Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное изучение состава клеток дрожжей RHODOTORULA RUBRA (DEMME)LODDER и CRYPTOCOCCUS LAURENTII (KUFFERATH) SKINNER - продуцентов экзогликанов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение состава клеток дрожжей RHODOTORULA RUBRA (DEMME)LODDER и CRYPTOCOCCUS LAURENTII (KUFFERATH) SKINNER - продуцентов экзогликанов"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

ОД

о f; г - £ На правах рукописи

ТИХОМИРОВА Ольга Михайловна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ RHODOTORULA RUBRA (DEMME) LODDER И CRYPTOCOCCUS LAURENTII (KUFFERATH) SKINNER — ПРОДУЦЕНТОВ ЭКЗОГЛИКАНОВ

03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ — 1996

Работа выполнена на кафедре микробиологии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор ВИТОВСКАЯ Галина Ароновна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор СУХАРЕВИЧ Валентина Ивановна

доктор биологических наук ЯКОВЛЕВА Елена Павловна

Ведущая организация — Санкт-Петербургская государственная академия холода и пищевых технологий.

Защита состоится « № » ЛЛрглси 1996 г. в -/Ь часов 00 минут на заседании диссертационного совета К 084.63.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института.

Автореферат разослан « Х2у> (рс£]\льлЛ 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н. В. КИРИЛЛОВА

Актуальность темы. Дрожжевые организмы широко используются в различных биотехнологических процессах. Синтезируемые ими экзо-гликаны находят применение в медицине, фармацевтической, пищевой и других отраслях промышленности. Перспективными продуцентами внеклеточных полисахаридов являются дрожжи базидиомицетового аффинитета — представители родов Rhodotorula и Cryptococcus. Rh. rubra ВК.М Y-341 образует экзоманнан родэксман, обладающий широким спектром биологической активности. Его сульфатированное производное ронасан проявляет гиполипидемическое и антиатеросклеротическое действие. Он успешно прошел клинические испытания, и в настоящее время решается вопрос о его внедрении в производство. Синтезируемый Cr. laurentii 1803-К высоковязкий гетерогликан крилан представляет интерес для использования в качестве энтеросорбента, а также как стабилизатор дисперсных систем, в частности, в косметической промышленности.

При промышленном получении дрожжевых экзогликанов клеточная биомасса является отходом производства. Она может служить источником ценных продуктов для применения в сельском хозяйстве и других областях, в связи с чем детальное изучение химического состава клеток и оценка возможности их практического использования представляется актуальной задачей.

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом НИР института по теме «Биология микробов — продуцентов биологически активных веществ и биотехнология микробных полисахаридов».

Цель и задачи исследования. Цель данной работы состояла в изучении химического состава и определении путей возможного использования клеточной биомассы Rh. rubra ВКМ Y-341 и Cr. laurentii 1803-К как отхода производства экзополисахаридов. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

— изучить химический состав клеток этих дрожжей, в том числе определить содержание и состав белка, свободных аминокислот, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот, водорастворимых витаминов, каро-тиноидов, макро- и микроэлементов;

— на основании полученных данных провести сравнительный анализ практической ценности различных клеточных компонентов и клеток в целом для обеих дрожжевых культур.

Научная новизна работы. Получены данные об особенностях химического состава клеток дрожжей Rh. rubra и Cr. laurentii при биосинтезе экзополисахаридов. Изучен состав белков, свободных аминокислот,

фракционный и жирнокислотный состав липидов, содержание нуклеиновых кислот, водорастворимых витаминов, каротиноидов, макро- и микроэлементов.

Выделены и исследованы углеводные фракции клеток и клеточных стенок. Выявлены закономерности изменения углеводного состава дрожжей в процессе полисахаридообразования. Подтверждено внутриклеточное происхождение родэксмана и капсульное происхождение кри-лана.

Полученные данные углубляют знания о биологии дрожжевых организмов базидиомицетового аффинитета.

Практическая ценность работы. Благоприятный аминокислотный состав белков биомассы клеток исследуемых дрожжей при хорошей их перевариваемое™, наличие других физиологически активных веществ (каротиноидов, водорастворимых витаминов), ценный набор макро- и микроэлементов, низкое содержание нуклеиновых кислот, отсутствие токсичности свидетельствуют о высокой кормовой ценности биомассы Rh. rubra и Cr. laurentii, которая по ряду показателей превышает ценность уже используемых в практике дрожжей других родов. На основании исследования фракционного и жирнокислотного состава липидов показано, что клетки обоих видов дрожжей могут быть использованы как источники суммарных липидов и их отдельных фракций (жирных кислот, стеринов) для практических нужд. Показана перспективность биомассы клеток Cr. laurentii в качестве биосорбента для иммобилизации ионов тяжелых металлов.

Отнесение клеток изученных дрожжевых организмов к разряду целевых продуктов (наряду с экзогликанами) определяет реальную возможность организации малоотходного производства.

Апробация работы. Результаты исследований обсуждены на заседаниях сотрудников кафедры микробиологии СПХФИ и доложены на Всероссийской научной конференции «Химия и технология лекарственных веществ» (С.-Петербург, 28—30 июня 1994 г.).

Публикации. По теме диссертации имеется три публикации.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и библиографии. Работа изложена на Ц.-б' страницах, содержит 29 таблиц и 13 рисунков. Библиография включает источников, из них /.У-Рна иностранных языках.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования были дрожжи Rhodotorula rubra ВКМ Y-341 — продуцент родэксмана и Cryptococcus laurentii 1803-К из коллекции культур Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г. Пущино) — продуцент крилана.

Для культивирования Rh. rubra использовали среду Харада следующего состава (г/л водопроводной воды): (NH4)2SC>4 —2,5 глюкоза —50,0

КН2РО4 —1,0 витамин Bi—0,0004

MgSC>4 • 7НгО — 0,5 витамин В2 —0,0002

NaCl — 0,5 витамин В6 —0,0004

СаСЬ • 2НЮ —0,1 pH до стерилизации 6,5—7,0.

Cr. laurentii выращивали на среде Голубева, содержащей (г/л дистиллированной воды):

MgSO-i ■ 7Н20 —0,5 FeS04-7H20 —0,01

NaCl —0,5 MnCh • 4H20 —0,0015

KH2PO4 —3,5 пептон — 2,0

Na:HP04 • 2HjO — 7,22 глюкоза — 50,0

СаСЬ • 2НгО — 0,001 дрожжевой автолизат — 10 мл

pH до стерилизации 6,9—7,0.

Ферментацию проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл на ротационной качалке (220 об/мин) при 24 °С. Для Rh. rubra объем среды в колбах составлял 300 мл, время ферментации 96 ч, для Cr. laurentii — 150 мл и 120 ч, соответственно. Клетки отделяли от культу-ральной жидкости центрифугированием, промывали 4—5 раз стерильной дистиллированной водой. Одну часть биомассы сразу высушивали при 37 °С до остаточной влажности 5—10 % («интактные клетки»). Другую часть предварительно инактивировали в автоклаве при 0,202 МПа в течение 1 ч («клетки после автоклавирования»). Для сравнения исследуемые дрожжи выращивали на сусло-агаре в течение 120 ч при 24 "С, снимали с поверхности среды и также высушивали при 37 °С до остаточной влажности 5—10 %.

В клетках определяли общее содержание углеводов по Хагедорну-Иенсену после гидролиза биомассы 2 н. H2SO4 в течение 4 ч при 100 "С, содержание гликогена — после экстракции 6 и 3 % NaOH и 0,5 н. СНзСООН (Захарова, Косенко, 1982), трегалозы — по Lillie, Pringle (1980) в собственной модификации. Качественный моносахаридный со-

став целых клеток или отдельных полисахаридных фракций определяли после кислотного гидролиза методом хроматографии на бумаге Filtrak (FN-11) в системе н-бутанол-этанол-вода-аммиак (40 : 10 : 49 : 1). Хрома-тограммы проявляли кислым фталатом анилина.

Полисахаридные фракции клеток Rh. rubra получали по схеме (рис. 1). Клетки разрушали в дезинтеграторе дискового типа (А. с. СССР № 440153). Экстракцию щелочерастворимых полимеров из клеточных стенок проводили 3 % водным раствором NaOH в течение 1 ч при 100 °С. Полисахаридные фракции клеток Cr. laurentii получали по схеме (рис. 2). Декапсулирование проводили при автоклавировании (0,202 МПа, 20 мин) в слабокислой среде (рН 4,0—4,5). Гетерополисахариды фракционировали цетавлоном (Abercrombie et al., 1960). В полисахаридных препаратах определяли редуцирующие вещества по Хагедорну-Иенсену, белок по Lowry et al. (1951), нуклеиновые кислоты по Спирину (1958). Количественное соотношение моносахаридов устанавливали методом ГЖХ ацетатов полиолов (Блинов и др., 1982). Динамическую вязкость растворов полисахаридов измеряли на приборе Rheotest-2 (Германия).

Общий белок в клетках определяли исходя из содержания общего азота, полученного на CHN-анализаторе (Крылова и др., 1983). Количество истинного белка вычисляли по сумме безводных остатков аминокислот (Химический состав пищевых продуктов, 1987). Свободные аминокислоты экстрагировали из клеток 80 % этанолом (Чистякова и др., 1981). Гидролиз клеточных белков проводили 6 н. НС1 при 145 °С в течение 4 ч (Sarwar, McDonogh, 1990) после удаления свободных аминокислот. Для определения цистеина и метионина проводили предварительное окисление белков надмуравьиной кислотой (Satterlee et al., 1982). Триптофан определяли после гидролиза белков гидроксидом бария при 110 °С в течение 15 ч (Piombo, Losano, 1980). Аминокислотный состав белков и свободные аминокислоты анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ фенилтиокарбамильных производных аминокислот (Davey, Ersser, 1990) в собственной модификации на приборе Waters 501 (США) с ультрафиолетовым детектором. Разделение производных осуществляли на колонке jiBondapak Cis (300 х 3,9 мм, размер частиц сорбента 10 мкм). Детекцию проводили при 280 нм. Для сравнения исследовали аминокислотный состав белков на аминокислотном анализаторе Hitachi (Япония). Биологическую ценность белка определяли по методу Армстронга и Митчелла (Стахеев, 1978). Лимитирующие аминокислоты выявляли, рассчитывая аминокислотный скор (Химический состав пищевых продуктов, 1987). Переваривае-мость белков определяли in vitro (Липатов и др., 1994).

Обезжиренные клетки

дезинтеграция, центрифугирование

f-

супернатант

упаривание, осаждение ■ этанолом внутриклеточная спиртоосаждаемая фракция (ВСФ)

i

осадок (клеточные стенки) экстракция NaOH, центрифугирование

супернатант осаждение I этанолом щелочерастворимая фракция клеточных стенок

осадок (щелочене-раствори-мая фракция клеточных стенок)

Рис.

1.

Схема получения полисахаридных фракций клеток дрожжей Rh. rubra

Обезжиренные клетки

декапсулирование, центрифугирование

f-

супернатант

упаривание, осаждение , этанолом капсульные полисахариды

осадок

(декапсулированные клетки) дезинтеграция, центрифугиро-

i-

супернатант

упаривание, осаждение этанолом водорастворимая клеточная фракция (РКФ)

вание

осадок (клеточные стенки) экстракция ИаОН, центрифугирование

»

супернатант

осаждение . этанолом щелочерастворимая фракция клеточных стенок

осадок (щелочене-растворимая фракция клеточных стенок)

Рис. 2. Схема получения полисахаридных фракций клеток дрожжей Сг. 1аигепШ

Нуклеиновые кислоты экстрагировали из клеток по методу Шмидта и Таннгаузера в модификации Сокуровой (1973) и определяли спек-трофотометрически по Спирину (1958).

Свободные липиды экстрагировали по методу Фолча смесью хлороформ — метанол (2 :1) (Christie, 1982) после инактивации липаз и фос-фолипаз по Letters (1966). Связанные липиды определяли после удаления свободных липидов, гидролиза остатков биомассы 10 % НС1 и экстракции смесью хлороформ — метанол (2 : 1) (Пидопличко, 1973). Неомы-ляемую фракцию липидов экстрагировали из клеток дрожжей смесью этанол — гептан (4 : 3) после обработки 10 % КОН в этаноле. Содержание Д5'7-стеринов определяли спектрофотометрически при 282 нм (Жаковская, 1986). Фракционный состав липидов исследовали методом ТСХ на пластинках Silufol UV254 (Kavalier, Чехословакия) в системе гек-сан-диэтиловый эфир-ледяная уксусная кислота (80 : 20 : 2) (Christie, 1982). Фосфолипиды фракционировали на таких же пластинках в системе хлороформ-метанол-вода (65 : 25 : 4) (Кейтс, 1975). Жирнокислотный состав липидов определяли методом ГЖХ метиловых эфиров жирных кислот (Кейтс, 1975) на хроматографе «Хром-5» на стальных колонках (200 х 0,3 см), заполненных Chromosorb VV (80—100 мкм), силанизированным диметилдихлорсиланом с 10 % полиэтиленгликольсукцината. Условную ненасыщенность липидов рассчитывали исходя из их жирнокислотного состава (Зайцева, Султанович, 1988).

Каротиноиды Rh. rubra определяли спектрофотометрически (Вечер, Куликова, 1967). Экстракцию каротиноидов Cr. laurentii проводили по Nakayama et al. (1954), после чего их определяли в сумме в пересчете на Р-каротин (Двинская и др., 1979).

Определение содержания витамина Bi проводили флюориметриче-ски по Ванчу и Харрису (Биохимические методы..., 1969), В: — флюори-метрически люмифлавиновым методом (Вржесинская и др., 1991), Вб— методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (Vanderslice et al., 1985), РР и Н — микробиологическими методами с использованием дрожжевых тест-культур (Одинцова, 1959), Вп— микробиологическим методом с использованием Escherichia coli 113-3 (ГФ XI, т. 2).

Содержание серы и хлора определяли по ГФ XI (т. 1), калия, натрия, кальция, магния, железа, цинка, меди, никеля, марганца, свинца, кобальта, молибдена, мышьяка — методом атомно-абсорбционной спек-трофотометрии на приборах Hitachi Z-7000 (Япония) и AAS-3 (Германия), фосфора — модифицированным ванадат-молибдатным методом (Petkova et al., 1993).

Эксперименты по изучению биосорбции меди проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл со 100 мл раствора, содержащего 1 мМ Cu2+ (Junghaas, Straube, 1991). Ионы меди десорбировали 1 М HCl в течение 30 мин при 220 об/мин и 24 "С.

Острую токсичность клеточной биомассы определяли по модифицированному методу (Прозоровский и др., 1978) при введении мышам суспензии клеток per os.

Электронно-микроскопические исследования проводили на микроскопе Tesia-613 (Чехословакия). Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме Reichert (Австрия). Срезы обрабатывали урашшацетатом в 70 % этаноле, а затем цитратом свинца (Ананьева и др., 1986).

Результаты подвергали статистической обработке в соответствии с ГОСТ 11.004-74.

Результаты исследований

1. Углеводы клеток Rh. rubra и Cr. laurentii.

Общее содержание углеводов в биомассе клеток Rh. rubra — продуцента родэксмана в конце ферментации составляло 54,3 ± 4,1 % абсолютно сухой биомассы (АСБ). В гидролизатах клеток были выявлены манноза, глюкоза, галактоза, фукоза. Клетки Cr. laurentii при продукции крилана к моменту окончания процесса ферментации содержали 42,8 ± 2,1 % углеводов, в составе которых были обнаружены манноза, ксилоза, глюкуроновая кислота, галактоза и глюкоза. Клетки, выращенные для сравнения на сусло-агаре, отличались более высоким содержанием углеводов (Rh. rubra — на 11 %, Cr. laurentii — на 35 %), но имели аналогичный качественный моносахаридный состав.

Содержание углеводов в клетках Cr. laurentii после автоклавирова-ния практически не изменялось, в то время как в случае Rh. rubra количество их уменьшалось на 29 %. Подобные явления можно связать как с наличием капсулы, препятствующей потерям углеводов, у Cr. laurentii и отсутствием ее у Rh. rubra, так и с различиями в условиях биосинтеза эк-зогликанов. Продукция крилана происходит при значении рН, близком к нейтральному. Напротив, обязательным условием синтеза родэксмана является резкое закисление питательной среды, которое сопровождается разрыхлением отдельных участков клеточной стенки. При автоклавиро-вании клеток Rh. rubra степень деструкции клеточных структур увеличи-

вается, в связи с чем из клеток могут высвобождаться различные вещества, в том числе углеводы.

Исследуемые дрожжи имели низкое содержание гликогена (табл. 1). Уменьшение количества этого полисахарида в клетках Rh. rubra при образовании родэксмана по сравнению с клетками, выращенными на сусло-агаре, очевидно, связано с нарушением его синтеза в условиях низкого рН среды, а увеличение у Cr. laurentii — с благоприятными условиями для его образования в жидкой среде, богатой легко доступным источником углерода, при интенсивной аэрации и значении рН среды, близком к нейтральному.

Таблица 1

Содержание трегалозы и гликогена в биомассе клеток дрожжей (% АСБ)

Rh. rubra Cr. laurentii

Углеводы среда для продук- сусло - среда для продук- сусло -

ции полисахарида агар ции полисахарида агар

ИнК КПА ИнК КПА

Трегалоза 3,38 5,14 4,31 2,52 3,20 9,10

Гликоген 1,04 0,15 1,63 1,65 1,53 0,33

Примечание. Здесь и далее в таблицах: ИнК — интактные клетки, КПА — клетки после автоклавирования.

Содержание трегалозы было впервые определено для представителей исследуемых видов. Оно соответствует таковому у Saccharomyces cerevisiae — наиболее изученного в этом отношении вида дрожжей. Увеличение выхода трегалозы после автоклавирования, вероятно, объясняется инактивацией трегалазы и улучшением условий экстракции при нарушении барьеров проницаемости клеток.

При исследовании состава основных углеводных фракций клеток Rh. rubra был выявлен ряд закономерностей, углубляющих современные представления о механизмах биосинтеза экзоманнанов.

Содержание внутриклеточной спиртоосаждаемой фракции (ВСФ) в клетках Rh. rubra достигало максимума (16,3 ± 0,9 % АСБ) к 48 ч культивирования, когда значение рН среды снижалось до 1,9—2,1 и начиналось интенсивное выделение родэксмана. В дальнейшем содержание ВСФ незначительно уменьшалось. В составе этой фракции были обнаружены манноза, глюкоза, галактоза и фукоза. В период, предшествующий появлению маннаиа в среде (до 17 ч культивирования), относительное содержание маннозы в полисахаридах ВСФ увеличивалось в 1,5 раза, а галактозы — уменьшалось в 2,7 раза. К моменту начала продукции полисахарида (25 ч культивирования), напротив.

содержание маннозы достигало минимума при значительном увеличении доли галактозы и глюкозы (в 1,7 и 2,3 раза, соответственно) и впоследствии мало изменялось.

Фракция клеточных стенок (КС) при росте Rh. rubra на среде Хара-да составляла 41,5—53,2 % АСБ. По мере быстрого снижения рН в процессе ферментации (9—17 ч культивирования) доля КС несколько увеличивалась, а затем снова снижалась, достигая минимума к моменту начала интенсивного выделения родэксмана (48 ч). К концу ферментации наблюдалось повторное незначительное возрастание выхода фракции КС. При культивировании Rh. rubra на сусло-агаре доля КС составляла 30,5 ± 1,4% АСБ.

Содержание щелоченерасгворимой фракции в КС снижалось по мере закисления среды и достигало минимума к 48 ч культивирования (18,5 ± 1,7 %), одновременно с минимумом содержания в клетках суммарных КС, а затем постепенно увеличивалось к концу ферментации до 29,3 ± 3,1 %. В процессе биосинтеза экзоманнана моносахаридный состав этой фракции изменялся мало. При этом преобладали манноза (57,5— 67,9 %) и глюкоза (29,0—37,2 %), минорные компоненты были представлены галактозой и фукозой.

Полисахариды щелочерастворимой фракции КС Rh. rubra содержали 18,9—28,5 % глюкозы, 26,4—62,3 % маннозы, 7,8—17,5 % галактозы, 6,0—-28,0 % фукозы, при этом в процессе ферментации доля маннозы увеличивалась, а фукозы — уменьшалась. Следует подчеркнуть, что количественные изменения моносахаридного состава углеводных полимеров этой фракции совпадали по времени с изменениями рН среды культивирования и началом биосинтеза родэксмана.

Таким образом, в процессе синтеза внеклеточного маннана Rh. rubra ВКМ Y-341 происходят глубокие качественные и количественные изменения клеточных полисахаридов. Полученные данные подтверждают ранее высказанную гипотезу о внутриклеточном происхождении родэксмана. Непосредственно образование экзоманнана связано, скорее всего, со щелочерастворимой фракцией КС.

Продуцент крилана Cr. laurentii при культивировании на сусло-агаре образует капсулу с характерной для дрожжей базидиомицетового аффинитета сетчато-фибриллярной структурой. В то же время, по данным электронной микроскопии, на поздних стадиях культивирования на среде Голубева подобная сетчатая структура, примыкающая к КС, не выявлялась, а толстые тяжи слипшихся фибрилл отходили прямо от КС.

В составе капсульных полисахаридов, полученных при декапсулировании клеток автоклавированием в слабокислой среде (рис. 2), были выявлены манноза, ксилоза, глюкуроновая кислота, галактоза и следы глюкозы. Аналогичный состав имели полисахариды водорастворимой клеточной фракции (РКФ).

При фракционировании капсульного материала цетавлоном были получены, как и в случае внеклеточного полисахарида крилана, две фракции, одна из которых (основная) содержала маннозу, ксилозу и глю-куроновую кислоту, а другая (минорная) — маннозу, ксилозу, галактозу и следы глюкозы. Минорная фракция капсульных полисахаридов при продукции крилана составляла 1,1 ±0,2 % от суммарного их количествам при росте на сусло-агаре — 6,5 ± 0,5 %. Капсульные глюкуроноксило-маннаны, полученные с сусло-агара и при образовании экзогликана, имели сходный состав (36,9—40,2 % ксилозы, 47,9—50,9 % маннозы, 12,0—12,2 % глюкуроновой кислоты) и незначительно отличались от соответствующей фракции крилана. Вязкость растворов нефракциониро-ванных капсульных полисахаридов, полученных при продукции крилана, превышала вязкость самого крилана в 1,7 раза. В связи с высоким выходом капсульных полимеров (более 20 % АСБ) возможно несложное получение дополнительного высоковязкого продукта из отходов биомассы.

Растворимые клеточные полисахариды при фракционировании цетавлоном также давали две фракции в соотношении 1 : (1,1—1,2) с преобладанием глюкуроноксиломаннана. Кислая фракция РКФ имела сходный состав независимо от источника ее получения (48,4—50,9 % маннозы, 31,7—33,2 % ксилозы, 17,1—19,9 % глюкуроновой кислоты) и отличалась от капсульных полисахаридов более высоким содержанием глюкуроновой кислоты и более низким — ксилозы.

Выход фракции КС у Сг. 1аигепШ составлял 22,5—24,4 % АСБ независимо от условий культивирования. В составе щелоченерастворимой фракции КС преобладала глюкоза, также присутствовали манноза, ксилоза и глюкуроновая кислота, но отсутствовала галактоза. Это указывает на прочную связь структурных глюканов с кислыми гетерополисахари-дами, но не с галактоксиломаннаном. Щелочерастворимая фракция КС Сг. 1аигепШ содержала глюкозу, маннозу, ксилозу, глюкуроновую кислоту и галактозу с преобладанием маннозы и ксилозы.

На основании результатов изучения состава полисахаридных фракций КС Сг. 1аигепШ и анализа данных литературы можно предположить, что галактоксиломаннаны являются истинными структурно-метаболическими полимерами КС, в то время как глюкуроноксиломаннаны имеют чисто капсульное происхождение и прочно связаны со структурными по-

лисахаридами. Сходство по составу капсульных полимеров Сг. 1аигепс11 и крилана является дополнительным подтверждением предположения о капсульном происхождении зкзогетерополисахаридов криптококков.

2. Аминокислоты и белки

Использование биомассы клеток микроорганизмов как отхода биотехнологического производства в качестве кормовой добавки — простой и экономически выгодный путь решения проблемы ее утилизации. Основным химическим компонентом клеток, определяющим питательную ценность биомассы, являются белки.

Содержание белка в клетках дрожжей при продукции экзогликанов и при росте на сусло-агаре было сходным (табл. 2). Меньшее количество свободных аминокислот в биомассе клеток дрожжей, выращенных на сусло-агаре (табл. 2), можно объяснить менее благоприятными условиями для их синтеза на этой среде.

Таблица 2

Содержание белка и свободных аминокислот (% АСБ) в клетках дрожжей

Rh. rubra и Cr. laurentii

Группа соединений Rh. rubra Cr. laurentii

среда для продукции полисахарида сусло-агар среда для продукции полисахарида сусло-агар

ИнК КПА ИнК КПА

Общий белок 28,9 34,4 30,7 И,7 15,8 13,0

Истинный белок 22,4 29,1 24,5 3,8 13,2 9,4

Свободные

аминокислоты 0,56 0,35 0,24 1,44 0,97 0,20

При автоклавировании, очевидно, имеют место потери свободных аминокислот и ряда других соединений, в то время как белки денатурируются и остаются в клетках, в связи с чем их относительное содержание возрастает.

Для определения состава белков и свободных аминокислот Rh. rubra и Cr. laurentii использовали обращенно-фазовую ВЭЖХ фенилтиокарбамиль-ных производных аминокислот. Методика была специально модифицирована для анализа объектов сложного химического состава, какими являются дрожжи. При сравнении результатов, полученных с использованием нового

метода, и данных ионообменной хроматографии на аминокислотном анализаторе было показано, что ВЭЖХ может с успехом использоваться для изучения аминокислотного состава дрожжевых организмов.

Таблица 3

Аминокислотный состав белка (% от суммы кислот) дрожжей Rh. rubra

и Cr. laurentii в сравнении с составом белка кормовых дрожжей _и стандартом ФАР («идеальный белок») _i_

Rh. rubra Cr. laurentii Дрож- Иде-

Амино- среда для среда для жи аль-

кислоты продукции сусло- продукции сусло- рода ный

полисахарида агар полисахарида агар Can- белок

ИнК КПА ИнК КПА dida

Аспарагиновая

кислота +

аспарагин Глутаминовая 9,6 9,7 10,2 8,0 9,8 9,7 8,3—13,4

кислота +

глутамин • 10,4 10,9 14,5 8,8 11,1 9,8 11,2—14,8

Серин 3,9 4,2 8,4 5,2 3,2 4,2 4,5—9,0

Глицин 3,3 4,4 2,3 3,9 3,4 3,4 3,9—11,8

Треонин 6,6 6,5 9,2 6,7 6,5 6,0 4,2—6,0 4,0

Алании 9,0 7,1 7,3 8,3 8,6 6,2 4,1-13,4

Гистидин 2,6 2,4 2,0 3,1 2,5 2,8 1,5—3,3

Аргинин 9,4 8,2 9,7 9,5 9,4 п,о 3,1—5,9

Пролин 6,2 4,5 8,4 7,5 7,0 7,7 2,3—6,8

Валин 6,0 7,7 3,5 6,6 6,2 7,0 4,6—7,6 5,0

Тирозин 3,9 4,0 2,3 3,2 3,1 3,1 2,1—6,0 ¡6,0

Фенилаланин 5,7 5,8 3,8 4,5 4,3 3,9 2,9—4,6

Лейцин +

изолейцин 11,8 14,1 8,9 11,6 13,5 10,7 10,6—15,8 п,о

Лизин 6,5 5,7 4,3 6,5 5,4 7,5 6,1—9,8 5,5

Цистеин 0,2 0,1 0,2 0,1 сл. 0,2 сл.—1,1 }з.

Метионин 2,2 2,1 1,9 3,1 2,7 2,2 0,5—2,8

Триптофан 2,8 2,6 3,6 3,4 3,3 4,6 1,2—5,7 1,0

Сумма незаме-

нимых амино-

кислот 41,6 44,5 34,7 42,4 41,9 41,9 41,5-45,2 36,0

В клетках исследуемых дрожжей в свободном состоянии было обнаружено 18 аминокислот. В составе свободных аминокислот клеток Rh. rubra при продукции полисахарида преобладала аспарагиновая кислота (25,4 ± 2,1 % от суммы кислот); значительную часть составляли также лейцин (12,2 ± 1,5 %), гистидин (9,4 ± 1,1 %), аргинин (9,1 ± 0,8 %) и ала-нин (8,4 ± 0,6 %). У Cr. laurentii при культивировании на среде Голубева преобладали аланин (25,0 ± 1,2 %), изолейцин (11,6 ± 1,0 %) и серии (9,8 ± 0,6 %). При росте дрожжей на сусло-агаре в обоих случаях основную часть составляли аспарагиновая кислота (22,4—32,6 %) и аланин (12,7—16,5 %). Соотношение свободных аминокислот при термоинактивации изменялось незначительно.

По аминокислотному составу клеточных белков исследуемые дрожжи оказались сходными с кормовыми дрожжами рода Candida (табл. 3), В то же время в составе белка Rh. rubra и Cr. laurentii обнаружено более высокое содержание аргинина, в случае Rh. rubra также фе-нилаланина, а у Cr. laurentii — треонина. Биологическая ценность белка исследуемых дрожжей, определенная по методу Армстронга и Митчелла, составляла 85,6—87,4. Единственными лимитирующими незаменимыми аминокислотами в белке интактных клеток дрожжей при продукции эк-зогликанов были серусодержащие (скор для Rh. rubra — 69 %, для Cr. laurentii — 91 %). После автоклавирования степень лимитирования возрастала. Перевариваемость белка интактных клеток Rh. rubra составляла 76,8 ± 10,5 %, a Cr. laurentii — 74,2 ± 5,1 %.

Таким образом, белки исследуемых дрожжей имеют благоприятный аминокислотный состав и хорошую перевариваемость.

3. Нуклеиновые кислоты

Содержание в биомассе клеток микроорганизмов нуклеиновых кислот является важным показателем при оценке пригодности ее в качестве кормового продукта.

. Клетки исследуемых дрожжей имели низкое содержание нуклеиновых кислот (на уровне денуклеинизированных препаратов) (табл. 4). Установлено, что при продукции полисахаридов отношение РНК/ДНК (показатель интенсивности азотистого обмена клеток) меньше, чем при культивировании дрожжей на сусло-агаре (для Rh. rubra — 3,5 и 4,1, для Cr. laurentii — 1,7 и 5,7, соответственно).

Таким образом, клетки дрожжей — отходы производства экзогли-канов выгодно отличаются от промышленных продуцентов белка низким содержанием нуклеиновых кислот.

Таблица 4

Содержание нуклеиновых кислот (% АСБ) в клетках дрожжей Rh. rubra и Cr. laurentii

Среда для продукции полисахарида Сусло-агар

Дрожжи ДНК РНК

ИнК КПА ИнК КПА ДНК РНК

Rh. rubra 0,72 0,69 2,51 1,99 0,65 2,63

Cr. laurentii 0,44 0,35 0,75 0,58 0,61 3,44

4. Липиды

В связи с экономической нецелесообразностью специального производства микробных липидов изучение их содержания и состава в клетках дрожжей — отходе производства полисахаридов представляет несомненный интерес. Содержание свободных, связанных липидов и неомыляемой фракции, в том числе А5'7-стеринов, обладающих D-провитаминной активностью, приведено в табл. 5. Хотя исследуемые штаммы нельзя отнести к активным липидообразователям, они содержат значительные количества свободных липидов, особенно Cr. laurentii в условиях продукции экзогликана. Невысокое содержание связанных липидов в биомассе клеток дрожжей Rh. rubra и Cr. laurentii является положительным фактором при оценке их как возможных кормовых продуктов, поскольку эта группа соединений образуется, в основном, при окислении свободных липидов, что ведет к деструкции незаменимых жирных и аминокислот, оксилабильных витаминов, образованию токсичных и плохо перевариваемых продуктов. Автоклавирование мало влияло на содержание свободных и связанных липидов, а также неомыляемой фракции (табл. 5).

Фракционный состав свободных липидов исследуемых дрожжей типичен для представителей соответствующих видов (табл. 6).

Свободные липиды представляют интерес как смазочные материалы и пеногасители в микробиологическом производстве, а также как ис-

точник отдельных фракций, прежде всего жирных кислот и стеринов, в том числе Д57-стеринов (табл. 5).

Таблица 5

Содержание липндов (% АСБ) в биомассе клеток Rh. rubra и Cr. laurentii

Группа липидов Rh. rubra Cr. laurentii

среда для продукции полисахарида сусло-агар среда для продукции полиса-, харида сусло-агар

ИнК КПА ИнК КПА

Свободные липиды 16,0 14,7 12,7 28,9 26,9 15,9

Связанные липиды 3,5 4,0 4,5 4,1 4,4 4,2

Неомыляемая

фракция

всего 4,9 4,9 3,6 3,1 2,8 2,0

в том числе

Д5'7-стерины 0,5 0,5 0,2 0,4 0,4 0,7

Таблица 6

Фракционный состав (% от суммы) свободных липидов Rh. rubra и Cr. laurentii

Rh. rubra Cr. laurentii

Фракция среда для про- среда для про-

липидов дукции полиса- сусло- дукции полиса- сусло-

харида агар харида агар

ИнК КПА ИнК КПА

Фосфолипиды 11,5 11,5 7,8 4,9 4,5 7,5

Стерины 8,2 8,2 8,4 5,3 3,9 3,5

Моноацилгли-

церины 3,4 3,8 11,1 3,4 4,5 2,4

Диацилглицерины 7,6 8,6 4,4 3,8 6,4 3,0

Свободные жирные

кислоты 15,4 16,1 14,6 24,8 27,8 10,8

Триацилглицерины 39,6 38,7 35,2 51,6 46,8 62,6

Эфиры стеринов и

углеводороды 10,8 9,1 п,з 4,5 3,3 8,0

Неидентифициро-

ванная 3,5 4,0 7,2 1,7 2,9 2,1

Фракционный состав связанных липидов Rh. rubra и Cr. laurentii был сходен вне зависимости от условий культивирования и обработки клеточной биомассы; преобладали фракции фосфолипидов (20,5—29,7 % от суммы), триацилглицеринов (22,5—28,7 %) и свободных жирных кислот (17,6—24,5 %). В составе фосфолипидной фракции свободных и связанных липидов были обнаружены фосфатидилхолин (преобладает у Сг. laurentii), фосфагидилэтаноламин (преобладает у Rh. rubra), фосфатидил-серин, фосфатидилинозит, фосфатидная кислота и две неидентифициро-ванные фракции.

Таблица 7

Сравнительный жирнокислотный состав (% от суммы кислот) свободных липидов Rh. rubra и Cr. laurentii и некоторых природных жиров и масел

Rh. rubra Cr, laurentii

Жирные кислоты среда для продукции полисахарида сусло-агар среда для продукции полисахарида сусло-агар Арахисовое масло Свиной жир

ИнК КПА ИнК КПА

Сы:0 1,4 0,8 1,0 0,5 0,4 0,4 0,5 1,4

С)5:0 0,3 0,3 0,4 сл. сл. сл. — 0,3

Cl6:0 15,5 13,7 19,5 21,8 22,6 24,0 6—15 24,0

Cl6: 1 1,3 1,2 1,2 0,3 сл. сл. сл. 1,5

Cl7:0 0,1 0,1 0,3 0,5 0,4 0,4 — 1,7

C)7:l 0,3 0,3 0,2 0,1 0,1 0,1 — —

Cl8:0 3,5 2,8 3,9 13,7 13,7 14,6 2,7 15,1

Cl8 : 1 53,9 57,2 40,3 39,1 37,8 38,1 35—72 45,7

Cl8 : 2 17,1 16,2 24,3 21,4 22,5 20,5 13—45 8,6

Cl8:3 6,0 6,8 8,6 0,1 0,1 сл. 0,8 —

C20 :0 сл. сл. сл. 0,6 0,7 0,6 1,2 1,8

C20:1 0,3 0,4 сл. — — -— 1,1 —

C22:0 0,3 0,2 0,2 0,4 0,5 0,4 3,4 —

C24:0 сл. сл. сл. 1,5 1,2 0,9 1,1 —

НЖК 21,1 17,9 25,3 38,9 39,5 41,3 нд 44,2

ННЖК 78,9 82,1 74,6 61,1 60,5 58,7 нд 55,8

УН 108 112 116 83 83 79 нд 64

Примечание. НЖК — насыщенные жирные кислоты; ННЖК — ненасыщенные жирные кислоты; УН — условная ненасыщенность липидов; НД — нет данных.

Жирнокислотный сосгав свободных липидов, в целом, характерен для представителей данных видов, однако у Cr. laurentii было впервые показано также присутствие лигноцериновой кислоты (Си ■. о), а у Rh. rubra — арахиновой (С:о: о) (табл. 7). По составу жирных кислот свободные липиды Rh. rubra напоминают арахисовое масло, a Cr. laurentii — жиры животного происхождения. Из числа эссенциалъных жирных кислот в состав липидов исследуемых дрожжей входит только линолевая кислота (Сis : 2), а линоленовая (Сis : з) представлена неэссенциальным а-изомером.

Изменение условий культивирования мало влияло на жирнокислотный сосгав свободных липидов у Cr. laurentii. Сдвиги в соотношении жирных кислот в случае Rh. rubra при продукции родэксмана можно связать с низким значением рН среды культивирования. После автоклавиро-вания соотношение жирных кислот изменялось незначительно.

Состав жирных кислот связанных липидов напоминал состав свободных липидов; преобладали олеиновая, пальмитиновая и линолевая кислоты.

Таким образом, биомасса клеток Rh. rubra и Cr. laurentii содержит значительные количества липидов, имеющих богатый фракционный и благоприятный жирнокислотный состав. Липиды этих дрожжей представляют интерес для кормопроизводства в составе цельной биомассы или отдельно от нее после экстракции. Они также могут найти применение как продукты, содержащие поверхностно-активные вещества, и источник отдельных фракций, прежде всего жирных кислот и сгеринов.

5. Каротиноиды

Содержание в дрожжевой биомассе каротиноидов является положительным моментом при определении ее кормовой ценности, поскольку они обладают широким спектром биологической активности, в том числе А-провитаминным действием.

Основными каротиноидами, выявленными у Rh. rubra, были тору-лин, торулародин и Р-каротин (табл. 8).

Суммарное содержание каротиноидов у Cr. laurentii в пересчете на Р-каротин при выращивании на сусло-агаре составляло 3,6 ± 0,1 мкг/г, а при продукции полисахарида увеличивалось в 3 раза (до 10,1 ± 0,5 мкг/г). После автоклавирования оно мало изменялось.

Таблица 8

Содержание основных каротиноидов в клетках Rh. rubra

Источник Содержание каротиноидов

биомассы всего, в том числе, % от суммы

мкг/г р-каротин торулин торулародин

Сусло-агар 114 33,4 9,4 57,2

Среда Харада

ИнК 203 30,1 43,9 26,1

КПА 176 31,6 46,2 21,5

Таким образом, содержание каротиноидов у Cr. laurentii слишком маю для практического использования. В го же время эти биологически активные вещества из клеток Rh. rubra представляют интерес для кормопроизводства (в составе цельной биомассы).

6. Витамины

При оценке биомассы клеток дрожжей как кормовой добавки важное значение имеет ее витаминный состав (табл. 9).

Таблица 9

Содержание витаминов (мкг/г АСБ) в клетках дрожжей

Rh. rubra Cr. laurentii Кор-

Вита- среда для среда для мовые

мины продукции сусло- продукции сусло- дрожжи

полисахарида агар полисахарида агар рода

ИнК КПА ИнК КПА Candida

В, 2,7 2,6 2,8 1,5 0,7 2,1 0,4—21

в2 6,0 5,2 7,9 3,6 3,5 3,9 15—220

Вб 8,4 4,9 7,6 18,7 9,5 9,0 2—21

РР 43,2 17,7 130,8 39,0 16,8 99,6 200—875

Н 1,9 1,7 1,7 0,08 0,07 0,09 0,2—0,8

В клетках Rh. rubra и Cr. laurentii были выявлены также следовые количества витамина В12.

Продукция внеклеточного полисахарида наиболее сильно сказывалась на содержании никотиновой кислоты (витамина РР), которое

уменьшалось при этом в 2,5—3 раза по сравнению с таковым на сусло-агаре. Термоинактивация влияла, в основном, на количество витаминов РР и Вб в биомассе клеток исследуемых дрожжей.

Таким образом, дрожжи Rh. rubra и Cr. laurentii по содержанию витаминов В« и Н не усгупают кормовым, хотя содержат меньше рибофлавина и ниацина.

7. Макро- и микроэлементы

Исследуемые дрожжи по своему макро- и микроэлементному составу, в целом, сходны с основными пищевыми и кормовыми дрожжами родов Candida и Saccharomyces (табл. 10). В то же время клетки Rh. rubra в условиях продукции экзоманнана отличались более низким содержанием калия, магния, марганца и цинка, а клетки Cr. laurentii при биосинтезе крилана — более высоким содержанием калия, натрия и железа. Последнее может быть связано, в частности, с адсорбцией ионов упомянутых металлов на капсуле Cr. laurentii, содержащей глюкуроно-вую кислоту.

В целом, зольность клеточной биомассы при продукции экзогликанов составляла 6,5 ± 0,8 % АСБ в случае интактных клеток Rh. rubra и 12,4 ± 2,4 % для интактных клеток Cr. laurentii. После автоклавирования зольность снижалась примерно на 20 %. При культивировании на сусло-агаре содержание золы в клетках Rh. rubra было более высоким, чем при продукции экзогликана (11,5 ± 1,8 %), а для Cr. laurentii — более низким (10,7 ± 1,2 %).

8. Использование биомассы клеток дрожжей в качестве биосорбента

Интактные клетки Cr. laurentii проявили высокую сорбционную активность в отношении ионов меди. При этом в течение 1 ч из раствора, содержащего 1 мМ Си2+, сорбировалось 81,2 ± 4,8 % меди (концентрация биомассы — 4,1 ±0,1 г/л, 25 °С) и затем десорбировалось (1 М НС1, 30 мин, 25 °С) 61,5 ± 4,4 % иммобилизованного количества ионов. Сорб-ционная активность интактных клеток Rh. rubra была низкой (из раствора удалялось лишь 25,2 ±3,5 % меди).

Термоинактивация по-разному влияла на эффективность иммобилизации ионов меди биомассой клеток исследуемых дрожжей: в случае Cr. laurentii она снижалась до 61,4 ± 4,4 %, тогда как в случае Rh. rubra — заметно увеличивалась (41,3 ± 3,2 %).

Таблица 10

Содержание макро- и микроэлементов в биомассе клеток дрожжей (10° % АСЕ)

Rh. rubra Cr. laurentii Кормовые и пи-

Элементы среда для продукции по- сусло- среда для продукции поли- сусло- щевые дрожжи

лисахарида агар саха рида агар родов Candida

ИнК КПА ИнК КПА и Saccharomyces

К 440±210 360±170 10850+260 10070±3600 98501240 83001510 2040—2270

Na 40—1290 40—1270 74+30 7901300 760190 80120 80—300

Са 95+23 90±28 132+13 24±9 6—27 130110 33—410

Mg 81±19 7б±24 190±30 130±10 130110 140110 180—320

S 180180 260±70 160+40 сл. сл. сл. сл.—700

р 1270+30 1240±50 940±30 700110 460170 ■ 560120 1180—1800

CI 750±250 680И80 600±50 630140 5801120 510+90 сл.—1360

Fe 2—11 0,3—10 4—18 73128 67+14 67115 8,1—34

Zn 0,6—1,7 0,1—1,7 2,1±0,2 1,110,3 0,810,2 1,810,2 3,2—31,7

Cu 2,3+0,9 0,7—2,4 3,0±1,3 2,911,0 2,710,9 1,110,4 0,4—5,5

Ni 1,0±0,3 сл.—0,5 0,48±0,04 0,510,1 0,09910,001 менее 0,1 нд

Mn 0,24+0,09 0,16±0,06 3,6+1,2 0,5—2,0 1,110,5 1,310,1 2,1—6,9

Pb 0,05—0,22 0,03—0,16 0,18±0,06 0,1310,05 0,1110,01 0,1310,04 0,07/НД

Со менее 0,1 менее 0,1 менее 0,1 менее 0,1 менее 0,1 менее 0,1 менее 0,01—0,132

Mo менее 0,1 менее 0,! менее 0,1 менее 0,1 менее 0,1 менее 0,1 0,042—0,106

As менее 0,1 менее 0,1 менее 0,1 менее 0,1 менее 0,1 менее 0,1 менее 0,01/НД

Примечание. НД — нет данных; сл.— элемент обнаружен в следовых количествах.

Таким образом, клетки Cr. laurentii — отход производства экзогли-кана крилана представляют несомненный интерес в качестве эффективного биосорбента.

9. Биологические исследования

При введении мышам линии СВА суспензий исследуемых дрожжей максимально возможной концентрации per os было показано отсутствие острой токсичности в следующих дозах (в пересчете на АСБ): для Rh. rubra — 5,7 г/кг (и интактные, и термоинактивированные клетки), для Сг. laurentii —3,2 г/кг (интактные клетки) и 2,7 г/кг (автоклавированные клетки).

Хотя исследуемые штаммы являются непатогенными и представители данных видов широко распространены в природе, представляется целесообразным рекомендовать для дальнейшего изучения в качестве кормовых добавок клеточную биомассу не в нативном, а в термоинакти-вированном виде с целью избежания искусственного вмешательства в микробоценозы людей, животных и окружающей среды.

ВЫВОДЫ

1. Клетки дрожжей Rhodotorula rubra ВКМ Y-341 и Cryptococcus laurentii 1803-К, продуцирующих биологически активные и практически ценные экзогликаны родэксман и крилан, содержат, соответственно, 54 и 43 % углеводов, 29 и 12 % общего белка, 3,2 и 1,2 % нуклеиновых кислот, 20 и 33 % липидов, 6,5 и 12,4 % зольных элементов, а также каротиноиды и водорастворимые витамины (Bi, Вз, Be, В12, Н, РР).

2. Выделены и изучены клеточные стенки дрожжей — продуцентов экзогликанов, их щелочерастворимые и щелоченерастворимые фракции, внутриклеточные полисахариды, а также капсульные полисахариды Сг. laurentii. При этом подтверждено внутриклеточное происхождение родэксмана и капсульное происхождение крилана.

3. В дрожжевом белке выявлены все незаменимые аминокислоты в соотношении, указывающем на его высокую биологическую ценность. По сравнению с рядом кормовых микробных протеинов белок Rh. rubra отличается более высоким содержанием аргинина и фенилаланнна, а белок Cr. laurentii — аргинина и треонина. Перевариваемость белка продуцентов

полисахаридов сопоставима с перевариваемостью белка кормовых грибов. Клеточный фонд вкшочает также 18 свободных аминокислот.

4. Липиды дрожжей при значительном содержании их в клетках имеют богатый фракционный состав. По жирнокислотному составу липиды Rh. rubra сходны с арахисовым маслом, a Cr. laurentii — с жирами животного происхождения. Преобладающими жирными кислотами являются олеиновая, линолевая и пальмитиновая.

5. Биомасса клеток обоих штаммов дрожжей выгодно отличается от биомассы продуцентов кормового белка более низким содержанием нуклеиновых кислот.

6. По содержанию макро- и микроэлементов исследуемые культуры сходны с пищевыми и кормовыми дрожжами. Клетки Cr. laurentii отличаются более высоким содержанием калия, натрия и железа.

7. Термоинактивация дрожжей сопровождается увеличением содержания в клетках белка и небольшими потерями ряда низкомолекулярных соединений и биополимеров (свободных аминокислот, витаминов, каротиноидов, гликогена, нуклеиновых кислот), мало влияя на соотношение аминокислот в составе белков, содержание свободных и связанных липидов, их фракционный и жирнокислотный состав. Влияние термоинактивации на химический состав клеток более выражено в случае Rh. rubra при биосинтезе родэксмана, сопровождающемся закислением питательной среды, разрыхлением участков клеточной стенки и нарушением структуры цитоплазматической мембраны.

8. Биомасса клеток дрожжей как отход производства экзогликанов родэксмана и крилана представляет интерес для сельского хозяйства и других областей.

8.1. Благоприятный аминокислотный состав и хорошая перевари-ваемость белков Rh. rubra и Cr. laurentii, наличие в клетках других физиологически активных веществ (каротиноидов, водорастворимых витаминов, липидов, богатого набора макро- и микроэлементов) при низком содержании нуклеиновых кислот и отсутствии токсичности позволяют рекомендовать биомассу клеток этих дрожжей для использования в качестве добавок к кормам сельскохозяйственных животных.

8.2. Полисахариды капсулы Cr. laurentii представляют интерес как высоковязкие продукты, а биомасса клеток — как биосорбент для иммобилизации ионов тяжелых металлов.

8.3. Клетки исследуемых дрожжей могут служить источником суммарных липидов и их отдельных фракций (жирных кислот, стеринов) для использования в промышленности.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Тихомирова О. М., Витовская Г. А., Блинов Н. П. Содержание нуклеиновых кислот, макро- и микроэлементов в клетках Rhodotorula rubra (Demme) Lodder и Cryptococcus laurentii (Kufferath) Skinner // Ми-кол. и фитопатол.— 1994.— Т. 28, вып. 3.— С. 40—44.

2. Тихомирова О. М., Витовская Г. А. Липиды Rhodotorula rubra (Demme) Lodder и Cryptococcus laurentii (Kufferath) Skinner — продуцентов внеклеточных полисахаридов Н Микол. и фитопатол.—1994.— Т. 28, вып. 5,—С. 36—41.

3. Тихомирова О. М. Химический состав дрожжей Rhodotorula rubra и Cryptococcus laurentii — продуцентов биологически активных эк-зополисахаридов И Химия и технология лекарственных веществ: Тез. докл. Всерос. конф., С.-Петербург, 28—30 июня 1994 г.— С.-Петербург, 1994,—С. 30.

Выражаем глубокую благодарность за помощь, оказанную при выполнении диссертационной работы, доктору химических наук И. Г.Зенкевичу.