Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие дождевых червей и бактерий в модификации биологических и химических свойств гумусовых веществ

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Участие дождевых червей и бактерий в модификации биологических и химических свойств гумусовых веществ"

На правах рукописи

4855527

Тихонов Владимир Владимирович

УЧАСТИЕ ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ И БАКТЕРИЙ В МОДИФИКАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГУМУСОВЫХ ВЕЩЕСТВ

Специальности 03.02.03 - микробиология 03.02.13 - почвоведение

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

_ 6 ОКТ 2011

г. Москва 2011

4855527

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Б.А. Вызов

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

B.В. Демин

доктор биологических наук, профессор

C.Н. Чуков

доктор биологических наук, профессор А.В. Кураков

Ведущее учреждение: Институт физико-химических и

биологических проблем почвоведения Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится 18 октября 2011 в 15 часов 30 минут в аудитории М-2 на заседании Диссертационного Совета Д 501.002.13 при МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан «/4 »

2011г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

| биологических наук, профессор р ^ зенова

доктор I

Актуальность

Структура и состояние микробного ценоза почвы могут эффективно регулироваться беспозвоночными животными (Вызов, 2003; Тиунов, 2007), в частности, дождевыми червями. Масштабы трансформации среды могут быть весьма значительны. Черви за сезон способны переработать до 25% гумусово-аккумулятивного горизонта (Lee, 1985). В процессе прохождения почвы через кишечный тракт червя происходит разрушение органического вещества, протекают процессы гумификации (Фроуз и др., 2011). Червей рассматривают как «инженеров экосистем», создателей особых физических свойств субстрата (Persson, Lohm, 1977; Petersen, Luxton, 1982). Известно, что вермикомпосты более полезны для растений, нежели просто компосты (Norman et al., 2006). Считается, что черви в первую очередь улучшают физические свойства почв (Тиунов, 2007), однако исследования биохимических изменений субстратов под действием червей остаются малоизученной областью.

Гумификация - второй по значимости процесс в биосфере после фотосинтеза (Перминова, 2008). Взаимодействуя с живыми организмами, гумусовые вещества в малых количествах подавляют (Ansorg, 1978; Pascual et al., 2002; Loffredo et al., 2007; Steinberg et al., 2006) или стимулируют (Бирюков, 2006; Vallini et al., 1997; Giyndler, 2005) рост организмов. Они способны защищать живые клетки от токсического воздействия природных и антропогенных соединений (Бирюков, 2006; Fafa, Piccolo 2002; Vacca et al., 2002). С одной стороны, гумусовые вещества (ГВ) регулируют процессы питания и развития растений (Христева, 1951; Чуков, 2001; Попов, 2004), с другой, сами могут служить источником питания, в частности, для микроорганизмов (Кудрина, 1951; Теппер, 1972). Они трансформируются естественными микробными сообществами (Filip, Berthelin, 2001; Filip, Kubat, 2001). Молекулярная масса гуминовых кислот является одним из параметров, с которым коррелирует их биологическая активность (Vaughan, Malcolm, 1985; Nardi et al., 2002). Таким образом, ГВ могут входить в сложную систему взаимодействия между микроорганизмами и дождевыми червями, выполняя некоторую регуляторную роль в субстратах.

Цель

Выявление особенностей воздействия дождевых червей и бактерий на свойства гумусовых веществ.

Задачи

1. Установить оптимумы действия гуминовых кислот на рост бактерий разных таксономических групп.

2. Измерить уровень сорбции из раствора гуминовых кислот различными бактериями и оценить их протекторную функцию при действии ядов.

3. Оценить роль червей в изменении свойств и биологической активности гуминовых кислот.

4. Определить действие модифицированных червями гуминовых кислот на рост бактерий.

Научная новизна

Бактерии, ассоциированные с пищеварительным трактом дождевых червей, способны расти на гуминовой кислоте как на единственном источнике углерода. На 185 штаммах почвенных и кишечных бактерий показано отсутствие ингибирования их роста гуминовыми кислотами в концентрациях близких природным (50 мкгС/мл), у 40 % протестированных бактерий обнаружена стимуляция роста. Отработана методика определения количества гуминовой кислоты, сорбируемой из раствора бактериями. Количество сорбируемой гуминовой кислоты варьирует для различных бактерий и составляет десятые доли проценты от сырой биомассы бактерий. При пассаже гуминовых кислот через пищеварительный тракт дождевых червей происходит уменьшение молекулярной массы ГВ. В присутствии червей молекулярная масса гумусовых веществ в субстратах падает, как в результате разрушения ГВ, так и в результате осаждения и образования новых высокомолекулярных фракций. Действие стерильной кишечной жидкости дождевых червей Aporrectodea caliginosa уменьшает молекулярную массу исходной ГК. Модифицированные червями гумусовые вещества изменяют скорость роста бактерий на различных субстратах. В компостах и вермикомпостах присутствуют низкомолекулярные биологически активные соединения, которые в концентрациях 0,15 - 0,2 мкгС/мл также могут влиять на рост отдельных штаммов.

Практическая значимость

Работа расширяет возможности применения гуминовых препаратов.

Гуминовые кислоты могут быть использованы при стимуляции роста бактерий

с полезными для биотехнологии свойствами, например, деструкторов нефти и

нефтепродуктов. Результаты исследований по сорбции гуминовых кислот

бактериями могут быть применены при разработке регламентов и технологий

4

по очистке водоемов от органических примесей. Материалы работы могут быть использованы в лекционных курсах и практических занятиях по биологии, экологии и почвенной зоологии, а также по зоомикробным взаимодействиям и химии гуминовых веществ как задачи для практических занятий.

Апробация работы Результаты исследований были представлены на V съезде Всероссийского общества почвоведов им. В.В. Докучаева (Ростов-на-Дону, 2008), на XV - XVIII Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008 - 2011), на XV Всероссийском совещании по почвенной зоологии (Москва, 2008), на V Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» (Санкт-Петербург, 2010), на II Международной конференции «Вермикомпостирование и вермикультивирование как основа экологического земледелия в XXI веке -проблемы, перспективы, достижения» (Минск, 2010), на Всероссийской научной конференции XIV «Докучаевские молодежные чтения» (Санкт-Петербург, 2011) и на заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ.

Публикации

По результатам исследования опубликовано 12 работ, из них 2 экспериментальные статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 10 статей и тезисов в материалах меяедународных и российских конференций.

Объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследовании, результатов экспериментов, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на/-¿Г страницах текста, содержат45рисунков nj_ таблиц. Список литературы включает^Зисточник, в том числеД^на иностранном языке.

Автор выражает благодарность Добровольской Т.Г., Завгородней Ю.А., Лопатиной A.B., Якушеву A.B., Федию B.C. и Орлову Д.С. за помощь в проведении анализов и обсуждении результатов.

Объекты и методы

Почвы, компосты и вермикомпосты

В работе использовали: дерново-подзолистую почву (Лесная опытная дача МСХА имени К. А. Тимирязева, смешанный лес, 0-20 см); чернозем выщелоченный (Воронежская обл., 200-летняя залежь, 0-20 см); шестимесячные компосты из конского навоза с соломой и компосты из навоза

5

крупного рогатого скота; вермикомпосты после 3 месяцев инкубации с

червями.

Черви

В опытах использовались компостные черви Eisenia fétida andrei (Bouche, 1972) породы «Русский Московский гибрид», предоставленные ООО «РОСТАГРОЭКОЛОГИЯ» (пос. Пирогово), и почвенные черви Aporrectodea caliginosa (Sav.), выделенные из окультуренной дерново-подзолистой почвы.

Гуминовые кислоты

В экспериментах использовали гуминовую кислоту из бурого угля (ГКу), выделенную из коммерческого образца гумата (ТУ 211-06-18-94, сырье -сильно выветренный бурый уголь Канско-Ачинского угольного бассейна); 2) гуминовую кислоту из выщелоченного чернозема (ГКч); 3) гумат калия из низинного торфа (коммерческий препарат фирмы «Флексом»); 4) гуминовую кислоту из торфа фирмы «Merck» (ГКт); 5) гуминовую кислоту из белоподзолистой почвы (ГКб). Все ГК очищали от органо-минеральных примесей (Орлов, 1981). Модифицированные гуминовые кислоты (ГКм) получали путем инкубации ГКт в нестерильных условиях. ГКт смешивали с песком и инкубировали в присутствии червей, либо без них в течение 2 месяцев. Затем производили экстракцию ГКм 0,1 н Na-фосфатным буфером (рН=7) либо из копролигов, либо из среды, где инкубировались черви. Перед экспериментами все гуминовые препараты стерилизовались фильтрацией через мембранный фильтр 0,22 мкм (Millipore). Микроорганизмы

В работе по изучению действия ГКу на рост были использованы чистые культуры бактерий, любезно предоставленные Т.Ю. Нечитайло (Department of Environmental Microbiology, HZI -Helmholtz Centre for Infection Research, 38124 Braunschweig, Germany). Культуры были ранее выделены из дерново-подзолистой почвы из очищенных от пищевого субстрата пищеварительных трактов дождевого червя A. caliginosa (Москва, Ботанический сад МГУ). Идентификацию бактерий производили с помощью ПЦР-амплификации генов 16S рРНК с последующим секвенированием ампликонов и анализом данных, как описано ранее (Хомяков, 2007). Всего исследовали 170 штаммов бактерий (81 штамм из почвы и 89 из пищеварительных трактов червей).

В работе по изучению действия ГКч на рост микроорганизмов были использованы штаммы бактерий, выделенные из выщелоченного чернозема.

Бактерии выделялись на средах для олиго- и копиотрофных микроорганизмов (Семенов, 1991).

Действие ГКч также тестировали на широком круге грамотрицательных бактерий, выделенных из дерново-подзолистой почвы и на бактериях Bacillus cereus и Bacillus lentus-firmus, любезно предоставленных Т.Г. Добровольской (кафедра биологии почв, МГУ).

Бактерия Acinetobacter baumannii выделена из нефтеразрушающего российского препарата «Дестройл» (ООО ПО "СИББИОФАРМ") на среду R2A. Бактерии из компостов, вермикомпостов и пищеварительной жидкости А. caliginosa выделяли на модифицированную среду Сабуро (Difco™ Sabouraud Agar, Modified, США) и идентифицировали путем секвенирования фрагментов бактериальной 16S рДНК с последующим филогенетическим анализом.

Рост бактерий исследовали на 96-луночном микропланшетном фотометре (Tecan Sunrise) при 620 нм, изменение обилия фиксировали по изменению мутности раствора (Перт, 1978). Для описания роста микроорганизмов использовали параметры логистического уравнения вида:

р= п д-_ ,

1 i D™» ~ D° D0

где t - время, час, D - оптическая плотность в данный момент времени, D„ -оптическая плотность в начальный момент, Rmax - максимальная удельная скорость роста, час", Dmax - максимальная оптическая плотность в ячейке. Воздействие гуминовой кислоты на клетки определяли по изменению Rmax и Dmax. В ряде случаев рассчитывали среднюю оптическую плотность за весь период измерения.

Молекулярные массы гумусовых веществ определяли методом эксклюзионной хроматографии высокого давления на хроматографе Agilent 1100 (Agilent Technologies, США) с диодно-матричным детектором и системой обработки данных ChemStation, LCChem. Параметры хроматографического процесса: колонка TSK-2000SW 7,5 х 60 (Tosoh Bioscience, Япония), объем пробы 100 мкл, элюент 0,1 М Ыа-фосфатный буфер (рН=7) + 1 г/л додецилсульфата натрия, скорость потока элюента 0,75 мл/мин, длины волн сканирования 280 и 465 нм. Калибровку колонки проводили с использованием смеси глобулярных белков с молекулярными массами 12500-65000 Да (Pharmacia, Швеция). Средневесовые и среднечисловые молекулярные массы ГВ рассчитывались стандартным методом (Рабек, 1983).

Определение растворимых соединений азота и углерода в экскретах червей проводили в жидких пробах на анализаторе VARIO liquiTOC trace (Elementar, Германия). Углерод и азот в твердых образцах определяли на элементном анализаторе VARIO EL III (Elementar, Германия).

Кишечную жидкость А. caliginosa получали, как описано ранее (Хомяков и др., 2007).

Результаты и обсуждение

Гуминовые кислоты как источник углерода и биологически активные вещества Многие почвенные бактерии и бактерии, выделенные из пищеварительного тракта червей, были способны расти на среде с гуминовой кислотой из бурого угля в качестве единственного источника углерода. На гуминовой кислоте росли 56 (63%) почвенных и 59 (73%) кишечных штаммов, причем кишечные бактерии росли быстрее (Табл.1). Коэффициент rmax, характеризующий максимальную удельную скорость роста, в экспоненциальной фазе роста, для кишечных бактерий равен 0,033±0,003, а для почвенных 0,021±0,002. Установлено, что возможность использовать гуминовую кислоту - это штаммоспецифичный признак (Табл.1). Для бактерий кишечника червей это показано впервые.

Таблица 1. Бактерии, способные (+) и неспособные (-) к росту на гуминовой кислоте как на

Почвенные бактерии + - Бактерии, ассоциированные + -

с пищеварительными трактами

червей

Aminobacter aminovorans 3 0 Acinetobacter spp. 4 0

Agromyces spp. 2 0 Aeromonas spp. 12 4

Arthrobacter spp. 2 2 Bacillus spp. 2 0

Bacillus spp. 16 8 Buttiauxella spp. 3 2

Kocuria palustris 3 5 Chryseobacterium spp. 2 0

Nocardioides spp. 2 3 Delftia acidovorans 1 4

Pseudomonas spp. 9 1 Microbacterium sp. 3 2

Rhodococcusspp. 1 0 Ochrobactrum grignonense 1 0

Sphingopyxis spp. 1 1 Paenibacillus sp. 1 0

Streptomyces spp. 1 3 Pseudomonas spp. 9 3

Microbacterium sp. 0 1 Shewanella sp. 0 1

Oxalobacter sp. 0 1 Rhodococcus sp. 0 1

Неопределенные штаммы 16 8 Неопределенные штаммы 21 5

При добавлении гуминовой кислоты в питательную среду, содержащую источник углерода в виде глюкозы, 40% протестированных бактерий росло быстрее, и конечное обилие их также возрастало по сравнению с вариантом без гуминовой кислоты. Причем бактерии из кишечника росли быстрее, и конечное обилие их было больше, почвенных вероятно из-за того, что кишечные бактерии являются г-стратегами (Рис. 1).

i 0,12

t

i. 0,1

I

: 0,08 : 0,06 0,04 0,02 О

Гтах=0,045

/

/

/ /

Гта«=0,03

;

so

|o,12

OJ

■».0,10

л

м

о 0,08

z н

§0,06 10,04

150 250 Время, часы

350

/ Г

0,02?

о!——

Гспах=0,035

Гта«=0,019

50 150 250 Время, часы

Рис.1. Рост кишечных (А) и почвенных (Б) бактерий в присутствии

1 гуминовой кислоты (0,1 мг/мл) в среде Чапека с

2

концентрацией глюкозы 1 мг/мл. 1 - с гуминовой _ кислотой, 2 — без 350 гуминовой кислоты

Стимулирующий эффект от ГКу был одинаковым для почвенных и кишечных бактерий. Стимулирующее действие гуминовой кислоты также проявляется на штаммовом уровне. Псевдомонады из пищеварительных трактов червей достигали большего обилия, чем псевдомонады из почвы при росте на среде с ГКу. Протестировано 170 штаммов, не выявлено ни одного случая подавления роста бактерий гуминовой кислотой в концентрации 0,1 мг/мл (Табл. 2).

Таблица 2. Рост бактерий, выделенных из почвы и пищеварительных трактов червей Aporrectodea caliginosa, на среде Чапека с добавлением гуминовой кислоты из бурого угля (0,1 мг/мл). Дано количество штаммов, испытывающих стимулирующее действие (+) и отсутствие действия (0)_

Бактерии, ассоциированные

Почвенные бактерии + 0 с пищеварительными трактами + 0

червей

Agromyces spp. 1 1 Acinetobacter spp. 0 4

Aminobacter vorans 3 0 Aeromonas spp. 6 10

Arlhrobacter spp. 0 3 Bacillus spp. 0 2

Bacillus spp. 8 8 Buttiauxella spp. 1 4

Kocuria palustris 4 1 Chryseobacterium spp. 2 0

Microbacterium sp. 0 1 Delftia acidovorans 3 1

Nocardioides spp. 1 4 Microbacterium spp. 1 3

Oxalobacter sp. 1 0 Ochrobactrum grignonense 0 1

Pseudomonas spp. 5 5 Paenibacillus sp. 0 1

Rhodococcus sp. 0 1 Pseudomonas spp. 9

Sphingopyxis spp. 1 1 Rhodococcussp. 0 1

Streptomyces spp. 2 2 Shewanella sp. 0 1

Не идентифицированные 10 16 Sphingobacterium spp. 1 1

Streptomyces sp. 0 1

Не идентифицированные 7 19

На 14 штаммах показано, что оптимальные концентрации для гуминовой кислоты из чернозема, стимулирующие рост бактерий, выделенных из различных почв, лежали в диапазоне 0,1-1 мг/мл (Рис. 2).

0,8 0,4

£ б о

О 0,005 0,05 0,1 1

0,5

0,3

0,1

0,5

0,3

0,1 0

0,5

0 0,005 0,05 0,1 1

0 0,01 0,1 1 2,5 5 о 0,005 0,05 0,1 1

Концентрация гуминовой кислоты, мг/мл

Рис. 2. Рост бактерий из чернозема на жидкой среде Чапека в зависимости от концентрации гуминовой кислоты: 1— 5 - грамотрицательные штаммы; 6 -копиотрофные бактерии; 7 -олиготрофные бактерии; 8 - Bacillus lentus-ßrmus; 9 -Bacillus cereus

Сорбция гуминовых кислот клетками бактерий

Сорбция гуминовых кислот на бактерии - важный аспект взаимодействия клеток с органическим веществом и их активности в почве. На Рис. 3 представлены хроматограммы остаточного количества гуминовой кислоты после ее сорбции клетками бактерий. Средневесовая молекулярная масса гуминовой кислоты достоверно не изменялась, а ее концентрация падала при росте олиготрофов и копиотрофов (Рис. 3). Таким образом, рост бактерий зависит от концентрации гуминовой кислоты в растворе, а микроорганизмы могут менять концентрацию гуминовой кислоты путем сорбции на поверхности клеток.

10 15 20 25 30 35 Время, мин

10 20 30 Время, мин

Рис. 3. Уменьшение интенсивности светопоглощения гуминовой кислоты из чернозема (1) после инкубации с копиотрофными (2) и олиготрофными бактериями (3). Концентрации гуминовой кислоты из чернозема: А - 0,1 мг/мл; Б - 1 мг/мл

Бактерии с различной интенсивностью сорбировали гуминовую кислоту (Рис.4)

♦ 1 ■2

■ 3 <4

'5

О 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Равновесная концентрация гуминовой кислоты, мг/мл

Рис. 4. Сорбционные кривые ГК для клеток 1 -Serratia marcescens, 2 — Pseudomonas putida, 3 -Streptomyces sp., 4 -Aeromonas hydrophila, 5 -Bacillus circulons с гуминовой кислотой из торфа

Ранее отмечалось, что сорбированные гуминовые кислоты могут защищать клетки дрожжей Басскаготусез сегеУ1Я1ае от действия ядов (Демин и др., 2003; Бирюков, 2006). Была предложена гипотеза «ажурного активного фильтра» (Демин и др., 2003), который создают сорбированные на поверхности клеток гуминовые кислоты, предотвращая проникновение молекул додецилсульфата натрия (ДСН) в клетку. Подобное явление мы наблюдали и у бактерий (Рис. 5). Рост А. ЬаитаппИ в присутствии ДСН ингибировался, как в случае с ГКч, так и без ГКч (Рис. 5 А), если инокулят бактерий вносился в раствор последним. При внесении ДСН последним на поверхности клеток успевал образовываться протекторный фильтр из молекул ГКч, и действие яда ослабевало (Рис. 5 Б).

Рис. 5. Оптическая плотность после 100 часов роста Асте1оЬас1ег ЬаитаппИ в присутствии гуминовой кислоты и додецилсульфата натрия. Клетки добавлялись в раствор последними (А); ДСН добавлялся в суспензию клеток с гуминовой кислотой (Б). 1 — без гуминовой кислоты, 2-е гуминовой кислотой, 3 - контроль.

Участие дождевых червей в модификации свойств гумусовых веществ

Микроорганизмы способны менять структуру молекул гуминовых кислот, частично их утилизируя. В модельных экспериментах и на промышленных образцах компостов (Рис. 6) нами показано уменьшение молекулярной массы и концентрации гумусовых веществ под действием червей. Присутствие червей в субстрате: низинном торфе, листве, навозе, приводило к уменьшению молекулярных масс (Табл. 3) и концентраций гумусовых веществ через 6 месяцев работы червей.

0,7 0,6

1 с

2 0,5 а

10.4 >

|о.з }

и

с 0,2 >

0.1

I

□ »

0.7. 0,6 0,5 0,4 0,3 0.2 0.1 _О

гЬ

торф

15 20 25 Время, мяв

600 500

I 400

90

д- 300 1 200 100

15 20 25 Время, мин

15 20 25 Время, мни

Рис. 6.

Хромато граммы гумусовых веществ в фосфатных вытяжках из компостов (1) и вермикомпостов (2)

Таблица 3. Изменение молекулярных масс гумусовых веществ в ходе вермикомпостирования

Субстраты Молекулярные массы, Да

компост вермикомпост

Торф 19300 6900

Листва 16900 5100

Навоз 42500 39700

При скармливании червям препарата гуминовых кислот (ГКт), внесенного в песок, средневесовая молекулярная масса гуминовой кислоты снижалась в 1,5-2 раза: при пассаже через пищеварительный тракт червей А. caliginosa с 8,5 кДа до 5,7 кДа (рис. 7 А), а Е. fétida - с 20 кДа до 10 кДа (Рис. 7 Б).

Рис. 7. Молекулярно-массовое распределение исходной гуминовой кислоты (1) и гуминовой кислоты, прошедшей через пищеварительный тракт червей (2). Aporrectodea caliginosa (А) и Eisenia fétida (Б)

ю 30

10 30 50 70 Молекулярная масса, кДа

Наблюдаемое уменьшение молекулярной массы гуминовых кислот, переходящих в фосфатный буфер, при пассаже можно объяснить, наряду с деструкцией молекул полимера, функцией кальциевых желез червя, которые генерируют гидрокарбонат кальция (Вызов, 2007) Ионы кальция взаимодействуя с гуминовыми веществами, снижают их растворимость.

Роль карбоната кальция в связывании гуминовых кислот определяли, добавляя комплексон ЭДТА, который разрушает комплексы гумусовых веществ с ионами Са. Присутствие ЭДТА и изменение времени экстракции не влияли на величину средневесовой молекулярной массы гумусовых веществ, выделяемых из компоста. В вермикомпосте, напротив, введение в раствор ЭДТА и увеличение времени экстракции приводило к увеличению средневесовой молекулярной массы гумусовых веществ с 37 - 39 кДа до 43 - 45 кДа (Рис.8). Таким образом, черви с одной стороны закрепляют гумусовое вещество, делая его менее водорастворимым, с другой стороны активно разрушают его.

Рис. 8. Молекулярная масса гумусовых веществ в компосте (1) и вермикомпосте (2) без ЭДТА (А) с ЭДТА (Б). Штриховка экстракция 1 час, без штриховки -экстракция 12 час

Трансформация ГКб при пассаже через кишечник червя может быть следствием воздействия ферментов кишечной жидкости или результатом деятельности микроорганизмов, ассоциированных с червем. В модельном эксперименте биополимер инкубировался с кишечной жидкостью, пятью бактериями, выделенными из кишечника и бактериями с кишечной жидкостью одновременно. Выявлено, что все бактерии росли на ГКб и кишечной жидкости в качестве единственного источника углерода. Все штаммы уменьшали

молекулярную массу ГК в 1,3 - 1,5 раза (Табл. 4). В присутствии кишечной жидкости молекулярный вес гуминовой кислоты достоверно уменьшался по сравнению с исходной гуминовой кислотой в 2,6 раз. Кишечная жидкость и бактерии при одновременном воздействии уменьшали молекулярную массу исходной гуминовой кислоты, однако действие только кишечной жидкости приводило к несколько более сильной деструкции гуминовой кислоты. Известно, что в ряде случаев в присутствии легкодоступного вещества труднодоступный субстрат не разлагается микроорганизмами. Механизм подробно описан в работах (Голышин, 1991) и называется катаболитной репрессией. Бактерии, по-видимому, используют углеводы, белки, в том числе и ферменты, кишечной жидкости как источник энергии, поэтому действие кишечной жидкости с бактериями менее интенсивное на ГКб по сравнению

кишечной жидкости без бактерий.

Таблица 4. Трансформация гуминовой кислоты в ходе инкубации при 25° С в течение 117 часов. ___________

Вариант опыта Средневесовой молекулярный вес, кДа

Гуминовая кислота 31 ±3,1

Гуминовая кислота + кишечная жидкость 12 ± 1,2

Гуминовая кислота + Aeromonas encheleia 21 ±2,1

Гуминовая кислота + Bacillus thuringiensis 22 ± 2,2

Гуминовая кислота + штамм 3 22 ± 2,2

Гуминовая кислота + Acinetobacter sp. 23 ± 2,3

Гуминовая кислота + Aeromonas sp. 22 ± 2,2

Гуминовая кислота + кишечная жидкость + Aeromonas encheleia 14 ± 1,4

Гуминовая кислота + кишечная жидкость + Bacillus thuringiensis 18 ± 1,8

Гуминовая кислота + кишечная жидкость + штамм 3 17 ± 1,7

Гуминовая кислота + кишечная жидкость + Acinetobacter sp. 14 ± 1,4

Гуминовая кислота + кишечная жидкость + Aeromonas sp. 17 ± 1,7

Взаимодействие стерильной кишечной жидкости червей с ГКб вызывает

увеличение содержания низкомолекулярных фракций (0,5 - 3 кДа) и увеличение содержания высокомолекулярных фракций более 65 кДа ГКб (Рис. 9). Свободные ферменты, присутствующие в кишечной жидкости, могут активно модифицировать фракционный состав ГКб. С одной стороны, они гидролизуют и окисляют молекулы ГК, с другой, по-видимому, способствуют образованию новых высокомолекулярных продуктов.

0,0025

= 0,0015

О 0,0005

Рис.9.

Хроматограмма гуминовой кислоты. Исходная ПК (1), ГК, проинкубированная с кишечной жидкостью червя (2)

15 20 25 Время, мин

Действие модифицированных гумусовых веществ на рост микроорганизмов

Модифицированные червями гуминовые кислоты могут обладать другими свойствами, нежели нативные, возможно, вследствие изменения молекулярных масс. Ранее на эукариотных организмах было показано, что высокая биостимулирующая способность была наибольшей во фракциях с молекулярной массой меньше 10 кДа (Мато, 1972; Воган, 1985; Стрелков, 1991).

Вслед за работами М.В. Бирюкова с соавторами (Бирюков, 2006) мы исследовали действие гуминовых кислот с разными молекулярными массами и в разных концентрациях на рост дрожжей БассИаготусея сеге^ае. При уменьшении путем модификации молекулярной массы ГКт ее стимулирующий эффект на рост дрожжей повышается. Гуминовая кислота с наименьшей молекулярной массой (5,5 кДа) наиболее сильно стимулировала рост при всех исследуемых концентрациях. (Рис. 10) .

Рис. 10. Рост дрожжей Засскаготусех д сегеуйгае на средах с гуминовой кислотой. А - контроль; Б -

л" 1 3 3 8< а? ■) исходная гуминовая

о § 8 й I . кислота, 20 кДа;

модифицированные гуминовые кислоты: В - 9 кДа; Г-7,5 кДа; Д -5,5 кДа Концентрации гуминовых кислот: I -0,16 мг/мл, 2-0,12 мг/мл, 3 - 0,08 мг/мл,

6[ 4 5 4 4

2 5 3 Гг

8 / 4 I 1

Я Л1 I ЬЗ

В 4 Й ^Р3 / 3 Шг

Г 1 /¿1 I .

Время, мин

4 - 0,04 мг/мл, 5 - 0,02 мг/мл

Исследовали рост бактерии А. Ьаитаппи при действии исходной гуминовой кислоты, экскретов червей и гуминовой кислоты из копролитов червей. Исходная гуминовая кислота подавляла рост бактерий, экскреты червей стимулировали, а гуминовые кислоты из копролитов не отличались от контроля (Рис. 11).

0,25

0.2

0,15

0,1

0,05

Рис.11. Действие экскретов червей (1), гуминовых кислот из копролитов (2), из конечного субстрата после 2 месяцев инкубирования с червями Eisenia fétida (3), из исходного субстрата (5) на рост бактерии Acinetobacter baumannii, 4 - контроль (рост бактерии на среде без добавок)

40 50 60 Время, часы

80 90 100

До сих пор остается неясным, как черви изменяют микробное сообщество при вермикомпостировании. Проверяли действие исходной и модифицированных червями гуминовых кислот на рост комплекса бактерий из компоста и вермикомпоста в жидких средах. Для компоста менялось как обилие колониеобразующих единиц, так и состав бактерий. Есть тенденция к уменьшению обилия при действии модифицированных гуминовых кислот на бактерии из компоста. При этом гуминовая кислота, выделенная из копролитов червей, подавляла рост бактерий (Рис.12).

Рис. 12. Рост бактерий (1 -Pseudomonas sp., 2 — Bacteroides sp., 3 -Pseudomonas viridißava, 4 -неопределенные культуры), выделенных из компоста на средах с гуминовыми кислотами: А - контроль (фосфатный буфер); Б -исходная гуминовая кислота, 20 кДа; В - гуминовая кислота, выделенная из конечного модельного субстрата после 2 месяцев инкубирования с червями Eisenia felida, 9 кДа; Г -гуминовая кислота из копролитов, 11 кДа; Д -

17

поверхностные экскреты червя Eisenia fétida

Модифицированные гуминовые кислоты увеличивали обилие бактерий, выделенных из вермикомпоста, а нативная гуминовая кислота не влияла на их обилие. Изменялось также доминирующие виды (Рис. 13).

Рис. 13. Рост бактерий (1 - Serratia marcescens, 2 -Pseudomonas putida, 3 -A er ото ñas media, 4 — Aeromonas hydrophila, 5 -Bacillus circulans), выделенных из вермикомпоста на средах с гуминовыми кислотами. А - контроль, Б — исходная гуминовая кислота, 20 кДа, В -гуминовая кислота, 9 кДа, Г - гуминовая кислота, 7,5 кДа, Д - гуминовая кислота, 5,5 кДа

Численность бактерий из компоста при действии на них гуминовой кислоты с более низкими молекулярными массами падает, а из вермикомпостов растет. Таким образом, гуминовая кислота, модифицированная червем, подавляет рост бактерий компоста, и не подавляет бактерии вермикомпоста. Очевидно, черви, пропуская субстрат через пищеварительный тракт и (или) действуя поверхностными экскретами, разрушают и стабилизируют гуминовую кислоту и тем самым индуцируют сукцессии в компостах и вермикомпостах.

На гуминовой кислоте, прошедшей через пищеварительный тракт червя, бактерии развивались быстрее, и конечное обилие их было больше (Рис. 14).

0.12

(А)

Л:

■-ГЛ

TT Í.J

ад1 тт

О 10 20 30 40 Время, ч

12

<= 8 s

(Б)

Рис. 14. Рост (А) и конечное обилие (Б) бактерий из компоста на гуминовых кислотах в качестве единственного источника углерода и азота. 1 - исходная гуминовая кислота, 20 кДа; 2 - гуминовая кислота, выделенная из конечного модельного субстрата после 2 месяцев инкубирования с червями Е. fétida, 9 кДа; 3 -гуминовая кислота из копролитов, 11 кДа

Больше всего бактерии снизили молекулярные массы исходной гуминовой кислоты, меньше - модифицированных гуминовых кислот (Табл. 5). Наибольшее снижение концентрации отмечено для модифицированных кислот - в 2 раза. Рост микроорганизмов на средах с гуминовыми кислотами после их биодеградации при пассаже через кишечник червя был более интенсивным. Дополнительным источником доступных форм углерода и азота могли являться поверхностные и кишечные экскреты червей, представленные комплексом полисахаридов и пептидов. Отношение C/N составляло в экскретах червей 9, ГКм 11,2 в ГКт 18. В работе также продемонстрирована возможность роста

комплекса бактерий из компоста на экскретах червя Е. fétida.

Таблица 5 Изменение концентраций и среднечисловых молекулярных масс гуминовых кислот (ГК) при росте на них, как на единственном источнике углерода и азота, комплекса

Ко^пчй ич ncnfiinpRiiiero конского навоза -

Субстрат Среднечисловая Среднечисловая Изменение Изменение

молекулярная молекулярная молекулярной концентрации,

масса исходного масса субстрата массы, % %

субстрата, кДа после роста бактерий, кДа

ГКи 20 13 35 26

ГКк 11 8.6 25 51

ГКм 9 7.8 13 53

Биологическая активность кампостов и вермикомпостов, низкомолекулярные регуляторы роста

Встречаются работы с указанием на то, что вытяжки из компостов и вермикомпостов обладают физиологически активными свойствами и, как правило, это связывают не с гуминовыми кислотами, а низкомолекулярными гормонами роста (Musculo, 2007). При добавлении небольшого количества вытяжек (менее 200 мкгС/л) из компостов и вермикомпостов в питательную среду рост бактерии A. baumannii ингибировался (Рис. 15). Так как концентрации гуминовых кислот в этих растворах были малы, мы предположили, что данное явление вызывают не гуминовые кислоты в растворе, а низкомолекулярные физиологически активные соединения.

2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 15. Обилие Acinetobacter baumannii через 100 часов роста на среде Чапека с водными (А) и фосфатными (Б) вытяжками из компоста (2) и вермикомпоста (3) при различных разведениях субстрат/растворитель (по массе): 1 - контроль, 2 -1/10000,3 - 1 /1000,41/500,5- 1/100,6- 1/50,71/10. При разведении 1/10000 концентрации углерода в фосфатных вытяжках варьировали в пределах 150 -200 мкг/л

Для того, чтобы зарегистрировать эффект от гуминовой кислоты и от низкомолекулярных физиологически активных соединений, мы исследовали рост бактерии Pseudomonas putida в полноценной жидкой среде в присутствии гуминовых кислот из компоста и вермикомпоста и на фосфатных вытяжках из этих субстратов. При действии низких концентрациях, происходило угнетение роста только в варианте с вытяжкой из вермикомпоста. Большие концентрации вызывали стимуляцию роста. Гуминовые кислоты устраняют ингибирующий эффект низкомолекулярных соединений с концентраций больше 5 мкг/мл в средах из вермикомпоста (Рис. 16).

Рис. 16. Обилие Pseudomonas putida через 35 часов роста (контроль-Д),на гуминовой кислоте из компоста (А), фосфатной вытяжке из компоста (Б), гуминовой кислотой из вермикомпоста (В), фосфатной вытяжке из вермикомпоста (Г) при различных концентрациях гуминовой кислоты: 1 - 0,5 мкг/мл, 2 - 1 мкг/мл, 3-2 мкг/мл, 4-5 мкг/мл, 5-10 мкг/мл, 6-20 мкг/мл

Как мы убедились, в компостах помимо гуминовых кислот есть и другие мощные регуляторы. Возможный вклад этих низкомолекулярных веществ в

регуляторное действие более заметен при низких концентрациях гумусовых веществ в растворе.

Заключение

Дождевые черви и микроорганизмы уменьшают молекулярную массу и концентрацию гумусовых веществ в субстратах. Измененные гумусовые вещества оказывают отличное от исходных ГВ влияние на микробное сообщество, как в целом, так и на отдельные его части, возможно, являясь молекулярными регуляторами сообщества. Стимулирующий эффект ГВ по отношению к бактериям зависти от концентрации и молекулярной массы полимера. Помимо гумусовых веществ в субстратах, населенных червями, присутствуют низкомолекулярные биологически активные вещества, действующие концентрации которых в сотни раз меньше аналогичных концентраций гумусовых веществ. В модификации молекулярных параметров гуминовых кислот играют роль как химически факторы, например, связывание кислот с кальцием, так и биологические. Кишечная жидкость червей разрушает гуминовую кислоту, в этом процессе, по-видимому, участвуют ферменты бактерий. Бактерии, выделенные из пищеварительной жидкости червя, как и почвенные бактерии способны расти на гуминовых кислотах. Выявлено, что бактерии сорбируют гуминовые кислоты с различной интенсивностью. Несмотря на то, что дождевые черви и бактерии способны разрушать ГК, беспозвоночные выделяют в среду различные экскреты, которые по механизму катаболитной репрессии, способны сохранять труднодоступные соединения, в частности, гумусовые вещества.

Выводы

1. Впервые показано, что бактерии из кишечного тракта дождевых червей также как и почвенные способны расти на гуминовой кислоте как единственном источнике углерода.

2. На 185 штаммах почвенных и кишечных бактерий из разных таксонов показано отсутствие ингибирования роста гуминовыми кислотами в концентрациях близких природным (50 мкг С/мл), в 40 % случаев отмечали стимулирование роста бактерий.

3. В компостах и вермикомпостах присутствуют низкомолекулярные биологически активные соединения, которые в концентрациях 0,15 - 0,2 мкг С /мл также могут влиять на рост бактерий.

4. Бактерии способны сорбировать гуминовую кислоту с различной интенсивностью. Отработана методика расчета количества сорбируемой гуминовой кислоты для бактерий. Сорбированные гуминовые кислоты снижают отрицательное влияние додецилсульфата натрия на рост бактерий.

6. В присутствии червей молекулярная масса гумусовых веществ в субстратах падает, как в результате осаждения и образования высокомолекулярных фракций гумусовых веществ, так и их разрушения.

7. Кишечная жидкость червя Aporrectodea caliginosa уменьшает молекулярную массу гуминовой, происходит фракционирование исходной гуминовой кислоты: увеличивается доля высокомолекулярных и низкомолекулярных фракций.

8. Черви изменяют биологическую активность гумусовых веществ, что является фактором сукцессии бактерий при вермикомпостировании.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Экспериментальные статьи в рецензируемых журналах:

1. Тихонов ВВ., Якушев A.B., Завгородняя Ю.А., Вызов Б.А., Демин В.В. Действие гуминовых кислот на рост бактерий // Почвоведение. 2010. № 3. с. 333-341.

2. Тихонов В.В., Вызов Б.А., Завгородняя Ю.А., Демин В.В. Дождевые черви -преобразователи структуры и биологической активности гуминовых кислот // Известия РАН. сер. биологическая. 2011. № 1. с. 1-10.

Тезисы, труды конференций, сборники:

3. Тихонов В.В. Эффект воздействия гуминовых кислот на рост микроорганизмов // Тезисы докладов XV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2008», секция почвоведение М.: МАКС Пресс. 2008. С. 127-128.

4. Демин В.В., Тихонов В.В., Завгородняя Ю.А. Влияние гуминовых кислот на рост бактерий различных экологических групп в почве // Материалы V Всероссийского съезда почвоведов им. В.В. Докучаева, 18-23 августа 2008 г./Ростов-на-Дону: ЗАО «Ростиздат». С. 73.

5. Тихонов ВВ., Демин В.В. Взаимодействие дождевых червей и их микробных ассоциантов с гуминовыми кислотами // Проблемы почвенной зоологии (Материалы XV Всероссийского совещания по почвенной зоологии) // Под ред. Б.Р. Стригановой. М.: Т-во научных изданий КМК 2008. С. 244 - 245.

6. Демин В.В., Тихонов В.В., Завгородняя Ю.А. Экологическая роль гуминовых кислот во взаимодействиях почвенных бактерий и дождевых червей // «Роль почвы в биосфере» Тр. Ин-та экологического почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова/ Под ред. Г.В. Добровольского и Г.СКуста -Вып. 9-М.: МАКС Пресс. 2009. С.207-227.

7. Семенов A.A., Тихонов В.В. Протекторные свойства гуминовых кислот // Тезисы докладов XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2009». секция почвоведение М.: МАКС Пресс. 2009. С. 127-128.

8. Демин ВВ., Тихонов В.В., Вызов Б.А. Модификация дождевыми червями структуры и биологической активности гуминовых кислот // Труды V Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере». В 2-х ч. Часть 1/ Под ред. Б.Ф. Апарина. - СПб.: Издательский дом С.-Петербургского государственного университета. 2010. - 476 с.

9. Тихонов В.В. Дождевые черви - преобразователи структуры и биологической активности гуминовых кислот // Тезисы докладов XVII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломсяосов-2010». секция почвоведение М.: МАКС Пресс. 2010 С. 107-108.

Ю.Тихонов ВВ., Вызов Б.А., Демин В.В. Влияние дождевых червей на структуру и биологическую активность гуминовых кислот // Республиканское научно-производственное унитарное предприятие "Диатех" // г. Минск. 2010. С. 46 - 52.

П.Тихонов В.В. Гуминовые кислоты и микроорганизмы: деградация, биологическая активность и эффекты сорбции // Тезисы Всероссийской научной конференции XIV Докучаевские молодежные чтения "Почвы в условиях природных и антропогенных стрессов"/ Под ред. Б.Ф. Апарина. - СПб.: Издательский дом С.-Петербургского государственного университета. 2011. С. 373 - 374.

12. Тихонов В.В. Участие червей Aporrectodea caliginosa и гуминовой кислоты в создании структуры почвы, изменении функциональных особенностей и физиологического состояния бактериального сообщества почв // Тезисы докладов XVIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2011», секция почвоведение М.: МАКС Пресс. 2011. С. 85-86.

Подписано в печать 13.09.2011 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1137 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тихонов, Владимир Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Гумусовые вещества.

1.1 Что такое гумусовые вещества.

1.2 Процесс гумификации, природа гумусовых веществ, их источники.

1.3 Разрушение гумусовых веществ.

1.4 Биологическая активность гуминовых кислот.

1.4.1 Участие ГВ в окислительно-восстановительных реакциях.

1.4.2 Биореакционная способность гумусовых веществ.

1.4.3 Гидрофильно-гидрофобные и электростатические взаимодействия вызываемые гумусовыми веществами.

1.4.4 Биологическая активность гуминовых кислот на микроорганизмы.

1-.5. Сорбция гуминовых кислот бактериями.

Дождевые черви - «экосистемные инженеры». Влияние на физико-химические параметры среды.

2.1 Влияние дождевых червей на физические свойства среды.

2.2 Влияние дождевых червей на химические свойства почв.

2.3 Влияние дождевых червей на микробный комплекс почв. Механизмы регуляции.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Почвы, компосты и вермикомпосты.

3.2 Черви.

3.3 Гуминовые кислоты.

3.4 Микроорганизмы.

3.5 Спектрофотометрия.

3.6 Спектрофотометрия гумусовых веществ.

3.7 Жидкостная хроматография.

3.8 Определение агрегатного состава почвы.

3.9 Получение пищеварительной жидкости Aporrectodea caliginosa.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1 Рост микроорганизмов на средах с ГКу в качестве единственного источника углерода.

4.2 Действие добавок ГКу на рост бактерий на среде Чапека.

4.2.1 Оптимальные концентрации гуминовой'кислоты, стимулирующие рост бактерий.

4.2.2 Изменение молекулярной массы гуминовой кислоты под действием бактерий при их росте на среде Чапека.

4.3 Оценка воздействия гумата натрия из препарата фирмы «Флексом» на рост углеводородокисляющей бактерии Acinetobacter baumannii из препарата «Дестройл»

4.4 Сорбция гуминовых кислот бактериями.

4.5 Протекторная роль гуминовых кислот на примерq Acinetobacter baumannii.

4.6 Участие дождевых червей в модификации гумусового вещества почвы.

4.6.1 Изменение молекулярной массы и концентрации гумусовых веществ в компостах

4.6.2 Оценка фактора ионов Са и биологического фактора в связывании гумусовых веществ

4.6.3 Содержание дождевых червей Aporrectodea caliginosa и Eisenia fétida на песке с добавлением гуминовой кислоты из торфа.

4.6.4 Влияние кишечной жидкости Aporrectodea caliginosa на гуминовую кислоту.

4.6.5 Влияние кишечной жидкости Aporrectodea caliginosa и бактерий, выделенных из нее на гуминовую кислоту.

4.6.6 Изменение содержания С и N в субстрате при вермикомпостировании.

4.6.7 Действие модифицированных гумусовых веществ на рост микроорганизмов.

4.6.8 Рост бактерий, выделенных из компоста и вермикомпоста, в присутствии исходной и модифицированных червями гуминовых кислот в жидкой культуре.

4.6.9 Рост бактерий из компоста на исходной и модифицированных червями гуминовых кислотах в качестве единственного источника углерода, возможность роста на экскретах червя.

4.6.10 Биологическая активность компостов и вермикомпостов, низкомолекулярные регуляторы роста.

4.6.11 Участие червей Aporrectodea caliginosa и гуминовой кислоты (ГКт) в создании структуры почвы и в изменении физиологического состояния бактериального сообщества почв, содержание азота и углерода.

ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1 Рост почвенных и ассоциированных с кишечником Aporrectoda caliginosa бактерий на средах с гуминовой кислотой, нахождение оптимальных концентраций гуминовых кислот для роста бактерий.

5.2 Изменение молекулярной массы гуминовой кислоты под действием олиго- и копиотрофов при их росте на среде с гуминовой кислотой из чернозема.

5.3 Возможность применения гуминовых кислот при интродукции ценных биотехнологических штаммов в среды на примере препарата «Дестройл».

5.4 Сорбция гуминовых кислот бактериями — перспективная область исследований.

5.5 Протекторная роль гуминовых кислот на поверхности клеток бактерий.

5.6 Участие червей Eisenia fétida в уменьшении молекулярной массы и концентрации гумусовых веществ в компостах при вермикомпостировании.

5.7 Факторы, влияющие на уменьшение концентрации и молекулярных масс гумусовых веществ при вермикомпостировании.

5.8 Влияние дождевых червей Aporrectodea caliginosa и Eisenia fétida на чистые препараты гуминовой кислоты из торфа.

5.9 Рост ассоциированных бактерий на гуминовой кислоте из белоподзолистой почвы и кишечной жидкости Aporrectodea caliginosa. Влияние бактерий и стерильной кишечной жидкости на разрушение данной гуминовой кислоты.

5.10 Влияние вермикомпостирования на содержания С и N в субстрате и растворе.

5.11 Рост Saccharomyces cerevisiae и Acinetobacter baumannii в присутствии исходной и модифицированных гуминовых кислот.

5.12 Действие исходных и модифицированных гумусовых веществ на рост микроорганизмовt из компоста и вермикомпоста. Гумусовые вещества — регуляторы микробных сообществ.

5.13 Рост бактерий из компоста на исходной, модифицированных червями гуминовых кислотах и экскретах червя в качестве единственного источника углерода, консервация труднодоступного углерода.

5.14 Биологическая активность компостов и вермикомпостов, низкомолекулярные регуляторы роста.

5.15 Влияние червей и гуминовой кислоты на агрегатный состав почвы.

5.16 Содержание углерода и азота во фракциях агрегатов.

5.17 Влияние внесенных гуминовой кислоты и червей на рост бактерий из микроксомов

5.18 Анализ роста функционального разнообразия бактерий в микропланшетном фотометре

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие дождевых червей и бактерий в модификации биологических и химических свойств гумусовых веществ"

Актуальность

Структура и состояние микробного ценоза почвы могут эффективно регулироваться беспозвоночными животными (Вызов, 2003; Тиунов, 2007), в частности, дождевыми червями. Масштабы трансформации среды могут быть весьма значительны. Черви за сезон способны переработать до 25% гумусово-аккумулятивного горизонта (Lee, 1985). В процессе прохождения почвы через кишечный тракт червя происходит разрушение органического вещества, протекают процессы гумификации (Фроуз и др., 2011). Червей рассматривают как «инженеров экосистем», создателей особых физических свойств субстрата (Persson, Lohm, 1977; Petersen, Luxton, 1982). Известно, что вермикомпосты более полезны для растений, нежели просто компосты (Norman et al., 2006). Считается, что черви в первую очередь улучшают физические свойства почв (Тиунов,. 2007), однако исследования биохимических изменений субстратов под действием червей остаются малоизученной областью.

Гумификация — второй по значимости процесс в биосфере после фотосинтеза (Перминова, 2008). Взаимодействуя- с живыми организмами, гумусовые вещества в малых количествах подавляют (Ansorg, 1978; Pascual et al., 2002; Loffredo et al., 2007; Steinberg et al., 2006) или стимулируют (Бирюков, 2006; Vallini et al., 1997; Gryndler, 2005) рост организмов. Они способны защищать живые клетки от токсического воздействия природных и антропогенных соединений (Бирюков, 2006; Fafa, Piccolo 2002; Vacca et al., 2002). С одной стороны, гумусовые вещества (ГВ) регулируют процессы питания и развития растений (Христева, 1951; Чуков, 2001; Попов, 2004), с другой, сами могут служить источником питания, в частности, для микроорганизмов (Кудрина, 1951; Теппер, 1972). Они трансформируются естественными микробными сообществами (Filip, Berthelin, 2001; Filip, Kubat, 2001). Молекулярная масса гуминовых кислот является одним из параметров, с которым коррелирует их биологическая активность (Vaughan,

Malcolm^ 1985; Nardi et al., 2002). Таким образом, ГВ могут входить в сложную систему взаимодействия между микроорганизмами и дождевыми червями, выполняя некоторую регуляторную роль в субстратах.

Цель

Выявление особенностей воздействия; дождевых червей и бактерий на свойства гумусовых веществ.

Задачи»

1. Установить оптимумы действия гуминовых кислот на рост бактерий разных таксономических групп.

2. Измерить уровень сорбции из раствора^ гуминовых кислот, различными бактериями и оценить их протекторную функцию при действии ядов.

3. Оценить роль червей в изменении: свойств; и биологической активности гуминовых кислот.

4. Определить действие модифицированных червями гуминовых кислот на рост бактерий.

Научная новизна

Бактерии, ассоциированные с пищеварительным трактом дождевых червей, способны расти на гуминовой кислоте как на единственном, источнике углерода: На 185 штаммах почвенных и кишечных бактерий показано отсутствие ингибирования их роста гуминовыми кислотами в концентрациях близких природным: (50 мкгС/мл), у 40 % протестированных бактерий обнаружена; стимуляция роста. Отработана методика: определения количества гуминовой кислоты,, сорбируемой из раствора бактериями. Количество сорбируемой гуминовой' кислоты варьирует для различных бактерий и составляет десятые доли проценты от сырой биомассы бактерий. При* пассаже гуминовых кислот через пищеварительный тракт дождевых червей происходит уменьшение молекулярной- массы ГВ. В присутствии червей молекулярная масса гумусовых веществ в субстратах падает, как в результате разрушения ГВ, так и в результате осаждения и образования новых высокомолекулярных фракций. Действие стерильной кишечной жидкости дождевых червей Aporrectodea caliginosa уменьшает молекулярную массу исходной ГК. Модифицированные червями гумусовые вещества изменяют скорость роста бактерий на различных субстратах. В компостах и вермикомпостах присутствуют низкомолекулярные биологически активные соединения, которые в концентрациях 0,15 — 0,2 мкгС/мл также могут влиять на рост отдельных штаммов.

Практическая значимость Работа расширяет возможности применения гуминовых препаратов. Гуминовые кислоты могут быть использованы при стимуляции роста бактерий с полезными для биотехнологии свойствами, например, деструкторов нефти и нефтепродуктов. Результаты исследований по сорбции гуминовых кислот бактериями могут быть применены при разработке регламентов и технологий по очистке водоемов от органических примесей. Материалы работы могут быть использованы в лекционных курсах и практических занятиях по биологии, экологии и почвенной зоологии, а также по зоомикробным взаимодействиям и химии гуминовых веществ как задачи для практических занятий.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Тихонов, Владимир Владимирович

выводы

1. Впервые показано, что бактерии из. кишечного тракта дождевых червей также как и почвенные способны расти на гуминовой кислоте как единственном источнике углерода.

2. На 185 штаммах почвенных и кишечных бактерий из разных таксонов показано отсутствие ингибирования роста гуминовыми кислотами в концентрациях близких природным (50 мкг С/мл), в 40 % случаев отмечали стимулирование роста бактерий.

3. В компостах и вермикомпостах присутствуют низкомолекулярные биологически активные соединения, которые в концентрациях 0,15 — 0,2 мкг С /мл также могут влиять на рост бактерий.

4. Бактерии способны сорбировать гуминовую кислоту с различной интенсивностью.' Отработана методика расчета количества сорбируемой гуминовой кислоты для бактерий: Сорбированные гуминовые кислоты снижают отрицательное влияние додецилсульфата натрия на рост бактерий.

5. В присутствии червей молекулярная масса гумусовых веществ в субстратах падает, как в результате осаждения и образования высокомолекулярных фракций гумусовых веществ, так и* их разрушения.

6. Кишечная жидкость червя Aporrectodea caliginosa уменьшает молекулярную массу гуминовой кислоты, происходит фракционирование исходной гуминовой кислоты: увеличивается доля высокомолекулярных и низкомолекулярных фракций.

7. Черви изменяют биологическую активность гумусовых веществ, что является фактором сукцессии бактерий при вермикомпостировании.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

Экспериментальные статьи в рецензируемых журналах:

1. Тихонов В.В., Якушев А.В;, Завгородняя Ю.А., Вызов Б.А., Демин В.В. Действие гуминовых кислот на рост бактерий // Действие гуминовых кислот на рост бактерий // Почвоведение. 2010: № 3. с. 333-341.

2. Тихонов В.В., Вызов Б.А., Завгородняя Ю.А., Демин В.В. Дождевые черви — преобразователи« структуры, и биологической, активности гуминовых веществ//Известия РАН. сер. биологическая. 20 П . № 1. с. 1-10.

Тезисы, труды конференций, сборники:

3. Тихонов В.В. Эффект воздействия; гуминовых кислот на рост микроорганизмов // Тезисы докладов XV международной конференции студентов, аспирантов и- молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2008», секция почвоведение М.: МАКС Пресс. 2008. С. 127-128.

4. Демин В В., Тихонов? В.В., Завгородняя Ю.А. Влияние гуминовых кислот на рост бактерий; различных экологических групп в почве // Материалы V Всероссийского съезда почвоведов им. В.В. Докучаева, 18 - 23 августа. 2008 ■т./Ростов-на-Дону: ЗА0ч<Ростиздат». С. 73.

5. Тихонов В.В., Демин В-В; Взаимодействие дождевых червей и их микробных, ассоциантов с гуминовыми, кислотами // Проблемы почвенной' зоологии (Материалы XV Всероссийского совещания по почвенной зоологии) // Под ред. Б.Р. Стригановой. М.: Т-во научных изданий КМК. 2008. С. 244-245.

6. Демин В.В;, Тихонов В.В., Завгородняя Ю.А. Экологическая роль гуминовых кислот во взаимодействиях почвенных бактерий и дождевых червей // «Роль почвы в биосфере» Тр. Ин-та экологического почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова/ Под ред. Г.В; Добровольского и Г.С Куста -Вып. 9 - М.: МАКС Пресс. 2009. С. 207 - 227

7. Семенов A.A., Тихонов В.В. Протекторные свойства гуминовых кислот // Тезисы докладов • XVI международной; конференции студентов; аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2009». секция почвоведение М.: МАКС Пресс. 2009. С. 127-128.

8. Демин В.В., Тихонов В.В., Вызов Б.А. Модификация дождевыми червями структуры, и биологической активности гуминовых кислот // Труды V Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере». В 2-х ч. Часть 1/ Под ред. Б.Ф. Апарина. - СПб.: Издательский дом С.-Петербургского государственного университета. 2010. — 476 с.

9. Тихонов В.В. Дождевые* черви — преобразователи структуры и биологической активности гуминовых кислот // Тезисы докладов XVII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2010». секция почвоведение М.: МАКС Пресс. 2010 С. 107-108.

Ю.Тихонов В.В., Бызов Б.А., Демин В.В. Влияние дождевых червей на структуру и биологическую активность гуминовых кислот // Республиканское научно-производственное унитарное предприятие "Диатех" //г.Минск. 2010. С. 46-52.

11. Тихонов В.В. Гуминовые кислоты и микроорганизмы: деградация, биологическая активность и эффекты сорбции //. Тезисы- Всероссийской научной конференции XIV Докучаевские молодежные чтения "Почвы в условиях природных и антропогенных стрессов"/ Под ред. Б.Ф. Апарина. -СПб.: Издательский дом С.-Петербургского государственного университета. 2011. С. 373-374.

12. Тихонов В.В. Участие червей Aporrectodea caliginosa и гуминовой кислоты в создании структуры почвы, изменении функциональных особенностей и физиологического состояния бактериального сообщества почв // Тезисы докладов XVIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2011», секция почвоведение М.: МАКС Пресс. 2011. С. 85 - 86.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Дождевые черви и микроорганизмы уменьшают молекулярную массу и концентрацию гумусовых веществ в субстратах. Измененные гумусовые вещества оказывают отличное от исходных ГВ влияние на микробное сообщество, как в целом, так и на отдельные его части, возможно, являясь молекулярными регуляторами сообщества. Стимулирующий эффект ГВ по отношению к бактериям зависит от концентрации и молекулярной массы полимера. Помимо гумусовых веществ в субстратах, населенных червями, присутствуют низкомолекулярные биологически активные вещества, действующие концентрации которых в сотни раз меньше аналогичных концентраций гумусовых веществ. В модификации молекулярных параметров гуминовых кислот играют роль как химически факторы, например, связывание кислот с кальцием, так и биологические. Кишечная жидкость червей разрушает гуминовую кислоту, в этом процессе, по-видимому, участвуют ферменты бактерий. Бактерии, выделенные из пищеварительной жидкости червя, как и почвенные бактерии способны расти на гуминовых кислотах. Выявлено, что бактерии сорбируют гуминовые кислоты с различной интенсивностью. Несмотря на то, что дождевые черви и бактерии способны разрушать ГК, беспозвоночные выделяют в среду различные экскреты, которые по механизму катаболитной репрессии, способны сохранять труднодоступные соединения, в частности, гумусовые вещества.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тихонов, Владимир Владимирович, Москва

1. Александрова И. В. О физиологической активности гумусовых веществ и продуктов метаболизма микроорганизмов // Органическое вещество целинных и освоенных почв. М.: Наука, 1972. С. 30 70.

2. Александрова JJ.H. Органическое вещество почвы и процессы его трансформации. М.: Наука, 1980. 288 с.

3. Аристовская Т.В. Микробиология процессов почвообразования- М.: Наука, 1977. 187 с.

4. Бирюков М.В. Биологическое действие гуминовых кислот и его пространственная локализация в почве // Автореф. дисс. . канд. биол. наук. 2006. 24 с.

5. Битюцкий Н.П., Соловьева А.Н., Лукина Е.И., Олейник A.C., Завгородняя Ю.А., Демин В.В., Вызов Б.А". Экскреты дождевых червей — стимулятор минерализации соединений азота в почве // Почвоведение. 2007. №4. С. 468-473.

6. БобыръМ.Ф. Влияние физиологически активных гумусовых веществ на фотосинтетические процессы у растений // Автореф. дисс. . канд. биол. наук. 1984. Кишинев. 24 с.

7. Вызов Б.А. Зоомикробные взаимодействия в почве. Автореф. дисс. . докт. биол. наук. М.: Изд-во Макс Пресс, 2003. 52 с.

8. Вызов Б.А. Зоомикробные взаимодействия в почве. М.: Геос, 2005. 212 с.

9. Вызов Б.А., Нечитайло Т.Ю., Бумаэ/скин Б.К., Кураков A.B., Голышин П.Н., Звягинцев Д.Г. Культивируемые микроорганизмы из пищеварительного тракта дождевых червей // Микробиология. 2009. Т. 78. №2. С. 1-10.

10. Вахмистров Д.Б., Зверкова O.A., -Дебец Е.Ю., Мишустина, Н.Е. Гуминовые кислоты: Связь между поверхностной активностью и стимуляцией роста растений // Докл. АН СССР. т. 293, 1989, 745 с.

11. Виноградский С.Н. Микробиология почвы. Проблемы и методы // М.: Изд-во АН СССР, 1952. 792 с.

12. Галактионов С.Г. Биологически активные // М.: Молодая гвардия, 1988.270 с.

13. Герасимов И.П. Современные представления о возрасте почв // Изв. АН СССР Сер.биол.1970. № 3. С. 28-37.

14. Гопышин П.Н. Экологическая роль растительных экссудатов во взаимодействии растений и микроорганизмов // Дисс. . канд. биол. наук. М.: МГУ, 1991. 160 с.

15. Горовая А.И. Роль физиологически активных гуминовых веществ в адаптации растений к действию ионизирующей радиации // Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993. С. 144 - 150:

16. Горовая А.И., Орлов Д.С., Щербенко О.В. Гуминовые вещества. Киев: Наукова думка, 1995. 304 с.

17. Гузев B.C., Вызов Б.А., Звгинцев Д.Г., Зваягинцев НД. Эффект задержки в регуляции микробного разложения полимеров в почве по типу катаболитной репрессии // Изв. АН СССР. сер. Биол. 1986. № 6. С. 834 -841.

18. Демин В.В., Терентъев В.А., Завгородняя Ю.А. Вероятный механизм действия гуминовых веществ на живые клетки // Гуминовые вещества в биосфере: Тр. II Международ, конф., Москва, 3-6 февраля 2003 г. М.: Изд-во Московского университета, 2004. С.37-41.

19. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970. 252 с.

20. Жигжитова И.А. Трансформация органических отходов методом вермикультуры и формирование биоудобрений // Автореф.дис. . канд. биол. наук. 1998. 18с.

21. Завгородняя Ю.А. Сравнительная характеристика гуминовых кислот и грибных меланинов // Дисс. . канд. биол. наук. М.: МГУ, 2000. 109 с.

22. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы М.: Из-во МГУ, 1987. 256 с.

23. Зражевский А.И. Дождевые черви как фактор плодородия лесных почв. Киев: Изд-во АН УСССР, 1957. 271 с.

24. Карпюк Л.А. Алкоксильные производные гуминовых веществ: синтез и сорбционные свойства // Дисс. .канд. биол. наук, 2008. 187 с.

25. Козловская Л. С. Роль почвенных беспозвоночных в трансформации органического вещества болотных почв. Л.: Наука, 1976. 211 с.

26. Комиссаров, ИД. , Логинов, Л. Ф. Химическая природа и молекулярное строение гуминовых кислот. В сб.: Химия гумусовых кислот: Их роль в природе и перспективы использования в народном хозяйстве: Тез. докл. зональной науч.-техн. конф. Тюмень, 1981, С.4

27. Кононова М.М. Органическое вещество почвы. М.: Изд-во АН СССР, 1963. 315 с.

28. Кононова М.М. Формирование гумуса в почве и его разложение // Успехи микробиологии Вып. 11., М.: Наука, 1976. С. 134-149

29. Кудрина Е.С. Влияние гуминовой кислоты на некоторые группы почвенных микроорганизмови ее значение для этих микроорганизмов-как источника питательных веществ // Тр. Почв, института им. В.В. Докучаева. М., 1951. т. 38. С. 185-254.

30. Курчева Г.Ф. Роль почвенных животных в разложении и гумификации растительных остатков. М.: Наука, 1971. 155 с.

31. Лазарев Н.М. Типы биоорганоминеральных систем различных почв Тр.Всесоюз. науч.-исслед. Института с-х микробиологии, 1949. С 23 -45.

32. Мальцева Н.Н., Годиепко С.А., Изэ/сеурова В.В. Использование гуминовых кислот олигонитрофильными микроорганизмами. // Почвоведение. 1974. №12. С. 1-7.

33. Марфенина О.Е., Ищенко ИА. Избирательность дождевых червей по отношению к почвенным микроскопическим грибам // Известия РАН. Сер. биологическая. 1997. № 4. С. 504-506.

34. Мишустин Е.Н., Никитин Д.И. Микроорганизмы, разлагающие гуминовую кислоту почвы- В- кн.: Доклад сов. Почвоведов к 7 Междунар. Конгр. Почвоведов в США, 1960. С. 45 56.

35. Мозговая КН. Судьба энтомопатогенных бацилл в почве. Автортеф. дисс. . канд. биол. наук. М.: Изд-во!МГУ, 2001. 24 с.

36. Наумова, Г.В., Райцина, Г.И., Лях, В.В. Биологическое действие торфяных гидролизатов на дрожжи. , В кн.: Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения: Тр. ДСХИ. Днепропетровск, 1983.

37. Непомнящая Я. Н. Филогенетеческое разнообразие микроорганизмов в термофильных железовосстанавливающих сообществах. // Автореф.дис. . канд. биол: наук. 2010. 24с.

38. Никитин Д.И. Разложение почвенных гуминовых кислот микроорганизмами // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1960. № 4. С. 618-625.

39. Никитинский Я.О. О разложении гуминовой кислоты в связи с усвоением ее элементов, высшими растениями // Изв. Моск. с-х ин-та. 1902. т. 8. С. 13-23.

40. Новогрудский Д.М. Почвенный гумус и микробиологические факторы его образования. Изд-во КазССР, 1959. 95с.

41. Овчинникова, Т.Ф. Влияние гидрогумата — гуминового препарата из торфа на пролиферативную активность и метаболизм дрожжевых микроорганизмов // Биологические науки. 1991. т. 10. С. 87 90.

42. Олейник А.С., Битюцкий Н.П., Вызов Б.А. Влияние экскретов дождевых червей Aporrectodea caliginosa на дыхание и нитрификацию в почве //

43. Мат-лы межд. конф. «Экология и биология почв». Ростов, 2005. С. 367-371.

44. Олейник A.C., Вызов Б. А. Реакция бактерий на воздействие поверхностных экскретов дождевых червей // Микробиология. 2008. Т. 77. № 6. С. 854—862.

45. Орлов Д. С. Гумусовые кислоты почв М.: Изд-во МГУ, 1974. 334 с.

46. Орлов Д. С. Свойства и функции гуминовых веществ // Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993. С. 16-27.

47. Орлов Д. С., Гришина Л. А. Практикум по химии гумуса // М.: Изд-во Моск. ун-та. 1981. 272 с.

48. Орлов Д. С. Гуминовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.: МГУ, 1990. 325 с. •

49. Орлов Д. С. Химия почв М.: Изд-во МГУ, 1992. 400 с.

50. Остроумов С.А. Биологический механизм самоочищения в природных водоемах и водотоках: теория и приложения // Успехи современной биологии. 2004. т.124. №5. С.429-442.

51. Паников Н.С., Горбенко А.Ю., Звягинцев Д.Г. Количественная оценка влияния мезофауны на скорость. разложения растительного опада // Вестн. МГУ. Сер. 17 Почвоведение. 1985. № 3. С. 37-45

52. Перминова И.В. Гуминовые вещества вызов химикам 21 века //Химия и жизнь. 2008. №1. С.50-56. '

53. Перт Дж. С. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.:Изд-во Мир, 1978. 331 с.

54. Понтович В.Э. Разложение гуминовых веществ микроорганизмами // Микробиология.1938. т.7. вып.6.С.696-707.

55. Попов А.И. Гуминовые вещества: свойства, строение, образование. СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2004. 248 с.

56. Постникова М.А. Использование гуминовых кислот почвенными бактериями// Автореф. . канд. биол. наук. 2007. 28 с.

57. РабекЯ. Экспериментальные методы в химии полимеров // М.: Изд-во Мир. 1983. 480 с.

58. Семенов A.A. Влияние гуминовых кислот на устойчивость растений и микроорганизмов к воздействию тяжелых металлов // Автореф. . канд. биол. наук. 2009. 24 с.

59. Стриганова Б.Р. Питание почвенных сапрофагов. М.: Наука, 1980. 244 с.

60. Стриганова Б.Р., Пантош Т.Д., Мазанцева Г.П., Тиунов A.B. Влияние дождевых червей на биологическую азотфиксацию в почве // Известия АН СССР Сер. биология. 1988. № 6. С. 878 884.

61. Теппер Е.З. Микроорганизмы рода-Nocardia и разложение гумуса // М., 1976. 199 с.

62. Тиунов A.B. Влияние дождевых червей Nicodrilus caliginosus на нитрификацию в дерново-подзолистых почвах // Деструкция органического вещества в почве. Вильнюс, 1989. С. 172—176.

63. Тиунов A.B. Метабиоз в почвенной системе: влияние дождевых червей на структуру и функционирование почвенной биоты // Дисс. . докт. биол. наук. М.: Институт проблем экологии и эволюции РАН, 2007. 284 с.

64. Третьякова Е.Б., Добровольская Т.Г., Вызов Б.А., Звягинцев Д.Г. Сообщества бактерий, ассоциированные с почвенными беспозвоночными // Микробиология. 1996. Т.65. № 1.С.102-110.

65. Уголев A.M. Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций. Л.: Наука, 1985. 544 с.

66. Умаров М.М., Стриганова Б.Р., Костина Н.В. Особенности трансформации азота в кишечнике и копролитах дождевых червей // Известия РАН. Сер. биологическая. 2008. № 6. С. 746-756.

67. Фляйг В. О влинии гумусовых веществ на обмен веществ растений. Л., 1963.

68. Фроуз И., Ли К, Бруне А., Пизл В., Абакумов Е.В. Влияние почвенных беспозвоночных на формирование гумусовых веществ путемрадикальной полимеризации фенолов и белков в лабораторных условиях // Почвоведение. В печати. 2011

69. Харин CA. Микроскопические грибы в местообитаниях, ассоциированных с дождевыми червями // Дисс. . канд. биол. наук. М.: МГУ, 2009. 129 с.

70. Хомяков Н.В, Харин С.А., Нечитайло Т.Ю., Голышин П.Н., Кураков A.B., Вызов Б.А., Звягинцев Д.Г. Реакция микроорганизмов на воздействие пищеварительной жидкости дождевых червей // Микробиология. 2007. Т. 76. № 1. С. 45-54.

71. Христева JI.A. Роль гуминовой кислоты в питании высших растений и гуминовые удобрения // Тр. Почв, института им. В.В. Докучаева. М., 1951. т. 38. С.108-184.

72. Чуков С.Н. Структурно-функциональные параметры органического вещества почв в условиях антропогенного воздействия // СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2001. 216 с.

73. Anderson J. Ecology of microbial communities. M. Fletcher (ed.), Cambridge University Press, 1992. P.125-133

74. Ansorg R., Rochus W. Studies on the antimicrobial effect of natural and synthetic humic acids // Arzneimittel-Forschung/Drug Research. 1978. V. 28 (12) P. 2195-2199.

75. Arancon N., Edwards C., Lee S., Byrne R. Effects of humic acids from vermicomposts on plant growth// European Journal of Soil Biology. 2006. V. 42. P. 65-69.

76. Arillo A., Melodia F. Nitrite oxidation in Eisenia foetida (Savigny): Ecological implications // Functional1 Ecology. 1991. V. 5. P. 629-634'.

77. Barois /., Villemin G., Lavelle P., Toutain F. Transformation of soil structure through Pontoscolex corethrurus (Oligochaeta) intestinal tract // Geoderma. 1993. V. 56. P. 57-66.

78. Binet F., Fayolle L., Pussard M. Significance of earthworms in stimulating soil microbial activity // Biology and Fertility of Soils. 1998. V. 27. P 79-84.

79. Bohlen P. J., Parmelee R. W., Allen M.F., Ketterings Q.M. Differential, effects of earthworms on nitrogen cycling from various nitrogen-15labelled substrates // Soil Sci. Soc. Amer. J. 1999. V. 63. P. 882-890.

80. Bolton P. J., Phillipson J. Burrowing, feeding, egestion and energy budgets of Allolobophora rosea (Savigny) // Oecologia. 1976. V 23. P. 225-245.

81. Bouche M.B. Action de la faune du sol sur les états de la matiere organique dans les ecosystems // Humifîcation et biodégradation Eds. G. Kilbertus et al. Pierron , 1975. P: 157-168.

82. Brown G.G., Barois /., Lavelle P. Regulation of soil organic matter dynamics and microbial activity in the drilosphere and the role of interactions with other edaphic functional domains // European Journal of Soil Biology. 2000. V. 36. P. 177-198.

83. Brussaard Z.Soil fauna, guilds, functional groups and ecosystem processes // Applied Soil Ecology. 1998.V. 9. P.123-135.

84. Byzov B.A., Chernjakovskaya T.F., Zenova G.M., Dobrovolskaya T.G. Bacterial communities associated with soil diplopods // Pedobiologia. 1996. V. 40. P. 67-79.

85. Chefetz B., Chen Y., Hadar Y. Purification and characterization of laccase from Ghaetomium thermophilium and its role in humification // Appl Environ Microbiol. 1998. V. 64(6). P.3175 3179.

86. Cooke A. The effects of fungi on food selection by Lumbricus terrestris L. Earthworm Ecology Eds J.E. Satchell. London: Chapman and Hall, 1983. P. 365-373.

87. Cortez J., Hameed R., Bouché M.B. C and N transfer in soil with or without earthworms fed with 14C- and 15N-labelled wheat straw // Soil Biology and Biochemistry. 1989. V 21. P. 491-497.

88. Darwin C. The formation of vegetable mould through the action of worms with observations of their habits. Murray, London, 1881, 298 p.

89. Dash M.C., Mishra P.C., Behera N. Fungal feeding by a tropical earthworm // Trop. Ecol. 1979. V. 20. P. 9-12.

90. Dash N.K., Behera N., Dash M.C. Gut load, transit time, gut microflora and turnover of soil, plant and fungal material, by some tropical earthworms // Pedobiologia. 1986. V. 29. P. 13-20.

91. Dexter A.R. Tunnelling in soil by earthworm // Soil Biology and Biochemistry. 1978. V 10. P. 447-449.

92. Edwards C.A., Fletcher K.E. Interactions between earthworms and microorganisms in organic matter breakdown // Agriculture, Ecosystem and Environment. 1988. V. 24. N. 1-3. P. 235-247.

93. Edwards C.A., Lofty J.R. Biology of Earthworms. London: Chapman & Hall, 1977.214 p.

94. Ehlers W. Observations on earthworm channels and infiltration on tilled and unfilled loess soil // Soil Sci. 1975. V. 8. P. 242-249.

95. Esparza-Soto M., WesterhoffP. Biosorption of humic and fulvic acids to live activated sludge biomass // Water Res. 2003. V. 37. P.2301-2310.

96. Fafa F., Piccolo A. Effects of humic substances on the bioavailability and aerobic biodegradation of polychlorinated biphenyls in a model soil // Biotechnology and Bioengineering. 2002. V. 77(2), P. 204-211.

97. Fein J., Boily J., Glüclu K, Kaulbach E. Experimental study of humic acid adsorption onto bacteria and Al-oxide mineral surfaces // Chem. Geol.l999.V.162. P. 33^15.

98. Ferrara G., Loffredo E., Senes i N. Aquatic humic substances inhibit clastogenic events in germinating seeds of herbaceous plants // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2001. V. 49 (3). P. 1652-1657.

99. Filip Z., Berthelin, J. Analytical determination of the microbial utilization and transformation of humic acids extracted from municipal refuse // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 200l.V. 371 (5). P. 675-681.

100. Filip Z., Claus H., Dippell G. Degradation of humic substances by soil microorganisms // Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 1998.V.161 (6). P. 45-63.

101. Filip Z., Kubat J. Microbial utilization and transformation of humic substances extracted from soils of long-term^ field experiments // European Journal of Soil Biology. 2001. V. 37. P. 167-174.

102. Frost P., Maurice P., Fein J. The effect of cadmium on fulvic acid adsorption to Bacillus subtilis // Chem. Geol. 2003. V. 200. P. 217-224.

103. Gramss G., Ziegenhagen D., Sorge S. Degradation of soil humic extract by wood- and soil-associated fungi, bacteria, and commercial enzymes //Microbial Ecology. 1999. V. 37 P.l 13-119.

104. Hanlon R.D.G., Anderson J.M. Influence of macroarthropod feeding activities on microflora in decomposing oàk leaves // Soil Biol; Biochem. 1980. № 12. P. 255-261.

105. Hartenstein R. Assimilation by the earthworm Eisenia foetidà // Earthworm Ecology from Darwin to Vermiculture, J.E. Satchell, (Ed.). London, New-York, 1983. P. 297-308.

106. Hassett D.J., Bisesi M.S., Hartenstein R. Earthworm peroxidase:: distribution, microbicidal action andmolecular weight // Soil Biol; Biochem. 1988. V.20.P. 887-890.

107. Hofrichter M., Ziegenhagen D., Sorge S., Ullric R., Bublitz F., Fritsche W. Degradation of lignite (low-rank coal) by ligninolytic basidiomycetes and their manganese " peroxidase- system- // Microbiology and Biotechnology. 1999.V.52 (1). P.78 84. .

108. Hrselovâ H., Soufcupovâ L., Gryndler M. Humic acid-like material from sewage sludge stimulates culture growth of ectomycorrhizal fungi in vitro // Folia Microbiol (Praha).2007.V,52(6>P627-630.

109. Imai A., Fukushima. T., Matsushige R. Effects of Aquatic:Humic Substances on the Growth of the Cyanobacterium Microcystis aeruginosa (a toxic algae) // Japan Soc. on Water Environment. 1999. V 22(7). P.555-560.

110. Kontchou. C.Y., Blondeau R. Biodégradation of soil humic acids by Streptomyces viridosporus // Canadian Journal of Microbiology . 1992: V. 38 (3). P.129-132.

111. Kretzschmar A. Burrowing ability of the earthworm Aporrectodea longa limited by soil compaction and water potential // Biology and Fertility of Soils. 1991. V 11. P. 48-51.

112. Lattaud C., Locati S., Moira P., Rouland C., Lavelle P. The diversity of digestive systems in tropical geophagous earthworms // Appl. Soil Ecol. 1998. V. 9. № 1-3. P. 193-199.

113. Lavelle P. Earthworm activities and the soil system // Biology and Fertility of Soils. 1988. V. 6. P. 237-251.

114. Lavelle P., Spain A. V. Soil Ecology. Dordrecht, Kluwer Academic Publishers, 2001. 654 p.

115. Laverack M. The Physiology of Earthworms, Oxford: Pergamon press, 1963.206 p.

116. Lee K.E. Earthworms. Their ecology and relationships with soils and land use. London: Acad, press, 1985. P. 211-221.

117. Lee K.E., Pankhurst C.E. Soil organisms and sustainable productivity // Austr. J. Soil Res. 1992. V. 30. P. 855-892.

118. Loffredo E., Berloco M., Casulli F., Senesi N. In vitro assessment of the inhibition of humic substances on the growth of two strains of Fusarium oxysporum II Biology and Fertility of Soils. 2007. V. 43 P. 759-769.

119. Loquet M., Bhatnagar N., Bouche M.B., Rouelle J. Essai d'estimation de 1'influence ecologique des lombriciens sur les microorganismses // Pedobiologia. 1977. V. 17. P. 400-417.

120. Luu Y, Ramsay B., Ramsay J. Nitrilotriacetate Stimulation of Anaerobic Fe(III) Respiration by Mobilization of Humic Materials in Soil // Appl. and Environ. Microbiol. 2003. V. 69 (9). P. 5255-5262.

121. Macfadyen A. The contribution of the microfauna to total soil metabolisms. Amsterdam, Deiksen J. (ed.), 1963, P. 3-17.j

122. Marhan S., Langel R., Kandeler E., Scheu S. Use of stable isotopes (C-13) for studying the mobilisation of old soil organic carbon by endogeic earthworms (Lumbricidae) // European Journal of Soil Biology. 2007. V. 43. P. 201-208.

123. Marinissen J.C.Y., Dexter A.R. Mechanisms of stabilization of earthworm casts and artificial casts // Biol. Fertil. Soils. 1990. № 9. P. 163-167.

124. Martin A., Mariotti A., Balesdent J., Lavelle P. Soil* organic matter assimilation by a geophagous tropical earthworm based on delta-13C measurements // Ecology. 1992 V. 73. P.l 18-128.

125. Martin N.A. The interaction' between organic matter in soil and the burrowing activity of three species of earthworms (Oligochaeta: Lumbricidae) // Pedobiologia. 1982. V 24. P. 185-190.

126. Mishra B., Srivastava L.L. Degradation of humic acid of a forest soil by some fungal isolates // Plant and Soil.l986.V. 96(3).P.413 416.

127. Moody S.A., Piearce, T.G., Dighton J. Fate of some fungal spores associated with wheat straw decomposition on passage through the guts of Lumbricus terrestris and Aporrectodea longa // Soil Biol. Biochem. 1996. V. 28. P. 533-537.

128. Mora P., Miambi E., Jimenez J., Decaens T., Rouland C. Functional complement of biogenic structures produced by earthworms, termites and ants in the neotropical savannas // Soil Biology and Biochemistry. 2005. V. 37. P. 1043-1048.

129. Moura M., Martin M., Burguillo F. A comparative study of the adsorption of humic acid, fulvic acid and phenol onto Bacillus subtilis and activated sludge // Journal of Hazardous Materials. 2007. V. 149. P. 42^8.

130. Muscolo A., Bovalo F.,Gionfriddo F., Nardi S. Earthworm humic matter produces auxin-like effects on Daucus carota cell growth and nitrate metabolism//Soil Biol. Biochem. 1999. V.31,№9.P. 1303-1311.

131. Naidu Y., Meon J. Kadir Y. Microbial starter for the enhancement of biological activity of compost tea // Int. J. Agrie. Biol.2010. V 12. P.51-56.

132. Nardi S., Concheri G., Dell Agnola G. Biological activity of humic substances. Humic Substances in Terrestrial Ecosystems // Ed. A. Piccolo / Amsterdam, 1996. P1361 -406.

133. Nardi S., Concheri G., Dell'Angola G., Scrimin P. Nitrate uptake and' ATPase activity in- oat seedlings in the presence of two humic fractions// Soil Biol. Biochem: 1991. V. 68; P. 1527-1536.

134. Nardi S., Panuccio M. R., Abenavoli M.R., Musscolo A. Auxin-like effect of humic substances extracted from-feaces of Allolobophom caliginosa and A. rosea II Soil Biol. Biochem. 1994. Vol. 26 P. 1341-1346.

135. Nardi S.,.Pizzeghello D., Musscolo A., Vianello A. Physiological effects of humic substances on higher plants: review // Soil Biol. Biochem. 2002. V. 34. № 11. P. 1527-1536.

136. Neuhauser E., Hartenstein R. Reactivity of macroinvertebrate peroxidases with lignins model compounds // Soil, Biol. Biochem. 1978. V. 10. P. 341342.

137. Nozaki M., Miura C., Tozawa Y., Miura T. The contribution of endogenous cellulase to the cellulose digestion in-the gut of earthworm // Soil Biologi & Biochemistry. 2009. V. 49. P. 762-769.

138. Oliver M., Juárez M., Jordá «/., Sánchez-Andreu J. Bioprotector effect of commercial humic substances against saline stress in tomato plants cv. Durinta and cv. Jaguar // Agrochimica. 2007. V.51. P. 105-113.

139. Parkin T.B., Berry E.C. Nitrogen transformation associated with earthworm casts // Soil Biol. Biochem. 1994. V. 26. P. 1233-1238.

140. Parle J.N. A microbial study of earthworms casts // J. Gen. Microbiol. 1963. V. 31. P. 13-22.

141. Pascual J., Garcia C., Hernandez T., Lerma S., Lynch J. Effectiveness of municipal waste compost and its humic fraction in suppressing Pythium ultimum II Microbial Ecology. 2002. V.44 (1). P. 59-68.

142. Persson T., Lohm U. Energetical significance of the annelids and arthropods in a Swedish grassland soil. Ecological Bulletin (Stockholm), 1977. V.23. P.1-211.

143. Petersen H., Luxton M.A. A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos, 1982.V. 39: P.287-388.

144. Piccolo A., Nardi S., Conchieri G. Structural characteristics of humic substances as related to nitrate uptake and growth regulation implant system // Soil Biol.Biochem. 1992.V.24.P. 273 380.

145. Piearce T.G. Gut contents of some Lumbricid earthworms // Pedobiologia. 1978. V. 18. P. 153-157.

146. Rerabek J. The relation of humic acids to the inhibition of plant straight growth//Naturwissenschaften , 1963. p. 50.

147. Saavedra, M, Benitez, E., Cifuentes, C. Nogales, R. Enzyme activities and chemical changes in wet olive cake after treatment with Pleurotus ostreatus or Eisenia fetida //Biodegradation.2006 V 17(1). P 315 331.

148. Satchell J. Earthworm microbiology // Earthworm ecology from Darwin to vermiculture. London: Chapman and Hall, 1983. P. 351-364.

149. Satchell J. Lumbricidae // Soil Biology Eds A. Bürge, F. Raw. London: Academic Press, 1963. P. 259-322.

150. Satchell J.E., Lowe D.G. Selection of leaf litter by Lumbricus terrestris // Progress in soil biology Eds Graff O., Satchell J.E. Amsterdam, 1967. P. 102-119.

151. Scheel T., Holker U., Ludwig S., Hofer M. Evidence for and expression of a laccase gene in three basidiomycetes degrading humic acids // Microbiology and Biotechnology .1999. V. 52. P. 190 -210.

152. Scheu S. Cellulose and lignin decomposition in soils from different ecosystems on limestone as affected by earthworm processing // Pedobiologia. 1993. V.37. P. 167-177.

153. Scheu S. Mucus excretion and carbon turnover of endogeic earthworms I I Biology and Fertility of Soils. 1991. V.12. P. 217-220.

154. Scheu S. The influence of earthworms (Lumbricidae) on the nitrogen dynamics in the soil litter system of a deciduous forest // Oecologia. 1987. V. 72. P. 197-201.

155. Scheu iS., Theenhaus A., Jones T.H. Links between the detritivore and the herbivore system: effects of earthworms and collembola on plant growth and aphid development // Oecologia. 1999. V. 119. P. 541-551.

156. Sellamuthu K., Govindaswamy M. Effect of fertiliser and humic. acid on rhizosphere microorganisms and soil enzymes at an early stage of sugarcane growth // Sugar Tech. 2003 V. 5(4). P. 273-277.

157. Semenov A.M. Physiological' bases of oligotrophy of microorganisms and concept of microbial community // Microbial Ecology. 1991. V 22. P. 239247.

158. Shan J., Brune A., Ji R. Selective digestion of the proteinaceous component of humic substances by the geophagous earthworms Metaphire guillelmi and Amynthas corrugatus // Soil Biology and Biochemistry. 2010. V. 42. P. 1455-1462.

159. Simek M., Pizl V., Chalupsky J. The effect of some terrestrial oligochaeta on nitrogenase activity in the soil // Plant Soil. 1991. V. 137. P. 161-165.

160. Slesak E., Kowaliszyn E. The effect of potassium humate on the redox activity of the plant cell plasmalemma// The role of humic substanses in theiLecosystem and in envariomental protection/ Trans. 8 Meeting of IHSS. Wroclav, Poland 1996 P.290

161. Tiunov A., Sheu S. Carbon availability controls the growth of detritivores (Lumbricidae) and their effect on nitrogen mineralization //Oecologia. 2004. V.138.P. 83-90.

162. Tracey M.V. Cellulase and chitinase of earthworms // Nature. 1951. V.176. P. 776-777.

163. Trigo D., Barois I., Garvin M.H., Huerta E., Irisson S., Lavelle P. Mutualism between earthworms and soil microflora' // Pedobiologia. 1999. V. 43. P. 866-873.

164. Trigo D., Lavelle P. Changes in respiration rate and some physicochemical properties of soil during gut transit through- Allolobophora molleri (Lumbricidae, Oligochaeta) // Biology and Fertility of Soils. 1993. V. 15. N 3.P. 185-188.

165. Vacca D., Bleam W., Hikey W. Isolation of soil bacteria adapted to degrade humic acid-sorbed phenanthrene // Applied and Environmental Microbiology. 2005. V.71 (7). P. 3797-3805.

166. Vallini G., Pera A., Avio L., Valdrighi M., Giovannetti M. Influence of humic acids on laurel growth, associated rhizospheric microorganisms, and mycorrhizal fungi // Biol.Fertil.Soils.1993. V.16. P 1-^4.

167. Vallini G., Pera A. Agnolucci M. Valdrighi M. Humic acids stimulate growth and activity of in vitro tested axenic cultures of soil autotrophic nitrifying bacteria // Biology and Fertility of Soils. 1997. V.24 (3). P. 243248.

168. Vaughan D., MacDonald R. E. Some effects of humic substances on growth and physiological process // Soil Organic Matter and Biological Activity/ Eds D. Vaughan, R. E. Malcolm. Dortrecht, 1976. P. 3-35.

169. Vaughan D., Malcolm R.E. Influence of humic substances on biochemical processes // Soil Organic Matter and Biological Activity. Boston: Dortrecht, 1985. P. 37-75.

170. Vinceslas-Akpa M., Loquet M. Organic matter transformations in lignocellulosic waste products composted or vermicomposted (eisenia fetida andrei): Chemical analysis and 13C CPMAS NMR spectroscopy // Soil Biol. Biochem. 1997. V. 29. P. 751-758.

171. Visser S.A. Effects Of Humic Substances On Plant Growth: In: Humic Substances Effect On Soil And Plants. Italy, Reda, 1986. P 89 135.

172. Visser S.A. Physiological action of humic substances on microbial cells // Soil Biol Biochem. 1985 V. 17. P:457-462.

173. Visser, S.A. Effect of humic substances on mitochondrial respiration and oxidative phosphorylation // Sci. Total Environment. 1987.V.62.P.347 354.

174. Wardle D.A. Communities and ecosystems: linking the aboveground and belowground components. Princeton, Princeton University Press, 2002.3921. P

175. Wellington E., Herron P., Cresswell N. Gene transfer in terrestial environments and the survival of bacterial inoculants in soil // Monitoring genetically manipulated microorganisms in the environment, C.A. Edwards (ed.). 1993. P. 137-170.

176. Whiston R.A., Seal K.J. The occurrence of cellulases in the earthworm Eisenia foetida // Biol. Wastes. 1988. V. 25. № 3. P. 239-242.

177. Wightman P., Fein J. Ternary interactions in a humic acid-Cd-bacteria system // Chem. Geol. 2001. V. 180. P. 55-65.

178. Willems J.J.G.M., Marinissen J.C.Y., Blair J. Effects of earthworms on nitrogen mineralization // Biol. Fertil. Soils. 1996. V. 23. № 1. P. 57-63.

179. Wunderwald U., Kreisel G., Braun M., Schulz M., Jäger C., Hofrichter M. Formation and degradation of a synthetic humic acid derived from 3-fluorocatechol // Microbiology and Biotechnology. 2000.V. 53. P. 129-133.

180. Zavarzina, A.G., Leontievsky, A.A., Golovleva, L.A., Trofimov, S.Ya. Biotransformation of soil humic acids by blue laccase of Panus tigrinus 8/18:An in vitro study// Soil Biology and Biochemistry.2004. V.36. P. 239243.

181. Zavgorodnyaya Yu.A., Demin V.V., Kurakov A.V. Biochemical degradation of soil humic acids and fungal melanins // Organic Geochemistry. 2002. V.33. P. 347-355.

182. БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает благодарность Добровольской Т.Г., Завгородней Ю.А., Лопатиной A.B., Якушеву A.B., Федию B.C. и Орлову Д.С. за помощь в проведении анализов и обсуждении результатов.