питательной среды

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

СаСОз 0,5 0,5 ОД

К2НР04 0,2 0,2 0,2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

М§804-7Н20 0,1 од ОД

ЫаС1 - - 0,05 - - - - - - - -

Ка2НР04 - - 0,4

- - - од ОД од од ОД ОД ОД ОД

Дрожжевой экстракт - - 2,0 - 2,0 4,0 - 2,0 4,0 6,0 2,0

Крахмал - - 2,0 - - - - - - - -

Мочевина од ОД 5,0 -

Соевая мука 2,0 5,0 - 0,5 0,5 0,5 2,5 2,5 2,5 2,5 -

Продукция липаз изучаемыми штаммами зависела от источника углерода в составе питательной среды. На среде МПБ, содержащей мало липидов, но достаточное количество белков, пептидов, аминокислот, обеспечивающих рост, небольшое количество липазы продуцировали лишь штаммы Serratia sp. ИБ 1, ИБ 3-1 и ИБ 3-3. Среда 3, включающая такие доступные субстраты как крахмал, дрожжевой экстракт, также не индуцировала синтеза липолитических ферментов изучаемыми штаммами. На среде,

содержащей бараний жир, синтез липазы наблюдался лишь у вышеперечисленных штаммов, причем после 48 часов культивирования количество фермента для каждого из них не превысило 7,5 мкМ олеиновой кислоты-мл"!-час"1 (рис, 1). В то же время на среде со свиным жиром ли политически активность проявили все исследуемые бактерии, ее величина для разных штаммов варьировала от 34,0 до 45,0 мкМ олеиновой кислоты-мл " час'1.

Штаммы

Рисунок 1. Липолитическая активность бактерий р. Serratia на минеральной среде Раймонда с добавлением бараньего и свиного жира

Использование для культивирования штаммов сред, содержащих соевую муку, покачало, что этот субстрат стимулировал проявление ли политической активности у всех изучаемых культур. Аналогичные результаты были получены для представителей рода Serratia и другими авторами (Башкатова, Северина, 1979) . Как видно из рисунка 2, величина продукции липаз изучаемыми штаммами зависела от концентрации соевой муки в среде. С увеличением содержания этого компонента липолитическая активность

исследуемых бактерий возрастала, изменялась и скорость синтеза фермента. Для штамма Serratia sp. ИБ 3-1 с повышением концентрации соевой муки с 2 мас.% до 5 мас.% липолитическая активность возрастала в 10 раз, ее максимум был отмечен через 24 часа культивирования, а штамм Serratia sp. ИБ 3-3 продуцировал на 25 % больше липазы за более длительный период культивирования (39 часов). Наибольшее значение липолитической активности (102,5 мкМ олеиновой кислоты -мл"1 -час"1) наблюдалось на среде с 5 % соевой муки у штамма S. marcescens ИБ 2-2.

120

Время культивирования, ч

0 5 10 15 24 39 48 63 72 Время культивирования, ч

-ИБ 1

— - -ИБЗ-1 •

- ИБ 2-1 • — ИБЗ-З

-ИБ2-2

-ИБ 1 ИБ 3-1

- - ИБ 2-1 • ♦ ИБ 3-3

-ИБ 2-2

Рисунок 2. Липолитическая активность исследуемых штаммов бактерий р. Serratia: а - на среде № 1; б - на среде № 2.

В процессе оптимизации состава питательной среды для культивирования бактерий р. Setratia были протестированы питательные среды, содержащие 0,5 мас.% и 2,5 мас.% соевой муки. В качестве дополнительного источника питательных веществ в ряде сред использовали дрожжевой экстракт в концентрации 2 мас.% и 4 мас.%. Дрожжевой экстракт имеет высокую физиологическую ценность, содержит витамины группы В и часто применяется в качестве компонента

питательных сред, например, при культивировании бактерий р. Pseudomonas (Пат. РФ 2203945).

Наши исследования показали, что различные концентрации соевой муки и дрожжевого экстракта в питательной среде по-разному влияли на величину липолитической активности всех изучаемых бактерий. Так, штамм S. marcescens ИБ 2-1 на среде № 4, содержащей минеральные соли и 0,5 мас.% соевой муки, липазу не синтезировал. При увеличении концентрации соевой муки в составе питательной среды до 2,5 мас.% (среда № 7), липолитическая активность штамма S. marcescens ИБ 2-1 достигала 21 мкМ олеиновой кислоты-мл"'-час"'. Добавление 2 мас.% дрожжевого экстракта на фоне 0,5 мас.% соевой муки (среда № 5) также способствовало синтезу небольшого количества липазы у микроорганизмов этого вида, которое с увеличением концентрации дрожжевого экстракта до 4 мас.% (среда № 6) увеличилось в 16 раз и достигало максимального значения 162 мкМ олеиновой кислоты-мл"1-час'1 (рис. 3 б, в).

Максимальная липолитическая активность штамма S. marcescens ИБ 2-2 (222,5 мкМ олеиновой кислоты-мл^-час"1) наблюдалась на среде № 6, содержащей 0,5 мас.% соевой муки и 4 мас.% дрожжевого экстракта (рис. 3 в). При увеличении концентрации дрожжевого экстракта с 2 мас.% до 4 мас.% на фоне 0,5 мас.% соевой муки, скорость синтеза липазы штаммом S. marcescens ИБ 2-2 замедлялась и максимальная активность фермента выявилась через 48 часов.

Аналогично предыдущим культурам, штамм Serratia sp. ИБ 1 проявил максимальную липолитическую активность (220 мкМ олеиновой кислоты мл"1-час"1) на среде с 0,5 мас.% соевой муки и 4 мас.% дрожжевого экстракта (рис. 3 в).

Липолитическая активность штамма Serratia sp. ИБ 3-1 на среде, содержащей 0,5 мас.% соевой муки (среда № 4), не превышала 10 мкМ олеиновой кислоты-мл"'-час"' (рис. 3 а). Повышение концентрации соевой муки до 2,5 мас.% (среда № 7), позволило увеличить синтез фермента в 5,6 раз. Введение в состав питательных сред дрожжевого экстракта, так же как и увеличение его концентрации, позволило достичь наивысших значений липолитической активности для этого штамма.

О 24 48 72 Время культивирования, ч

•ИБ1 - - - - ИБ 2-1 • - ИБ 3-1 -«-ИБ 3-3

- ИБ 2-2

24 48 72 Время культивирования

-ИБ 1 - - - ИБ 2-1 -В-И Б 2-2

- ИБ 3-1 » ИБ 3-3

120

250

24 43 72 96 Время культивирования, ч

- ИБ 1 - - - - ИБ 2-1 -■ ИБ 3-1 ♦ ИБЗ-З

-ИБ 2-2

Рисунок 3. Липолитическая активность бактерий р. Serratia: а - на среде № 4; б - на среде № 5; в - на среде № 6.

Максимальное значение ферментативной активности этой культуры (350 мкМ олеиновой кислотьгмл '-час"') было достигнуто на среде с 2,5 мас.% соевой муки и 4 мас.% дрожжевого экстракта, при этом динамика синтеза фермента не изменялась.

Максимальный синтез липазы бактериями Serratia sp. ИБ 3-3 наблюдался на среде № 4, содержащей 0,5 мас.% соевой муки и -минеральные соли, и составил 130 мкМ олеиновой кислоты-мл~'-час~' (рис. 3 а).

Наши исследования показали, что добавление дрожжевого экстракта в состав питательной среды и повышение его концентрации на порядок увеличивает липолитическую активность культур S. marcescens ИБ 2-1, S. marcescens ИБ 2-2, Serratia sp. ИБ 1 и Serratia sp. ИБ 3-1. Однако, при культивировании штаммов на среде №11, содержащей дрожжевой экстракт без соевой муки, активность ферментов была незначительной, либо отсутствовала вообще. Это свидетельствует о том, что на синтез липазы исследуемыми штаммами большое влияние оказывают оба компонента питательной среды.

Для штаммов S. marcescens ИБ 2-2 и Serratia sp. ИБ 3-1, проявивших максимальную липолитическую активность по сравнению с другими штаммами, было проведено более детальное изучение динамики синтеза липаз. Для культивирования штамма ИБ 2-2 использовали среду № 10, содержащую более высокую концентрацию дрожжевого экстракта (6 мас.%), так как в предыдущем эксперименте было показано, что увеличение концентрации этого компонента значительно (на 36 %) повышает липолитическую активность штамма. Динамика липолитической активности штаммов S. marcescens ИБ 2-2 и Serratia sp. ИБ 3-1 представлена в таблице 2.

Анализ полученных данных показал, что повышение концентрации дрожжевого экстракта до 6 мас.% позволило увеличить липолитическую активность S. marcescens ИБ 2-2 еще на 26%. Максимум продукции фермента был отмечен уже через 30 часов культивирования.

Изучение синтеза липазы Serratia sp. ИБ 3-1 на среде, содержащей 2,5 мас.% соевой муки и 4 мас.% дрожжевого экстракта, показало, что данный

штамм проявил максимальную активность фермента по сравнению с другими культурами, которая выявилась также через 30 часов культивирования.

Таблица 2

Липолитическая активность штаммов Serratia marcescens ИБ 2-2 и Serratia species ИБ 3-1 на оптимальных питательных средах

Время культивирования, ч Липолитическая активность, мкМ олеиновой кислоты/мл"' -час"1

Штамм Serratia marcescens ИБ 2-2 Штамм Serratia species ИБ 3-1

5 0 0

10 15 2

15 50 150

20 110 275

25 125 350

30 285 490

35 13 312

40 50 25

45 0 0

Таким образом, изучение влияния состава питательной среды на биосинтез липаз новыми штаммами бактерий рода Serratia показало, что значения липолитической активности сильно варьируют не только среди различных видов Serratia, но и в пределах одного вида, и зависят от содержания в питательной среде сложных органических компонентов (соевой муки, дрожжевого экстракта).

Для Serratia sp. ИБ 3-1 и S. marcescens ИБ 2-2 были подобраны питательные среды, на которых эти штаммы показали ферментативную активность, намного превышающую показатели, известные нам из патентных данных, для бактерий этого рода. Эти бактерий запатентованы в Российской Федерации как «Штамм бактерий Serratia species - продуцент липазы» и «Штамм бактерий Serratia marcescens, продуцирующий липолитические ферменты, для получения препарата для очистки сточных вод от жиров».

3. Исследование спектра окислительной активности новых штаммов бактерий р. Serratia

Определен спектр окислительной активности бактерий р. Serratia по отношению к жирам растительного и животного происхождения, индивидуальным углеводородам, нефти и продуктам ее переработки. Результаты определения окислительной активности бактерий р. Serratia приведены в таблице 3.

Показано, что все изученные штаммы обладали достаточно высокой окислительной активностью по отношению к растительным маслам. Подсолнечное масло лучше окисляли штаммы Serratia sp. ИБ 1 и ИБ 3-3, оливковое - штамм S. marcescens ИБ 2-2. Кукурузное масло успешно окисляли все исследуемые культуры.

Жиры животного происхождения окислялись изученными штаммами сложнее. Твердые животные жиры с высокой эффективностью окисляли штаммы ИБ 2-2, ИБ 3-1 и ИБ 3-3. Наивысшую окислительную активность, равную 143 мг С02/г субстрата, проявил штамм Serratia sp. ИБ 3-1 при культивировании на свином жире.

Полученные результаты по величинам окислительной активности для растительных масел и животных жиров, очевидно связаны с соотношением насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в том или ином субстрате (Тютюников, 1974).

Как видно из таблицы 3 способностью окислять углеводороды различного химического строения, а также нефть и нефтепродукты, обладали в различной степени все изученные штаммы бактерий р. Serratia.

. Проведенные эксперименты показали, что изученные штаммы Serratia sp. ИБ 1, Serratia sp ИБ 3-1, Serratia sp ИБ 3-3, S. marcescens ИБ 2-1, S. marcescens ИБ 2-2 обладают высокой окислительной активностью по отношению к жирам растительного и животного происхождения, а также способны окислять углеводороды, нефть и продукты ее переработки.

Таблица 3

Окислительная способность микроорганизмов р. Serratia по отношению к различным субстратам, мг С02/г субстрата

1 Субстрат Штамм

Serratia sp.Pffi 1 Serratia sp. ИБЗ-1 Serratia sp. ИБ 3-3 Serratia marcescens ИБ 2-1 Serratia marcescens ИБ2-2

Подсолнечное масло 194 61 198 99 69

Кукурузное масло 122 156 114 137 134

Оливковое масло 69 100 100 61 154

Свиной жир 88 143 35 7 91

Говяжий жир 28 60 121 56 120

Кулинарный жир 25 65 120 67 109

Нонан 24 29 29 49 93

Декан 72 44 149 86 106

Ундекан 90 119 185 104 100

Тетрадекан 74 65 74 109 106

Парафин 25 21 67 8 5

Толуол 12 28 12 60 73

Циклогексан 63 156 22 28 32

Нафталин 14 45 21 11 10

Бензиловый спирт 17 17 91 61 31

Октиловый спирт 55 51 30 24 34

Нефть 106 106 35 53 9

Дизельное топливо 33 108 95 29 8

4. Исследование процесса биодеструкции жиров бактериями рода Serratia

Для оценки возможности применения исследуемых бактерий р. Serratia для локальной очистки жиросодержащих сточных вод на следующем этапе эксперимента исследовали способность выделенных штаммов утилизировать жиры. Биодеградацию жиров изучали на средах, обеспечивающих максимальную липолитическую активность штаммов.

Чтобы уменьшить стоимость питательной среды для культивирования продуцентов, дорогостоящий компонент среды - дрожжевой экстракт, заменили автолизатом пивных дрожжей. Отработанные пивные дрожжи в настоящее время не находят квалифицированного применения. Для получения автолизата отработанные пивные дрожжи подвергали термической обработке при 100°С. Готовый продукт - дрожжевой автолизат, содержал 34 мг/мл сухих веществ, 22 мас.% которых составляли белки. Очевидно, что стоимость автолизата пивных дрожжей намного ниже цены коммерческого продукта - дрожжевого экстракта.

Для культивирования бактерий р. Serratia использовали среду Раймонда с соевой мукой в концентрациях 0,5 мас.%, 2,5 мас.% и автолизатом пивных дрожжей в концентрациях 3 мас.%, 6 мас.%, 9 мас.%. В качестве субстрата для деструкции использовали кулинарный жир. Кулинарный жир представляет собой комбинацию говяжьего жира (90%) и растительных масел, поэтому он может служить подходящей моделью для изучения процесса биодеструкции жиров.

Анализ полученных данных показал, что степень биодеградации кулинарного жира бактериями р. Serratia зависела от состава питательной среды. После 96 часов культивирования степень утилизации кулинарного жира исследуемыми штаммами достигала 100% на средах, содержащих соевую муку и дрожжевой автолизат.

Показано, что полная деструкция (100%) кулинарного жира штаммом Serratia sp. ИБ 1 достигалась на среде, содержащей 2,5 мас.% соевой муки и 9 мас.% дрожжевого автолизата, штамм S. marcescens ИБ 2-2 полностью

разлагал жир при наличии 2,5 мас.% соевой муки и 6 мас.% автолизата пивных дрожжей, S. marcescens ИБ 2-1 нуждался лишь в высокой концентрации дрожжевого автолизата, штамм Serratia sp. ИБ 3-3 разлагал жир на среде с 2,5 мас.% соевой муки и 3 мас.% автолизата пивных дрожжей (рис. 4 а, б, в, д).

Наиболее активным штаммом - деструктором жира оказался Serratia sp. ИБ 3-1. Степень утилизации кулинарного жира этим штаммом на разных средах колебалась от 85% до 100% (рис. 4 г). Наилучшие результаты по биодеградации жира штаммом ИБ 3-1 были получены на средах, содержащих 6 мас.% дрожжевого автолизата. Даже в отсутствии соевой муки степень утилизации кулинарного жира составила 95%, добавление в среду 2,5 мас.% соевой муки привело к 100% деструкции жира штаммом ИБ 3-1.

Для штамма Serratia sp. ИБ 3-1, проявившего себя самым активным деструктором кулинарного жира, была исследована способность утилизировать свиной жир, оливковое и подсолнечное масла. В условиях лабораторного опыта полная биодеградация свиного жира достигалась в течение 48 часов при использовании питательной среды, содержащей 2,5 мас.% соевой муки и 3 мас.% автолизата пивных дрожжей. Аналогичный результат по биодеградации растительных масел (оливкового и подсолнечного) на питательной среде указанного состава достигался уже за 24 часа культивирования.

Показано, что степень биодеградации жиров бактериями р. Serratia, как и липолитическая активность, зависят от состава питательной среды. Максимальная деструкция субстратов микроорганизмами наблюдалась на средах, содержащих 2,5 мас.% соевой муки (при концентрации автолизата пивных дрожжей в составе питательных сред от 3 мас.% до 9 мас.%). Показана возможность 100% деградации свиного и кулинарного жиров, оливкового и подсолнечного масел штаммом Serratia sp. ИБ 3-1.

Рисунок 4. Степень биоцеградации жиров бактериями р. Serratia на богатых питательных средах через 96 часов культивирования: а- S. marcescens ИБ 2-1, б - S. marcescens ИБ 2-2, в - Serratia sp, ИБ 1, г - Serratia sp. ИБ 3-1, д - Serratia sp. ИБ 3-3.

5. Изучение эффективности процесса очистки модельных растворов жиросодержащих сточных вод бактериями рода Serratia

Изучение эффективности процесса очистки жиросодержащих сточных вод исследуемыми микроорганизмами проводили на модельных растворах. Растворы готовили на основе среды Раймонда. В качестве субстратов использовали оливковое и подсолнечное масла, а также свиной и кулинарный жиры, которые вносили в модельные растворы в концентрации 1 мас.%. В качестве инокулята была использована биомасса изучаемых микроорганизмов р. Serratia, полученная на оптимальных для синтеза липазы питательных средах.

Показано, что все исследуемые штаммы бактерий р. Serratia утилизируют жиры с достаточно высокой степенью (табл. 4). Уже после 16 часов культивирования степень биодеградации оливкового масла для разных штаммов составляла от 65% до 100%. Для подсолнечного масла соответствующий показатель варьировал от 64% до 98%. Жиры животного происхождения утилизировались медленнее растительных масел. Очевидно, это обусловлено их плохим эмульгированием в воде. Степень биодеградации кулинарного жира разными штаммами составляла от 51% до 100% в зависимости от продолжительности культивирования. Свиной жир утилизировался исследуемыми бактериями несколько быстрее, степень его биодеградации для разных штаммов составила от 61% до 100%.

Наилучшие результаты по биодеградации растительных масел получены для штаммов Serratia sp. ИБ 3-1 и ИБ 1. Эти штаммы на 100% утилизировали оливковое масло уже после 16 и 24 часов культивирования соответственно, максимальное потребление подсолнечного масла для обоих штаммов достигалось за 24 часа. Твердые жиры животного происхождения (свиной и кулинарный) полностью утилизировались после 96 часов культивирования лишь штаммами S. marcescens ИБ 2-2 и Serratia sp. ИБ 3-1.

Таким образом, показано, что все исследуемые штаммы бактерий р. Serratia весьма эффективно утилизируют растительные и животные жиры в условиях очистки модельных жиросодержащих растворов.

Таблица 4

Биодеградация растительных и животных жиров бактериями р. Serratia в условиях модельных опытов по очистке воды, %

Время культивирования, ч Штаммы

ИБ 1 ИБ 2-1 ИБ 2-2 ИБ 3-1 ИБ 3-3

Оливковое масло

16 81 75 72 100 65

24 100 82 75 100 86

48 100 89 77 100 88

Подсолнечное масло

16 81 64 72 98 88

24 100 64 72 100 89

48 100 83 94 100 98

Кулинарный жир

24 75 73 70 51 67

45 82 76 86 78 71

72 91 89 99 97 80

96 93 95 100 100 87

Свиной жир

24 93 84 61 92 74

45 97 85 73 95 90

72 98 95 83 97 92

96 100 97 100 100 93

Оценивая перспективы дальнейшего использования исследованных штаммов бактерий р. Serratia, следует рекомендовать штаммы S. marcescens ИБ 2-2 и Serratia sp. ИБ 3-1 в качестве основы биопрепаратов для локальной очистки жиросодержащих сточных вод и биоферментной очистки канализационных систем от твердых жиров. Эти штаммы, как показал комплекс проведенных исследований, обладают высоким уровнем липолитической и окислительной активности, и могут эффективно разлагать жиры растительного и животного происхождения, содержащиеся в сточных водах.

ВЫВОДЫ

1. Выделены и идентифицированы пять новых штаммов бактерий рода Serratia: Serratia marcescens ИБ 2-1, Serratia marcescens ИБ 2-2, Serratia species ИБ 1, Serratia species ИБ 3-1, Serratia species ИБ 3-3, обладающих высокой липолитичёской активностью.

2. Установлен оптимальный состав сред, обеспечивающий максимальное продуцирование липолитических ферментов каждым штаммом. Показано, что штаммы Serratia marcescens ИБ 2-2 и Serratia species ИБ 3-1 могут быть использованы в качестве продуцентов липаз.

3. Определена величина окислительной активности.новых штаммов по. отношению к жирам растительного и животного происхождения, а также углеводородам (алифатическим, циклическим, окисленным) нефти и нефтепродуктам.

4. Показано, что штаммы Serratia marcescens ИБ 2-2 и Serratia species ИБ 3-1 могут служить основой биопрепарата для очистки жиросодержащих сточных вод.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Паканещикова Н.В., Логинов О.Н., Силищев H.H. Исследование липолитичёской активности на твердых жирах // Материалы III всероссийской научной internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (1531.12.2004 г., Уфа). Уфа: Гос. изд-во научй-техн. лит-ры «Реактив», 2005.- С. 45.

2. Паканещикова Н.В., Логинов О.Н., Соков Ю.Ф. Выделение микроорганизмов, обладающих липолитичёской активностью // Материалы III всероссийской научной internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (15-31.12.2004 г., Уфа). Уфа: Гос. изд-во научн-техн. лит-ры «Реактив», 2005,- С. 20-22.

3. Паканещикова Н.В., Соков Ю.Ф. О роли липолитических ферментов - липаз // Материалы III всероссийской научной internet-

конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (15-31.12.2004 г., Уфа). Уфа: Гос. изд-во научн-техн. лит-ры «Реактив», 2005.- С.100-102.

4. Паканещикова Н.В., Логинов О.Н., Силищев H.H. Скрининг новых микроорганизмов, обладающих липолитической активностью // Материалы Всероссийской Молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (1-3.11.2005 г., Москва). М.: МАКС Пресс, 2005.-С. 100-101.

5. Логинов О.Н., Паканещикова Н.В., Силищев H.H., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. «Штамм бактерий Serratia marcescens, продуцирующий липолитические ферменты для получения препарата для очистки сточных вод от жиров // Заявка на изобретение № 2006107802/13 (008473) от ¡3.03.2006 г. Решение Роспатента о выдаче Патента РФ от 11.04.2007.

6. Логинов О.Н., Паканещикова Н.В., Силищев H.H., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. «Штамм бактерий Serratia species - продуцент липазы Н Заявка на изобретение № 2006107803/13 (008474) от 13.03.2006 г. Решение Роспатента о выдаче Патента РФ от 1.03.2007.

7. Паканещикова Н.В., Силищев Н.Н, Логинов О.Н. Влияние компонентов питательной среды на биосинтез липазы // Башкирский химический журнал, 2006.- Т. 13.- № 2.- С. 16-19.

8. Паканещикова Н.В., Силищев Н.Н, Логинов О.Н. Утилизация кулинарного жира бактериями рода Serratia // Тезисы докладов XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (2-4.10.2006 г., Уфа). Уфа: Гос. изд-во научн-техн. лит-ры «Реактив», 2006.- Т. 1.- С. 189-190.

9. Паканещикова Н.В., Силищев Н.Н, Галимзянова Н.Ф., Логинов О.Н. Сравнительное изучение зависимости липолитической активности бактерий рода Serratia от состава питательной среды // Башкирский химический журнал, 2006.- Т. 13.- № 4,- С.31-34.

10. Поскрякова Н.В., Силищев Н.Н, Галимзянова Н.Ф., Логинов О.Н. Бактерии Serratia sp. ИБ 3-1 как основа биопрепарата для локальной очистки жиросодержащих сточных вод // Экология и промышленность России, 2007, № 6 (в печати).

Подписано в печать 14.04.2007. Формат 60x84 1/16. Бумага ксероксная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 101. Гарнитура «Times Ñew Reman». Отпечатано с готовых оригинал-макетов в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ». ИП ВЕРКО. Объем 1,4 п.л. Уфа, Карла Маркса12/4, т/ф: 2727-600, 2729-123

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Поскрякова, Наталья Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Биологическая очистка сточных вод

1.2 Локальная очистка сточных вод

1.3 Методы скрининга микроорганизмов - продуцентов липаз и определение их липолитической активности.

1.4 Микробные липазы

1.5 Факторы, определяющие биосинтез липаз микроорганизмами

1.6 Применение микробных липаз

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Объекты исследований

2.2 Скрининг липолитически активных микроорганизмов

2.3 Изучение фенотипических характеристик выделенных культур.

2.4 Идентификация микроорганизмов

2.5 Определение липолитичекой активности

2.6 Изучение условий культивирования, влияющих на биосинтез липаз исследуемыми микроорганизмами

2.7 Исследование окислительной активности микроорганизмов

2.8 Исследование процесса биодеструкции растительных и животных жиров

2.9 Изучение эффективности процесса очистки модельных растворов жиросодержащих сточных вод

2.10 Статистическая обработка результатов

3. СКРИНИНГ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ, ПРОЯВЛЯЮЩИХ ЛИПОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

3.1 Выделение и фенотипическая характеристика новых штаммов продуцентов липазы

3.2 Идентификация исследуемых штаммов путем секвенирования 16S рРНК

4. ИЗУЧЕНИЕ ЛИПОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ РОДА SERRATIA

4.1 Влияние источника углерода на продукцию липаз изучаемыми штаммами

4.2 Оптимизация состава питательной среды для увеличения липолитической активности выделенных штаммов

5. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРА ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ РОДА SERRATIA

6. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА БИОДЕСТРУКЦИИ ЖИРОВ РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ БАКТЕРИМИ РОДА SERRATIA

7. ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОЦЕССА ОЧИСТКИ МОДЕЛЬНЫХ РАСТВОРОВ ЖИРОСОДЕРЖАЩИХ СТОЧНЫХ ВОД БАКТЕРИЯМИ РОДА SERRATIA

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка основы биопрепарата для деструкции жиров"

Актуальность проблемы.

Состояние водной среды, особенно в индустриально развитых регионах, заставляет разрабатывать и вводить в действие все более жесткие нормативы на сброс загрязнений в водоемы и городские коллекторы. Одним из перспективных способов решения этих проблем является биоферментная технология разложения органических веществ, в том числе жиров и растительных масел на локальных очистных сооружениях, находящихся непосредственно на предприятиях (Молоканов с соавт., 2005; Новохатко, Михельсон, 2006).

Задачи исследования.

1. Выделить из природных и техногенных мест обитания новые штаммы липолитически активных микроорганизмов.

3. Определить спектр окислительной активности исследуемых микроорганизмов в отношении растительных и животных жиров, а также углеводородов различных классов.

Определен спектр окислительной активности бактерий p. Serratia по отношению к жирам растительного и животного происхождения, индивидуальным углеводородам, нефти и продуктам ее переработки.

Практическая значимость.

В модельных условиях выявлено, что исследуемые микроорганизмы способны осуществлять 100% биодеградацию жиров растительного и животного происхождения. Показана возможность использования штаммов S. marcescens ИБ 2-2 и Serratia sp. ИБ 3-1 для разработки биопрепарата для очистки жиросодержащих сточных вод.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на III Всероссийской научной internet-конференции

Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 2004), Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2006).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Поскрякова, Наталья Владимировна

выводы

3. Определена величина окислительной активности новых штаммов по отношению к жирам растительного и животного происхождения, а также углеводородам (алифатическим, циклическим, окисленным) нефти и нефтепродуктам.

101

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сточные воды предприятий пищевой промышленности, образующиеся в технологических процессах, характеризуются высоким содержанием органических загрязнений. Отсутствие современных локальных очистных сооружений на большинстве предприятий, а также рост объемов производства, зачастую приводит к ухудшению состава производственных сточных вод по таким показателям, как ХПК, БПК, жирам, аммонийному азоту, фосфатам и т.п. Вместе с тем, с каждым годом, со стороны контролирующих органов предъявляются все более жесткие требования к предприятиям, оказывающим отрицательное воздействие на окружающую среду. Одним из способов решения этой проблемы является локальная биологическая очистка сточных вод.

Современные технологии локальной биологической очистки сточных вод основаны, главным образом, на применении микробиологических препаратов, целенаправленно воздействующих на специфические загрязнения.

Новые штаммы бактерий рода Serratia, выделенные нами из образцов активного ила биологических очистных сооружений Пермского мясокомбината, обладают высокой липолитической и оксислительной активностью по отношению к жирам растительного и животного происхождения, углеводородам нефти и продуктам ее переработки.

Величина липолитической активности изучаемых штаммов бактерий рода Serratia зависит от наличия в питательной среде таких сложных органических компонентов, как соевая мука и дрожжевой экстракт. Добавление дрожжевого экстракта в состав питательной среды, содержащей соевую муку, и увеличение его концентрации не просто повышает синтез фермента изучаемыми бактериями, а на порядок увеличивает липолитическую активность исследуемых культур. Для каждого исследуемого штаммаподобрана питательная среда, оптимальная для биосинтеза липазы. Выявлены два штамма, S. marcescens ИБ 2-2 и Serratia sp. ИБ 3-1, которые продуцировали максимальное количество липазы по сравнению со всеми известными нам бактериями этого рода.

Новые штаммы-продуценты липазы способны утилизировать на 100% жиры растительного и животного происхождения как на богатых питательных средах, содержащих сложные органические компоненты, так и в условиях модельных жиросодержащих растворов.

Совокупность положительных свойств изученных штаммов позволяет считать их перспективной основой для создания биопрепаратов, которые могут использоваться в процессах локальной очистки жиросодержащих стачных вод. Наиболее активными из всех исследованных являются штаммы Serratia species ИБ 3-1 и Serratia marcescens ИБ 2-2, способные эффективно утилизировать широкий спектр жиров.

100

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Поскрякова, Наталья Владимировна, Уфа

1. Алещенкова З.М., Самсонова А.С., Семочкина Н.Ф. Влияние микроорганизмов-деструкторов на очистку в активном иле сточных вод производства лавсана // Прикладная биохимия и микробиология,- 1999.- Т. 35.-№4.-С. 448-451.

2. Аренде И.М., Дорохов В.В., Турочкина Т.М., Борисова Т.Г. Питательные среды для биосинтеза липазы Aspergillus awamori // Прикладная биохимия и микробиология.- 1975 .- Т. 11.- № 5.- С. 691-696.

3. Артемов А.В., Попов В.О., Королева О.В., Шубина Е.В., Кудрявцева Т.Н. Перспективы использования ферментативного катализа в текстильной промышленности // Катализ в промышленности.- 2006,- № 1.- С. 42-47.

4. Башкатова Н.А, Северина Л.О. Влияние условий культивирования на биосинтез липазы у Serratia marcescens // Микробиология,- 1979.- Т. 48.- № 5.- С. 826-831.

5. Башкатова Н.А., Северина Л.О. Выделение и характеристика внутриклеточной липазы Serratia marcescens 345 // Прикладная биохимия и микробиология.- 1980.- Т. 16.- № 3.- С. 315-325.

6. Башкатова Н.А., Северина Л.О. Экзолипазы некоторых видов Pseudomonas // Микробиология.- 1978.- Т. 47, № 2.-С. 234-240.

7. Безбородое A.M. Биотехнология продуктов микробного синтеза,- М.: Агропромиздат, 1991.- 238 с.

8. Безбородое А.М. Биохимические основы микробного синтеза.- М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984.- 304 с.

9. Брокерхоф X., Дженсен Р. Липолитические ферменты.- М.: Мир, 1978.396 с.

10. Вожова И.М., Лебедева Ж.Д. Влияние липидного компонента среды на биосинтез липазы грибами // Микробиология -1979. Т. 48.- № 4. - С. 653-657.

11. Глазунова Л. М., Гончаров Ю. И., Минина В. С. Липазы микроорганизмов,- М.: ОНТИТЭИмикробиопром, 1984.- 36 с.

12. Голубовская Э.К. Биологические основы очистки воды. М.: Высшая школа, 1978.- 232 с.

13. Гореликова Г.А. Основы современной пищевой биотехнологии: Учебное пособие. Кемерово , 2004.- 100 с.

14. Давранов К.Д., Гулямова К.А., Розмухомедова Б., Шамшиева М. Выделение и характеристика внеклеточных липаз микромицета Penicillium sp. // Прикладная биохимия и микробиология.- 1994,- Т. 30.- № 2.- С. 234237.

15. Давранов К.Д., Куйлибаев И.Т., Розмухамедова Б.Х., Махсумханов А.А. Некоторые свойства внеклеточной липазы из Rhizopus microsporus УзЛТ-3 // Прикладная биохимия и микробиология.- 1995.- Т. 31.- № 4.- С. 405-411.

16. Давранов К.Д. Микробные липазы в биотехнологии // Прикладная биохимия и микробиология,- 1994,- Т. 30, № 4.- С. 527-533.

17. Дужак А. Б., Панфилова З.И., Васюнина Е.А. Выделение и свойства препаратов внеклеточных липаз природного (В-10) и мутантного (М-1) штаммов Serratia marcescens // Прикладная биохимия и микробиология.-2000.- Т. 36, №4.- С. 402-411.

18. Закиров М.З., Султанова И.Г., Давранов К. Rhizopus microsporus штамм УзЛТ-1 термотолерантный продуцент липазы // Прикладная биохимия и микробиология.- 1975.- Т. 11.- № 4,- С. 546-549.

19. Заявка ЕПВ (WO) № 0528828 МКИ 5 С 12 N 9/20. Щелочные липазы Bacillus, кодирующие их последовательности ДНК и продуцирующие эти липазы бациллы. Опубл. 03.03.93.

20. Заявка ПНР № 265870 МКИ 4 С 12 N. Способ получения нерастворимых препаратов липазы и эстеразы Mucor racemosus А 37 // Опубл. 26.05.88.

21. Заявка РСТ (WO) № 94/01542 МКИ 5 С 12 N 9/12. Способ очистки двух изоферментных липаз Candida rugosa // Опубл. 02.07.93.

22. Заявка Японии № 4-30833 МКИ 5С N 1/14; 9/12. Способ получения микробной биомассы с высокой липазной активностью // Опубл. 22.05.92

23. Звягинцева И.С., Городнянская Л.И. Липолитическая активность осмотолерантных дрожжей // Микробиология.- 1978.- Т. 47.- № 2.- С. 230233.

24. Звягинцева И.С., Дмитриев В.В., Рубан Е.Л., Фихте Б.А. Локализация внеклеточной липазы у дрожжей Candida paralipolytica // Микробиология.-1980.- Т. 49.- № 3.- С. 417-420.

25. Илларионова Р.П., Бондаренко Б.Н., Пархоменко Л.В., Бернасовская Е.П. Количественный метод определения лецитиназ и липаз у микроорганизмов. // Прикладная биохимия и микробиология.- 1976.- Т. 12.-№ 5.- С. 784-787.

26. Илялетдинов А.Н., Алиева P.M. Микробиология и биотехнология очистки промышленных сточных вод.- Алма-Ата: Гылым, 1990.- 224 с.

27. Казанина Г.А., Петрова Л.Я., Селезнева А.А., Рубан Е.Л. Сравнительное изучение свойств липаз микробного происхождения // Прикладная биохимия и микробиология.- 1976.- Т. 12.- № 44.- С. 537-540.

28. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия: Пер. с нем. М.: Мир, 2000. - 469 с.

29. Коновалов А.А. Разработка методов разделения рацемических эфиров с помощью гидролаз микроорганизмов: Автореф. дис. канд. техн. наук. -Уфа,2002.-24 с.

30. Коршунова Т.Ю., Силищев Н.Н., Логинов О.Н. Микробиологические процессы на очистных сооружениях. Уфа: Реактив, 2005.- 62 с.

31. Крушенко Г.Г., Сабирова Д.Р., Петров С.А., Талдыкин Ю.А. Проблема воды // Вода и экология.- 2000,- № 3.- С. 2-8.

32. Кудряшова Н.В., Андреева И.Н. Serratia marcescens продуцент пигмента продигиозина // Материалы 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». 17-21 апреля 2006.- С. 380.

33. Куимова Т.Ф., Шабанова Е.А., Казаков Г.А. Быстрый отбор микроорганизмов, образующих внеклеточные липазы // Микробиология.-1975.- Т. 44.- № 2.- С. 365-367.

34. Лещинская И.Б. Современная промышленная микробиология // Соросовский образовательный журнал.- 2000.- Т. 6,- № 4.- С. 14-18.

35. Лобырева Л.Б. Липолитическая активность дрожжей Candida utilis 295t // Известия АН СССР. Серия биологическая.- 1974.- № 6.- С. 885-890.

36. Лобырева Л.Б., Марченкова А.И. Липолитическая активность спорообразующих бактерий Bacillus subtilis // Микробиология.- 1979.- Т. 48.-№2.- С. 208-211.

37. Международная заявка № 91/00910 МКИ 5С 12 N 15/55. Мутантные липазы, продуцируемые Pseudomonas // Опубл. 24.01.91

38. Меледина Т.В., Соколова А.А. К вопросу очистки жиросодержащих сточных вод. Л., 1990.- 3 с.

39. Методы общей бактериологии: Пер. с англ. В 3 т. / Под ред. Ф.Герхардта и др.- М.: Мир, 1984.- 264 с.

40. Михеев А.В., Зиновьева М.Е., Калачева Н.В. Получение и некоторые свойства липазы Saccharomicopsis lipolytica-35 // Материалы 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века». 17-21 апреля 2006.- С. 384.

41. Молоканов Д.А., Молчан А.В., Хайруллин Р.С. Очистка сточных вод предприятий пищевой промышленности // Пищевая промышленность.-2005.- № 4.

42. Определитель бактерий Берджи: В 2 т. / Под редакцией Дж. Хоулта и др.-М.: Мир, 1997.-Т. 1.

43. Очистка сточных вод. Пер. с англ. / Хенце М., Армоэс П., Ля-Кур-Янсен Й., Арван Э. М.: Мир, 2004.- 480 с.

44. Пат. 2233325 Российской Федерации, 7 С12 N9/02. Способ получения комплексного препарата липазы и липоксигеназы / Шеламова С.А., Янышева Н.В. / Заявлено 08.01.2003; опубл. 27.07.2004.

45. Перевозникова О.А., Козырева Т.М. Липолитическая активность дрожжей Yarrowia lipolytica при различных условиях культивирования // Материалы 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века». 17-21 апреля 2006.- С. 388.

46. Попова Н.И., Кривова А.Ю., Растимешина И.О., Бурцева С.А. Взаимосвязь биосинтеза липидов, липоксигеназы и липазы у культур актиномицетов // Микробиология.- 2005.- Т. 74.- № 5.- С. 717-719.

47. Практикум по микробиологии. / Под ред. Н.С. Егорова.- М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1976.- 308 с.

48. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. М.: Мир, 1987.117с.

49. Рубан Е.Л., Лобырева Л.Б., Свириденко Ю.Я., Марченкова А.И., Уманский М.С. Липолитическая активность микроорганизмов, выделенных из различных источников // Прикладная биохимия и микробиология.- 1978.Т. 14,- №4,- С. 499-502.

50. Рубан Е.Л. Микробные липиды и липазы. М.: Наука, 1977.- 192 с.

51. Свириденко Ю. Я., Лобырева Л. Б., Марченкова А. И., Рубан Е. Л., Усманский М. С. Влияние состава среды на биосинтез и свойства экзолипаз микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология- 1978.- Т. 14.- № 5.- С. 677-683.

52. Северина Л.О., Башкатова Н.А. Выделение внутриклеточной липазы у Serratia marcescens // Микробиология.- 1979.- Т. 48.- № 6.- С. 994-998.

53. Современная микробиология. Прокариоты: В 2-х томах. Пер. с англ. / Под ред. Ленглера Й., Древса Г., Шлегеля Г.- М.: Мир, 2005,- 656 с.

54. Стебловская Е.Ф. Липолитичекие ферменты микроорганизмов. Институт микробиологии АН Респ. Молдова.- Кишинев, 1997.- 5 с.

55. Табак М.Я., Щелокова С.С. Влияние твинов на липазную активность // Микробиология. -1979. Т. 48, № 4. - С. 658-662.

56. Тимофеева С.С. Современные методы очистки сточных вод предприятий мясоперерабатывающей промышленности // Химия и технология воды.- 1993.- Т. 15.- № 7-8.- С. 571-577.

57. Тютюнников Б.Н. Химия жиров. М.: Пищевая промышленность, 1974.446 с.

58. Феофанов Ю.А. Проблемы и задачи в сфере обеспечения населения питьевой водой // Вода и экология.-1999. №1. - С. 4-7.

59. Шаяхметов И.Ф. Экологическая биотехнология. Уфа: РИО БашГУ, 2003.- 168 с.

60. Шеламова С.А., Жеребцов Н.А., Щеголев В.В. Оптимизация условий биосинтеза липазы // Ферментная и спиртовая промышленность,- 1984.- № 4.- С. 26-28.

61. Яковлев С.В., Воронов Ю.В. Водоотведение и очистка сточных вод / Учебник для вузов. М.: АСВ, 2004.- 704 с.

62. Abdou A.M. Purification and partial characterization of psychrotrophic Serratia marcescens lipase // J. Dairy Sci.- 2003.- Vol. 86.- P. 127-132.

63. Adamitsch B.F., Karner F., Hampel W.A. High cell density cultivation of Brevibacterium linens and formation of proteinases and lipase Biotechnology Letters.- 2003.- Vol. 25.- P. 705-708.

64. Aires-Barros M.R., Taipa M.A., Cabral J.M.S. Isolation and purification of lipases. In: Wooley P, Petersen SB (eds) Lipases-their structure, biochemistry and application // Cambridge University Press: Cambridge, -1994. P. 243-270.

65. Becker P., Koester D., Popov M. N., Markossian S., Antranikian G., Maerkl H. The biodegradation of olive oil and the treatment of lipid-rich wool scouring wastewater under aerobic thermophilic conditions // Wat. Res.- 1999.- Vol. 33.- № 3.- P. 653-660.

66. Berne C., Montjarret В., Guountti Y., Garcia D. Tributyl phosphate degradation by Serratia odorifera. // Biotechnology Letters.- 2004.- Vol 26.- P. 681 -686.

67. Berry G. Detection of Microbial Lipase by Copper Soap Formation // Journal of Bacteriology.- 1933.- Vol. 25.- № 2.- P. 433-434.

68. Berto P., Belingheri L., Dehorter B. Production and purification of a novel extracellular lipase from Alternaria brassicicola // Biotechnology Letters.-1997.-Vol 19, No 6, P. 533-536.

69. Bloomer S. Lipase-catalysed lipid modifications in nonaqueous media // Dissertation Abstracts International.- 1993.- Vol. 53.- № 4.- P. 0703.

70. Borgstrom B. a. Brockman H. L. Lipases.- Amsterdam: Elsevier Science Publishers В. V., 1984.- 527 p.

71. Bours J., Mossel D. A comparison of methods for the determination of lipolytic properties of yeasts isolated from margarine // Antonie van Leeuwenhoek. J. Microbio.- 1969.- Vol. 35.- № 1.- P. 246.

72. Bradoo S., Saxena RK., Gupta R. Two acidothermotolerant lipases from new variants of Bacillus sp. H // World Journal Microbiol. Biotechnol. 1999. - Vol. 15. -P. 87-91.

73. Bridoux G., Dhulster P. and Manem J. Analyse des graisses dans les stations d'epuration // Tech. Sci. Methodes.-1994.- Vol. 5.- P. 257-262.

74. Brockerhoff H., Hoyle R., Hwang P. An assay of lipase based on the liberation of acetaldehyde from vinyl oleate // Anal. Biochem.- 1970.- Vol. 37.- № 1.- P. 26-31.

75. Brune A.K., Gotz F. Degradftion of lipids by bacterial lipases. In: Winkelman G (ed) Microbial degradation of natural products.- VCH: Weinhein, 1992.-P. 243-266.

76. Burlina A., Galzigna Z. Turbidimetric Procedure for Determination of lipase activity // Clin. Chem.- 1973.- Vol. 19.- № 4.- P. 384 386.

77. Cang S., Sanada M., Johdo O., Ohta S., Nagamatsu Y., Yoshimoto A. High production of prodigiosin by Serratia marcescens grown on ethanol // Biotechnology Letters.- 2000.- Vol. 22.- P. 1761-1765.

78. Cheng Y-C., Tsai S-W. Enantioselective esterification of (SR)-2-(4-chlorophenoxy) propionic acid via Carica papaya lipase in organic solvents // Tetrahedron Asymmetry.- 2004.- Vol. 15.- № 18.- 2917-2920.

79. Deive F.J., Costas M., Longo M.A. Production of a thermostable extracellular lipase by Kluyveromyces marxianus Biotechnology Letters.- 2003.-Vol. 25.- P. 1403-1406.

80. Dharmsthiti S., Kuhasuntisuk B. Lipase from Pseudomonas aeruginosa LP602: biochemical properties and application for wastewater treatment // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 1998.- Vol. 21.- P. 75-80.

81. Dharmsthiti S., Luchai S. Production, purification and characterization of thermophilic lipase from Bacillus sp. THL027. FEMS // Microbiol. Letters. 1999. -Vol. 179.-P. 241-246.

82. Dole V. A relation between nonesterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose // Journal of clinical investigation.- 1956. Vol. 35.- P. 150154.

83. Dong H., Gao S., Han S., Cao S. Purification and characterization of a Pseudomonas sp. lipase and its properties in non-aqueous media // Appl Microbiol Biotechnol. -1999. Vol. 30. - P. 251-256.

84. Donnerhock W. Abwasserbehaudlung in der Lebensmittelindustrie // {Correspond. Abwasser.-1991.- Vol. 38.- № 3.- P. 432-435.

85. Dunkley W., Smith Z. Hydrolytic rancidity in milk. IV. Relationship between tributyrinase and lipolysis // Journal of Dairy Science. 1951.- Vol. 34, № 4, P. 940-947.

86. Fruer Т., Rieter В., Lawrence R. Methods for isolation and enumeration of lipolytic organisms // J. Dairy Sci.- 1967.- Vol. 50, № 4 .- P. 477-484.

87. Garber N. The effect of osmotic stress and antibiotic on the production of protease and lipase by Serratia marcescens // European Journal of Biochemistry.-2001.- Vol. 268.-P. 189-243.

88. Ghosh P.K., Saxena R.K., Gupta R, Yadav R.P., Davidson W.S. Microbial lipases: production and applications // Science Progress. -1996. -Vol. 79.-P. 119-157.

89. Gilbert E.J., Drozd J.W., Jones C.W. Physiological regulation and optimization of lipase activity in Pseudomonas aeruginosa EF2 // Journal of General Microbiology. -1991. Vol. 137 - P. 2215-2221.

90. Guieysee D., Sandoval G., Faure L., Nicaud J-M., Monsan P., Marty A. New efficient lipase from Yarrowia lipolytica for the resolution of 2-bromo-arylacetic acid estrs // Tetrahedron Asymmetiy.- 2004.- Vol. 15.- № 22.- P. 3539-3543.

91. Gupta R., Gupta N., Rathi P. Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical properties // Applied and Environment Microbiology.2004.-Vol. 64.-P 763-781.

92. Jiali X., Jun Z., Zutong Q. Lipase from Penicillium camembert II-PG3 // Acta mycol. sin.- 1995.- Vol. 14.- № 2.- P. 136-142.

93. Jaeger K.E., Schneidinger В., Rosenau F., Werner M., Lang M., Dijkstra B.W., Schimossek K., Zonta A., Reetz M.T. Bacterial lipases for biologycal application // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic.- 1997.- Vol. 3.-№ 1-4.-P. 3-12.

94. Kanwar L., Gogoi B.K., Goswami P. Production of a Pseudomonas lipase in n-alkane substrate and its isolation using an improved ammonium sulfate precipitation technique // Bioresource Technology. 2002. - Vol. 84. - P. 207-211.

95. Kawai E., Akatsuka H., Sakurai N., Idei A., Matsumae H., Shibatani N., Komatsubara S., Omori K. Isolation and analysis of lipase-overproducing mutant of Serratia marcescens // J. Biosci. Bioeng.- 2001.- Vol. 91.- P. 409-415.

96. Kim S.S., Kim E.K., Rhee J.S. Effects of growth rate on the production ofPseudomonas fluorescens lipase during the fedbatch cultivation of Escherichia colill //Biotechnology Progress. -1996. Vol. 12. - P. 718-722.

97. Mahler G.F., Kok R.G., Cordenons A., Hellingwerf K.J., Nudel B.C. Effects of carbon sources on extracellular lipase production and lipA transcription in Acinetobacter calcoaceticus // Applied and Environment Microbiology.- 2000. -V. 24.-P. 25-30.

98. Makhzoum A., Knapp J.S., Owusu R.K. Factors affecting growth and exstracellular lipase production by Pseudomonas fluorescencs 2D // Food Microbiol.- 1995.- Vol. 12.- № 4.- P. 277-290.

99. Montpas S. , Samson J., Langlois E., Lei J., Piche Y., Chenevert R. Degradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Serratia marcescens. Biotechnology Letters, Vol 19, № 3, March 1997, P. 291-294.

100. Murty V.R., Bhat J.,. Muniswaran P.K.A Hydrolysis of rice bran oil using an immobilized lipase from Candida rugosa in isooctane // Biotechnology Letters.-2004.-Vol. 26.-P. 563-567.

101. Nascimento M.G., Zanotto S.P., Melegari S.P., Femandes L., Mandolesi S.M., Resolution of a-methylene-p-hydroxy esters catalysed by free and immobilized Pseudomonas sp. lipase // Tetrahedron Asymmetry.- 2003.- Vol. 14.-№20.-P. 3111-3115.

102. Nawani N., Dosanjh N.S., Kaur J. A novel thermostable lipase from a thermophilic Bacillus sp.: characterization and esterification studies Biotechnology Letters.-1998.- Vol 20.- No 10.-P. 997-1000.

103. Ogino H., Ishikawa H. Enzymes which are stable in the presence of organic solvents // Journal of Bioscience and Bioengineering.-2001.-Vol. 91, № 3.-P.109-116.

104. Oh B.-C., Kim H.-K., Lee J.-K., Kang S.-C., Oh T.-K. Staphylococcus haemolyticus lipase: biochemical properties, substrate specificity and gene cloning // FEMS Microbiology Letters. 1999. - Vol. 179.- P. 385-392.

105. Ota Y., Yamada К., Tomizuka N. Lipase from Candida cylindracea. I. Purification and properties // Agric. and Biol. Chem.- 1966 Vol. 30.- P. 576584.

106. Pancholy S., Lynd J. Characterization of Wheat Germ Lipase // Phytochemistry.- 1972.- Vol. 11.- № 4.- P. 643-645.

107. Pepeyira-Meireles F., Rocha-Leao M.H.M., Sant'Anna Jr. Lipase location in Yarrowia lipolytica cells // Biotechnology Letters.- 2000.- Vol. 22.- P. 71-75.

108. Rapp P. Production, regulation and some properties of lipase activiti from Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum // Enzyme and microbial tecnology.-1995.- Vol. 17.-P.832-838.

109. Rashid N, Shimada Y, Ezaki S, Atomi H, Imanaka T. Lowtemperature lipase from psychrotrophic Pseudomonas sp. Strain KB700A // Applied and Environment Microbiology. 2001.- V. 67.- P. 4064-4069.

110. Rathi P., Saxena R.K., Gupta R. A novel alkaline lipase from Burkholderia cepacia for detergent formulation // Process Biochemistry. 2001. - Vol. 37. - P. 187-192.

111. Reetz M.T., Jaeger K.-E. Overexpression, immobilization and biotechnological application of Pseudomonas lipases // Chem Phys Lipids.- 1998.-Vol. 93.- P.3-14.

112. Schmidt-Dannert C., Luisa R. M., Schmid R.D. Two novel lipases from the thermophile Bacillus thermocatenulatus: Screening, purification, cloning, overexpression and properties // Methods Enzymol. 1997. - Vol. 284. - P. 194-219.

113. Schrag J.D., Li Y., Wu Sh., Cygler M. Multiple crystal forms of lipases from Geotrichum candidum // Journal of Molecular Biology.- 1991,- V 220.- P 541-543.

114. Schrag J.D., Li Y., Wu Sh., Cygler M. Ser-His-Glu Forms the Catalytic Site of a Lipase from Geotrichum candidum // Lett, to Nature.- 1991.- V 351.- P 761764.

115. Schuepp C., Kermasha S., Michalski M.-C., Morin A. Production, partial purification and characterization of lipases from Pseudomonas fragi CRDA 037 //

116. Process Biochemistry. -1997.- Vol. 32.- P. 225-232.

117. Sharma R., Soni S.K., Vohra R.M., Jolly R.S., Gupta L.K., Gupta J.K. Production of extracellular alkaline lipase from a Bacillus sp. RSJ1 and its application in ester hydrolysis // Ind. J. Microbiol.- 2002.- Vol. 42.- P.49-54.

118. Sierra G.A Simple method for the detection of lipolytic activity of microorganisms and some observations on the influence of the contact between cells and fatty substrates // Antonie van Leeuwenhoek 1957. - Vol. 23.- P. 15-22.

119. Sugihara A., Tani Т., Tominaga Y. Purification and characterization of a novel thermostable lipase from Bacillus sp. // Journal of Biochemistry.- 1991,- Vol. 109.-P.211-216.

120. Vargos V.A., Delgado O.D., Hatti-Kaul R., Mattiason B. Lipase-producing microorganisms from a Kenyan alkaline soda lake // Biotechnology Letters.-2004.-Vol. 26.-P. 81-86.

121. Wang Y., Srivastava K.C., Shen G.J., Wang H.Y. Thermostable alkaline lipase from a newly isolated thermophilic Bacillus strain, A30-1 (ATCC 53841) // Journal of Ferment Bioengineering -1995. Vol. 79. - P. 433-438.

122. Wei D., Zhang L., Song Q. Studies on a novel carbon source and cosolvent for lipase production by Candida rugosa // Applied and Environment Microbiology. 2004. - Vol. 31. - P. 133-136.

123. Wei Y., Lai H., Chen S., Yeh M., Chang J. Biosurfactant production by Serratia marcescens SS-1 and its isogenic strain SMAR defective in SpnR, a quorum-sensing LuxR family protein // Biotechnology Letters.- 2004.- Vol 26.- № 10.- P. 799-802.

124. Wimmer Z.K., Skouridou V., Zarevuska M., Saman D., Kolisis F.N. Enzymic resolution of 2-substituted cyclohexanols through lipase-mediated esterification // Tetrahedron Asymmetry.- 2004.- Vol. 15.- № 24.- P. 3911-3917/

125. Wu H.-Y., Xu J.-H., Shen D., Xin Q. Improved production of (S)-ketoprofen ester hydrolase by a mutant of Trichosporon brassicae CGMCC 0574 // Journal Ind Microbiol. Biotechnol. 2003. - Vol. 30. - P. 357-361.

126. Yeoh H.H., Wong P.M., Lin G. Screening for fungal lipases using chromogenic lipid substrates // Mycologia. -1986. Vol. 78. - P. 298-300.

127. Zhang J., Hou Z., Yao C., Yu Y. Purification and properties of lipase from a Bacillus strain for catalytic resolution of (R)-naproxen // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic.- 2002.- Vol. 18 № 4-6.- P. 205-210.

Информация о работе

Поскрякова, Наталья Владимировна
кандидата биологических наук
Уфа, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка основы биопрепарата для деструкции жиров - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы