Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние вермипрепаратов на различные тест-объекты

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Влияние вермипрепаратов на различные тест-объекты"

На правах рукописи Быбнн Виктор Александрович

ВЛИЯНИЕ ВЕРМИПРЕПАРАТОВ НА РАЗЛИЧНЫЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТЫ

03.02.08 - экология (биологические науки)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 МАЙ 2012

Иркутск-2012

005016640

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет):

ФГБОУ ВПО НИ «Иркутский государственный технический университет».

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

Стом Дэвард Иосифович

Официальные оппоненты: Данчинова Галина Анатольевна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗС РЧ СО РАМН

Хуснидинов Шарифзян Кадырович доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Иркутская государственная сельскохозяйственная академия

Ведущая организация Красноярский государственный

аграрный университет

Защита состоится 24 мая 2012 г. в 16:00 на заседании диссертационного со» Д 212.074.07 при Иркутском государственном университете на биолого-почвенн факультете Иркутского государственного университета.

Почтовый адрес: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, биолого-почвенн

факультет ФГБОУ ВПО «ИГУ».

Телефон/факс: (3952)241855, e-mail: dissovet07@gmail.com. godolin@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИГУ по адресу: 664003, г. Иркутск, бул. Гагарина, 24.

Автореферат разослан «22» апреля 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета К.6.Н., доцент

4f

А.А. Приставка

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Сегодня во всем мире наблюдается бум по созданию, патентованию и выпуску новых лекарственных средств повышенной эффективности го дождевых червей (ДЧ) (патенты №: РФ - 2412593, 2359685, 2180574, 2177784, США - 20100074962; 5,128,148; 5,024,844; КНР - 200910157894 и многие другие; Chu et al, 2007; Cooper, 2010). Интерес к вермипрепаратам (ВП) обусловлен их противоопухолевой, антибактериальной, антиоксидангаой, иммуногенной, а также рядом других активностей (Sun, 2003; Lee et al, 2007; Im et al, 2009; Sinha, 2010). Иммунная и ферментативная системы ДЧ подвергаются значительным флюктуациям под действием биотических и абиотических факторов (Komiyama et al., 2003; Wang et al, 2004). Это приводит к изменению антимикробных свойств ДЧ, увеличению активности их ферментов, играющих важную роль в проявлении препаратами фармацевтических свойств. В связи с тем, что для производства ВП используется живое сырье, количество и качество биологически активных агентов, входящих в их состав, зависят от различных условий, в частности, от исходного физиологического состояния ДЧ, кормовых субстратов, используемых для выращивания червей. Исходя из вышесказанного, можно было ожидать получения более эффективных препаратов из ДЧ, подвергнутых определённым активирующим воздействиям. Поэтому столь актуальным представляется изучение действия различных факторов биотической и абиотической природы на ДЧ. Для обеспечения поиска процедур, приводящих к повышению активности ВП, крайне важно иметь простые и дешевые методы экспрессной оценки их активности. Наличие таких методов позволило бы преодолеть основной момент, сдерживающий применение в официальной медицине самых различных комплексных многокомпонентных животных и растительных препаратов, - трудности при дозировке их активного начала. Эти приемы могут быть также использованы для контроля условий производства, хранения и эффективного применения ВП. К сожалению, на сегодня подобных способов очень мало (Яшин и др., 2004; Тимофеев и др., 2005; Стом, 2008). Недостатками существующих методов оценки активности ВП являются длительность получения ответа, дороговизна, потребность в соответственно оборудованных лабораториях.

Цель работы: изучение взаимовлияния дождевых червей и некоторых групп микроорганизмов, а также действия вермипрепаратов на различные тест объекты.

Задачи работы:

1) изучить возможность сохранения представителей ряда групп микроорганизмов в кишечнике ДЧ;

2) исследовать влияние инокуляции культурой Saccharomyces cerevisiae препаратом «Бифидумбакгерин» на численность гетеротрофных бактерий, в тх числе бактерий группы кишечной палочки (БГКП), в кишечнике ДЧ;

3) изучить влияние Trichoderma viride на ДЧ;

4) проанализировать действие ряда биотических и абиотических факторов иммунные свойства ДЧ;

5) разработать приемы повышения активности ВП и снижения бактериальн обсемененности вермисырья;

6) проанализировать влияние ВП на тест-организмы из различных систематическ групп и предложить экспрессные, технически простые методы оценки активное ВП.

Защищаемые положения:

1. Антимикробные свойства целомической жидкости ДЧ и получаемых из них I усиливаются под действием некоторых биотических (инокуляции ДЧ отдельны] штаммами микроорганизмов) и абиотических (охлаждение, нагревание) факторов.

2. При контаминации (инъекции per os, свободном скармливании) некотор: штаммы бактерий, дрожжей, микроскопических грибов могут шпродуцироватьа аутомикрофлору кишечника ДЧ.

3. ВП оказывают преимущественно негативное влияние на физиологическ процессы и выживаемость беспозвоночных животных, водорослей, высших вода: и наземных растений.

4. Пероральная инъекция ДЧ определенными концентрациями перекиси водоро, эфирных масел и отварами лекарственных трав, а также инокуляция препарат «Бифидумбакгерин» и культурой пекарских дрожжей S. cerevisiae значитель снижает количество гетеротрофных бактерий, в том числе БКГП, в кишечнике J без видимого вреда для организма животных.

Научная новизна. Изучена выживаемость некоторых групп микроорганизм (Staphylococcus sp., Bacillus thuringiensis, Pseudomonas aerugina

Yarrowia lipofytica, T. viride, Streptomyces sp., Rhodococcus erythropo Scenedesmus quadricauda, Dunaliella salina и Oscillatoria sp.) в кишечнике ДЧ not их инокуляции. Исследовано усиление бактерицидных свойств целомическ жидкости при инокуляции ДЧ некоторыми штаммами микроорганизмов. Вперв изучены эффекты ВП на олигохет, планарий, рачков, простейших, высшие водны наземные растения, одноклеточные и высшие водоросли. Исследованы процес накопления металлов-микроэлементов в ДЧ. Выяснено действие некотор концентраций перекиси водорода, эмульсий эфирных масел, отваров лекарственн трав, инокуляции препаратом «Бифидумбакгерин» и культурой пекарских дрожа

5". сегеУ1згае на количество гетеротрофных бактерий, в том числе БКГП, в кишечнике ДЧ.

Практическая значимость. Разработаны методы: повышения бактерицидной активности ВП путем предварительной физической или биологической активации иммунной системы червей (патент РФ № 2322993); увеличения содержания в ВП микроэлементов (патент РФ № 2414918); снижения бактериальной обсемененности вермисырья (патент РФ № 2336084); экспрессной интегральной оценки биологической активности ВП (патента РФ № 2377561, 2413219, 2415419); усиления способности ДЧ утилизировать целлюлозу. Полученные материалы могут быть использованы при производстве, контроле качества, поиске оптимальных лечебных доз не только ВП, но и других многокомпонентных лекарственных средств животного и растительного происхождения.

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались на: П Межд. науч.-практ. конф. «Почва как связующее звено ... », 2006 г., г. Иркутск; Всерос. науч-практ. конф. с межд. участием «Социально-экологические проблемы ... », 2006 г., г. Красноярск; XIV всерос. студ. науч.-пракг. конф. с межд. участием. «Безопасность-09», Иркутск, 2009 г.; Межвуз. конф. студ. и аспир. «Полезные лекарственные растения ... », г. Иркутск, 2010 г. и Межд. науч. конф. «Проблемы экологии», г. Иркутск, 2010 г. Результаты исследований использованы при чтении курсов лекций «Прикладная экология»; «Рациональное природопользование» на биолого-почвенном факультете ФГБОУ ВПО «ИГУ». Результаты исследований использованы в отчетах о НИР по проектам РФФИ: № 05-04-97237-Байкал-р; № 06-04-39003-ГФЕН_а (РФ-КНР); ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»: ПС № 02.740.11.0018 от 15.06.2009 г.; ПС № 02.740.11.0335 от 07.07.2009 г.; ПС № 02.740.11.0418 от 30.09.2009 г.; ФЦП «Исследование и разработка по приоритетным направлениям ... на 2007-2013 годы»: ПС № 11.519.11.5016 (РФ-КНР) от 28.10.11 г. Материалы работы включены российско-китайской Комиссией по подготовке встреч глав правительств в Программу научно-технического сотрудничества № 12-35 от 24.09.2008 г.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 24 работы, в том числе из них в журналах рекомендованных ВАК Минобразования РФ - 5 и получено 6 патентов на изобретение.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 147 страницах и состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 61 рисунком и содержит 12 таблиц. Список литературы включает 188 работ (101 отечественная и 87 зарубежных источника).

Личный вклад автора: Лабораторные исследования, анализ полученных данных, обобщение и интерпретация результатов, подготовка материалов для

докладов и публикаций проведены лично или при определяющем вкладе авто, Работа проводилась в период 2003 - 2012 гг. на биолого-почвенном факультете НИИ биологии ИГУ, в НИ «Иркутском государственном техничесю университете», в Байкальском музее ИНЦ СО РАН.

ГЛАВА 1. Литературный обзор

Приводится анализ литературных данных о взаимовлиянии гочвенш олигохет и микроорганизмов, иммунной системе ДЧ, о методах оцен антимикробных свойств ДЧ и активности фармацевтических препарате получаемых на их основе, о методах биотестирования.

ГЛАВА Z Объекты и методы исследования

Объекты исследования. В качестве объектов исследования брали:

- беспозвоночных животных: червей Eisenia fetida, байкальских (Mesenchytrae bungei) и речных (Tubifex tubifex) олигохет, планарий (Phagocata sibiric, ракообразных {Daphnia magna, Moina sp. и Simacephalus vetulus), простейш (Euglena sp., Paramecium caudatum)\

- растения: одноклеточные зеленые водоросли (S. quadricauda, D. salina), сш зеленые нитчатые водоросли (Oscillatoria sp.); многоклеточные харовые водорос {Nitella sp.y, высшее водное растение (Elodea canadensis)', кресс-салат "Дански ("Агрос", Россия);

- микроорганизмы: бактерии (P. aeruginosa, Staphylococcus sp., В. thuringiera Ehodococcus erythropolis)-, микромицеты: Т. viride-, дрожжи: Y. lipoiytica, S. cerevisic

Для микро биальной инокуляции использовали культуры Staphylococcus % В. thuringiensis, Я erythropolis, Streptomyces sp., ¥. lipoiytica, S. cerevisiae, T. viru S. quadricauda, D. salina и препарат «Бифидумбактерин», содержащий mrai Bifidobacterium bifidum.

Методы исследования

Микробиологические методы. Для определения количества гетеротрофн микроорганизмов в кишечном тракте ДЧ проводили асептическое вскрьп олигохет, извлекали кишечную трубку, полученный материал гомогенширова: затем объем гомогената доводили до 5 мл, готовили ряд серийных разведений осуществляли посев на рыбо-пепгонный агар (РПА) и среду Эндо (Вятчина и р 2005). Для изучения возможности сохранения микроорганизмов различных груш кишечнике ДЧ проводили инокуляцию, используя пероральное инъецирование метод свободного скармливания. Для селективного выделения Staphylococcus использовали РПА с 6,5 % NaCl; В. thuringiensis - РПА; R erythropolis, и Г. lipofyt' - среду следующего состава (%): KNQ3 - 0,40; MgS04 • 7НгО - 0,08; КН2РО, - 0,<

Na2HP04 - 0,14; гексадекан - 1; агар - 2; рН 7,2 - 7,3. Для изоляции Streptomyces sp. использовали среду Гаузе, Т. viride - среду Чапека (Практикум по микробиологии..., 2005), S. cerevisiae - среду IEPD следующего состава (г/л): глюкоза - 20, пептон основной - 10, автолизат дрожжевой - 5, агар - 23. Количественный учет микроорганизмов осуществляли после посева соответствующих разведений гомогената на селективные среды, подсчитывая количество колониеобразующих единиц (КОЕ/мл). Для оценки антимикробных свойств ДЧ и препаратов на их основе использовали диско-диффузионный метод (Практикум по микробиологии..., 2005).

Приготовление препаратов из ДЧ. Препараты из ДЧ изготавливали по традиционной китайской методике (Супь, 2004). Для повышения эффективности ВП ДЧ предварительно контаминировали суспензией Staphylococcus sp., помещали в емкость с водой, нагретой до температуры 40 °С на 5 мин, или выдерживали при температуре + 5 °С на 30 мин (Стом, 2008). Для приготовления ВП с пониженной активностью исходные ВП прогревали при 90 °С в течение 30 мин. Для обогащения ВП микроэлементами ДЧ предварительно 2 сут выдерживали в водных растворах солей (ZnS04, K2Cr207, CuSCX,) либо до 10 сут в почвенных субстратах, пропитанных этими растворами.

Методы биотестирования. Биологическую активность ВП оценивали по их влиянию: на скорость ценообразования в суспензии дрожжей с глюкозой (Вятчина и др., 2009); изменение частоты сердцебиения дафний (Колупаев, 1989) и выживаемость кладоцер (ФР 1.39.2001.00283); гибель инфузорий (Голубкова, 1983; Р 52.24-94; ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.2-98); прорастание семян кресс-салата (Лященко, 1999); циклоз в клетках нигеллы и листьях элодеи (Stom et al, 1974; Дмитриева, 1988); на фототаксис планарий и М. btmgei (Ключевская, 2006); поведенческие реакции олигохет М. bungei и Т. tubifex (Стом и др., 2008). Влияние Т. viride на физиологическое состояние ДЧ фиксировали по изменению скорости их зарывания в землю (Черных и др., 1993).

Биохимические методы. Определение целлюлазной активности кишечного сока ДЧ проводили по Mandéis (1974), анализ белка - по Лоури (Бузун и др.,1982). Кишечный сок получали в асептических условиях путем гомогенизирования и последующего центрифугирования кишечников ДЧ (Стом и др., 2010).

Рентгенфлюоресцентный анализ. Содержание микроэлементов в ДЧ анализировали в Инстшуте геохимии СО РАН с использованием рештенофлюоресцентного спектрометра «S4 Pioneer» под руководством в.н.с., д.х.н. Т.Н. Гуничевой.

Люминесцентные методы. Флюоресценцию хлорофилла клеток водоросл измеряли на «Флюорат 03-2 М» по ФР.1.39.2007.03223. Люминесценцв хлорофилла растений анализировали с помощью микроскопа «Axio Scope A1».

Другие методы. Целомическую жидкость получали в асептических услови путем рассечения кожно-мускульного мешка без повреждения кишечной трубв Проверку воздействия различных лекарственных средств на темпы регенерации I проводили путем подсчета сегментов животных, отросших в течение 2-х неде! после отсечения 5-и хвостовых сегментов с последующей трехдневной обработю ран исследуемыми препаратами.

Статистическая обработка данных. Полученные результаты исследован) статистически обработаны с использованием пакета программ Microsoft Excel 201 Все эксперименты производили в 5 независимых опытах в 3 параллельш повторностях. Достоверность различия результатов определяли с помопц критерия Стъюденга. Выводы сделаны при р<3,05 (Гланц, 1998).

ГЛАВА 3. Антимикробные свойства ДЧ и получаемых из Hi вермипрепаратов

В связи с тем, что для усиления антимикробных свойств целомическ жидкости E.fetida проводили инокуляцию червей культурами микроорганизм (Staphylococcus sp., В. thuringiensis, R. erythropolis, Y. lipclytica, T. viride), изучали способность сохраняться в кишечнике E.fetida. В кишечнике ДЧ длительно ( протяжении 60 сут эксперимента) фиксировали наличие штаммов Staphylococcus s В. thuringiensis. Культуры Streptomyces sp. и Y. lipofytica сохранялись в кишечни ДЧ в течение 8 сут. После инъекции per os водорослей клетки S. quadricau сохранялись в кишечнике E.fetida до 8, a D. salina и Oscillatoria sp. - до 6 с; Штамм Т. viride высевался из кишечника ДЧ в течение 40 сут. Таким образом, микрофлоре кишечника ДЧ могут сохраняться и размножаться, инокулированн микроорганизмы. При этом они меняют трансформационный потенциал ДЧ. Та свободное скармливание триходермы увеличивало целлюлозную активность кишечнике олигохет в 14 раз. Другим подтверждением участия аутом икрофло] кишечника ДЧ в трансформации целлюлозы служит снижение целлюлазн активности и способности ДЧ переваривать целлюлозосодержащие субстраты сравнению с контролем при инокуляции олигохет антибиотика] «Амоксициллином» и «Флуконазолом». При проведении экспериментов отмеча угнетающее действие Т. viride на жизнеспособность и подвижность ДЧ. Эффе действия зависел от титра иноку лиру емо й суспензии и возраста культуры. П пероральной инокуляции червей суспензий 2-х недельной культуры с титра:

порядка 1(У - 105 КОЕ/см3 (объем вводимой суспензии 0,05 см3) черви погибали в течение 2-3 сут.

При использовании диско-диффузионного метода повышенный бактериостатический эффект целомической жидкости червей выявлен по отношению к Staphylococcus sp. и P. aeruginosa. Зона угнетения роста этих тест-культур достигала 46,0±6,8 и 50,0±7,4 мм, соответственно. Менее выраженное влияние целомической жидкости зафиксировано при использовании в качестве тест-культур В. thuringiensis и Y. lipolytica. Диаметр зон угнетения роста составлял ! 12,0±1,8 и 7,0±1,0 мм, соответственно. Инокуляция ДЧ суспензиями культур В. thuringiensis и Staphylococcus sp. приводила к усилению бактериостатических свойств целомической жидкости ДЧ. При использовании В. thuringiensis повышение антибактериальных свойств целомической жидкости происходило через полчаса после инокуляции. Зона угнетения роста В. thuringiensis составляла 40,5±ЗД в то время как в контроле - 10,Oil,4 мм (рис. 1).

Рисунок 1. Влияние инокуляции дождевых червей суспензией Bacillus thuringiensis на способность целомической жидкости Eiseniafetida подавлять рост тест-культуры

После инокуляции ДЧ суспензией Staphylococcus sp. повышение бактериостатического эффекта целомической жидкости отмечали через 30 мин. Зона угнетения роста Staphylococcus sp. составляла 38,0±4,0, в то время как в контроле -25,0±1,5 мм (td=3,02; р<0,05). Максимальную активность целомической жидкости фиксировали через 4 ч после инокуляции. В этом случае зона подавления роста Staphylococcus sp. достигала 71,0±4,0 мм. Появление более обширных, чем в контроле (целомическая жидкость неинокулированных червей), зон подавления роста на газоне Y. lipolytica наблюдали вокруг бумажного диска, пропитанного целомической жидкостью червей, инокулированных Т. viride.

Проводили сравнительное изучение антимикробных свойств 1 %-ых интактных ВП из ДЧ, а также препаратов, приготовленных из червей, подвергнутых биологической (контаминация Лорйу/ососсгй эр.) и физической (выдерживание при температуре +40 °С в течение 5 мин и +5 °С в течение получаса) активации.

9

50 -i

f

0,5 1 2 3

Время инкубации В. thuringiensis в кишечнике Е. fétida , ч

Согласно данным, полученным с помощью диско-диффузионного мето, повышенной чувствительностью к действию интактных препаратов обладаг штаммы В. thuringiensis, P. aeruginosa, Staphylococcus sp. Зона подавления рос этих культур составляла 30±4,6; 22±3,2 и 20±2,4 мм, соответственно. Штамм Y. lipolytica и R. erythropolis проявляли большую устойчивость к интактным В (рис. 2).

, 100 т

□ У. lipolytica И R. erythropolis Ш Staphylococcus sp.

В P. aeruginosa Ш В. thuringiensis

Рисунок 2. Сравнительная оценка влияния интактных и активированных ВП на ро : микроорганизмов: А - интактные ВП; Б - ВП, полученные из червей, активированных п + 40°С; В - ВП, полученные из червей, активированных при + 5°С, Г - ВП, полученные червей, подвергнутых контаминированию Staphylococcus sp.

ВП, полученные из червей, подвергнутых предварительной биологической J физической активации, проявляли более высокую бактериостатическую активное , по сравнению с интактными. Так, вокруг дисков, пропитанных суспензия» интактных 1 %-ых ВП зона подавления роста культуры Staphylococcus; составляла 20,0±2,4 мм, а вокруг дисков с препаратами, полученными из черв« подвергнутых предварительному нагреванию, охлаждению и конггаминащ Staphylococcus sp., - 66,0±9,8; 84,0*12,6 и 74,0±11,6 мм, соответственно. Сходн закономерность в действии испытуемых препаратов прослеживалась и п использовании в качестве тест-культур P. aeruginosa, R. erythropolis и ¥. lipolytic Следует отметить, что существенных различий между биологической активносп ВП с усиленными свойствами и интактных ВП по отношению к В. thuringiensis с. наблюдали. Предлагаемые нами способы повышения активности ВП, как помощью биологической, так и физической активации червей, находят свое научн обоснование в полученных нами материалах, а также в работах Лассаля соавторами и Суня (Lassalle etal, 1988; Sun, 1995; 1997; Стом и др., 2006).

После посева спор Т. viride на среду Чапека и обработки засеянного субстрата водными суспензиями 1 %-ых ВП, интактных и ослабленных нагреванием, выявили следующее. Ингакгаые ВП подавляли прорастание спор Т. viride практически полностью. После выдерживания при 90 °С в течение 30 мин ВП теряли способность препятствовать прорастанию спор триходермы.

Были проведены исследования по проверке возможности использования реакции ценообразования в суспензии дрожжей с глюкозой для оценки биологической активности ВП. Интактные ВП из E.fetida в концентрации 1 % ингибировали ценообразование на 80±12 % по сравнению с контролем (1d=8; р<0,05). ВП, выдержанные при температуре 90 °С в течение получаса, в меньшей степени, чем интактные препараты ингибировали пенообразование (на 40 ± 8 %; td=2,9; р<0,05). Таким образом, получасовое прогревание вермипрепаратов при температуре 90 °С не приводило к полной потере ими микробоцидных свойств. Довольно высокая устойчивость ВП к нагреванию находит объяснение в относительной термостойкости веществ ДЧ, отвечающих за антибактериальное действие (Sun, 1995; 1997).

Предложенная тест-реакция, основанная на ценообразовании в суспензии дрожжей, оказалась пригодной для оценки активности и других многокомпонентных лекарственых средств (настойка и отвар корня левзеи сафлоровидпой, настойка элеутерококка, отвары, шалфея лекарственного, эдельвейса скученного, кошачьей лапки двудомной, препарат мумие «Золотое мумие», а также стимулятора роста «Терпенсил») (Стом и др., 2010).

В плане ингибирования роста препаратами из М. bungei и P. sibirica повышенную чувствительность проявляли штаммы Y. lipolytica, Staphylococcus sp. и В. thurmgiensis.

Подавляющее большинство препаратов коммерческих многокомпонентных ВП, так же как и поливитаминов, получают механическим смешиванием, добавляя к ним различные биологически активные компоненты, в частности микроэлементы (Багирова и др., 1998; Кашина и др., 1998; Сунь, 2004). Отдельные ингредиенты таких смесей токсичны сами по себе, например, многие металлы-микроэлементы. Поэтому необходимо вести поиск путей экранирования токсичности потенциально опасных биологически активных веществ при их использовании в лечебных целях. Одним из таких приемов может явиться их предварительная ассимиляция живыми организмами. С этой целью изучали накопление ионов металлов в ДЧ. В контрольных червях содержание катионов цинка составляло 118±15 мг/кг сухого вещества. При экспонировании червей в течение 20 ч в растворах с концентрацией ионов Zn2+ равной 0,36 г/дм3 оно увеличивалось до 3295 ± 430 мг/кг. Выдерживание олигохет в модельных образцах почвы с концентрациями Сг6* - 100 и Си2+ - 400

мг/кг при том же времени инкубирования приводило к нарастанию концентрат этих металлов в червях от следовых значений до 37±6 и 90±10 мг/к соответственно.

Таким образом, некоторые микроорганизмы сохраняются в кишечник инокулируемых ими ДЧ, достаточно длительное время. Инокуляция Д . суспензиями культур микроорганизмов приводит к усилению антимикробны свойств их целомической жидкости. ВП, полученные из червей, подвергнуть предварительной биологической и физической активации, проявляют болг высокую бактсрио статическую активность по сравнению с интактным препаратами. После выдерживания при 90 °С в течение 30 мин активность В понижается, но не полностью. Тест-реакция, основанная на ценообразовании г суспензии дрожжей, пригодна и для оценки активности мношкомпонентнь лекарственных средств животного и растительного происхождения. Помпы, Е. fétida антимикробные препараты можно получать из других червей (М. bungei i Р. sibiricá).

ГЛАВА 4. Снижение бактериальной обсемененности вермисырья

_ _

Одной из проблем применения ДЧ в фармацевтике, косметологии, пшцевс промышленности является высокая обсемененностъ их кишечника и покров« бактериальной микрофлорой, в составе которой возможно присутствие патогенны и условно-патогенных для человека микроорганизмов.

После часового экспонирования ДЧ, инокулированных 1,5%-ыми растворам перекиси водорода, наблюдали почти пятикратное снижение количества бактерий г переднем и среднем отделах кишечника (рис. 3) и уменьшение класса разнообразг гетеротрофных бактерий (с 20 до 6 морфотипов) уже через 30 мин по сравнению контролем без угнетения подвижности ДЧ.

отдел кипечника: □ передний

I средний

1 3

Время инкубации червей, ч

И задний

Рисунок 3. Влияние разного времени экспозиции на количество гетеротрофш бактерий в кишечниках Eiseniafétida, инокулированных 1,5-% перекисью водорода

При применении отваров лекарственных трав, чаги (1 :20), суспензий эфирных масел для снижения обсемененносга кишечного тракта Е. fétida высокий микробоцидный эффект фиксировали в вариантах с чаем «Ермак», чагой, лавандовым и можжевеловым маслами. При проведении микробиологического анализа в кишечнике Е fétida наряду с другими микроорганизмами нами были обнаружены бактерии группы кишечной палочки (БГКП). Имеются данные о применении препарата «Бифидумбактерин» для коррекции дисбиоза кишечной микробиоты червя (Верховцева и др., 2004). В связи с этим мы предприняли попытку снизить количество гетеротрофных бактерий, в том числе БГКП, «пролечив» червей препаратом «Бифидумбактерин». Количество гетеротрофных бактерий на 10-е сутки эксперимента в переднем отделе кишечника снизилось с (3,54±0,34)х109 до (1,79±0,15)х10\ в среднем - с (3,17±0,28)х109 до 1,28±0,14 хЮб КОЕ/г. В заднем отделе кишечника червя исследуемые бактерии при посеве не были обнаружены. Дальнейшая инкубация червей (до 30 сут) не приводила к значительному изменению количества гетеротрофных бактерий в их кишечнике. Применение препарата «Бифидумбактерин» способствовало существенному снижению количества БГКП в кишечнике Е. fétida. После 10-суточной инкубации червей численность БГКП в переднем отделе кишечника снизилась с (1,44±0,25)х 109 до (1,71±0,15)хЮ\ в среднем - с (1,20±0,08)*109 до (1,02±0,09)хЮ5КОЕ/г. В заднем отделе кишечника червя исследуемые бактерии при посеве не были обнаружены. На 20-е и 30-е сут эксперимента существенного изменения количества БГКП не отмечали.

Инкубирование червей на целлюлозном субстрате, в который ежедневно добавляли суспензию пекарских дрожжей S. cerevisiae, приводило к снижению численности гетеротрофных бактерий в кишечнике, в том числе БГКП, но в меньшей степени, чем при использовании «Бифидумбактерина».

Таким образом, инокулирование ДЧ растворами перекиси водорода, отварами лекарственных трав, чаги и эмульсиями эфирных масел, скармливание препарата «Бифидумбактерин» и дрожжей S. cerevisiae целесообразно использовать для снижения обсемененности вермисырья.

ГЛАВА 5. Влияние дождевых червей и вермипрепаратов на растения

С помощью диско-диффузионного метода исследовали действие целомической жидкости и 1 %-ых суспензий интакпшх, а также ослабленных нагреванием ВП, на рост одноклеточных водорослей. ВП стимулировали рост D. salina больше, чем целомическая жидкость. ВП и целомическая жидкость усиливали рост S. quadricauda, но подавляли ростовые процессы Oscillatoria sp. При добавлении в суспензию клеток S. quadricauda интактных ВП в диапазоне концентраций 0,01 -

0,25 % наблюдали увеличение флюоресценции суспензий водорослей. При это] максимальное повышение уровня флюоресценции (на 50 %) по сравнению контролем фиксировали при концентрации ВП 0,1 %.

В клетках Nitella sp., инкубированных в 1 %-ых суспензиях ВП, красно свечение сменялось на оранжево-розовое через 20 ± 2 ч, розовое через 30 ± 2 ч, и н розово-серое - через двое суток. При действии ВП, ослабленных теплово: обработкой, розово-красное свечение близкое к свечению в контроле сохранялос более 2 сут. ВП (1%) останавливали цюслоз в клетках у основания лист Е. canadensis через 3,5±0,3 часа. Ослабленные нагреванием 1% ВП даже пр: экспонировании более суток не подавляли цшслоз в клетках листочков Е. canadensh При инкубировании нигеллы в суспензиях ВП в диапазоне концентраций от 0,6 д 0,8 % фиксировали снижение скорости циклоза в ев клетках. При увеличении ж концентрации ВП от 1 % и выше наблюдали полное прекращение движени цитоплазмы. Ингактные 1 %-ые ВП подавляли циклоз в клетках Nitella sp. чере 2±0,1 ч, тогда как 1 %-ые ВП, ослабленные нагреванием, только через 4 ± 0,1 ' (рис. 4).

60

-----0 % (юнтроль) —0- 0,60% 0,80%

-+-1% 1,25% ---1,60%

-—2,50% —•—5%

Рисунок 4. Влияние различных концентраций интакшых вермипрепаратов h¡ скорость движения цитоплазмы циклоза в клетках Nitella sp.

ВП (1 %) оказывали влияние не только на водоросли, но и на высшие растения При выдерживании семян кресс-салата в 1 %-ых суспензиях интактных ВГ прорастало только 30±4 % семян по отношению к контролю, а при обработке ВП, ослабленными выдерживанием при 90 °С в течение 30 мин, всхожесть семга составляла 60±8 % (td=4,2, р<0,05).

Таким образом, ВП и целомическая жидкость стимулируют рост зеленых (S. quadricauda, D. salina), но ингибируют ростовые процессы сине-зеленой (Oscillatoria sp) водорослей. ВП подавляют циклоз в клетках водных макрофитов

(Nitella sp., E. canadensis), а уже затем изменяют интенсивность люминесценции их хлоропластов. Ослабленные нагреванием ВП слабее подавляли движение цитоплазмы и люминесценцию хлоро пластов гидрофигов, чем шггахтные. Циклоз и люминесценция - более чувствительны к действию испытанных препаратов у клеток элодеи то сравнению с клетками нигеллы. Прорастание семян кресс-салата больше подавляют интактные ВП, чем ВП, ослабленные нагреванием. Полученные результаты при дальнейшей доработке могут быть использованы для оценки биологической активности лекарственных средств помощью описанных тест-реакций растений.

ГЛАВА б. Влияние вермипрепаратов и других лекарственных средств на червей

Суспензии с 6 %-ым содержанием ВП вызывали гибель планарий P. sibirica через 1,5 ± 0,2 ч. При 1%-ой концентрации ВП планарии выживали, но ослаблялась их реакция на свет. Так после часового инкубирования в затемненный сектор перемещалось только 39,3±4,0 % особей, а в контроле - 80*10 % (td=3,8; р<0,05). Более низкие концентрации ВП (0,5; 0,1; 0,01%) не оказывали существенного влияния на реакцию фототаксиса плоских червей. Предложенная тест-реакция, основанная на фототаксисе планарий оказалась пригодной также для оценки активности и других лекарственых средств (настойки левзеи, элеутерококка, стимулятора роста «Терпенсил») (Быбин и др., 2012).

В контроле, при помещении олигохет М. bungei и Т. tubifex в чистую воду, наблюдали их сползание в течение 10±3 мин, взаимное переплетение с образованием характерного клубочка. Сходную картину отмечали и при действии ВП, ослабленных нагреванием, но в этом случае для сползания в клубок требовалось больше времени - 30±4 мин. В присутствии 1%-ых препаратов, полученных из E.fetida и М. bungei, происходило обездвиживание олигохет М. bungei через 7,5±1,2 мин. При этом олигохеты не сползались в клубок, их тела перед обездвиживанием волнообразно сокращались. В варианте с 0,5%-ыми ВП подвижность олигохет снижалась уже через 10 мин экспозиции, сборка в клубок также отсутствовала. ВП в концентрации 0,25 % вызывали скручивание червей в спирали, сползание в плохо оформленный клубок. При контакте с 0,15 %-ыми ВП все особи покидали суспензию и забирались на верхнюю створку чашки Петра В 0,01 %-ой суспензии наблюдали очень слабую реакцию на ВП, проявляемую в треморе тела животных. В течение получаса тремор прекращался. При этом черви, так же как и в контроле, собирались в клубок. Эта же концентрация ВП на 80±10 % снижала скорость ухода М. bungei в затемненную зону, что позволяет говорить о большей чувствительности реакции фототаксиса по сравнению с поведенческими реакциями олигохет, описанными выше.

ВП, ингактные и ослабленные нагреванием, в концентрации 0,01% щи обработке места ранения ускоряли регенерацию хвостовых сегментов тела ДЧ ] среднем в 2,6 раз (t<j=9; р<0,05) по сравнению с контролем. Повышени концентрации ингактных ВП до 0,1% приводило к подавлению регенерации i среднем на 56 % (td=3,l; р<0,05). В то же время к ослабленным нагреванием ВП i этой же концентрации животные были нечувствительны. Дальнейшее повышени содержания обоих типов ВП до 0,5 и 1% значимо не изменяло темпы регенераци сегментов. Реакции регенерации ДЧ оказались пригодными и для оценки активносп других многокомпонентных лекарственных средств. Препарат «Золотое мумие» i концентрации 0,1 и 1% ингибировал регенерацию хвостовых сегментов у ДЧ ; среднем на 32 и 50 % (t<f=2,6; t<¡=4,2; р<0,05), соответственно, и стимулировал npi содержании мумиё 0,01 % на 112 % р<0,05) по сравнению с контролем

Отвары (1 :20) боровой матки 1-го года хранения сырья подавляли скорост регенерации хвостовых сегментов ДЧ в среднем на 52 % (td=7,7; р<0,05) п сравнению с отварами из боровой матки 10-летней давности.

Таким образом, определенные концентрации ВП снижают реакции планари! P. sibirica на свет. Ингактные ВП, в отличие от ВП, ослабленных нагреванием вызывают обездвиживание олигохет М. bungei и Т. tubifex, а также препятствуют и сползанию в клубок. ВП и мумие в низких концентрациях стимулируют, а в боле высоких ингибируют регенерацию хвостовых сегментов ДЧ. Эти реакции являютс: перспективными биопробами, так как позволяют подбирать эффективные дозы ВП i других лекарственных средств, необходимых для интенсификации регенераци] тканей.

ГЛАВА 7. Влияние вермипрепаратов и других лекарственных средств н некоторые водные тесг-объекгы

Препараты из Е. fétida, М. bungei и Р. sibirica в концентрации 6 % эффективн понижали частоту сердцебиения рачков D. magna и приводили к их гибели ; интервале 45-60 мин. Ингактные ВП из Е. fétida подавляли сердцебиение дафни сильнее, чем ослабленные нагреванием. Так 1%-ые ВП останавливали работу сердц дафнии через 60±15 мин, а ослабленные нагреванием ВП - только через 180±30 ми (U=3,6; р<0,05).

Отвары (1: 20) го более старых сборов боровой матки (10 лет хранения сырья подавляли сердцебиение дафнии интенсивнее, чем свежие (1 год хранения). I первом случае сердце рачков прекращало свою работу через 120 ± 15 мин, во вггорот - 210 ± 15 мин. Растворы с 0,01 %-ым содержанием мумие препарата «Золото мумие»подавляли сердечную деятельность дафнии через 75 ± 10 мин, а 0,1 %-ым ■ через 45 ± 10. Сильно снижали частоту сердцебиения дафний и отвары друга

бактерицидных лекарственных растений, в частности ромашки аптечной, курильского чая (Быбин и др., 2010).

При инкубировании дафниид: Moina sp. и S. vetulus - в 1 %-ой суспензии ВП (Е. fétida) гибель рачков фиксировали в близких пределах - 30-35 мин, а в случае с ослабленными нагреванием ВП - через 198-210 мин.

Через 15 мин в ВП в концентрации 1 % вызывали обездвиживание клеток Euglenasр., а через 40±6 мин - трансформацию формы клеток эвглены из веретеновидной в шарообразную. Добавление 0,5 % ВП приводило к потере подвижности P. caudatum через 15 ± 2 мин.

Резюмируя данный раздел работы, следует обратить особое внимание на то, что ВП, в том числе полученные из других олигохет (М. bungei) и плоских червей (P. sibirica), проявляют не только бактерицидную активность, но и оказывают выраженное действие на беспозвоночных животных. Препараты из Е. fétida, М. bungei, P. sibirica понижают частоту сердцебиения рачков D. magna и приводят к их гибели. Интактные ВП из Е. fétida, более старые сборы боровой матки подавляют сердцебиение дафний сильнее, чем ослабленные нагреванием ВП и отвары свежей боровой матки. Интактные ВП приводят к гибели копепод Moina sp. и S. vetulus быстрее, чем ослабленные нагреванием ВП. Интактные и ослабленные нагреванием ВП вызывают обездвижение клеток Euglena sp. и Р. caudatum.

На основании полученных результатов предложены следующие практические рекомендации:

1. Использовать выдерживание ДЧ при +5 °С в течение 30 мин для повышения бактерицидной активности получаемых из них ВП (патент РФ № 2322993).

2. Для снижения обсемененности кишечника ДЧ гетеротрофными бактериями при получении ВП применять 1,5 % перекись водорода или соответствующие разведения эфирных масел, отвары лекарственных трав, а также скармливание «Бифидобактерина» и сахаромицетов (патент РФ № 2336084).

3. Для оценки биологической активности ВП, а также других многокомпонентных лекарственных средств растительного и животного происхождения, фармацевтических препаратов использовать методы биотестирования, основанные на поведенческих реакциях олигохет (патент РФ № 2377561 "Способ биотестирования активности препаратов, полученных из дождевых червей") и изменении сердечной деятельности дафний (патент РФ № 2413219 "Способ оценки активности вермипрепаратов").

выводы

1. При исследовании взаимовлияния ДЧ и микроорганизмов показано, чп представители ряда групп микроорганизмов при инокуляции ДЧ способн сохраняться в кишечном тракте олигохет: актиномицеты Streptomyces sp. и дрожж Y. lipolytica в течение 8-и сут, бактерии: Staphylococcus sp. и В. thuringiensis - до б суг, одноклеточные зеленые водоросли: S. quadricauda, D.salina, цианобакгери Oscillatoria sp. - до 6-и сут, а целлюлозоразрушающий микромицет (Г. viride) боле 40 дней.

2. Добавление антибиотиков («Флуконазол», «Амоксициллин») снижало, пероральная инъекция Т. viride интенсифицировала способность ДЧ переваривап целлюлозу. Свободное скармливание триходермы увеличивало целлюлазну] активность кишечника олигохет в 14 раз.

3. По чувствительности к угнетающему действию целомической жидкости Д изученные штаммы микроорганизмов располагаются в следующий ря, Oscillatoria sp. > P. aeruginosa > Staphylococcus sp. > B. thuringiensis > Y. lipolytica R erythropolis. Инокуляция per os ДЧ культурами Staphylococcus sp. B. thuringiensis усиливала антимикробные свойства целомической жидкости ДЧ в и 4 раза, соответственно.

4. При инокуляции per os и свободном скармливании ДЧ препарат «Бифидумбактерина», сахаромицетов, а также при действии перекиси водород (1,5%), препаратов эфирных масел, отваров лекарственных трав в кишечнго олигохет существенно снижалось количество гетеротрофных бактерий, в том числ БГКП.

5. При контаминации Staphylococcus sp. или выдерживании ДЧ при 40 °С в течет 5 мин антимикробные свойства ВП, полученных на их основе, усиливались в 3 раза а после 30-минутной экспозиции при 5 °С - в 4 раза.

6. По чувствительности к ингибирующему действию ВП испытанные тест-реакци могут бьпъ ранжированы следующим образом: сборка олигохет в клубок > частот сердцебиения дафний > рост Oscillatoria sp. > циклоз в клеггках Nitella sp. Е. canadensis > изменение характера люминесценции хлорофилла в клетка Nitella sp. и Е. canadensis > прорастание семян кресс-салата и спор грибов Т. viride регенерация хвостовых сегментов олигохет > пенообразование в суспензи хлебопекарных дрожжей > потеря подвижности клеток Euglena sp и P. caudatun Получасовое выдерживание ВП при 90° С ослабляло их способность подавлят вышеназванные тест-реакции.

Список работ, в которых опубликованы основные положения диссертации: Статьи в изданиях, включенных в список ВАК РФ:

1. Возможность сохранения жизнеспособности микроорганизмов после прохождения через кишечный тракт дождевых червей/О.Ф. Ветчина, О.С. Рыкова, Д.И. Стом, В.А. Быбин//Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2005. - № 6. - С. 131 -133.

2. О возможности усиления иммунных свойств дождевых червей/ Д.И. Стом, RA Быбин, О.Ф. Вятчина//Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. -Иркутск, 2006. - № 6. -163 - 166.

3. Об интродукции некоторых штаммов микроорганизмов в кишечник красного калифорнийского гибрида (Eisenia fétida Andrei boucheyО.Ф. Ветчина, Д.И. Стом, О.С. Рыкова, RA Быбин и др. // Вестник Бурятского гос. ун-та. Химия, биология, география. - Улан-Удэ, 2007. - Вып.3. - С. 121 -126.

4. Переваривание целлюлозы дождевыми червями под воздействием Trichoderma viride/Стом Д.И., Быбин В.А, Приставка A.A. и др.// Известия Иркутской государственной экономической академии. — 2010. — № 5. - С. 290 — 293. — Электрон. Версия печат. Публик. - Систем. Требования: Adode Acrobat Reader/ -URL: http: //httpУ/www.eizvestia.isea.ru/reader/article.aspx?id=7148/ (дата обращения: 14.01.2012).

5. Утилизация целлюлозы зоомикробным комплексом/ Д.И. Стом, RA Быбин, АА. Приставка и др.//В мире научных открытий. Красноярск: изд-во СФУ, 2010. - №4 (10), Ч. 10.-С. 67 - 69.

Патенты:

6. Способ биотестирования активности препаратов, полученных из дождевых червей/Д.И. Стом, А.Э. Балаян, C.B. Полехина, RA. Быбин//Патенг РФ № 2377561/ Бюл. № 36 от 27.12.2009.

7. Способ оценки активности вермипрепарата/RА. Быбин, А.Э. Балаян, Д.И. Стом и др.//Патенг РФ № 2413219/Бюл. № 6 от 27.02.2011.

8. Способ получения вермипрепаратов, обогащенных микроэлементами/Д.И. Стом, АЭ. Балаян, М.Н. Саксонов, RA. Быбин/ЯТатенг РФ № 2414918/ Бюл. № 9 от 27.03.2011.

9. Способ снижения обсеменённости кишечника дождевого червя/А.В. Кононова, О.С. Рыкова, RA Быбин и др.//Патенг РФ № 2336084/ Бюл. № 29 от 20.10.2008.

10. Стом Д. И. Способ оценки активности препаратов, полученных из дождевых червей/Д-И. Стом, RA. Быбин, А.Э. БалаянШатент РФ № 2415419/Бюл. 9 от 27.03.2011.

П. Стом Д.И. Способ получения фармацевтического препарата, обладающей антимикробным действием/Д.И. Стом; В.А. Быбин; О.Ф. Вятчина//Патенг РФ Л 2322993/Бюл. № 12 от 27.04.2008.

Прочие публикации:

12. Быбин В.А. Возможность сохранения жизнеспособности Streptomices sp. поел прохождения через кишечный тракт дождевых червей/ В.А. Быбин, О.Ф. Вятчина Вестник Иркут. ун-та. - Иркутск: Иркут. ун-т, 2005. - С. 18 -19.

13. Взаимодействие красного калифорнийского гибрида и целлюлозоразрушакдцеп гриба Trichaderma viridel В.А. Быбин, А.А. Приставка, В.П. Саловарова, и др //Проблемы экологии: чтения памяти проф. М.М. Кожова: тез докл. Межд. науч конф. - Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2010. - С. 388.

14. Влияние пассажа через кишечный тракт дождевых червей на выживаемост микроорганизмов/О.Ф. Вятчина, О.С. Рыкова, В.А Быбин и дрУ/Биологи микроорганизмов и их научно-практическое использование. Иркутск, 2004. - С. 12' -131.

15. Вятчина О.Ф. Способы снижения бактериальной обсемененносп вермипрепаратов/О.Ф. Вятчина, А.С. Мунгалова, В.А Быбин //Проблемы экология чтения памяти проф. М.М.Кожова: тез докл. Межд. науч. конф. - Иркутск: Изд-bi Иркут. гос. ун-та, 2010. - С. 396.

16. Добрынин В.И. Люминесценция некоторых групп микроорганизмов/В.И Добрынин, Е.В. Евсюнина, В. А. Быбин //Проблемы экологии: чтения памяти npoej М.М.Кожова: тез докл. Междунар. науч. конф. - Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-Т£ 2010.-С. 405.

17. Оценка активности фармацевтических фитопрепаратов с использование? беспозвоночных животных и микрооргантмов/ДИ. Стом, Г.М Федосеева, В.А Быбин и др.//Проблемы экологии: чтения памяти проф. ММ. Кожова: тез докл Междунар. науч. конф.. - Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2010. - С. 467.

18. Повышение активности препаратов из дождевых червей / C.B. Полехина, RA Быбин, Д.И. Стом и др.//Вестник Иркут. ун-та. - Иркутск: Изд-во Иркут. Гос. ун-тг 2007.-С. 19-21.

Материалы конференций:

19. Антимикробные свойства красного калифорнийского червя/RA. Быбин, О.С Вятчина, Д.И. Стом и др.//Мат. П Межд. науч.-практ. конф. «Почва как связующе звено... », Иркутск, 2006. -С. 399 - 400.

20. Быбин RA. Возможность сохранения жизнеспособности Streptomices sp. поел прохождения через кишечный тракт дождевых червей/В. А. Быбин//Материат

20

докладов XI Всерос. науч.-прак. конф. аспирантов и студентов с международным участием «Проблемы безопасности современного мира: Средства защиты и спасения «Безопасность - Об»». - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2006 - т. 1 - С. 56.

21. Быбин В.А. Возможность сохранения микроскопических водорослей после пяггяжя через кишечник дождевых червей Eisenia fetida/BA. Быбин, Л.Ю. Тарасов, М.Н. Саксонов //Материалы докладов XIV всерос. студ. науч.-прак. конф. с международным участием. Современные проблемы безопасности жизнедеятельности, «Безопасносгь-09», - Иркутск: изд-во ИрГТУ, 2009. - с. 180 -181.

22. Быбин В.А. Использование люминесценции хлорофилла и циклоза Nitella sp., Elodea canadensis для биологического контроля активности препаратов, полученных ю дождевых червей/В.А. Быбин, Д.И. СтомШатериалы докладов XIV всерос. студ. науч.-прак. конф. с международным участием. Современные проблемы ..., «Безопасносгь-09», Иркутск: изд-во ИрГТУ, 2009. - С. 182.

23. Быбин В. А. Оценка качества вермипрепаратов с использованием поведенческих реакций олигохет и рачков/В.А. Быбин, А.Э. Балаян//Материалы докладов XIV всерос. студ. науч.-прак. конф. с международным участием. Современные проблемы ..., «Безопасность-09». - Иркутск: изд-во ИрГТУ, 2009. - С. 181 -182.

24. Получение новых фармацевтических препаратов на основе дождевых червей/ В.А. Быбин, С.В. Полехина, ДИ. Стом и др.//Проблемы безопасности современного мира: способы защита и спасения «Безопасность - 05»: Материалы докладов X Всерос. науч.-прак. конф. студентов и аспирантов.- Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2007. -Т. 1. - С. 211-213.

Неоценимую помощь в проведении экспериментов и подготовке диссертации оказали к.б.н. Вятчина О.Ф., к.б.н. Саксонов М.Н., к.б.н. Балаян А.Н., проф. Саловарова В.П., кб.н. Приставка А.А., проф. Федосеева Г.М, проф. Сунь Чжэньцзюнь, чл.-корр. РАН Ившина И.Б., к.б.н. И.А. Борзенков, проф. Чхенкели В.А.

Научное издание

Быбин Виктор Александрович

ВЛИЯНИЕ ВЕРМИПРЕПАРАТОВ НА РАЗЛИЧНЫЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТЫ

Автореферат Подписано в печать 05.04.2012. Формат 60x90 1/16 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз Экспресс-типография "Минутка" г. Иркутск, ул. Советская, 58, оф., 29 тел. 950-142

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Быбин, Виктор Александрович, Иркутск

61 12-3/884

ФГБОУ ВПО «ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

ч»

СГ

Быбин Виктор Александрович

ВЛИЯНИЕ ВЕРМИПРЕПАРАТОВ НА РАЗЛИЧНЫЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТЫ

Специальность: 03.02.08 - экология (биологические науки)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., профессор

Иркутск 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................5

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.............................................................11

1.1 Иммунная система дождевых червей........................................................11

1.2 Взаимодействие дождевых червей с микроорганизмами........................17

1.3 Фармацевтические препараты из дождевых червей................................20

1.4 Методы биотестирования...........................................................................22

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................29

2.1 Объекты исследования................................................................................29

2.2 Методы исследования.................................................................................38

2.2.1 Методы получения препаратов...............................................................38

2.2.2 Определение антимикробных и других свойств цел омической жидкости, а также препаратов из дождевых червей......................................40

2.2.2.1 Диско-диффузионный метод................................................................40

2.2.2.2 Оценка действия вермипрепаратов на флюоресценцию одноклеточных водорослей..............................................................................41

2.2.2.3 Определение влияния лекарственных средств на скорость пенообразования пекарских дрожжей.............................................................42

2.2.2.4 Оценка активности вермипрепаратов по влиянию на частоту сердцебиения дафний, гибель рачков и простейших.....................................42

2.2.2.5 Определение содержания белка в вермипрепаратах.........................43

2.2.3 Изучение возможности сохранения микроорганизмов различных групп в кишечнике дождевого червя...............................................................44

2.2.3.1 Метод свободного скармливания.........................................................44

2.2.3.2 Инъецирование дождевых червей суспензией культур микроорганизмов...............................................................................................44

2.2.3.3 Микробиологический анализ кишечника дождевых червей............44

2.2.4 Методы снижения бактериальной обсемененности кишечника дождевых червей................................................................................................46

2.3 Влияние Т. утйе на дождевых червей......................................................48

2.3.1 Оценка действия Т. утс!е на физиологическое состояние дождевых червей..................................................................................................................48

2.3.2 Влияние Т. уЫйе на целлюлазную активность кишечного сока дождевых червей................................................................................................49

2.4 Оценка активности вермипрепаратов по влиянию на прорастание семян кресс-салата........................................................................................................51

2.5 Оценка активности лекарственных средств и стимулятора роста растений «Терпенсил» по влиянию на фототаксис планарий и олигохет...51

2.6 Оценка активности вермипрепаратов по изменению поведенческих реакций олигохет...............................................................................................52

2.7 Оценка активности вермипрепаратов по гашению люминесценции хлорофилла и подавлению циклоза у Nitella sp. и Elodea canadensis..........52

2.8 Оценка активности вермипрепаратов по регенерации хвостовых сегментов дождевых червей.............................................................................53

2.9 Рентгенофлюоресцентный метод анализа содержания металлов..........53

2.10 Статистическая обработка результатов...................................................53

ГЛАВА 3. АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ И ПОЛУЧАЕМЫХ ИЗ НИХ ВЕРМИПРЕПАРАТОВ.......................................55

3.1 Изменение антимикробных свойств целомической жидкости после инокуляции в кишечник дождевых червей культур микроорганизмов.......55

3.1.2 Изучение антимикробных свойств целомической жидкости Eiseniafetida и их изменение после микробной инокуляции........................71

3.2 Сравнение антимикробных свойств вермипрепаратов и препаратов из планарий и олигохет..........................................................................................75

3.3 Получение вермипрепаратов, обогащенных микроэлементами.............86

ГЛАВА 4. СНИЖЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ ВЕРМИСЫРБЯ..................................................................................................90

4.1 Влияние перекиси водорода, эфирных масел и отваров лекарственных трав на количество гетеротрофных бактерий в кишечнике Eisenia fétida...90

4.2 Использование препарата «Бифидумбактерин» для снижения бактериальной обсемененности Eis enia fétida..............................................93

4.3 Влияние инокуляции культурой Saccharomyces cerevisiae на количество

гетеротрофных бактерий в кишечнике Eisenia fétida....................................96

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ И ВЕРМИПРЕПАРАТОВ НА РАСТЕНИЯ................................................................................................100

5.1 Действие дождевых червей и вермипрепаратов на одноклеточные водоросли..........................................................................................................ЮО

5.2 Влияние вермипрепаратов на циклоз и люминесценцию в клетках макрофитов.......................................................................................................102

5.3 Влияние вермипрепаратов на прорастание семян кресс-салата...........105

ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ ВЕРМИПРЕПАРАТОВ И ДРУГИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ЧЕРВЕЙ..............................................107

6.1. Влияние фитостимулятора и вермипрепаратов на фототаксис планарий Phagocata sibirica.............................................................................................107

6.2 Влияние вермипрепаратов на поведенческие реакции олигохет.........109

6.3 Влияние лекарственных средств на регенерацию хвостовых сегментов дождевых червей.............................................................................................. 111

ГЛАВА 7. ВЛИЯНИЕ ВЕРМИПРЕПАРАТОВ И ДРУГИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА НЕКОТОРЫЕ ВОДНЫЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТЫ........................................................................................................115

ВЫВОДЫ...................................................:......................................................124

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ......................................126

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Сегодня во всём мире наблюдается бум по созданию, патентованию и выпуску новых лекарственных средств повышенной эффективности из дождевых червей (патенты РФ - [77, 50, 100, 5, 71]; США - [137, 103]; КНР - [144] и многие другие; [136, 116]).

Получаемые из дождевых червей вермипрепараты находят все более широкое применение в медицине и косметике [175, 125]. Интерес к вермипрепаратам обусловлен их противоопухолевой, антибактериальной, антиоксидантной, иммуногенной, а также рядом других активностей [104, 131]. Иммунная, ферментативная и антибиотическая системы дождевых червей подвергаются значительным флюктуациям под воздействием физических, химических и биологических факторов [155, 182]. Это приводит к изменению антимикробных свойств дождевых червей, увеличению активности их ферментов, играющих важную роль в проявлении препаратами фармацевтических свойств. В связи с тем, что для производства вермипрепаратов используется живое сырьё, количество и качество биологически активных агентов, входящих в их состав, зависят от различных условий, в частности, от исходного физиологического состояния дождевых червей, кормовых субстратов, используемых для выращивания червей. Исходя из вышесказанного, можно было ожидать получения более эффективных препаратов из дождевых червей, подвергнутых определённым активирующим воздействиям. Поэтому столь актуальным представляется изучение действия различных факторов физической и биологической природы на дождевых червей и прежде всего на их иммунную систему. Для обеспечения поиска процедур, приводящих к повышению активности вермипрепаратов, крайне важно иметь простые и дешевые методы экспрессной оценки их активности. Наличие таких методов позволило бы преодолеть основной момент, сдерживающий применение в официальной медицине самых различных комплексных многокомпонентных животных и

растительных препаратов, - трудности при дозировке их активного начала. Эти приемы могут быть также использованы для контроля условий производства, хранения и эффективного применения вермипрепаратов. К сожалению, на сегодня подобных способов очень мало [101, 86, 80]. Недостатками существующих методов оценки активности вермипрепаратов являются длительность получения ответа, дороговизна, потребность в соответственно оборудованных лабораториях, в использовании позвоночных лабораторных животных.

Подавляющее большинство известных коммерческих

многокомпонентных вермипрепаратов, так же как и поливитаминов, получают механическим смешиванием, добавляя к ним различные биологически и фармацевтически активные компоненты, в частности микроэлементы [72, 43, 84]. Отдельные ингредиенты таких смесей токсичны сами по себе, например, многие тяжелые металлы-микроэлементы. Некоторые компоненты подобных смесей вступают в непосредственное взаимодействие друг с другом (например, соли металлов - сильные окислители и различные витамины, в частности соли железа и аскорбиновая кислота [56]). Это может приводить не только к нейтрализации активности полезных ингредиентов, но и к появлению агрессивных по отношению к организмам продуктов. Поэтому необходимо вести поиск путей экранирования токсичности потенциально опасных биологически активных веществ при их использовании в лечебных целях. Одним из таких приемов может явиться их предварительная ассимиляция живыми организмами.

Цель работы: изучение взаимовлияния дождевых червей и некоторых групп микроорганизмов, а также действия вермипрепаратов на различные тест объекты.

Задачи работы:

1) изучить возможность сохранения представителей ряда групп микроорганизмов в кишечнике дождевых червей;

2) исследовать влияние инокуляции культурой Saccharomyces cerevisiae и препаратом «Бифидумбактерин» на численность гетеротрофных бактерий, в том числе бактерий группы кишечной палочки (БГКП), в кишечнике дождевых червей;

3) изучить влияние Trichoderma viride на дождевых червей;

4) проанализировать действие ряда биотических и абиотических факторов на иммунные свойства дождевых червей;

5) разработать приемы повышения активности вермипрепаратов и снижения бактериальной обсемененности вермисырья;

6) проанализировать влияние вермипрепаратов на тест-организмы из различных систематических групп и предложить экспрессные, технически простые методы оценки активности вермипрепаратов.

Защищаемые положения:

1. Антимикробные свойства целомической жидкости дождевых червей и получаемых из них вермипрепаратов усиливаются под действием некоторых биотических (инокуляции дождевых червей отдельными штаммами микроорганизмов) и абиотических (охлаждение, нагревание) факторов.

2. При контаминации (инъекции per os, свободном скармливании) некоторые штаммы бактерий, дрожжей, микроскопических грибов могут интродуцироваться в аутомикрофлору кишечника дождевых червей.

3. Вермипрепараты оказывают преимущественно негативное влияние на физиологические процессы и выживаемость беспозвоночных животных, водорослей, высших водных и наземных растений.

4. Пероральная инъекция дождевых червей определенными концентрациями перекиси водорода, эфирных масел и отварами лекарственных трав, а также инокуляция препаратом «Бифидумбактерин» и культурой пекарских дрожжей S. cerevisiae значительно снижает количество гетеротрофных бактерий, в том числе БКГП, в кишечнике дождевых червей без видимого вреда для организма животных.

Научная новизна. Изучена выживаемость некоторых групп микроорганизмов (Staphylococcus sp., Bacillus thuringiensis,

Pseudomonas aeruginosa, Yarrowia lipolytica, T. viride, Streptomyces sp., Rhodococcus erythropolis, Scenedesmus quadricauda, Dunaliella salina и Oscillatoria sp.) в кишечнике дождевых червей после их инокуляции. Исследовано усиление бактерицидных свойств целомической жидкости при инокуляции дождевых червей некоторыми штаммами микроорганизмов. Впервые изучены эффекты вермипрепаратов на олигохет, планарий, рачков, простейших, высшие водные и наземные растения, одноклеточные и высшие водоросли. Исследованы процессы накопления металлов-микроэлементов в дождевых червях. Выяснено действие некоторых концентраций перекиси водорода, эмульсий эфирных масел, отваров лекарственных трав, инокуляции препаратом «Бифидумбактерин» и культурой пекарских дрожжей S. cerevisiae на количество гетеротрофных бактерий, в том числе БКГП, в кишечнике дождевых червей.

Практическая значимость. Разработаны методы: повышения бактерицидной активности вермипрепаратов путем предварительной физической или биологической активации иммунной системы червей (патент РФ № 2322993 "Способ получения фармацевтического препарата, обладающего антимикробным действием" [79]); увеличения содержания в вермипрепаратах микроэлементов (патент РФ № 2414918 "Способ получения вермипрепаратов, обогащенных микроэлементами" [75]); снижения бактериальной обсемененности вермисырья (патент РФ № 2336084 "Способ снижения обсеменённости кишечника дождевого червя" [76]); экспрессной интегральной оценки биологической активности вермипрепаратов (патент РФ № 2377561 "Способ биотестирования активности препаратов, полученных из дождевых червей" [73]; патент РФ № 2413219 "Способ оценки активности вермипрепаратов" [74]; патент РФ № 2415419 "Способ оценки активности препаратов, полученных из дождевых червей" [78]); усиления способности дождевых червей утилизировать целлюлозу [90].

Полученные материалы могут быть использованы при производстве, контроле качества, поиске оптимальных лечебных доз не только вермипрепаратов, но и других многокомпонентных лекарственных средств животного и растительного происхождения.

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались на II Международной научно-практической конференции «Почва как связующее звено функционирования природных и антропогенных преобразований экосистем», 4-7 сентября 2006 г., г. Иркутск; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Социально-экологические проблемы природопользования в центральной Сибири», 18-21 октября 2006 г., г. Красноярск; XIV всероссийской студенческой научно-практической конференции с международным участием. Современные проблемы безопасности жизнедеятельности, «Безопасность-09», г. Иркутск, 22-24 апреля, 2009 г.; Межвузовской конференции студентов и аспирантов «Полезные лекарственные растения флоры Восточной Сибири», г. Иркутск, 19 мая 2010 г. и Международной научной конференции «Проблемы экологии» Чтения памяти профессора М. М. Кожова, Иркутск, 20-25 сентября 2010 г.

Результаты исследований использованы при чтении курсов лекций «Прикладная экология»; «Рациональное природопользование» на биолого-почвенном факультете ИГУ и проведении учебных практик студентов ФГБОУ ВПО «ИГУ»

Результаты исследований использованы в отчетах о НИР лаборатории водной токсикологии НИИ биологии ФБГОУ ВПО «ИГУ» по проекту РФФИ № 05-04-97237-Байкал-р (региональный); РФФИ-ГФЕН № 06-04-39003-ГФЕНа (РФ - КНР); ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»: ГК № 02.740.11.0018 от 15.06.2009 г.; ГК № 02.740.11.0335 от 07.07.2009 г.; ГК № 02.740.11.0418 от 30.09.2009 г.; ФЦП «Исследование и разработка по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 гг.»: ГК №

11.519.11.5016 (РФ-КНР) от 28.10.11 г. Материалы работы включены российско-китайской Комиссией по подготовке встреч глав правительств в Программу научно-технического сотрудничества № 12-35., 24.09.2008 г. «Экологическая безопасность оз. Байкал - р. Амур...».

Публикации: По теме диссертации опубликовано 24 работы, в том числе в журналах рекомендованных ВАК Минобразования РФ - 5 и получено 6 патентов на изобретение.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 147 страницах и состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 61 рисунком и содержит 12 таблиц. Список литературы включает 188 работ (101 отечественная и 87 зарубежных источника).

Личный вклад автора: Лабораторные исследования, анализ полученных данных, обобщение и интерпретация результатов, подготовка материалов для докладов и публикаций проведены лично или при определяющем вкладе автора. Работа проводилась в период 2003 - 2012 гг. на биолого-почвенном факультете и НИИ биологии ИГУ, в НИ «Иркутском государственном техническом университете», в Байкальском музее ИНЦ СО РАН.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Иммунная система дождевых червей

Среда обитания дождевых червей характеризуется повышенной агрессивностью. Это, во-первых, бактерии, грибы, живущие в почве, гнилостных субстратах, которые поглощаются при питании и проникают в организм при ранении. Паразиты, особенно личиночные формы, являются другой значимой группой потенциально болезнетворных агентов. Нередко дождевые черви участвуют в трансформации самых разнообразных отходов, в том числе токсичных. Но дождевые черви могут выживать в такой столь неблагоприятной для обитания среде, потому что в результате своей эволюции они развили эффективные механизмы защиты против различных неблагоприятных факторов.

Внутренний механизм устойчивости дождевых червей может быть подразделен н�