Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Судьба дрожжей в ассоциациях с почвенными беспозвоночными

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Судьба дрожжей в ассоциациях с почвенными беспозвоночными"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Ы. В. ЛОМОНОСОВА ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

ол

На правах рукописи

Ву Нгуеа Тхань

х СУДЬБА ДР0КЖ2Й С АСС01ЩАЦНЯХ С ПОЧНЕИНЬШ БЕСПОЗВОЯОЧНШМ

•Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

ПГ ч

I I и

МОСКВА - 1993

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского Государственного Университета им. М. 3. Ломоносова.

Научные руководители:

кандидат биологических наук И. Ш. Бабьева

кандидат биологических наук Б. А. Вызов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Е. С. Паников кандидат биологических наук И. Ю. Чернов Ведущая организация:

Институт эволюционной морфологии и экологии животных РАН Защита состоится '1^/ " ^¿'¿^Зуа 1993 в "К1? часов на заседании Специализированного совета К.053.05.86, Москва, 119899, Лекторы, факультет почвоведения/учений Совет.

С диссертацией мсшю ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан " -У- "1993 г.

Приглашаем Бас принять участке в обсуждении диссертации на заседании специализированного Совета, а отзывы на автореферат присылать в двух экземплярах.

Ученый секретарь специализированного Совета,

доцент , /л . /у. /2 И- П. Бабьева

ОШЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работа: Известно, что подобно ризосфере растений, кишечник и экскременты почвенных беспозвоночных являются жо-кусами с высокой микробиологической активностью (Козловская, 1976; Стебаев, 1984; Lavelle ù Barols, 1988; Anderson. 1988). Беспозвоночные животные зо многом определяют протекание почвенных процессов: разда-епие органического вещества (Стриганова 1971; Lee & Wood, 1971; Гиляров и Стриганова, 1978; Brian, 1983; Пани-ков и др., 1985), реутилизацию микробной биомассы, миграцию и мобилизацию биогенных элементов (Syers et al., 1979; Sharpley et al., 1979; Покаржевекия, 1987), селективно выедают одни и способствуют размножение других (Pierce, 1978; Dash et al.,. 1979; Марфекина, 1989), могут способствовать распространению микроорганизмов в почве (Reddell & Spain, 1991; Hendriksen, 1992), в том числе - фитопатогеяных (Beute & Benson, 1379). Очевидно, что в основе этих эффектов леяат взаимодействия конкретных микроорганизмов и животного. Однако до сет. пор вопрос о судьбе отдельных микробных популяций з оооаикробном комплексе почв оставался открытым. В последнее время в связи с использованием мутантных и геннорекомбинантных микроорганизмов в сельском хозяйстве более остро встал вопрос о выживаемости внесенных популяций и та в линии на другие компоненты живой природы (Stotzky & Babich, 1S84; Rötlich et al., 1991). Для реиеняя этих проблем необходима теоретическая база знаний о поведении природных популяций микроорганизмов в определенных ассоциациях.

Дрожжи - удобная для популяционянх исследований модель среди почвенных микроорганизмов: их сравнительно легко идентифицировать, количественно определять в почве и следить га их динамикой. Изучение их судьбы в почве позволит охарактеризовать основные механизмы зоомикробных взаимодействий.

Научная навязка: На примере многоножек-дкплсяод описаны типы сиюбиотических вз&таодействш дроикей с почвенными беспозвоночными. Кишечник джшжюд состоит из двух функционально различных

- г -

частей. Задний отдел является природным "ферментером", где обитают кишечные древам Debaryanyces hanser.ll, Torulaspora delbrueckll. Zygo\ri lllopsls californicus к другие. Симбиотичеекие дролжи устойчивы к сиене режимов корыления и содержания живегшх. Основными функциями кишэчеье драахей являются реутилизация мочевой кислоты и эндогенное нктаниз ивогйя. Эти дроажи активно передаются в средний отдел благодаря антиперистальтическому Лвидению пищеварительного тракта гашотного и перевариваются таа (эндогенное питание). Показана возможность перехода от кутуалистичес-ких взаимоотношений к патогенезу со стороны кишечных дрожжей. Средний отде- - зона перезаривания микробных клеток к предохранения от заражения заднего отдела. Показана избирательность в переваривании дрсяжей, преходящах пищеварительный тракт почвенных животных. Подстилочные дроаяи jiureobasidlira pullulans, Rhcdotorula grastlnls, Cryptococcus albldus и Candida scottll наиболее чувствительны к переваривании. Дрогши Trlchosporon pullulans, выделенные из экскрементов, более устойчивы. Самыми устойчивыми ока^ запись кишечные изоляты.

Впервые показано, что процесс переваривания дрегааевых клеток складывается из двух этапов: (1) быстрой убивки клеток (в течение нескольких »шут) терыоустоэтквьш неферыентативным фактором животной природа, вызывающим деструкции клеточных мембран; (2) автолиза и гидролиза под действием ферментов пищеварительного тракта животных. Процесс переваривания дрожевых клеток в среднем отделе не связан с активностью кишечной микрофлоры.

С использованием 14С-меченой биомассы показано, что более 80% биомассы дроажей метаболизуется при прохождении через кишечник диплопод.

Дрожи не образуют тесных ассоциаций с почвенными изоподами и дождевыми червяыи. Мокрица активно переваривают клетки всех видов дрожжей. У дсэдевых червей в зависимости от типа субстрата и таксономической принадлежности населяющих его дрожжей, судьба отдельных популяций может различаться.

Одним кз результатов трофической деятельности почвенных беспозвоночных яздяется форщрозание профильного распределения дрожжей з почве.

Прглзпгсстз гягякксси. Создана коллекция в объеме более 400 штаммов представителей более 50 видов дрогшей; среди выделенных дростей имеются штамш, потенциально цепные для биотехнологии, a Taisie представители неизвестных до сих пор таксонов; разработан способ повышения продуктивности вериикулътури с помощью дролжеЕЫХ добавок.

Цель. Сценгл взаимодействий в ассоциациях драякей с почвенной мезофауной.

Оснозягэ задачи. 1. Изучение судьбы дронжей в ассоциациях с почвенными беспозвоночными: эффект прохождения через пидевари-тельный тракт, кишечные симбиозы. 2. Изучение механизма перегруппировки сообщества дроткей, проходяиих через кишечвик диплопод. 3. Определение роли почвенных беспозвоночных в формировании сообщества дрожгй в почве. 4. Оценка возысшости использования дрож-г.гй в производстве вершкомпостоь.

Азпсбадл patoru. Основные погокекия дкссерташи были доло-кены на Всесоюзной научней конфзрзвции "Шкрооргазкгмы - стимуляторы и ингибиторы роста зивотных к растений" / Ташкент, 1989/, на XI Международном колло'.эиумэ по почзэеюй зеолэпш/ Ювясшиа, Финляндия, 1952/ и на заседании кафедры биологии по'гз /1993/.

Еу&ш^гфп. Кгтериэлы диссертации изложены в 9 работах.

Сбъеи и стклт^тра рзйотс:. Диссертация состоит лз введения, обзора литературы, списания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения и выводсй, списка цитируемой литературы, пршюления. Работа содержи1_страниц текста, шшзегр::розана_рисунками и_таллщаки. Список литературы включает__накмзпоЕаний, из них_зарубежных авторов.

Автор выражает глубокую признательность профессорам Л. Г Звягинцеву, Ц.М. Умарогу, Т.О. Пэрель, в.н.с. B.C. Гузеву, с.н.с. К.С Ресетовой, н.с. З.Ю. Нилановскому, аспиранту Дам Тхань Шон.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования служили следующие представители почвенных беспозвоночных:

- почвенные многоножки-кивсяки Pachylulus flavlpes C.L.Koch, Leptoiulus polonlcus Jawlowski. Megsphlllm projectum kochi Verhoeff и Glomerls connexa C.L. Koch.

- изоподы-мокрицы Tracheonlscus ratbkel ■ (Brandt) и Armadlllldlm vulgare (Latr.K. Кивсяки P. flavlpes, мокрицы Гг. rathkel и Л. vulgare были собраны в подстилке широколиственного леса на склона! гор и в саду под камнями в г. Гурзуф, Южный берег Крьша в мае-октябре 1939-1993 гг.. Кивсяки L. polonicus, Ii. projectum kochi и Gl. connexa били собравы в 1989, 1990 годах в лесной подстилке широколиственного леса, Ыукачевской обл., Украина. Животных содераали на естественном опаде с влажностью 25Z в эксикаторах при температуре 18°С. В экспериментах животных кормили естественным иди модель нши субстрателш.

- естественные популяции доядевых червей Lwbrlcus rubel lus Hoffn, Aporrectodea caliginosa (Sav.), собранные в дерново-подзолистой почве смешанного леса Балашшшского р-на Московской обл., а также в районе Ботанического сада ИГУ в ише-августе 1992 года. Червей содержали на естественных субстратах во влажной камере.

- Культурные популяции червей Elsenla fétida Savigny отобраны из верыикомяоста на отходах животноводства и шампиньонного производства Подольского экспериментального теплично-овощного комбината, г. Подольск. Червей содержали на навозе и на смеси шампиньонного грунта с навозом.

Исследовали состав естественных сообществ дрожжей подстилки, почвы, вермикомпоета, кишечника и экскрементов животных; следили за судьбой ивтродуцярозанных и естественных популяции дрожжей. В экспериментах использовали: подстилку широколиственного леса (дуб, бук, грабинник; 25% влажности), субстраты, взятые из разных горизонтов дерново-подзолистой почвы, вермикошгосты разной степени зрелости, приготовленные из отработанного шампиньонного грунта

в смеси с коровьим навозом в соотношении 8:2, коровий навоз, кристаллическую целлюлозу. Исследования проводили в лабораторных микрокосмах, тагане анализировали природные образцы.

Основными методами исследования были: 1. Выеезы пищевого субстрата, килечника, экскрементов животных на подкисленный сусло агар; 2. Метод почзенных комочков на среде Зиби для количественной оценки популяцш: Ироглусгз-, 3. Для определения обзей численности бактерий использовали среду с казеином, крахмалом, дрожжевым экстрактом (¡й:1пеоу et а1., 1932), а для оценки численности дрожжелктичз сккх бактерий применяли среду с живыми дрсдааыи ОеЬагуомусез ЬгпззпН: 4. Световая и сканирующая алектронная микроскопия; 5. Метод цечгных атомов: дратаи вырацивгли в присутствии 14С-глюкозы; радионктишость измеряли методой жидкостного сцинтилляцйонного счета; 6. Идентификации дроянек проводили по стандартной схеме (Кте^ег-уап ИЗ, 1934).

Результаты обрабатывали статистически, рассчитывали стандартное отклонение: п-Б, Р<0.01, проводили кластерный анализ.

ОСНОВНОЕ СОДРРН А ЗИЕ -РАБОТЫ

При прохождении естественного пищевого субстрата через пищеварительный тракт почгеншх иапрстрсфннх животных: происходит смена доминирующих видов дроажей. Численность пигиеютфсЕанних дрог-лей» таких как АигзсЬазШип и ¡?ЪэЗоиоги1г, характерных для фил-лошгаяы и свежего' опада, резке снижается. В гашечнюе и экскрементах доминировали другие виды, большинство из них - аскомицеты или виды аскомицетнсго аффинитета. Эти дрожи не характерны для спада. Наибольшее разнообразна а обилие дрошззого населения бшга обнаружено у кивелков Р. fln.vlpes (Табл. 1, рис. 1; 2). Достаточно сходная, хотя »¿-много беднее, држжевая микробиота обнаружена у черзей гиЬеНиз (Табл. 1; рис. 1: 3). В экскрементах сапрот-рефных кивотных также часто встречались дрогли Тг1сЬоБрог:п -главный доминант позднего зт?яа разложения лесной подстилки. Для мокриц характерно тотальное элиминирование ьсех популяций дрожжей

- б -

и регкое синение численности жизнеспособных микромицетов, ассо-цироваяных с опадоы, что свидетельствует о сильной миколитической активности процесса пищеварения у мокриц. Из кишечника и экскрементов мокриц выделяется единичные штаммы дрожжей и, по-видимому, это те, которые сохраняются после переваривания корма. У мокриц отсутствует кишечная дрожжевая микробиота (Табл. ,1; Рис. 1). Кишечные драка не обнаружены также у червей A. caliginosa и Е. fétida.

80 до 40 $0 (%)

_i-Корм (дубовый опад)

'-Кишечник и экс. мокриц

_i-:-Кишечник и экс. червей

1--Кишечник и экс. кивсяков

Рис. 1. Дендрограмма сходства дрожжевого населения кормов, кишечника и экскрементов разных животных (в качестве признаков использованы значения встречаемости видов).

У кивсакав Р. flavlpes в кишечнике . обнаружена постоянная дрожжевая уи?юбиота. Сообщество дрожжей было устойчиво к смене субстрата и условий содержания животных. Бри кормлении стерильным опадем дрожи выделялись только из заднего отдела кишечника к экскрементов, причем постоянно доминировали Debaryanyces hansenil, Torulaspora delbrueckll, Zygcxrllllopsls californlcus (в дальнейяеы DIZ). Когда животные в течение 3-х недель питались стерильной цешюлозой, численность этой группы дрожжей в экскрементах сохранилась на стабильно высоком уровне. Дрожжи группы DTZ доминировали в кишечнике кивсяков когда животных содержали при 4° в течение 3-х недель. При 3-х недельном голодании животных обнаружена аналогичная картина. Эта группа такте была устойчива при попытке заменить ее путем кормления кивсяков субстратом, обогащенным разными дрожжами в концентрации, намного больше естественной (107кл/г) (Табл. 2). Эти эксперименты доказывают облигатность симбиоза дроякей с кивсякаыи.

Таблица 1.

Виды дрожхей ассоциированные с: дубовым опадом (1); кишечником и экскрементами кивсяков P. flsvipes (2); червями L. xubellas (3); мокрицами А. vulgare (4).

Вид Количество изученных штаммов 12 3 4

Asconycetes

Debsryomyces hansenii (Zopf) Lodder, Kreger-van Rij Torulacpora delbruackii (lindner) Lindner Zygonilliopzis californicus dodder) Küdriavzev Pichia loeabranaefacier.s Hansen Zygosacchaiomyces rouj:ii (Boutroux) Yarrow Galactomyces geotrichum (Butler, Petersen) Redhead, Malloch Saccharonyces paradoxus Batchinskaya

Artbroascus schoenii (Nadson, Krassilnikov) Babjevs et al. Kluyveromyces thermotolerans (Philippov) Yarro« Citeromyces matritensis (Santa Maria) Santa Maria Pachytichospora tiansvaalensis (van der Halt) van der Walt Не идентифицированный

Deuteronycetes

Виды аскомицзтного аффинитета

Kloeckera apis Lavie ex Saith, Sinione et Keyer Candida norvegica (Reiersol) Heyer et Yarrow Candida valida (Leberle) van Uden et Buckley Candida guilliermondii (Castellani) Langeron et Guerra Candida faaata (Harr?.son) Heyer et Yarrow Candida ingcns van der Halt et van Kerken Candida frisdrichii van Uden et ifindiseh Candida variioraarai (Capriotti) van Uden et buckley Candida vini (Desaazierss ex Lodder) van Uden et Buchley Candida sake (Saito et Ota) van Ude:i et Buckley Зида базидпомяцеткого а^аиктета Candida podzolica Babjcva et Eeshetova landida scottii Diddens et Ladder

*ryr>tococcus albidvs (Saito) Skinner Iryptococcuc laurentii (Kufferath) Skinner "richosporon pullulans (Lindner) Diddens & Lodder "richosporon beigelii (Küchenmeister,Rabcnhorst) Vailleoin \ureobasidiun pullulans (Je Вагу) ürnaud ^hodotorula rubra (Denns) Lodder 'hodotorula glutinis (Fresenius) Harrison 'hodotorula minuta (Saito) Harrison hodotorula grzainis Ei Kenna 'hodotorula aurantiuoa (Saito) Lodder

csidica7cete3

-stophilcbssidiva cvpitatun (Fell) Oberwinkler et Bandoni 2 + - - +

ilobasidium sp. 1 + - - -

геюзНа encephsja Persoon i - - + -

45 - + + -

24 - + + -

13 - + + -

16 - + - -

8 - + - -

i 7 - + + -

2 - + 4 -

1 - + - -

2 - + - -

2 - + - -

1 - + - -

7 +

4 +

30 - a. - +

7 - + - -

5 - + - -

3 - + - -

1 - + - -

1 - + - -

2 - - + -

1 - - + -

3 + - + -

3 _ _ + _

1 + - - -

30 + + +

15 + - + -

11 + + -r +

16 ■t- + + +

3 + - + +

11 + + - +

G + - - -

4 + - - -

2 + - + -

2 + - - -

ОПАД

С. д«Ыг{сЬип1 Гг1сЬозрогсп хрр.

В.Т.2.

£оогг1сЬит Тг1сЬо*рогоп ярр. Р. (пвлпЬгапаа^пзлз О. со!»

0X2. Сг. сэЬМиз

С. двЫгёЬит Тг)сЬсэ?0ЛМ1 зрр. Р. шетЬгала^ас)Элз К*, ар!» 0.7.Х С г. с!Ы&л

ЕЕЛ-

СРЕДНИЯ С7ДЕЛ

ЗАДНИЯ ОТДЕЛ

эксхгеммты

1Е0О

100 75 50 23 Частати встрсчаекссти, X '

10 -'20 30 ¿1 50 Чиокнчхль. КОЕ. х 10/г

Рис. 2. Дрожжи ассоциирование с опалом, кишечником, и экскрементами у кизсяхоз Р. 1сллре2.

КОЕ х 10 /г сухого веса

1 ........... 1

1 1

1 ш

ЩЩк й^ЙПА» ------- ' ' — " '

с зке г-ш

и гиЬеНиБ ВИТпсЬоэрогоп ЕНЗ Аскоспорогенные

зке а зке

А. сс!1д1по5а ЕВ Пигментированные ЕШ Сгур^соссиэ

Рис. 3. Численность дрохохей в корме и в экскрементах мереей питаощихся субтратами из разных горизонтов дерново—подзолистой почвы Ц Г+Н — горизонт подстилки; А - гумусовый горизонт; Экс — экскременты.

Таблица 2.

Численность дрсгаей в разных отделах кишечника и экскрементах кивсяков Р. flavlpes после 21 суток питания кристаллической цел-, люлозой обогащенной дрожжами С. . gvllllermondll, С. scottll и D. hansenll.

Численность дрожжей, N клеток х 104/г

Виды дрожжей Корм Средний отдел Задний Экскременты отдел

С. gvllllermondlKа) 8200+1000а 3.4+1ÜIZ 9.1±0.6MZ 4.8+1,8а 660±130а

С. scottll (б) 96С0+16006 0 5.4+1.8OTZ 50±10б

D. tensen!i(в) 150Э±400в 17+1ROTZ 43+10DTZ 160+10в

Одинаковые буквы (а, б, в) указывают на 1 вид дрожжей. DIZ' - Кишечная группа дрожжей (смотреть в текст).

Вероятно, дрожжи играют определенную физиологическую роль в нормальной жизнедеятельности этих животных. Одной пз возможных Функций дрожжей з кишечнике кивсяков кокет бьпгь реутилизация конечных продуктов азотного обмена. Такая гипотеза была ранее сформулирована для некоторых насекошх (Koch, 1S57; Baker et al., 1970). Мы установили, что все изохяты из кишечника кивсяков способны использовать мочевую кислоту как единственный источник азота, а некоторые штаьмы Trlchosporon beipelil - как источник и азота, и углерода (Табл. 3).

Оказалось, что когда типичные кишечные дрскжи гамещдагся на других, то возможно развитие патогенного процесса вплоть до гибели животных. Кивсяки в. соппеха при содержании в лаборатории в течение нескольких месяцев после сбора имели повышенное содержание Candida (-Pichls) gul llienrondil в среднем к задаем отделах ге*ше'.т!шка; отмечена также их вчсотзя смертность. Аналогичное явление обнаружено для Ы. protection. Было проведено искусственное заражение здоровых особей путем кормления лх субстратом, обогащенным С. gulllierjiondll (Рис. 4). Минимальная инфекционная доза, при которой наблюдали заражение всех отделов кишечника, была

Таблица. 3

Способность дрожжевых изолятов использовать мочевую кислоту как источник углерода, азота и как единственный источник и углерода и азота одновременно.

С Н СМ Виды, штаммы (все с индексом Ж) -

б г е г в г

В. ЬапэепИ 48, 47, 45, 56, 46, 43 - _ + _ _

Г. с1е1Ьгиеск11 120 - а + - - +

55, 72, 80 - - + - - -

2. саИГогпыав 126, 130 - - + - - -

68. 83, 87(2) - й + - - Й

Р. тетЬгапгеГас1еп5 74,125, 131, 104 - - + - - -

3. еео1г!сЬии 10 - - + - - -

К. 1Ьегто1о1егапв 93 - - + - - -

К1. ар1Б 106 - - + - - -

137 - с! + - - -

61 - (1 + - - й

С. диПНегаакИ! 24, 14 - (1 + - - (1

Тг. Ье1ееШ 79 + + + + + +

5 - - + - - -

113 - - + + - -

Тг. ри11и1гш 118 - - + + - -

30, 115 - - + - - -

Сг. а1Ь1с1из 71. 117. 116 - - + + - -

№. гиЬга 3. 34 - - + + - -

111 - - + - - -

С. эаке 49 - - + + - -

С. ясоин 50 - - + + - -

Нсп. з^агкеу1-Ьепг1с11 95(2) - - + + - -

Аг1Ь. гсЬоепИ 110

Б. рагаЗохиэ 7, 2

С, N. СИ - как источник углерода, азота, и углерода и азота одновременно.

в, 1 - рост и зона растворения на мочевой кислоте, (с!) - задерганный; (-) - отсутствие; (+) - наличие.

равной 105 кхеток /г. Заражение сопровождалось гибелью животных. Ранее было показано, что С. гиНПеппопсШ может вызывать подобное явление у кровососуиих комаров (Еранц, 1989).

Для выяснения причин перегруппировки состава дрожжей от пищи к экскрементам мы изучали механизмы переваривания дрожжей, изолированных из подстилки и кишечника животных. Кивсяков Р.

Численность, LgN клеток/г

Рис. А. Численность дрожжеп С. guilliermondii в передней, среднем и задней отделах кишечника кивсяков G. соппеха, питоощихея опалом, обогащенным дрожжами С. guilliermondii. К— контроль без дрожжей; I. II, III, IV — варианты с разгел/и и сходными количествами дрожжей в корме.

Численность, КОЕ х 10 /г

С. guilliermondii С. scottii D. hansenii

Рис. 5. Динамика численности дрожжей в экскрементсх кивсяков Р. Асмреэ пои питании иеллолозоП, обогсыденноп дронокоми разных видов: С. эсоНП — выделены из подстилки; О.Ьапзепм — кишечные: С. диННегшопйП — патогенные.

кормит целлюлозой, обогащенной дрожжами, и численность дрожжей затем определяли в экскрементах. Максимальная степень переваривания отмечена для подстилочных видов, минимальная - для кишечных-(Рис. 5). За переваривание дрожжевых клеток могут быть ответственны микроорганизмы кишечника, однако обогащение пищи дрожжами не приводило к возрастании численности кишечных дресдкелитических бактерий на среде с живши дрожжами (они были представлены, в основном, актикомицетами). Кроме того, элиминирование дрожжей было заметно уже е среднем отделе (табл. 2), в то время, как дрожжели-тичесхие бактерии локализовались в заднем отделе.

Пищеварительная жидкость среднего отдела кивсяков обладает селективной дролиелогической активностью. Инкубирование суспензии двухсуточных культур разных дрожжей в кишечной жидкости из среднего отдела кивсяков привело к общему снижению численности жизнеспособных клеток. Испытанные дрсасш четко разделились на три группы по устойчивости к воздействии кишечной жидкости. К первой группе относятся подстилочные, наиболее чувствительные виды. Это Aureobasldlum pullulans, Rhodotorula grandnis, Cryptococcus albldus и Candida scottil (Рис. 6.). У некоторых из них, резкое снижение численности (на 2 - 3 порядка) наблюдалось уже после 2-х минут, а практически полное элиминирование - через 4 часа инкубирования. Более устойчивыми оказались дрожжи рода Trlchosporon (Рис. б.). Их численность после~4-х часов инкубирования снижалась на один порядок, а полное элиминирование наступало через 18 часов. Возможно, благодаря относительной устойчивости к процессу пищеварения животных, часть популяции подстилочных Trlchosporon может проходить средний отдел и, прирастая в заднем отделе, выходить с зкафементами в большем количестве. К последней группе относятся кишечные, наиболее устойчивые виды. Четырехчасовое инку-бироЕание этих дрожжей в кишечной жидкости привело к снижению численности жизнеспособных клеток менее, чем на один порядок (Рис. 7), 18-ти часовое - на два порядка, а полное элиминирование происходило только после трех суток инкубирования.

Численность, LgN клеток/мл

1 1

( !

\\

1\ч

^ ч4-—_ _-Й—1-ïft-1-1-1-1 , 1

О 2 4 G R 10 12 14 16 18

Время, час

Рис. 6. Динамика численности жизнеспособных клеток подстилочные дрожжей при инкубироеании в кишечной жидкости среднего отдела кивсякоз P. flavipes: 1 — Aur. pullulons; 2— Сг. albidus; 3 — С, scottii; 4 — Rh. graminis; 5— Tr. pullulons.

Время, час

Рис. 7. Динамика численности жизнеспособных клеток кишечных дрожжей при инкубировании в кишечной жидкости среднего отдела кивсяхов Р. Яо>лрез: 1 — 2. саМогЫсиэ; 2- в. део1псЬчт; 3-0. Ьапзепи.

Таким образом, смена состава дрожжей связана, с одной стороны, с пищеварительной активностью кишечника животных, а с другой - с различной устойчивостью дрожжей к перевариванию.

Действие кишечной жидкости по отношению к дрожжам определяется ' не только наборе« литических ферментов. За быструю гибель (при сохранении целостности клеточной стенки) отвечает другой фактор. В отличие от ферментативного, этот фактор характеризуется термостабильностью. На это указывает то, что после термической обработки на фоне денатурации логических ферментов, активность килечной жидкости сохранялась на довольно высоком уровне (Рис. 8). Интересно, что разные режимы термообработки (80°С, 5 мкв.; 80°С, 10 мин и 100°С, 10 мин) практически одинаково сказывались на ее активности. Возможно, что уже при 80°С дезактивизи-розались все литкческие ферменты и после этого действует только этот термостабильный фактор. С помощью световой микроскопии обнаружено, что при обработке дрожжей Rh. graadnis кишечной жидкостью происходила мгновенная деструкция содержимого клетки - исчезали вокусли и наступал плазмолиз. В то же время клеточная стенка оставалась неповрежденной. Это явление, по нашему мпенко, связано с нарушением фосфолипидных мембран с последующим автолизом клеток. Подобные явления могут вызывать многие детергенты.

Наличие дрокжелитических ферментов з килечной жидкости также несомненно, так как 20 минуты се инкубирование в ней сумок D. hansenll привело к кассовому разрушению асков и освобождению аскоспор. Кипечиая жидкость также вызывала лизис термообработав-ных клеток Galactomyces gsotrlchom.

Ктак, переваривание дрожжевых клеток в среднем отделе является результатом двух процессов: быстрой убивки и последующего лизиса за счет ферментов животных и ферментов самих дрожжевых клеток. Это явление близко к описали ому для позвоночных индуцированному азтелизу (Уголев, 1991).

Кишечная жидкость кивсяков до и после термической обработки такхе очень сильно действует на промышленные дрожжи Saccharomces

Время, мин.

Рис. 8. Влияние термической обработки на дрожжелитическуо активность жидкости среднего отдела кивсяков Р. Яолрев по отношение к дрожжам ЯЬ. дгапмгмз: 1 —"при 80*С, 5 мин.; 2 — 80*С, 10 мин.; 3 - ЮО'С. Ю мин.; 4 - вода; 5 - натиеная жидкость

9 8

7 6 5 4

3

О 30 60 90 120 1Й 130

Время, мин.

Рис. 9. Активность кишечной жидкости среднего отдела кивсяков Р. flavipes по отношению к дрожжам Rh. graminis посче 17 суток кормления цел/толозой (1); целлюлозой со сгрептоми цином (2). 3 — Контрольная кривая.

Численность, LgN клеток/мл

cerevlsiae (полное элиминирование наступает в обоих случаях через 1-4 часа). Таким образом, кишечная жидкость кивсяков действует как на базидиомицеты, так и на аекомицеты в отличие , от улиточного сока, который действует практически только на аекомицеты (Bastide et al., 1975). Селективность действия кишечней жидкости связана, по видимому, как с составом литических ферментов, так и с природой фактора, вызывающего быструю гибель клеток.

Если сравнивать состав кишечпых дрожжей у кивсякоз и многих насекомых, например у муравьев, жуков-ксилсфагов, дрозофил, комаров, то можно обнаружить большое сходстео, по крайней мере - на уровне родов. Несмотря на большое разнообразие видов дрожжей, обитающих на субстратах их питания, в кишечнике и экскрементах встречаются дрожжи из группы достаточно близких родов: Pichia (-Hansenula), Debaryomyces, Torulaspora (Golubev & Bab'eva, 1972; Pignal,1973; Slavikova & Kockova-Kpatochvilova, 1979; Густедева и Исаев, 1982; Phaff & Stanner, 1987; Франц, 1SS9). Из этого следует, что у членистоногих, к которым относятся и многоножки, и насекомые , существует вероятно, механизм, позволяющий предохранять их пищеварительный тракт от зарат.ения к одновременно сохранять постоянный состав кишечных дрожжей. Если считать, что дрожжелити-чесхие ферменты имеются не у всех указанных ответных, вполне логично предположить, что у разных животных существует сходный не-фэрментатквный фактор, вызывающий гибель экзогенных дрожжей.

Дрозжзгахическая активность кишечной жидкости среднего отдела кивсяков не связана с активностью кишечной микрофлоры. 17-ти суточное кормление кшеягав кристгдЕтчеекой целлюлозой со стреп-тешщг-ном в концентрации 1 кг/г привело к понижению общей численности бактерий кишечника более, чем на 2 порядка, однако при этом активность кишечной жидкости оставалась на уровне, близком к варианту без антибиотика (Рис. 9).

Кивсяки очень здфэктквно переваривают дрок®. Эксперимент по кормлению кивсяков кристаллической целлюлозой, обогащенной мечеными 14С драпами Rh. grminis, Тг. pullulans, D. hansenii пока-

зал, что содержание метки в экскрементах составляло около 20% от исходного в корме. Интересно отметить, что лучше всего ассимилируются- кишечные дрожжи.

Исходя из вышеизложенного, мы предложили следующую модель судьбы дрожжей в гагаечнике кивсяков P. flavlpes (Рис. 10.). Попадая с пищей, экзогенные дрожжи перевариваются в среднем отделе. Средний отдел, таким образом, является буферной зоной, предохраняющей кнпечник от заражения. В заднем отделе постоянно обитает группа кишечных дрожжей, утилизирующих мочэзую кислоту. Микробная биомасса за счет антиперистальтического движения кишечника может подаваться в средней отдел и перевариваться там, что, вероятно, имеет особое значение при диапаузе, периодах засухи и зимовки животных. Благодаря устойчивости к перевариванию, дрожки рода Trlchosporon не только Еьиавают, но и размножаются, проходя кишечник. В пользу существования процесса передачи субстрата из заднего отдела в средний говорит тот факт, что, хотя средний отдел не представляет собой среду для выживания дрежей, тем не менее из среднего отдела довольно часто выделяются кииечные дрожжи.

Питаясь в верхних сдоях подстилки, беспозвоночные откладывают экскременты з тигле слои. Это явление до скх пор никто не связывал со стратификацией состава микроорганизмов и, в частности, дразяей по элементам подстилки. Наш натуркые наблюдения показывают, что состав дрожек в F+H горизонте сходен с их составом в экскрементах животных. Согласно нашим и литературным данным в верхнем горизонте подстилки доминирует дроани филлопланы, а в нижнем - дрожжи рода Trlchosporon. Аналогично, дрожжи филлопланы элиминируются в процессе питания животных, но в экскрементах возрастает доля и абсолютное количество дрожжей рода Trlchosporon. Это было показано для кивсяков и червей L. rubellus (Рис. 2; 3; И).

Таким образом, за счет трансформации сообщества дрожжей в направлении опад - экскременты и обогащения экскрементами нижележащих слоев подстилки формируется сообщество F+H горизонта.

ЗАДНИЙ ОТДЕЛ

Ночеьая кислота

С<рэ

Пищеварительные 4>ерменты

абсорбция

питательных

веществ

Антип ери стал ь -тичесхое двизекие

Мальпигиевы сосуды выделяют: мочевую х-ту, Р0<а", 50<2-С1-, К+, Ка- ...

Филлоплаиовые ДРОХЯИ

Дрохгк ТгхсЪоврогсп

Кишечные дролхи

Переваривающееся клетки

Перистальтическое

ДЕИЕвНИЭ

ЭКСКРЕМЕНТЫ

Рис. 10 . Модель судьбы дроггей в ассоциации с киасякаки Р. .Паг^рег

Главны!® преобразователями минеральных горизонтов дерново-подзолистой почвы являются дождеЕЬ'е черви. L. rubellus (поч-зенно-подсгилочные черви) питаются растительным опадом и откяады-' ваот экскременты в F+H горизонте. Л. caliginosa (почвенные черви) питаются в верхних слоях почвы и откладывают экскременты там же. При питании червей L. rubellus и A. caliginosa субстратами из F+H и А горизонтов часть популяции Trlchosporon переваривается, часть сохраняется и перераспределяется по почвенному профилю. Интересно отметить, что судьба популяции Trichosporon может быть разной з зависимости от того, чем питаются животные (Рис. 11).

Дрожжи рода Llpomyces, максимальная численность которых отмечается в минеральных горизонтах, устойчивы к пищеварительным процессам обитающих здесь червей Л. caliginosa (Рис. 12)." При прохождении через кишечник червей численность Liponyces сохраняется длительное время на таком же уровне, что и в почве . Таким образом, копролгаизация минеральных горизонтов может рассматриваться как фактор перераспределения и стабилизации популяции Llpomyces в почге.

Трофическая взаимосвязь между дрожками и беспозвоночными может иметь прикладное значение. Мы изучали роль дрожжей в стимуляции роста компостных червей Е. fétida. Предпосылкой для этого была литературная сводка, в которой рассматривались благоприятные и неблагоприятные с точки зрения влияния на рост червей микроорганизмы. В процессе вермиксмпостирования дрожжи, характерные для навоза, элиминировались и готовый вермикомпост практически не содержал. дрожжей. Можно выделить по крайней мере два механизма элиминирования: (1) выедание червями дрожжей; (2) присутствие в компосте выделений черзей, содержащих целомическую жидкость из-за характерной для вермикультуры повышенной плотности червей. Экспериментально было показано, что целомическая жидкость сдерживает рост дрожжей в жидкой культуре (Рис. 13). Известно, что целомическая жидкость обладает тиаминазной активностью. Все это может приводить к дефициту витамина Bi в компосте. Добавив в компост

1000 eoo 600 400 200 О

/. 1

V

i

Г/Г-. . . <м /1 ■ о / Кг

L F-H L rubellus к An А. caliginoso

Рис. 11. Численность дрожжей Trichosporon в корме и в экскрементах червея, питоошихся субстратами из разньк горизонтов дерново—подзолистой почвы

Обрастание комочков, %

60 70 60 50 <0 30

го ю о

Рис. 12. Относительное обилие дрожжей рода Ь'ротусез в почве и в экскрементах мереей А. сойдтоза, питсюшихся субстратом из А г оризонта вернозо-подзолистся почвы.

Рис. 13. Влияние различных концентрация целломичес— коя жидкости червей Е. fétida но динамику роста разных видов дрожжей: А — С. famata; Б — D. hansenii; В - G. geotrichum; Г-Н. burtonii. 1 - Контроль с водой; 2 -2 — Коиентраиия жидкости 1/8 (по обьему); 3 - 1/4; 4 - 1/2.

Время, неделя

Рис. 14. Динамика роста червкй Е. fétida на шсмпикьонном грунте с назозом (4:1) при внесении рсзнььс дрожжей: (1) С. famata; (2) G. geotrichum; (3) — Контрольной всриант без внесения дрожжей.

Время, неделя

Рис. 15. Динсыи:;а росте чь^зей Е. felida из коконов на смеси навоза с шампиньонном грунтом (1:1) при добавлении дрожжей С. famata (*); (2) — контроль без дрожжей. Исходное количество коконов - 10.

живые дрожжи, можно снять этот дефицит, причем витамин будет защищен от прямого действия тиашназы, поскольку он находится внутри клеток дрожжей. Было показано, что внесение дрожжей С. famata (живых и мертвых) и в. geotrlchm в количестве 1 мг/г компоста, существенно стимулирует рост, продукцию коконов и развитие молоди червей. Эффзкт оссбзнно отчетлив за бедном навозом компосте и на последних стадиях .чомпостирова-шя (Рис. 14, 15), при чем прирост биомассы червей на много превитает биомассу внесенных дрокжей, что свидетельствует з пользу стимуляциснного характера эффекта. На основании лабораторных экспериментов и испытаний в хозяйстве рекомендовано использовать этот прием для повышения продуктивности зермякулътуры па бедных органических субстратах. Подана заявка на патент.

В 1J В О Д Ы

1. Впервые проведено обследование ассоциации дрожжей с основными представителями салротрофаых беспозвоночных, среди которых у дишгапод обнаружена наиболее тесная ассоциация с дроздами.

2. На примере основных представителей сапротрсфного комплекса почвенных беспозвоночных - доадевых червей, многоножек, мокриц -показано, что при прохождении пищи через кишечник животных происходит перегруппировка сообщества дроджей, которая выражается в следующем: а. полное элкмикирование дрожжей - обитателей фюшоп-ланы; б. увеличение численности дрожжей рода Trichcsporon - обычных представителей поздней стадии разрушения лесной подстилки; в. выброс кишечных дроджей с экскрементами.

3. Впервые показано, что механизм переваривания дрожжевых клеток в кишечнике диплопод состоит из двух этапов: быстрой гибели клеток за счет действия термостабильного неферментативного фактора, вызывающего нарушения мембранных структур клетки и дальнейшего лизиса клеток за счет пищеварительных ферментов животного и автолитических процессов.

4. Показана селективность действия кишечной жидкости по отношению к дрожжам разных экологических групп. Наиболее чувствительны подстилочные виды и виды, местообитанием которых не является кишечник. Более устойчивы дрожжи рода Trlchosporon и саше устойчивые - кишечные виды. Доказано, что дрожкелитическая активность кишечной жидкости кивсяков не связана с активностью кишечной микрофлоры.

5. С помощью метода меченых атомов показано, что более 80% биомассы дрожжей при пассаже через кишечник диплопод метабсишзирует-ся.

6. Описано сообщество дрожжей-симбионтов кишечника почвенных диплопод, в котором доминируют популяции аскомицетовых дрожжей Debaryomyces hansenll, Torulaspora delbrueckii и Zygo::illiopsls californicus, обитающих исключительно в заднем отделе жиеотных. Симбиотические дрожжи устойчивы к смене режимов кормления и содержания животных. Основные, функции кишечных дрожхей - реутилизация мочевой кислоты и эндогенное питание животных. Показана возможность патологического процесса при естественной ц искусственной замене кишечного сообщества дрожжей на популяцию Candida

Pichia) gullllermondll.

7. Впервые экспериментально установлено, что трофическая деятельность почвенных беспоззоночных вносит существенный вклад б формирование "профильного" распределения дрожжей в почве.

8. Выявлен стимуляционный эффект внесения дрожжей при вермиком-посткровании на рост и продуктивности чэрвей Е. fétida. Рекомендовано использовать этот прием для повышения продуктивности вер-микультур на бедных органических субстратах.

- 35 -СПИСОК ПУБЛИКАЦИЯ 1. Вызов Б.A., By Нгуен Тхань и Бабьева ii.n. Роль дрожжей рода Candida в патогенезе сапротрофлых беспозвоночных. Микроорга-

Тапкбнт.- 1933. '- 36.

2. Бабьева И. П., By Нгуен Тхань. Новые ориентиры для выделения из почв дрояжей-гвдролитиков Llpomvces когюпепкоае Nieuwdorp et al. // Веста. Ыоек. Ун-та. сэр. 17. Почвоведение 1992 №. 2. с. 66-70.

3. Зикченхо О.Н., Лсбанок А.Г., Бабьева И.П., Решетова И.О., By Нгуен Тхань. Декстраназнат актизнссть почвенных дротаей - ли-пошцетоз. Микробиология. 1991. т. 60. н. 5. с. 833-836.

4. Yu Nguyen Thanh and Byzov В.A. The effect of coelomic fluid of the earthworms, Eisenla fetlda, on yeast growth. // In: "Soil Organisms and Soil Health ". Abstr. of XI International, Colloquium on Soil Zoology, Jyvaskyla, 9-14 Aug., 1992, p. 91.

5. Byzov B.A. and Vu Nguyen Thanh. // Applying of yeasts in vermlcomposting system. /7 In: "Soil Organises and Soil Health". Abstr. of XI International Colloquium cn Soil Zoology, Jyvaskyla, 9-14 Aug., 1992, p. 261.

6. Byzov B.A, Vu Nguyen Thanh and Babjeva I.P. Interrelationships between yeasts and soil dlplopods. // Soil Biol. Bioche. Vol. 25, N. 8, pp. 1119-1126, 1993.

7. Byzov B.A, Yu Nguyen Thanh and Babjeva I.P. Yeasts associated with soil Invertebrates. // Biology & Fertility of Soils. 16: pp. 183-187, 1993.

8. Byzov B.A., Polyanskaya L.M. and Vu Nguyen Thanh. The role of yeasts as growth stimulators for Eisenla fetlda in vermicomposting systems. // Proc. of XI International Colloquium on Soil Zoology, Jyvaskyla, 9-14 Aug., 1993. -in press.

9. By Нгуен Тхань, Вызов Б.А., Бабьева И.П. 'Чувствительность дрожжей к пищеварительной жидкости кишечника почвенных многонатек Pachylulus flavlpes C.L. Kock. Микробиология. - в печати

низмы - стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных.