Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез ксилита и этанола мутантами ксилозоассимилирующих дрожжей pachysolen tannophilus

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Болотникова, Ольга Ивановна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. КОНВЕРСИЯ Б-КСИЛОЗЫ В КСИЛИТ И ЭТАНОЛ

С ПОМОЩЬЮ ДРОЖЖЕЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Дрожжи, ассимилирующие Б-ксилозу.

1.2. Метаболизм Б-ксилозы в дрожжевой клетке.

1.3. Условия, влияющие на ферментацию Б-ксилозы в ксилит и этиловый спирт.

1.4. Ферментация многокомпонентных субстратов дрожжами, метаболизирующими Б-ксилозу.

1.5. Генетический контроль катаболизма Б-ксилозы.

1.6. Способы улучшения биотехнологических характеристик продуцентов ксилита и этанола.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтез ксилита и этанола мутантами ксилозоассимилирующих дрожжей pachysolen tannophilus"

В конце XX века особенно актуальны проблемы безопасности жизнедеятельности человека. Решение их связано с разработкой новых технологий, направленных на сохранение экологического равновесия природы и, в т.ч., утилизацию отходов, сопряженных с получением ценных для человека продуктов. Ежегодно остаются невостребованными огромные ресурсы растительных материалов (отходов сельского и лесного хозяйств, лесоперерабатывающей промышленности) - потенциально-пригодное сырье для производства энергии, а также веществ химического и микробиологического синтеза. При гидролизе этих материалов образуется смесь пентозных и гексозных Сахаров.

По существующей в настоящее время технологии гексозы перерабатываются в этиловый спирт [1,2]. Из пентоз, до недавнего времени, получали кормовые дрожжи, производство которых, в настоящий момент, признано нерентабельным [3]. В мире активно ведутся поиски новых способов биотрансформации пентоз растительных гидролизатов, сопряженных с синтезом ценных для человека продуктов, например, этанола и ксилита. Современные методы гидролиза делают возможным получение для ферментации субстратов, обогащенных Б-ксилозой. В силу указанных причин, большой интерес приобретают исследования, направленные на выявление ксилозоассимилирующих видов микроорганизмов. Рассматривается возможность использования для этой цели бактерий, мицелиальных грибов, но особое внимание уделяется дрожжевым культурам.

Дрожжи обладают уникальной лабильностью метаболизма и традиционно применяются человеком в биотехнологических производствах [4]. Они устойчивы к высоким концентрациям Сахаров в ферментируемых субстратах, легко отделимы от культуральной жидкости, относительно мало чувствительны к воздействию факторов внешней среды. По оценкам американских исследователей, именно с помощью дрожжей можно ожидать наибольший экономический эффект в случае конверсии отходов растительного происхождения в этиловый спирт [5].

Этанол находит широкое применение в различных отраслях народного хозяйства: является важным сырьем для химической, фармацевтической и пищевой промышленности, служит субстратом для синтеза различных препаратов, смазочных материалов, клеев, моющих средств, пластификаторов, взрывчатых веществ, смол. Этиловый спирт выступает как растворитель, экстрагант и антифриз [1,2,6]. В условиях истощения запасов нефти и природного газа рассматриваются возможности использования этанола как бойлерного и моторного топлива [7]. Промышленные способы получения спирта заключаются в ферментации смесей Сахаров, полученных после предварительного гидролиза, штаммами Saccharomyces cerevisiae. Однако, дрожжевые клетки этого вида, из-за отсутствия ферментов, осуществляющих трансформацию D-ксилозы в D-ксилулозу, метаболизируют лишь гексозные компоненты таких субстратов (D-глюкозу, D -галактозу, D -маннозу, D-фруктозу) [810].

Сейчас известно более 25 видов дрожжей, способных с разной степенью эффективности конвертировать D-ксилозу в этиловый спирт. В качестве наиболее перспективных для синтеза этанола признаны Candida shehatae, Pichia stipitis и Pachysolen tannophilus [11,12]. Причем, в ходе ферментации растительных пентозанов этими культурами образуется не только этанол, но и ксилит.

Традиционный способ синтеза ксилита - химическая гидротация D-ксилозы - достаточно трудоемок и дорогостоящ. В то же время, ксилит широко используют в производстве кефалевых олиф, поверхностно-активных веществ, неионогенных детергентов, лаков, клеев, в качестве стабилизатора влажности и пластификатора для целлюлозной промышленности, а также заменителя сахарозы в пищевой индустрии [13Д4].

К сожалению, дикие штаммы ксилозоассимилирующих дрожжей отличает низкая продуктивность и объемная скорость синтеза указанных продуктов. Многочисленные публикации [15-18] констатируют тесную связь биохимических путей катаболизма Б-ксилозы с другими метаболическими процессами клетки, такими, как дыхание, пентозофосфатный цикл, цикл трикарбоновых кислот, анаэробный гликолиз. Тем не менее, генетическая регуляция катаболизма О-ксилозы остается практически не исследованной. В связи с чем, эффективность стандартных методов для повышения продуктивности дрожжевых штаммов по ксилиту и этанолу мала. Так, несмотря на выделение мутантных линий Ра. 1аппорЫ1и8 и Р. эйрШБ, характеризующихся улучшенной способностью к образованию этих спиртов [11,15], до сих пор не предложено ни одного штамма для коммерческого использования.

Практически полное отсутствие сведений, касающихся генетики ксилозоассимилирующих культур, значительно усложняет работу по созданию новых продуцентов. С другой стороны, малая изученность биологических особенностей С. зЬе11а1ае, Р. БЙрШБ и Ра. 1аппорЫ1ш, которые относительно недавно, по сравнению с 8ассЬ. сегеу1з1ае, стали предметом активных научных исследований, обуславливает сложность проведения генетических экспериментов. Поэтому, особую актуальность приобретает вопрос определения наиболее перспективного, с точки зрения биологии и генетики, объекта для анализа особенностей катаболизма Б-ксилозы в дрожжевой клетке и селекции промышленных продуцентов этилового спирта и ксилита. Так, штаммы С. БИеЬ^ае и Р. БЙрШз выгодно отличают большая продуктивность и скорость образования этилового спирта [17].

Немаловажным аргументом при оптимизации микробиологического синтеза целевых продуктов является устойчивость продуцента к токсическим компонентам растительных гидролизатов. Установлено, что культуры Ра. 1аппорЫ1из характеризуются толерантностью к присутствию в сбраживаемых субстратах уксусной кислоты, фурфурола и его производных, веществ лигнофуранового комплекса [19]. Большая лабильность метаболических процессов, свойственная клеткам этих дрожжей [20], может свидетельствовать о лучшей адаптивной приспособленности вида к изменяющимся условиям внешней среды. В отличие от С. 8ЬеЬа1ае и Р. БЙрШв, биохимические особенности катаболизма Б-ксилозы у Ра. 1аппорЫ1ш благоприятствуют накоплению сопоставимых количеств ксилита и этанола [16,18]. Соотношение целевых продуктов конверсии, в большей мере, определяется степенью аэрации ферментационной среды, что создает возможность для моделирования селективных условий, способствующих образованию либо ксилита, либо этилового спирта в качестве основного продукта биотрансформации растительных материалов. Таким образом, исследование биологии и генетики Ра. 1аппорЫ1ш актуально, поскольку открывает перспективы как для анализа регуляторных механизмов конверсии Б-ксилозы у дрожжей, так и для скрининга новых продуцентов ксилита и этилового спирта.

Настоящая работа посвящена изучению ксилозоассимилирующих дрожжей Ра.1аппорЫ1ш с целью получения мутантов с измененным катаболизмом Б-ксилозы, представляющих интерес в качестве потенциальных продуцентов этилового спирта и ксилита. Для осуществления поставленной цели в работе необходимо было решить следующие задачи:

- установить жизненный цикл Ра. 1аппорЫ1ш и определить условия стабилизации дрожжевой культуры в той или иной фазе жизненного цикла;

- разработать методическую базу для проведения генетических исследований у Ра. 1аппорЫ1из;

- разработать приемы выделения мутантов по различным этапам распада Б-ксилозы в дрожжевой клетке;

- провести оценку мутантов по катаболизму Б-ксилозы в качестве потенциальных продуцентов ксилита и этанола.

Практическая значимость работы. Разработана методическая база для лабораторного исследования ксилозоассимилирующих дрожжей Ра. 1аппорЫ1ш, а также специальные приемы для изучения генетической системы вида, которые применяются в лабораториях ВНИИГидролиз (г. Санкт-Петербург), а также на кафедре биохимии, органической химии и биотехнологии ПетрГУ (г.Петрозаводск) при проведении работ по созданию технологии утилизации отходов растительного происхождения с помощью дрожжей. Предложена оригинальная методика скрининга продуцентов ксилита. Даны рекомендации об использовании конкретных штаммов-продуцентов для отработки промышленных параметров синтеза ксилита микробиологическим способом.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 7-ой и 8-ой Межгосударственных межвузовских научно-практических конференциях "Новые фармакологические средства в ветеринарии" (С-Петербург, 1995, 1996); 1-ой Международной конференции "Биоиндикация и оценка повреждения организмов и экосистем" (Петрозаводск, 1997); Международной молодежной научной школе "Биоиндикация-98" (Петрозаводск, 1998); 4-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности" (С-Петербург, 1999). По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Болотникова, Ольга Ивановна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что жизненный цикл Ра. 1аппорЫ1из относится к дипло-гаплонтному типу с преобладанием гаплоидной фазы; диплоидная стадия кратковременна и неустойчива; спорулирующая культура отличается необычной морфологией: вегетативная клетка выбрасывает трубку (аскофор), на конце которого формируется аск с четырьмя аскоспорами. Предложенная схема адекватно объясняет природу гетерогенности популяций дрожжей.

2. Подобраны условия для разделения вегетативной и генеративной фаз жизненного цикла Ра. 1аппорЫ1ш. Вегетативный рост наблюдается на средах, сбалансированных по источникам углерода и азота, а индукция полового процесса осуществляется при избытке азота.

3. Разработана методическая основа для генетического исследования Ра. 1аппорЫ1ш: впервые проведена стабилизация диплоидной и гаплоидной культур, определены условия мутагенеза, гибридизации и анализа спорового потомства. Под действием 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидина получен целый спектр мутантов - 49 ауксотрофных, 1 морфологический и 42 мутанта с нарушениями различных этапов катаболизма Б-ксилозы. Генетическим анализом установлена аллельность мутаций, получены гибридные культуры и выделены множественно-маркированные штаммы.

4. Показано, что при ферментации жидких ксилозосодержащих сред в микроаэробных условиях гаплоидная культура не диссоциирует, а для популяции клеток диплоида необходим подбор дополнительных условий стабилизации.

5. Впервые разработана методика скрининга мутантов с нарушениями различных этапов катаболизма Б-ксилозы на средах с ксилитом, этиловым спиртом и Б-ксилозой. Показано, что мутации подобного рода напрямую связаны с изменением продуктивностей этанола и ксилита.

6. Впервые выделены мутанты РаДаппорЬПш с нарушениями ключевых

125 этапов распада Б-ксилозы, приводящими к избирательному накоплению ксилита. Отобраны штаммы с продуктивностью этого спирта, превышающей показатель исходного гаплоида в 2 - 2,5 раза. Разработан подход к селекции промышленных продуцентов ксилита.

6.4. Заключение

Несмотря на биологические особенности, именно Ра. 1аппорЫ1и8 наиболее перспективны для селекции промышленных штаммов с улучшен

123 ной продуктивностью и скоростью образования этилового спирта и ксилита, поскольку биохимические и биотехнологические особенности этого вида делают возможным исследование регуляторных механизмов конверсии Б-ксилозы в дрожжевой клетке. Однако успех экспериментальных исследований, в значительной мере, и определяется полнотой биологической, а также генетической характеристик дрожжей. Вследствие чего, дальнейшее исследование этого объекта должно быть направлено, с одной стороны, на повышение фертильности и жизнеспособности гибридных культур, а с другой - на скрининг различных групп мутантов по катаболизму Б-ксилозы и анализ активности ферментов, оказывающих наибольшее влияние на процесс конверсии ксилозосодержащих субстратов дрожжевыми клетками. Проведение этих мероприятий создаст условия для генетического конструирования промышленных штаммов - продуцентов, будет способствовать разработке экологически -чистой технологии биотрансформации отходов растительного происхождения с помощью дрожжей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Болотникова, Ольга Ивановна, Петрозаводск

1. Промышленная микробиология. / Под ред. Н.С.Егорова. М.: Высшая школа, 1989.-414 с.

2. Воробьева Л.И. Промышленная микробиология. М.: Изд. МГУ, 1989. -135 с.

3. Dart R.K., Bets W.F. Uses and potential of lignocellulose. London: London Limited, 1991.-201 p.

4. Квасников Е.И., Щелокова И.Ф. Дрожжи: биология, пути использования. Киев: Наукова думка, 1991. - 326 с.

5. Xylose fermentation : an economic analysis / N.D. Hinman, J. Wright, W. Hoagland, C.E. Wayman // Appl. Biochem. Biotechnol. 1989. - V. 20-21. -P. 391-401.

6. Кузнецов B.M., Голубков И.М., Островская Ю.В. Направления утилизации лигноцеллюлозного сырья в гидролизной промышленности. // Гидролизная и лесохимическая пром-сть. 1992. - N1. - С. 1-2.

7. Биотехнология: принципы и применение / Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса . М.: Мир, 1988 . - 480 с.

8. Mishra P., Singh A. Microbiol pentose utilization. // Adv. Appl. Microbiol. -1993.-V.39.-P. 91-152.

9. Шарков В.И., Куйбина Н.И. Химия гемицеллюлоз. М.: Лесная пром-сть, 1972.-440 с.

10. Ю.Холькин Ю.И. Технология гидролизных производств. М.: Лесная пром-сть, 1989. - 496 с.

11. Schneider Н. Conversion of pentoses to ethanol by yeast and fungi. // Crit. Rev. Biotech. 1989. -N 9. - P. 1-40.

12. Перспективы получения этанола из гемицеллюлозы растительной биомассы. Обзор. / О.И. Шаповалов, Е.Н. Яблочкова, Н.П. Михайлова, Т.Е. Огородникова. // Химия древесины. 1995. - N 3. - С. 15-19.

13. Pepper Т., dingers P.M. Xylitol applications. // Food technol. 1988. - N 10.-P. 98-106.

14. Conversion of D-xylose into ethanol by yeast Pachysolen tannophilus. / H. Schneider, P.Y. Wang, Y.K. Chan, R. Maleszka // Biotechnol. Lett. 1981. -V.3,N2.-P. 89-92.

15. Prior B.A., Kilian S.G., du Preez J. C. Fermentation of D-xylose by the yeast Candida shehatae and Pichia stipitis. // Process Biochem. 1989. - V.24, N1.-P. 21-32.

16. Slininger P.J., Bolen P.L., Kurtzman C.P. Pachysolen tannophilus: properties and process considerations for ethanol production from D-xylose. // Enzyme Microbiol. Technol. 1987. - V.9, N 1. - P. 5-10.

17. Микробиологическая переработка гемицеллюлозы в этанол. Сообщение

18. Сбраживание гемицеллюлозных фракций растительных гидролизатов в этанол дрожжами Pachysolen tannophilus / Т.Е. Огородникова, М.В. Кожурова, О.Э. Борохова и др. // Гидролизная и лесохимическая пром-сть.-1992.-N 4.-С. 3-5.

19. Микробиологическая переработка гемицеллюлозы в этанол. Сообщение

20. Изучение процесса сбраживания Сахаров гемицеллюлозы древесины в этанол дрожжами Pachysolen tannophilus / О.Э. Борохова, Т.Е. Огородникова, Н.П. Михайлова, О.И. Шаповалов // Гидролизная и лесохимическая пром-сть. 1993. -N 3. - С. 3-5.

21. Barnett J.A. The utilization of sugars by the yeast // Adv. Carbohyd. Biochem. 1976. -N321. - P. 126-234.

22. Hoelle H.W. Bacterial metabolism. New York, London: Academ. Press, 1969.-469 p.

23. Стейнер Р., Эдельберг Э., Ингрем Дж. Мир микробов: В 3 т. / Пер. с англ. М.: Мир, 1979. - 485 с.

24. Беккер 3. Э. Физиология и биохимия грибов. М.: Изд-во МГУ, 1988. -227 с.25,Onishi Н., Suzuki Т. The production of xylitol, arabitol and ribitol by yeasts. // Agr. Biol. Chem. 1966. - V.30. - P. 1139-1144.

25. Pat. Appl. PCT /FI92/ 00203. Novel yeast strains for the production of xylitol, Xyrofin Oy. (Apajalahti J., Viljava Т.). Appl. 10.1.1991. - Publ. 25.7.1991.-P.21.

26. Effect of oxygen transfer rate on levels of key enzymes of xylose metabolism in Devaromyces hansenii. / F.M. Girio, J.C. Roseiro, P. Sae-Machado et al. // Enzyme Microb. Technol.- 1994.-V.16,N.12.-P. 1074-1080.

27. Fermentation of D-xylose to ethanol by Pichia stipitis NRRL Y-7124 // D. Guebel, A. Cordeions, C. Nudel, A.M. Guilietti // Yeast. 1989. - V.5. - P. 73-74.

28. Skoog K., Hahn-Hagerland B. Xylose fermentation with Pichia stipitis. // Yeast. 1989. - V.5. - P. 79-83.

29. Fermentation of hardwood hemicellulose hydrolisate by Pachysolen tannophilus, Candida shehatae and Pichia stipitis. / P. Predo, A. Converti, E. Palazzi et al. // J.Ind. Microbiol. 1990. - V.6, N 3. - P. 157-164.

30. Du Preez J.C., wan der Walt J.P. Fermentation of D-xylose to ethanol by strain of Candida shehatae. // Biotechnol. Lett. 1983. - N 5. - P.357-362.

31. Sreenath H.K., Chapman T.W., Jeffries T.W. Ethanol production from D-xylose in batch fermentation with Candida shehatae: process variables. // Appl. Microb. Biotechnol. 1986. - N.24. - P. 294-299.

32. Wayman M., Tsuyuki S.T. Fermentation of D-xylose to ethanol by Candida shehatae. // Biotechn. Bioeng. Symp. 1986. - V.15. - P. 167-177.

33. Alexander M.A., Chapman T.W., Jeffries T.W. Continuous ethanol production from D-xylose by Candida shehatae. // Biotechn. Bioeng. 1987. -V.29.- P. 685-691.

34. Direct evidence for a xylose metabolic pathway in Saccharomyces cerevisiae. / C.A. Batt, S. Carvallo, D.P. Easson et. al. // Biotechnol. Bioeng. 1986. - N 28.-P. 549-553.

35. Kotyk A. Sugar transport in yeast. // Membranes and transport. 1982. - V.2. -355 p.

36. Alcorn M.E., Griffin C.C. A kinetic analysis of D-xylose transport in Rodotorula glutinis. // Biochim. Biophys. Acta 1978. - V.510. - P. 361371.

37. Kilian S.G., van Uden N. Transport of xylose and glucose in the xyloso-fermenting yeast Pichia stipitis. // Appl. Microb. Biotech. 1988. - Y.27. - P. 545-548.

38. Does A.L., Bisson L.F. Characterization of xylose uptake in the yeast Pichia heedii and Pichia stipitis. // Appl. Environ. Microb. 1989. - V.55. - P. 159164.

39. Lucas C., Uden N. Transport of hemicellulose monomers in the xylose fermenting yeast Candida shehatae. // Appl. Microb. Biotech. 1986. - V.23. -P. 491-495.

40. Barnett J.A., Sims A.P. The requirement of oxygen for the active transport sugars into yeasts. // J. Gen. Microbiol. 1982. - V.128. - P. 2303-2312.

41. Готшалк Г. Метаболизм бактерий. М.: Мир, 1982. - 310 с.

42. Aldose reductase from Rhodotula. 1. Purification and properties. / G.N. Sheys, W.I. Arnold, J.A. Watson et.al. // J. Biol. Chem. 1971. - N 246. - P. 3824-3827.

43. Bruinenberg P.M., van Dijken J.P., Scheffers W.A. An enzymatic analysis of NADPH production and consumption in Candida utilis. // J. Gen. Microbiol. -1983.-V.129.-P. 965-971.

44. Lachke A.H., Jeffries T.W. Levels of enzymes of pentose phosphate pathway in Pachysolen tannophilus Y-2460 and selected mutants. // Enzyme Microb. Technol. 1986. V.8. - P. 353-360.

45. Alexander M.A., Yang V.W., Jeffries T.W. Levels of pentose phosphate pathway enzymes from Candida shehatae grown in continuous culture. // Appl. Microb. Biotech. 1988. - V.29. - P. 182-288.

46. Шлегель Г. Общая микробиология. M.: Мир, 1987. - 566 с.

47. Берри Д. Биология дрожжей. М.:Мир, 1985. - 96 с.

48. An investigation of D-l-C13. xylose metabolism in Pichia stipitis under aerobic and anaerobic conditions. / M.E. Ligthelm, B.A. Prior, J.C. du Preez, V. Brandt // Appl. Microb. Biotech. 1988. - V.28. - P. 293-296.

49. The role of ADH in the fermentation of D-xylose by Candida shehatae ATCC 22984. / B.A. Prior, M.A. Alexander, V. Yang, T.W. Jeffries // Biotechnol. Lett. 1988. -N 10. - P. 37-43.

50. Du Preez L.C., Prior B.A., Monteiro M.T. The effect of aeration on xylose fermentation by Candida shehatae and Pachysolen tannophilus. // Appl. Microb. Biotech. 1984. -V. 19. -P. 261-265.

51. Neirinck L.G., Maleszka R., Shneider H. The requirement of oxygen for incorporation of carbon of D-xylose and D-glucose by Pachysolen tannophilus // Arch. Biochem. Biophys. 1984. - V.228. - P. 13-18.

52. Evans C.T., Ratledge C. Induction of xylose-5-phosphoketolase in a variety of yeasts grown on D-xylose: the key to efficient xylose metabolism. // Arch. Microbiol. 1984. - V.139. - P.48-56.

53. Ratledge C., Holdsworth J.E. Properties of a pentulose-5-phosphoketolase from yeasts. // Eur. J. Appl. Microb. Biotech. —1985. V.22. - P. 217-225.

54. Xylose fermentation by yeast. 4. Purification and kinetic studies of xylose reductase from Pichia stipitis. / M. Riizi, P. Erlemann, P. Bui-Thanh, H. Dellweg // Appl. Microb. Biotech. 1988. - V.29. - P. 148-154.

55. Xylose metabolism in Pachysolen tannophilus: purification and properties of aldose reductase. / G. Ditzelmuller, C. P. Kubicek, W. Wohrer, M. Rohr // Can. J. Microbiol. 1984. - V.30. - P. 1330-1336.

56. Bolen P.L. Detroy R.W. Induction of NADPH-linked D-xylose reductase and NAD+-linked xylitol dehydrogenase in Pachysolen tannophilus by D-xylose, L-arabinose or D-galactose. // Biotechnol. Bioeng. 1985. - V.27. - P. 302306.

57. The induction of D-xylose catabolizing enzymes in Pachysolen tannophilus and the relationship to anaerobic fermentation. / M.E. Lighthelm, A.P. Bernard, James C. du Preez // Biotechnol. Lett. 1988. - V. 10, N 3. - P. 207212.

58. Induction of xylose reductase and xylitol dexydrogenase activities in Pachysolen tannophilus and Pichia stipitis on mixed sugars. / P.A. Bicho, P.L. Runnals, J.D. Cunningham, H. Lee // Appl. Environ. Microb. 1986. - V.54. -P.50-57.

59. Properties of the NAD(P)H-dependent xylose reductase from the xylose fermenting yeast Pichia stipitis. / C. Verdyn, R. Van Kleef, J J. Frank et. al. // Biochem. J. 1985. - V.226. - P. 669-674.

60. Girio F.M., Peito M.A., Amaral-Collaco M.T. Enzymatic and physiological study of D-xylose methabolism by Candida shehatae. // Appl. Microb. Biotech. 1989. - V.32. - P. 199-204.

61. Purification, characterization and amino acid terminal sequence of xylose reductase from Candida shehatae. / N.W.Y. Ho, F.P. Lin, S. Huang et. al. // Enzyme Microb. Technol. 1990. - V. 12. - P. 38-39.

62. NADPH-specific and NADH-specific xylose reduction is catalyzed by two separate enzymes in Pachysolen tannophilus. / G. Ditzelmuller, C.P. Kubicek, M. Rohr, E.M. Kubicek-Pranz // Appl. Microb. Biotech. 1985. - V.22. - P. 297-307.

63. Bolen P.L., Bietz J.A., Detroy R.W. Aldose reductase in the yeast Pachysolen tannophilus: purification, characterization and terminal sequence. // Biotechn. Bioeng. Symp. 1985. - V.15. - P. 129-137.

64. Bolen P.L., Roth K.A., Freer S.N. Affinity purification of aldose reductase and xylitol dehydrogenase from the xylose fermenting yeast Pachysolen tannophilus. // Appl. Environ. Microb. 1986. - V.52. - P. 660-665.

65. Multiple forms of xylose reductase in Pachysolen tannophilus. / C. Verdyn, J.J.F. Frank, J.P. van Dijken, W.A. Scheffers // FEMS Microbiol. Lett. -1985.-V.30.-P. 313-317.

66. Effect of growth conditions on cofacor-linked xylose reductase activity in Pachysolen tannophilus. / J.E. van Cauwenberge, P.L. Bolen, D.A. McCracken, RJ. Bothast // Enzyme Microb. Technol. 1989. - V. 11. - P. 662-667.

67. Purification and properties of aldose reductase from Pachysolen tannophilus. / S. Morimoto, T. Tawaratami, K. Azuma et. al. // J. Ferm. Technol. 1987. -V.65.-P. 17-21.

68. Xylose fermenting by yeast. 7. A kinetic study of NAD-xylitol dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis. / M. Rizzi, K. Harwart, P. Bui-Thanh, H. Dellweg // J. Ferment. Bioeng. 1989. - V.67. - P. 25-30.

69. Pentose metabolism in Candida. II. The diphosphoridine nycleotide specific poliol dehydrogenase of Candida utilis. / M. Chakravorty, L.A. Veiga, M. Bacila, B.L. Horesker // J. Biol. Chem. 1962. - N 237. - P. 1014-1020.

70. Yang V.W., Jeffries T.W. Purification and properties of xylitol dehydrogenase from the xylose fermenting yeast Candida shehatae. // Appl. Biochem. Biotechn. 1990. - V.26, N 2. - P. 197-206.

71. Xylitol dehydrogenase from Pachysolen tannophilus. / G. Ditzelmuller, C.P. Kubicek, W. Wohrer, M. Rohr // FEMS Microbiol. Lett. 1984. - V.25. - P. 195-203.

72. Lucas C., Uden N. Transport of hemicellulose monomers in the xylose-fermenting yeast Candida shehatae. // Appl. Microb. Biotech. 1986. - V.23. -P. 491-495.

73. Mutze В., Wandrey C. Continuous fermentation of xylose with yeast Pachysolen tannophilus. // Biotechnol. Lett. 1983. - N 5. - P. 633-638.

74. Jeffries T.W. Conversion of xylose to ethanol under aerobic conditions by

75. Maleszka R., Schneider H. Conçurent production and consumption of ethanol by cultures of Pachysolen tannophilus growing on D-xylose. // Appl. Environ. Microb. 1982. - V.44. - P. 909-915.

76. Kreger-van Rij N.J.W. The yeast: a taxonomic study. Amsterdam: Elsevier Science Publishers B.V., 1984. 1082 p.

77. The effect of pH on kinetic and yield of parameters during the ethanolic fermentation of D-xylose with Pachysolen tannophilus / V. Bruvo, F. Camacho, S. Sanhez, E. Castro // Bioprocess Eng. 1993. - V.9, N 4. -P.159-165.

78. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / Пер. с англ. М.: Мир, 1978. - 131 с.

79. Работнова Л.И., Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов. М.: Наука, 1979. - 207 с.

80. Growth, death, and oxygen uptake kinetic of Pichia stipitis on xylose. / P.J. Slininger, L.E. Branstrator, R.J. Bothast et.al. // Biotechnol. Bioeng. 1985. - V.27, N 3. - P.280-285.

81. Luong J.H.T. Kinetics of ethanol inhibition in alcohol fermentation. // Biotechnol. Bioeng. 1985. - V.27, N 3. - P.280-285.

82. Dekker R.F.H. Lipid-enhanced ethanol production from xylose by Pachysolen tannophilus // Biotechnol. Bioeng. 1986. - V.28, N 3-4. -P.605-608.

83. Menderson G.J., Newland M. Sodium azide enhancement and inhibition of ethanol production from D-xylose Pachysolen tannophilus. // J. Biotech. -1987. -V.6,N 1-4. -P.167-171.

84. Screening of yeasts for production of xylitol from D-xylose and some factors which affect yield in Candida guilliermondii. / M.F.S. Barbosa, M. De Maderious , I.M. de Manchilota et.al. // J. Ind. Microbiol. 1988. - V.3. - P. 150-241.

85. Production of xylitol from D-xylose by Candida tropicalis: Optimization of production rate. / H. Horitsu, Y. Yahashi, K. Takamizawa et.al. // Biotechn. Bioeng. 1992. - V.40. -P. 1085-1091.

86. Xylitol production from D-xylose by Candida guilliermondii: fermentation behavior / V. Meyrial, J.P. Delgenes, R. Moletta, J.M. Navarro // Biotechnol. Lett. 1991. - V.13.-P. 281-286.

87. The effects of the oxygen transfer coefficient and substrate consentration on the xylose fermentation by Debaromyces hansenii. / J.C. Roseiro, Peito M.A., F. Girio, M.T. Amaral-Collaco // Arch. Microbiol. 1991. - V.156, N 6. - P. 484-490.

88. Utilization of xylan by yeast and its conversion to ethanol by Pichia stipitis strains. / H. Lee, R.K. Latta, P. Biely et.al. // Appl. Environ. Microbiol. -1986. V.52, N 2. - P. 320-324.

89. Fein J.E., Tallim S.R., Lawford G.R. Evaluation of D-xylose fermenting yeast for utilization of a wood-derived hemicellulose hydrolysate. // Can. J. Microbiol. 1984. - V.30, N 5. - P. 682-690.

90. Neirick L., Maleszka R., Schneider H. Alcohol production from sugar mixtures by Pachysolen tannophilus. // Biotechnol. Bioeng. Symp. 1982. -V.12.-P. 161-169.

91. Magree R.J., Kosaric N. Bioconversion of hemicelluloses. // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1985. - V.32. - P. 61-63.

92. Watson N.E., Prior B.A., Lategan P.M. Factors in acid treated begasse inhibiting ethanol production from D-xylose by Pachysolen tannophilus. // Biotechnol. Bioeng. Symp. 1984. - V.6. - P. 451-454.

93. Микробиология и биохимия разложения растительных материалов / Под. ред. Г.К. Скрябина. М.: Наука, 1988. - 120 с.

94. Борохова О.Э. Дрожжи, продуцирующие этанол из D-ксилозы.: Дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук: 03.00.23. Л., 1994. - 156 с. -Библиография: С. 139-156.

95. Alexander N.J. Characterization of respiratory deficient mutant of Pachysolen tannophilus. // Curr. Gen. 1990. - V.17, N 6. - P. 493-498.

96. Lee H., James A.P., Zahab D.M. Mutants of Pachysolen tannophilus with improved production of ethanol from D-xylose. // Appl. Environ. Microb. -1986.-V.51,N6.-P. 1252-1258.

97. Physiological properties of a mutant of Pachysolen tannophilus deficient in NADPH-dependent D-xylose reductase. / H. Schneider, H. Lee, M.D.F.S. Barbosa, A.P. James // Appl. Environ. Microb. 1989. - V.55, N 11. - P. 2877-2881.

98. Xylitol dehydrogenase mutants of Pachysolen tannophilus and the role of xylitol in D-xylose catabolism. / R., Maleszka, L.G. Neirinch, A.P. James et.al. // FEMS Microbiol. Lett. 1983. - V.l7, N 1. - P. 227-229.

99. Genetic and biochemical characterization of mutations affecting the ability of the yeast Pachysolen tannophilus to metabolize D-xylose. / A.P. James, D.M. Zahab, G. Mahmourides et.al. // Appl. Environ. Microb. 1989. -V.ll. -P. 2871-2876.

100. Jeffries T.W. Mutants of Pachysolen tannophilus showing enhanced rates of growth and ethanol production from D-xylose. // Enzyme Microb. Technol. 1984. - V.6. - P. 254-258.

101. Hagedorn J., Ciriacy M. Isolation and characterization of xyl mutants in a xylose-utilizing yeast Pichia stipitis. // Curr. Genet. 1989. - V. 16. - P. 2733.

102. McCracken L.D., Gong C. D-xylose metabolism by mutant'strains of Candida shehatae. // Adv. Biochem. Eng. Biotech. 1983. -V.27, N 33. - P. 316-319.

103. Does A.L., Bisson L.F. Isolation and characterization of Pichia hedii mutants defective in xylose uptake. // Appl. Environ. Microbiol. 1990. -V.ll.-P. 3321-3328.

104. Bolen P.L., Slininger PJ. Continuous culture selection of mutants strains of Pachysolen tannophilus capable of rapid aerobic growth on D-xylose. // Enzyme Microb. Technol. 1986. - V.7. - P. 315-321.

105. Gong C.S., McCracken L.D., Tsao G.T. Direct fermentation of D-xylose to ethanol by a xylose-fermenting yeast mutant Candida sp. XF 217. // Biotechnol. Lett. 1981. - N 3. - P. 245-248.

106. Di Lorio A.A., Weathers P.J., Campbell D.A. Comperative enzyme and ethanol production in an isogenic yeast ploidy series. // Curr. Genet. 1987. -V.12, N 9. - P. 9-14.

107. James A.P., Zahab D.M. The construction and genetic analysis of polyploids and aneuploids of the pentose-fermenting yeast Pachysolen tannophilus. // J. Gen. Microb. 1983. - V.129. - P. 2489-2494.

108. Strain improvement of the xylose-fermenting yeast Pachysolen tannophilus by hybridization of two mutant strains. / T. Clark, N. Wedlock, A.P. James etal. // Biotechnol. Lett. 1986. - V.8. - P. 801-805.

109. Maleszka R., James A.P., Schneider H. Ethanol production from various sugars by strains of Pachysolen tannophilus bearing different numbers of chromosomes. // J. Gen. Microbiol. 1983. - V.129. - P. 2495-2499.

110. Johansen E., Eagle L., Berdenhanm G. Protoplast fusion used for the construction polyploids of the xylose fermenting yeast Candida shehatae. // Curr. Genet. 1985. - V.9, N4. - P. 313-319.

111. Ho N.W., Chen Z., Brainard A.P. Genetically engineered Saccharomyces yeast capable to effective cofermentation of glucose and xylose. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V.64, N 4. - P. 1350-1358.

112. Molecular cloning of the Escherichia coli gene encoding xylose isomerase. / P.P. Ueng, K.J. Volpp, J.V. Tucker et.al. // Biotechnol. Lett. -1985. -V.7- P. 73-83.

113. Sarthy A.V. Expression of the Escherichia coli xylose isomerase gene in Saccharomyces cerevisiae. // Appl. Environ. Microbiol. 1987. - V.53, N 9. -P. 1996-2000.

114. The influence of cosubstrate and aeration on xylitol formation by recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing the XYL1 gene. / J. Hallbon, M.F. Gorwa, N. Meinander et.al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1994. V.24, N 2-3. - P. 326-333.

115. Effect on product formation in recombinant Saccharomyces cerevisiae strains expressing different levels of xylose metabolic genes. / X. Bao, D. Gao, Y. Qu et. al.//Chin. J. Biotechnol. 1997. - V.13, N 4. - P. 225-231.

116. Meinander N., Zacchi G., Hahn-Hagerdal B. A heterologous reductase affects the redox balance of recombinant Saccharomyces cerevisiae. // Microbiol. 1996. - V.142. - P. 165-172.

117. Guphar A.S. Segregation of altered parental properties in fusion between Saccharomyces cerevisiae and the D-xylose fermenting yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. // Can. J. Microbiol. —1992. V.38, N 12. - P. 1233-1237.

118. Isolation of xylose reductase gene of Pichia stipitis and its expression in Saccharomyces cerevisiae. / S. Takuma, N. Nakashima, M. Tantirungkji et.al. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1991. - V.28-29. - P. 327-340.

119. Mopsoli R., Zalce E., Durand S. Secretion of a Cryptococcus albidus in Pichia stipitis resulting in a xylan fermenting transformant. // Carr. Genet. -1993.-V.24, N 1-2.-P. 94-99.

120. Hybrid process for ethanol production from rise straw. / B.S. Chadha, S.S. Kanwar, H.S. Saini, H.S. Garcha. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1991. -V.28-29.-P. 131-144.

121. Chadha B.S., Kanwar S.S., Garcha H.S. Simultaneous saccharification and fermentation of rise straw into ethanol. // Acta Microbiol. Immunol. Hung. -1995.-V.42,N1.-P. 71-75.

122. Yeast adaptation on softwood perhydrolyzate. / F.A. Keller, D. Bates, R. Ruiz, Q. Nguyen. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. - V.70-72. - P. 137148.

123. Alcoholic glucose and xylose fermentations by the coculture process: compability and typing of associated strains. / J.M. Laplace, J.P. Delgenes, R. Moletta, J.M. Navarro. // Can. J. Microbiol. 1992. - V.38, N 7. - P. 654658.

124. Continuous conversion of D-xylose to ethanol by immobilized Pachysolen tannophilus. / P.J. Slininger, R.J. Bothast, I.T. Black, J.F. Meghee. // Biotechnol. Bioeng. 1982. - V.24, N 10. - P. 2241-2251.

125. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. / И.А. Захаров, С.А. Кожин, Е.И. Кожина, И.В. Федорова. Л.: Наука, 1984. -144 с.

126. Инге-Вечтомов С.Г. Новые генетические линии дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Вест. ЛГУ, серия биологическая. 1963. -T.21,N 4.-С.117-129.

127. Практикум по биохимии. / Под ред. С.Е. Северина. М.: Из-во МГУ, 1989.-510 с.

128. Емельянова Е.И. Химико-технологический контроль гидролизных производств. М.: Лесная пром-сть, 1976. - 328 с.

129. Газохроматографический анализ сред гидролизного производства на содержание индивидуальных моносахаридов / В.Г. Костенко, Л.П. Выродова, Г.Г. Сенченко, И.Н. Гранд-Скубик // Гидролизная и лесохимическая пром-сть. 1977. - N5.-C. 11-13.

130. Биометрия / Н.В. Глотов, Н.В. Животворский, В.Г. Хованов, Н.Н. Хромов-Борисов. Л.: Изд. ЛГУ, 1982. - 244 с.

131. Spenser J.F.T., Spenser D.M., Reynolds N. Protoplast fusion for the improvement of industrial yeasts. // The Alko symp. on industrial yeast genetics: Book of abstr. Helsinki, 1987. - P. 114-117.

132. Виестур У.Э., Шмите И.А., Жилевич A.B. Биотехнология: биологические агенты, технология, аппаратура. Рига: Зинатне, 1987. -263 с.

133. Lodder J. The yeasts. A taxonomic study. Amsterdam, London: NAdland Pub. Com., 1970. - 454 p.

134. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. И.О. Биргера. М.: Медицина, 1987. - 464 с.

135. James А.Р., Zahab D.M. A genetic system for Pachysolen tannophilus, a pentose-fermenting yeast. // J. Gen. Microb. 1982. - V.128. - P. 2297-2301.

136. Crandall M., Lawrence L.J. Sporulation in Hansenula wingei is induced by nitrogen starvation in maltose-containing media. // J. Bact. 1980. -V.142, N 1. -P. 276-284.

137. Crandall M., Egel R., Mackay V.L. Physiology of mating in three yeasts. // Advances in microbial pfysiology. London: Academ. Press., 1977. - P. 307-392.

138. А. Сассон. Биотехнология: свершения и надежды. / Пер. с англ. М.: Мир, 1987.-410 с.

139. Инге-Вечтомов С.Г. "Незаконная" копуляция и полиплоидия у дрожжей. // Генетика. 1967. - N 11. - С. 100-105.

140. Сох B.S., Bevan Е.А. Aneuploidy in yeast. // New Phytol. 1962. - V.61, N3.-P. 342-355.

141. Захаров И.А., Квитко В.К. Генетика микроорганизмов. JL: Изд. ЛГУ, 1967.-243 с.

142. Инге-Вечтомов С.Г., Карпова Т.С. Частная генетика дрожжей сахаромицетов. С-Пб.: Изд. С-Пб. ун-та, 1993. - 249 с.

143. Толсторуков И.И. Генетика метилотрофных дрожжей Pichia pinus: Афтореф. дис. на соиск. учен. степ. док. биол. наук / ВНИИ Генетики и Селекции Промышленных Микроорганизмов. М., 1988. - 40 с.

144. Гибридизация аспорогенных штаммов дрожжей Hansenula polymorpha путем слияния протопластов. / В.Г. Савченко, Ю.Г. Капульцевич, A.B. Темина, И.А.Никитина. // Микробиология. 1983. -Т.52,Вып.З.-С. 449-453.

145. Ohara Y., Nonomura H., Yamazavi T. Studies of the single-spore cultures of Saccharomycodes ludwigii Hansen. 1: The homozygous sporulation and the heterotallic agglutination. // J. Ferment. Tachnol. 1968. - V.46. - P. 347-355.

146. Гибридизация и митотическое расщепление у парафинусваивающих дрожжей Pichia guillermondii. / A.A. Сибирный, Г.М. Шавловский, Б.В. Кшановская, Г.И. Наумов. // Генетика. 1977. - Т. 13, N 2. - С. 314-321.

147. Наумов Г.И., Кондратьева В.И., Наумова Е.С. Методы гибридизации гомоталличных дрожжей диплонтов и гаплонтов. // Биотехнология. -1986.-N 6.-С. 33-36.

148. Селекция генетической линии дрожжей Pichia guillermondii, способной к образованию значительного количества спор. / A.A. Сибирный, В.П. Жарова, Б.В. Кшановская, Г.М. Шавловский. // Цитология и генетика. 1977. - Т. 11, N 4. - С. 330-334.

149. Margaritis A., Bajpai P. Direct fermentation of D-xylose to ethanol by Kluyveromyces marxianus strains. // Appl. Environ. Microbiol. 1982. -V.44,N 5.-P. 1039-1041.

150. Alcoholic fermentation of D-xylose by yeast. / A. Toivola, D. Yarrow, E. van der Bosch et.al. // Appl. Environ. Microb. 1984. - N 47. - P. 12211225.

151. Baranian A. Fermentation of D-xylose into ethanol by yeast strains. // Acta Microbiol. Pol. 1988. - N 2. - P. 227-230.

152. Pat. Appl. F1 92/00203. // 1992. Kluyveromyces marxianus produced xylitol. — Publ. 21.9.1990. -P. 35.

153. Коновалов С.А. Биохимия дрожжей. M: Пищевая пром-сть., 1980. -271 с.

154. Lighthelm М.Е., Prior В.А., du Preez J.C. The oxygen requirements of yeasts for the fermentation of D-xylose and D-glucose to ethanol. // Appl. Microb. Biotech. 1988. - V.3. - P. 241-250.

155. Delgenes I.P., Moletta R., Navarro I.M. The effect of aeration on D-xylose fermentation by Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis, Kluyveromyces marxianus and Candida chehatae. // Biotechnol. Lett. 1987. - V.8, N 12. -P. 897-900.

156. Furlan S.A., Bouilloud P., de Castro H.F. Influence of oxygen on ethanol and xylitol production by xylose fermenting yeasts. // Process Biochem. -1994. V.29, N 8. - P. 657-662.

157. Борохова О.Э., Огородникова Т.Е. Штаммы дрожжей, ферментирующие ксилозу в этанол. / Тезисы междунар. симпоз. Строение, гидролиз и биотехнология растительной биомассы. // СПб. -1992. С. 32.

158. Количественные показатели роста ксилозоусваивающих дрожжей Pachysolen tannophilus и Candida chehatae / Т.Е. Огородникова, Н.П. Михайлова, Е.Н. Яблочкова и др. // Микробиология. 1995. - Т.64, N 1. -С. 13-17.

159. Ogorodnikova Т.Е., Yablochkova E.N., Borokhova O.E., Mikhailova N.P., Shapovalov O.I. Microbiological conversion of D-xylose to ethanol. // Abstr. Int. conf. "Biotechnology St.- Peterburg", 21 sept. 1994-St.-Petersburg, Russia, 1994. P. 154-155.

160. Морфологическая гетерогенность и особенности жизненного цикла дрожжей Pachysolen tannophilus. / Е.Н. Яблочкова, М.В. Шабалина, Т.Е. Огородникова и др. // Микробиология. 1994. - Т.63, вып. 6. - С. 10581063.

161. Яблочкова Е.Н., Огородникова Т.Е., Бодунова Е.Н. Разработка генетической системы дрожжей Pachysolen tannophilus, ферментирующих D-ксилозу. // Тез. докл. I съезда ВОГиС, 20 дек. 1994. -Саратов, 1994.-С. 36.

162. Яблочкова Е.Н. Образование ксилита и этанола ксилозоассимилирующими дрожжами.: Дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук: 03.00.23. С.- Петербург, 1996. - 146 с. - Библиография: С. 123-142.

163. Михайлова Н.П., Болотникова О.И. Исследование дрожжей Pachysolen tannophilus, конвертирующих D-ксилозу в этанол. / Тезисы докл. 8-ой Межгосуд. межвуз. научно практической конфер. Новые фармакологические средства в ветеринарии. // СПб. - 1996. - С. 51.

164. Болотникова О.И., Яблочкова E.H., Михайлова Н.П. Получение ксилита путем биотрансформации растительного сырья. // В. сб. матер, междунар. молодежи, науч. школы "Биоиндикация 98", 21-28 сент. 1998. - Петрозаводск, 1998. - Т.1. - С. 37-43.