Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дрожжи, продуцирующие этанол из D-ксилозы

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Дрожжи, продуцирующие этанол из D-ксилозы"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ

ИНСТИТУТ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

■На правах рукописи

РГ8 ОД

■2 5 ЦЩ

:БОРОХОВА Ольга Эдуардовна

ДРОЖЖИ, ПРОДУЦИРУЮЩИЕ ЭТАНОЛ ИЗ О-КСИЛОЗЫ специальность 03.00.23 - биотехнология

. АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени, .кандидата Сяолчл-ических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1994

Работа выполнена в лаборатории промышленной микробиологии ШИИгицгглиз.

Шаповалов Олег Иванович

Михайлова Наталья Павловна

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, Дмктренко

профессор Леонид Васильевич

Кандидат биологических ."околов

наук, доцент Виктор Николаевич

Ведущее предприятие: ВНИИ сельскохозяйственной

микробиологии /САНКТ^ПЕТЕРЕУР^/

Защита состоится " 2./ " Сгнтя^я 1994г. в

__ час ауд. № на заседании Специализированного

Совета Д 063.25.09 при Санкт-Петербургском Технологическом институте.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Замечания и отзывы по данной работе, заверенные гербовой печать», в одном экземпляре просим направить по адресу: 193013, Санкт-Петербург, Л-13, Загородный пр., дом 49, &16ТИ, Ученый соват.

Автореферат разослан 1994 г.

Учений секретарь

Специализированного Совета ^^

кандидат технических наук ^ Т.Б.Лисицкая

Научные руководители: Доктор технических наук, профессор

Кандидат биологических наук

- 3 -

ОБиДО ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тета. Этанол является важным сырьем для химической, фармацевтической и пищево"« промьшгснно-сти. В гтослвдпе время обсуждается значение этанола как экологически чистого топлива: в качестве добавки к бензину или его заменителя (Бо^лс.РЗО?). Широкое применение этанола обсуславливает постоянный рост его производства во всем мире. Этанол получают путем гидратации этилена или сбраживанием углеводсодеркащего сырья. Традиционно используемые дрожжевые культуры Ззссйароауоеа и

•зсЫгоЁессЬагслусез способна сбраживать только гзксозн и не могут ферментировать Ь-ксялоэу, согг&вляюцув основу гомицеллюлоэ растительных тканей. Вследств,.э этого огромные ресурсы возобновляемых видов растительного сырья и сельскохозяйственных отходов, характеризующиеся высоким содержанием гемицеллюлоз.не применяются для получения этанола. Поэтому исследования, посвященные изучению микроорганизмов, продуцирующих этанол из Б-ксилозы, являются актуальными, перспективными и имеют не только фундаментальное, но и большое практическое значение.

Микроорганизмы, спл^м^ осуществлять конверсии £>-ксилозы в этанол были открыты в 80-х годах (ЕеЬпе1сЗег 1981). Особый интерес представляют дрожжи, которые

традиционно участвуют в производстве этилового спирта,характеризуются устойчивостью к высоким концентрациям Сахаров и этанола, малоч чувствительностью к изменениям внешних условий и легкостью, с которой они отделяются от ку-льтурально?* жидкости (Квасников, 1991). Однако до сих пор дрожки, продуцирующие этанол из ю-ксилозы, мало изучены с точки зрения их биологии, физиологии и практически не разработаны принципы использования их в производстве этанола. То есть остается неясным как внесшие условия влияют на рост этих дрожжей, на процессы образования этанола из Р-ксилпы и к каким последствиям могут привести изменения этих условий. Поэтому изучение адаптивных реакций дрожже1»условия направленной конверсии £-ксилозы в этанол позволит не только оценить мэтаболическу»

активность дрстсезых культур, но и разработать пути управления биосинтезом этанола в производственных условиях.

ьвязь теуы с планом научшх работ. Диссертация является развитием работ в соответствии с Госзаказо:.! № 1891-5365-01 и № 0005365061БЭ.

Цели и задачи исследования. Исследование посвящено поиску дрожжей.ферментирующих й-ксилозу в этанол,изучению количественных показателей роста и условий,обеспечи-кащих направленную конверсию I)-ксилозы в этанол с целью оценки возможности использования этих культур для получения этилового спирта из ксилозосодержащего сырья.В соответствии с этим решены следующие задачи:

- разработаны приемы скрининга,с помощью которых в отечественных коллекциях микроорганизм в обнаружены дрожжи,образующие этанол из 1>-ксилозы;

- проведено сравнительное изучение физиологических особенностей дрожжей Сапб1аа

ферментирующих 1>-ксилозу в этанол;

- изучены условия, обеспечивающие избирательный синтез этанола из Т>-ксилозы дрожжами Pa.tannophil.ua}__

- проведена спиртовая ферментация дрожжами а.-ьаппорь.иив различных ксилоэосодержащих субстратов,в том числе произведет венных (гидролиэатов лиственной др-весины,сульфитных щелоков,предгидролизатов).

Научная новизна. Разработана схема скрининга дрожжей, продуцирующих этанол уз -ксилозы.Это позволило впервые обнаружить данную способность у дрожжей С.вНтаиогшз. Впервые проведено сравнение особенностей роста дрожжей Ва. taIшophllцsм С.вЬеЬагае при изменении факторов внешней среды (концентрации В-ксилоэы,этанола,ингибиторов,рН и температуры культивирования),что позволило оценить адаптивные возможности организмов.Составлено математическое описание влияния Ь—ксилозы и этанола на скорость роста г?ожжей Га^апворЬИиз и с«у позволяющее предсказать поведение культур при изменении концентраций этих веществ в куль;уралЫ!01 среде- Установлены количественные закономерности пшвращзния О-ксилозы в ксилит,этанол или био»'ассу. Определена концентрация кислорода,обеспечивающая

направленную конверсию D-ксилозы в этанол с помощью дрожжей Pa.tacnophilus. Впервые показана разная чувствительность дроетей C.shehatae и Pa.tamopbilus к продуктам деструкции разительной биомассы (фурфуролу,оксиметилфур-Фуролу,летучим органическим кислотам,веществам лигнофура-нового комплекса). Установлено, что эти токсичные продукты оказывают более сильное воздействие на рост культур, чем на образование этанола.

Впервые проведена спиртовая ферментация производственных ксилозосодержащих субстратов: гидролизатов лиственной древесины:сульфитных щелоков,предгидролизатов,с помощью дрожжей Pa.tannophilus.

Практическая значимость. Выявлены дрожжи,перспективные в качестве продуцентов для получения этенола из D-кси-лозы.Отобраны штаммы дрожже'» C.shehatae и Pa.tannopht-lus маловосприимчивые к токсичным продуктам деструкции древесины и показана возможность их использования при получении этанола из ксилозосодержацего сырья.включающего гидролизаты древесины (патентная заявка от 24.09.1991г.)i сульфитные щелока(патентная заявка от 24.09.1991).и другое сырье растительного грсисяолдения. Штаммы депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ВНШгенетика, Москва. . .

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международном симпозиуме "Строение,гидролиз и биотехнология растительной биомассы" (С.-Петербург, 1992г.).

Объем и построение рабо-ы. Диссертация состоит из введения, шеста глав, включающих,обзор литературы.материалы и методы,результата исследований,обсуждение и выводов общим объемом 155 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 13 рисунками, 22 таблицей™. Список цитируемой литературы содержит 145 наименований.

ОСНОВНОЕ ОиДЕМАНИЕ РАГОТЫ

Обзор литературы состоит из 3 разделов,в которых рассмотрены микроорганизмы,синтезирующие этанол из сахаросо-держаяртх материалов,совремегное состояние биохимических

_ б -

аспектов обраэозаиия этилового спирта и особенности ферментация D-ксилозя и 1>-глюкозы с помощью дрожжей.

материалн и изтоди. Штаммы дрожжей был:* получены из отечественных коллекци1 микроорганизмов: ВКПМ,ШИИгене-гика, Москва:

Candida tropicalis У-456, C.shehatae У-4В4, Kluyverornycea fragilifl У-i 65, у-487, К. irarxianus У-483, Pachysolen tannophilue У-476, У-475; BKM, ИФШ РАН, Пуп*с-:о-ка-Око: C.shehatae У-1483, K.marxianue var.inarxianus У-432, У-212, Pa.tanrkophilue У-274, Pichia stipitis У-2160; иуесй мккрооргакиаиюя БЙИИГюгролиз СПб: Ах1'гозicaizca jnonospora, С. didsnsiae 4>-3, C.intexmadiae Тавд-11 (35) , C.r.olibhiaitia, С. parapsiloeis, C.scottiL KC-2, С.tropicalis П-1, . C.oilvitnorum ВТИ-11, K.scarxianus Tab«-.3(82) ,Еобр. 6 (74) , p.alcohoiophila PID, P.epeciee P; ВНИИ цадз V 6иот<1хкологкк, Коскоа; Sacch.corevisiae ЛВ-7.

i> работе использовали стандартные лабораторные и производственные среда,гвдролизаты лиственной древесиш(опытные варки,стенд БНИЙгидролиз),сульфитные гцеиока(Светогор-ский ЦБК,Советский ЦБК),предгидролизатъг(Братский ЦБК). Действие ингибиторов оценивали на среда::,получепкых с использованием различных методов их извлечения из произгод- \ стзенньпс- гидролизатов лиственной древеслшСКожурова и др. 1989). Ассимиляцию и конвирс® моносахаридов смешанных субстратов та.тае изучали с использованием синтетической (модельной) среде с содержанием сахароз, еоответехауксцим усредненному составу гидролизатов гемицеллюлозы лиственной древесины, г/л: D-rvroK03a~d,6; 0-мапноза~6,4; D-ra-лактоза-2,1; 1>-ксклоза-18,б; Ь-арабиноза-1,6; L—рамно-за-0,5. Дрожжи инкубировали при 30°С, кроме случаев оговоренных особо. Ферментации в полуаэробных условиях осуществляли б колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 100 мл питательной среда при перемешивании со скоростьо 100 об/мин. Кинетику роста дрожней и образования этанола изучали на лабораторной ферментационной установке Biostat И. (Германия) ооьексм 1,8 л, снабженной устройством для поддержания pH, pQ, и температур*, с барботером и турбинной

мешалкой.

В качестве показателя физиологического состояния дрожжей рассматривали удельную скорость роста.Зависимость удельной скорости роста от температуры,рН,концентрации D -ксилозы и этанола определяли микрокинетическим методом,который позволяет оценить реакции клеток на один анализируемый фактор (К антерз, 1990).

Количественное определение редуцирующих веществ проводили ^булиостатическш методом (Емельянова и др.,1973). Анализ моносахаридов и ксилита в виде ацетатов альдонмтри-лов осуществляли методом газоясидкостной хроматографии. Содержание этилового спирта определяли методом газовой хроматографии после его предварительно*» отгонки из культура-льноч жидкости. Концентрацию фурфурола и оксиметилфурфуро-ла определял'.! методом жидкостной хроматографии (Немировс-кий и др.,1987), веществ лигнофуранового комплекса- спект-рофотометричеекк (-Л¿400, 1 =1 см). Содержание летучих органических кислот анализировали стандартными методами (Емельянова и др.,1973). Экспериментальные данные обрабатывали статистически (Глотов и др.,1982). Поиск коэффициентов математических вираигриич.сяксыБайщих рост дрожжей при различных условиях, осуществляли методом наименьших квадратов или симплекс-методом с использованием персонального компьютера^

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Скрининг дрожжеЬ.Ферментирующих D-ксилозу в этанол. Поиск дрожжей,образующие этанол из D-ксилозы}согласно литературных данным,целесообразна проводить среди видов .усваивающих этот'сахар и обладающих бродильным типом катаболизма углеводов. В соответствии с этим были выбраны 24 культуры дрожжей,образование этанола которыми ранее не изучалось. Круг культур составили 15 видов дрожжей,относящихся К родам Candida,Pichla,Pachj ">olen, Kluyreroinyceo« Была предложена cxe"a скриникга.позволяющая на начальных этапах исключить культуры с низкой скоростью сбраживания

D -глюкозы и утилизации D-ксилозы: сбраживание D-глюкозы—> усвоение D -ксилозы-»-ферментация D-ксилозы—>

отбор по признаку образования этанола-отбор по продуктивности. Специально подобранные условия ферментации р--ксилозы (ограниченное снабжение клеток кислородом) способствовали образования этанола 10-ю изучаемыми культурами. Сценка спиртообразующе^ способности показала,что выход этанола с единица субстрата для 8-ми штаммов превысил (рис.1).

20

10.

24

22

гп

30

Э1

21 Л

19

14

й

18 И

У-456

С.ггор1са11з

У-484 У-1433 С.5КеЬа1ае

ВГИ-11 С.еЦуапагит

У-475 У-476 У-274 Ра.1аппорЬ11иа

Рис Л. Спиртообразующая способность дрожжей, ферментирующих О-ксилозу в этанол.

Впервые способность продуцировать этанол из 1>-ксилозы показана для дрожжей вида с.еИтапогша. Два штамма С.еЬеЬа«ае у .484» Pa.tannophi.lus У-476, характеризующиеся самым высоки« коэффициентом образования этанола из Ь -ксилозы (0,30+0,01 г/г) и наибольшей продуктивнбстьта" 0,04 г/г.час были выбраны для дальнейшего изучения.

,2. Физиологические особенности .дрожжей п.вЬеЬа^ав и Та.-ьап^ргЬПчя Сценка физиологических особенностей культур, наряду с высокой продуктивностью,играет существ-

енную роль при обспадении перспектив их использования в биотехнологических процессах. Хорошая адаптивная способ- „ ность продуцента указывает на быструю регуляцию метаболических реакций и лучяую защищенность организма от знеяних воздействий. Иными словами^ биотехнологии

следует использовать культуры, более устойчивые к изменениям условий среды,т.к. это значительно облегчает оптимизацию процесса и управление биосинтезом.

2.1. Температура культивирования. Зависимость изменения скорости роста Га^ашорМ1ив И С.зЬеЬа^е от температуры представлена графически (рис.2.А). Максимальная скорость.роста дрожжей была зарегистрирована при температуре 30°С, В субоптимальком интервале температур от

24 до 30°С зависимость ¿корости роста от температуры подчиняется уравнению Аррениуса (I) (табл.1)(сплошная линия на графике!). При повышении температуры культивирования наблюдается ингибирование поста: дрожжей (экспериментальные точки соединены пунктиром). Дрожжи с.еЬе1^ае более чувствительны к изменение температуры (значение Е3^ для С«в11еЬаЪае в 2 раза выше, чем для ра*1;а1тоР1111иЧт&бл.1), что проявляется в резке.'? ::я:г.цнии скорости роста уже при температуре 34°С (рис.2А.),

2.2. Влияние рН. Зависимость скорости роста дрожжей от величины рН ферментационной среда представлена на рисунке 2Б. Оба штамма дрожжей малочувствительны к колебаниям рН в достаточно широком интервале. рН 4,0-5,5 способствует максимальной скоросг" роста дрожжей Fa.tannophi2.us Дрожжи С.бЬеЬйЪеен.ч'еют гранищ активного роста" при рН среды от 4,5 до 6,0. Таким образ ом, Дрожжи Pa.tarinoph3.lus обладают большей ацилофильностыо по сравнению сс.е)гс1^ае, оптимум роста которых сдвинут в нейтральную область.

2.3. Влияние концентрации . Ь-ксилозы. Зависимость удельной скорости роста дрожжей Ра.ъаплорЬПив и С.вЪеЬаЬае от концентрации I)-ксилозы представлена на рис.2В. Обнаружено, что оба штамма лучше всего развиваются при концентрациях субстрата от 20 до 60 г/л. Резуль-

таты показывают, что существуют такие концентрации 1>-кси-лозы в.среде,при которых рост дрожжей практически подавлен. Причем этот эффект наблюдается не только в случае максимальных концентраций О 100 г/л) ограничивающих рост, но и минимальных (<Ю г/л). Уравнение (2),учитывающее эти особенности роста дрожкеа на &-ксилозе, было предложено П. Слининжар (£Ип1аеег,199х) (табл.1). Коэффициента уравне-. ния наЧдены по экспериментальным данным.Используемое математическое выражение позволяет предсказать поведение культур при всех возможных концентрациях О-ксилозы. Отмирание культур СО скоростью 0,101 -Ч&Сдля'Ра.-ЬеппорЬИиа^О,550 час-* для С.ыЬеЬсйовпредлолагается ПРИ отсутствии О-ксилозы в среде. Прзкрацение роста онидается в двух точках: при Х»3,01 и Х=109,60 для Pa.tannopbi.Ue и при Х=0,15 и. Х*П0,20 для с.аЬе^8е.

Приведенные результаты показывают, что концентрация Б-ксилозы, ингибирущая рост этих штаммов, примерно одинакова. Однако,содержалие Р-ксилозы в среде, индуцирующее рост дрожжей 5а»^ашюрЬИие значительно превышает таковое для С.зЬаЬа^е. Эти различия могут быть обусловлены особенностями транспорта Б-ксилозы в клетку дрожжей у разных видов.

2.4. Влияние этанола. Было изучено влияние экзогенного этанола на рост дро.чиеЧ с.г;Ье1мгЬае и Ра»'ЬагшорЫ1цэ и составлено математическое выражение»адекватно описывающее экспериментальные данные (табл.1.,рис.2.Г). Сго' позволило установить зоьу нечувствительности рц^аппорЬИиа к атанолу до концентрации 20 г/л, сравнить характер воздействия этанола на рост обоих,видов и рассчитать критические концентрации атаиола, при которых еще наблюдается рост (табл.1). Эти концентрации оказались близки?« для обоих штаммов: Ра.ЪамюрЬИие45,51 г/л, с.ЕЬсЬагао 46,01 г/л (рис.3.Г). Характер кривых, описывающих рост дрожжей в присутствии этанола указывает на более высокую чувствительность дрожжеЧ с.вЬег^аз к этиловому спирту.

-II - ß

. B

I 1

\

t I

0 10 20 30 40 5Q Этанол,Г/л

i г « .

Рис.2. Влияние температуры (А), pH (Б)_Р-ксилозы(В) ____

—----и этанола (Г) на рост дрожж й. Pa,tann°Phi1"® с.

вЬеЬаъае(л],Максимальная ошибка в каждой экспериментальной '

точке менее: для температуры IC$, pH - 5^,этанола--5ксилозы - Ж.

- 12 -

2.5. Влияние ингибиторов. Влияние токсичных веществ, образующихся при деструкции растительной биомасса! - фурфурола, оксиметюфурфурола, летучих органических кислот,веществ лигнофураново: о комплекса на рост дрожжей изучали в условиях периодической культуры. Дрожжи с.еЬеЬпгаэ характеризуются бсльшей, чем ра^ашюрЬИие восприимчивостью к анализируемым ингибиторам. Основное негативное воздействие на обе культуры оказывает фурфурол. Для госта С.вЬеНа^е требуется практически полное удалении фурфурола,большая чем для Ра^апяорЬИиесгепень извле :еьия оксиметилфурфуро-ла, летучих органических кислот и веществ лигнофуранового комплекса, что было достигнуто только после применения ионообменных смол. Таким образом, дрожжи С.еЬеЬаЪае обладают высокой "увствителоностью к токсичным веществам - продуктам деструкции растительной биомассы. ____________Таблица I.

Математические уравнения, описыьающиа рост дрожжей Pa.tannophi.lus и С. вЬеИаНае»

Уравнения,расчетные константы Ра. " •ЬаппорЬИиз С.5ЬеЬа1ае

з-е-а/^т (I) 5»/&-константа. уравнения Арре-, ниуса Л -предзкспоненциальнь. А , . множитель. 6222®* -3,6*10®^ 12968** . 'з,8-ю10М*

-константа насыщения Моно,г/л Н1 -константа ингибирования,р/л 4,44* 7^,22*' и,27* 61,8х

^/уЧ = ' - Гр/рп)л сз) ^-максимальная концентрация этанола,допускающая рост,г/л <-константа,характеризующая зависимость скорости роста в присутствии этанола 45,51»« 3>0окй 46,00** 1,53«

Примечание: Еа энергия активации-, Дк-моль-*; -универсальная газовая постоянная, Дж'Моль; Т - абсолютная температура К; X -концентрация Р-ксилозы, г/л; Хщ-мак-

- 13 -

«шальная концентрация D-ксилозы, r/n; /^¡^максимальная удельная скорость роста в присутствии этанола, час" \/J0 -максимальная удельная скорость роста в отсутствии этанола,

коэффициент корре-

Таблица 2.

час"*^; Р -концентрация этанола,г/л

ЛЯЦ1

л-.* -0,95 **- 0,98

Чувствительность дрожжей c.shehatae tannophilus к ингибиторам .

Ра.

Продукта деструкции растительной биомассы Концентрации, г/л

Ра. ■tannophfilus C.shehatae

ФУРФУГ0Л Оксиметилфурфурол Летучие органические кислоты Вещества лигнофуранового комплекса 0,10+0,01 0,28+0,01 0,53+0,03 1,74+0,20 0,02+0,01 0,13+0,01 0,44+0,03 0,76+р,05

2.6. Сравнительны" анализ физиологи"! ростаС.зЬеЬ^ав Ра. ^пло1)Ы1ия . Изучение физиологии роста дрожже4, Ра.«апаорЫ1из и С.зЬе1^ае) обладающих равной.ферментативной активность» в отношении конверсии Р-ксилозы в этанол, позволило оценить их адаптивный возможности.Оказалось,что дрожжи Ра.гаппорЬИио обладают больней физиологической пластичность»,так как развиваются в пифоком интервале температур, рН, концентрации ксилозы, этанола и малочувствительны к токсичным продуктам деструкции растительной биомассы. Полученные результаты позволили найти оптимальные условия выращивания дрожжей С.вЬе1^ав и Ра^пппорЬПие на среде .с 0-ксилозой в условиях периодической культуры. Га.ЪашсфМЗхш характеризуются бо- . лее высокой по сравнению с C,sЬehatae скоростью роста,, меньшим временем генерации и более интенсивным протеканием метаболических процессов,о чем свидетельствует большее значение метаболического коэффициента (табл.3).Комплексная оценка адаптивных и технологических возможностей культур позволила выбрать дрожжи Рв^аппорйНив как наи-

более перспективные для разработки микробиологического способа получения этанола из Э-ксилозы.

Таблица 3.

Параметры роста С.вЬй^ае Ра^аппорЬ±1ив в условиях периодической культуры

Параметры роста С.8Ье1н^ае Ра.ЪагшорЬИи«

Время генерации, час Удельная скорость рос-г,час~^ Экономический коэффициент образования биомассы,г7г ксияозц , Метаболический крэффициент г а.с.биомря.сы/г ксилозы.час 3,07 0,2"5 0,52 0,43 2,79 0,248 0,41 0,61

3. Роль кислорода в образовании этанола из Р-ксилозы. У микрорганизмов Р-ксилоза вовлекается в катаболизм Сахаров в форме & -ксилулозо-5-фссфатаИзомеризация Р-ксилозн в Ь-ксилулозу у дрожжей может протекать согласно схеме:

Б-ксилоза —у . ксилит —* Б-ксилулоза^й-ксилулозо-б-фосфат. I?-К силулозо-5-фосфат при неполном окислении превращается в этанол, а при избытке кислорода пс -костью окисляется с образованием биомассы. Была проведена ферментация

; Т> -ксилозы Ра.^аппорЫ1ив ' . ■ ' при' различных уровнях аэрации. . Г-ксилоза потребляетсй дрожжами с образованием биомассы при концентрации растворенного кислорода не ниже 2,7 мг/л. Снижение концентрации растворенного кислорода приводит к замедлению роста и способствует превращению 1>-ксилозы в продукты неполного окисления(рис.3).

Направленный синтез этилового спирта наблюдается в строго заданных условиях аэрации,обеспечивающих концентрацию растворенного кислорода 0,07-0,10 мг/я. Пр:: меньшем содержангч растворенного кислорода в среде.дрожжи продуцируют ксилит (рис.3). Полученные данны указывают н'-. то,что образование проектов катаболизма ^-ксилозы определяв 'ся содеряанлем растворенного кислорода в ферментационной среде

3 о,г

I

ксилит

<35 0.1

о,ъ ч<*

0.1

0,0^ О,* о

ЗТАНОЛ

0,05' О. (О

0,1:> ' 2ёЧ 2 ?0

БИОЙАССА '

0,05

'0/5*

¿55

Концентрация Р створенного

кислорода, иг/л1

Рис.3. Вл1"гние аэрации на конверсию Ъ -ксилоек ;

Изучение динамики накопления ксилита и этанола з условиях,обеспечивающих направленный синтез этанола (рис.4) показало, что концентрация ксижта сначала возрастает,достигая максимума к 24 часам, а затем убывает вплоть до окончания процесса. В то же время концентрация этанола монотонно возрастает по ходу ферментации. Характер полученных закономерностей потребления I)-ксилозы, образования ксилита и этано.та соответствует кинетическим кривым последовательных реакций. То есть, 1>-ксилоза утилизируется дрожками Ра.^гшорЬИиз с образовав

нием ксилита, из которого затем синтезируется этанол. Это согласуется с предположением, ряда авторов,что именно окисление ксилита является узким местом,лимитирующим образование этанола. Регенерация коферментов,необходимых для дальнейшего превращения ксилита,происходит,вероятно, при участии кислорода. Наши данные подтверждай? ключевую роль кислорода в регуляции синтеза дрожжами этанола из Р-ксилозы.

4. Спиртовая ферментация ксилозосодержащих субстратов дрожжами Pa.tanno^hiiui,. Промышленным источником

Р-ксилозы служат гидролизаты растительной биомассы Шар-ков.Кучбина,1972). Сало показано, что токсичные продукта деструкции древесина оказывают меньшее влияние на биосинтез этанола, iew на рост дрожжей. И хотя летучие органические кислота и фурЛурол оказывают наиболее сильное угнетающее воздействие на образование этанола из Р-ксилосы, допустимые концентрации всех ингибиторов в 1,5-2 раза выше концентраций,критических для росja (табл.2).

Изучение ассимиляции и конверсии моносахаридов смешанных субстратов проводили на модельном субстрате,Гк,дро-лизатах листвеьной древесины,сульфитных щелоках и предги-дролизатах в условиях,обеспечивающих каправленный синтез этанола. Наряду с D-ксилозой, в таких средах присутствуют другие моносахариды: D-глгкоза, D-манноза, D-гала-ктоза, L-арабиноза, L-рамноза. Установлен ряд общих закономерностей при ферментации мультисубстратных сред, обогащенных D-ксилозой. Ь-глюкоза утилизируется первой из смеси Сахаров. Дли Р-маннозы, D-ксилозы и ^-галактз-зы наблюдали явление диауксии. Образование эгидовсо спирта также имеет двухфазный характер,что отражает сложную : картицу ферментации емсланног,о субстрата (рис.5.)'. Выявленные закономерности показывает целесообразность раздельной конверси f: пентоз дрожжами. . pa.tanno'philus : и гексоз дрожжами ; bacch.&ererlelae (табл.4).

Применение двух культур дрожжей поэчоляе* избежать дааук-сии в потреблении Сахаров, увеличить глубину утилизации

D-ксилозы,сократить продолжительность процесса и повысить экономический коэффициент образования этанола.

я р>

о ч э а

20,0

10,0

Я.О

.Л"

X

X

к4

X

\ ? V

-

Ж

К

—т-

12

Т"

'1,0

ър

1Р

1.0

Р.О

<

л

■6 н

Г)

Ч.о

ь,о Хр'

т..

18

24 30 36

| ' ВрвИЯ ; ,

______ ____________________________культивирования (Час. 2

Рис. 4*„'Рэ£ментвция Р-коилозы в этанол дрпжжами Pa.tannophiJ.ue. ..'__Е^Ч-дЦТ (*"1 ^ ксилоза1' ) , Этанол"

ч СК > 20,0

10,0

} Л

-к.

Ч-

V

3,0

1,0

12

16

24

30 3& Время культивирования,час. Рис.5 Ферментация модельной смеси Сахаров дрожжами Р^. 1аппарШ. ив. Концентрация! Сахаров СС) г/л, этанола«(В) г/л.

»- ксилоза. о - глюкоза. О- манноэа, »- . алчктсэа.

С.

ч

\

• Характеристика ферментации ксилозосодержащлх субстрат 1 д^ашоЬьниа; ■ •'

Таблица 4 ов в этанол дроалсами

Субстрат

Фе^^нтация Ра^ехшо

Синтетическая среда с Р-ксилозой

Модельная смесь Сахаров

Гидролизат древесины' Сульфитный щелон Ферментаци; Secch.eerevi6^,fee | Ра.ЪагторЬИие

Гидролизат(I) (2)

Предгидролизат(1) (2)

(1)

(2)

Концентрация сахароа, начальная/ко вечная,г/л -.

25,0/3,5-

35,5|б,7

36,3/11,7 22,7/3.,3.

78,4/32,6 32,6/9,0. 36,2/14,0 14,3/5,5

Степень ути-"чиации

о -ксилозы,/

86

81

52 76

Г")

. 65

Максимальная этанола,г/л

6,71+0,05

9,41+0,45

7,88+0,40 7,40+0,37

18,02+0,55 26,10+1,05 10,53+0,53 12,33+0,60

Объемная скорость образования этанола, г/л-час

0,19-0,05

0,27+0,01

0,24+0,37 0,31+0,01

0,95+0,03 0,34+0,02 0,88+0,02 0,20+0,01

Экономический коэффициент образования этанола.г/г

0,3^0,01

0,33+0,02

0,32-Ю, 01 0,38+0,01

0,41+0,01 0,38+0,01 О,48+0,Л 0,29+0,01

сю ■

1

» 1

к

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Теоретическая проработка проблемы и зт: -~:рименталь-ные исследования показали принципиальную возможность спиртовой ферментации мультисубстратных сложных сред,обогащенных Х>-ксилозой с помочь» дрожжей Ра^апасрЬИис■ Использование этих дрожжей позволяет увеличить выход этанола на 20% за счет утилизации пзнтоз геоцеллюлооы.Переработка Сахаров гемицеллэлозы в этиловый спирт по оценке зарубежных экспертов даст возможность снизить себестоьло-сть этанола из растительной биомассы на 0,40 $ за I дал. Наиболее существенное влияние на снижение себестоимости будет оказывать повышение селективности конверсии пектоз. Это означает, что основные усилия долины быть сконцентрированы на изучении факторов,способствующих узеличениэ выхода спирта из 0-ксилозы. Повышение продуктивности используемого штакма также скажется на экономике процесса.Та-ким образом, результаты данной работы не только доказали реальность получения этанола из Р-ксилог с помощью .дрожжей, но и определили направление дальнейших исследований '

вывода ■

1. Предложена схема скрининга дрожкей.продуцирующих

' этанол из Р-ксилозы.Выделено 8 культур/активно образующих этанол,в том числе С.зПтааогша для которой данное свойство обнаружено впервые. Установлено,что максимальной продуктивностью обладают дрожжи Га^ахшорЬИив.С.еЬоЬа^.е.

2. Показано,, что в условиях роста в периодической культуре дротике Ра.гаппо^МЗ-ив характеризуются меньшим, чем С.8Ье1кЛае временем.генерации,более высокой скоростью роста и потребления I)-ксилозы,т.е. обладают большей интенсивностью метаболических процессов.' :

3. Применение математических моделей позволило описать влияние I)-ксилозы и этанола на рост дрожжей С.вЬеЬагав

и Ра.ъаппорЬИив и установить количественные показатели роста, экспериментальный ангчиз которых затруднен.,_'

4. Сравнительный анализ роста показал^то Pa.tannophj.iuiT! обладает большей физиологической пластичность»: раз- " вивается в широком ^интервале температур, рН,концентраций

- £0 -

субстрата (t>-ксилозы), этанола у, токсичных продуктов де-'струкции д-евесины. .

5. Подтверждено, что 0-ксилоза превращаете* дрожжами Pa.tannophilus в кс. .лит,из'которого через ряд последова-

i тельных ферментативных реакций образуется этанол.

6. Еока1¿на ключевая роль кислорода для превращения "D-ксилозы в этиловы** спирт. Установлена концентрация растворенного кислорода,способствующая направленной конверсии ф-ксилозы в этанол.

7. Изучено взаимное влияние мслосахаридов сложного субстрата на процесс их ассимиляции и конверсии в этанол. Установлено,что потребление субстрата и образование этанола носит двухфазный характер. D-глзкоза и D-маннозя. способствуют утилизации D-..силозы в смешанном субстрате.

8. Показала принципиальная возможность получения этанола из ксилозо содержащих субстратов с помощью дрожжей Pa.tannophdlus. При использовании этих дрожжей за счет конверсии D-ксилозы выход этанола из биомассы древесины может быть увеличен на 20%.

По материалам диссёртации опубликованы следящие работы:

1. Борохова 0 Э., Огородникова Т.Е.,Миха"юва НЛ.и др. Микробиологическая г.ереработй" гемицеллюлозы в этанол. Сообщение I. Сравнительная бродильная активность некоторых штаммов дрожжей", усзаи^ащих ксилозу./Гидролизная и лесо- • химическая промышленность.-I99I.-I31.7,с. 1-4. •

2. ^ropi ;никова Т.Е., Кожу^ова Ы.В., Борохова О.Э. и др. Микрооиологичь^кая переработка гемицеллюлозы в этанол. Сообщение II. Сбраживание :змицеллюлозных,фракций растительных гидролизатов в Э1 ..но л дрожжами bachysolen tai£.;ophilue. /Гидролизная и лесохимическая.промышленность.-1992.-ДО 4

3. Борохова О.Э..Огородникова T.F. Штаммы дрожжей, ферментирующие D-ксилозу в этанол./Тезисы международного симпозиума "Строение, гидролиз и биотехнология растительной биомассы" /СПб, mzy-c-10-H

4. Борохова О.Э., Огородникова Т.Е., Михайлова Н.П. и др. Микробиологическая-переработка гемицеллюлозы в этанол. Сообщение III. • Изучение процесса сбраживания Сахаров гемицеллюлозы древесины в этанол дрожжами Facbysolen tarmophilus /Ги^рол..аная н лесохимическая промышленность,- 1993.- № 3.

14.^6.94, 'Зах 425 - j РТП Ш ¿:.'.Т2а, :.:оскэв„-ка*- nr., 26