Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Дрожжевая микрофлора кожи и респираторного тракта человека при аллергических заболеваниях
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Арзуманян, Вера Георгиевна
1.ВВЕДЕНИ Е.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Дрожжи - таксономия, идентификация, рольв экологии и патологии Человека.
Глава 2.1. Современные представления о таксономии и классификации дрожжей.
2.1.1. Коротко об истории дрожжей.
2.1.2. Зимология как раздел микологии.
2.1.3. Современное определение понятия "дрожжи".
Глава 2.2. Дрожжевая микрофлора в норме и при патологии.
Значение в экологии Человека.
2.2.1. Клинически значимые дрожжи.
2.2.2. Дрожжи Candida albicans и Malassezia spp.
Глава 2.3. Дрожжи и аллергия.
2.3 1. Аллергические заболевания, ассоциированные с дрожжевой микрофлорой.
2.3.2. Дрожжевые аллергены - природа, способы получения и использование.
Глава 2.4. Идентификация клинически значимых дрожжей.
2.4.1. Современные методы идентификации дрожжей.
2.4.2. Схема видовой идентификации липофильных дрожжей рода Malassezia.
2.4.3. О схемах и тест-системах для идентификации клинически значимых нелипофильных дрожжей.
Глава 2.5. Противогрибковые препараты для элиминации дрожжевой микрофлоры.
2.5.1. Традиционные антифунгальные препараты - группы и механизмы действия на клетки дрожжей.
2.5.2. Новые антимикотики и способы элиминации дрожжевой микрофлоры.
Глава 2.6. Заключение по обзору литературы.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 3.1. Материалы и методы исследования.
Глава 3.2. Схема родовой идентификации клинически значимых дрожжей.
3.2.1. Схема идентификации.
3.2.2. Описание основных тестов.
Глава 3.3. Разработка алгоритма обследования пациентов на дрожжевую флору кожи и бронхиального секрета.
3.3.1. Методы посева и учета микрофлоры кожи, режимы культивирования на плотных средах.
3.3.2. Методы посева и учета микрофлоры бронхиального секрета, режимы культивирования на плотных средах.
3.3.3. Метод микроскопии материала ногтевых пластинок.
3.3.4. Оценка эффективности двух стандартных питательных сред.
3.3.5. Методы коллекционирования и хранения изолятов.
Глава 3.4. Исследование дрожжевой микрофлоры у пациентов с аллергическими заболеваниями: частота встречаемости и обсемененность.
3.4.1. Родовой и видовой состав дрожжевой флоры кожных покровов в норме и при атопическом дерматите.
3.4.2. Родовой и видовой состав дрожжевой микрофлоры бронхиального секрета при аллергическом бронхо-легочном микозе и бронхиальной астме.
Глава 3.5. Оценка чувствительности дрожжей к ряду противогрибковых препаратов: минимальные ингибирующие концентрации; фунгицидный и фунгистатический эффект:.
3.5.1. Аскомицетные дрожжи рода Candida.
3.5.2. Нелипофильные базидиомицеты - Rhodotorula, Cryptococcus, Trichosporon.
3.5.3. Липофильные базидиомицеты Malassezia.
3.5.4. Новый метод определения целостности цитоплазматической мембраны клеток эукариот.
Глава 3.6. Новые свойства дрожжей рода Malassezia.
3.6.1. Экстремальная галотолерантность и способность к росту в микроаэробных условиях.
3.6.2. Устойчивость к детергентам и термотолерантность.
3.6.3. Киллерная активность.
Глава 3.7. Микробиологические основы технологии получения аллергенсодержащего препарата из дрожжей
Malassezia.
3.7.1. Разработка синтетических питательных сред и скрининг быстро растущих штаммов.
3.7.2. Разработка метода избирательной экстракции аллергенных белков и проверка их сенсибилизирующей активности.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Дрожжевая микрофлора кожи и респираторного тракта человека при аллергических заболеваниях"
Актуальность проблемы
Двадцать первый век считают "золотым веком" клинической микологии, поскольку на фоне растущего числа вторичных иммунодефицитных состояний все более широкое распространение получают заболевания, ассоциированные с грибковой микрофлорой [Саттон Д. с соавт., 2001]. Основными областями современной медицинской микологии являются: полезные и токсичные вторичные метаболитов грибов; микозы - инфекционные болезни, вызываемые или ассоциированные с микроскопическими грибами; аллергические заболевания грибковой этиологии. Различают внешние (экзогенные) и внутренние (эндогенные) источники возникновения микогенной аллергии. Экзогенными резервуарами грибковых аллергенов являются пища и воздух, насыщенные спорами грибов. В комплексе экзогенных аллергенов доминирующее положение занимают плесневые грибы. Эндогенное поступление аллергенов обусловлено персистенцией грибов в организме носителя, причем значительную часть этой микофлоры составляют дрожжи - одноклеточные грибы, принадлежащие к аско- и базидиомицетам, размножающиеся в вегетативной стадии почкованием или делением и не имеющие половых структур, заключенных в плодовые тела [Kurtsman С.Р., Fell J.W., 1998]. Аллергенность плесневых грибов изучают давно и очень интенсивно [Адо А.Д., 1963; Пастернак Н.И., 19661975; de Hoog G.S., 1995], в то время, как о дрожжах больше информации накоплено в связи с микозами.
Из 36 видов клинически значимых дрожжей роль в провокации аллергических заболеваний достоверно установлена лишь для трех 6 наиболее известных видов - Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae и Malassezia furfur. С эндо- и экзогенной сенсибилизацией к этим видам связаны такие заболевания, как бронхиальная астма (БА) [Пронина Е.В., Караев 3, 1990; Jaw-Ji Tsai, 1999; AkiyamaK., 2000], аллергический бронхолегочный микоз (АБЛМ) [Roig Е., 1997], атопический дерматит (АД) [Kortekangas О., 1993; Zargari А., 1997, 1999; Мокроносова М.А.,1999] и аллергический ринит [Yang К., 1996]. Публикации, посвященные изучению дрожжевой сенсибилизации, связаны исключительно с оценкой иммунологических параметров, в то время видовой /родовой пейзаж дрожжевой микрофлоры при данных нозологических формах, подробно исследованный у прочих категорий больных, до сих пор остается вне поля зрения микробиологов [Seebacher С., 1971; Sonck С.Е., 1979]. Очевидно, что причина столь малой выборки аллергически значимых видов (3) из общего количества оппортунистических дрожжей (36) связана с отсутствием данных о родовом/ видовом составе и частоте встречаемости дрожжей, выделяемых от больных аллергическими заболеваниями и здоровых носителей. Получение данных о родовом/ видовом составе должно, с одной стороны, способствовать расширению спектра диагностических дрожжевых аллергенов, с другой - выбору более адекватных противогрибковых препаратов.
Важнейшими этапами, предшествующими лечению больных с установленной грибковой сенсибилизацией, являются: выяснение местонахождения источника аллергена, его идентификация и in vitro подбор препарата для его элиминации. Как правило, источник дрожжевых аллергенов локализуется на коже, слизистых оболочках или в кишечнике больного, иногда, в его жилище или пище. Для решения этого 7 вопроса необходимо произвести посев, а, в случае обнаружения дрожжей -количественно оценить обсемененность клинического материала. В литературе описаны методы забора проб с поверхности кожи и из респираторного тракта [Нобл У., 1986; Метод.рекоменд.,1981], однако, в случае АД необходимо выбрать адекватный способ и адаптировать его к условиям лаборатории клинический аллергологии. Данные по частоте встречаемости дрожжей у здоровой части человеческой популяции в литературе имеются [Seebacher С. et al, 1971], однако, нет сведений о количествах высеваемых микроорганизмов с поверхности кожи, что необходимо для установления норм носительства у здоровых людей.
Методы видовой идентификации дрожжей, постоянно совершенствующиеся и многоуровневые, используются сегодня в основном в научной, а не в клинической зимологии [ Бабьева И.П., 1979; Yarrow D., 1998]. В клинической микологии - отечественной и зарубежной - большой популярностью пользуются коммерческие тест-системы [Dupont В. et al, 1991; Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В., 2000]. На наш взгляд упрощенные схемы для видовой идентификации, лежащие в их основе, не могут дать качественного результата, поскольку разнообразие видов, встречающихся в клинике, выходит за рамки числа видов, заложенных в тест-системы [de Hoog G.S., 1995]. Кроме того, тест-системы дороги и имеют ограниченный срок годности. Полагаем, что клинике нужна схема родовой идентификации, причем составленная так, чтобы в случае необходимости ее можно было бы расширить для определения видов Cryptococcus neoformans и Candida albicans.
Показано, что у больных АД противогрибковая терапия дает значительный положительный эффект [Самуйлова Т.Л., 1998; Мокроносова М.А., 1999]. Большой разброс в величинах минимальных 8 ингибирующих концентраций (МИК ) для разных штаммов одного вида свидетельствует в пользу того, что использование опубликованных величин МИК даже при наличии информации о виде полученного изолята не является гарантией успешного лечения [Ghannoum М.А., Rice L.B., 1999; Саттон Д. с соавт., 2000]. Очень важно располагать доступным методом определения МИК каждого причинно-значимого штамма. Тест-системы для определения чувствительности грибов к антимикотикам уже существуют (например, Fungitest, Sanofi-Paster), однако они дороги и содержат ограниченный набор препаратов. Модификация методов определения чувствительности, позволяющая проверить любой доступный препарат, не прибегая к помощи тест-систем, была бы очень полезна в клинической практике.
Для успешной диагностики аллергий, ассоциированных с дрожжевой микрофлорой, необходимо располагать набором очищенных и стандартизованных дрожжевых аллергенов. На данный момент у нас в стране производят препараты аллергенов лишь из дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans [Лукашков В.М. с соавт., 1984,1987; Фрадкин В.А., 1990], причем способы их получения направлены в основном на выделение компонентов клеточных стенок - маннопротеинов - которые ответственны за перекрестную аллергенную реактивность между различными родами дрожжей [Savolainen J. et al, 1992]. В то же время известны антигенные эпитопы, специфические для каждого вида: это кислая протеаза С.albicans [AkiyamaK. et al, 1994, 1996, 2000] и поверхностные белки клеток Malassezia [Zargari А., 1997, 1999]. Описаны способы получения аллергена из Malassezia либо путем деструкции клеток, в результате чего экстракт обогащается неспецифическими маннановыми компонентами [Zargari А. et al, 1994], либо с помощью 9 сложных и дорогостоящих рекомбинантных методов, не обеспечивающих полного набора специфических белков [га^ап А. е1 а1,1999].
Целесообразна разработка простого метода, позволяющего получать стандартный аллергенный препарат из биомассы дрожжей МакввегАа.
Очевидна актуальность и своевременность проведения комплексных систематических, микробиологических, исследований, направленных на выделение, установление родовой/видовой принадлежности и частоты встречаемости дрожжей у здоровых носителей и больных аллергическими заболеваниями, а также подходов к разработке технологии получения стандартного отечественного диагностического аллергенного препарата из дрожжей рода Ма1а88ег1а.
Цель работы:
Комплексное исследование дрожжевой микрофлоры, выделяемой от клинически здоровых носителей и больных с кожными и бронхолегочными аллергическими заболеваниями: таксономическая идентификация, определение частоты встречаемости, степени обсемененности и чувствительности к антимикотикам.
Задачи исследования:
- разработка алгоритма обследования пациентов на дрожжевую флору кожи;
- определение норм носительства дрожжей на коже;
- разработка модифицированного набора тестов и схемы родовой идентификации клинически значимых дрожжей;
- изучение родового/видового разнообразия и частоты встречаемости дрожжей на коже и в бронхиальном секрете;
10
- создание музейной коллекции культур дрожжевой флоры человека;
- определение чувствительности изолятов дрожжей к набору противогрибковых препаратов;
- создание синтетических сред для культивирования Ма1аз8ег1а врр.;
- разработка микробиологических основ технологии получения новых дрожжевых аллергенов на примере препарата из дрожжей рода Ма1аз8е21а.
Научная новизна:
Впервые показано, что при АД имеет место статистически достоверное превышение частоты встречаемости нелипофильных дрожжей кожной локализации (30%) по сравнению с таковой у здоровых людей ( 4.7% ; р < 0.001). Обнаружена зависимость контаминации кожных покровов липофильными дрожжами рода Ма1аз8е21а от возраста, половозрелости и заболеваемости АД.
Впервые проведены валидные исследования таксономической принадлежности дрожжевой микрофлоры при аллергических заболеваниях: определен количественный и качественный состав родов и видов дрожжей, специфичный для кожных покровов больных АД и отделяемого бронхов у больных БА и АБЛМ.
Предложены новые подходы для разработки диагностического аллергенного препарата, содержащего специфические поверхностно-клеточные аллергенные белки дрожжей Ма1аз8е21а. Показано, что 28% больных АД имели антитела класса к данному препарату.Обнаружена прямая корреляция между уровнями специфических антител классов и к разработанному препарату у больных АД.
11
Установлена обратная взаимосвязь между степенью обсемененности бронхиального секрета больных БА и АБЛМ дрожжевой микрофлорой и наличием специфических IgE-AT к коммерческому препарату из Candida albicans (кандидину).
Дана характеристика фунгицидной/ фунгистатической активности 10 противогрибковых препаратов в отношении 76 полученных культур аско- и базидиомицетных дрожжей.
Обнаружены неизвестные ранее свойства дрожжей рода Malassezia, способствующие их выживанию на кожных покровах и естественной селекции: экстремальная галотолерантность (способность к росту при 0 -16% NaCl), термотолерантность (сохранение жизнеспособности при 50°С), способность к росту в микроаэробных условиях, устойчивость к ряду детергентов, наличие киллерной активности в отношении особей того же рода.
Практическая значимость
Разработан алгоритм обследования пациентов на дрожжевую флору кожи, заключающийся в контактном способе посева нелипофильных дрожжей или посева методом смыва липофильных дрожжей непосредственно на плотные модифицированные среды, оценке полученных результатов с помощью разработанных для здоровых людей норм носителъства, идентификации изолятов до уровня рода с помощью схемы.
Разработана схема родовой идентификации (на основе модифицированного набора тестов) клинически значимых дрожжей, позволяющая идентифицировать наиболее распространенные рода -Candida, Rhodotorula, Cryptococcus, Trichosporon, Geotrichum,
12
ЗассЬаготусеБ, Ма1аз8ег1а, а также вид С.аИжаш. Создана и поддерживается коллекция клинически значимых дрожжей кожной и бронхолегочной локализации.
Разработан простой и поддающийся стандартизации метод получения кандидата в аллергенные препараты из дрожжей рода Ма1а88е21а, заключающийся в создание синтетических и полусинтетических сред, скрининге культуры-продуцента по скорости роста и урожаю биомассы, избирательной экстракции поверхностных белков клетки, оценке данного препарата на наличие аллергенных белков и сенсибилизирующей активности.
Модифицирован способ оценки чувствительности дрожжевых изолятов и определения величин МИК, заключающийся в использовании синтетических сред и рН-индикатора. Установлены величины МИК для 36 изолятов базидиомицетных дрожжей.
Разработан количественный метод оценки целостности цитоплазматической мембраны клеток эукариот, который позволяет избежать применения традиционного проточного цитофлуориметра и состоит в учете количества красителя, поступающего в клетки через поры в мембране.
Внедрение результатов работы в клиническую практику
Разработанный алгоритм обследования пациентов на наличие дрожжевой микрофлоры, разработанная схема родовой идентификации изолятов, а также модифицированный способ определения чувствительности культур используются на практике в работе Лаборатории клинической микробиологии НИИВС имени И.И.Мечникова РАМН. Подготовлена и передана на утверждение в ГИСК нормативная
13 документация на среду N 2 ПД, используемую для первичного высева нелипофильных дрожжей, и ведется подготовка к выпуску данной среды на предприятии АО "Биомед" (Петрово-Дальнее). Подготовлены, утверждены на Ученом Совете НИИВС им.Мечникова и переданы на дальнейшее утверждение Методические рекомендации « Определение кокковой и дрожжевой микрофлоры у больных с кожной патологией».
Основные положения, выносимые на защиту
1. Впервые описан родовой/видовой состав и частота встречаемости дрожжей, выделяемых с кожи клинически здоровых людей и из органов-мишеней пациентов с кожными (АД) и бронхолегочными (БА и АБЛМ) аллергическими заболеваниями.
2. Разработаны микробиологические основы получения аллергенсодержащего препарата из дрожжей рода Malassezia путем использования новых синтетических сред, быстрорастущей и продуктивной культуры и метода избирательной экстракции поверхностных белков клетки.
3. В экспериментах in vitro выявлены существенные различия в фунгицидной активности ряда противогрибковых препаратов по отношению к родам Candida, Rhodotorula, Cryptococcus, Trichosporon и Malassezia
4. Обнаружены ранее неизвестные адаптационные свойства дрожжей рода Malassezia: экстремальная галотолерантность, термотолерантность, способность к росту в микроаэробных условиях, устойчивость к
14 некоторым детергентам, наличие киллерной активности в отношении особей того же рода.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на заседаниях Ученого Совета НИИВС им.И.И.Мечникова (1999, 2000); на ежегодных Национальных конгрессах РААКИ (Москва 1997, 1998); на ежегодных Международных Симпозиумах по дрожжам ISSY в Бледе (Словения, 1997) и Львове (Украина, 2001); на ежегодном Международном конгрессе ICACI в Канкуне (Мексика, 1998); на 13 Международном Конгрессе Венгерского микробиологического общества в Будапеште (Венгрия, 1999); на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Москве (март 2002); на I Съезде микологов «Современная микология в России» (Москва, апрель 2002).
15
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Арзуманян, Вера Георгиевна
5. ВЫВОДЫ
1. Разработан алгоритм обследования пациентов на дрожжевую флору кожи, заключающийся в контактном способе посева нелипофильных дрожжей или посеве методом смыва липофильных дрожжей непосредственно на плотные модифицированные среды, сравнении полученных результатов с установленными для здоровых людей нормами носительства, а также идентификации изолятов и определении их чувствительности к антимикотикам.
2. Разработана новая схема родовой идентификации клинически значимых дрожжей, включающая 4 стадии и позволяющая идентифицировать 7 родов наиболее известных клинически значимых дрожжей - Candida, Rhodotorula, Cryptococcus, Trichosporon, Geotrichum, Saccharomyces, Malassezia, а также вид C.albicans.
3. Определена частота встречаемости дрожжей в органах-мишенях больных аллергическими заболеваниями. Показано, что у больных АД в 30% случаев на коже встречались нелипофильные дрожжи в количествах, превышающих норму (по сравнению с 4.7% в группе здоровых людей, р < 0.001). Встречаемость липофильных дрожжей рода Malassezia у детей с АД отмечена в 40 % случаев при отсутствии у здоровых детей (р < 0.05); у взрослых с АД - в 61.5% случаев (у здоровых - 82.4 %; р < 0.20). В отделяемом бронхов у больных БА и АБЛМ дрожжи встречались в 74.3 % случаев.
216
4. Впервые описано родовое/ видовое разнообразие дрожжей у больных АД, БА и АБЛМ. Показано, что на коже у больных АД нелипофильная дрожжевая микрофлора была представлена в основном родами Candida ( 48-49% всех изолятов ), Rhodotorula (25- 29%), Cryptococcus (7.4-14%), Trichosporon (3.7- 4.6%) и Debaryomyces (2-11%), Saccharomyces (2%). В отделяемом бронхов у больных БА и АБЛМ родовой пейзаж представлен родами: Candida (76%), Rhodotorula (9.5%), Kluyveromyces (9.5%) и Saccharomyces (4.8%).
Установлено, что в бронхиальном секрете доминирующим являлся вид Candida albicans, однако встречались C.glabrata, C.haemulonii, C.versatilis и C.zeylanoides, Rhodotorula rubra и R.glutinis; редко Kluyveromyces marxianus и Saccharomyces bayanus. На коже видовой состав отличался большим разнообразием: С. albicans, C.apis, C.azyma, C.bombicola,
C.haemulonii, C.terebra, C.versatilis; Raurantiaca, R.glutinis, R.minuta, R.mucilaginosa, Cr.albidus, T.ovoides, D.hansenii,
D.polymorphus, M.sympodialis, M.globosa. Полученные чистые культуры сохраняются в коллекции.
5. Разработаны синтетические и полусинтетические среды для культивирования дрожжей рода Malassezia (оптимальные для вида M.sympodialis). Среди полученных изолятов отобрана культура, обладающая наиболее высокой скоростью роста и урожаем биомассы.
6. Разработан простой, недорогой и поддающийся стандартизации метод получения потенциального аллергенного препарата из дрожжей рода Malassezia, основанный на избирательной
217 экстракции поверхностных белков клетки. Показано, что данный препарат содержит причинно-значимые аллергенные белки молекулярной массой 36 и 67 кДа. Установлено, что 28% больных АД имели антитела класса IgE к данному препарату. Обнаружена прямая корреляция между уровнями специфических антител классов IgE и IgG к данному препарату.
7. Установлена обратная корреляция между обсемененностью бронхиального секрета дрожжевой микрофлорой и уровнем специфических IgE-AT к коммерческому препарату из Candida albicans в сыворотках больных БА и АБЛМ.
8. Изучена чувствительность 76 полученных культур дрожжей к 10 противогрибковым препаратам. Установлены величины МИК для базидиомицетных дрожжей. Показано, что длительная инкубация клеток дрожжей с антифунгальными препаратами приводит к снижению чувствительности. Определены антимикотики, обладающие наиболее выраженным фунгицидным эффектом - это мирамистин, пимафуцин, нитрофунгин, а для дрожжей рода Candida - еще и дифлюкан.
9. Обнаружены новые свойства дрожжей рода Malassezia: экстремальная галотолерантность, термотолерантность, способность к росту в микроаэробных условиях, устойчивость к некоторым детергентам, наличие киллерной активности в отношении особей того же рода.
Ю.Разработан количественный метод оценки целостности цитоплазматической мембраны клеток эукариот.
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Дрожжи являются неотъемлемой составляющей в жизни человека - без них невозможны важнейшие биотехнологические процессы хлебопечения и виноделия, пиво- и сыроварения. В этих процессах задействованы, в основном, дрожжи-сахаромицеты, однако, спектр известных на сегодня истинных дрожжей включает свыше 700 видов более 100 родов. Большая часть этих дрожжей обитает в природных экосистемах, но некоторые из них ассоциированы с различными заболеваниями человека. На данный момент насчитывают 9 родов (36 видов) клинически значимых дрожжей [de Hoog G.S., 1995], некоторые из которых принимают участие в развитии заболеваний аллергического характера.
Наиболее распространенными аллергическими заболеваниями, ассоциированными с дрожжевыми аллергенами, являются бронхиальная астма и атонический дерматит [Пронина Е.В., Караев З.О., 1990; Savolainen J., 1990; Nermes M., 1994; Kawano S., 1995; Belchi-Hernandes J., 1996; Jaw-Ji Tsai, 1999; Мокроносова M.A., 1999; Akiyama K., 2000]. В развитии этих заболеваний описано участие нелипофильных дрожжей родов Candida, Saccharomyces и липофильного рода Malassezia. Установлено, что дрожжи рода Candida, выделяемые со слизистых оболочек и кожи человека, могут индуцировать формирование гиперчувствительности немедленного типа у людей с заболеваниями атопического генеза. У 29-86% больных бронхиальной астмой (БА) клеточные компоненты Candida albicans являются причинно-значимыми аллергенами [Караев З.О., 1986; Гумерова A.M., 1989 ; Savolainen J., 1990; Ishiguro A., 1992;
Balantyne D.S., 2000; Kustrzeba-Wojcicka I., 2000]. Для больных атопическим дерматитом (АД) показано, что важное место в структуре сенсибилизирующих аллергенов занимают дрожжи Candida albicans и Malassezia furfur [Savolainen J., 1990; 1993; Kortekangas O., 1993; Zargari A., 1997,1999; Мокроносова M.A., 1999].
Аллергены дрожжей могут поступать в организм человека извне (вдыхание, прием с пищей) или путем постоянной утилизации метаболитов культур, носителем которых он является. Для больных БА дрожжи рода Saccharomyces описаны как внешняя причина сенсибилизации [Belchi-Hernandes J., 1996], a Candida albicans - как эндогенный источник аллергена, локализованный примущественно в бронхах [Пронина Е.В., Караев З.О., 1990]. В случае АД основным источником формирования сенсибилизации к Candida albicans считают желудочно-кишечный тракт и, возможно, кожу [Savolainen J., 1990,1993]; а к Malassezia furfur - только кожу [Kawano S., 1995; Scalabrin D., 1999]. Известно, однако, что число видов дрожжей, ассоциированных с инфекционными бронхо-легочными заболеваниями, не ограничивается C.albicans. Видовое разнообразие дрожжей, способных колонизировать кожу при поверхностных микозах, также исчисляется десятками видов [Seebacher S., 1971; Sonck С.Е., 1979; de Hoog G.S.,1995; Ahearn D.G., 1998; Саттон Д., 2001]. Липофильные дрожжи рода Malassezia - это облигатные комменсалы человека, причем число известных видов достигает 7. При сопоставлении всех этих данных представляется маловероятным участие лишь видов Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans и Malassezia furfur в развитии указанных аллергических заболеваний. Первым и наиболее важным с нашей точки зрения этапом при исследовании участия прочих видов
197 дрожжей в сенсибилизации носителей является установление реального видового/ родового пейзажа и частоты встречаемости дрожжевой микрофлоры у больных кожными (АД) и бронхолегочными (БА и АБЛМ) аллергическими заболеваниями. Пока мы ограничились исследованием лишь органов-мишеней, поскольку именно через них происходит поступление указанных аллергенов в организм носителя. Кроме того, немаловажным моментом является наличие данных о носительстве в здоровой части популяции. Такие данные имеются лишь в отношении частоты встречаемости дрожжей на коже [Нобл У., 1986], но не об их таксономической принадлежности.
Основной идеей данного исследования явилось получение данных о видовом / родовом пейзаже дрожжей в органах-мишенях больных атопическим дерматитом (АД), бронхиальной астмой (БА) и аллергическим бронхо-легочным микозом (АБЛМ) с целью выяснения всего разнообразия потенциальных причинно-значимых дрожжевых аллергенов для данных категорий больных. Для достижения поставленной цели в первую очередь было необходимо адаптировать методы идентификации дрожжевых грибов, известные в общей зимологии, к задачам лабораторной диагностики.
Приступив к данной работе, мы столкнулись с совершенно неожиданными трудностями: налицо имел место значительный научный и методический разрыв между общей и клинической микологией. Оказалось, что в отечественной медицинской литературе отсутствуют пособия по методам родовой идентификации клинически значимых дрожжевых грибов. Описанные в отечественной литературе методы идентификации клинических изолятов дрожжей сводятся лишь к нескольким видам
198
Candida [Реброва P.H., 1979]. Обратившись к зарубежной литературе по клинической микологии, мы обнаружили, что и там недостаточно методов, позволяющих точно определить до вида все известные на тот момент (1995-1996 годы) клинически значимые дрожжи [Hurley R., 1987; de Hoog G.S., 1995]. Поэтому пришлось воспользоваться публикациями по общей зимологии, над которыми трудились выдающиеся отечественные и зарубежные ученые [Бабьева И.П., 1979; Голубев В.И., 1980, 1992; Barnett J., Yarrow D. 1968-2000; Kurtzman C.P., 1999]. Ознакомившись с литературой no современным методам видовой идентификации дрожжей, мы обнаружили, что методы постоянно претерпевают некоторые изменения, а число родов/видов, к которым принадлежат клинические изоляты, неуклонно растет. Таким образом, с учетом результатов более ранних публикаций, пришлось остановиться на самых последних - пособии под редакцией Kurtzman и Fell [Kurtzman С.Р., Fell J.W., 1998] и компьютерной программе Barnett и Yarrow [ Barnett J., Yarrow D. 1996]. Работа по идентификации клинических изолятов дрожжей была весьма трудоемкой, а также требовала наличия обширного набора реактивов и оборудования. Выделенные изоляты нелипофильных дрожжей идентифицировали с помощью классических физиолого-биохимических и морфо-цитологических тестов [Yarrow D.,1998], результаты которых оценивали с помощью компьютерной программы Barnetf a [Barnett J. Yarrow D., 1996]. Липофильные дрожжи рода Malassezia идентифицировали методом Guillot и Gueho [Guillot J., Gueho E., 1996]. Для установления видовой принадлежности 1 изолята нелипофильных дрожжей требовалось проведение минимум 47 - 60 тестов, а липофильных дрожжей - 7 тестов.
199
Выделенные культуры коллекционировали путем замораживания в 20% глицерине (нелипофильные дрожжи) или лиофилизации (Malassezia).
Сопоставление данных литературы с собственными результатами привело нас к следующему выводу: многостадийные и сложные схемы для видовой идентификации хороши для исследовательской работы, но совершенно неприемлемы и дороги в клинической практике. Попытка использовать коммерческие тест-системы показала, что реальное видовое разнообразие богаче, чем заложенное в тест-систему. Кроме того, они имеют ограниченный срок хранения. В современных пособиях по клинической микологии, а также в тест-системах, предлагается определить вид получаемого изолята. Однако, проведенный нами анализ 5 схем ( см. главу 2.4) показал, что на основании 7- 43 проводимых тестов невозможно получить качественный результат по сравнению с классической схемой: на примере дрожжей С.albicans мы убедились, что ни одна из этих схем не дает однозначного ответа, а одна из них вообще не работает. По нашему мнению в условиях клинической лаборатории достаточно проводить родовую идентификацию, но на высоком уровне. Такой схемы в доступной литературе нами не обнаружено. Имея в виду ограниченный спектр оппортунистических родов по сравнению с остальными и при сопоставлении имеющихся классической и прочих схем видовой идентификации нами была создана удобная, достаточно точная и недорогая схема определения клинических изолятов дрожжей до уровня рода. Разработанная схема состоит из 4 стадий и позволяет, используя составленную таблицу, сравнительно быстро установить род полученного изолята. В схему заложена возможность идентификации родов Candida, Rhodotorula, Cryptococcus, Trichosporon, Geotrichum, Saccharomyces, a также вида C.albicans. Реализация схемы занимает около 1 часа, а считывание результатов проводится в течение 1-7 суток, в случае обнаружения C.albicans -1-2 суток. Для родовой идентификации дрожжей Malassezia spp. необходимо лишь проводить первичный посев на среду Диксона и убедиться в появлении колоний клеток характерной формы путем микроскопирования.
Параллельно проводилась разработка алгоритма обследования больных АД, поскольку для данной категории пациентов нет единого способа посева и учета дрожжевой микрофлоры. При этом оказалось, что наиболее приемлемым способом посева нелипофильных дрожжей с кожи пациентов является метод отпечатков в собственной модификации [ Нобл У., 1986; Bergbrant I-M.et al, 1992], а для липофильных дрожжей рода Malassezia - модифицированный нами метод смыва [Korting Н. et al, 1991]. Для посева нелипофильных дрожжей впервые были использованы очень удобные и гигиеничные контейнеры -бакпечатки («Ленмедполимер»), что дало возможность исключить из обращения дорогостоящие и, на наш взгляд, не совсем корректные для количественного учета транспортные среды. Аналогично, минуя транспортную среду, производили посевы и бронхиального секрета от больных бронхиальной астмой и аллергическим бронхо-легочным микозом. Данную субстанцию предварительно разжижали дитиотрейтолом, что дало возможность более точно производить количественный учет обсемененности. Кроме того по мере необходимости проводили микроскопирование материала ногтевых пластинок (у пациентов с подозрением на онихомикоз) [Rebell G., Taplin D., 1971]. У медицинских микологов наибольшей популярностью в качестве среды для культивирования дрожжей пользуется среда Сабуро, тогда как в общей зимологии обычно для первичного высева используют сусло-агар либо глюкозо-пептон-дрожжевую среду (ГПД). После сравнительного изучения сред Сабуро и ГПД, оказалось, что последняя является более эффективной, так как содержит полный комплекс компонентов, необходимых для роста дрожжей. Используя среду ГПД и идентифицируя полученные изоляты с помощью разработанной схемы, мы определили нормы носительства нелипофильных дрожжей на коже здоровых людей - не более 4.7% носителей при обсемененности не выше 60 КОЕ/дм дрожжами родов Candida и Cryptococcus. Таким образом, оригинальными аспектами данного алгоритма являются: посев на плотные питательные среды минуя транспортные среды; применение бакпечаток вместо чашек Петри и др.; использование полученных количественных норм носительства дрожжей на коже у здоровых лиц; использование среды ГПД вместо среды Сабуро; использование метода Rebell для микроскопирования материала ногтевых пластинок.
В отношении липофильных дрожжей Malassezia получены следующие данные: в группе из 44 здоровых индивидумов (34 взрослых старше 14 лет и 10 детей) 63.6 % явились носителями дрожжей Malassezia, причем в количестве 100-500 КОЕ/см . Преобладающим видом Malassezia был M.sympodialis (у 54% индивидуумов), хотя встречались также M.globosa ( у 6 %). Остальные изоляты не удалось идентифицировать до вида методом Guillot. Интересно отметить, что наибольшая частота встречаемости имела место у взрослых людей (82.4%). Самая высокая обсемененность отмечена у людей в возрасте 18-48 лет, тогда как у здоровых детей 6-14 лет даже при повторных посевах нам не
202 удалось обнаружить дрожжи Malassezia. Такой феномен в отношении детей описан в литературе [Faergemann J, 1980] и может быть объяснен менее различиями в составе сального секрета у детей по сравнению со взрослыми [Де Люка К., 2002].
Используя разработанный алгоритм, мы обследовали несколько групп больных АД в стадии обострения. Видовой состав нелипофильных дрожжей изучали в группе, состоящей из 91 человека. Имея в виду полученные нами нормы носительства дрожжей мы установили, что у 27% пациентов наличие нелипофильных дрожжей на коже превышало норму. Видовое и родовое разнообразие оказалось гораздо богаче, чем это можно было себе представить из данных литературы - всего 18 видов 6 родов: из полученных 27 изолятов нелипофильных дрожжей 48% приходилось на долю рода Candida, 29% - Rhodotorula, 7.4% - Cryptococcus, 11%-Debaryomyces, 3.7% - Trichosporon. Видовой состав был представлен видами: С. albicans, C.apis, C.azyma, C.bombicola, C.haemulonii, C.terebra, C.versatilis; R.aurantiaca, R.glutinis, R.minuta, R.mucilaginosa, Cr.albidus, T.ovoides, D.hansenii, D.polymorphus, Интересно отметить, что C.albicans не являлся преобладающим видом у данной категории пациентов.
При обследовании большей группы (326 человек) только на родовую принадлежность носительство в количествах, превышающих норму, обнаружено нами у 30% пациентов, а набор родов для 108 полученных изолятов составил: 49% культур рода Candida, 25% - Rhodotorula, 14% - Cryptococcus, 4.6% - Trichosporon, 3.7% - Aureobasidium, no 1.8 % - Debaryomyces и Saccharomyces. Таким образом, в отличие от группы здоровых людей, у пациентов с
АД мы обнаружили значительное разнообразие видов и родов нелипофильных дрожжей, а также большую обсемененность.
Группа в количестве 23 пациентов (13 взрослых и 10 детей) с АД была обследована на предмет носительства и видового состава липофильных дрожжей Malassezia. Оказалось, что 52.2% пациентов являлись носителями. Причем ими были 61.5% взрослых пациентов и 40% детей. Преобладающим видом, как и у здоровых носителей, являлись M.sympodialis (у 28% обследованных), однако встречались также M.globosa ( у 14% пациентов). Таким образом, существенных различий в видовом составе дрожжей рода Malassezia на коже здоровых носителей и больных атопическим дерматитом нами не обнаружено. Установлено лишь, что у людей, страдающих АД, заселение кожных покровов происходит раньше, чем у здоровых. На основании данных литературы можно заключить, что состав выделяемых при АД липидов - пониженное содержание сквалена и повышенный уровень холестерина и его эфиров -способствует более раннему заселению кожных покровов этими дрожжами [Де Люка К., 2002].
В литературе описано участие лишь трех родов дрожжей -Candida, Saccharomyces и Malassezia - в аллергических процессах у больных АД [Kortekangas-Savolainen О., 1993; Nermes М., 1994; Broberg А., 1995; Scalabrin D.,1999]. На основании полученных нами данных можно предположить, что гораздо большее число родов дрожжей может быть задействовано в качестве источника аллергенов у атопических больных.
К аналогичному выводу мы пришли также после обследования больных бронхиальной астмой (БА) и аллергическим бронхолегочным микозом (АБЛМ). Из группы в 21 человек 80.9% являлись носителями дрожжей в бронхах. Большая часть изолятов
204
76%) представлена родом Candida, 9.5% - Rhodotorula, 9.5% -Kluyveromyces, 4.8% - Saccharomyces. Видовое разнообразие было следующим: C.albicans, C.glabrata, C.haemulonii, C.versatilis и C.zeylanoides, Rhodotorula rubra и R.glutinis; Kluyveromyces marxianus и Saccharomyces bayanus. Характерным для данной категории больных явилось значительное преобладание вида C.albicans (47.6 %) среди прочих видов. После увеличения группы обследованных до 36 человек, было уточнено количество носителей дрожжей в бронхах -74.3%. В литературе в связи с БА и АБЛМ встречаются ссылки лишь на рода Candida и Saccharomyces [Shen H.D., 1989; Пронина Е.В., Караев З.О., 1990; Savolainen J., 1990; Belchi-Hernandes J., 1996; Jaw-Ji Tsai, 1999; Akiyama K., 2000]. Если учесть, что Kluyveromyces spp. это телеоморфа (половая форма) Candida, то лишь род Rhodotorula впервые обнаружен нами у указанных категорий пациентов. Дрожжи рода Rhodotorula настолько часто встречаются в бронхах у других категорий пациентов с бронхо-легочной патологией, подвергшихся бронхоскопии, что эти микроорганизмы предложено даже считать маркером нестерильности бронхоскопического оборудования [Whitlock М. et al, 1992; Hagan М. et al, 1995]. Сродство Rhodotorula к данной эконише можно объяснить их облигатной аэробностью.
Обобщая полученные данные, можно заключить, что число видов/родов дрожжей, обнаруженных нами в органах-мишенях обследованных категорий больных, значительно превышает три основных вида причинно-значимых источников аллергенов, которые описаны в литературе.
Известно, что полисахариды клеточных стенок многих родов дрожжей содержат перекрестно реагирующие эпитопы, с которыми взаимодействуют антитела класса IgE у атопических больных [Savolainen J., 1992; Kanbe Т., 1997]. Тем не менее для дрожжей родов Candida и Malassezia выявлены специфические антигены белковой природы, которые являются причинно-значимыми аллергенами [Ishiguro А., 1992; Yasueda Н., 1998; Akiyama К., 1996, 2000]. Исходя из полученных данных можно предположить, что подобные белки имеют место также у дрожжей родов Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon и прочих. Однако поиск таких веществ, установление их природы и места локализации в клетке, а также доказательство их причинной значимости будет отдельной и весьма трудоемкой задачей. В настоящей работе нами предприняты попытки оценить взаимосвязь между носителъством наиболее часто встречающегося компонента экосистемы и уровнем сенсибилизации к полученному из него аллергену. Такими компонентами являются Candida albicans для больных бронхолегочными заболеваниями и Malassezia spp. для больных АД.
У 14 пациентов в возрасте 29 - 63 лет с Б А и АБЛМ, являющихся носителями дрожжей в бронхах, методом твердофазного ИФА в сыворотке крови были определены уровни иммуноглобулинов класса Е (IgE-AT) к коммерческому препарату из C.albicans - «кандидину». Данный препарат является гликопротеидом с основным компонентом в виде полисахарида клеточных стенок - маннана [Фрадкин В.А., 1990]. Оказалось, что у 4 человек не обнаружено IgE-AT к «кандидину», причем именно у них обсемененность бронхиального секрета дрожжами составила 950-2900 КОЕ/мл; у 8 - уровень IgE-AT соответствовал 1 классу реакции в ИФА, а обсемененность - 20-700 КОЕ/мл ; у 2 - IgE-AT 2 класса, обсемененность - 20-650 КОЕ/мл. То есть, между обсемененностью бронхиального секрета дрожжами и уровнем
206 специфических IgE-AT к «кандидину» имела место обратная корреляция (р = - 0.707). На наш взгляд этот результат свидетельствует в пользу того, что при обследовании пациентов с бронхолегочными аллергическими заболеваниями нельзя пользоваться нормами носительства, принятыми в обычной микологической практике. Даже невысокая степень носительства для данной категории больных может являться причиной обострения заболевания. К сожалению, мы не располагаем аллергенным препаратом из С.albicans, в котором содержатся только индивидуальные, а не перекрестные эпитопы, более специфичные в отношении слизистых оболочек. Возможно, наличие такого препарата уточнило бы результат исследования.
Чтобы провести подобное исследование среди больных АД, необходимо иметь аллергенный препарат из дрожжей рода Malassezia. Разработка такого препарата была начата нами с получения чистых культур Malassezia spp., создания синтетических и полусинтетических сред для их культивирования и скрининга быстрорастущих штаммов. При разработке сред нами использован известный в общей микробиологии экологический подход, когда моделируется состав компонентов, наиболее характерных для естественной среды обитания микроорганизмов. Мы учли состав человеческого мерокринного пота, определили значимость наиболее важных компонентов и создали среды, в которых культуры Malassezia spp. росли с достаточно высокой скоростью. Наконец был отобран штамм- продуцент, обладавший максимальной скоростью роста на разных средах и самым широким диапазоном ростовых температур.
На основании данных литературы о белковой природе причинно-значимого аллергена Malassezia и месте его локализации в клетке [Zargari А., 1998], нами был разработан простой и поддающийся стандартизации метод экстракции аллергенной субстанции. За основу метода нами был принят неординарный бактериологический прием избирательной экстракции поверхностных белков клетки с помощью детергента [Lortal S.,1992]. Интересно отметить, что после обработки клеток Malassezia подобранным детергентом (SDS) они полностью сохраняли жизнеспособность и целостность цитоплазматической мембраны. Наличие искомых белков (36 и 67 к Да) и активность экстракта проверяли методом гель-электрофореза, дот-блот анализа и ИФА с сыворотками крови пациентов с АД. Показано, что полученный белковый препарат содержал искомые аллергены. В группе взрослых здоровых людей (5 человек) отмечено отсутствие специфических IgE-AT. На группе из 25 взрослых больных АД установлено, что не менее 28% пациентов имели антитела класса Е к данному препарату. Это значительно меньший процент, чем описано ранее (84%) [Мокроносова М.А., 1999], поскольку тогда был использован препарат, содержавщий, наряду с белковыми, неспецифические компоненты - маннаны. Однако в упомянутом исследовании у 26.3% пациентов с АД были выявлены IgE-AT только к Malassezia spp., что может косвенно подтверждать полученные нами данные. На наш взгляд именно такая частота встречаемости сенсибилизированных именно к Malassezia наиболее вероятна среди больных АД, поскольку, несмотря на большой процент носителей, существует много причинно-значимых аллергенов, помимо дрожжей рода Malassezia.
У 5 здоровых взрослых людей нами отмечено наличие иммуноглобулинов класса G к белковому препарату из Malassezia в невысоких титрах (от 1:16 до 1:64). Кроме того, в упомянутой выше группе больных АД (25 человек) уровень IgE-AT коррелировал с титром IgG-AT к данному препарату, который достигал значений 1:1024 (г = 0.782). Сам факт обнаружения IgG-AT у всех обследованных подтверждается частым выявлением данных дрожжей на коже взрослых людей, поскольку даже на нормальную микрофлору может фор ответ. Есть данные литературы о том, что антитела типа IgGl реагируют с теми же белками, что и IgE-AT [Zargari А., 1994]. Однако нарастание титра специфических IgG-AT к Malassezia параллельно с увеличением концентрации специфических IgE-AT обнаружено нами впервые. Этот факт может иметь большое значение при использовании будущего препарата из Malassezia для специфической иммунотерапии (СИТ).
На 10 произвольно отобранных сыворотках от пациентов Отдела Аллергологии, содержащих IgE-AT к коммерческому препарату из Candida albicans (2-3 класс), показано отсутствие в них IgE-AT к нашему препарату из Malassezia (дот-блот), но наличие IgG-AT в титрах от 1: 16 до 1 : 64. Это свидетельствует, с одной стороны, об отсутствии маннановых примесей в полученном нами препарате и перекрестных реакций между коммерческим препаратом из Candida albicans и препаратом из Malassezia; с другой стороны - о том, что формирование IgE-ответа к Candida albicans не связано с таковым к Malassezia, а титры IgG-AT у этих больных имели фоновый уровень.
По данным иммуноблоттинга полученный комплексный белковый препарат из дрожжей Ма1а88ег1а содержит аллергены, которые являются белками мол.массой 15, 36, 52-56 и 78.4 кДа.
Подводя итог вышеизложенному, можно сделать следующий вывод. Несмотря на то, что специального эксперимента по определению взаимосвязи между носителъством и наличием сенсибилизации к аллергену Ма1аззе21а нами не проводилось, однако, в разных опытах показано, что процент носителей среди взрослых пациентов с АД составил 61.5%, а доля сенсибилизированных к препарату - 28%. Таким образом, можно с большой долей вероятности считать, что носителъство МаЫБзегга на коже скорее всего является фактором, необходимым, но не достаточным для развития гиперчувствительности к этим дрожжам у пациентов с АД.
Обнаружение дрожжей у вышеупомянутых категорий больных и установление их причинной значимости в развитии аллергических заболеваний приводит к необходимости подбора средств для их элиминации. В предыдущих исследованиях был установлен положительный эффект антифунгальной терапии у 83% больных атопическим дерматитом с выявленной микогенной сенсибилизацией [Мокроносова М.А., 1999] и при наличии значительной колонизации кожи [Самуйлова Т.Л., 1998]. Разумеется, что полной элиминации дрожжей рода Ма1а88е21а с поверхности кожи добиться практически невозможно, да и не следует, поскольку они являются постоянными и небесполезными спутниками человека. Однако, в стадии обострения, когда необходимо остановить процесс, врачу приходится прибегать к противогрибковым препаратам для устранения Malassezia. Аналогично поступают и в случае заболевания пестрым лишаем и себореей, хотя применение антимикотиков дает лишь временный эффект [Ingham Е., 1993]. Методом серийных разведений в расплавленной плотной среде Диксона мы исследовали чувствительность 7 культур базидиомицетных липофильных дрожжей Malassezia к 10 препаратам, из которых наименьшими величинами МИК (минимальных ингибирующих концентраций) обладали азолы - низорал, дифлюкан, орунгал и клотримазол, что согласуется с данными литературы [Van Gerven F., 1995; Faergemann J., 1996; Strippoli V., 1997; Gupta AK, 2000]. Нами впервые изучены в этом отношении пимафуцин, нитрофунгин, 5-НОК, экзодерил и мирамистин. Все эти препараты, за исключением мирамистина, достаточно эффективно останавливали рост Malassezia spp. in vitro (МИК 16-64 мкг/мл). Однако что в диапазоне до 500 мкг/мл Malassezia spp. совсем нечувствительны к мирамистину, хотя этот препарат является сильным фунгицидом в отношении других дрожжей. Таким образом, с помощью мирамистина можно проводить селективную элиминацию дрожжей с поверхности кожи.
На 40 культурах нелипофильных аскомицетных дрожжей рода Candida и 29 культурах базидиомицетов - Rhodotorula, Trichosporon и Cryptococcus, выделенных с кожи и из бронхиального секрета, проведено исследование жизнеспособности клеток после длительной инкубации с антимикотиками. Нами модифицирован метод определения чувствительности грибов таким образом, что вместо полноценных сред была использована синтетическая среда, разработанная специально для нелипофильных дрожжей [Бабьева И.П., 1979; Yarrow D., 1998], а также рН-индикатор, изменение цвета которого свидетельствовало о росте культуры. Показано, что в результате экспозиции с большинством из изученных препаратов у клеток значительно снижалась чувствительность, по-видимому, благодаря включению адекватных механизмов защиты. Установлено, что препараты, задерживающие рост клеток дрожжей, зачастую обладали лишь фунгистатическим, а не фунгицидным действием. Фунгицидным эффектом в отношении аскомицетов Candida в наибольшей степени обладали мирамистин (57% всех культур не содержали живых клеток после 14 суток инкубации), пимафуцин (38%), нитрофунгин (26%) и дифлюкан (23%). Для базидиомицетных дрожжей родов Rhodotorula, Cryptococcus и Trichosporon были определены величины МИК 10 антифунгальных препаратов и показано, что базидиомицеты не чувствительны к азолам в концентрации <= 256 мкг/мл. В то же время наибольшим фунгицидным эффектом обладали мирамистин (ни одна культура не содержала живых клеток после длительной экспозиции) и пимафуцин (92%, 80% и 100% культур вышеупомянутых родов не содержали живых клеток).
Таким образом, очевидны различия в чувствительности между родами аско- и базидиомицетных дрожжей к антимикотикам, что еще раз доказывает необходимость родовой идентификации клинических изолятов. Однако проведенные исследования и анализ литературных данных подтвердили предположение о том, что использование только известных опубликованных величин МИК даже для идентифицированных до уровня вида дрожжей, не является гарантией успешной элиминации нежелательного компонента экосистемы. На наш взгляд важнейшей задачей клинического миколога является определение МИК каждого причинно-значимого штамма.
Несмотря на то, что некоторые проводимые в рамках данного исследования эксперименты не входили в число поставленных задач, результаты их можно считать новыми знаниями в области микробиологии. Изучены физиолого-биохимические свойства дрожжей Ма1аз8ег1а Брр., которые способствуют выживанию этих микроорганизмов в условиях их природной экосистемы - кожи человека и теплокровных животных. В ходе работы установлено, что дрожжи рода Ма1а8зег1а являются экстремально галотолерантными, поскольку способны расти при концентрации соли от 0 до 12-16%. Кроме того, они могут выживать и размножаться в микроаэробных условиях, однако, диапазон допустимых концентраций №С1 при этом сужается до 8-10%. Эти дрожжи устойчивы к воздействию некоторых детергентов, термотолерантны к температуре до 50° С.
Установлено, что Ма1а88ег1а вырабатывает киллерные соединения неизвестной природы, активные в отношении особей, по крайней мере, собственного рода. Этот феномен достаточно хорошо изучен у некоторых родов дрожжей, особенно сахаромицетов [Оо1иЬеу 1998], однако до сих пор не был показан для Ма1а88ег1а. Явление образования дрожжами токсинов различной природы, объединенное под единым названием «киллерная активность», имеет большое значение для выживания микроорганизмов в различных экосистемах. По-видимому, данное свойство необходимо также и Ма1а88ег1а Брр., и приводит, в конечном счете, к заселению кожи более быстро растущими и менее чувствительными к токсинам штаммами. Возможно, что таковые более активно экскретируют вещества, способствующие защите кожных покровов от патогенной и условно-патогенной микрофлоры.
Это явление заслуживает более глубокого изучения на молекулярном уровне.
Для оценки киллерной активности и повреждающего эффекта мирамистина нами был разработан и использован метод, позволяющий количественно оценить степень нарушения целостности цитоплазматической мембраны (ЦПМ) клеток эукариот. Метод заключается в последовательной обработке суспензий клеток эукариот изучаемым препаратом, а затем красителем, проникающим через поры в ЦПМ. В отличие от прототипа, который основан на подсчете окрашенных клеток дрожжей с помощью проточного люминесцентного микроскопа [Kurtzweilova H.et al, 1993], данный метод не предполагает отмывку красителя, а лишь регистрацию его количества, оставшегося вне клеток, с помощью обычного спектрофотометра. Применение данного метода показало, что используемые в клинике концентрации мирамистина одинаково губительны для дрожжей Candida albicans и эпителиоцитов.
Таким образом, три основных задачи настоящего исследования - получение данных о таксономическом разнообразии дрожжей у больных АД и БА, оценка чувствительности полученных дрожжевых культур к антимикотикам и разработка микробиологических основ технологии получения аллергенного препарата из Malassezia - выполнены.
214
Нам представляется, что естественным продолжением настоящей работы, выполнимым в рамках микробиологических исследований, должно стать:
1. Усовершенствование метода получения препарата из Malassezia spp. в направлении очистки от балластных компонентов поверхностных слоев клетки.
2. Изучение природы киллерных компонентов у дрожжей Malassezia spp. на молекулярном уровне и оценка их действия на дрожжи прочих клинически значимых родов.
3. Разработка на основе литературных данных метода выделения и очистки специфических аллергенных белков из дрожжей Candida albicans.
4. Поиск специфических аллергенных эпитопов у базидиомицетов Rhodotorula, Trichosporon и Cryptococcus, и изучение их способности к сенсибилизации носителей.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Арзуманян, Вера Георгиевна, Москва
1. Арзуманян В.Г. Особенности окислительного обмена этанолассимиллирующих дрожжей Candida utilis при избытке и недостатке растворенного в среде кислорода // Авт.дисс. на соиск.канд.биол.наук.-1991.
2. Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей // М. Пищевая промышленность.-1979.- С.52.
3. Благодатская В.М., Уткина Л.И., Уткин И.С. Дрожжи рода Candida Berkhout (Систематика, идентификация).- Пущино.- 1980.- С.42.
4. Бурова С.А., Буслаева Г.Н., Шахмейстер И.Я. Грибковые заболевания// Приложение к журналу «Здоровье».- 1999.- N 6.- С.22.
5. Величко Е.В. Роль адгезии в патогенезе кандидоза // Актуальные вопросы медицинской микологии: заболевания, вызванные условно-патогенными грибами.- Тез.докл. Всеросс.Симп.- 1987.-С.22-23.
6. Гальченко В.Ф., Нестеров А.И. Нумерический анализ белковых электрофореграмм облигатно метанотрофных бактерий // Микробиология.- 1981.- Т.50.-С.973-979.
7. Гервазиева В.Б., Овсянникова И.Г., Райкис Б.Н. Иммуноферментный метод определения аллергенспецифических IgE антител // В кн. Актуальные вопросы клинической и экспериментальной аллергологии.- Каунас.- 1986.- С.58-59.
8. Голубев В.И. Таксономия и идентификация дрожжевых грибов рода Cryptococcus // В серии: Биология и систематика конкретных групп микроорганизмов.- Научный центр биологических исследований АН СССР.- 1980.- С.78.219
9. Голубев В.И. Эволюция понятия «дрожжи»// Успехи современной биологии.- 1992.- Т.112.- Вып.5-6.- С.715-724.
10. Голубев В.И., Кулаковская Т.В., Голубева Е.В. Pseudozyma fusiformata ВКМ Y- 2821 продуцент антифунгального гликолипида // Микробиология.- 2001.
11. Голубев В.И., Циоменко А.Б., Тихомирова Л.П. Не содержащие плазмид штаммы-киллеры дрожжей Sporidiobolus pararoseus// Микробиология.- 1988.- Т.57.- Вып.5.-С.805-809.
12. Голубев В.И., Чуркина Л.Г. Широкое распространение штаммов-убийц у дрожжей Rhodotorula mucilaginosa (Jorgensen) Harrison. // Известия Академии наук СССР. Серия биологическая.- T. 6.-С.854-861.
13. Гумерова A.M., Молотилов Б.А., Гервазиева В.Б., Овсянникова И.Г., Глушко Н.И. Кандидозная сенсибилизация у пациентов с аллергическими заболеваниями // Иммунология,- 1989.- N 6.- С.61-63.
14. Де Люка К. Сквален как акцептор прооксидантных воздействий на кожу человека // Авт.канд.биол.наук.- Москва.- 2002.
15. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М., изд-во МГУ.1994.- С.311.
16. Елинов Н.П., Турина C.B., Ананьева Е.П. Иммунобиологическая активность гликанов в эксперименте// Микология и фитопатология.1995.- Т.29.- Вып.2,- С.39-43.
17. Захарова И .Я., Косенко Л.И. Методы изучения микробных полисахаридов. Киевю- Наукова Думка.- 1982.- С.29
18. Караваева A.B., Кашкина М.А., Огурцов Р.П. Экзогликан Rhodotorula rubra (Demme) Lodder 1889 как иммуномодулятор // Микология и фитопатология.- 1996.- Т.ЗО.- Вып.2.- С.31-34.
19. Караев 3.0. Аллергия к грибам рода Candida : Метод. Рекомендации. -Л.- 1986.
20. Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях.- М.-«Мир».-1981.-С.372.
21. Кривошеин Ю.С. Противомикробные свойства новых поверхностно-активных веществ// Авт.дисс.д-ра мед.наук.- Киев.-1985.
22. Кудрявская В.М., Руденко A.B., Пыриг Л.А. Лекарственная чувствительность Candida spp. у пациентов с заболеваниями почек, получающими иммуносуппрессивную терапию// Антибиотики и химиотерапия- 1989.- T.34.-N 10.- С.769-773.
23. Лабинская A.C. Микробиология с техникой микробиологических исследований -// «Медицина».- М.- 1978.
24. Лукашков В.М., Глушко Н.И., Шахбазова E.H., Молотилова Б.А. Изучение полисахаридного аллергена Кандида альбиканс в эксперименте и клинике// Новое в практике лабораторных исследований.- Горький- 1984.- С. 111-115.
25. Методические рекомендации. Микробиологические методы обследования пульмонологических больных // ВНИИ Пульмонологии.-Ленинград.- 1981.
26. Мокроносова М.А. Влияние Staphylococcus aureus и дрожжеподобных грибов на течение атопического дерматита // Автореф. Дисс. .докт.мед.наук. 1999.- С.19.
27. Нобл У.К. Микробиология кожи человека // М.- «Медицина».- 1986.-С.462.
28. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы// Изд-во РАМН.- Москва.- 2000.- 51 С.
29. Пронина Е.В., Караев З.О., Алферов В.П. Повышенная чувствительность к грибам рода Candida у больных бронхиальной астмой // Педиатрия.- 1990.- Вып.5.- С. 14-18.
30. Реброва Р.Н. Грибы рода Candida при бактериальных инфекциях// Медицина.- Москва.- 1979.
31. Самуйлова Т.Л. Клинико-иммунологическая характеристика больных атопическим дерматитом с сенсибилизацией к Candida albicans // Авт.дисс. .канд.мед.наук.-Москва.- 1998.
32. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно патогенных грибов // М,- «Мир» -2001 г.- 468 С.
33. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Кандидоз // Изд-во «Триада-Х».-Москва.- 2000.- С. 121.222
34. Сергеев Ю.В., Сергеев А.Ю. Онихомикозы. Грибковые инфекции ногтей // Изд-во ГЭОТАР МЕДИЦИНА.- Москва.- 1998.- С.59.
35. Свистов В.В. Мирамистин -российский антисептик с широким спектром действия // Военно-Медицинский Журнал.- 1998.- Т.319.- N 5.- С.57-59.
36. Смирнова Е.Я., Лебедин Ю.С., Сердюк O.A., Василов Р.Г. Использование моноклональных антител к IgE человека для определения уровня аллергенспецифических IgE // Ж-л микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1990.- № 9.- С. 93.
37. Толсторуков И.И., Зимина М.С., Казанцева Д.И. Киллер-фактор К2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae М437 обладает широким видовым спектром действия // Биотехнология.-1989.-Т.5.-N 3.-С.295-302.
38. Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены.// Медицина.-М.- 1990.- С.130-145.
39. Цыциков Э.Н., Втюрина И.Ю., Галанина O.E. // Биотехнология.-1988.- Т.7.- № 3.- С. 32.
40. Человек и лекарство. VII Российский Национальный Конгресс // Тезисы докладов. Москва. - 10-14 апреля 2000г .
41. Шандрль Г. Микробиология соков и вин. // М.: Пищевая промышленность.- 1967.-359 С.
42. Шлегель Г. Общая микробиология. Мир - M.- С.269.
43. Ahearn D.G. Yeasts pathogenic for humans // In: The Yeasts, A Taxonomic Study.- Elsevier.- 1998.- Ed.by KurtsmanC.P,Fell.J.W.- P.9-12.
44. Ahearn D.G., Simmons R.B. Malassezia Bâillon // The Yeasts, A Taxonomic study.- Ed. By Kurtsman C.P., Fell J.W.- Elsevier.- 1998.-P.782.
45. Akiyama K, Shida T. , Yasueda H., Saito A., Hasegawa M., Maeda Y. Takesako K., Yamaguchi H., Kato H. Assay for detecting IgE and IgG antibodies against Candida albicans cell-wall mannan.// Allergy 1998. -V.53.- N 2,- P.173-179.
46. Akiyama K. Shida T. Yasueda H. Mita H. Yamamoto T. Yamaguchi H. Atopic asthma caused by Candida albicans acid protease: case reports.// Allergy.- 1994.-V.49.- N 9.- P.778-81.
47. Akiyama K. Shida T. Yasueda H. Mita H. Yanagihara Y. Hasegawa M. Maeda Y. Yamamoto T. Takesako K. Yamaguchi H. Allergenicity of acid protease secreted by Candida albicans.// Allergy. 1996.-V.51.-N12.-P.887-92.
48. Akiyama K. The role of fungal allergy in bronchial asthma. Review.// Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi.- 2000.- V.41-N 3.- P.149-55.
49. Aly R., Maibach H.I., Bloom E. Quantification of anaerobic diphtheroids on the skin // Acta Dermatovenerol. (Stockholm).- 1978.- V.58.- P.501.
50. Ando M., Arima K., Yoneda R., Tamura M. Japanese summer-type hypersensitivity pneumonitis geographic distribution, home environment, and clinical characteristics of 621 cases // Amer.Review of Respir.Disease.-1991.-V.144.-N 4.-P.765-769.
51. Antonen P., Lehtonen O.P., Kero P. Malassezia furfur colonization of neonates in an intensive care unit.// Mycoses.- 1990.- V.33.- P.543-547.
52. Baldo B.A. Allergenic crossreactivity of fungi with emphasis on yeast: strategies for further study// Clin.Experim.Allergy.- 1995.- V 25.- P.488-492.
53. Ballantyne Denis S. Warmington John R. Purification of native enolase from medically important Candida species.// Biotechnology & Applied Biochemistry. 2000. -V.31.-N 3.-P.213-218.
54. Barnett J.A.// The fungi V.3.- Eds. Ainsworth G.C., Sussman A.S.N.Y.: Acad.Press -1968.- P.557.
55. Barnett J.A. ,Pankhurst R.J.// A new key to the yeasts. A key for identifying yeasts based on physiological tests only. Amsterdam North-Holland Publ. Co. 1974.- P.273.
56. Barnett J.A., Payne R.W., Yarrow D.// Yeasts. Characteristics and identification. Cambridge: Univ.press.- 1990.- P. 1002.
57. Barnett J.A., Payne R.W.,Yarrow D.// Yeasts: characteristics and identification. Cambridge: Univ.press.- 2000.
58. Barnett J.A., Payne R.W.,Yarrow D.: Yeast identification PC Program version 4.- 1996.
59. Bataille A., Anton M., Mollat F., Bobe M., Caramani am M.N., Geraut C., Dupas D. Respiratory allergies among symptomatic bakers and pastry cooks: initial results of a prevalency study// Allergie et Immunologie.-1995.- V 27.- N 1.- P.7-10.
60. Belchi-Hernandes J., Mora-Gonzales A., Iniesta-Perez J. Baker's asthma caused by Saccharomyces cerevisiae in dry powder form // J.Allergy and Clin. Immunol. 1996.- V. 97.- N 1(1).- P. 131-134.
61. Bergbrant I-M., Igerud A., Nordin P. An improved method for quantitative culture of Malassezia furfur // Res. Microbiol. 1992.-V.143.-P.731-735.
62. Boekhout T., Kamp M., Gueho E. Molecular typing of Malassezia species with PFGE and RAPD// Medical Mycology.- 1998.-V.36.- P.365-372.225
63. Boekhout T., Renting M., Scheffers W.A., Bosboom R. The use of karyotyping in the systematics of yeasts .//Antonie van Leeuwenhoek.-1993.- V.63.-P.157-163.
64. Borelli D. Pityriasis versicolor due to Malassezia ovalis // Mycopathologia.- 1985.- V.89.- P.147-153.
65. Broberg A. Pityrosporum ovale in healthy children, infantile seborrhoeic dermatitis and atopic dermatitis // Acta Dermato-Venereologica. Supplementum. -1995.-V. 191 .-P. 1 -47.
66. Brotherton J. Shrinking of Pityrosporum ovale in media of different osmotic pressures and its relationship with survival in the relatively dry conditions of the scalp // J.Gen.Microbiol.-1967.- V.48.- P. 305-308.
67. Capek A., Simek A., Nemcova D., Janata V.Antimicrobially active substanses . V. Antimycotic activity of quarternary ammonium salts // Folia microbiol.- 1970.- V.15.-N 5.- P.54-58.
68. Capek A., Simek A., Leiner J., Weichet J. Antimicrobial agents. VII. Microbial degradation of the antifungal agent 2-chloro-4-nitrophenol (nitrofungin) // Folia microbiol.- 1970.- V.15.- N 5.- P.350-353.
69. Cassone, A., R. Mason, and D. Kerridge. Lysis of growing yeast-form cells of Candida albicans by echinocandin: a cytological study// Sabouraudia .-1981. -V. 19.-P.97-110.
70. Cole G.T., Nozawa Y.// Biology of conidial fungi.- Eds.Cole G.T., Kendrick B.N.Y.: Acad.Press .-1981.- V.I.- P.97.
71. Dixon D., Walsh T. Antifungal agents // In: Baron's Medical Microbiology Textbook.- http://www.md.huji.ac.il/microbiology/book/toc.htm
72. Dubois M., Gilles K.A., Hamillton J.K., Rebers P., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal.Chem.-1956.- V.28.-N3.- P.350-356.
73. Dupont B., Ronin O., Cohen M., Kervroedan P., Lavarde V. Evaluation ofa colorimetric auxanogram system for yeast identification //it.
74. Comm.affichee.- 5 Europ.Congress of Clinical Microbiol.and Infect.Diseases.- Oslo.- 1991.
75. Faergemarm J. Bratel AT. The in vitro effect of fluconazole on the filamentous form of Pityrosporum ovale// Acta Dermato-Venereologica.-1996.-V76.-N6.-P.444-6.227
76. Faergemann J. Tinea versicolor and Pityrosporum orbiculare -mycological investigations, experimental infections and epidemiological surveys // Acta Dermato-Venerologica (Suppl.86).- 1979.- P. 1-23.
77. Faergemann J., Fredriksson T. Experimental infections in rabbits and humans with Pityrosporum orbiculare and P.ovale //J.Invest.Dermatology.-1981.- V.77.- P.314-318.
78. Faergemann J., Fredriksson T. Age incidence of Pityrosporum orbiculare on human skin // Acta Dermato-Venerologica.-1980.-V.60.-P.531-533.
79. Faergemann J., Maibach H.I. The pityrosporon yeasts. Their role as pathogens // J. Dermatol.- 1984.- V.23.- P.463-465.
80. Fell, J.W. Rapid identification of yeast species using three primers in a polymerase chain reaction. // Mol. Mar. Biol. Biotechnol.-1993.-V. 2-P. 174-180.
81. Frank-Kamenetskii M.D. Simplification of the empirical relationship between melting temperature of DNA, its G+C content, and concentration of sodium ions in solution. //Biopolimers .- 1971.- V.10.-P.2623-2624.
82. Freydiere A.-M., Guinet R. Rapid methods for identification of the most frequent clinical yeasts // Rev.Iberoan.Micol.- 1997.- V.14.- P.85-89.
83. Freydiere A.-M., Guinet R., Boiron P. Yeast identification in the clinical microbiology laboratory: phenotypical methods // Medical Mycology. -2001.-V.39.-P.9-33.
84. Ghannoum M.A., Rice L.B. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance // Clinical Microbiology Reviews.-1999.-V12.- N4.-P.501-517.
85. Golubev W., Shabalin Y. Microcin production by the yeast Cryptococcus humicola//FEMS Microbiol.Letters.-1994. V.l 19.- P.105-110.
86. Golubev W.I. Micocins (Killer toxins).// The Yeast. A Taxonomic study.2281998. Ed. By Kuztzman C.P., Fell J.W. - Elsevier.-P.55-62.
87. Golubev W.I. Capsules // In: "The Yeasts" Eds. Rose A.H., Harrison J.S. 2nd edn V.4. "Yeast organelles" - Acad.Press.-London.-1991.- P. 175198.
88. Gueho E., Midgley G., Guillot J. The genus Malassezia with description of four new species // Antonie van Leeuwenhoek.- 1996.- V.69.-P.337-355.
89. Guillot J., Gueho E., Lesourd M., Midgley G., Chevrier G., Dupont B. Identification of Malassezia species: a practical approach//J.Mycol.Med.-1996.-V.6.- P.103-110.
90. Gupta AK., Kohli Y., Li A., Faergemann J., Summerbell RC In vitro susceptibility of the seven Malassezia species to ketoconazole, voriconazole, itraconazole and terbinafine.// British Journal of Dermatology.- 2000.- V.142.- N 4.- P.758-65.
91. Hagan ME, Klotz SA, Bartolomew W., Potter L., Nelson M. A pseudoepidemic of Rhodotorula rubra a marker for microbial contamination of the broncoscope// Infect.Control and Hospital Epidemiol.- 1995.- V.16.- N 12.- P.727-728.
92. Hakkaart GA., Harmsen MM., Chua KY., Thomas WR. ,Aalberse RC. Van Ree R. Expression of the house dust mite allergen Der p 2 in the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae// Clinical & Experimental Allergy.- 1998.-V.28.-N 1.-P.45-52.
93. Halbert A.R., Weston L.W., Morelli J.G. Atopic dermatitis: is it an allergic disease? //J.Am.Acad.Dermatol.- 1995.- V.33.- P.1008-1018.
94. Hammer KA., Carson CF., Riley TV. In vitro activities of ketoconazole, econazole, miconazole, and Melaleuca alternifolia (tea tree) oil against Malassezia species // Antimicrobial Agents.& Chemotherapy.-2000.- V. 44- N 2.- P.467-9.229
95. Hector R. F. Compounds active against cell walls of medically important fungi// . Clin. Microbiol.- 1993. Rev. 6.- P. 1-21.
96. Hernandez-Molina JM, Llosa J, Ventosa A. In vitro activity of nitroxoline against clinical isolates of Candida species // Mycoses.- 1991.-V.34.- N 7-8.- P.323-325.
97. Hong C.S., Stadler B.M., Walti M., De Week A.L. Dot-immunobinding assay with monoclonal anti-IgE antibodies for the detection and quantitation of human IgE // J. Immunol. Methods.- 1986.- V. 95.- P. 195
98. Hurley R., de Louvois J., Mulhall A. Yeast as human and animal pathogens // In: The Yeasts. In: "The Yeasts" Eds. Rose A.H., Harrison J.S. 2nd edn.- V.l. "Biology of yeasts" Acad.Press.-London.-1987.-P.207-256.
99. Hurley R., Stanley V.C., Leask B.G.S., de Louvois // In: "The normal microbial flora of Man".- Ed.by Skinner F., Carr JG.- Acad.Press.-1974.-P.155-183.
100. Ingham E, Cunningham A.C. Malassezia furfur Review. //J. of Medical and Veterinary Micology.- 1993.- V.31.- P.265-288.
101. Ishiguro A. Homma M. Torii S. Tanaka K. Identification of Candida albicans antigens reactive with immunoglobulin E antibody of human sera.// Infection & Immunity.- 1992.-V. 60.-1550-7.
102. Jawetz E., Melnick J.L., Adelberg E.A. Review of medical microbiology // Lange Medical Publication, Los Altos, California.- 1980.-V.2- P.224-269.
103. Jaw-Ji Tsai, Wu-Charng Chen. Different age of asthmatic patients affected by different aeroallergens.// Journal of Microbiology, Immunology & Infection. -1999.- V. 32.-N 4.- 283-288.230
104. Jonston J. R., Mortimer R. K. Electrophoretic karyotyping of laboratory and commercial strains of Saccharomyces and other yeasts// Int. J. Syst. Bacterid.- 1986.- V. 36.- P. 569-572.
105. Johnstone A., Thorpe R. Immunochemistry in practice.// 2-nd Edition.-Oxford: Blackwell Scientific Publication.- 1987.
106. Kawano Shiomi. Nakagawa Hidemi. The correlation between the levels of anti-Malassezia furfiir IgE antibodies and severities of face and neck dermatitis of patients with atopic dermatitis // Japanese Journal of Allergology.- 1995. -V. 44.-N3.-128-133.
107. Klis F.M., de Groot P., Hellingwerf K. Molecular organization of the cell wall of Candida albicans // Medical Mycololy.- 2001.- V.39.Suppl.l -P. 1-8.
108. Kortekangas-Savolainen O., Einarsson R. Thermal and storage stability of Saccharomyces cerevisiae (baker's yeast) allergens.// Clinical & Experimental Allergy. 1994.- V.24.- N 3.- P. 257-262.
109. Kortekangas-Savolainen O., Savolainen J., Lantto R., Kalimo K. Immediate hypersensitivity to bakery, brewery and wine products in yeast-sensitive atopic dermatitis patients// Clinical & Experimental Allergy.2311994.- V.24.- N 9- P.836-842.
110. Körting H.C., Loferer S., Hamm N. The detergent scrub method for quantitative determination of Malassezia furfur on chest and back skin: comparative evaluation of three different media // Mycoses.- 1991.- V.34.-P.267-271.
111. Kurtsman C.P., Fell J.W. Definition, classification and nomenclature of the yeasts // In: The Yeasts, A Taxonomic Study.- Ed.by KurtsmanC.P,Fell.J.W.- 1998.- P.3-5.
112. Kurtz, M. B. New antifungal drug targets: a vision for the future//ASM News.- 1997.-V. 64-P.31-39.
113. Kurtz, M. B., and C. M. Douglas. Lipopeptide inhibitors of fungal glucan synthase // J. Med. Vet. Mycol.- 1997. -V. 35.- P.79-86.
114. Kurtzman, C.P., Phaff, H.J. Molecular taxonomy.// In: The Yeasts. 2nd ed. (A.H. Rose, J.S. Harrison, eds.) vol.1. Biology of Yeasts.- Academic Press, London .-1987.-P. 63-94.
115. Kurzweilova H., Sigler K. Fluorescent staining with bromocresol purple: a rapid method for determining yeast cell dead count developed as an assay of killer toxin activity// Yeast.- 1993.- V.9.- P.1207-1211.
116. Kustrzeba-Wojcicka I., Golczak M. Enolase from Candida albicans: Purification and characterization.// Comparative Biochemistry & Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. -2000.- V.126 B.-P. 109-120.
117. Lacey R.W., Alder V.G., Gillespie W.A. The survival of Staphylococcus aureus on the human skin // British J. Experim. Pathology.-1970.- V.51.- P.305.
118. Lachance M-A., Starmer W.T. Ecology and yeasts // In: The Yeasts, A Taxonomic Study.- 1998.- Ed.by Kurtsman C.P,Fell.J.W.- P.21-30.232
119. Lachapelle J.M., Gouverneur J.C., Boulet M., Tennstedt D. A modified technique (using polyster tape) of skin surface biopsy. Its interest for the investigation of athlete's foot // British J.Dermatol.- 1977.- V.97.-P.49.
120. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterial fage T4 // Nature.-1970.- V.227.- N 5259.- P.680-685.
121. Lamb DC, Corran A, Baldwin BC, Kwon-Chung J, Kelly SL // FEBS Letters. 1995. - V 368.- N 2.- P.326-330.
122. Leeming J.P., Holland K.T., Bojar R.A. The in vitro antimicrobial effect of aselaic acid // British J. of Dermatology.-1986.- V.115.-P.551-556.
123. Leeming J.P., Notman F.H., Holland K.T. The distribution and ecology of Malassezia furfur and cutaneous bacteria on human skin// J.of Appl.Bacteriol. 1989.- V.67.- P.47-52.
124. Lieckfeldt E., Meyer W., Borner T. Rapid identification and differentiation of yeasts by DNA and PCR fingerprinting // J. Basic Microbiol. -1993.-V.33.-P.413-25.
125. Lodder J., Kreger-van Rij N.J.W. The yeast. A taxonomic study // Amsterdam North-Holland Publ. Co. 1952.- P.713.
126. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J.Biol.Chem.-1951.- V.193.-P.265-275.233
127. Magliani W., Conti S., Bernardis F.D., Polonelli L. Therapeutic potential of antiidiotypic single chain antibodies with yeast killer toxin activity// Nature biotechnology.-1997- V. 15P. 155-158.
128. Marples R.R., Downing D.T., Kligman A.M. Influence of Pityrosporum species in the generation of free fatty acids in human surface lipids // J.of Investigative Dermatology.- 1972.- V.58.- P.155-159.
129. Mayser P., Pape B. Decreased susceptibility of Malassezia furfur to UV light by synthesis of tryptophane derivatives//Antonie van Leeuwenhoek.-1998.-V.73.-N 4.-P.315-9.
130. McBride M., Knox J.M., Livery E.M. Differentiation of cutaneous anaerobic bacteria // Archives of Dermatology.- 1967.- V.96.- P.296.
131. McGinnis M.R. Recent taxonomic developments and changes in medical micology review. // Annual Review of Microbiology.-1980.-V.34.- 109-135.
132. McGinnis M.R., Rinaldi M.G. Antifungal drugs: mechanisms of action, drug resistance, susceptibility testing, and assays of activity in biological fluids. In: Antibiotics in laboratory medicine.- ed.4.- Baltimore.-Williams& Wilkins.- 1996.
133. Meisel C., Wouters L.H.J. Oral therapy in dermatomycoses: a step forward // Proceedings of a Symposium . Ed.W.Meinhof.- Oxford.-1985.-P.101-106.
134. Mittag H. Fine structural investigation of Malassezia furfur: I. Size and shape of the yeast cells and consideration of their ploidy // Mycoses.-1994.- V.37.- P.393-399.
135. Mittag H Fine structural investigation of Malassezia furfur: II. The envelope of the yeast cells // Mycoses.- 1995.- V.38.- P.13-21.234
136. Moore R.T. Cytology and ultrastructure of yeasts and yeastlike fungi// In: The Yeasts, A Taxonomic Study.- 1998.- Ed.by KurtsmanC.P,Fell.J.W.- P.33- 44.
137. Moraes PSA., Goiaba S., Taketomi E A. Candida albicans allergen immunotherapy in recurrent vaginal candidiasis.// J. of Invest. Allergol. & Clin. Immunol.2000.- V.10.-N 5.-P. 305-309.
138. Morren M.A., Przybilla B., Bamelis M. Atopic dermatitis: Triggering factors // J.Amer.Acad.Dermatol.- 1994.- V.31.- P.467-473.
139. Nazzaro-Porro M., Passi S. Identification of tyrosinase inhibitors in cultures of Pityrosporum // J.of Investigative Dermatology.- 1978.- V.71.-P.205-208.
140. Nazzaro-Porro M., Passi S., Caprilli F., Nazzaro P., Morpurgo G. Growth requirements and lipid metabolism of Pityrosporum orbiculare // J.Investigative Dermatology.- 1976.- V.66.- P.l 78-182.
141. Nazzaro-Porro M., Passi S., Picardo M., Merrcantini R., Breathnach A.S. Lipoxygenase activity of Pityrosporum in vitro and in vivo // J.of Investigative Dermatology.- 1986.-V.87.-P.108-112.
142. Nermes M. Savolainen J. Kalimo K. Lammintausta K. Viander M. Determination of IgE antibodies to Candida albicans mannan with nitrocellulose-RAST in patients with atopic diseases // Clinical & Experimental Allergy. -1994.-V.24.-N 4.-P.318-23.
143. Nermes M., Savolainen J., Kortekangas-Savolainen O. Nitrocellulose-RAST analysis os allergenic cross-reactivity of Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae mannans // Int.Arch. Allergy Immunol.- 1995.-V.106.- P.118-123.
144. Notermans S., Hindle V., Kampelmacher E.H. Comparison of cotton swabs versus alginate swab sampling method in the bacteriologicalexamination of broiler chickens // J. Hygiene (Cambridge).- 1976.- V.77.-P.205.
145. Obtulowicz K., Pawlik B., Gluszko P. Mycoflora in bronchial asthma // Allergie und Immunologie.-1981.- N1.- P.28-34.
146. Parant F., Freydiere A.-M., Gille Y., Boiron P., Odds F.C. A "one minute" trehalase detection test for the identification of the Candida glabrata // J.Mycol.Med.- 2001V. 11.- P.26-31.
147. Peter G., Deak T. On the false positive urease activity of Yarrowia lipolytica // Antonie van Leeuwenhoek.- 1991.- V 60.- P.55-59.
148. Phaff H.J. Chemotaxonomy based on the polysaccharide composition of cell walls and capsules // In: The Yeasts, A Taxonomic Study.- 1998.- Ed.by KurtsmanC.P, Fell J.W.- P.45-47.
149. Raahave D. Experimental evaluation of the velvet pad rinse technique as a microbiological sampling method // Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica.- 1975.- V.83.- P.416.
150. Rebell G., Taplin D. Dermatophytes. Their recognition and identification// University of Maiami Press.-1971.- P. 124.
151. Rebora A., Marples R.R., Kligman A.M. Erosio interdigitalis blastomycetica // Arch, of dermatol.- 1973.- V.108.- P.66.
152. Rigg D. Miller MM. Metzger WJ. Recurrent allergic vulvovaginitis: treatment with Candida albicans allergen immunotherapy.// American J. of236
153. Obstetrics & Gynecology. -1990.-V.162.-N 2-P.332-6.
154. Roig E. Malo JL. Montplaisir S. Anti-Candida albicans IgE and IgG subclasses in sera of patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis (ABPA) // Allergy.- 1997.-V.52.-N 4- P.394-403.
155. Rose H, Harrison A. The yeasts . Acad.Press.- 1987.- V. 1.
156. Salvaggio J., Burge H.A., Chapman J.A. Emerging concepts in mold allergy: what is the role of immunotherapy? // J. Allergy Clin.Immunol.-1993.-V.92.-N2.- P.217-222.
157. Sutton D., Fothergill A., Rinaldi M. Guid to clinically significant fungi. Willims& Wilkins.- Baltimore.- 1998.
158. Savolainen J. A standardized densitometric immunoblotting analysis of Candida albicans protein allergens.// Clinical & Experimental Allergy. -1995.- V.25.-N.4.-P.357-63.
159. Savolainen J. Kalimo K. Einarsson R. Koivikko A. Viander M. Terho EO. In-house reference (IHR) preparation of Candida albicans allergen extract. A standardized extraction procedure // Allergy. 53(4):359-66, 1998 Apr.
160. Savolainen JKortekangas-Savolainen O., Nermes M.,Viander M. Koivikko A.,Kalimo K., Terho E O. IgE, IgA, and IgG responses to common yeasts in atopic patients // Allergy.- 1998.- V.53.- N 5.- P.506-512.
161. Savolainen J., Viander M., Koivikko A. IgE-, IgA- and IgG-antibody237responses to carbohydrate and protein antigens of Candida albicans in asthmatic children//Allergy.-1990.-V.45.-N 1- P.54-63.
162. Seebacher S., Hubner U., Blaschke-Hellmessen R. Vergleichende Untersuchungen zum vorkommen von sprobpilsen auf gesunder und krankhaft veränderter haut// Mycosen.-1971.- V.14.- N 8.- P.371-383.
163. Sheehan D.J., Hitchcock C.A., Sibley C.M.review. // Clinical Microbiology Reviews.-1999.- V12.- N1.- P.40-79.
164. Shen HD, Choo KB., Tang RB., Lee CF., Yeh JY., Han SH. Allergenic components of Candida albicans identified by immunoblot analysis // Clinical & Experimental Allergy.-1989.-V.19.-N.2.- P. 191-5.
165. Schmidt A. Ruhl-Horster B. In vitro susceptibility of Malassezia furfur// Arzneimittel-Forschung.- 1996.- V. 46.- N 4.- P.442-4.
166. Siersted HC. Gravesen S. Extrinsic allergic alveolitis after exposure to the yeast Rhodotorula rubra // Allergy.- 1993.-V. 48.-N 4.-P.298-9.
167. Snyder C, Seguy N, Lafitte S, Polonelli L. Production of anti-toxin antibodies by immunization with Pichia killer toxin-like antiidiotypic monoclonal antibodies // J.Eukaryot.Microbiol.- 1999.- V.46.-N 5.- P.138S.
168. Sonck C.E. On the incidence of yeast species from human soursces in Finland. III. Yeast flora of some skin regions (exept feet and nails)// Mycosen.- 1979.- V.22.-N4.- P.129-139.
169. Stein J.H. Internal Medicine.- 4th ed. Mosby.-1994.-P. 1832-1833.238
170. Spacek R., Vondrejs V. Rapid method for estimation of killer activity in yeasts // Biotechnology Letters.- 1986.- V.8.- N 10.- P.701-706.
171. Strippoli V. Piacentini A. D'Auria FD. Simonetti N. Antifungal activity of ketoconazole and other azoles against Malassezia furfur in vitro and in vivo// Infection.- 1997.- V.25.- N 5.-P.303-6.
172. Tkacz J. S. Glucan biosynthesis in fungi and its inhibition. In J. Sutcliffe and N. H. Georgopapadakou (ed.), Emerging targets in antibacterial and antifungal chemotherapy.- Chapman & Hall.- New York.- 1996.-P. 495-523.
173. Towbin H., Gordon U., Staehelin Т., Electrophoretic transfer of proteins from poly acrylamid gels to nitro cellulose sheets procedure and some // Proc. Nat. Acad. Sci. (USA).- 1979.- V 76.-N 9.- P. 4350-4354.
174. Vandepitte J., Engbaek K., Piot P., Heuck C.C. Основные методы лабораторных исследований в клинической бактериологии// Всемирная организация здравоохранения.- 1994.- Женева.- С.45.
175. Venkateswarlu K., Taylor M, Manning NJ, Rinaldi MG, Kelly SL // Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 1997. - V 41.- N4. - P.748-751.
176. Vondrejs V., Palkova Z. Chemical warfare among the yeasts: the "killer"239phenomen, genetics and applications // In: Yeasts in natural and artificial habitats.- Ed.by Spencer and Spencer.- Springer.-1997.- P. 153-170.
177. Weary P.E. Pityrosporum ovale observations of some aspects of hostparasite interrelationship // Archives of Dermatology.- 1968.- V.98- P.408-422.
178. Whiting D.A., Bisset E.A. The investigation of superficial fungal infections by skin surface biopsy // British J. Dermatol.- 1974.- V.91.-P.57.
179. Williamson P. Quantitative estimation of cutaneous bacteria.- In: Skin bacteria and their role in infection.- ed.Maibach H.I., Hildick-Smith G.New York.- McGraw-Hill.- 1965.
180. Whitlock M., Dietrich RA, Steimke EH, Tenholder MF. Rhodotorula rubra contamination in fiberoptic bronchoscopy// Chest.- 1992.- V.102.- N 5.- P.1516-1519.
181. Wright MC. Hevert F. Rozman T. In vitro comparison of antifungal effects of a coal tar gel and a ketoconazole gel on Malassezia furfur// Mycoses.- 1993.- V.36.-N 5.-P.207-10.
182. Yang K., Kenji S., Shunji K., Ippei T., Shunkichi B. Clinical review of nazal allergy due to fungus // Acta Otolaryngol.- 1996.- Suppl.525.- P. 105107.
183. Yarrow D. Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts// In: The Yeasts, A Taxonomic Study.- 1998.- Elsevier.- Ed.by KurtsmanC.P,Fell.J.W.~ P.77-100.
184. Zargari A. Identification and characterization of allergen components of the opportunistic yeast Malassezia furfur. Repro Print AB, Stockholm.- 1998.-P.50-56.
185. Zargari A., Emilson A., Hallden G., Johansson S., Scheynius A. Cell surface expression of two major yeast allergens in Pityrosporum genus // Clinical and experimentel Allergy.- 1997.- V.27.-P.584-592.
186. Zargari A., van Heijenoort J., Gruber K., Sleytr U.B.// J.General Microbiol.- 1992.- V.138.- P.611-618.
187. Zargari A., Harfast B., Johansson S., Johansson S.G.O., Scheynius A. Identification of allergen components of the opportunistic yeast Pityrosporum orbiculare by monoclonal antibodies // Allergy.- 1994.-V.49.- P.50-56.
188. Zargari A., Schmidt M., Lundberg M., Scheynius A., Whitley P. // Immunologic characterization of natural and recombinant Mal f 1 yeast allergen. // J. Allergy & Clin. Immunology.-1999.-V.l03.-N 5 (1).-P.877-884. 1987.- C.269.241
-
Арзуманян, Вера Георгиевна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2002
-
ВАК 03.00.07
- Особенности микробиоценоза основных биотопов организма человека в условиях Европейского Севера России
- Микрофлора толстого кишечника у детей, стадающих аллергическими заболеваниями
- Аутофлора кожи при красном плоском лишае
- Аллергические заболевания органов дыхания, вызываемые грибами
- Экологическая характеристика микрофлоры кожи больных дисбактериозом кишечника
