Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЗООМИКРОБНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ПОЧВЕ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ЗООМИКРОБНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ПОЧВЕ"

<Д-ЬЬ¥*е

им правах рукописи

ВЫЗОВ Борис Алексеевич

ЗООМИКРОБНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ПОЧВЕ

Специальность 03.00.27 - почвоведение 03.00.07 • микробиология

АВТОРЕФЕРАТ * диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 2003

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета им. МЛ. Ломоносова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор биологических паук, профессор доктор биологических наук, профессор

Н.М. Чернова Л.О. КарпачевскнЙ Д.И. Никитин

Ведущее учреждение:

Институт Проблем Экологии и Эволюции им, А.Н. Севериова РАН

Зашита диссертации состоится 14 ноябри 2003 года

в 15 часов 30 минут в аудитории М-2 на Заседании Диссертационного Совета Д.501.001.57 при МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ

Автореферат разослан "_" октября 2003 года

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук,

профессор А.С. Никифорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблемы мсжорпиi изменяй х взаимодействий занимают иентрхтьное место в экологии. Первые фундаментальные исследования но изучению структуры Ii функционально!*! роли зоочикробных взаимодействий в почве начались ьо второй половине 20-го века. В нашей стране они связаны с именами М.С. Гиларова, Л.С. Козловской, JI.M ЗагуральскоП^ Б.Р. Сгригановой, Н. М. Черновой, И.В. Стебасва, H.A. Мехтиепой, Д1\ Звягинцева, Н.С, Наниковз, АД, Покаржевскою, a за рубежом - J. Anderson, П, Coleman, D. Parkinson, С. Edwards и других. Показано, что микроорганизмы и беспозвоночные животные образуют в почве пищевые сети, а трофическая и срсдооС-разующая .деятельность животных является фактором, определяющим скорость, направление процессов и активность микробного комплекса в почвах. У беспозвоночных установлены различные формы отношений с микроорганизмами, повышающих эффективность трансформации органических и неорганических веществ.

Участие организмов в почвенных процессах может быть и прямым, и косвенным. Прямое участие реализуется в метаболических процессах, а косвенное предполагает регулирующее действие организмов друг на друга. Метаболические функции осуществляются при использовании организмами химических соединений для получения энергии, углерода, азота и других элементов питания при фото- и хемотрофии, ^-фиксации и других метаболических процессах. Регулирующие функции предполагают модификацию одним из организмов активности другою. Их следствием являются большие потоки энергии и массолереноса, чем собственные метаболические потребности организмов, их вызывающих (Anderson, 1995), В экосистемах основные потоки углерода, энергии и питательных элементов проходят но нищевым связям между бактериями, грибами, простершими и нематодами и меньше связаны с активностью мезо- и макрофауны - микроартро-под, дождевых червей, многоножек и др, (de Ruiter et si., 1997), Беспозвоночные участвуют в метаболизме только 1-10% углеродною потока (Macfadyen, 1963; Reichlc, 1975; I.uxton, 1982), но за счет высокого уровня потребления и среаообразуюихй деятельности они оказывают большое влияние на микробные процессы (Anderson, 1995).

Ключевым принципом, на котором основаны зоомикробные взаимодействия, является неспособность беспозвоночных к синтезу незаменимых аминокислот (Сравнительная физиология животных, 1977), а в почве животные абсолютно зависят от микроорганизмов как источника незаменимых аминокислот (Покзржевекий и др., 1984).

В проблеме зоомикробных взаимодействий выделяются функциональное и структурно-функциональное направления. Функциональное направление ориентировано на выяснение роли беспозвоночных в почвенных процессах: в разложении органического вещества, эмиссии СОг, динамике питательных элементов и др.. Большинство исследований посвящено именно этим вопросам (Coleman et al., 1983; Ingham et al., 1985; и др.). В значительной меньшей степени развито структурно-функциональное направление, в рамках которого изучаются взаимосвязи между органюмами и их функциональное значение в почвах. Важнейшие достижения в этой области связаны с работами no выяснению роли животных в судьбе микроорганизмов (Козловская, 1976; SzaSo,' 19/4; НШЕГпГЛМЖоТТ;

1979 и др.): ередообразующей деятельности животных как &м ест и тел eft- микробах со-

itlOnf,. >■•»■*г "-М

обществ (Szabo, 1974; Bigneil, 1984 и др.) или модификаторов среди обитания микробов (Edwards (Ed.), 199S и др.); роди микробов в питании животных (Сгриганова, 1980; По-карженекий и др., 19S4 и др.).

Актуальность настоящего исследования определяется необходимостью формулирования принципов зоомикробных вэанмодействий в почве, возникающих при компакте микроорганизмов и животных в процессе нитзния (трофические взаимодействия) или их метаболитов (метаболические взаимодействия). Работа посвящена изучению регулятор-пых механизмов я их втзнмодеЙС1вий и их функциональной роли в Экосистемах. Получение фундаментальных знаний в угоЙ области необходимо для развития экологическою направления, представляющего почвенный биотический комплекс как систему взаимодействующих организмов. Знание закономерностей зоомикробных взаимодействий важно для понимания того, как организованы и функционируют трофические сети в почве, а также для решения разнообразных прикладных проблем: при экологическом мониторкк-ie, оптимизации режима питательных элементов в агроэкосистемах, котроля паразитических беспозвоночных (нематод и др.), производства вермикомпостов и многих других.

Цель исследования - разработка теоретических представлений о регуляции зоомикробных взаимодействий и их функциях в почвз нз основе изучения особенностей воздействия микро-, мезо- и макрофауны на микробное сообщество и роли микроорганизмов в жизнедеятельности беспозвоночных животных.

Направления исследования,

1. Определение судьбы микробных популяции (в том числе генетически модифицированных бактерий) при их пассаже через пищеварительный тракт почвенных животных - макрофауиы {дождевых червей, многоножек и мокриц).

2. Оценка роли беспозвоночных в формировании микробного комплекса почвы.

3. Изучение механизмов селективного переваривания микроорганизмов животными и его роди в формировании микробного комплекса почвы.

4. Выяснение особенностей питания животных разными микроорганизмами (разработка микробиологических основ вермн ком [юстирования).

5. Характеристика морфологического и таксономического разнообразия микроорганизмов пищеварительного тракта беспозвоночных и их функциональной рати.

6. Опенка воздействия микрофауны и мезофауны {нематоды и микроартроподы) на состав, активность и продуктивность микробного комплекса почвы; изучение механизмов регулирующего действия этих беспозвоночных на микробный комплекс.

7. Выяснение закономерности трофического поведения хищных грибов в почве: с чем связан переход от сапрочрофизча к хищничесту?

8. Исследование нематоцидной активности энтомопатогенных бацилл в почве.

Научна» новизна. Зоомикробный комплекс почвы действует как единая система, во многом определяющая i гроте канне почвенных процессов. Установлены конкретные регулирующие механизмы, возникающее при прямом взаимодействии беспозвоночных жи-

вотных it микроорганизмов или их метаболнтоа. Показана функциональная роль почвенных и сим биотических микроорганизмов в жизнедеятельности -животных.

Пищеварительный тракт сапротрофны* почвенных беспозвоночных животных, относящихся к макро фауне (диплоподы, дождевые черви), представляет собой особое местообитание микроорганизмов в почве. Экспериментально показано, что микробные сообщества пищеварительного тракта диллопод и дождевых червей состоят из специфических микроорганизмов. В этих сообшествах различаются пристеночные и полостные микробные группировки. В пристеночны к сообществах доминируют факультативно-анаэробные нротеоСактер)ш сем. Enterobacteriaceae и Vibrionaceae и актинобактсрии. И пищеварительном тракте днплопод обнаружены аскомицетовые дрожжи. Доказана сим-биотическая природа .микроорганизмов пристеночного сообщества и показана их функциональная роль. Кишечные симбионты могут служить пищей животных, участвовать в пищеварении, реутилизируя продукты обмена животного, поддерживать устойчивость кишечника к колонизации чужеродными микроорганизмами за счет продукции антибиотиков, вызывать патологические процессы, приводящие к гибели животных.

Сформулировано новое представление о переваривании микроорганизмов беспозвоночными животными, основанном на "киллерном" эффекте пищеварительной среды животных на микробные клетки. Показано, что перевариванию предшествует гибель, клеток, вызываемая веществами небелковой природы, затем происходит ферментативный [ндролиз с участием ферментов животного и автолитических ферментов микробов. Кил-лерное воздействие имеет мембранотропный характер. У кивсяка Pachyiuius flavipez кил-лерный фактор связан с 16-сульфо-гидроксинальч1птшовой кислотой, обнаруженной впервые. Киллерный механизм обнаружен у кивсяков Р. Jlavipes, Megaphyiium roisiewn, Rossiuius kesskri, мокрицы ArmadiUidium wlgarc, у дождевых червей Lumbricus terrestris и Eisenia fettiLi. Установлено, что переваривание микроорганизмов животными вило- и штаммоспецифично. Пребывание в кишечной жидкости животных может вызвать у некоторых микробов последующее замедление скорости размножения. Селективное переваривание является одной из главных причин формирования трофических сетей в почязх.

На примере мокрицы А, vulgare обнаружена передача рекомбинантных и естественных коньюгативных плазм ид от интродуцнрованных штаммов бактерий к кишечным бактериям сем. Enterobacteriacese. Участие беспозвоночных животных в генетическом обмене но-новому ставит проблему оценки последствий интродукции в почву микроорганизмов, в том числе генетически модифицированных, и роли беспозвоночных в создании условии, благоприятных для переноса генов между микроорганизмами и почве.

Показано, что реакция почвенных микроорганизмов на активность нематод и мик-роартропод зависит от соотношения углерода и азота в питательном еубсграте, потребляемом микроорганизмами. Стимуляция микробного роста и активности отмечается только в условиях лимита по доступному азоту. Установлено, что нижний предел попу-ляционкой плотности животных, при котором осуществляется их регуляторное воздействие на микробный комплекс, может быть очень мал: около 10 нематод/г почвы или 10 холл См бол/г опада. Реакция микробного комплекса на воздействие животных может быть быстрей (от 1 сугок) и не пропорциональна количеству потребленной микробной массы, что свидетельствует о метаболической природе эффекта.

Особенности регуляторного воздействия нематод как жертв по отношению к хищным грибам проявляются в том, чю эти животные являются источником физиологически активных веществ для грнСов, а па их основным тшлсвыч ресурсом. Нематоды ограничивают рост и дыхание хищных грибов и стимулируют их репродуктивную активность.

Развивается концепция регуляции зоочикробных взаимодействий, включаюшая трофический и метаболический механизмы. Регуляция по трофическому механизму основана на мобилизации животными питательных веществ, связанных в микробных клетках, их экскреции и высвобождению в почву (вместе с микроорганизмами, размножающимися в пищеварительном тракте), Рыуллция но мегаСоли чес кому механизму предполагает физиологический отклик микробов на метаболиты животных, обладающих свойствами физиологически активных вешеств. Метаболический механизм объясняет многие эффекты, например, быструю реакцию микроорганизмов на воздействие нематод и мик-роартропод, не пропорциональную количеству потребленной микробной массы.

Практическая значимость. Разработан ряд оригинальных приемов э нсперимстального изучения зоомикробных взаимодействий в почве. Предложены способы выделения пристеночного и полостного микробных сообществ пищеварительного тракта мношиожек и червей, определения кил леркой антимикробной активности пищеварительной среди жи-во1ных. Предложен метод опредс.)сния скорости разрушения микробных клеток. Разработан прием определения нематоиидной активности энточопатогенных бактерий. Предложена модификация метода дефаунирования почвы. Создана коллекция микробных штаммов (npoieo- и актинобактерий, дрожжей).

Знания о роли беспозвоночных в создании условий для Генетического обмена между бактериями (в особенности с бактериями кишечной группы), важно при оценке экологической безопасности интродукции микроорганизмов в почву, что тем более актуально, если нигролу цент несет признаки устойчивости к антибиотикам или патогенности.

Предложен способ повышения продуктивности культуры червей Eisen,'а Jetida и эффективности процесса верми компостнрования на бедных органических субстратах (orpaCotanHiifi шампиньонный грунт) с помощью микроорганизмов-стимуляторов роста червей (дрожжей, мицелия грибов).

У природных изолятов энточопатогенных бацилл Bacillus thvringiensis обнаружена неспепифическая нематоцадпая активность, проявляющаяся как in vitro, ток и & почве, которая может быть обусловлена термолабильными агентами белковой природы. Отобранные штаммы могут быть использованы для борьбы с фитопатогенными нематодами,

Реализация результатов. Результаты исследования могут быть использованы в экологическом мониторинге, при разработке экологически безопасных биогехнологнй, при изучении микробного разнообразия, при поиске микробов-продуцентов физиологически активных веществ, при оценке риска интродукции микроорганизмов в почвы. Материалы работы используются в курсах лекций "Биология почв", "Почвенные животные и их взаимодействие с микроорганизмами"

Основные защищаемые положения. В основе регуляторного воздействия беспозвоночных животных на микробный комплекс лежат несколько основных принципов.

1. Беспозвоночные осуществляют отбор микроСннк популяций и модифицируют микробные сообщества, пассируя пищевые субстраты через свой шнцсварительиы¡1 тракт. Переваривание микроорганизмов животными основано на "киллерном" эффекте; оно - вило- и шмаммоспецифично. Киллерный механизм - фактор, определяющий разнообразие трофических связей в почвах. В ряде экосистем роль макрофауны в регуляции продукционно! о процесса микроорганизмов существенна.

2. Кишечник беспозвоночных - специфическое местообитание в почве, отличающееся по составу н активности микробов. Функциональная роль кишечных симбионтов беспозвоночных во многом аналогична таковой у позвоночных.

3. Животные регулируют рост и активность микроорганизмов и как хищники (микро-бофаги), и как игертвы (хищные грибы-нематоды). Результат регуляции меняется ог стимулирования к иигибнрованию при увеличении обеспеченности микроорганизмов азотом и при возрастании популяциоиной плотности животных выше определенною уровня. Животные меняют скорость микробной сукцессии и состав доминирующих микроорганизмов. Реакция микроорганизмов на воздействие животных может быть очень быстрой и проявляется при низкой популяциоиной плотности животных-хищников. И стимулирующее, и ннгибируюшее влияние фауны на микробный комплекс, регистрируемое в виде быстрого ответа, не пропорционально количеству потребленной микробной массы.

4. В регуляции со стороны микро-, чезо- и макрофауны много общего. Это - наличие пищевой специализации в отношении микробов; предпочтение в пищу тем неокрашенных грибов; киллерный механизм переваривания; быстрый ответ микробов на послание (появление) животных; увеличение доли бактерии в ходе сукцессии. Общим является и то, что в основе регуляции лежат трофические и метаболические механизмы. Регуляция по трофическому механизму основана на мобилизации животными питательных веществ, связанных в микробных клетках, их экскреции и высвобождению в почву микроорганизмов, размножающихся в кишечнике. Регуляция по метаболическому механизму предполагает физиологический отклик микробов на метаболиты животных, обладающих свойствами физиологически активных веществ. Метаболический механизм объясняет быструю реакцию микробов на воздействие животных, не пропорциональную количеству потребленной биомассы.

5. Прямая регулирующая роль микро- и чезофауиы во много превосходит таковую у макрофауны и сводится к активизации или подавлению отдельных микробных популяций в почве.

6. Отличительной особенностью взаимодействия микроорганизмов с макрофауноП является наличие развитого микробного сообщества в пищеварительном тракте.

Место проведения работы. Работа выполнилась в период с 1987 по 2003 гг. на кафедре биологии почв факультета иочвоьсдсния МГУ им. М.В. Ломоносова,

Благодарности. В 1993-1994 гг. раиота била поддержана Фондом Сороса и Правительства РФ (гранты NDAOOO и NDA300). В 199-1-1996 гг, работа была поддержана ¡рангом Министерства Образования, Науки и Технологии Германии и грантом РФФИ N 95-04-11942а. С 1996 г по настоящее время работа поддержана грантами РФФИ N 96-04-48418, N 99414-48000, N 02-0449049. Автор выражает благодарность своим учителям и коллегам Д Г. Зиягинневу, B.C. Гузе-ву, И.П. БаСьевой, Т.Г. Мирчвнк, Т.ГДобровсшьской, Г.М. Зеноеой, O.E. МарфениноЙ, Л.М. Полянской, JI.B. Лысах, АЛ. Степанову, By Нгуен Тхань, Я.М.Рабиновичу, Е.Б, Третьятоеой, Н.Ф. Рябченко, НД Романенко, A.B. Куракову, НА.КузнецовоЙ, И,Ю Чернову, H.H. Голыши ну, В.В.Демину, А_Г.Андрееву, АД Покаржсвскочу,Л.Г. Ягловой, Г.В. Коссовой, Л.Ш. Мамилову, И.Н. Мозговой, В Л. M игу новой, Нгуен ДТЛыу, H.H. Бабкиной, HB. Зитшу, C.B. Левину, Г.И. Селецкому, Ю.Б. Быаовой, 3. Филину, Дж. Андерсону, X. Клаусу, О. Дил-ли за поддержку шей, выполнение отдельных разделов экспериментальной работы, техническую помощь и дискуссии.

Личный вклад автора. Автор принимал личное участие во всех этапах исследования. Ему принадлежит формулирование проблемы, постановка целей и задач, планирование экспериментов. Автор участвовал в сборе значительной части полевого материала, в выполнении эксперимешальной paCoiu, в обобщении и интерпретации полученных результатов, в подготовке основного числа научных публикаций, многократно выступал с научными докладами. В работе исиользованы материалы, полученные в соавторстве с аспирантами и студентами, проводившими исследования под руководством автора.

Лпровация. Основные положения аиссерташи докладывались на IX, XI и XII Международных коллоквиумах по почвенной зоологии в Москве (1983 г.), а Ювяскила, Фикдлян-дня (1992 г.) ti в Дублине, Ирландия (1996 г); на IX Международном симпозиуме по биологии почв в Кетцхеи, Венгрия (1989 г.); на Всесоюзном совещании по проблемам почвенной зоологии в Тбилиси (1987 г.); на Всесоюзных конференциях "Биодинамика почв" в Таллине (1988 г.) и "Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных" в Ташкенте (1989 г.); на научном семинаре Института Гигиены почвы, воды и но «уха в Лангене, Германия (1993 г.); на Ломоносовских чтениях в МГУ (1996 и 2002 тг.); на XVIII Международном специализированном симпозиуме по дрожжам в Бледе, Словения (1997 г.); на Международном нематологическом симпозиуме в Москве (1997 г.); на Республиканской научной конференции "Состояние и рациональное использование почв республики Казахстан" в Алма-Ате (1993 г.); на II (XII) Всероссийском совещании по почвенной зоологии в Москве (1999), на заседаниях и научных семинарах кафедры биологии. На конференции, посвященной 100-летию со дня рождения E.H. Мишусти-

на в Москве (2001 г). На Международно« симпозиуме "Структура и функции почвенной микробиоты'* в Марбурге, Германия (2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 56 работ, в том в числе 32 статей, 23 — в рецензируемых журналах, 5 — в сборниках, 3 - в коллективных монографиях; 25 работ опубликованы за рубежом.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 -3-я главы), объектов (4-я глава), методов (5-я глава), результатов и их обсуждения (5 глав), заключения. Текст диссертации изложен на страницах и иллюстрирован 54-мя рисунками и 56-тью таблицами. Список литературы включает названий.

КРАТКОЕ СОДРЕЖАНИЕ РАБОТЫ В главах 1-3 лам обзор литературы, В главе I проанализированы современные представления об участии животных в поч пенных процессах: модификации физико-химических свойств почвы, деструкции органического вешества, в круговороте питательных элементов и питании растений, в образовании гумуса и других, В главе 2 рассмотрены взаимодействия микроорганизмов и животных в пищевых пепях. Анализируются особенности питания животных и роль микроорганизмов как источника питания. Выявляется регуляторная роль животных в функционировании микроорганизмов, осуществляющих никл углерода, азота и других биогенных элементов, в судьбе микробных популяций и сообществ, а также роль микробов-антагонистов в жизни животных, В главе 3 дается анализ ассоциативных связей микроорганизмов с животными, Рассматриваются особенности пищеварительного тракта животных как среды обитания микроорганизмов. Дается таксономическая характеристика микроорганизмов кишечника.

4,5. Объекты и методы исследования

Почвы и другие субстраты. Полевые и лабораторные исследования проводили с образцами следующих почв.

1. Дсрново-нодзол истая среднесу глинистая почва на морене под ельником-кисличником, район агробиостаиции МГУ "Чешниково", Московской обл. Образцы почв отбирали с глубины 0-15 см горизонта А|.

2. Дерново-подзолистая среднесуглинистая почва на морене, отобранная на опушке смешанного леса в районе агробиостаиции "Чашниково".

3. Дерново-подзолистая среднесуглинистая почва на морене под смешанным лесом, нос, Салтыковка, Московской обл,

4. Окультуренная дерново-подзолистая почва, отобранная на опытном участке Института паразитологии РАН под посадками черной смородины, Москва.

5. Дерново-подзо.1 истая суглинистая почва на морене поя мелколиственным лесом, Почвенный стационар МГУ им. М.В. Ломоносова.

6. Вермикомпосты готовили, смешивая отработанный шампиньонный фунт (верховой торф, солома, доломитовая мука, после 3-х месяцев выращивания шампиньонов) и перепрелый коровий навоз в отношении 8:2 и 1:1, а также па чистом навозе.

.Микроорганизмы. Использовали различные бактерии, дрожжевые (рибы и микрочиие-ти, изолированные из подстилок и почв различных типов, кишечника и экскрементов животных, а также музейные культуры из коллекции кафедры биологии почв МГУ.

Беспозвоночные животные. Использовали представителей почвенной микро, мезо- и макрофауны: нематод, микроартронод, диплопод, изопод дождевых червей, собранных в подстилках и почвах разных типов (табл. 1). Животных собирали в следующих подстилках и почвах.

7. Подстилка сметанного леса, дерново-подюд истая среднесуглинистая почва на морене. пос. Салтыковка, Московская обл.

3. Дерново-подзолистая средиесугдннистая почва на морене под смешзкным лесом, пос, Салтыковка, Московской оОл.

9. Чернозем типичный тяжел осу глинистый пылсвато-иловатый на лессовидном суглинке, Курская обл.

10. Подстилка, посадки акации, чернозем обыкновенный на лессовидном суглинке. Ростовская обл.

11. Подстилка широколиственного леса (бук, дуб, граб, ясень), бурая лесная почва на красноцветной коре выветривания, Мукачсво, Украина.

12. Подстилка широколиственного леса (дуб, грабинник), коричневая почва на карбонатной породе, Гурзуф, Украина.

13. Подстилка пол ельником кисличником с липой, лещиной и рябиной в подлеске, слабоподзолистая почва нылепато-иловатая на покровных суглинках, Московская обл.

Принципиальная особенность работы - лабораторное моделирование зоомнкробных взаимодействий с использованием разных уровней организации: организменного, попу-л я иконного и уровня сообществ. Использовали микроскопические методы язя морфо-метрической характеристики и подсчета микроорганизмов in vitro и in situ; метод посева - дпя сравнительного анализа таксономического состава и обилия микроорганизмов; BIOLOG - язя идентификации бактерий; гельхроматогорафию - для фракционирования и характеристики компонентов пищеварительной жидкости животных; газовую хроматографию и поляро! рафию - для определения дыхания микроорганизмов; радио изотопны Я метод — для определения скорости переваривания и ассимиляции микробов; методы on-

ределсния микробной биомассы; методы идентификация плазм ид, ДНК-фингер принт -для изучения генетического обмена между бактериями и другие методы (табл. 2).

Таблица ). Животные, их местообитания и почвы

/KitBOTHbie Местообитание Экосистемы

Miioroii№KKii: Pachyiuius Jíavipes C.L.Koch подстилка широколиственного леса (дуб. грабинник), коричневая почва на карбона!ной породе Лесные. Гурзуф, Крым

Gtomerk connexa C.L.Koch Leptomlus potonicus Jawlowski MegaphyUum projectum (Verhoeff) Megaphylium rossicum (Tim) подстилка широколиственного леса (бук, дуб, граб, ясень), бурая лесная почва на красноцветной коре выветривания подстилка широколиственного леса (дуб), чернозем типичный тяжелосугдинистый пылевато-иловатый на лессовидном суглинке подстилка, посадки акации, чернозем обыкновенный на лессовидном суглинке Лесные. Мукачево, Украина Курская обл.

MegaphyUum rossicum (Tim) Rossiulus kessleri (Lohm.) Лесостепь, Ростовская обл.

MoKpiiuu: Trachehpus rathkei (Brand) ArmaJiUUium vulgare (Latr.) подстилка широколиственного леса (,туб, грабинник), коричневая почва на карбонатных породах Лесные. Гурзуф. Крым

JoimesMe •lepBii: Lumbricus terrestris (L.) Lumbricus rubeUus Hoffin. Aporrectodea caliginosa (Sav,) подстилка смешанного леса, лерновоподзол истая средне-суглинистая почва на морене Лесные. Московская обл.

Etsenia fétida (Sav.) вермикомпост на отходах шампиньонного производства

KojuieMGojibi: Orckesella flin-escens Bourl. Pogonognaihellusjlavescens Tutlb. Sinella coeca (Schott) подстилка под ельником кисличником с липой, лещиной и рябиной в подлеске, слабоподзолистая пылсвато-среднесуглинистая почва на покровных суглинках Лесные. Московская обл.

Fokomia candida Willem почво-грунт из-под цветов

HcMaTOíiw; Ccenorkobditis elegans Maupas лабораторная культура -

Таблица 2. Методы и задачи

Метод Задача

1. Сканирующая электронная микроскопия 2. Трансмиссионная электронная микроскопия Морфологическая характеристика микроорганизмов in vitro и in situ

3. Посев на селективные среды 4. вююо Определение таксономического состава и структуры микробных сообществ кишечника и экскрементов животных Определение жизнеспособности микробных клеток в пищеварительной жидкости

5. Метод агаровых блоков Определение антибиотической okthbhoci н акта но минетов

6. Гель-хроматография на сефадексе 1Л-20 Фракционирование компонентов пищеварительной жидкости

7, Радио изотопный метод Определение ассимиляции и скорости переваривания микроорганизмов

8. Газовая-хроматографня 9, Поляро(рафи чески Й метол Определение дыхания микроорганизмов

10. Метод субстрат-индуцироваиного дыхания 11. Метод фумигации-экстракции 12. Метод люминесцентной микроскопии Определение биомассы микроорганизмов Определение численности бактерий и длины грибного мицелия

13. Выделение пяазм ид, электрофорез в агарозе 14. ДНК-фингерпринг, скрещивание Изучение генетического обмена между бактериями

15. Метод Бермана 16. Метод Флега 17. Центрифугирование в сахарозе Экстракция нематод

18. Метод Тульгрена Экстракция микроартропод

Достоверность и обоснованность. Результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием стандартных программ. Обоснованность выводов следует из трактовки достоверных результатов и сопоставления их с ранее известными данными,

6. Роль макрофауны в регуляции состава и активности микробного комплекса почв

В главе 6 анализируются особенности регуляториого действия крупных беспозвоночных: многоножек, дождевых червей и мокриц на микробный комплекс почв.

Изменения численности и структуры популяций микроорганизмов при пассаже через пищеварительныи тракт животных

Регуляторное действие животных на микробный комплекс связано с эффектами, возникающими при пассаже микроорганизмов через пищеварительный тракт. При пассаже через пишеваритсльный тракт животных-макрофауны (долевых червей, многоножек, мокриц н др.) возрастает обилие бактерий (Parle, 1963; другие; [3, 8]) и сокращается обилие трибов (Hanion, 1981; другие). Обшая биомасса при этом падает (Паников и

лр-, 1984) Судьба микробных популяций при прохождении пищеварительного тракта может включать почти тотальную гибель и элиминирование, ингнбирование роста, сохранение жизнеспособности, инициацию роста, размножение.

По данным люминесцентной микроскопии увеличение численности бактерий при пассаже через пищеварительный тракт кивсяка РаскуШиз/¡ау'!рез и дождевого червя Е'и-епш/егШа может составлять 2-3 раза, а но данным посева - в 10 раз [8]. При этом отношение численности, определенной при микроскопии и методом посева меньше в экскрементах, чем в корме. Это означает, что при пассаже через пищеварительный тракт животных возможен не только рост бактериальных популяций, но и активизация покоящихся клеток (табл. 3).

Таблица 3. Увеличение общей численности бактерий при пассаже через пищеварительный тракт кивсяка Pachyiulus flavipes и дождевого червя Eisenia fétida по данным люминесцентной микроскопии и посева и отношение микроскопия/посев

Вариант Микроскопии численность клеток, х ю'/г Посев численность КОГС.х 10®/г

Р. fia vipes Е. fétida P.fiavipes Е. fétida

Корм1 15,6 ± 1,3 2,3-0,32 4,9 ± 0,37 9,8 ± 0,32

Кишечник 4,3 ± 0,35 0,73 i 0,06 1.43 ±0,15 7.3 ± 0,52

Экскременты 32 i 2,6 7,1 ± 0,6 22,3 ± 1,7 38,2 ±3,6

Отношение численности: микроскопия/посев

P.flavipes Е. fétida

Корм 32 2,35

Экскременты 14,3 1,86

1 - корм кивсяков - перезимовавший дубовый опад; червей - вермикомпост; для микроскопии и - 66, Р < 0,05, для посева п «= 3-5, Р < 0,05,

Перераспределение обилия групп микроорганизмов приводит к тому, что в субстрате возрастает доля бактерий и падает доля грибов. Например, при верм и компостировании органических отходов червями Е, /е{¡(¡а за 3 месяца доля грибов в комплексе уменьшалась в 4 раза, а бактерий возрастала в 4 раз (табл.4) [6,24,40],

Таблица 4. Модификация группового состава микробного комплекса {биомасса по методу люминесцентной микроскопии, мкг С/г) верм и ком поста, приготовленного из отходов шампиньонного производства, дождевым червем Eisenia fétida__

Микроорганизмы До компостирования: навоз с шампиньонным rpvtrroM «1:4 (Л) Через 3 месяца компостирования с червями (Б) Б/Л

Мицелий грибов 5,4 1,4 0,24

Споры грибов и 0,49 0.6 U2

дрожжи

Мицелий 0,01 0,07 4.8

актино ми истов

Бактерии 0,04 0,13 3.0

Общая биомасса 5,8 3,2 0,38

Шмекеиня таксономического состав» микробных сообществ

Кроме изменения общего обилия при пассаже происходят структурные изменения в составе микробного комплекса. Так, в экскрементах кивсяка Р. ßavipes возрастает численность трамотринательных аэробных протеобактерии (в основном, рода Pseudomonas), актиномицетов, бацилл и бактерий актиномицетнои линии, при этом 1рамотрииатсльные аэробы всегда сохраняют доминирование, В экскрементах появляются грамотрииатель-ныс факультативно-анаэробные протеобактерии типичные для пристеночного кишечного сообщества (см. глава 8}. В группе актиномицетов структурные перестройки при пассаже носят менее закономерный характер. Тем не менее, таксономическая структура сообщества корма всегда в той или иной степени отличается от сообщества содержимого и свежих экскрементов. Это свидетельствует в либо пользу селективного стимулирования роста, либо избирательного переваривания мицелия или спор актиномицетов разных родов. Численность отдельных видов грибов падает от 2 до 25 раз и более. Теми »окрашенные грибы сем. Dentatiaceae более подвержены выеданию животными. Численность некоторых грибов может и увеличиваться при пассаже, вероятно, за счет образования спор. Численность дрожжей меняется незначительно, но происходит полная смена сообщества. Пигментированные дрожжи Aureohasidt«т pullulans, Rhodotorula rubra, характерные для филоиланы и свежего опада, исчезают. Некоторые вилы дрожжей (например, Trichosporon cutaneum) размножаются, В экскрементах появляются новые виды, типичные ятя кишечника животных (см. ниже) (табл. 5) [1,3,7,8,14].

Модификация микробных сообществ при пассаже через пищеварительный тракт • это следствие отбора популяций в кишечнике. Судьбу микробных популяций определяли, скармливая чистые культуры животным. Из экскрементов кивсяка Р. ßavipes бши выделены доминирующие бактерии Pseudomonas sp. и Promlcromonospora citrea, и отобраны клоны, устойчивые к стрептомицину. После скармливания на модельных субстратах било отмечено размножение бактерий как у кивсякое, так и у дождевых червей. Максимальную скорость роста наблюдали у нсевдомонад. Время генерации в кишечном тракте у кивсяков составило 4,6 ц, а у дождевых червей- 0,7 ч (табл. б). Такая высокая скорость роста сравнима с таковой при росте на питательных средах [8].

При пассаже через кишечник возможна практически полная (ниже предела определения методом посева) или частичная гибель микробов. Например, численность дрожжей, характерных ДЛЯ филопланы Rhodotorula gramwh и опада Trichoiporon pullutans и Candida scouii. падала в 100-10000 раз, А дрожжи Debaryomyces hansenii и Pichia guilliermondii, выделенные из кишечника животных, погибали не полностью или не погибали (табл. 7) [1,2].

Таблица 5. Структура доминирующих микроорганизмов в корме и экскрементах кивсяка Pachyiulus flavipes, питающегося дубовым опадом

Корм Экскременты

Микроорганизмы КОЕ * 10<Уг Микроорганизм ы КОЕ x lOVr

Бактерии

грамотри нательные 31.6 a* грамотрицательные аэробные 794 6

аэробные и факультативно-анаэробные

Streptomyces spp. 7.9 a Streptoniyces spp¿ 501 6

Bacillus spp,. 6.3 a Bacillus spp. 3166

коринеподобные 2.5 a кори неподобные 251 6

Дрожжи

Candida sp. 0.32 Debrtyomyces hansenii, Toruîaspora delbruectíi. Zygoivilliopsis cali/ornicus {-WïUiopsis calofornica) 0.5

Aureobasidium pullulons 0.16 Pichia membranaefaciens 0.03

Rhodotonda rubra 0.05 Tríchosporon cutaneum 0.016

Trickosporon cutaneum 0.01 Calactomyces geotrichum 0,01

Cryplococcus albidus 0.0! 6 Kloekera apis 0.008

Микромииеты

Dematiaceae 2.0 a Dematiaceae 0.08 6

(myceJía stcrilia, другие) (mycelia sterilia, другие)

Pénicillium spp. 0.5 a Pénicillium spp. 0.S

Ctadosportum 0.16 a Ç. elùdosporioides 0.03 6

cladosporioides

Acremon ium sp. 0.1 a Acremonmm sp. 0.025 6

Mucorspp. 0.05 a Mucor spp. 0.016

Trichoderma sp. 0.02 a Trichoderma spp. 0.01 a

Alternaría altérnala 0,00 4

* разные буквы показывают достоверные различия, п=«3, Р<0,05

Таблица 6. Динамика выживания устойчивых к стрептомицину Pseudomonas sp. и Promicromonospora citrea в кристалической целлюлозе и при пассаже через пищеварительный тракт кивсяка Pachyiulus ßavipes, Ки вся ков содержали на целлюлозе, обогащенной чистыми культурами бактерий в количестве около 10 КОЕ/г

Время от Численность (Ig КОЕ/г)

начала опыта. Pseudomonas sp. Promicromonospora citrea

сут. Корм экскременты корм экскременты

2 8.9 а* 8,8 а 9,3 а 9,1 а

4 8,3 а 8,8 6 8,2 а 8,4 а

7 7,5 а 8,06 7,3 а 7,5 а

И 6,4 а 6,96 6,1 а 6,7 6

18 5,1 а 6,2 6 4,7 а 6,06

25 3,5 а 4,7 С 3,5 а 4,4 6

* разные буквы показывают достоверные различия, п=3, Р<0,05

Таблица 7. Численность дрожжей в корме и в свежих экскрементах кивсяка РасНутЫ Атчрез, питавшегося стерилизованной целлюлозой, обогащенной дрожжами. Каждую неделю корм обновляли, п=3

Дрожжи корм Численность дрожжей, КОЕ к 10"/г экскременты

7 сут. 14 сут. 21 сут.

R, graminis 10 0,001 и.о. н.о.

Т. puüulans 6,3 0,08 н.о. И.о.

С. scottii 93= 16 0,5 ±0,1 3,4-0,5 0,5 ± 0,1

D. hansenil 15 ±4 0,2 ±0,1 9,0 ±2,3 1,6 0,1

Р. guiUiermondii 82-10 49 ±29 45 ± 11 6,6 ± 1,3

н,о, — ни определяли

И н и i щация прорастания спор бацилл

Пассаж через пищеварительный тракт дождевых червей Aporrectodea caliginosa почвы, обогашенной вегетативными клетками бациллы BaciUus ihuringiensis, вызывал снижение обшей численности бацилл. При скармливании червям почвы, инокулиро-ванной спорами, наблюдали либо падение общего титра бацилл и их спор, либо численность не менялась (табл. 8). Споры бацилл чрезвычайно устойчивы к пишеваритеяьной среде животных (см. ниже). Поэтому уменьшение количества спор (КОЕ) при пассаже может быть líe следствием их переваривания, а, наоборот, инициацией прорастания с последующей гибелью вегетативных клеток. Таким образом, в кишечнике животных возможна инициация прорастания спор. Механизм инициации не известен, но можно предположить, что пищеварительные секреты червей содержат вещества.

вещества, стимулирующие рост бактерий. Известно также, что в передний отдел кишечника червей секретируются водо-раетворимые органические вещества (мукопротеины), концентрация которых затем резко падает в среднем к заднем отделах (Trigo, Lavelle, 1993). Вероятно, эти соединения инициируют прорастание спор бацилл и (или) являются субстратом для их роста.

Таблица 8. Возействие пассажа через пищеварительный тракт червей Лроггес/оЛеа сана споры ВасШиз !киг^кпз1$ \'аг, кгае1ск$к 1-51, внесенные в дерново-подзолистую почву, обогащенную различными источниками углерода

Вариант Численность, КОЕ/г Почва Экскременты Результат

Почва общая (1,5 ±0,2) х10( (0,7 ± 0,2) х 10* элиминирование

Без добавок споры1 (1,1 í 0,2) хЮ® (0.8 ± 0,2) хЮ* в 2 раза

Почва +1% обшая (5,8±0,8)х10' (6,5 £0,1) xlO1 численность

целлюлозы споры (4,8 * 0.9) х 107 (5,4 ± 1,5) xlO7 постоянна

Почва общая (8,1 ± 1.8) х107 (1,3±0,5)х107 элиминирование

крахмала споры (8,1 ± 1,1) хЮ5 (1,0±0,1)х10т в б раз

Почва т1% обшая (1,3±0,3)х10® (1,1 i 0,3) x!0s численность

глюкозы споры (U±0,4)xl0s (l,0±0,4)x]0e постоянна

1 - даны результаты посева, произведенного через б суток после внесения бацилл и источников углерода; численность бацилл в момент внесения - (1,5 ±0,2) х!0й

2 - численность спор определяли, вычитая из обшей численности КОЕ численность, полученную при высеве суспензии, про!ретой при 80° 10 минут (Мишустии и др., 1979)

Трофическая деятельность дождевых червей и распределение микроорганизмов в н оч вен но ч профиле

Трофическая активность животных регулирует распределение микроорганизмов по почвенному профилю (Рис. 1). В экскрементах обитателей подстилок червей Ь гиЬеНш, которым о лаборатории скармливали разлагающиеся листья из слоя I* подстилки дерново-подзолистой почвы, доминировали дрожжи рода ТпсИозрогоп, являющиеся минорным компонентом в слое Ь. При пассаже через пищеварительный тракт червей эти дрожжи размножаются, и экскременты, обогащенные ими, попадают в нижний слой подстилки Р+Н, В пробах из этого слоя также доминировав и Гг1ско$рогоп зрр. Экскременты ги-питавшихся подстилкой, отобранной из слоя Р+Н, содержат меньше ТгкЬо$рагоп, чем их корм, поскольку зги дрожжи перевариваются червями в составе другого субстрата, В горизонте Л[ по-прежнему доминироаали дрожжи рода ТУ/е&м/тагоя, Они, по-видимому. попадают сюда вместе с экскрементами подстилочных червей. Эти дрожжи выживают и при пассаже через пищеварительный тракт обитателей горизонта А] червей

A. caliginosa. Напротив, пигментированные дрожжи выделялись только из верхнего слоя подстилки и эли минировались при нассажс через кишечник подстилочных червей. Обитатели органо-минеральных горизонтов дрожжи рода Lipomyces выделяются из экскрементов червя A. caliginosa. Их относительное обилие в экскрементах не снижается, и они долго сохраняются жизнеспособными. Таким образом, на примере дрожжей вого населения отмечены две закономерности: (1) профильное распределение микроорганизмов может быть следствием селективного элиминирования или размножения микробной популяции при пассажс; (2) судьба микроорганизмов при пассажа ззвиагг от того субстрата, в составе которого они попадают в пищеварительный тракт животных. В результате пассаже происходит не только перемещение органического вешества в профиле, но и смена доминантов в микробном комплексе. Вклад животных в профильное распределение микроорганизмов велик, особенно в луговых экосистемах, где численность дождевых червей максимальна.

Вклад макрофауны в продукционный процесс почвенных микроорганизмов

Долговременный аффект животных на динамику микробной биомассы и продукционный процесс микробного комплекса в естественных условиях трудно оценить. Однако экстраполяция экспериментальных данных и теоретические расчеты позволяют представить тенденцию этих процессов, В опыте по вер ми компостирован ню отходов шампиньонного производства за счет деятельности червей Е, fétida через 3 месяца биомасса грибов упала в 4 раза, а бактерий и актнномииетов - возросла соответственно в 3 и 7 раз (табл. 4), Относительное увеличение доли бактерий при разложении растительных остатков отмечается и в присутствии микро- и мезофауны (см. ниже). Эти факты согласуются с представлениями о важной роли грибов в питании почвенных беспозвоночных (Edwards, Fletcher, 1988) и возрастании роли бактерий на поздних этапах сукцессии.

В дерново-подзол истой почве за счет роста в кишечнике дождевых червей за сезон проходит одна операция неспороносных бактерий, а сезонная продукция бактерий в подстилке за счет их роста в кишечнике диплонод не превышает сотой доли от суммарной численности бактерий, учитываемых на МИА в лесной подстилке (Горбенко и др., 1986), Таким образом, роль червей в продукционном нропессе бактерий значительно выше, чем диплопод. Если принять во внимание, что в среднем за сезон в почве сменя-

З13 %

С £10

S

L Эрс F-H Экс Lumbricüs mhcilus

А, Экс Aporree todej caUpnösa Trichospöron ш Пигментированные "Лспорогснныс aCryptococcus

Рис. 1« Влияние дождевых червей на профильно* распределение дрожжей ъ дерново-подзолистой почве» L, F**H - ело и ПОДСТИЛКИ^ А| - Г}и}С0*^4ХКумуляТИВКЬ1Я горизонт Экс, - гы.

ется 3-25 генераций микроорганизмов (Паников, 19912), то в ряде экосистем, например, в луговых или в окультуренных почвах, где плотность дождевых червей высока, их роль в регуляции продукционного процесса микроорганизмов можно считать существенной.

Трофическая деятельность беспозвоночных (макрофауны) к генетический обмен между бактериями в почве

Следствием размножения или активизации бактерий в кишечнике может быгь генетический обмен между ними. Опенка риска интродукции генетически модифицированных бактерий в почву показала, что некоторые из них долгое время выживают на растительном опаде и в почве, а, попадая в кишечник животного, размножаются. Впервые обнаружена передача рекомбинантной коньюгативной плазмиды pLV!0i7 от интродуцированного штамма Pseudomonas pittiih PaW340 (pLVIOlT) к диким кишечным бактериям сем. Enterobaeteriaceae (Enterobacter gergovia) в результате пассажа через кишечник мокрииы А. vulgare (га6л. 9) [II, 15, 47]. Также обнаружена передача естественной коньюгативной плазмиды pAXlflx между Enterococcus faecalis JH2-2 (pAMfi) н Bacillus thuringiensis var. israelensis 1-5 в вермикомпоеге и экскременгах червей Е, fetida [10,16]. Генетический обмен может протекать в естественных условиях с частотой, сопоставимой с таковой in vitro (2-10 х 10'1 трапсконьюгантов на реципиент) [lOJ. Попадая в кишечник животного, штамм интродуцента имеет, кроме того, шанс приобрести нлазмиду от дикого штамма. Это, в конечном итоге, может стать причиной возрастания множественной устойчивости бактерий к антибиотикам, что особенно актуально, если интродуиент песет признаки патогенности.

Таблица 9, Генотипическая и фено типическая характеристика бактерий - возможных трансконъюгантов, выделенных из дубового опала и экскрементов животных, питавшихся кормом, обогащенным Pseudomonas stützen JM302 (pLVJOH) иди Р. pulidct PaW340 (pLl'1017)

Источник Характеристические признаки штаммов

выделения Плазмиды Устойчивость, мг/л С 230* DNA- flngerpHnts BIOLOG

опад PLV10I3 R£20, Nx50, Sml5, Knl5 + JM302 Burkholderia cepacia

опад pLVIOtt Rf20, NxSO, Sml5,Knl5 * Схожий с JM302 Salmonella sp., В. cepacia

экскременты, червей pLVIOtt Rf20, NxSO, SmlS,Knl5 Схожий с J.M302 Alcaligenes xvlosoozidam

экскременты мокриц pLVIOl? Ap50, KnSO, Tc50 1 не PaW340 В. ccpacia

экскременты мокриц pL VIOl 7 Ap50, KnSO, Tc50 - не PaW340 Enterobacter gergovta

' - наличие активности катехол 2,3-диоксигеназы; Rf - рифампицин, Nx - налиликсовая кислота, Sm - стрептомицин, Кп - канамицин, Ар - амиииилин; Экс, - экскременты

7. Микроорганизмы и питание животных

В главе 7 рассматривается роль микробов в питании, механизмы переваривания микробных клеток и другие эффекты, возникающие с микроорганизмами в пищеварительном тракте животных.

Антимикробная активность пншеварительной жидкости животных

Для объяснения причин избирательной гибели микроорганизмов в кишечнике проведено тестирование антимикробной активности пищеварительной жидкости ряда животных по отношению к бактериям, дрожжам и грибам, изолированным ил разных мест обитания. В пищеварительных экстрактах кипсяков РасИуМю Аа\гре;. Ме$арЬуИит го%-%1сит. ЛопЫи! кеЫегц мокрицы АгтасЬШсИит \~и1&агеу дождевого червя ЬтЬгки; 1ег-геМт и виноградной улитки НеИх ротаНа впервые обнаружена так называемая "киллерная" активность. На примере эпифитных и почвенных дрожжей показано, что один и тот же микробный штамм может Сыть чувствителен к перевариванию одним животным и устойчив к пищеварительной жидкости другого. Это позволяет сделать вывод о различном составе киллерных вешеств у животных и о том, что каждый вид животного имеет свой круг микробных жертв (табл. 10), V наиболее чувствительных штаммов Солее <Ж« клеток гибли в первые минуты инкубации в кишечной жидкости. У менее чувствительных штаммов доля жизнеспособных клеток выше, а нечувствительные штаммы не погибали в течение суток. К чувствительным микроорганизмам относятся обитателилистового опада или почвы, а к более относительно устойчивым • обитатели кишечника и экскрементов животных. Ес1ь и абсолютно устойчивые микробы - некоторые кишечные изоляты, а также некоторые подстилочные визы (например, дрожжи рода ТгкЪтрогоп ). Обнаружена видовая и штаммовая селективность кнллерного эффекта [12-14,42).

Состав и киллерная активность пищеварительной жидкости РасНу1и1и$/1а\1ре$

С помощью гель-хроматографии на сефа-дексе были разделены неферментативная (киллерная) и фермента гиена я фракции кишечной жидкости. Гибель клеток связана с активностью неферментативной (небелковой) фракции, а ферментативная, напротив, не вызывает ни быстрой гибели популяции, ни разрушения клеток. Только совокупное действие этих фракций вызывало эффективное переваривание (Рис. 2,3). Киллерная активность исчезает при разбавлении в 6 раз [12-14],

Действие кишечной жидкости и се киллерной фракции приводит к ингибированию дыхания, разрушению органелл, отслоению иитоплаз мат и ческой мембраны, разр^ше-

ЕНи«к*е ь* щечной л»икостн fc.iatuhd Pjch) ru'ui /.'л J (6, в) И CyrefxlTtn Л J'lV.if осаждения бедкйв кчпачениеч ■! г) на чср£одсгик> ►летск дрожжеа / r\

ccrf'isut a - ютрегь: No - ид;ю; M -чнго*он£ри4; V - ыкуо.^ь; CM цитоплииатнчездач мс-чрл.и. CW клеточнай с rt' мц a

нию клеточной стенки (фото). Подавление роста популяций кишечных бактерий скармливанием кивсякам стрептомицина не снижало киллерной активности кишечной жидкости. На этом основании сделан вывод о том, что кидлерный фактор синтезируется животным [12-14]. Масс-слектрометрический анализ показал преобладание в киллерной фракции кивсяка Р. Jlavípes 16-сульфо-гидраксилальмитиновой кислоты - соединения, обнаруженного »первые. Киллерная фракция обладает поверхностной активностью. Разбавленная в 100 раз киллерная фракция снижает поверхностное натяжение с 72 mN/m до 42 mN/m. Это позволяет характеризовать ее как умеренный детергент (Вызов, Голы шин, не опубнк. данные).

Таблица 10. Киллерная активность пищеварительной жидкости кн всяков Pachyiuius Jlavípes (P.f.) и Rossiulus kessleri (R. к), улитки Heiixpontatia (Я. р.) и гепатопанкрготического экстракта мокрицы Armadillidium vulgare (A. v.) по отношению к дрожжам, выделенным из разных местообитаний

JpOBOKH Источник выделения Л/ R, к. A. v. И. р.

Rhodotoruîa fujisanensis растения - ± А

R. foilorum - + г

R. gramtnis +

R. ghitinis

R. mucifaginosa + +

Sporobolomyces hoisaticus t +

Sp. salmonicolor + +

Metschnikowia pulcherrima

M reukaujti ■+ ±

Bullera piricola - -

Aureobasidium pullulant подстилка

Cryptococcxs hungaricus д.-п. почва 4. - X

Cr, laurenlii +

Cystofilobasidium capitatum - - +

C, infïrmominiatum > -

Debaryomyces hansenii + +

Torutaspora globosa +

Candida /amata вермикомпост +

Saccharomyces cereviiiae промыш. штамм - - +

S. paradoxus экскременты -t-

C. scottii кишечник -

Trichosporon pullulons *

D, hansenii + + ч- ±

T. delbrueckii

Goiaciomyces geotrichum +

Zygûmlliopsis çalifornicus и +

нормальный рост; "±" рост подавлен; киллерный эффект

3 час

бел - КОЕ

" белковая, прямой счет

* нагипнаэ КЖ, прямой счет •г нативная КЖ, КОЕ

* кнллерна«, прямой счет ~ белковая, 8 мг/мл, КОЕ

Рис, 1. Влияние натавной кишечной жидкости киесяка РаскуЫЬх Аач1ре$, ее белковой и кнллерной фракций на жизнеспособность и переваривание дрожжей 5ассЬагот),се$ сегешизе.

40 60 80 1 мин

■•-иатиенаи КЖ, дыхание +суг>ернатан прогретой КЖ, дыхание *натвна« КЖ, КОЕ ■«супернагаи прогретой КЖ, КОЕ

Рис. 3. Влияние иативной кишечной жидкости кквсяка РасНуЫщ f!av^pes и ее киллерной фракции: супериатанта, полученного после осаждения белков путем прогрева цвтивной жидкости при 97> С 10 ынн, на дыхзыие и на численность КОБ дрожжей $а£.скаго/лусе& сеге\'Шае.

Скорость разрушения и переваривания микроорганизмов в кишечнике кмвсяка РасЬучЫиз /!т:1ре$

Впервые проведена оценка скорости и степени разрушения микробных клеток по выходу из них С-меченых органических соединений иод действием пищеварительной жидкости (Рис. 4). Процесс разрушения носит экспоненциальный характер. Под действием только фракции кнллерных веществ из клеток высво-

14

бождается до 20% С-соедииений, но в натив-ной пищеварительной жидкости скорость разрушения возрастает в 5 раза. Бремя полуразрушения клеток составляет от нескольких мин до часа, а степень разрушения достигает 80%, Выход органических веществ из клеток не обязательно связан с их гибелью. Клетки могут терять значительную часть углерода и сохранять жиз-

30 90 150 210 270 ззо ыпн

— натаавая кж.суперншиг ч-натчекя КЖ, осиок ^прогретая КЖ,су1тернатант" прогретая КЖ,осадок

Рнс. 4, Разрушение клеток дрожжей ЗассНаготуса ссге\ в натианоч

кишечной жидкости кивсяка Рлску^иЫ* и в ее килверной фраки им: супернатактв, полученного после осаждения белков путем прогрева нэтнбной жидкости при 07° С 10 мим Показана динамика выкола ИС из клеток в р&сгвор и остаток в оеддке при 25й С (ДИ - максимальный доверительный интервал, л = 3, Р <0.0!)

неспособность на питательной среде (кишечные бактерии и дрожжи) (табл. II) (29,48].

Впервые показано, что пищеварительная среда моокет оказывать микробостатиче-ский эффект. Так, популяции сим биотических дрожжей ВеЬагуотусез кагиепи. в отличие от не симбногических штаммов, сохраняли жизнеспособность в пищеварительной жидкости, но образование их колоний шло с меньшей скоростью. При этом их клетки уменьшались в объеме (табл. 12).

Степень ассимиляции микроорганизмов на примере кивсяка РяскуШизАа\1реь

У представителей макрофауны эффективность ассимиляции микроорганизмов намного выше, чем мертвого растительного материала. Так, у кивсяка Р. кажущаяся степень ассимиляции некоторых дрожжей достигала 73-82%, а стрентомицетов - 40-60% (табл. 13). Об эффективной ассимиляции грибов косвенно свидетельствует снижение их обилия при пассаже и практически полное отсутствие мицелия в свежих экскрементах.

Таблица 11. Время, степень разрушения и жизнеспособность микроорганизмов в кишечной жидкости кивсяка РаскуШм _/!а\'1ра, определенные по выходу из клеток в водный раствор '*С-меченых органических соединений. Жизнеспособность определяли через 90 мин инкубации в жидкости по количеству КОЕ на сусло-агаре

Микроорганизмы Время Степень Жизне-

полуперева- разрушения, способность, %

ривания, МИН %

Засскаготусез сегектае, 13й С 65 76 < 0,001

сеге\1$шг, 18° С 45 79 -

5. сегс\ Шае, 25° С 15 91 -

ОеЬагуоъусез ИапзепН 1922* 30 87 8

В. ИапзепИ 1594 35 82 30

Комплекс грибов из д.-п. почвы 20 86 -

В, Нап$епИ Ж107 45 81 100

комплекс бактерий из 45 75 100

Кишечника Р./1ау1рех

комплекс дрожжей из 40 86 100

кишечника Р, рахчрез

* - номера ипаммов, полученных из

коллекции кафедры биологии почв МГУ

Таблица 12, Уменьшение размеров колоний и жизнеспособность клеток дрожжей Ое-Ьагуотусех !штепИ на сусло-агаре после 90 мин инкубации в кишечной жидкости кився-ка РасЬуШш Даъгрез, Жизнеспособность определяли но числу микроколоний на 1 мкл, п=-Ш-70. Размер колоний определяли на 2 сут.

NN штаммов Источник Уменьшение ве- Жизнеспособность,

выделения личины %

ми кроколони и

О. АаюепИ 1922 подзолистая почва -к* 8

О. ЬаюепИ 1918 + 12

О. ИапзепН 1594 4 30

£>. катепи 391 45

И. НатепН 1184 50

О. ЬагяепИ 1924 торфяник * 65

О, кажепи Ж-56 кишечник ч- 85

Л. ксмхеппА00 д-п почва f 100

О. Иа>иепИ 1919 + 100

В. Наюепи 3141 рыбный корм - 100

В кап$епИ Ж107 кишечник Р.Аащре.г • 100

О. кшиепИ 2562 д-п почва . 100

О, кагиепН 1930 - 100

* - уменьшение зарегистрировано

Таблица 13, Численность дрожжей и актиномииетов н доля МС в экскрементах (от активности я корме) кивсяка Раскут1ш АтЛрез, поглощающего целлюлозу, обогащенную

,4С-мечеными вегетативными клетками дрожжей или мицелием стрептомицетов

Микроорганизмы КОЕ х Ю'/г % "с

корм экскременты экскременты

Ц}юЛогоги{а graminЬ 10 а1 <0.001 б 27

ТпсНо1рогоп ри1Ыаш 6.3 а 0,08 6 20

ОеЬагуоту-сез Ьатеп'й 126.0 а 7.96 18

Вгтерхотусез р$еш1о%гиео1из 25.1 а 100.0 6 40

5. саИ/от'юи 31.6 а 63.16 52

1 - достоверны различия только между значениями, помеченными разными буквами в одном и том же ряду (гг=3, Р<0.05), Механизм переваривания представляется следующим. Микробные клетки, попадающие а пишеваригельлый отдел кишечника, быстро погибают под действием киллер-ных веществ, вызывающих деструктурирование мембран. Нарушается барьер проницаемости, и в раствор выходит содержимое цитоплазмы; гидролиз клеточного материала осуществляют вместе автол ити чес кие ферменты микробной клетки и ферменты живот-

ною. Механизм сходен с описанным для позвоночных индуцированным автолизом, согласно которому жертва как бы обеспечивает собственное переваривание, индуцируемое веществами пищеварительного тракта хищника (Уголев, Цветаева, 1934). Такой механизм, по-видимому, существует у всех беспозвоночных. Известно, например, что хищные членистоногие парализуют и убивают свою жертву ядами, а переваривание осуществляется вне кишечника (внекишечное пищеварение). Другой аргумент в пользу этого механизма - высокая скорость протока бактерий через кишечник микрофауны, которая у нематод составляет несколько минут. При такой скорости для эффективного переваривания необходим механизм, аналогичный индуцированному автолизу.

Таким образом, судьба микроорганизмов в гшшеваргпельном тракте разнообразна. Это может быть полная гибель, ингибирование роста и потеря значительной части содержимого (углерода) (с сохранением жизнеспособности), инициация прорастания спор, нормальный рост и развитие, размножение выживших транзитных организмов, генетический обмен (табл. 14). К главным причинам этих событий следует отнести различную реакцию микроорганизмов на биологическую активность среды кишечника и способность выжизших микробных клеток к росту и активности в нижних отделах кишечника [31]. Факторы, действующие со стороны животных, можно разделить на трофические (появление доступных пищевых ресурсов в кишечнике, рост на мертвых микробные телах), и метаболические (киллерные вещества, микробостатический и активизирующий эффект пищеварительной среды, антагонистическая активность кишечных симбионтов).

Таблица 14. Реакция микроорганизмов на пребывание в пищеварительном тракте почвенных животных_

Реакция Пример

1. Элиминирование 2. Быстрая гибель с высвобождением до 90% С-меченых соединений Многие почвенные и подстилочные микроорганизмы (диплоподы, изоподы, дождевые черви) Не симбиотические аскомицетовые дрожжи Debaryomyces hansenii (кивеякР. flavipes)

3. Ингибирование роста (микробостазис) с сохранением жизнеспособности Симбиотические кишечные аскомицетовые дрожжи D. hansenii (кивеяк Р. fliivipes)

4, Сохранение жизнеспособности у большинства клеток и высвобождение до 80% мС-мечепых соединений Бактериальные симбионты кишечника Симбиотические кишечные аскомицетовые дрожжи D. hansenü (кивеяк Р. Jlavipes)

5. Инициация прорастания Споры Bacillus thuringieniii (кивеяк Р. flavipes)

6, Нормальный рост и развитие Кишечные симбионты (диплоподы, изоподы, дождевые черви)

7. Размножение выживших транзитных клеток Pseudomonas ¡рр., Promicromonospora citrea, Trickosporon sp. (диплоподы, дождевые черви)

8, Генетический обмен Pseudomonas putida pLV ¡017 (мокрицы)

Уровень потребления у животных (на примере дождевых червей)

Уровень потребления у представителей микор- и макрофауны сильно различается. По данным Б.Р. Стригановой (1980) дождевые черви Lumbricus terrestis потребляют до 27 мг опала (лещина, вяз, ольха).'г сухой массы в сутки; a Aporrcctodea rosea и Л caliginosa соответственно до 200 и 400 мг навоза или 1500 и 1000-2000 мг почвы, обогащенной оргакикой/г биомассы в сутки. Биомасса микроорганизмов может достигать 10 мг С/г в навозе и подстилке (Мирчинк, 1988), 6 мг С/г-в компостах [6J и до 1-1,5 мгС/г- в почве, обогащенной органикой [16]. Таким образом, дождевые черви с почвой могут потребить до 1,5-3 мг Cu^puc/r сухой массы в сутки, с оладом - до 270 мкг См^^/г еут., а с навозом - до 2,5 мг Смшрс«/г сут. За счет высокой скорости потребления и обмена и эффективности ассимиляции микробов, достигающей 85°«, значительное количество питательных элементов, связанных в микробной массе, возвращается в пищевые цепи. Представители микро- и мезофауны потребляют значительно больше микробов. Так, бактериоядные нематоды способны в сутки потребить массу бактерий, равную удвоенной массе их тела (Fciris et al., 1997), а грибоядная коллембола Folsomia candida при массе около 10 мкг С/особь в период размножения съедает в сутки коло 6 мкг С гриба Chdosporium cladosportoiJes (см. главу 9), Эти ориентировочные расчеты показывают, что уровень потребления микробной биомассы сильно отличается у разных представителей почвенной фауны, причем чем меньше животное, тем выше уровень потребления.

Микроорганизмы как пиша животных (микробные добавки и производство верми-ко мп остов)

По способу питания среди почвенных беспозвоночных выделяют микрофитофагов (потребителей микроорганизмов) и фитосаирофаго» (потребителей живых и разлагающихся растений, детрита, экскрементов и жидких продуктов разложения) (Сгриганова, 1980). Однако принципиальной пишей и специализированных микробофагов, и сзпрофа-гов, включая представителей крупной фауны • червей, диплопод н мокриц, являются микроорганизмы: трибы, простейшие и бактерии. Этому есть ряд прямых и косвенных доказательств. Животные не поселяются на свежем растительном опаде (основная гипотеза - наличие репеллентов в составе растительных тканей) (Martin, Daniels, 1963). Животные не способны к деполимеризации структурных растительных полимеров, которые преобладают в почвенном органическом веществе (Паников и др., 19S5; Варне и др., 1992), Целлюлазная активность, обнаруживаемая в экстрактах из пищеварительного тракта почвенных животных, очень низка (Siepel, de Ruiter-Dukman, 1993; Lattaud et al., 1998), Животные облигатно зависят от микроорганизмов как источника незаменимых аминокислот, которые сами синтезировать не могут (Битон и др., 1989), а в почве ресурс аминокислот сосредоточен в микробной биомассе (Покаржевский и др., 1984).

Таким образом, микроорганизмы • важный источник пищи почвенных беспозвоночных животных. Материал микробных клеток может поступать в пищу экзогснно - с кормом и эндогенно - за счет использования метаболитов микробных симбионтов, реутилизации продуктов обмена животного и микробных тел.

Теоретически микроорганизмы могут быть основным источником углерода для животных. 0,01-0,1% Cao 1 мг С/г - в почве) и до l?í (до 10 мгС/r- в подстилке) общего углерода может быть связано в микробной биомассе {Звягинцев, 1987), Поскольку биомасса животных на 1-2 порядка ниже, микробная биомасса должна обеспечивать продукцию животных. Но в почве, подстилке и, особенно, в свежем опаде много растворимого органического вещества: моно- и олигосахара, аминокислоты, белки и др.(Солее 100-200 мкг С РОВ в дерново-подзолистой почве [16]), которое тоже может быть источником углерода. Однако эти соединения образуются в том числе и в результате деятельное™ микроорганизмов и их экэоферментов. Следовательно, существует и прямая, и косвенная роль почвенных микроорганизмов в углеродном питании животных.

Перевариваемые микроорганизмы -главный источник азота и незаменимых аминокислот для животных (Покаржев-ckiiíí и др., 19S4), но они также необходимы как источник физиологически активных веществ. Только при определенном наборе микробов в корме возможен нормальный рост и развитие животных. Так, небольшие добавки живых дрожжей Candido /amata или Geotriekum candidum увеличивали скорость роста, созревания, а также репродукцию червей Eisenia fétida, причем живые дрожжи были эффективнее мертвых (Рис. 5). Таким образом, наряду с выделенными ранее категориями шггательных, плохо перевариваемых и токсичных микробов следует выделять микроорганизмы-стимуляторы. Результаты этих исследований были использованы для разработки способа повышения продуктивности вермнкультуры червей E.fctida на бедных органических отходах - отработанном шампиньонном грунте (6,24,40].

недели

— Сап:'.\Ла /¿па 1л ■* * контроль

Рис. 5. Влияние живых дрожжей СакЛМа {атахл и СегХпсЬит сатеШит нд рост червей Е1$еп1а/е(Ша в смеси извоза и шампиньонного грунта (1:4). В верхнем утл у - динамика численности дрожжей С, /¿этздз после однократного внесения в смесь {Р<0,01, п-5). Дрожжи вносил и в концентрации 2 мг/г субстрата (расчет на сухую массу ).

S. Микробные сообщества, ассоциированные с пищеварительным трактом животных: состав и функции

В главе 8 дается характеристика микробных сообществ пищеварительного тракта дождевых червей и динлонол. Приводятся доказательства снмбиотическои природы этих сообществ, анализируется функциональная роль кишечных микроорганизмов.

Одним из проявлений регуляторной рати беспозвоночных в отношении микробного населения можно считать установление и поддержание ассоциаций с микроорганизмами. Ранее из кишечника почвенных беспозвоночных били выделены онтеробактерии родов Klebsiella. Escherichia, Enterobacter, Plesiomonas (диплоподы, личинки бибионид) (Siabo, 1974; Ineson, Anderson, 1985); Enterobacter (изоподы) (Griffiths, Wood, 1985); бактерии сем. Vibrionaceae (дождевые черви) (Contreras, 1980). Однако до начала настоящего исследования (1987 г.) не было доказано, что эти бактерии составляют симбиотическое сообщество. В данной работе приводится ряд доказательств в пользу наличия у почвенных беспозвоночных животных, относящихся к группе макрофауны (дождевых червей, многоножек) микробных симбионтов в пищеварительном тракте.

Морфологическое разнообразие микроорганизмов пищеварительного тракта беспозвоночных (макрофауна)

Впервые с помощью сканирующего электронного микроскопа показано, что поверхность эпителия и кутикулы tri мытых от остатков содержимого стенок кишечника диплопод P. fla\ipci. G. conrtcxa и L pobnicus колонизирована бактериями разных мор-фотипов (всего более 20). Среди них; очень мелкие кокки (менее 0,2 мкм в диаметре), палочки, изогнутые формы, кокки, V-образные, похожие на коринеформные бактерии и мицелий актином и ист ов. Бактерии распределены неравномерно и в виде микроколоний. Численность клеток в микроколонни может достигать нескольких тысяч, а во всем кишечнике - 10!-10* клеток. Она увеличивается от переднего к заднему отделу (3, 7), Наличие большого разнообразия морфотипов бактерий предполагает и большое таксономическое разнообразие, которое не всегда можно выявить методом посева.

В кишечнике диплопод .\fegaphyllum rossicum, M. projectum, Clomeris connexa, Pachyiulusßavipes, Leptoiulus polonicus были обнаружены дрожжи. Морфология клеток очень однородная, похожая: овальные почкующиеся в нескольких направлениях клетки, округлые сумки, внутри некоторых видны аекосноры. Дрожжи встречаются и в среднем, и в заднем отделах пищеварительного тракта, однако максимальная их плотность - в заднем отделе кишечника. Численность дрожжей по прямому счету может достигать Ю1 клеток иа кишечник. При натолопш у диплопод (см. ниже) отмечается массовое развитие дрожжей на поверхности кишечного эпителия в среднем отделе и даже в переднем отделе кишечника.

Важно отмстить, что при близкой численности плотность заселения кишечника на 1-2 порядка выше, чем поверхности почвенных частиц.

Таксономический состав н структура пристеночного и полостного микробного сообществ пищеварительного тракта

По данным посева в "пристеночном" сообществе диплопод и червей абсолютно доминируют представители факультативно-анаэробных протеобактерий семейств Entcro-bacteriaceae и Vibrionaceae, наседающие внутреннюю поверхность эпителия и кутикулы всех отделов кишечника. Их численность по посеву максимальна в заднем отделе и достигает tO1 КОЕ/г кишечных тканей. Встречаются стрептомииегы, бактерии актином и-цетной линии группы Promicrontonopora-Oershovia. Их доля по данным посева составляет примерно по 15%, Из кишечника диплопод выделяются акти ночи нети редких родов -Micromonospora, Aciinomadura, StreptovcrticUlium, Slreptoiporangimn. Часть из них - обитатели кишечника, другие - транзитные виды.

Экспериментально доказано, что "приегеночное" кишечное сообщество стабильно при смене режимов питания (в том числе при голодании), в разные сроки анализа и при содержании животных при 4° С, Наличие у диплопод перитрофической мембраны помогает огделить собственно "пристеночное" сообщество от "полостного", Иеритрофическач мембрана представляет собой постоянно образующийся хитиновый чехол, покрывающий пишевой комок при его продвижении но кишечнику. Она не пропинаема для микроорганизмов, части детрита и почвы (размер пор около 0,05 мкм), но проницаема для растворов, образуется на границе переднего и среднего отделов и разрушается - в заднем отделе, На этом основании микроорганизмы, обнаруживаемые в среднем отделе, следу er считать истинными кишечными. В "полостном" сообществе, т.е. сообществе шпцеиою комка, нет абсолютных доминантов. Оно представлено транзитными нидами бактерий, часть которых размножается, проходя кишечник. Ею состав во многом определяется составом бактерий в пшне (табл. 15,16) [3,4,7,8,28,29].

В кишечнике диплопод впервые обнаружены дрожжи. Численность их достигает 104 клеток на кишечник или 1 OVr кишечных тканей. Дрожжевые клетки сосредоточены в заднем отделе. Из среднего отдела периодически могут быть выделены те же виды, но их численность намного меньше, чем в заднем отделе. Максимальное количество видов (22) выделено из кишечника кивсяка Р. flavipes. Подавляющее большинство штаммов являются аскомниетами и их анаморфами. Наиболее многочисленны - Debaryomyces hansenii (45 шт.). Torulaspora ddbrueckii (25 шт.). Zygúnitliopsb cah/ornicus (13 шт.), Pichta теп-kranaefaciens (16 шт.). Zygosaccliaromyws rouxit (8 шг.), Geotrichum geotrichum (7 шт.), Candida norvegica (30 шт.). В сообществе дрожжей доминирует труппа морфологически сходных дрожжей D. hansenii, Т. Jelbmeckii. Z cah/ornicus - "D К числу частых видов относятся Р. guilliermondii. С. /amata (совершенная стадия - Ü. hansenii), С. ingens, С. frícdrichii. Cryptacoccut albid-us. Trichosporonpullulans, Tr. beigelii [1,2].

Таблица 14. Бактерии кишечника и экскрементов дождевого червя Eiseniafétida

Источник выделения Бактерии

Стенки кишечника-'пристсночное сообщество Klebsiella pneumonia, Erwinia sp., PtesJomonas sp., Aeromonas sp., Bacillus subtilis-pumiius

Содержимое кишечника - "полостное сообщество" Pseudomonas sp., Alcaligenes sp., Acmetobacter sp., Promicromonospora sp., Arthrobacter sp., Streptomvces sp., Bacillus sp.

Экскременты Pseudomonas sp. Alcaligenes $p„ Promicromono-Spora sp., Streptomy-ces sp., Bacillus sp., Vibrio sp. Arthrobacter sp

Прямые доказательства симбиотической природы кишечных бактерий и дрожжей следующие: (1) они сохраняются на поверхности кишечных тканей после многократной промывки водой, т.е. прикреплены к ним; (2) не встречаются в корме животных; (3) относительно устойчивы к перевариванию; (4) кишечное сообщество устойчиво к смене режимов питания и содержания животных. Косвенным доказательством являются также особенности физиологии этих организмов. Доминирующие бактерии относятся к факультативным анаэробам, не являющиеся активными гидродитиками (например, не способны гидролизовать целлюлозу). Кишечные дрожжи характеризуются узким снсктром ассимиляции и бродильным метаболизмом, что косвенно свидетельствует о богатстве простых углеводов и факультативно-анаэробных условиях в кишечнике диплопод. Наиболее важным аргументом в пользу симбиотичеекой природы кишечных микроорганизмов следует считать наличие у них определенных функций в организме хозяина.

Таблица 15, Бактерии кишечника и экскрементов км вся ка Pachomius ßavipes

Источник выделения Бактерии

Стенки кишечника -"пристеночное сообщество" Klebsiella pneuirurnia, Enterobacter cloacae, Ptesiomonas sp., Promicromonospora citrea, Sp-eptomyces chrysomallus, S Candidas, Streptoverttcilhum spp, \ficromonospora spp. Hck iHus spp

Кишечная жидкос1ь Salmonella subsp., Alcaligenes xylosooxiJjns, RurkkoLferia ctpacla. Pseudomonas ffuoresctns

Перитрофическая мембрана Enterobacter cloacae, S. badtus, S. ßuorcscens, & xanihocidicus, S. filamentosus

Содержимое кишечника - "полостное сообщество" Pseudomonas sp., FUnobacterium sp, Promkrontonospora sp, Rhodococctts sp-. Bacillus spp, S. carpati-cus, S. griseolus.S. pseudogriseolus, S, paucidiastaticus, S.felUus, S chrysomallus, S. abvraviensis, S. nitrosportus, S. globisporvs, S. pluricoloreseens, S. langisporojlavus, S. eehnatus Streptosporangium cdbidum, Micromonospora spp., A ctinomaihira spp.

Экскременты Pseudomonas sp., Ps, phenoxlnium, Pr. Citren, Burkholderia cepacia. Enterobacter gergo^ia, Salmonella subsp-, A. xylosooxidans, Fljvobacterium sp. Strepto-mycesspp., Bacillus spp. StrepioverticÜlium spp, Streptosporan-giumspp, Micromonospora spp., Actinomadura sp.

Симбионтное пищеварение

Функции микроорганизмов кишечника беспозвоночных связаны, во-нервых, с явлением симбиокшого пищеварения. Олнако среди доминирующих бактерий нет способных гидролизовать основные растительные полимеры: целлюлозу, i-сми целлюлозу, пектин. Тем самым их участие в непосредственном разложении остатков не возможно. Однако бактерии из сем. Enterobacteriaceae и Vibrionaceae обладают протеолитической активностью. Из пищеварительного тракта днпдопод выделены бактерии с мнколитической ак-знвкостью (2], которые, ло-видимому, завершают процесс переваривания убитых грибов в заднем отделе кишечника. Также косвенное свидетельство наличия хитинолитческой активности - рост бактерий на остатках перитрофичеекой мембраны (3]. Таким образом, функциональная роль кишечных бактерий в процессе симбиоптнопо пищеварения - скорее утилизация мертвых микробных тел, чем растительных тканей.

В кишечнике беспозвоночных велика концентрация глюкозы. В кишечной жидкости среднего отдела кивсяка Packyiulus flavipes она составляет 6,0 ммоль/л, а о заднем отделе 12,7 ммоль/л. В кишечной жидкости кнгсяка Romulus Kessicri концентрация глюкозы - 7,1 ммоль/л, а в экстрактах гепатопанкреагических желез мокрицы ArmaJil-lidium \tilg<jre - 8,4 ммоль/л, В верхнем оглеле пищеварительного тракта червя Lumbrt-cus rubeltus концентрация глюкозы особенно высока - 58 ммоль/л. Для сравнения, в дерново-подзолистой почве концентрация глюкозы ниже 1 ммоль/л (или менее 40 мкг/г). Таким образом, концентрация глюкозы в пищеварительном тракте животных скорее сравнима с условиями питательных сред, чем с почвой. Это дает основание предположить, что в кишечнике животных идет активный гидролиз углсводсодержашнх ди- и олигомеров растительного и микробного происхождения [Бызов, не опублик. данные].

Симбионтное питание

Микробы кишечника могут участвовать в симбионтном питании животного-хозяина, Так, некоторые дрожжи - обитатели заднею отдела кишечника днплоиод, не встречающиеся в их корме, выделялись из среднего отдела кишечника. Это ладо основание предположить, что в периоды голодания диплоподы могут использовать в пищу эти дрожжи, которые, подаются в пищеварительный огдел за счет антиперистальтического движения. Кишечные микроорганизмы реутилизируют продукты обмена животных. Дрожжи, выделенные из диплопод, способны расти на моченой кислоге (конечном продукте азотного обмена) как на единственном источнике азота (табл. 16) [2], а актиноми-цсты, обитающие в заднем отделе, заселяют остатки хитиновой перитрофичеекой мембраны, выбрасывающиеся в задний отдел кишечника [3].

Тела самих кишечных микроорганизмов могут служить источником питания животных. Так, в периоды искусственного голодания (питания стерильной целлюлозой) кивсяки могут использовать в пищу дрожжи, обитающие в заднем отделе кишечника, которые подаются обратно в пищеварительный огдел за счет антиперистальтического движения кишечника и там перевариваются. Это доказывается тем, что дрожжи Debaryomy-

ces hansenii, Torulaspora delbrueckii, Zygou/illiopsis californiens не выделяются из опада, но выделяются из среднего (пищеварительного) отдела кишечника [2]

Таблица 16. Рост дрожжей, ассоциированных с диплоподами, на среде с мочевой кислотой как единственном источнике углерода, азота и углерода и азота и их способность гидролизовать моченую кислоту

мочевая кислота как источник

Дрожжи углерода азота углерода н азота

рост гид- рост гнд- рост гидролиз

ролиз ролиз

Debaryomyces hansenii - • + - - -

Zygowffliopsis Californiens -i- - -t- - ± -

Torulaspora delbrueckii J. - - - -

Pichia membrar.aefaciens - - + - - -

Pichla gulliermondii ± - + - -

Kloeckera apis - - 4* - - -

Trichosporon cuianeum - - + + - -

Tr. cutarssum 4- + + + -ь -г

Tr. pullulons ) - - ■4- - - -

Gcûtrichum candidum - - ч- - - -

- роста или гидролиза мочевой кислота нет, + активный рост и гидролиз мочевой кислоты (зоны просветления в агаре); ± рост задержан; зона лизиса в среде = "гидролиз"

Антагонистические свойства акпшомниетов, ассоциированных с кишечником н экскрементами животных (устойчивость к колонизации)

Микробные симбионты, вероятно, могут повышать устойчивость кишечника к колонизации чужеродными микроорганизмами за счет образования антибиотических веществ. Показано, что кишечные изоляты актиномииетов обладают более высокой антибиотической активностью по отношению к тест-культурам бактерий, чем почвенные ак-тнномииеты. Причем они более активны по отношению к ¡рамположительным бактериям, чем к грамотрииательным (табл. 17,18). Грамположительные бактерии представляют минорный компонент кишечной микрофлоры, и конкуренция с ними для актиномниетов должна быть более важна, чем с доминантами - грам отрицательны ми бактериями [9].

Таблица 17. Антагонистическое действие актиномицетов, ассоциированных с дерново-подзолистой почвой и животными, против бактерий. Дана встречаемость случаев (%), когда акпшомииеты образовывали зону подавления роста бактерии радиусом более 5 мм

Актином ицеты. ассоциированные

Бактерии, С почвой с червями с кивеякам и

ассоциированные (4 штамма) (8 штаммов) (б штаммов)

с почвой (5 штаммов) 0 2,5 0

с червями (8 штаммов) 0 0,8 6,3

с кивеякам (S штаммов) 0 6,3 12,5

Таблица 18. Антагонистическое действие актином и него в. ассоциированных с почвой и беспозвоночными, на :рамположительные (Г+) и грамотрицательные (Г-) бактерии. Дана встречаемость случаев (%), когда актиноницеты образовывали зону подавлении роста бактерии радиусом более 1 мм

Бактерии, ассоциированные Лктиномицеты, ассоциированные

с почвой (4 штамма) Г+ Г- с червями (8 штаммов) Г+ Г- с кнвсякамм (6 штаммов) Г+ Г-

спочвой (1:3)* 25 25 13 20 25 3S

с червями (1:7) 75 20 56 IS 50 23

скивсяками (4:4) 38 13 34 23 46 23

* соотношение числа штаммов Г+ и Г- бактерий, испытанных в эксперименте.

Дрожжи как патогены беспозвоночных

Кишечные симбионты могут вызвать гибель животных. Это показано на примере дисбиозов, вызываемых дрожжами Pichia gullliermondii - типичных обитателей кишечника диплопод Glomerts сап-пеха (Рис. 6). Эти дрожжи были выделены из больных животных и скормлены здоровым особям в составе кристаллической целлюлозы. Гибель животных наступала при заселении дрожжами всех отделов кишечника и при плотности дрожжей не менее 105 КОЕ/г кишечных тканей [2, 38], Аналогичные дисбиозы были также зафиксированы у диплопод L polonicus и М. projectum, содержащихся долгое время (3-6 месяцев) в лабораторных условиях: в эксикаторах на несменяемом опаде. С помощью сканирующего электронного микроскопа в кишечнике мертвых особей обнаружены дрожжи, заселяющие все отделы кишечника [2,38].

9. Роль микро- и мезофауны в регуляции динамики популяций, состава и активности микроорганизмов в почве

В главе 9 выясняется функциональная роль микро- и мезофауны (нематод и микро-архропод) как регуляторов микробного комплекса. Вскрываются механизмы регуляции.

Главная особенность регулирующего влияния микро- и мезофауны (нематод и мик-роартропод), в отличие от макрофауны, связана с тем, что уровень потребления микробной биомассы у мелких беспозвоночных в сотни раз больше, чем у крупных. С учетом же

Рис. 6. Численность дрояокей в кишечнике мисмоножки Glomeris соппеха, питавшейся кристаллической целлюлозой, обогащенной дрожжами PuhsJ guilUermandil. К - контроль (перильная целлюлоза); Концентрация дрожжей: I- 10Vr;ll-5X 10«,'г; Ш-10г/г; IV-lOVr.

большей численности вклад нематод и микрозртропод в рефляцию микробного комплекса намного выше. Обычно его связывают с трофическим механизмом, т.е. с мобилизацией питательных элементов в процессе питания микробными клетками (Anderson et al., 1998). Но появились также данные о том, что эти животные могут вызывать реакцию микроорганизмов но механизму, не объясняемому только трофическим взаимодействиям, а связанному с метаболическим механизмом, а именно - с воздействием выделений животных, регулирующих активность микроорганизмов (Hedlund et al., 1991). Таким образом, регулирующая роль животных по отношению к микробному комплексу должна рассматриваться с позиций и трофических, и метаболических механизмов.

Влияние бактериоядноП нематоды Caenorhabditis eíegans на рост и развитие немато-фагового гриба Arthrobotrys oltgospora

Все описанные выше примеры регуляции со стороны животных основаны на том, что животные располагаются на более высоком уровне трофической пирамиды, и, следовательно, регуляториые механизмы так или иначе связаны с процессом литания животных микроорганизмами. Однако в почве возможны случаи, когда животные выступают регуляторами микроорганизмов как объекты их питания. Наиболее яркий пример такого взаимодействия - хищные нематофаговые грибы. Хищные грибы способны к существованию за счет мертвого органического вещества, но при определенных условиях могут ловить живых нематод. Об экологии этих грибов известно очень мало. В частности, не ясно как изменяется стратегия поведения, развитие и активность этих грибов при взаимодействии с нематодами. Из-за этого результаты использования хищных грибов для борьбы с фитопаразити чески ми нематодами часто трудно предсказуемы, Гипотезы, объясняющие хищничество, сводятся к вопросу, являются ли нематоды основным или дополнительным источником литания для грибов.

Показано, что рост хищного гриба Arthrobotrys oligospora Fres. Л18 в почве сопровождается ловлей им нематод, а нематоды стимулируют прирост мицелия гриба, но только при плотности популяции не более 10-50 особей/г. При более высокой плотности, напротив, наблюдается снижение прироста мииелия по сравнению с вариантом без нематод (табл. 19) и дыхания гриба на 25-35% [22]. Если считать, что нематоды - основной ресурс питания гриба, то согласно правилу экологической пирамиды масса жертвы должна быть выше, чем приросшая биомасса хищника. Однако это не выполняется. Это означает, что прирост мицелия осуществляется за счет почвенного органического вещества, а тела нематод представляют дополнительный источник питания. Аналогично, при отсутствии лимитации по доступному углероду и азоту нематоды также ограничивали вегетативный рост гриба (Рнс. 7),

Таблица 19. Прирост мицелия ЛпкгоЬопуз оГ^озрога в дерново-подзол истой почве, не обогащенной органическим веществом, па 30-е сутки в зависимости от количества нематод СаепогкаЬсИ№ е!е%аю

Вариант опыта Прирост мицелия, ч/г и оч вы Биомасса мицелия, мкт С/г почвы Масса добавленных нематод', мкгС

Контроль 3,3 4,8 0

10 нематод/г 7.8 12 0,104

50 нематод^ 4,5 6,8 0,520

100 нематод/г 2,4 3,6 1,04

1000 нематод/г 1.8 2,8 10,4

1 - для расчета использовали среднюю сухую массу одной бактериоядной нематоды 26 нг (40% углерода) (Griffiths, Caul, 1993).

контроль 10 нематод/г — 1000 немагтод/г

б а ю 12 и

недели

Рис. 7. Динамика длины мниелкя Arihrobotrys oligospora. внесенного в виде конидии в стерилизованную дерноао-подзолноую почву, обогащенную мукой люцерны, в присутствии нематоды Cjenorhabdiits elegans и баитерии Micrococcus sp (n-3)

I 30 S

5

Контроль ^ """ liwu йемвгод/

Рис, Удельная продукция конидий Arthrobotrys oligospora а «ерлоао-полмпистой почве, обогашенной мукой люцерны, в присутствии нематоды Caenorhahditis elegans.

Другой особенностью реакции хищного гриба на взаимодействие с нематодами является увеличение удельной продукиии конидий - отношения количества конидий к длине мицелия, которое наблюдали и при лимите углерода и азота, и без лимита (Рис, 8).

Наиболее перспективной идеей, объясняющей переход грибов к хищничеству, представляется предположение о том, что хищная стратегия связана с неспособностью гриба синтезировать необходимые соединения или потреблять их из среды. '>га гипотеза подтверждается экспериментом, в котором на средах, содержащих набор аминокислот и витаминов, А. оИ^рога не проявлял нематофаговой активности (табл. 20).

Таблица 20. Влияние состава питательной среды на нематофаговую активность и интенсивность образования конидий у ЛпИгоЬо1гу5 оИ^озрога. Гриб выращивали иг конидий -60 ± 15 штУстекло. Нематофаговую активность оценивали на 3-е сутки, нанося 200-300 нематод на поверхность колонии гриба, п = 10, Р< 0,05

Среза Число ловчих Пойманные Интенсив ность

Орган os/100 мм1 нематоды/100 мм1 образования

Кольца Сети Живые Мертвые конидий

Голодный агар 41 t II 1400±235 0 83 ±23 +

Углеродная 35 ±49 174 ±47 47 ±7 94± 15 ++

основа1

Среда Чапека 19±3 7± 13 3±6 14 ±17 +

Картофельный агар 0 0 0 0 +

Азотная основа1 0 0 0 0 ++

Сусло-агар 0 0 0 0 H-f

У глеродно-азотн ая 0 0 0 0 -ни-

основа*

Среда Чапека с ДЭ4 0 0 0 0 -Н-+

1 - глюкоза, набор витаминов м аминокислот (L-ги стадия, DL-метионик, DL-трнгггофан), макро- и микроэлементы; 1 - сернокислый аммоний, набор витаминов и аминокислот, макро- и микроэлементы;1 - глюкоза, сернокислый аммоний, набор витаминов н аминокислот, макро- и микроэлементы;4 - ДЭ - дрожжевой эяхгфакт.

Тал и м образом, Hail более вероятно, что реализация хищничества нематофаговым грибом регулируется физиологически активными веществами, получаемыми от нематод. При этом у хищного гриба снижается сапротрофная активность и сокращается период завершение цикла развития за счет более эффективного образования конидий [20-22, 52].

Влияние комплекса почвенных нематод и микроартропод на состав и активность микробного комплекса

Одна из главных функций животных - регуляция разложения органического вещества, Оценка участия животных в разложении и их вклада в продукционный процесс микроорганизмов даже более сложна, чем сама проблема изучения микробной продукции в почве. Дело в том, что кроме измерения in sim микробной продукции, необходимо корректно отделить роль животных. Для элиминирования животных широко применяют разнообразные методы дефауннрования. Однако важно, чтобы измеиения в комплексе в результате дефауннрования были минимальными. Нами был модифицирован известный метод влажного прогрева (Wright et aU 1989). Образцы дерново-подзолистой почвы, отобранные из горизонта Ai под смешанным лесом, прогревали при 55° С в течение 5 ч без

значительной потери влажности (не более 7% от исходной). В результате депонирования численность нематод н микроартропод поддерживалась на уровне, близком к нулю, в течение 3-х недель, При этом не менялись микробиологические свойства: содержание микробной биомассы, интенсивность дыхания (в течение 11 сут.), функциональное разнообразие микробного комплекса, определявшееся по дыхательному отклику в ответ на внесение ряда органических вс-шсств, а также содержание водорастворимого органическою вещества. Для контроля корректности выводов из экспериментов с дефаунированием проводили ре-фаунироеание одной из порций дефаункрованной почвы и измеряли соответствующие параметры

О 4 8 12 16 20

, сут, __

крахмал пш^жчиля

А В 12 16 20 14

сут.

люцерновая иува

1.5

Я

Т

!

ь

I

10

1,5

10

Бс!

60

Рис. 9. Динамика обшей биомассы, массы грибов и бактерий в почве при разложении крахмала, пшеничной солочы (С;К = 80) и люцерновой м>ки (С^ - 32) в дер ново-ползая и стой поч&с в присутствии нематод и микроартропод относительно вариантов без животных (пунктирная линия),

[16|. В динамике определяли общую микробную биомассу методом фумигации-экстракции и биомассу грибов и бактерий методом субстрат-индутднрованного дыхания с антибиотиками.

При разложении крахмала и пшеничной соломы в присутствии нематод и микроартропод микробная биомасса уже на 10-е сут была на 30% выше, чем в почве без животных (Рис. 9). К моменту наблюдаемого эффекта численность нематод составляла всею 34 ± 8, а микроартропод (клешей и коллембол) — 9 ± 5 в 10 г ночвы. Таким образом, микробная продукция находятся в почве под контролем со стороны небольшого количества животных, Регуляция микробной продукции на коротком промежутке времени связана, скорее всею, с воздействием животных (или их экскретов) на физиологическое состояние микроорганкзмов, т.е. осуществляется по метаболическому механизму.

гЬ

Р-0.05 Р<0,С01

срелнее (г-5) п 70 с>ю»

Рис. 10. Влияние нечатод на лшанис компаекга почвенмы* чиьроергаммзчое при раможенни крлямала, II дефаун иро мни> ю дерио в о - подю 1 и ст> ю почву подселяли 6, 40 и 60 нематод естественною »омпдена на I г лочам.

Увеличение дыхания при разложении (крахмала) наблюдали также при подселении в дефаунированую почву естественного комплекса нематод. Эффект от деятельности нематод заметен очень скоро - уже на 1-3 сутки. Повышенная минерализация крахмала сохранялась более 2-х месяцев (Рис. 10).

Влияние комплекса подстилочных микроартропод на салротрофную активность микробного комплекса

В опытах с подселением животных в дефаунироеанные субстраты впервые показано, что микроартроподы регулируют эмиссию СОг уже после кратковременного контакта С микроорганизмами, и в широком интервале лопуляшюнной плотности животных (Рис.

11). Уже через сутки после подселения коллсмболы Folsomia candida на свежий опад лещины (старые листья снимали с дерева), предварительно заселенный грибом Clodospo-года» cladosporioides, дыхание возрастало в 1,5-2,5 раза. Аналогично микроартроподы (естественный комплекс), вселенные на свежий опал, усиливали дыхание микроорганизмов в 2 раза через сутки после иодссления (Рис.

12) [27]. Рассчитано, что вклад животных в продукцию COi составляет не более 5Í4, таким образом, эффект можно отнести за счет стимулирования микроорганизмов.

Таким образом, реакция микроорганизмов на животных возникает в виде быстрого функционального ответа. Быстрый ответ означает, что роль микро- и мезо-фауны состоит в регулировании физиологического состояния микроорганизмов. Это - своего рола стрессовая реакция на появление хищников. Механизм такой быстрой реакции, по-видимому, состоит в компенсаторном ответе микроорганизмов на трофическую или метаболическую активность животных, которая во многом аналогична компенсациям растений в ответ на поедание растительноядными животными [31]. Она может состоять в активизации роста или других составляющих метаболизма микробных популяций. Быстрый функциональный ответ микроорганизмов предполагает наличие метаболического механизма регуляции животными микробной активности.

Влияние микроартропол на сукцессию микром и цетоя в подстилке

До сих пор не было известно об участии микро- к мезофауны в регуляции группового состава и микробной сукцессии в почве. Вместе с тем пишевые предпочтения и разнообразие трофических саязей предполагают такое участие. В ходе сукцессии прирост обшей биомассы происходил за счет грибов, но относительная доля бактерий в комплексе возрастала, а грибов падала. В результате падало и соотношение грибы/бактерий. Эта

сут.

юигрсаь — + tOF. tañd.d] <—> * 30 F. coiJJa — + 60 F. canJiJa + 90 Г uoh&J.I

Phc. 11, Влияние кэплемболы Foh&nfa cencida H¿ дыхэмне иякромицета ClaJasporium claiosporiciJa на ;и;те«4ч oraje лепнины. Сгерклюоиаиные листья вселяли f.ohодними гриба и гзтги подселяли 10.30,60 и 90 юиечбол Hi 1 ronui(n-i)

закономерность сохранялась шзе зависимости от наличия животных, однако в iipucyrci-вии животных нарастание дачи бактерий было активнее (см. выше Рис. 9, [6]).

Для оценки роли микроартропод в формировании сушсссии микромииегов свежий опад лещины заселяли комплексом микроартропод, выделенных из подстилки. Впервые установлено, что микроартроподы регулируют сукцессию грибов. В присутствии животных общая численность грибов через 6 месяцев была меньше, чем без них. Животные значительно меняли структуру грибного комплекса. Снижалось обилие темно-окрашенных грибов (табл. 21) [27]. В варианте с микроартроподами вид кривых рангового распределения видов в комплексе приобретал характер логарифмической модели, увеличивалось разнообразие грибов. Опять обращает на себя внимание относительно быстрая реакция комплекса, заметная уже через 12 суток после подселения животных. Это можно объяснить следующими причинами. Во-первых, микроартроподы способны избирательно выедать грибы, особенно темпоокрашенные, меняя баланс в конкурентных отношениях между ними. Во-вторых, изменение состава грибов может быть связано с избирательным перевариванием микробных клегок животными. Кроме трофических механизмов играет роль и измельчение растительных остатков и транспорт микробов животными [27].

Таблица 21. Модификация структуры комплекса микромииегов (встречаемость родов (групп), %, п ■* 3-5) при разложении оиада лещины под действием комплекса микроарт-ропод иодегилки дерново-подзолистой почвы (через 6 месяцев)_

Вариант опыта

Микромниеты Листья, Опад без Опад с

снятые с микроартропод ми кроартро пода м и

дерева

Численность КОВ/гх I04 24 ±7 112 ±7 75 А 16

Çladosporium spp. 67 46 1,5

Acremonium, Fusarium и др. 14 24 6

Другие темноо крашенн ые 8 5 19

Pénicillium spp. 5 3 69

Alternaría spp. 3 14 0.5

Aureobasldhm pullulons 2 0,6 0,5

Mucor 1 - 1,5

Aspergilhis spp. - 0.2 -

Chaetomîum spp 2

Другие - 7,8 -

О | ¥ ! *

—без микроартропод чн»[ч>зртр<)"а-зми

Рис, 12. Изменение интенсивности дычання микробного ксчз.зекса свеиего огада cvemcmioro леса в ответ на подселение (стрелка) естественного количества микроартропод, видел ея них из подспики этого же леса (п=3).

Пишевые предпочтения у микроартропод и нематод

Также как для макрофауны, для мелких животных характерно избирательное питание микробами. Это проявляется в разных пишевых предпочтениях.

V нематоды бактериоядной СаепогИаЬс1Ш£ е1е%ат обнаружены пищевые предпочтения по отношению к бактериям, выделенным из дерн о во-подзолистой почвы. Оно оценивалось по состоянию культуры нематоды при выращивании на разных бактериях (табл. 22).

Таблица 22. Состояние культуры нематоды СаепогНаЬ<}ик е1е%ап5 при выращивании на разных бактериях

Бактерия на картофельном агаре Состояние культуры нематоды

Promicromonospora sp. нематоды не размножаются*

Bacillus sp. -

Pseudomonas putida PsP3 нематоды обильны, но малоподвижны

Artkrobacter sp. -

Pseudomonas stutzen HC 1013 -

Pseudomonas stutzeri 2112 -

Micrococcus sp. нематоды обильны и активны

** - нематод ннокулировали на газон бактерий на 3-5 сутки после засева в количестве около 1000 особей на чашку Петри

Были охарактеризованы пищевые предпочтения у 4-х видов коллембол по отношению к светлоокрашенным и темноокрашенным грибам (табл. 23). Установлено, что один вид гриба может поедаться, а другой - кет. Кроме того, к одному и тому же грибу разные виды коллембол могут относиться по-разному. Большинство темноокрашенных грибов поедались, а среди светлоокрашенных отрицательные пишевые взаимодействия с коллембол аяи отмены в 70% случаев. Сделан вывод о том, что формирование пищевых сетей определяется не только разнообразием организмов, но и разнообразием трофических связей, возникающих между ними. Пищевые предпочтения у мнкробофагов определяются и трофическими механизмами (например, пищевой ценностью мииелия), и метаболическими (химическими сигналами, исходящими от грибов, токсинами и т. д) 127].

Предпочтение темноокращенных грибов в пищу характерно также и для крупных беспозвоночных (см, выше). Это делает почвенных животных непосредственными участниками процесса образования гумуса, поскольку меланины темноокрашенных грибов -это предшественники гумусовых соединений.

Весьма вероятно, что пищевые предпочтения беспозвоночных в отношении микроорганизмов - один из главных механизмов формирования трофических испей и микробной сукцессии в почве.

Таблица 23. Пищевые предпочтения коллембол в отношении светлоокрашенных и тем-ноокрашенных грибов (всего проверено 114 сочетаний гриб — коллембола, из ни* 83 - со светлоокрашенными и 31 — с тем неокрашенным и грибами)

Вид гриба/Внд коллемболы Orcheseita Pogptwgnatkettm Sinella Fohomta

flavescens flavescens coeva candida

Светлоокрашенные грибы

Acremomum roseum - - - -

Aspergillus niger - - - -

Fusarium sp. - - -

Cliocladium catenulatum - +

G.penicüloides - - -

Heücostilium piriforme - - - *

Monilia geophila - - -

Martierella ramanniana +

Mucor hiemaiis * + 4

№ plumbeus +

Mucor sp. * +

Myrothecium catenuiúturn - - -

Neosartoria fischeri - - -

Paecilomyces marquandii - -

Penicillium purpurogenum *

P. chysogenum t- f

P. decumbens + 4-

P. impticalum * r

Penicillium. sp. - - -

Talaromyces luteus - - -

Trickoderma karzianum - - -

Trichotectum roseum f -ь +

l'erticiUium lecanii - - -

Zygorhynchus heterogamus - -

Тсмноокраш енные грибы

Acrothecium apicale + -i-

Alternaría altérnala + + +

Alternaría sp. + + f

Cladosporium cladosporioides <- + *

C. herbarum

Curvularia lunata + + + -t-

Pkoma spp. *

Pestalotia sp. +

Peyronella sp. -

Phiaiophora sp. - -

Siemphylium lanogtnosum "Г 4-

Trichunts spiralis +

Регуляция, зависимая от качественного состава органического вещества {соотношение углерода и азота)

Результат воздействия фауны на микробный комплекс зависит от соотношения углерода и азота в питательном субстрате. Так, нематоды стимулировали прирост микробной биомассы на 20-30% (Рис. 9), об шее и удельное дыхавие на 20-70% (Рис. 13) при разложении не содержащих азот или бедных азотом крахмала и пшеничной соломы, и ннгибировали соответственно на 25, 15 и 15%- при разложении богатой азотом муки люцерны. Аналогично минерализация органических соединений азота активнее проходила в присутствии нематод на крахмале и подавлялась - на люцерновой муке (Рис. 14). Очевидно, что при лимитации микробного роста азотом происходит его усиленная иммобилизация в микробных клетках, и активность микробофагов способствует ускорению оборота азота за счет минерализации микробной массы. Возможно, в отсутствии лимитации по азоту микробный рост сдерживается животными, потому что выедание активно растущей микробной массы (более питательной, чем старой) преобладает над стимулированием се возобновления [17-19). Истинные причины этого феномена, однако, предстоит выяснять.

Регуляция, зависимая от плотности животных

Результат регуляции также зависит от шютности популяций фауны. При подселении в дефаунированную дерново-подзолистую почву комплекса почвенных нематод (Рис. 10) или на стерилизованный опад лещины, заселенный микромнцетом С. ciadosporioides, коллемболы F. Candida (10-60 особей/г) (Рис. 11) была отмечена стимуляция минерализации в очень широких пределах начального уровня численности животных. Причем нижний предел был очень мая - около 10 нематод и 10 коллембол/г субстрата. Превышение начального уровня численности выше определенного (более 40-60 нематод или более 40 коллембол на г) приводило к инверсии эффектов - к сдерживанию продукции и активности микробного комплекса [16,18]. Это явление сходно с так называемым "перевьтасом" (overgrazing). Однако оно не может быть объяснено только повышенным уровнем выедания животными, поскольку, как показывают расчеты, полученные эффекты не пропорциональны количеству съеденной животными микробной массы [16]. Пе-

врахчал-*-пшеничная солома люцер.ор.ад мупэ

Рве. 13. Общее (СО)) и удельное (дСОг) дыхание микробного комплекса при разложении крахмала, пшеничной соломы (С:И - 80) и люцерновой муки (СЛ = 32) в дерново-подзолистой почео в присутствии нематод и ми«роартролод относительно варианте« без животных (пунктирная линия).

ревыпас возможен в почве, но только в тех микрофонах, в которых уровень микробной активности и активности фауны особенно велик. Размножение коллембол на разлагающемся опаде приводила к резкому снижению запасов микробной биомассы, но и к возрастанию интенсивности дыхания (Пан и кое, Симонов, 1986). Это означает, что в присутствии микроартропод возрастает удельная активность микробного комплекса.

Роль прямого выедания в регуляшш микробного комплекса

Быстрый функциональный ответ микроорганизмов предполагает наличие метаболического механизма регуляции животными микробной активности. Однако вряд ли можно исключить и роль трофического воздействия, т.е. прямого выедания. Для выяснения значения трофической регуляции приводятся ориентировочные расчеты выедания грибной массы коллемболой F. candida (Рис. 11), а также экскреции. Максимальная масса взрослых особей коллемболы F. candida составляет около 12 мкг С (Уваров, 19S7). Ориентировочный расчет продукции коллемболы за 35 суток дает около 1,1 мг С сухой массы. При эффективности ассимиляции у грибоядных микроартропод, составляющей около 50% и эффективности продукции - 35% (de Ruiter el al., 1998), для образования массы коялембод в 1,1 мг С (без учета отмирания животных) им необходимо потребить около 6,4 мг С грибов. Половина из потребленного материала (3,2 мг С) должна войти в состав экскретов, принимая во внимание эффективность ассимиляции, и может быть использована грибом на вторичную иродукнню. Продукция СОг С. cladotporioidt's к этому времени была больше в присутствии коллембол, чем без них - соответственно 10 и 8,5 мг С-СО;/г, н этот прирост теоретически может быть обеспечен экскретами жиношыч - 3,2 мг С. Таким образом, на продолжительном отрезке времени (более I месяца) роль выедания и экскреции субстратов роста в регуляции минералнзационной активности триба можно признать значительным. Однако трофический механизм не может объяснить стимулирующего эффекта при кратковременном (несколько дней) взаимодействии этих животных и микроорганизмов.

10. Микроорганизмы как регуляторы беспозвоночных животных в почве

В главе 10 рассматриваются наиболее характерные случаи регуляции микроорганизмами популяций и сообществ почвенных беспозвоночных.

Известно много микроорганизмов, которые вступают в антагонистические взаимодействия с беспозвоночными животными. Эти свойства микробов пытаются использовав

Су Т Í.T

put. и, Динамиса NOj-N (А) и N)l,.\ (Б) а >оде paviChtteHHR люцерновой u v * и (I, 2) н ирздндл (3. 4) в .гСр.н^яЬ ПОД ЫХИ^К'Й ПО-Ч&4 в npx¿>U16*rt исмятол и uHjrpo&pTponoa (I, 3) и в дефаунировахной по чье (2, 4), 5 - натчвнде г f'H-л 6е1до6>ви( (яг*3).

для контроля популяций вредных беспозвоночных. Нематоды - одни из самых (розных врагов культурных растений. В последнее время для борьбы с фитонематодами все большее развитие получают препараты на основе хищных нематофаговых грибов и бацилл. В задачи этого раздела работы входило изучение регуляторного действия гриба Arthrobotrys oligospora и энтомопатогекной бациллы Bacillus thuringiensis на естественные комплексы нематод, формирующиеся в прикорневой зоне растений винограда и пшеницы.

400Г 350j

зоо|

2J0f

Влияние хищного гриба Artkrobottys olisospora на комплекс нематод в прикорневой зоне винограда и пшеницы

Хишные грибы проявляют определенную специфичность по отношению к фитопа-разитическим нематодам, но не известно как реагируют свобданоживущие нематоды (Jansson, Norbrmg-Hertz, 1980). Хищный гриб A, oligospora Fres. А18 эффективно контролировал общую численность нематод в прикорневой зоне растений. Внесение А. oligospora в почву иол виноградом и пшеницей в количестве 10* конидий/г вызвало снижение их количества к 3-5-й неделям примерно в 1,5-2 раза (Рис. 15). При этом отмечается определенная специфичность взаимодействия гриба с нематодами разных эколого-трофических групп. Всего из прикорневой зоны винограда было выделено 40 родов нематод, образующих естественный комплекс. Из них 6 родов фитопаразити-ческих нематод, 24 рода бактериоядных и сапро-бионтой, 4 рода хищных и б родов грибоядных нематод. Обнаружено достоверное снижение численности фито паразитических и увеличение численности грибоядных нематод. Увеличение доли грибоядных нематод при внесении хищного гриба позволяет предположить, что A. oligospora, развиваясь в почве, стимулирует размножение нематод, питающихся гифами грибов. Специфической реакции нематод на A. oligospora в прикорневой зоне пшеницы не было обнаружено.

Это свидетельство специфичности нематофагового эффекта, что может быть связано с исходным различием в составе родов (видов) в составе труппы под растениями ишенииы и винограда, но также и с эффективностью хищного гриба, зависимой от уровня его внесения в почву (21].

I50f 100 sor 0L

;<юо isoo 1600 1400

1000Г

soo!" 600?-

í.

13 Б

to

18

3 б нежели к о играть ~~ ~ A oUgospQra

Рис. 15. Влияние хищного гриба Arthrobotrys oligospora на общую численность нематод в прикорневой зоне випогрзда (Л) н тиенкиы (В) (п-3).

Нематоцнднап активность энтомопатогенных банил л

Примером метаболического взаимодействия микроорганизмов и животных является нематоиидное действие энтомо патогенных Саши л. Bacillus thuringUnsh образует разнообразные токсины: белковый ^-эндотоксин, экзотоксины а (пептид) и ¡3 (нронзводиое нуклесткда), а также экэоферченты (нротеазы, липазы), которые могут оказывать токсическое действие не только на насекомых-мишени, но и на другие организмы (Kreig, Lysenko, 1979). Проблема нецелевых воздействий энтом о пакленных бацилл на почвенные организмы интересна не точькп с точки зрения фундаментальной экодоши, но и для поиска новых биологически активных микробных препаратов и развития биоинженерии на основе генома В. thuringicnsts. В течение последнего десятилетня появились сообщения о токсическом действии бацилл в отношении нематод-паразитов растений (Dévidas, Rehberger, 1992) и механизмах пематоцидного эффекта (Leyns et al., 1995). Не всегда, однако, удавалось установить какие токисны вырабатывает бацилла.

В опытах по изучению нематоцидното действия энтомонатотениых бацилл in vitro жидкие культуры бацилл фракционировали, чтобы разделить токсины. Предполагали, что культуральная жидкость содержит растворимые экзотоксины и эмофермснш, а нерастворимые кристаллы эндотоксинов осаждаются центрифугированием вместе с клеточной массой. Автоклав про вакие культуры вызывает денатурацию белков, что позволяет элиминировать действие эндотоксинов и экзоферчентов, следовательно, токсичность проавтоклавиро ванной культуры будет связана либо с экзотоксинами, либо новообразованными в процессе автоклавирования токсичными агентами,

Установлено, что нематоиидным действием обладает иативная суспензии клеток В. thuringiensis var. tenebrionis 12С (вызывала гибель 60% нематод), а проантоклавированная теряет нематоиидные свойства. Естественно предполагать наличие у этого пиамма растворимого в воде токсина белковой природы, неустойчивого к термообработке. Не исключено, что данный агент может действовать подобно 5-эндотоксину, быть его аналогом или производным. Аналогичные предположения ранее уже высказывались другими исследователями (Borgonie et, al., 1996). Токсичность 5, thuringiensis по отношению к нематодам варьирует между штаммами, разные штаммы несут токсины различной химической природы, а один штамм способен продуцировать одновременно несколько токсинов [I9J.

Влияние Bacillus thurtngUrtsts на комплекс нематод в прикорневой зоне ячменя

До сих пер не проводилась оценка воздействия энгочопагогенинх баципл на комплекс почвенных нематод in situ. Нематоцндную активность В. rhuringiens is оценивали в ве!'етационных опытах с растениями ячменя. Почву либо поливали суспгнзиячи бацилл (10s клеток/мл трижды в течение 70 сухок) и затем высевали ячмень, либо в почву высевали семена, замоченные в суспензиях бапиял. В отличие от опытов in vitro, в которых наблюдали элиминирование нематод, действие бацилл в почве проявилось в виде эффекта сдерживания их размножения (Рос. 16), что, вероятно, связано с особенностями почвы

как среды обитания нематод, ее гетерогенностью и микрозональностью. Очевидно, что содержание токсинов В. Жиг^ктк в почвенном растворе не могло достигнуть величин, сравнимых с их концентрацией в культуральной жидкости: во-первых, из-за относительно невысокой плотности бацилл-интродуцентов в почве; во-вторых, вследствие сорбирующих свойств почвы и, в-третьих, ввиду наличия в почве пула ферментов. Поэтому процесс размножения нематод превалировал над смертностью, вызванной бациллами [19].

В качестве рабочей принимали гипотезу о том, что обработка бацилла- 2 »хг

8 л»'

Г мо' г 500'

ё мо

20 40 G0 SO сут.

ми вызовет перегруппировку в составе неметод за счет гибели форм, приспособленных к потреблению бактериальных пленок, взвесей и детрита, которые они пассируют через кишечник (Сактс-риоядные и всеядные нематоды). Известно, что токсины В, Ihuringiensis действуют преимущественно через клетки кишечника (Dévidas, Rehberger, 1992). В отличие от бактериоядных, грибоядные нематоды и фигонематоды обладают стилетом, приспособленным перфорировать мицелий и ткани растений. Они не способны заглатывать клетки бацилл или токсины и поэтому не должны быть подвержены их действию. Однако достоверных изменений в соотношении трофических групп комплекса нематод выявлено не было [19]. Это означает, что бациллы могут воздействовать на нематод не только прямо (посредством токсинов), но к опосредованно.

ю ад ьо îo

Сие. 16. Изменение общей числекнпстн ночяекных немэггод я хазе Аегетадосюют} опдов при гфеддоседнай сбрзбепке семян жидккчн культурами баинде (А) н при bh&swh ку.шур бацклл в почву (В) 1 - ионтрнь, 2 - В ¡Ьип-щкти van sotK> tf 3 - & tfivingiensis var. israel&iia 1*5, 4 - R thurvtgicTLtis var. tenebri&u$ /ГС

11. Заключение

В настоящем исследовании сделана попытка сшализа и обобщения биотических механизмов, осуществляющих внутреннюю регуляцию зоо-чнеровного комплекса почвы. Становится очевидным, что эта регуляция основана на тесных взаимодействиях мехау микроорганизмами и животными на уровне отдельных организмов, популяций и сообществ. Зоо-чикробные взаимодействия в той или иной степени определяют протекание основных почвенных процессов и состояние биотического сообщества в целом. Эффекты от взаимодействий микроорганизмов и животных реализуются в процессах разложения н минерализации органического вещества, азотфиксацин, мобилизации-иммобилизации и др. Взаимодействия определяют судьбу микробных популяций (состав, обилие, активность) и популяций фауны. Следствием взаимодействий является формирование микробных сообществ и комплекса фауны почвы, динамику биомассы и продукцию микроорганизмов, транспорт микробов и их профильное распределение, генетический обмен между микробами. Как со стороны животных, так и со стороны микроорганизмов существует регулирующее воздействие, результат которого

не пропорционален основным метаболическим тратам вызывающего это во ¡действие организма. Трофический механизм не всегда объясняет эффекты от зоомикробных взаимодействий, следовательно, наличие метаболических механизмов в почве надо признать очевидным. В основе взаимодействий микроорганизмов и почвенных животных лежат несколько принципов.

Регул «торное воздействие крупных беспозвоночных на микробный комплекс состоит в следующем. При пассаже через нншеварительный тракт резко сокращается обилие грибов и возрастает численность физиологически активных бактерий, происходит модификация микробных сообществ. Переваривание микроорганизмов основано на "киллерном" эффекте. Оно - видо- и шмаммоспецнфичио. Максимально чувствительны к перевариванию микробы-обитатели свежего опала и почвы, минимальная скорость их гибели и выхода из клеток растворимых органических соединений составляет несколько минут, а эффективность ассимиляции достигает 80%, Киллерный механизм является одним из факторов, определяющих разнообразие трофических связей в почве. Кишечная среда может обладать и микробостатическим, и стимулирующим эффектом. Благодаря высокой скорости роста, некоторые бактерии (в основном, неспороносные) размножаются в заднем отделе кишечника как в ферментере, что и определяет общее увеличение их численности при их пассаже. В ряде экосистем роль макрофауны в регуляции продукционного процесса микроорганизмов существенна, Кишечник беспозвоночных - специфическое местообитание в почве, отличающееся по составу и активности микробов.

Регуляция лишеных иепси микро- и мезофауной имеет следующие особенности. Животные могут регулировать микроорганизмы и как хищники, и как жертвы. Питаясь микробами, нематоды и микрозртроподы регулируют микробный рост, активность, причем результат регуляции меняется от стимулирования к ингибированию при увеличении обеспеченности микроорганизмов азотом и при достижении пороговой нлотност популяций-хищников. Животные меняют скорость микробной сукцессии и состав доминирующих микроорганизмов. Реакция микроорганизмов на воздействие животных может быть очень быстрой и проявляется при низкой понуляционной плотности живогпик.

И стимулирующее, и ингибирующее влияние фауны на микробный комплекс, регистрируемое в виде быстрого ответа, не пропорционально количеству потребленной микробной массы. Питаясь, животные, вероятно, могут повреждать значительную часть грибной колонии, нарушая транслокацию веществ по мицелию. Экскреты, мертвая биомасса и метаболиты поврежденных микробных клеток могут активизировать микроорганизмы. Возрастание доли активной микробной биомассы в свою очередь приводит к увеличению скорости минерализации труднодоступных субстратов. Компенсаторный рост микроорганизмов как реакция на поедание животными, стимуляция микробов при пассаже, воздействие физиологически активных веществ животных, выделяющихся в микробные клетки при питании и их экскретов - это факторы положительной обратной связи, усиливающие микробную активность. Увеличение плотности животных до нскоторо-

го уровня приводит к ннгибированиго микробных процессов в результате превышения естественных компенсаторных механизмов (отрицательная обратная связь).

Компенсаторные реакции почвенных микромииетов на хищничество со стороны микро- и мезофауны но многом аналогичны таковым у растений на поедание растительноядными животными [31]. !>ю - повышение скорости энергодающих процессов, увеличение продукции, перераспределение продуктов и активности ферментов внутри тела, И для растений, и для грибов характерна непропорциональна* реакция на трофическое воздействие, выражающаяся в значительном изменении физиологического состояния в ответ на относительно малое воздействие (например, повреждение коры иди мицелия). 11 ряде случаев в основе механизма лежит действие физиологически активных веществ, исходящих от хищника. И растения, и мииелиальные грибы принадлежат к модулярным организмам, развитие которых, в отличие от унитарных организмов (бактерий, животных) сильнее зависит от их взаимодействия с окружающей средой (Бигон и др., 1989).

Главной отличительной особенностью взаимодействия микроорганизмов с мак-рофауиой является наличие развитого и разнообразного симбиотического сообщества в пищеварительном тракте, состоящего из протео-, актинобактерий и дрожжей. Прямая регулирующая роль этих животных по отношению к почвенным микробам состоит, в основном, в модификации микробных сообществ при их пассаже через пищеварительный тракт, поскольку дождевые черви, диплоподы и др. способны заглатывать крупные фрагменты субстрата, заселенные целым набором микроорганизмов. Особенностью взаимодействия микро- и мезофауны с микроорганизмами следует считать значительно более высокий уровень потребления микробной биомассы и значительно Солее "индивидуальное" потребление микробов. Вследствие этого прямая регулирующая роль этих животных во много превосходит таковую у макрофауны и сводится к активизации или подавлению отдельных видов и их популяций в почве.

В регуляции со стороны микро-, мезо- и макрофауны много общего. Это - наличие пищевой специализации в отношении микробов; предпочтение в пищу темноокрашенных грибов; киллсрныЙ механизм переваривания; быстрый ответ микробов на поедание (появление) животных; увеличение дали бактерий в процессе сукцессии под действием животных, Общим является и то, что в основе регуляции лежат трофические и метаболические механизмы. Регуляция по трофическому механизму основана на мобилизации животными питательных вешеств, связанных в микробных клетках, их экскреции и высвобождению в почву микроорганизмов, размножающихся в кишечнике. Регуляция по метаболическому механизму предполагает физиологический отклик микробов на метаболиты животных, обладающих свойствами физиологически активных веществ. Метаболический механизм объясняет быструю реакцию микробов на воздействие животных, не пропорциональную количеству потребленной микробной биомассы.

47

выводы

1. Почвенные беспозвоночные животные в процессе питания модифицируют состав микробоценоэов подстилок и почв. При пассаже через пищеварительный тракт животных, относящихся к макрофауне (многоножек, дожлевых червей, мокриц) меняется состав и структура микробных сообществ: резко сокращается обилие фибов и возрастает численность бактерий. В экскрементах увеличивается доля грамотршшельных неспороносных аэробных и факультативно-анаэробных, а также коринеподобных бактерий, актин ом ицетоа и дрожжей-аскомниетов. При этом снижается доля дрожжей-бззидиомицетов и мицелиальных трибов, особенно тем ноо крашенных. Основными причинами модификации микробоиеноза являются: элиминирование, задержка роста с сохранением жизнеспособности, инициация нрорасташи, рост и развитие устойчивых к перевариванию транзитных и симбиотических микроорганизмов. Задний отдел кишечника - природный ферментер, в котором обитают симбиотнческие микроорганизмы, В нем размножаются транзитные микроорганизмы, что и определяет общее увеличение их численности в субстрате, прошедшем через пищеварительный тракт. Роль дождевых червей в регуляции продукционного процесса микроорганизмов велика в луговых экосистемах.

2. Впервые определен механизм переваривания микробов беспозвоночными, объясняющий их селективное питание и связанное с ним формирование микробных сообществ и разнообразие трофических связей в почве. Селективность питании обусловлена специфическим кнллерньш эффектом пищеварительной среды животного по отношению к микробам. Пищеварительные экстракты кишечника диплопод, мокриц и дождевых червей обладают способностью убивать микробные клетки. Киллерное воздействие имеет мембранотропный характер. Устойчивые к киллерночу воздействию клетки не перевариваются. У грибов и бактерий проявляется видовая и штаммовая специфичность к киллерному воздействию, Киллерный фактор имеет неферментативную природу и, например, у кивсяка Pachyiulus flavipes связан с 16-сульфо-гидрокс1шальмитиновой кислотой, веществом, обнаруженным нами впервые. При воздействии киллерного фактора в сочетании с фермсн-гатииным гидролизом и автолизом достигается быстрое и эффективное переваривания микробных клеток. Ускорение переваривания микроорганизмов беспозвоночными в присутствии киллерного фактора сходно с механизмом индуцированного автолиза, описанною для позвоночных живо тных.

3. Активизация бактерий при пассаже через пищеварительный тракт животных может быть причиной генетического обмена между нитродуцированнычи и кишечными микробами. Показано, что некоторые бактерии, в том числе теистически модифицированные, могут долго выживать в почве, размножаться в кишечнике и экскрементах животных и передавать плазмиды к обычным кишечным бактериям сем. Enterobacíeriaceae. Генетический обмен может протекать в ес тественных условиях с частотой, сопоставимой с таковой in vitro. Обнаруженный факт генетического обмена между и (продуцированными и автохтонными бактериями обусловливает необходимость оценки роли почвенных беспозвоночных в регуляции переноса тенов между бактериями в почве.

•1. Микроорганизмы являются необходимым компонентом нищи дождевых червей, диплопод, мокриц. Состав микроорганизмов в пище определяет его качество для животных. Наряду с ранее выделенными токсичными, плохо и хорошо перевариваемыми микробами предлагается выделять микробы-стимуляторы. Сравнительно небольшие добавки микробов-стимуляторов в корм приводит к увеличению скорости роста и размножения животных. Предлагается способ повышения продуктивности культуры червей Eis-enia Jetida и эффективности процесса вермикомпостирования бедных органических субстратов путем внесения живых дрожжей - стимуляторов роста.

5. Кишечник дождевых червей и диплопол представляет собой особое местообитание микроорганизмов. В пристеночном сообществе (на внутренней поверхности стенок кишечника) доминируют факультативно-анаэробные протеобактсрии из семейств Enterobactcriaceac и Vibrionaceae, актинобактерии (в том числе, стрептомииеты) и дрож-жи-аскомицсты (у диплопод), В этом сообществе также присутствуют очень мелкие кок-ковндные бактерии (< ОД мкм), не культивируемые на питательных средах.

6. Функции кишечных симбионтов состоят в том, что он могут служить л и шей животных, реутилнзировать продукты обмена животного или мертвую микробную массу, обеспечивать устойчивость кишечника к колонизации чужеродными микроорганизмами за счет продукции антибиотиков, но и вызывать патологические процессы, приводящие к гибели животных,

7. Нематоды и микроаргроподы, питаясь микроорганизмами, оказывают регулирующее воздействие на комплекс почвенных микроорганизмов. Изменяется динамика биомассы и дыхательной активности, соотношение грибной и бактериальной биомассы, скорость минерализации углерода и азота растительных остатков. В присутствии микро-артропод увеличивается видовое разнообразие микромииетов, снижается доля темноок-рашеных грибов, возрастает выравненность видов по обилию. Реакция микроорганизмов на воздействие животных может быть быстрой (от суток) и не пропорциональна пищевым потребностям животных.

8. Реакция микроорганизмов на активность нематод и микроартропод зависит от соотношения углерода к азота в питательном субстрате и меняется от активизации роста до подавления при снятии лимита по азоту. Установлено, что нижний предел численности животных, при котором осуществляется их регу.иггорное воздействие, может быть очень мал: например, около 10 нематод/1 г почвы или 10 коллембол/ г опада.

9. Реализация хищничества нематофаговым грибом Artkrobotrys oltgospora регулируется ростовыми факторами, получаемыми от нематод при питании ими. Стимулом к хищничеству у нематофаговых грибов является недостаток в среле внтамннов или аминокислот. Как жертвы, нематоды ограничивают рост и сапротрофную активность и усиливают хонидиогенез хищных грибов. При питании нематодами у хищного гриба сокращается период завершения никла за счет более быстрого образования конидий.

10. В регуляции со стороны микро-, мезо- и макрофауны много общего. Это - наличие пищевой специализации в отношении микробов; предпочтение в пшцу темноок-

ращенных грибов; киллерный механизм переваривания; быстрый функциональный ответ микробов на поедание (появление) животных; увеличение доли бактерий в процессе сук* цессии под действием животных. Общим является и то, что ц основе регуляции лежат трофические и метаболические механизмы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальные статьи в рецензируемых журналах:

1. Byzov В.ЛЧ Vu Nguyen Thanh, Bab'eva LP. Yeasts associated with soil invertebrates. Biology and Fertility of Soils, 1993, V, 16, pp. 183-187.

2. Byrev B.A., Vu Nguyen Thanh, Bab'eva LP. Interrelationships between yeasts and soil diplo-pods. Soil Biology and Biochemistry, 1993, V. 25, N 8, pp. 1119-1126.

3. Вызов Б.Л. Зенова Г.М., Бабкина Н.И., Добровольская Т.Г., Третьякова Е.Б. и Звягинцев Д. Г. Актином и петы в нище, кишечнике н экскрементах почвенных многоножек Pachytulnsflavipes C.L.Koch, Микробиология, 1993, т. 62, N5, с. 916-927,

4. Третьякова Е.Б., Добровольская Т.Г., Бызок П.Л. Использование устойчивости к щелочи для селективного выделения грам положи тельных бактерий из почвы. Вест, Моск. Ун-ia, сер. 17 почвовед., 1994, N1, с. 49-55,

5. By Нгуен Тхань, Вызов БА., Бабьеиа Н.П, Чувствительность дрожжей к пищеварительной жидкости кишечника почвенных многоножек Pachyiuhts jlaiipes C.L.Koch, Микробиология. 1994, т, 63, N4, с, 715-720.

6. Byzov В.А., Polyanskaya L.M., Vu Nguyen. Thanh Applying of yeasts as growth stimulators for (he earthworm Eisenia fetida. Acta Zoologica Fennica, 1995, N 196, pp. 376-379.

7. Byzov B.A., Chemjakovskaya T.F., Zenova G.M., Dobrovotskaya T.G. Bacterial communities associated with soil diplopods. Pedobiologia, 1996, V. 40, pp. 67-79.

8. Третьякова Е.Б., Добровольская Т.Г„ Бызов Б.Л., Звягинцев Д.Г. Сообщества бактерий, ассоциированные с почвенными беспозвоночными. Микробиология. 1996, т. 65, N 1, с, 102-110,

9. Нгуен Дык TJI., Бызов Б.А., Зенова Г.М., Звягинцев Д.Г. Антагонистические свойства актином и цетон, ассоциированных с пищеварительным трактом почвенных беспозвоночных. Вест, Моск. Ун-та. сер. 17 почвовед., 1996, N 3, с. 70-77.

10. Рябченко Н.Ф., Степанова Т.В., Румер JI.M., Мозговая И.Н., Кызов Б.А., Звяжниев Д.Г. Коныативный перенос плазм иды pASfy от стрептококков в бациллы в вермиком-посте, Микробиология, 1996, т. 65, N 5, с, 663-667,

11. Byzov В.А., Claus Н., Tretyakova Е.В., Zvyagintsev D.G., Filip Z. Effects of soil invertebrates on the survival of some genetically engineered bacteria in leaf litter and soil. Biology and Fertility of Soils, 1996, V. 23, pp. 221-228.

12. Вызов Б.А., Рабинович Я.М. Килдерная активность пищеварительной жидкости почвенной многоножки Pachyiuhts fiavijm. Прикладная биохимия и микробиология, 1997, т. 33,N5, с. 568-571.

13. Byiov В.А., Vu Nguyen Thanh, Bab'eva LP., Tretyakova E.B., Dyvak l.A, and Rabinovich Ya^ M. Killing and hydrolytic activities of the gut fluid of the millipede Pachytulus Jbnipet C.L. Koch on yeast cells. Soil Biology and Biochemistry, 1998,30, N 8/9, pp. 1137-1145.

14. Byzov B.A., Kurakov A.V., Tretyakova E.B., Vu Nguyen Thanh, N'guyen Due To Luu and Rabinovich Ya.M, Principles of the digestion of microorganisms in die gut ofsoil millipedes: specificity and possible mechanisms. Applied Soil Ecology, 1998, N 9, pp. 145-151.

15. Byzov B.A., 1!. Claus, E.B. Tretyakova, M.F. Ryabchenfco, I.N.Mozgovaya, D.G, Zvyagintsev, Z. Fill p. Plasmid transfer between introduced and indigenous bacteria in leaf I ¡Iter, soil and verroicompost as affected by soil invertebrates. Biology and Fertility of Soils, 1999, N 28, pp. 169-176.

16. Мамилов Л.Ш., Бызов Б.А., Покаржевский АЛ.., Звягинцев Д.Г, Регуляция микрофауной биомассы и активности почвенных микроорганизмов. Микробиология, 2000, т. 69, N5, с. 727-736.

17. Мамнлов Л.Ш., Вызов БЛ., Степанов АЛ., Звягинцев Д.Г. Дифференцированный учет микробной биомассы в почве при разложении растительных остатков. Поч во веден ие, 2000, N 12, с. 1457-1462.

18. Mamilov A.Sh., By/ov В.А., Zvyagintsev D.G. and Dilly O.M. Predation on fungal and bacterial biomass in a soddy-podzolic soil ans ended with starch, wheat straw and alfalfa meal. Applied Soil Ecology, 2001, N 16,131-139.

19. Mo/govaya I.N., Byzov B.A., Ryabchenko N.F., Romanenko N.D. and Zvyagintsev D.G. Nematicidal effects of the entomopathogenic bacteria Bacillus tkurlnglensis in soil. Pcdobi-otogia, 2002, V. 46, N 6, pp. 558-572.

20. Мигунова В .Д., Вызов Б .А., Полянская Л.М., Звягинцев Д.Г. Развитие хищного нематофагового 1риба Artkrobotrys oJigpspora в дерново-подзолистон почве. Вестник Московского Университета, серия 17, Почвоведение, 2002, N 3, с. 44 - 47,

21. Мигунова В .Д., Бызов Б.А., Звягинцев Д.Г., Романенко НД. Влияние хищного нема-тофагового гриба Artkrobotrys oligospora на комплекс почвенных нематод, формирующихся в прикорневой эоне винограда и пшеницы Вест, Моск. Ун-та, сер. 17 почвовед, в печати.

22. Migunova V.D., Byzov В.А. Determinants of trophic modes of the nematophagous fungus Artkrobotrys oligospora interacting with bacierivorous nematode Caenorhabditis elegant, FEMS Microbiology Ecology, in press.

Статьи в сборниках;

23. Бызов Б.А, Микробиологические исследования вермикомлоста, приготовленного на отходах шампиньонного производства. В сб.: Биоконверсня органических отходов для-произвоаства биогумуса, биогаэа и белка и охрана окружающей среды, Киев-Ивано-Франковск, 1991,с. 67-70.

24. Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Полянская Л.М., Бабьева И.П., Чернов И.Ю, Вызов Б.А., Зенова Г.М., Лысак Л.М, Почва как природный банк микроорганизмов. Биология, экология, биотехнология и почвоведение. М,: Изд-во МГУ, 1994, с. 228-238.

25. Мамилов А.Ш., Бызов Б.Л., Звяшнцев Д.Г. Экспериментальные подходы к изучению микробной продуктивности почв. В кн.: Состояние и рациональное использование почв республики Казахстан: Материалы научной конференции. Алматы. "Тезис", 1998. с 157.

26. Паренчеикова Ю.А., Вызов Б.А. и Лебедева Г.Ф. Влияние гербицидов на численность почвенных нематод и интенсивность дыхания почвы, В сб.: Материалы по изучению русских почв, 2001, вып. 2 (29), Изд-во Санкт-Петербургского университета, с. 36-40.

27. Кураков А.В., Давыдова М.А., Бурова Н.Е., Салюк В.И., Вызов Б.А. Сукцессии микро. с конических грибов при разложении опада и иищевая активность микроартропод, В

сб.: Проблемы лесной фитопатологии и микологии. Материалы 5-Й Международной конференции, .М,: РАН, 2002, с. 141-144.

Обзоры;

23, ftyzov В.А. Intestinal microbiota of millipedes, in. (H. K6nig and A, Varma, eds.) Intestinal microorganisms of termites and other invertebrates, in press

Главы в книгах:

29. Гуэев В-С„ Бызов Б.А., Гуэева Л.С., Звягинцев Д.Г. Изучение методом сканирующей электронной микроскопии взаимодействия микроорганизмов с беспозвоночными. В кн.: Экологическая роль микробных метаболитов, М: Изд-во МГУ, I9S6, с. 212- 231.

30. Бызов Б.А. Методы изучения микробных сообществ, ассоциированных с сапрогроф-ными почвенными беспозвоночными. В кн.: Методы почвенной микробиологии и биохимии, М.: Изд-во МГУ, 1991, с. 47-58.

31. Бызов Б-А. Трофо-динамические взаимодействия микроорганизмов и животных в почве, В кн.: Перспективы развития почвенной биологии, 2001, М.: Изд-во Макс Пресс, 108-132.

Тезисы докладов:

32. В у7.0v В.А., Guzev V.S, The rote of invertebrates in the formation of a microorganism succession in decaying plant litter. Abstracts 9th International Colloquium Soil Zoology, Moscow, 1985, p 43,

33. Бызвв Б.А., Особенности микробного разложения углеводов в системе микроорганиз-мы'Сапротрофные беспозвоночные. Тезисы Всесоюзного совещания но проблемам почвенной зоологии, Тбилиси, 1987, с. 50-51.

34. Бызов БЛ, Зоомикробные взаимодействия как возможный показатель антропогенных воздействий на экосистему. Тезисы Всесоюиюй конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве", Кишинев, 1988, с. 62,

35. Бызов Б.А.,, Добровольская Т.Г, Динамика микробных группировок в зоочикробгюм комплексе в процессе лабораторного содержания животных. Тезисы Бессоюзной конференции "Биодинамика почв", Таллинн, 1988, с. 57.

36. Byzov В.А., Dobrovolskaya T.G., Zvyagintsev D.G, Microorganisms in the gut and faeces of Glomeris connexa C.L.Koch and Leptoiuluspolonlcus Jawlowski (Diplopoda). Abstracts 10H International Colloquium on Soil Zoology, Bangalore, India, 1988,

37. Byzov B.A., Dobrovolskaya T.G., Chemyskovskaya T.F. Dynamics of microbial communities of the saprotroph zoomicrobial complex. Abstracts 10th International Symposium on Soil Biology, Keszthely, Hungary, 19S9, p. 9.

38. Бызов Б.А., By Нгуен Тхань, Бабьева И.П. Роль дрожжей рода Candida в патогенезе салротрофных беспозвоночных. Тезисы Всесоюзной конференции "Микроорганизмы -стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных", Ташкент, 1989, с, 36,

39. Бызов Б.А., Третьякова Е.Б., Добровольская Т.Г. Зообактериальные сообшссгы в вер-м и ком посте и подстилке. Тезисы Всероссийской конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве", Пущи но, 1992, с, 199,

40. Byzov В.АЧ Vu Nguyen Thanh. Applying of yeasts in vermicomposting systems. Abstracts XI International Colloquium on Soil Zoology, Juvaskyla, 1992, p. 261.

41. Vu Nguyen Thanh, Byzov B.A. The effect of coelomic fluid of the earthworm F.iscnia fetida on yeast growth. Abstracts XI International Colloquium on Soil Zoology, Juvaskyla, 1992,91,

42. Zvyagintsev D.G,, Byzov B.A., Tretyakova E.B., Filip Z. Fate of genetically engineered bacteria in soil: influence of soil mesofauna on survival and possible gene transfer. Abiiracts 3^ German-Russian Workshop Biotechnology, Berlin, 1994, p. 8.

43. Byzov B.A., Trctyakova E.B., Rabinovich Ya.M. Principles of the digestion of microorganisms in the guts of soil millipedes; specificity and possible mechanisms. Abstracts Xll International Colloquium on Soil Zoology, Dublin, Ireland, 1996, p. 22.

44. Tretyakova Б.В.. By?ov B.A. Species-dependent survival of bacteria after passage through the gut of soil invertebrates. Abstracts XII International Colloquium, on Soil Zoology, Dublin, Ireland. 1996. p. 151.

45. Byiov B.A., Bab'eva 1.Р., Rabinovich Yaivl. Interactions between yeasts and soil millipedes. In: Yeast Nutrition and natural habitats. Abstracts 18th International Specialized Symposium on Yeasts, 1997, Bled, Slovenia, SOP8-8.

46. Migunova V.D., Polyarokaya L.M., Byzov B.A. Feeding strategies of the ncrmtopli3£0us fungus Arthrobotrys oligospora in soddy-podzolic soil. Abstracts Second English Language International Nematology Symposium of the Russian Society of Nematology, Russian Journal of Nematology, 199S, N 1, pp. 67-68.

47.Третьякова Е.Б., Мозговая И.Н., Рябчснко Н.Ф., Бызов Б.А, Влияние Gccno? коночных на судьбу генетически модифицированных бактерий в подстилке и почве. Тезизы II открытой юродской научной конференции молодых ученых города Пушино, Пущи но, 1997, с. 203-204.

48. Вызов Б.Л. Трофические взаимодействия микроорганизмов и беспозвоночных в почве. Тезисы II Всероссийского совещания "Проблемы почвенной зоологии", Москва, 1999, с. 183.

49. Мозговая Н.Н., Рябченко Н.Ф., Вызов Б. А, и Звягинцев Д.Г. Судьба энтомопатогенных баинлл в почве. Тезисы И Всероссийскою совещания "Проблемы почвенной зоологии", Москва, 1999, с. 199.

50. Зинин Н.В., Рабинович ЯЛ!.. Демин В.В. и Бызов Б. А. Особенности переваривания микроорганизмов почвенными беспозвоночными. Тезисы II Всероссийского совещания "Проблемы ночвенной зоологии", Москва, 1999, с, 191.

51. Мамнлов А.Ш., Бызов Б. А. и Звягннисв ДГ Влияние микрофауны на продукцию и групповой состаа комплекса почвенных микроорганизмов. Тезисы II Всероссийского совещания "Проблемы почвенной зоологии", Москва, 1999, с. 195.

52. Мигуиова В .Д., Бызов Б. А., Полянская J1.M. и Звягинцев Д.Г. Трофические стратегии хищного гриба Arthrobotrys ollgospora в почве. Тезисы II Всероссийского совещания "Проблемы почвенной зоологи и", Москва, 1999, с. 197.

53. Migunova V.D, and Byzov B.A. Selection of Trophic Strategy by Predacious Fungi. Abstracts 9s" International Symposium On Microbial Ecology "Interactions in the Microbial World", Amsterdam, 2001, p. 262.

54. Morgovaya l.N. and Byzov B.A. Behaviour of Entomopathogenic Bacilli in Soil: Survival and Interactions with Soil Biota. Abstracts 9я International Symposium On Microbial Ecology "Interactions in the Microbial World", Amsterdam, 2001, p. 328.

55. Мозговая И.Н., Вызов Б.А,, Кураков А.В., Звягинцев Д.Г. Экологические последствия применения Bacillus thurlngiensls для почвенных ценозов. Тезисы II научной конференции "Актуальные вопросы биотехнологии" М.: МГУ, 2001, с. 27.

56. Migunova V.D., Byzov B.A. Determinants of trophic modes of the netnalophagous fungus Arthrobotrys oli&ospora interacting with bacterivorous nematode Caenarhabditis elegans. Abstracts of International Symposium "Structure and Function of Soil Microbiota", 2003, Marburg.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 01.10.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 3,0. Тираж 120 >кз. Заказ 775. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Телефакс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В Ломоносова.

»16476