Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез 2-оксоглутаровой кислоты дрожжами при росте на этаноле

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чернявская, Ольга Геннадьевна, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ИМ. Г.К.Скрябина

ЧЕРНЯВСКАЯ ОЛЬГА ГЕННАДЬЕВНА

БИОСИНТЕЗ 2-ОКСОГЛУТАРОВОЙ КИСЛОТЫ ДРОЖЖАМИ ПРИ РОСТЕ НА ЭТАНОЛЕ

(специальность 03.00.07 - микробиология)

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н., проф. Т.В.Финогенова к.б.н. Н.В.Шишканова

Пущино - 1998

Список сокращений, использованных в тексте.

АМФ - аденозин-5-монофосфат

АТФ - аденозин-5-трифосфат

СоА - кофермент А

Ас-КоА - ацетил-кофермент А

НАД(Н) - никотинамидаденин-динуклеотид (восстановленный)

НАДФ(Н) - никотинамидаденин-динуклеотидфосфат (восстанов.)

АДГ - алкогольдегидрогеназа

АлДГ - альдегиддегидрогеназа

АО - алкогольоксидаза

ЦС - цитратсинтаза

АК - аконитат-гидратаза

ИДГ(НАД) - ■ изоцитратдегидрогеназа НАД-зависимая

ИДГ(НАДФ) - - изоцитратдегидрогеназа НАДФ-зависимая

ИЛ - изоцитрат-лиаза

мс - малат-синтаза

огдг ■ оксоглутаратдегидрогеназа

сдг - сукцинатдегидрогеназа

ФГ ■ фумарат-гидратаза

мдг ■ малатдегидрогеназа

2 -ОГК ■ 2-оксоглутаровая кислота

пвк ■ пировиноградная кислота

ЩУК • щавелевоуксусная кислота

ТПФ ■ тиаминпирофосфат

дтт ■ дитиотрейтол

ДТНБ ■ 5,5-дитиобис-(2-нитробензоат)

ДФИ • дихлорфенолиндофенол

Введение ........................... 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. БИОСИНТЕЗ 2-ОКСОГЛУТАРОВОЙ КИСЛОТЫ БАКТЕРИЯМИ .... 9

1.1. Характеристика 2-оксоглутаровой кислоты, ее использование и методы получения ............ 9

1.2. Продуценты 2-оксоглутаровой кислоты........11

1.3. Условия биосинтеза 2-оксоглутаровой кислоты . . . .14 1.2. Механизмы синтеза 2-оксоглутаровой кислоты бактериями .......................19

ГЛАВА 2. БИОСИНТЕЗ 2-ОКСОГЛУТАРОВОЙ И ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ

ДРОЖЖАМИ......................2 7

2.1. Продуценты 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислоты......................2 7

2.2. Характеристика дрожжей Candida (Yarrowia)lipolytica

и основные условия синтеза 2-ОГК и ПВК......30

2.3. Влияние условий культивирования на синтез 2-ОГК . .33

2.4. Механизмы синтеза 2-ОГК и ПВК дрожжами......37

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ЭТАНОЛА КАК СУБСТРАТА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

МИКРООРГАНИЗМОВ...................4 3

3.1. Повреждающее действие этанола и устойчивость к нему микроорганизмов..................43

3.2. Основные пути окисления этанола..........46

3.3. Особенности роста дрожжей на этаноле.......51

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 4. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............5 7

4.1. Объекты исследования...............57

4.2. Методика культивирования дрожжей.........57

4.3. Методы контроля роста, содержания органических

кислот, азота и этанола в среде..........61

4.4. Определение интенсивности дыхания.........62

4.5. Определение концентрации цитохромов в клетках . . .63

4.6. Определение активности ферментов.........6 3

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБНОСТИ ДРОЖЖЕЙ РАЗЛИЧНОГО ТАКСОНОМИЧЕСКОГО ПОЛОЖЕНИЯ ПРОДУЦИРОВАТЬ 2-ОКСОГЛУТАРОВУЮ КИСЛОТУ ПРИ РОСТЕ НА ЭТАНОЛЕ................7 0

5.1. Изучение кислотообразующей способности дрожжей при культивировании в среде с этанолом в колбах ... .70

5.2. Проверка кислотообразующей активности отобранных штаммов в условиях лабораторных ферментеров . . . .72

ГЛАВА б. ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ НАПРАВЛЕННЫЙ СИНТЕЗ 2 -ОКСОГЛУТАРОВОЙ КИСЛОТЫ ДРОЖЖАМИ УАШОЫ1А ЫРОЬУТЮА МУТАНТОМ N1....................75

6.1. Влияние концентрации тиамина на рост дрожжей и синтез 2-ОГК...................75

6.2. Влияние концентрации азота в среде на синтез 2-ОГК 76

6.3. Зависимость синтеза 2-ОГК от концентрации микроэлементов в среде (гп2+ , Ге2 + и Си2+).......81

6.4. Зависимость синтеза 2-ОГК от концентрации этанола

в среде......................85

6.5. Влияние рН среды на синтез 2-ОГК.........85

6.6. Влияние концентрации растворенного в среде кислорода (р02 ) на рост дрожжей и синтез 2-ОГК.....89

ГЛАВА 7. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БИОСИНТЕЗА 2-ОКСО-ГЛУТАРОВОЙ КИСЛОТЫ ДРОЖЖАМИ У. ЫРОЬУТЮА МУТАНТОМ N 1

ИЗ ЭТАНОЛА.....................9 6

7.1. Дыхательная активность и функционирование электрон-

но-транспортной цепи при различной концентрации кислорода в среде.................96

7.2. Активность ферментов начальных этапов окисления этанола и центральных путей метаболизма при различной концентрации кислорода в среде.....108

7.3. Представление о механизме биосинтеза 2-ОГК дрожжами Y.lipolytica мутантом N 1 из этанола.......119

ГЛАВА 8. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РОСТА ДРОЖЖЕЙ Y.LIPOLYTICA МУТАНТА N 1 НА ЭТАНОЛЕ И СИНТЕЗА КИСЛОТ В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА АЗОТА (ПРИ ПЕРИОДИЧЕСКОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ )......................122

8.1. Рост мутанта N 1 и биосинтез лимонной кислоты при различной концентрации кислорода в среде.....122

8.2. Дыхательная активность и функционирование электронно-транспортной цепи при различной концентрации кислорода в среде.................124

8.3. Активность ферментов начальных этапов окисления этанола и центральных путей метаболизма при различной концентрации кислорода в среде......130

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................133

ВЫВОДЫ............................140

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................142

ВВЕДЕНИЕ

2-оксоглутаровая кислота (2-ОГК) относится к дикарбоновым кислотам, является метаболитом цитратного цикла и предшественником синтеза целого ряда аминокислот (глутаминовой, глутамина и др.), и входит в состав практически любой живой клетки.

Актуальность работы. В последнее время интерес к получению с помощью микроорганизмов веществ, химический синтез которых невозможен или дорогостоящ, продолжает неуклонно расти. Исследования проводятся по нескольким направлениям. Это отбор штаммов -продуцентов, поиск доступных для промышленности источников углерода, а также исследование метаболических последовательностей конверсии субстрата в продукт. Известно, что при ассимиляции ряда углеродных субстратов дрожжи способны экскретировать в среду органические кислоты - лимонную, изолимонную, 2-оксоглутаровую, пировиноградную (Финогенова, 1991). Однако, наши знания о механизмах и физиолого-биохимических особенностях этих процессов ограничены .

Важное значение в медицинской практике и биохимических исследованиях имеет 2-оксоглутаровая кислота (2-ОГК), которая применяется при лечении нейрозаболеваний, а также для определения активности аспартат-аминотрансферазы и аланин-аминотрансферазы в сыворотке крови.

В литературе имеются сведения о принципиальной возможности синтеза 2-ОГК микроорганизмами из различных источников углерода: углеводов, органических кислот, спиртов, жирных кислот, углеводородов (КоервеИ et а1 . , 1952; Шапошников и др., 1964; Кошеле-ва, Байкова, 1966; Финогенова и др., 1968).

В последние годы большой интерес вызывает использование других перспективных источников углерода для микробиологического синтеза, в том числе этанола, который обладает рядом преимуществ перед другими субстратами. Использование этанола, являющегося водорастворимым индивидуальным соединением, обеспечивает образование чистого продукта, что облегчает процесс его выделения.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в подборе штамма дрожжей - продуцента 2-оксоглутаровой кислоты из этанола и в изучении физиолого-биохимических основ микробиологического синтеза 2-ОГК из этанола дрожжами.

В число основных задач входило:

- изучение способности дрожжей различного таксономического положения синтезировать 2-ОГК из этанола, отбор штамма-продуцента;

- определение условий культивирования дрожжей, обеспечивающих направленный синтез 2-ОГК;

- изучение физиолого-биохимических особенностей дрожжей при синтезе 2-ОГК из этанола;

- изучение механизма синтеза 2-ОГК из этанола.

Научная новизна работы. Исследована способность дрожжей различного таксономического положения синтезировать 2-ОГК при росте на этаноле. Показано, что синтез 2-ОГК из этанола осуществляется только тиаминауксоторфными дрожжами в условиях дефицита тиамина.

Показано, что условия культивирования дрожжей определяют качественный и количественный состав экскретируемых продуктов. Для направленного синтеза 2-ОГК необходимы: концентрация тиамина в среде - от 2 до 4 мкг/л (оптимальная концентрация тиамина в клетках - 0,17-0,28 мкг/г); концентрация (ЫН4)2304 - 10 г/л,

концентрация азота [Ы] в среде в период синтеза не менее 0,5 г/л; рН среды 4,5; концентрация кислорода в среде - от 5 до 5 5%.

Впервые показано, что синтез 2-ОГК дрожжами У.Иро1уЬ1са из этанола более активно осуществляется при низкой концентрации кислорода в среде (5-8% насыщения), в отличие от синтеза лимонной кислоты из этанола (оптимальная концентрация кислорода - от 20 до 55% насыщения), изолимонной кислоты из этанола (р02 от 30% и выше), а также синтеза 2-ОГК из парафинов (р02=60-70%).

При низкой концентрации кислорода в среде (5-8%), по сравнению с высокой концентрацией (50-55%), выше удельная скорость роста дрожжей, потребление азота, концентрация митохондриальных цитохромов, а также активность ряда ферментов, в том числе ферментов начальных этапов окисления этанола, центрального метаболизма, а также карбоксилирующих ферментов. В результате при низкой концентрации кислорода в среде (5-8%) накапливалась большая биомасса и большее количество 2-ОГК.

Выявлены физиолого-биохимические особенности процесса синтеза дрожжами из этанола 2-оксоглутаровой кислоты в условиях дефицита тиамина по сравнению с синтезом лимонной кислоты в условиях дефицита азота. В период синтеза 2-ОГК наблюдалось медленное потребление дрожжами источника азота. Интенсивность дыхания дрожжей была в 2-3 раза ниже, чем при синтезе лимонной кислоты и не зависела от концентрации кислорода в среде. Содержание митохондриальных цитохромов а+а3, Ь и с в клетках дрожжей при синтезе 2-ОГК существенно не изменялось, при синтезе лимонной кислоты резко снижалась концентрация цитохрома а+а3 .

Обсуждается механизм синтеза 2-ОГК из этанола дрожжами. В условиях дефицита тиамина в клетках сохраняется высокая актив-

ность ферментов метаболизма этанола, ферментов цитратного и гли-оксилатного циклов. Разрыв ЦТК на уровне оксоглутаратдегидроге-назы в результате лимитирования роста дрожжей тиамином,

приводящий к экскреции 2-оксоглутарата в среду, компенсируется функционированием анаплеротического глиоксилатного цикла и увеличением активности ферментов восстановительной ветви ЦТК.

Практическая ценность работы. Показана возможность получения 2-ОГК из этанола путем микробиологического синтеза. В качестве модели продуцента 2-ОГК отобран штамм дрожжей Уаггоы1а Иро1уЫса мутант N 1. Подобраны условия культивирования (концентрация тиамина, азота, микроэлементов, рН среды, концентрация растворенного кислорода), обеспечивающие накопление в культу-ральной жидкости практически одной 2-ОГК в концентрации до 50 г/ л. Изученные закономерности могут являться основой для микробиологического получения 2-ОГК из этанола.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на ежегодном конкурсе научных работ ИБФМ РАН в 1995 и 1997 году, на семинарах Лаборатории окислительного обмена веществ, совместном семинаре Лаборатории аэробного метаболизма микрооргназимов и Лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), экспериментальной части (5 глав), обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 166 страницах учетного машинописного текста, содержит 19 таблиц и 18 рисунков. Библиография включает 192 источников.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. БИОСИНТЕЗ 2-ОКСОГЛУТАРОВОЙ КИСЛОТЫ БАКТЕРИЯМИ.

1.1. Характеристика 2-оксоглутаровой кислоты, ее использование и методы получения.

2-0ксоглутаровая кислота (2-ОГК) имеет химическую формулу НООС-СН2-СН2-СО-СООН, синонимы - оС-кетоглутаровая или 2-оксопен-тандикислота. 2-ОГК занимает ключевое положение в обмене веществ каждой живой клетки. Она является метаболитом цикла Кребса, а также основным метаболитом аминокислотного и белкового обмена. В результате восстановительного аминирования, осуществляемого глу-таматдегидрогеназой, 2-ОГК превращается в глутаминовую кислоту. Последняя выполняет роль донора аминогруппы в реакциях трансами-нирования и, кроме того, глутаминовая кислота является непосредственным предшественником целого ряда аминокислот, в том числе пролина, оксипролина, орнитина, аргинина и других. В связи с такой ролью в клетке поддерживается низкая концентрация свободной 2-ОГК, что в свою очередь контролирует активность оксоглута-ратдегидрогеназы и всего цикла трикарбоновых кислот на этом участке.

2-ОГК является важным биохимическим реактивом, необходимым для измерения активности многих ферментов, в том числе оксоглу-таратдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, аспартатаминотрансфе-разы, аланинаминотрансферазы, цистеинаминотрансферазы, глицина-минотрансферазы, тирозинаминотрансферазы и др. Эти тесты широко используются в клинической практике за рубежом и в нашей стране для диагностики большого спектра заболеваний (например, гепатитов, инфекции миокарда, дистрофии мышц, дерматитов и др.). Кис-

лота используется в медицине при лечении шизофрении, алкоголизма и других заболеваний. За рубежом она используется как пищевая добавка, а вместе с солями щелочных металлов - в качестве консервирующего агента для мясных и рыбных продуктов, а также различных напитков. Кислота находит применение в химической промышленности в производстве полимеров. 2-ОГК энзиматическим или химическим путем может быть превращена в глутамат.

Во всем мире 2-ОГК производят путем химического синтеза, исходным сырьем являются диэтиловый эфир янтарной и эфир щавелевой кислот. Процесс производства многостадийный, связан с использованием токсичных и взрывоопасных веществ, таких как толуол, хлороформ, диэтиловый эфир, абсолютный этанол, металлический натрий. В бывшем СССР 2-ОГК производили в количестве около 100 кг в год на заводе"РИАП" (г.Киев), продажная цена колебалась от 530 до 1200 рублей за 1 кг. Фирма "Сигма" (США) продает свободную 2-ОГК по цене 176 $ за 1 кг, динатриевую соль - 452 $ и монокалиевую соль - 486 $ за 1 кг. Использование 2-ОГК в различных областях, в первую очередь, в химической промышленности, а также ферментативном синтезе глутамата, сдержиХвается высокой стоимостью и малыми масштабами ее производства.

В начале пятидесятых годов обнаружена способность ряда бактерий продуцировать 2-ОГК при использовании в качестве источника углерода углеводов и ряда органических кислот. Начались научные исследования данного вопроса и попытки разработать микробиологический метод производства 2-ОГК, однако, такого производства не было создано.

В шестидесятые годы в связи с интересом к использованию н-парафинов нефти для производства микробного белка вновь под-

нялся вопрос о возможности получения 2-ОГК с помощью дрожжей из н-алканов.

Последнее время привлечено внимание к этанолу, как возможному сырью для получения ряда органических кислот, в том числе лимонной, изолимонной и 2-ОГК.

1.2. Продуценты 2-оксоглутаровой кислоты.

Способностью продуцировать 2-ОГК обладают бактерии, относящиеся к различным видам и даже родам. В табл.1 приведен список этих бактерий, условия, при которых обнаружен синтез 2-ОГК, и выход кислоты от потребленного субстрата.

Наибольшее количество работ посвящено изучению синтеза 2-ОГК Pseudomonas fluoresceins, выращенными на глюкозе (Koepsell et al., 1952; Кошелева и др., 1964). Способностью накапливать в среде 2-ОГК с выходом 40-60% от использованной глюкозы обладают и другие виды псевдомонад: Ps.ovalis, Ps.aeruginosa (Kaneko et.al., 1968), Ps.reptilivora (Reekers et al., 1965). Многие из исследованных бактерий оказались способны превращать в 2-ОГК не только глюкозу, а также широкий спектр органических субстратов, например, лактозу, мальтозу, сахарозу, фруктозу, галактозу, ман-нозу, арабинозу, ксилозу, многоатомные спирты: сорбит, глицерин (Кошелева, Байкова, 1966), органические кислоты: молочную, лимонную, янтарную, фумаровую, яблочную (Шапошников и др., 1964). Выход 2-ОГК составлял 30-45% от использованного субстрата.

Способность многих микроорганизмов накапливать большие количества 2-ОГК при росте в среде с глюкозой и органическими кислотами послужило^ основой для разработки промышленных методов по-

Таблица 1.

Бактерии - продуценты 2-оксоглутаровой кислоты.

Источник Лимитир. Выход

Продуценты углерода фактор 2-ОГК* Литература

1 2 3 4 5 б

Pseudomonas fluorescens Ps.fluorescens

глюкоза 100:1

50:1

янтарная к-та 400:1 44 :1

1

Ps .fluoresceins орг. к-ты

Ps .fluoresceins moho- и ди-

сахариды2 , многоат.спирты3 Ps.reptil Ivorа глюкоза 300:1

75:1

глюкоза глюкоза

Ps.aeruginosa Ps.oualis

Escherichia coli глюкоза

Aerobacter

aerogenes

Serratia

marcescens

молочная к-та

глюкоза

moho- и ди-

сахариды2

маннит

глюкоза

азот 45 КоервеИ еЬ а1 . ,

1952

азот Коди^ et а1.,

1953

азот 30 Шапошников и

др., 1964 азот Кошелева и др.,

1966

азот 50 ИеекегБ et а1.,

10 1965 азот 40 Капеко еЬ а1., азот 64 1968 азот 40-45 Katagiri et а1.,

30 1957 а, 1957 В азот 40-45 Katagiri et а1., 1960

азот 33 Asai et al., 1952, 1955

Продолжение таблицы 1

1 2 3 4 5 б

Proteus vulgaris глюкоза

Bacillus глюкоза

megatherium

Micrococcus sp. орг. к-ты-1

азелаиновая к-та 60 5

д

Bacterium sp. Brevibacterium

flavum Acetobacter