Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование ксилита и этанола ксилозоассимилирующими дрожжами

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Образование ксилита и этанола ксилозоассимилирующими дрожжами"

од

ДЕН

На правах рукописи

ЯБЛОЧКОВА Елена Николаевна

ОБРАЗОВАНИЕ КСИЛИТА И ЭТАНОЛА КСИЛ030АССИМИЛИРУЮПЩШ ДРОЖЖАМИ

специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (техническом университете).

Научные руководители: Доктор химических наук, профессор

ГШАК

Анатолий Иосифович

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник

МИХАЙЛОВА Наталья Павловна

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

ЯКОВЛЕВА Елена Павловна

Кандидат биологических наук

СОРОКОЛЕТОЕА : Елена Федоровна

Ведущая организация:

ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, С-Петербург

Защита состоится " 27 " декабря 1996 г. в 10 часов в

аудитории_на заседании Диссертационного Совета Д 063.25.09

при Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (техническом университете).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Замечания и отзывы по данной работе, заверенные гер-' бовой печатью, в одном экземпляре просим направлять по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Московский пр., д. 26, СПбТИ(ТУ), Ученый Совет.

Автореферат разослан

Ученый секретарь 4

Диссертационного Совета Д 063.25.09, кандидат технических наук

Лисицкая Т.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Разработка ноеых способов утилизации органического комплекса возобновляемого растительного сырья в целях получения продуктов микробиологического синтеза является одной из наиболее важных задач биотехнологии (Dekker et.al., 1979; Кузнецов и др., 1992). В этом отношении несомненный интерес представляет биоконверсия .богатой D-ксилозой гемицеллюлоэы в этиловый спирт и ксилит. В настоящее время микробиологическим способом производят только этанол путем сбраживания гексоз. По оценкам зарубежных экспертов уже в ближайшем будущем микробиологический способ получения ксилита и этанола из Сахаров лигноцеллюлозы будет конкурентоспособен альтернативным химическим методам производства этих продуктов (Бойлс,'1987).

Среди микроорганизмов, ферментирующих D-ксилозу, приоритет как продуцентам ксилита и этанола принадлежит дрожжам (Квасников, 1992; Ojamo, 1994). Однако, промышленные технологии получения данных продуктов с помощью дрожжей пока не созданы. Это обусловлено, прежде всего, недостаточной изученностью ферментных систем, участвующих в образовании этанола и ксилита, и чувствительностью биоконверсии D-ксилозы к многочисленным факторам, среди которых наиболее ощутимое влияние оказывает аэрация (Schneider, 1989). Поэтому исследование этапов катаболизма D-ксилозы, отвечающих за образование ксилита и этанола у дрожжей, и условий, способствующих их продукции, является актуальным, так как позволяет определить пути управления и оптимизации биоконверсии кси-лозосодержащих субстратов растительного происхождения.

Цели и задачи исследования. Исследование посЕящено выявлению причин образования дрожжами ксилита и этанола из D-ксилозы и поиску условий их продукции. В соответствии с этим необходимо было решить следукшше задачи:

- провести сравнительное изучение способности ксилозо-ассимшшрующих дрожжей ферментировать D-ксилозу и D-глюкозу при ограниченной аэрации среды;

- определить активность, коферментную специфичность и чувствительность к условиям аэрации ферментов ксиловоредук-тазн и ксшштдегидрогенавы, контролирующих начгльные этапы превращения О-ксилозы;

- установить зависимость ферментации В-кснлоиы в ксилит и этанол от условий аэрации;

- показать возможность повышения эффективности спиртовой ферментации ксилозосодержащих субстратов ( растительных гидролизатов и сульфитных щелоков).

Научная новизна. Среди ксилозоассимилирующих дрожжей выявлено три группы, а именно: накапливающие в условиях ограниченной аэрации ксилит, этанол или одновременно ксилит и этанол. Впервые способность к продукции ксилита из 0-ксилозы показана для дрожжей С.сИ<Зепз1ае, С.зйуапогигп, Т.гпоПз-Ыапа и КЬГгаеШз.

Впервые показано, что наиболее высокой активностью ксилозоредуктазы и ксшштдегидрогеназы,. контролирующих начальные эталы превращения 0-ксилозы, отличаются дрожжи, продуцирующие этанол. Выявлено, что ксилитдегидрогеназа у всех изученных нами ксилозоассимшшрующих дрожжей строго специфична к НАД^-коферменту. Ксилозоредуктаза у одних культур специфична только к НАДФН-коферменту» а у других проявляет двойную коферментную специфичность к НЛДФН. и НАДН. Впервые показано, что способность дрожжей к продукции ксилита и этанола зависит от коферментной Специфичности ксилозоредуктазы, а причиной накопления ксилита может быть дисбаланс системы регенерации коферментов, возникающий е' условиях ограниченной аэрации.

Установлено, что селективного накопления ксилита или зтакола у дрожжей можно достичь путем ограничения аэрации среды, максимально разобщив образование этих , продуктов и рост культуры.

Впервые оценена способность ксилозоасонмилирующих дрожжей ферментировать 0-глюкозу в условиях ограниченной аэрации, что особенно важно в случае получения этанола из смешанных ксилозосодержащих субстратов.

Практическая значимость работы. Отобраны 4 культуры

ксилоэоассишлирующих дрожжей (С. intermedia, С. didensiae, C.parapsilosis, C.silvanorum), перспективные в качестве продуцентов ксилита.

Подобраны услоеия аэрации, обеспечивающие направленную конверсию D-ксилозы дрожками Pa.tannophilus как в ксилит, так и в этанол. Показано, что двухстадийный onocoö проведения спиртовой ферментации D-ксилозы значительно интенсифицирует процесс бромешш (увеличивает выход этанола," повышает продуктивность и сокращаем время процесса). Параметры ферментации ксилозоассимилируюшдми дрожжами субстратов, полученных на основе растительных гидролизатов и сульфитных щелоков, послужили исходны).® данными для проектирования опытной установки по получению этилового спирта из ксилозо-содержащего растительного сырья.

Связь темы с планом научных' работ." Настоящая работа является частью научных исследований, проводимых по программе "Биотехнология 2000" и развитием работ в соответствии с Госзаказам N 1891-6365-01 и Н 005365061БЭ.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований были представлены на: международной конференции "Biotechnology St.-Petersburg-94" (С.-Петербург, 1994); VIII Европейской конференции "Biomass for energy, environment, agricultural and industry" (Вена, Австрия, 1994); I съезде B0-ГиС им. Н.А.Вавилова (Саратов, 1994); VI международной конференции "Biotechnology in the pulp and paper industry" (Вена, Австрия, 1995). По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и построение работы. Диссертация состоит из введения, шести глав (обзор литературы, материалы и методы, три главы результатов исследований, обсуждение) и выводов общим объемом 146 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 11 рисунками, 17 таблицами. Список цитируемой литературы содержит наименований 178 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы состоит из 6 разделог, где освещены

биохимические аспекты катаболизма D-глюкозы и D-ксилозы у дрожжей. Рассмотрены вопросы, касающиеся особет-остей образования дрожжами продуктов неполного окисления D-ксилозы -ксилита и этанола. Обоснована необходимость изучения разных этапов катаболизма D-ксилозы у ксилозоассимплируи щих дрожжей и условий, способствующих селективному образованию ксилита и этанола.

Материалы и методы. Объектами исследования служили ксилогоассимилируюпще дрожки из разных таксономических групп и спиртообразующие дрожжи-сахаромицеты, не ассимилирующие D-ксилозу, полученные из отечественных коллекций микроорганизмов (музей ВНИИГидролиз, С.-Петербург; ВКПМ ВНИИГенетика, Москва; ВКМ ИБШ РАН, Пущина-на-Оке; музей ВНИИ пищевой биотехнологии, Москва) (табл.1).

В микробиологических исследованиях применяли общепринятые среды (Kreger van Rij, 1984), модифицированные ксило-зосодержащие среды (Борохова, 1994) и ксилозообогащенные субстраты на основе гидролизатов лиственной древесины (опытные варки, стенд ВНИИГидролиз) и сульфитных щелоков (Светогорский ЦБК).

Культивирование дрожжей проводили на чашках Петри, в колбах Эрленмейера, а также в ферментере Biostat М (Braun, Германия), емкостью 2 л. В 'зависимости от целей эксперимента, ферментации проводили при разной степени снабжения дрожжей кислородом. Необходимые скорости поступления кислорода (мМоль/л-ч) подбирали экспериментальный путем, коли-' чественную оценку которых осуществляли сульфитным методом (Егоров , 1976). Дезинтеграцию дрожжевых клеток проводили по методу (Adachi et. al., 1986) с использованием гомогенизатора Vortex (Германия). Удельную активность ксилозоредук-тазы и ксилитдегидрогеиазы в неочищенных бесклеточных экстрактах оценивали по методу (Эверлов и др., 1988), белка -по (Lowry et.al., 1951). Для количественного определения редуцирующих веществ пользовались эбулиостатическим методом (Емельянова и др., 1973). Анализ моносахаридов и ксилита в виде ацетатов альдонитрилов осуществляли методам газожид-

костной хроматографии (Коотенко и др., 1977). Концентрацию этилового спирта устанавливали методом газовой хроматографии после его предварительной отгонки из культуральной среды (Борохова и др., 1991). Экспериментальные данные обрабатывали стандартными статистическими методами (Глотов и др., 1982; Ллойд, Ледерман, 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОЕСУВДЕНИЕ

1.Способность ксшюзоасоимилирующих дрожжей образовывать ксилит и этанол в условиях ограниченной аэрации. Микробиологическое получение ксилита и этанола из О-ксилозы основывается на способности дрожжей, утилизирующих этот сахар, ферментировать его в данные продукты. Образование дрожжами • ксилита и этанола из И-ксилозы изучали в одинаковых для всех культур условиях, при ограничении аэрации среды, что способствует биосинтезу данных продуктов (ЭНгипеег е):.а1., 1987). Для этой цели были отобраны ксилозоассимили-рующие дрожжи из 5-ти различных родов, представленные 21-м штаммом (табл.1).

Сравнение экономических коэффициентов образования ксилита и этанола показало, что исследуемые дрожжи различаются по этим параметрам (табл.1). К продукции этанола оказались способны только три культуры - С.зЬеЬаЬае, Р.з^рШэ (111-ая группа) и Ра. 1аппорЫ1из (П-ая группа). Остальные дрожжи при ограниченной аэрации продуцировали ксилит (1-ая группа). При этом, эффективность конверсии О-ксилозы в ксилит у СЛпЬегтесИае, С.зПуапогшп, С.сИ(1епз1ае и С.рагарэ!-1о51э была наиболее значительна. Впервые данная способность была обнаружена для дрожжей С.сИсЗег^ае, С.БНуапогит, И.ГгаеШэ, Р.^иИНегтопсШ. В отдельную группу были выделены дрожжи Ра. 1аппорЫ1из, продуцирующие этанол и ксилит в сопоставимых количествах.

2. Сравнительный анализ ферментации Р-ксилозы и Р-глю-козы дрожжами при ограниченной аэрации среды. Этиловый спирт является продуктом неполного окисления Р-ксилозы и его обра-

Таблица 1. Образование дрожжами ксилита и этанола из Б-ксилозы в условиях ограниченной аэрации

Вид дрожжей Количество штаммов Экономический коэффициент образования продукта, % от теоретического

Ксилит Этанол

I группа

С.сМепз1ае С. ^егтесИае С.рагарзПоз1э С.зНуапогш СЛгорюаНэ Kl.fragi.lis К1.шагх1апиы Р.^иППептапсШ Т.шоИзМаша 1 1 1 1 3 2 3 2 1 55.0 ± 1.0 72.2 ± 1.5 55.3 ± 1.1 60.0 ± 1.0 47.7 ± 2.1 • 34.4 ± 1.2 35.6 ± 1.5 40.0 ± 2.0 40.0 ± 1.3 4.0 + 0.1 6.0 ± 0.1 2.0 ± 0.1 9.0 ± 0.2 6.0 ± 0.1 3.0 ± 0.1 3.0 ± 0.1 2.0 ± 0.1 2.0 ± 0.1

II группа

Ра. ЬашорЬПиз 3 28.0 ± 1.0 53.0 + 1.0

III группа

С.зЬеИаЬае Р.зИрШэ 1 2 . 4.0 ± 0.1 2.0 + 0.1 78.0 ± 1.0 76.0 ± 1.2

Примечание: теоретический выход ксилита-0.91 г/г, этанола-0.51 г/г потребленной Б-ксилозы.

зование непосредственно зависит от процессов брожения. Невысокие выходы этанола из Б-ксилозы у ксилозоасскмшшрующих культур могут быть обусловлены их слабой бродильной актив- . ностью. Эффективность функционирования бродильного аппарата можно косвенно оценить по сбраживанию дрожками Б-глюкозы, которая, в отличие от В-ксилозы, непосредственно включается в зтап катаболизма, связанный с брожением. На рис.1 представлена сравнительная характеристика способности ксилозоас-симилирущих дрожжей разных групп и дрожжей-сахаромицетов, обладающих высокой спиртообразующей способностью', к ферментации Б-ксилозы и Б-глюкозы в условиях ограниченной аэрации. Сравнение экономических коэффициентов образования этанола (рис.1) показало, что ксилозоассимилирующие дрожжи а}?-

тивно образуют спирт из И-глюкозы. При атом, максимальные его количества образуют дрожжи Ш-ей группы при ферментации как Б-глюкозы, так и 0-ксилозы. Дрожжи П-ой и, особенно, 1-ой групп из о-ксилозы продуцируют значительно меньше спирта, чем из Б-глюкозы.

100

gH

и к

03 0)

"50

Sg2

О® Й vo о

Ш1

-rfn

Sacch. I II III

cerevisiae Группа ксилозоассимилирующих дрожжей

Рис.1. Сравнение экономических коэффициентов образования дрожками этанола из D-ксилозы и D-глюкозы в условиях ограниченной аэрации.

|—[ _ D-глюкоза g-j _ D-ксилоза

Представленные данные показывают, что у изучаемых ксилозоассимилирующих дрожжей бродильная активность достаточно высота. Следовательно, этап катаболизма, отвечающий за процессы брожения, функционирует у них нормально и не ограничивает продукцию этанола при ферментации 0-ксилозы. Тогда снижение выхода спирта из 0-ксилозы у таких дрожжей, вероятно, связано с накоплением ксилита, образующегося в результате ее превращения в ксилулозу.

3.Биохимические особенности начальных этапов превращения Р-ксилозы. Изомеризация Б-ксилозы в ксилулозу у дрожжей происходит в результате двух последовательных окислительно-восстановительных реакций, которые катализируют ферменты ксилозоредуктаза и ксилитдегидрогеназа. Специфическими переносчиками атомов водорода в процессах подобного типа, обычно служат коферменты. В качестве коферментов ксилозоре-дуктазы могут выступать восстановленные формы пиридиновых динуклеотидов - НАДН и НАДФН, а ксилитдегидрогэназы - соот-

ветсвенно окисленные - НАД+ и НАДФ+. Были определены общая и коферментная (специфическая) активности ксилозоредуктавы и ксилитдегидрогеназы при разных условиях аэрации (аэробных, микроаэробных и анаэробных), различающихся степенью снабжения дрожжевых культур кислородом, который, как известно, может значительно влиять на окислительно-восстановительные процессы.

Данные по общей удельной активности ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы представлены на рис.2. Оказалось, что

«

Н

о

о

X

100

50

S-S5 И о

65 О

¡100

50

Ксилозоредуктаза

г4-

Ы

Ксилитдегидрогеназа

±

-i-rrf-

Условия аэрации:

аэробные

микроаэробные

анаэробные □

т, 1 11 111

Группа ксилозоассимшшрующих дрожжей

Рис.2. Обшая удельная активность ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы у дрожжей в зависимости от условий аэрации.

изучаемые дрожжи, различающиеся по способности к конверсии О-ксилозы в ксилит и втанол, имеют также разную активность этих ферментов. Причем, у спиртообразующих культур они более активны, У штаммов, продуцирующих ксилит или одновременно ксилит и этанол, эти ферменты менее активны и чувствительны к аэрации.

Для оценки активностей, связанных с тем или иным ют-ферментом, были рассчитаны их еклэды в общие активности соответствующих ферментов. Сравнение специфических активностей ксилитдегидрогеназы при разных условиях аэрации показа-ло8 что для всех культур характерна преимущественная специфичность к НАД+-коферменту. При этом, специфичность к НАДФ+-коферменту не превышает ЗХ от суммарной активности фермента (табл.2), что не выходит за пределы ошибки измерений. Ив этого можно заключить, что, вне зависимости от аэрации, ксилозоассимшшрующие дрожжи имеют единственную, НАД+-зависимую, форму ксилитдегидрогеназы.

Таблица 2.

Коферментная специфичность ксилитдегидрогеназы в зависимости от условий аэрации

Группа дрожжей Вклад специфической активности в общую, %

Условия аэрации

Аэробные Микроаэробные Анаэробные

НАД+

I II ' III 97.0 98.0 97.0 98.0 99.0 . 97.0 98.0 97.0 98.0

НАДФ+

I II III .3.0 2.0 3.0 ■ 2.0 . 1.0 3.0 2.0 3.0 2.0

Более сложная ситуация выявлена в случае ксилозоредук-тазы (рис.3). У разных групп культур обнаружены разные формы этого фермента, отличающиеся коферментной специфичностью. Так, ксшгозоредуктаза из дрожжей 1-ой группы была специфична только к НАДФН-коферменту. У культур П-ой и III-ей групп ксилозоредуктаза проявляла двойную специфичность - одновременно к НАДФН- и НАДН-коферментам. Условия аэрации не влияли на коферментную специфичность ксилозоре-дуктазы, характерную для каждого типа дрожжей. Однако, вклад специфических активностей в общую активность фермента

-wioo

50

«

S|

о а,

о *о g°

в tu

3 к,

<В Н|

g о ЮО ж

50

■ I | Т I | г I

НАДФН

НАДН

-1-Х.

гЬ

I II III

Группа ксшшзоассимилируюпщх дрожжей

Рио.З. Коферментная специфичность ксилозоредуктазы в вави-симости от условий аэрации

Условия аэрации:

[—|- аэробные -микроаэробные | |-анаэробные

у культур П-ой и Ш-ей групп зависит от условий аэрации.

Сопоставление специфических активностей гссилозоре'дук-тазы и способности дрожжей к продукции ксилита и этанола при ограниченной аэрации показызает (табл.3), что ксилит накапливают культуры, у которых высока доля НАДФН-активности фермента. Этиловый спирт продуцируют дрожжи, у которых, кроме НАДФН-специфической активности, обязательно присутствует и НАДН-активность ксилозоредуктазы. Причем, чем

Таблица 3.

Специфическая активность ксилозоредуктазы и образование ксилита и этанола при ограниченной аэрации среды

Группа дрожжей Вклад специфической активности в общую, X Экономический коэффициент образования продукта, г/г

НАДН НАДФН Этанол Ксилит

I 3.0 97.0 4.0 50.0

П 42.0 68.0 53.0 28.0

III 64.0 36.0 77.0 3.0

выше ее вклад в общую активность фермента, тем больше спирта образуют культуры.

Для интерпретации обнаруженных закономерностей начать-ные зтапы катаболизма 0-ксилозы логично представить в виде схемы, позволяющей рассмотреть разные случаи коферментной специфичности ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы у дрожжей и возможные пути регенерации данных коферментов.

Б-Ксилоза надн а

_НАД+^

Ксилит _НАД+_^

КР

ЛАДФН^ _ЛАДФ+_

Окислительный цикл пентозо-фосфатного• пути

_НАД+ На0

02

^5_аЛАДН_I

Дыхательная цепь

П-Ксилулоза

Рис.4. Начальные этапы катаболизма Ю-ксилозы у дрожжей КР-ксилозоредуктаза КД-ксилитдегидрогеназа

Согласно представленной схеме (рис.4, правая сторона), в условиях недостаточной аэрации в системе с разной коферментной специфичностью ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы, вероятно, будет возникать дисбаланс НАДН/НАД+-ре-докс-системы и накопление НАДН, что приведет к замедлению или блокированию дальнейшего метаболизма ^"ксилозы.. В результате, у дрожжей, обладающих такой ферментативной системой, будет происходить образование ксилита.

Спиртообразугащие дрожжи, тлеют, наряду о НАДФН-, также и НАДН-зависимую активность ксилозоредуктазы (рис.4, левая сторона). Тогда, НАДН, образованный на втором этапе катаболизма, может быть использован в реакции восстановления Б-ксилозы в ксилит. Это, по-видимому, позволяет, в условиях ограниченного снабжения дрожжевых клеток кислородом, частично снизить пул НАДН и обеспечивает превращение ксилита в ксилулозу и далее в этанол. Очевидно, что чем выше доля НАДН-активности ксилозоредуктазы, тем больше НАД+ может (быть регенерировано и, как_ следствие, будет образовано

меньше ксилита и больше этанола. Таким образом, накопление ксилита или этанола может быть связано с дисбалансом системы регенерации коферментов, возникающим в условиях ограниченной аэрации.

4. Регуляция образования ксилита и этанола при помощи аэрации. В данных экспериментах использовали дрожжи Ра.1ап-порМ1из, которые, в отличие от других ксилозоассрмшшрую-щих культур, способны к продукции как ксилита, так и этанола и, поэтому, наиболее подходят для выявления закономерностей образования этих продуктов при разном насыщении ферментационной среды кислородом.

Оказалось, что в отсутствие принудительного аэрирования ферментационной среды возможно лишь незначительное потребление Б-ксилозы, без включения ее в метаболизм клетки (табл.4). Селективное образование этанола происходит при низких скоростях растворения кислорода, а ксилита - еще при более ограниченной аэрации. При этом рост дрожжей практи-

Таблица 4.

Влияние аэрации на образование продуктов метаболизма Б-ксилозы дрожками Ра. ЬаппорЫ1из

Скорость поступления кислорода мМоль/л-ч Выход, г/г

Этанол Ксилит Биомасса

0 2 5 8 13 36 140 0.03+0.01 0.17+0.01 0.25+0.02 0.23+0.02 0.16+0.01 0.09+0.01 0.01+0.01 0.01+0.01 0.23+0.03 0.16+0.01 0.12+0.02 0.05+0.01 0.01+0.03 0.01+0.01 0.01+0.01 0.03+0.01 0.08+0.01 0.09+0.03 0.25+0.01 0.34+0.01 0.41+0.01

чески не наблюдается. Максимальное образование как ксилита, так и спирта происходит в узком интервале значений скорости потребления кислорода. С увеличением степени аэрации продукция этанола и ксилита практически полностью прекращается, рост культуры усиливается и биомасса становится основным продуктом ферментации.

- 15 -

Динамика потребления 0-ксилозы и накопления продуктов ее метаболизма в условиях, обеспечивающих направленный синтез ксилита и этанола представлена на рис.5. Можно видеть, что при ограниченной аэрации скорость ферментации 0-ксилозы определяется степенью снабжения клеток кислородом. И даже незначительное повышение аэрации приводит к существенному усилению утилизации сахара и сокращению длительности процесса. Накопление ксилита в периодической культуре происходит. параллельно снижению концентрации Б-ксшгозы. Связь между образованием этанола или биомассы и потреблением субстрата имеет более сложную зависимость. Так, несмотря на интенсивное потребление Б-ксилозы в первые часы ферментации, в образовании данных продуктов наблюдается лаг-период, который наиболее значителен в случае этанола. При этом, активное накопление спирта происходит при замедлении роста дрожжей, в конце ферментационного процесса.

Таким образом, образование тех или иных продуктов конверсии В-ксшюзы (ксилита, этанола, биомассы) дрожжами Ра. .ЬаппорЬПиэ можно регулировать при помощи кислорода, раст-. воренного в среде. При этом," уменьшение степени аэрирования приводит к дисбалансу реакций превращения Б-ксилозы в кси-лулазу и накоплению ксилита. Избыточлая аэрация стимулирует полное окисление Б-ксилозы- и образование биомассы. Следовательно, для направленного синтеза дрождеЕой клеткой ксилита и этанола необходимо максимально разобщить процессы образования этих продуктов и роста культуры.

5. Спиртовал ферментация ксилозооодержзщих субстратов. С технологической точки зрения процессы роста и образования ксилита или этанола модно разделить на две стадии: стадию выращивания биомассы и, непосредственно, стадию ферментации, проводимую при оптимальной для данного продукта аэрации. Подобный прием был опробован в экспериментах по спиртовой ферментации дрожжами РаЛаппорШиз ксилозосодержащих субстратов, таких как гидролизаты лиственной древесины и сульфитные щелока. Результаты проведения спиртовой ферментации разными способами представлены в табл.5. В первом случае ферментацию проводили в одну стадию, при низкой кон-

Время, час

Рис.5 Профиль ферментации Б-ксилозы дрожками Pa.tannopm.lus в зависимости от скорости поступления кислорода

Скпрость поступления кислорода (мМоль/л'ч); 2 _ -»--в--й-

Таблица 5.

Спиртовая ферментация ксилозосодержащих субстратов дрожками Ра.tannophilus

Параметр Гидроливат лиственной древесины Сульфитный целок

Одна стадия Две стадии Изменение параметра Одна стадия Две стадии Изменение параметра

Выход, г/г 0.21± 0.02 0.32+ 0.01 34% 0.27± 0.01 0.37+ 0.01 27%

Продуктивность , Г/Л'Ч 0.07+ 0.01 0.20+ 0.02 65% 0.08+ 0.01 0.19+ 0.02 58%

Время ферментации, час 70 40 43% 76 50 34%

центрации засеваемых дрожжей, во втором - процесс разбивали на две стадии: - сначала выращивали биомассу, которую затем использовали для спиртовой ферментации. Разделение ферментации на две стадии привело, по сравнению с одностадийной, к значительному повышению продуктивности, увеличению выхода этанола и сокращению общего времени яроцесса (табл.5).

6. Перспективы получения ксилита и этанола с помощью ксилозоассшнлпрующих дрожжей. Изучение образования ксилита и этанола кгапхсзоасстлилирующими дрожками выявило следующие особенности катаболизма D-ксилОвы, основные этапы которого представлены па рис. 6. Ксилит является первым кнтермедиатсм в цепи превращений D-ксшгазы и его накопление непосредственно связано с активностью и специфичностью ферментов ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы, контролирующих начальные этапы. Образование этанола происходит. на более поздних стадиях и зависит как от превращения D-ксилозы в ксилулозу, так и, в значительной степени, от распределения пирувата между бродильным и окислительным путями внутриклеточного обмена. Следовательно, продукция дрожжевой клеткой ксилита и этанола, образующихся яа разных этапах катаболизма D-ксилозы, определяется функционированием соответствую-

Рис.6. Основные этапы катаболизма D-ксилозы у дрожжей (Schneider, 1989)

щих ферментных систем, которые чувствительны к кислороду. Уменьшение аэрирования приводит к усилению дисбаланса реакций превращения D-ксилозы в ксилулозу и накоплению ксилита. Избыточная аэрация стимулирует полное окисление D-ксилозы и образование биомассы. Таким образом, катаболизмом D-ксилозы можно управлять, подобрав условия аэрации,' обеспечивающие направленный синтез ксилита или этанола.

Основным фактором, сдерживающим промышленную реализацию процесса конверсии D-ксилозы в ксилит и этанол, является низкая продуктивность дрожжей. Поэтому дальнейшие исследования должны быть направлены, прежде всего, на улучшение технологических характеристик штаммов-продуцентов с помощью генетического и биотехнологического подходов.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в условиях ограниченной аэрации ксилозоассимилирующие дрожжи разделяются на продуцирующие из D-ксилозы ксилит, этанол или одновременно ксилит и этанол.

2. Изучены ферменты начальных этапов превращения D-ксилозы - ксилозоредуктаза и ксилитдегидрогеназа. Наибольшую активность этих ферментов имеют спиртообразующие дролки. У всех изуенных ксилозоассимилирующих дрожжей ксилитдегидрогеназа специфична только к НАД+-кофермент/. Обнаружено, что гдни кугьтуры имеют ксилозоредук^азу, строго специфичную к НАдФН-коферменту, а другие обладают ксилозо-

редуктазой, которая проявляет двойную специфичность к НАДФН- и НАДН-коферментам.

3. Выявлено, что ксилит накапливают культуры, ксилозо-редуктаза которых высокоспецифична к НАДФН-коферменту и причиной его накопления может быть дисбаланс системы регенерации коферментов, возникающий в условиях ограниченной аэрации.

4. Показано, что этиловый спирт продуцируют дрожжи, у которых наряду с НАДФН-активностью обязательно присутствует НАДН-активность ксилозоредуктазы и эффективность его образования из D-ксилозы у разных культур зависит от аэрации и от соотношения специфических активностей ксилозоредуктазы.

5. Показано, что ксшгазоассшилиругащие дрожжи активно ферментируют D-глюкозу в этиловый спирт в условиях ограниченной аэрации.

6. Изучено влияние условий аэрации на образование продуктов конверсии D-ксилозы (биомассы, ксилита, этанола) и установлено, что селективное накопление ксилита и этанола у дрожжей Pa.tannophilus возможно только в узком интервале аэрирования, когда рост дрожжей значительно ограничен. Определены уровни аэрации, обеспечивающие направленную конверсию D-ксилозы в ксилит и этанол.

7. Показано, что спиртовую ферментацию ксилозосодержа-щих субстратов целесообразно проводить в • две стадии, что значительно увеличивает выход этанола, повышает продуктивность и сокращает время процесса.

По материалам диссертации опубликованы работы:

1. Морфологическая гетерогенность и особенности жизненного цикла дрожжей Pachysolen tannophilus /E.H. Яблочкова, M.B. Шебалина, Т.Е. Огородникова и др. //Микробиология. -1994. -Т. 63,вып.6.-С.1058-1063.

2. Og-orodnikova Т.Е., Yablochkova E.N., Borokhova O.E., Mikhailova N.P., Shapovalov 0.1. Microbiological conversion of D-xylose to ethanol. //Abstr. Int. conf. "Bio-

technology St.-Petersburg", 21 sept. 1994- St.-Petersburg, Russia, 1994.-P.154-155.

3. Shapovalov O.I., Mikhailova N.P., Ogorodnikova Т.Е., Borokhova O.E., Yablochkova E.N. Complete processing of wood to ethanol by yeast.//Abstr. VIII Europ. biom. conf. "Biornass for energy, environment, agricultural and industry", 3 ootob. 1994.-Vienna, Austria, 1994.-Vol.2. -P.1331-1336.

4. Яблочкова E.H., Огородникова Т.Е., Водунова E.H. Разработка генетической системы дрожжей Pachysolen tannop-hilus, ферментирующих 0-ксилозу.//В сб. тез. докл. I съезда ВОГиС, 24 дек. 1994.-Саратов, 1994.-С.36.

5. Количественные показатели роста ксилозоусЕаивающих дрожжей Pachysolen tannophilus и Candida shehatae /Т.Е. Огородникова, Н.П. Михайлова, Е.Н. Яблочкова и др. //Микробиология. -1995.-Т.64, N 1. -С.13-17.

6. Перспективы получения этанола из гемицеллюлозы растительной биомассы. Обзор./ О.И. Шаповалов, Е.Н. Яблочкова, Н.П. Михайлова, Т.Е. Огородникова. //Химия древесины. -1995г. -N3. -С. 15-19.

7. Bodunova Е., Yablochkova Е., Ogorodnikova Т., Mikhailova N. Xylose fermenting yeast Pashypolen tannophilus as a model for genetic research and engineering in forestry.//Abstr. VI Int.conf."Biotechnology in the pulp and paper industry", 11 jun. 1995.-Vienna, Austria, 1995.-P.203.

2I.II.SS Зал 224-65 РГП ИК СШГМЗ ¡¿ооновски" пр. 26