Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биотехнологических подходов к созданию медицинских диагностических тест-систем на основе твердофазного иммуноферментного анализа

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологических подходов к созданию медицинских диагностических тест-систем на основе твердофазного иммуноферментного анализа"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПО РАЗРАБОТКЕ И ВНЕДРЕНИЮ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

На правах рукописи

ВОРОНОВ Александр Васильевич УДК 577. 27: 57. 083. 3

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К СОЗДАНИЮ МЕДИЦИНСКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИТЗА

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1990

Работа выполнена в Научном центре по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики ЫЭ СССР.

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор Е. С. Северин

кандидат биологических наук Ю. 1й Венгеров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Е Е Ходарев

кандидат биологических наук а К. Сологуб

Ведущий орган иьация: Институт биохимии им. А. Е Баха АН СССР

Защита состоится " е20 " онл^виа^я 1990 г. в 1^~С'<иасов на васедании Специализированного совета при Научном центре по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики Ш СССР по адресу: 113149, 14зсква, Симферопольский б-р, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦЦД ЫЗ СССР.

. Автореферат разослан " " ко ,0ц $ 1990 г.

Учений секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

В Отраднова

ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема Бурное развитие методов иммунохимичес-кой диагностики в 1970-1980 гг. во многом связано с появлением различных видов иммуноферментного анализа (ИФА). ИФА значительно потеснил радиоиммунологический и другие иммунологические методы и начал внедряться в практику в широких масштабах, в том числе в СССР (Покровский В. И., Шабалина С. Е ,1989).

Наиболее важными областями применения твердофазного ИФА (тИФА) в медицине в настоящее время являются диагностика инфекционных заболеваний человека, выявление возбудителей в объектах . внешней среды, контроль банков крови и лекарственных препаратов. Более значимой становится роль тИФА в диагностике неинфекционных заболеваний человека, прежде всего в онкологии;, аллергологии и кардиологии, а также при оценке иммунного, биохимического и гормонального статусов (Егоров А. М. ,1988).

В связи с тем, что в настоящее время спектр объектов диагностики постоянно расширяется и имеется значительное отставание в производстве и внедрении в практику иммуноферментных (ИФ) тест-систем в СССР, весьма актуальным является вопрос разработки универсальных методических подходов к созданию ИФ диагностикумов.

Цель исследования. На ряде имеющих практическую ценность антигенов различного происхождения с использованием современных мо-лекулярно-биологических методов и биотехнологических приемов разработать общие подходы к созданию диагностических ИФ тест-систем.

Задачи исследования:

1. В применении к различным антигенам (таблица 1) исследовать эффективность и рациональность использования различных методов получения и очистки иммуноспецифических компонентов для проведения тИФА (антигенов, антител, ИФ конъюгатов) и разработать подходы к оценке их специфичности.

2. Разработать ИФ тест-системы для диагностики ряда инфекци энных и неинфекционных заболеваний человека, провести их расширен иую апробацию на клиническом материале и оценить возможности при «нения и перспективы внедрения.

Научная новизна проведенных исследований.

Разработаны ИФ тест-системы для выявления (IBsAg и антител и 1ему, антигена ротавирусов группы А, соматических О-антигенов шй ■елл зонне и флекснера II типа, определения уровня общего и специ жческого IgE, -микроглобулина и плацентарной щелочной фоофчтчян [еловека на основе различных схем тИФА.

Таблица 1

Краткая характеристика антигенов, избранных для разработки диагностических ИФ тест-систем.

Антиген (антитела к нему)

Диагносцируеше заболевания

Ссыжа на

литературный

источник

I. Вирусные антигены:

1. HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В)

2. Анти-НВзАя-антитела классов 6 и II человека'

3. Группоспецифический антиген ротавирусов,группы А

II. Бактериальные антигены:

1. Соматический О-антиген шигелл аонне

2. Соматический О-антиген шигелл флекснера II типа

III. Антигены человека:

1. Иммуноглобулины классов. G, М и А

2. Иммуноглобулин Е (общий и специфический)

3. ß 2-микроглобулин (бета-2-M)

4. Плацентарная палочная фосфатаза (ПЩФ)

Вирусный гепатит В

Жданов Е Ы. И др. (1986).

Ротавирусньге инфекции Esters M. К. человека и животных et al.(1979)

Дизентерия Зонне Дизентерия Флекснера

Хазенсон JLE Чайка Е А. (1987)

Иммунодефицитные состояния, гаммапатии и др. Атопические аллергические и паразитарные заболевания

Аутоиммунные и воспалительные заболевания Неопластические заболевания

Le ms-Van Kai et al. (1983' Адо А. Д. (1978)

Аметов A.C. и др. (1984) Pollöt D.E. et al. (1985;

Отработаны методы очистки иммуноспецифических компонентой (антигенов, антител) применительно к созданным ИФ тест-системам и предложены ИФ подходы к оценке их специфичности.

Разработаны методические подходы для применения бета-лактама-зы при создании ИФ тест-систем с возможностью визуальной регистрации результатов анализа. Разработан метод приготовления конъюгатов бетн лактамя-ш с антителами и антигенами.

Разработаны общие методические подходы к созданию лаборатор ых вариантов ИФ диагностикумов и внедрению их в клиническую прак ику в виде ИФ тест-наборов.

Практическая значимость работы.

На основе методов и подходов тИФА созданы тест-системы, имею щие практическую ценность для диагностики ряда инфекционных и неинфекционных заболеваний человека.

Проведена клиническая апробация созданных ИФ тест-систем. Исследована чувствительность и специфичность разработанных тест-систем в сравнении с коммерческими диагностикумами.

Разработанная методология наработки препаратов поликлональных антител к бактериальным антигенам с помощью аффинной хроматографии может быть использована для создания иммунодиагностикумов, предназначенных для определения бактериальных антигенов. Предложенные методы получения иммуноспецифических компонентов позволяют опти- -мально решить проблему выбора схемы определения антигенов с требуемой степенью чувствительности и специфичности, обусловленной клиническими задачами.

Разработанная методика синтеза конъюгатов антител и антигенов с бета-лактамазой на основе периодатного метода перспективна для создания ИФ тест-систем с визуальным учетом результатов тИФА.

Внедрение результатов работы.

№ результатам работы составлено и утверждено 22.05.1989 г. Фармакопейным комитетом ЫЗ СССР изменение N3 к ВФС 42-24ВС-86 "Тест-система иммуноферментная для определения НВз-антигена", утверждены 31.12.1987 г. Госагропромом СССР "Технические условия производства диагностических иммуноферментных тест-систем для детекции шигелл зонне и флекснера". ИФ набор для диагностики ротави-русной инфекции утвержден 12.07.1990 г. Комитетом МИБП для проведения государственных испытаний.

ИФ наборы для определения О-антигенов шигелл были использова-вы для диагностики дизентерии в клинических учреждениях городов Мэсквы, Уссурийска, Тюмени, Рудного и Ашхабада ИФ тест-система для определения уровней обшэго и специфического 1вЕ человека была внедрена в клиническую практику НИИ педиатрии АМН СССР и городской клинической больницы N 60 г. Мэсквы. Положительные отзывы о ревуль татах клинического использования ИФ набора для выявления НВйА? бы ли получены из клинической больницы N6 и I инфекционной больницы г. Мэсквы. областной СЭС г. Калининграда.

Апробация работы.

Результаты проведенных исследований и отдельные фрагменты доложены и обсуждены на заседании Московского научного общества инфекционистов (1987 г.), Всесоюзном семинаре "Иммуномодуляторы и их значение в инфекционной и неинфекционной патологии (Москва, 1987 г.) Международном симпозиуме "Advances in enzyme regulation" (Индиана-полис, США, 1987 г.), VI Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимо-логия" (Вильнюс, 1988 г.), III Всероссийском съезде инфекционистов (Москва-Смоленск, 1989 г.), 19-ом конгрессе FEBS (Рим, Италия, 1989).

В завершенном виде диссертационная работа апробирована 25 октября 1990 г. на конференции отдела экологии и диагностики Научного центра по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики МЗ СССР.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, •грех глав обзора литературы, трех глав изложения собственных исследований и их результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на IH9 страницах машинописного текста, содержит ¿5 таблиц и 18 рисунков. Библиография включает 190 литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ Ii МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Методы получения очищенных препаратов антигенов.

Очистка HBsAg. HBsAg из сыворотки серопозитивных доноров получали по методу а А. Ананьева.

Очистка ротавируса обезьян, штамм SA-11. Препарат ротавируса выделяли из культуральной жидкости зараженной вирусом культуры клеток гетероплоидной линии почки взрослой обезьяны 4647.

Очистка О-антигенов энтеробактерий. Препараты О-антигенов (О-Аг) Shigella sonnel, Sh. flexneri 2a и Salmonella typhimurlum получали водно-фенольной экстракцией по методу Westphal 0.(1965).

Очистка иммуноглобулинов класса G, А и М человека IgG и IgA выделяли методом ионообменной хроматографии на целлюлозе ДЭ-52 (Whatman, Великобритания), IgM получали ионообменной хроматографией на целлюлозе ДЭ-52 с последующей гель-фильтрацией на колонке с Сефакрил S-200 (Pharmacia, Швеция) из сыворотки крови по методу *атонаЖ.К, и соавт. (1981).

Очистка бета-Z М человека. Бета-2-M получали ив белковой

фракции мочи больных системной красной волчанкой осаждением 55 ным насыщенным раствором сульфата аммония с последующей гель-филь трацией на колонке с Сефакрил S-200. '

Очистку термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы чело вена (Ш№) проводили по методу Harkness D. R. (1968). Методы иммунизации экспериментальных животных и получения антител.

Для иммунизации использовали беспородных кроликов обоих полов в возрасте от 6 до 12 месяцев в количестве 2-5 животных на каждый иммуноген. Для получения антисывороток применяли схемы иммунизации, предложенные Амброзиусом X(1987), Vaitukaitis J. (1981). Ас-цитические жидкости (А® получали от сенсибилизированных пристаном мышей линии Balb/c по стандартным методикам.

Использованные в работе клоны гибридом к HBsAg были предоставлены A.A. Кущ (ИВ им. Д.И.Ивановского АМН СССР), клоны гибридом к группоспецифической антигенной детерминанте ротавирусов группы А были получены от Т.Е Вуларгиной (МГУ им. М.В. Ломоносова).

Биохимические методы исследований.

Гамма-глобулиновую фракцию гипериммунных антисывороток и АЖ выделяли методом трехкратного осаждения насыщенным раствором (NHvbSOv по методу Kekwick R. А. (1940). IgG-фракцию кроличьих и ослиных антиеывороток получали методами аффинной хроматографии Há протеин А-сефарозе CL 4В (Pharmacia, Швеция) или ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Сефацеле (Pharmacia) в соответствии с процедурами, описанными в работах Hjelm Н. (1972), Ishikawä Е, (1983), Cortier а(1984) et al. IgG-фракцию AS получали ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-Сефацеле или методом осаждения каприловой кислотой (Serva) и сульфатом аммония по методам Neoh S.H. (1986), Reik L.M. et al. (1987).

В качестве ферментов-маркеров применяли пероксидаву хрена (НПО "Биолар", г. Олайне), щелочную фосфатазу ив тонких кишок теленка (Serva, ФРГ) и бета-лактвмазу ив Bacillus licheniformis 749/0 (Московский экспериментальный завод ВНИИ антибиотиков).

Коньюгаты антител и протеина А с пероксидазой получали соответственно методом периодатного окисления по Wilson М.В., Naka-ne P.K.(1978) и пиридил дисульфидным методом по Surolla А., Pain П. (1983); коньюгаты. с щелочной фосфатазой и бета-лактамявой - одно ступенчатым глутаральдегидным методом по Avrameas S. (1969).

Изоэлектрофо'кусирование проводили на колонке с фврмгдитами или пластинках с сервалитами с диапазоном pH ?.<М0.0 im природ

"Miltiphor" фирмы "LKB" по методу Hall P. W., Rícanatí Б. S., Vacca V. (1977).

Аналитический диск-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) проводили в системе Laem-mil U.К.(1970). Пгренос белков из ПААГ на нитроцеллюлозный фильтр осуществляли по методу Tovbin Н. et al. (1979) с модификациями.

Иммунохимические методы исследований.

Аффинные сорбенты готовили на основе CNBr-активированной се-фарозы 4В и эпоксиактивированной сефарозы 6В (Pharmacia) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

Природный и рекомбинантный осповакцинный HBsA? (субтип "ad") выделяли на иммуносорбенте с моноклональными антителами к HBsAg по методу Симонова В. И. и соавт. (1987) в модификации. * Источниками KBsAff соответственно служили плазма крови больного вирусным гепатитом В и сульфатаммонийная фракция кулътуральной жидкости клеток линии CV-1, зараженных рекомбинантным штаммом вируса осповакцины HBsl, содержащим ген HBsAg. Генноинженерный материал был предоставлен Гибадулиным P.A. (ИВ им. Д.И. Ивановского АМН СССР).

Локализацию О-Аг шигелл проводили на ультратонких криосрезах микробных клеток с помощью комплекса коллоидного золота с протеином А по методу Beesley J. Е. ©t al. (1982).

Выявление ПЩФ на криостатных срезах плаценты и опухолевых тканей осуществляли непряыьш иымунофлуоресцентным и имуноперокси-дазным методами по Coons А. Н., Kaplan М. Н. (1950) и Mason D. Y., Saraons R. E. (1978).

Различные варианты тИФА (двойной прямой антительный "сэнд-вич"-ДАС, непрямой тИФА-тест, конкурентные и неконкурентные тести) ставили по методам Guosdon J. L.. Avraraas S. (1981), Tijsson P. (1985) с кодификациями на Об-луночных планшетах производства Dyna-tech (Швейцария), Titcrtek (ФРГ) и псковского НИИ ыэдтехнкки. В качестве хромогенов для определения энзиматической активности ферментов использовали: для пероксидааы - о-феимлондиамин Uíorck, ФРГ); для Е&лочной фосфатазы - п-нитрофенилфосфат (Мэгск); для бе-та-лактамазы - иодинол (Борисовский химфармзавод), содержаний калиевую соль бэкзилпеницилина. Результаты тИЗА регистрировали на фотометре "Multiskan" при длинах волн 492, 405 и 624 нм соответственно для трех ферментов.

Доведение тИФА на нитроцеллшозных фильтрах осуществляли по методу Tsan? V.C.W, et al. (1983) в модификации.

7 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и характеристика иммуноспецифических компонентов для проведения тИФА.

1.1. Шлучение очищенных препаратов антигенов.

Наработка препаратов антигенов САГ) различной природы является в настоящее время важной биотехнологической задачей. Для получения очищенных препаратов АГ был использован ряд традиционных вирусологических (очистка НВзАг и ротавирусного антигена), бактериологических (очистка О-Аг шигелл и сальмонелл) и биохимических (выделение иммуноглобулинов, бета-2-М и ПЩФ человека) методов, выбор которых определялся природой, физико-химическими свойствами самих антигенов и задачами исследования.

Цри создании ИФ тест-систем для определения ПЩФ, бета-2-М и анти-НВзАг и 1кМ человека применяли специальные методы получения АГ, что обусловлено трудностями эффективной их очистки традиционными способами.

ПЩФ выделяли из экстракта плаценты с использованием на завершающей стадии препаративной колонки для изоэлектрофокусирования (ИЭФ), Результаты ИЭФ представлены на рис. 1.

Основной пик профиля ферментативной активности полученного электрофоретически гомогенного препарата ПЩф совпадал с пиком кривой концентрации белка Значение р1 составило 4,6, значение удельной активности - 500 Е/мг. Высокая степень очистки препарата позволила использовать его для получения моноспецифических гипериммунных сывороток и приготовления антигенных конъюгатов.

При разработке ИФ тест-систем для определения антител классов 18(3 и 1«М к НВвАг и детекции бета-2-М для выделения АГ использовали способ аффинной очистки: 1) природного и рекомбинантного НВэАг на иммуносорбентах с иммобилизованной 1?(5-фракцией моноклональных (МКА) антител к НВзАг, клон ЖАК 22, и 2) бета-2-М человека на им-муносорбеяте с аффинно очищенными кроличьими поликлональными (ГОД) антителами.

Исходная концентрация природного НВэАг, определенная с помощью ИФ тест-системы для детекции НВвАг, составила 16±0,1 мкг/мл, рекомбинантного осповакцинного НВэАг - 5±0,1 мкг/мл. Результаты иммуноаффинной очистки НВэАг представлены в таблице 2.

В результате процедур иммуноаффинной очистки был получен эле итрофоретически гомогенный препарат, содержащий нВэАг в димерной (49 кД) и мономерной формах (25 и 30 кД), что согласуется о литр-

номер фракции

Рис. 1. Очистка ПЩф методом препаративного иэоэлектрофокуси-рования: (о) - ферментативная активность Шф, (ф) - общий белок, (о) - значения рН. ратурными данными (Козловская Т.Н. Пушен П. П. .1986). Таким образом, применение аффинного иммуносорбента позволило очистить природный и рекомбинантный HBsAg в 3500-4500 раз. Очинённые препараты НВзАг сохраняли антигенную активность и были пригодны для создания Ш тест-систем для выявления аяти-HBsA? IgG и IgM и определения титров AS, содеркагцкх МКА к HBsAg.

Гфи проведении аффинной очистки бета-2-Ы на ПКА-нмууносорбен-те выход гомогенного бета-2-И составил 0,1-0,13 мг из 1 л «очи; при гель-хроматографической очистке он был ншш: 0,03-0.05 мг из 1 л при одинаковой исходной концентрации. Гомогенность аффинно очищенного препарата бета-2-Ы была подтверждена методом И35, результаты которого представлены на рис. 2. Значение pl препарата составило 5,7, что соответствует значению pl для бета-2-М человека (Hall Р. W. et al. ,1977). Сохранение антигенной активности препаратом позволило использовать его для иммобилизации твердой фазы при ИФ определении Оета 2-М (глава 2.2).

Таблица г

Шмунохимическке параметры очистки НВэА? при использовании афишного иммуносорбента

N Источ- Элюирую- Количест- Количест- Отношение Степень

ник ВДЙ во HBsAg, во НВэАг, антигенной очистки

НВзАг раствор нанесен- злюиро- активности за одну

ного на ванного элтта к стадию*

колонку, с колон- исходной. а'

а тШ ки, в ТШ В ТИФА а

(мкг) (ыкг) (X)

1.

Плазма 0,2 М НаНСОз 22511,5 КРОВИ 0,5 М НН<,ОН 225*1,5 2. Клетки 0,2 М КаНООз 7541,5 СУ-1 0,5 М МК^ОН 75+1,5 * а я а' - количества НВэАг в пересчете на 1 мг белка антигев-содертаиэго материала до (а) и после (а') очистки.

17041,Б 153±1,5 5241,5 46±1,5

76 68 69 61

4200 3730 4810 4520

I ~

■ .1

рй

3

4

5

6

7

8

9

10

Рис. 2. И809лектрофо1сусирование препарата бета-2 -М человека, полученного методом аффинной хроматографии: по оси справа - значения рН в градиенте сервадитоя. I - по.ч'к а. соответетвувдая бета- ?-М.

Таким образом, способ очистки АГ с использованием аффинных иммуносорбентов является перспективным методическим подходом, который в сравнении с традиционными вирусологическими, бактериологическими и биохимическими методами менее дорог и трудоемок и позволяет применять иммуносорбенты на основе как ПКА, так и МКА. Наиболее привлекательным представляется применение иммуносорбентов на основе МКА, т. к. они удобны для биотехнологических производств вследствие гомогенности МКА по специфичности и аффинитету, возможностей наработки МКА в большом количестве и получения препаратов АГ с минимальным содержанием контаминируадих примесей.

1.2. Получение и характеристика препаратов антител.

1.2.1. Характеристика полученных иммуноматериалов методами тИФА.

Получение очищенных препаратов антител (AT) является наиболее ответственной стадией создания ИФ тест-систем. При этом определяющее влияние на чувствительность и специфичность анализа оказывает специфичность AT и их способность связывать антиген (аффинитет и авидность).

Основным экспериментально определяемым параметром, позволяющим предварительно оценить качество гипериммунных антисывороток или АЖ, является титр специфических антител. Для определения титров сывороток и АЖ в работе использовали непрямой тИФА-тест по Voller А. (1976) в модификации.

Для получения антисывороток применяли две основные схемы иммунизации. Данные о титрах гипериммунных сывороток суммированы в таблице 3.

При одной и тедже схеме иммунизации титры полученных антиса-вороток зависели в основном от природы антигена - его иммуноген-ных, физико-химических и биологических свойств и степени чистоты препарата Условно для определенной схемы иммунизации можно разделить антигены на две группы: 1) антигены, к которым были получены сыворотки с титрами 10^-10е("сильные" иммуногены - иммуноглобулины, ПЩФ, ротавирусный антиген) и 2) антигены, титр сывороток к которым составил Ю^-Ю^ "слабые" иммуногены - О-антигены шигелл, обладающие свойствами эндотоксинов, аллерген домашней пыли и бета-2-Ю. Следует отметить, что критическим значением титра антисыворотки в тИФА является, видимо, уровень 10^-2-10 , т. к. на антителах из сывороток с более низкими титрами стандартными способами (выделение гамма-глобулиновой и IgG-фракций) соэдать ИФ тест-системы нам не удавалось.

Таблица 3

Результаты титрования кроличьих гипериммунных антисывороток к различным антигенам в непрямом тИФА-тесте.

N Антигены Схема Среднее значение

иммунизации* титров антисыворотки

I. Бактериальные антигены: N 2 1:4,5-ю''

1. Соматический О-Аг шигелл зонне

2. Соматический О-Аг шигелл N2 1:4-10<' флекснера II типа

II. Ротавирусный антиген N 1 1:7,5-10^

III. Аллерген домашней пыли N2 1:1,1-10^

IV. Антигены человека:

б

1. Тяжелые цепи N 1 1:2,1-10

2. Тяжелые цепи 1вМ N 1 1:2-106

3. Тяжелые цепи 1вА N 1 1.-1.7-106

4. бета-2-Ы N 1 1:3,8-10*

5. ПЩФ ' N 1 1:1-10®

* - схема N 1 - комбинированная схема иммунизации: инокуляция малых доз иммуногена в лимфоузел и множественная подкожная инъекция; схема N2 - схема внутривенной инъекции.

Результаты титрования АН, содержащих МКА разных специфичнос-тей, приведены в таблице 4.

■ Из приведенных данных следует, что титры АЖ находились в диапазоне 10 -10е. Продукцию МКА оценивали после выделения 1дО-фракции АТ из соответствующей АН. Низкий аффинитет ЫКА, полученных из АЖ с титрами около 10е, ногат препятствовать создан™ чувствительной ЙФ системы, поэтому для отбора клонов гибридом, продуцирующих пригодные для этой цели НКА, использовали подход, заключающийся в сравнительном исследовании чувствительности тест-систем, созданных на основе ЫКА различных клонов.

На основании'полученных результатов при разработке ИФ тест-систем для выявления НВзАд и ротавирусного АГ были соответственна отобраны МКА, продуцируете клонами ЙАК 22 и С 10.

Таблица 4

Иммунохимические характеристики асцитических жидкостей, содержащих ЫКА различных специфичностей.

N Антигены Клон Группа Среднее Продукция Максимальная

гибридош конку- значение MRA чувствительность ренции титров AB (мг на № тест-систем 1 мл А® на основе ЫКА в ДАС-методе (нг/мл)

I. Вирусные антигены: с

1. HBsAg ЯАК 11 1 1:10 10,3 • 5

КАК 12 2 1:10* 5,8 15

КАК 22 1 l:S'iOS 8,5 3

КАК 23 1 1:10* 11,0 10

2. Ротавирус- С 10 нет 1:106 6,1 1

ный аити- D 10 нет 1:8-10* 6,8 3

ген F 3 нет 1:5-10* 5,3 5

1.2.2. Исследование эффективности методов получения очищэнных препаратов антител для использования в тИФА.

При разработке W тест-систем с целью достижения высокой чувствительности и специфичности проводят очистку полученных иммуно-материалов различными метода^! для выделения фракции специфических АТ а освобождения от прикесей. Параметром, определяющим необходимую степень очистки ПКА, видш>, шжно счшать значение титра ги-пераыыунных сывороток. Для сшороток с титрами 1:2-Ю5 и выше в ряде случаоа достаточно выделение raicea-глобулшовой фракции с помощью (NHi,)2SOi< для последующей ишэбидизации антнтел и приготовления И® конъиогатоп. При болоо низких тиграх необходимо выделение Igü-фракции антител хроиатографическими или hhuici изтодаци.

С позиций технологичности представляло интерос исследовать зффогаишгость выделения специфических IqB из кроличьих шшко- (ан-тисывороткп к О-Аг Щ11ГСЛЛ эош1з) и высокотитражиых антнсывороток (к ПЩФ) различными хроштографяческиш! методами. Препараты IgG получали из гамма- глобуллновой фракции методами ионообменной хроматографии на ЯЭЛЭ--Сефацело (l-fi ыетод); аффинной хроматографии на

протеин А-сефарозе (2-й метод): аффинном сорбенте с иммобилизованными козьими АТ против кролика (3-й метод) и аффинных носителях с ковалентно связанным АГ (4-й метод), приготовленными на основе СЫВг- и эпоксиакгивированной сефарозы. Электрофоретический анализ полученных препаратов 1е(3 показал их гомогенность и соответствие по подвижности в геле стандартному препарату 1еС кролика. Непрямым тИФА-тестом и ДАС-методом в препаратах оценивали общее количество количество специфических к АГ антител по отношению к общему (%), а также чувствительность ИФ тест-систем, созданных на их основе.

Анализ результатов эксперимента показал, что наибольшее количество специфических антител присутствует в препаратах, очищенных методом аффинной хроматографии на сорбенте с соответствующим иммобилизованным АГ (97,8 и 92,5 % для АТ к ПЩЕ> и О-Аг шигелл соответственно) ; хорошие результаты для антисывороток с высокими титрами против ПЩ® дает ионообменная хроматография на ДЭАЭ-Сефацеле (72,9 X) и аффинная хроматография на протеин А-сефарозе (39,6 X). Чувствительность ИФ тест-систем для детекции ЩФ на основе выделенных 1-м и 2-м методами составила 3-10 нг/мл (ДАС-метод) или 0,1-0,2 Е/мл (эндогенный тест); 4-м (аффинная хроматография) -1 нг/мл или 0,036 Е/мл соответственно.

В случае антисывороток с низкими титрами против о-Аг шигелл вонне лучше результаты были получены только при помощи метода аффинной хроматографии на сефарозном носителе с иммобилизованным О-Аг.

11а рис. 3 представлены калибровочные кривые титрования О-Аг шигелл зонне, полученные с помощью И® тест-систем, разработанных на основе антител, выделенных методами 1 (кривая 2), 4 (кривая 3) и сульфатаммонийным (кривая 1). ИФ тест-счстема на аффинно выделенных антителах обладала лучшими характеристиками: чувствительность составила 0,5-1 иг О-Аг в 1 мл, линейный характер зависимости оптической плотности (ОП) продукта ферментативной реакции от концентрации О-Аг был получен в широком интервале от 3 до 200 нг/мл, отрицательный контрольный образец имел значения ОП ниже 0,1, перекрестные реакции с гетерологичпыми О-Аг были минимальны (рис. 3, кривая 1 - кривая титрования О-Аг шигелл флекснера 2а в ИФ системе на основе аффинно очищенных АТ к О-Аг шигелл аонне).

Рис. 3. Калибровочные кривые титрования О-Аг, полученные с

помощью ИФ тест-систем: по оси абсцисс - концентрация О-Аг шгелл эонне (нг/ш), по оси ординат - значения ОП при длине волны 492 лм, Аналогичный методический подход был применен для оценки чувствительности ИФ тест-систем для выявления НйзАг на основе йрелара-тов ЫКА ЖАК 22 (субкласс 1дШ), выделенных из АК методами осаждения сульфатом аммония, осаждения каприловой кислотой и (Ш<,)2!50<,и хроматографии: аффинной на протеин А-еефарозе и на сефарозном носителе с иммобилизованным ИВбАй. Цри проведении ДАС-метода применяли пероксидазный конъюгат гамма-глобулиновой фракции АЕ (КАК 22) в оптимальном для каждого типа препаратов ЫКА разведении. Из результатов следовало, что наиболее эффективными оказались методы выделения 1в<5-фракции АЕ осаждением каприловой кислотой и аффинной хроматографии (чувствительность систем 2 и 1 нг/мл соответственно). Сульфат-аммонийный метод не позволял очистить препарат ША от белковых примесей, что снижало чувствительность анализа. Ис-

пользование препаратов ЫКА, полученных методами ионообменной и аффинной хроматографии на сорбентах с ковадентно связанным АГ дает возможность увеличить чувствительность тест-системы для выявления HBsAg до 0,5-1 иг/мл, однако эти методы многостадийны, трудоемки и в случае недостаточной стабильности ЫКА существует опасность потери активности антител при злюции. Кроме того, указанные методы имеют ограниченное применение при переходе к промышленным масштабам наработки ЫКА.

Таким образом, основными критериями выбора той или иной схемы выделения антител можно считать значения титра в непрямом тИФА полученных иммуноматериалов, количество специфических AT в препарате иммуноглобулинов и чувствительность тест-систем, созданных на их основе. Описанные выше методические подходы могут быть использованы для оценки эффективности методов получения препаратов антител для целей тИФА.

1.2.3. Исследование и контроль специфичности препаратов поли- и моноклональных антител.

Специфичность антител, используемых при разработке ИФ тест-систем, является характеристикой, которая в свою очередь обусловливает специфичность создаваемого ИФ теста. При изучении специфичности антител определяющими являются такие параметры, как моно- и полиспецифичность в отношении иммуногена и его компонентов, наличие или отсутствие перекрестных реакций с близкородственными антигенами и т. д. Необходимая степень специфичности AT обусловлена целями определения, выбор методов исследования специфичности антител зависит от особенностей используемых ПКА или ЫКА.

Исследование специфичности полученных препаратов ПКА и ЫКА проводили с помощью непрямого теста, конкурентного метода тИФА и иммуноблоттинга с соответствующими АГ. фи разработке ИФ тест-систем для количественного определения О-Аг шигелл зонне и флекснера вопрос специфичности ПКА стоял особенно остро вследствие необходимости создания специфичных, дифференцированных тестов, что довольно сложно из-за наличия большого количества блиакородственных се-ротипов у энтеробактерий рода Shigella. Для оценки специфичности IgG-фракций полученных антисывороток был предложен подход, заключающийся з изучении возможности конкурирования между О-Аг Sh. sonne1, flexneri 2а и S. tuphlmurium, иммобилизованными на твердой фаве я находящимися в растворе, при связывании с соответствующими антителами в конкурентном тесте. Было получено, что О-Аг

шигелл флекснера 2а в концентрации 10-40 мкг/мл ингибировал связы- • вание против О-Аг шигелл зонне с гомологичным АГ. С О-Аг Б. ЬЬурЬШтиПиш конкуренции не наблюдалось. Аналогичные результаты были получены при тестировании № против О-Аг шигелл флекснера и подтверждены методом иммуноблоттинга с соответствующими О-Аг. Этот факт свидетельствовал о гетероспецифичности антисывороток к О-Аг и их Ггб-фракций, что объясняется особенностями химического строения липополисахаридов (ЛПС) шигелл ( ЫйегИг 0. е1 а1. ,1982). Для получения моноспецифичного препарата ДО был использован метод аффинной хроматографии, представляющийся более универсальным подходом вследствие возможности получения препаратов специфических антител без перекрестных реакций в указанных выше тестах и элиминирования контаминирующих иммунных и неиммунных примесей (рис. 3, кривые з и 4).

Другим подходом к оценке специфичности антител, например, к клеточным антигенам, являются иммуногистохимические методы. Специфичность аффинно очищенных антител к О-Аг шигелл зонне анализировали методом иммунозлектронной микроскопии с использованием протеина А, меченного коллоидным золотом. Частицы коллоидного золота были расположены на внешней мембране микробных клеток круглых форм шигелл в местах локализации О-специфических цепей Ж) - О-антигенов (рис. 5, указано стрелками).

Рис. Г'. Клетки круглых Форм шигелл зонне после инкубации с

аффинно очищенными 1КА к 0-Аг и последующей обработка конъюгатом коллоидного р о лота е белком А, х 60 ООО.

Аффинно очищенные АТ к ПЩФ применяли для локализации АГ на препаратах срезов плаценты и ряда опухолевых тканей методами имму-нофлуоресценции и иммунопероксидазного окрашивания. На препаратах плаценты иммунофлуоресценция наблюдалась на внешней поверхности плазматической мембраны клеток микроворсинок', что соответствует изученной локализации фермента в синцитиотрофобласте плаценты (ЕепЗекепз М, V/. еЪ а1. ,1985). Таким образом, полученные препараты специфичных к О-Аг и ПЩф антител могут быть использованы не только для целей ИФ диагностики, но и для проведения исследований по локализации антигенов 1п я^и.

1.3. Получение и характеристика иммуноферментных конъюгатов.

Наряду с традиционно применяемыми в тИФА конъюгатами с перо-ксидазой хрена, щелочной фосфатазой в работе использовали конъюгаты иммуноспецифйческих компонентов с бета- лактамазой.

Фермент бактериального происхождения, бета-лактамаза, гидро-лизующая р-лактамное кольцо пенициллинов и цефалоспоринов, является защитным ферментом и поэтому не имеет прямых аналогов и эндогенных субстратов в организме теплокровных животных (Леви М.И. и др., 1985). Другими преимуществами применения бета-лактамазы в тИФА являются высокая стабильность и удельная активность по отношению к бензил-пенициллину и возможность визуальной регистрации результатов анализа.

Разработку методических подходов к получению бета-лактамаэных конъюгатов проводили в двух направлениях: синтез конъюгатов фермента с антителами и антигенами. Для приготовления конъюгатов с антителами был предложен метод периодатноге окисления полисахарид-яих носителей (фиколл 400, декстраны), с альдегидными форма»® которых затем по аминогруппам связывали антитела и бета-лактамаау. Было проведено сравнительное исследование иммунологической актив-кости пероксидазного и бета-лактамэаных конъюгатов с АТ против 1дб н 1&М человека, приготовленных различными методами. Из анализа результатов следовало, что предложенный метод позволяет получать бета- лактамазные конъюгаты, близкие по иммунохимическим характеристикам к иммунопероксидазным конъюгатам, синтезируемым классическим периодатным методом (рабочее разведение 1:2500, 1:5000 соответст-вено для обоих ферментов), и значительно превосходит качественные показатели одноступенчатого глутаральдегидного способа. Неспецифическое связывание полученных таким методом конъюгатов оказалось зущественно ниже, чем у иероксидазных, что обусловлено высокой, мо-

.пекулярной массой молекул конъюгата фиколл-антитела-бета-лактамаэ (800-1200 кД). Синтезированный описанным способом конъюгат МКА Ш 22 с бета-лактамазой был использован при разработке ИФ тест-систе мы для выявления ИВбАй.

Для бесприборной регистрации результатов ИФА был также разра ботан конкурентный метод определения О-Аг шигелл с использование» конъюгата О-Аг с бета-лакгамазой, приготовленного на основе перис датного метода путем окисления препаратов О-Аг ИзДО*,. Чувствител* ность выявления О-Аг в тест-системе на основе аффинно выделенных антител и бета-лактамазного конъюгата была равной чувствительное! теста с использованием конъюгата тех же АТ с пероксидазой и состг вил$ 0,5-1 нг/мл.

2. Оптимизация условий проведения тИФА и клиническая апробация разработанных ИФ тест-систем и наборов.

2.1. Выбор иммуноферментной схемы определения и оптимизация условий ее проведения.

При оптимизации методов тИФА избирали соответствующую ИФ сх< му определения, исходя из конкретной задачи и условий определена характеристики определяемого вещества и полученных иммуноспецифи ческих компонентов. Решающее влияние на выбор схемы тИФА оказыва также задачи адаптации разрабатываемых тест-систем к условиям ма сового производства и быстрого внедрения экспрессных и простых в постановке диагностических тестов.

При разработке каждого ИФ метода проводили оптимизацию уел вий проведения ИФ реакции, заключающуюся в экспериментальном выб ре значений параметров реакции, обеспечивающих необходимую степе чувствительности и специфичности теста Было показано, что оптимальные значения чувствительности и специфичности ИФ тест-систе* для выявления НВзАе и ротавирусного АГ достигаются при использог нии схемы гетерологичного ДАС-метода на основе соответствующих 1г<3-фракций ПКА и ЫКА клонов КАК 22 и С 10.

Сопоставление ИФ схем определения антигенов и антител выяв; ет одинаковые закономерности их реализации, заключающиеся в про! дении определенных этапов реакции и использовании иммуноспецифи-ческих и неспецифических (компоненты опорного буфера для стадии сорбции, детергент, компоненты промывочного и буферного растворг для разведения образцов и конъюгата, субстратного раствора) инг] диентов. Для решения задачи массового производства ИФ напоров б! разработан унифицированный комплект неспецифических компонентов

его позволило, с одной стороны, реализовать возможность проведения ИФА в любой лаборатории при минимуме оборудования, а с другой -юаыожность быстро переключать производство с одной тест-системы (а другую, т. к. при этом меняется в основном только специфическая всть.

2.'2. Создание и апробация иммуноферментных тест-систем и наборов для диагностики ряда инфекционных и неинфекционных заболеваний человека.

Разработанные методические подходы были применены при создали ЙФ тест-систем для диагностики различных заболеваний человека. 3 качестве основных подходов к оценке специфичности созданных ИФ гест-систем рассматривали исследование специфичности применяемых антител и данные клинической апробации тест-систем при массовом испытании биологического материала в сравнении с результатами других серологических или иных тестов. В связи с этим, каждая разработанная ИФ тест-система была апробирована на клиническом материале. Проводили также сравнение результатов ИФА, полученных в созданных тест-системах, с результатами исследования аналогичного материала коммерческими гшмуйодаагностнкуыами. Для выявления вирусных, баотериальных и ряда антигенов человека применяли схему ЛАС на основе ЯНА, использовавшихся для сорбции планшетов, и ККА или ПКЛ в составе ® шпагата и конкурентный тест; для определения антитез - непрямой тйФА-тест. Кроме того, для определения специфической фер^нтатиэной активности ЩФ был предложен эндогенный тест, проводой&й в 3 стадии; сорбция* аЗфинно очищенных ПКА. внесение исслодуемых и контрольных образцов и внесение субстатного раствора. Основные иамувохимические характеристики разработанных КЭ тест-систем представлены в таблщэ б.

При создании ксьзшксной I© тест-системы для выявления серологических царкороз вирусного гепатита В использовали взаимно дополняющие друг друга ссриая-хн тИ^Л, направленные на детекцию в пробах КВзАг с использованием пороксцвазного и бета-лактаказного конъззгатов и обиаругэзш© антител ¡охассоз и 1вМ к НВвАд. Детек-Ш!я КБзАз позволяет выявить вирусокосителей, в то время как определение шгпггел делает возможным оценить реакцию иммунной систеш оргшп«л.?а на Контакт с вирусом, что обусловливает диагностическую ценность обоих тестов.

Таблица 6

Краткая иммунохимическая характеристика разработанных ИФ тест-систем и наборов.

N Название ИФ тест-системы

Принцип ИФ определения

Чувствительность

1.

2.

3. -

4. -

6.

7.

8.

- для выявления НВэАд ' (ИФ набор)

- для определения анти-нвзАг 1гв и 1еМ для выявления антигена 'ротавирусов группы А (ИФ набор)

количественного определения О-Аг шигелл зонне (ИФ набор)

количественного определения О-Аг шигелл флек-снера II типа (ИФ набор) количественного определения ПЩФ

Гетерологичный ДАС- 1-3 нг/мд метод (ПКА*/МКА) Непрямой тИФА-тест (аффинно очищенный АГ) Гетерологичный ДАС- 1 HrjMfi метод (ПКА/МКА)

Гомологичный ДАС-метод (аффинно очищенные ПКА) То же

0,6-1 нг/ыл

1 нг/мл

1 нг/мл

а) Гомологичный ДАС-метод (аффинно очищенные ПКА)

б) Эндогенный тест 0,036 Е/л Гомологичный ДАС- 0,15 ЫЕ/мл метод (1еО- фракция (0,3 нг/мл) ПКА)

Конкурентный тИФА 50 нг/ыл (аффинно очищенные ПКА и АГ)

фракция коммерческой анти-НВзАд ослиной сыворотки произ-

количественного определения общего IgE

количественного определения бета-2-M

водства Ташкентского НИИ гематологии и переливания крови.

Сравнение результатов анализа 6393 донорских сывороток, полученных методами тИФА на основе ПКА/МКА, ВИЭФ и РПГА показало, что разработанный специфичный ИФ тест для выявления HBsAsr вследствие более высокой чувствительности позволил вдавить 119 HBsAg-содержащих проб, что в 3 раза больше, чем ГПГА и в 10 pan больше, чем ВИЭФ.

5

При клинической алрооации ИФ набора для выявления антигена . ротавирусов группы А исследовали различными методами (электронная микроскопия, тИФА) 58 образцов суспенвии фекалий. Совпадение результатов анализа для положительных образцов в разработанном наборе в сравнении с коммерческими ИФ тест-систеМами было получено в 92,9 % случаев.

С целью диагностики распространенных бактериальных заболеваний - дизентерии Зонне и вяеюзнера - были разработаны ИФ тест-системы для определения О-Аг и микробных клеток шигелл на основе аффинно выделенных АТ и пероксидааы и бета-лактамазы в качестве ферментов-маркеров. В результате клинической апробации диагностикумов было установлено, что концентрация соматических 0-антигенов шигелл, определяемая в сыворотке крови и моче больных дизентерией, в первые дни болезни вависит от тяжести и клинического варианта течения заболевания.

для детекции ПЩФ человека были разработаны два типа ИФ систем. Тест-система первого типа на основе ДАС-метода предназначена для количественного определения ПЩф в биологических жидкостях. ИФ система второго типа, разработанная как эндогенный тест, служит для определения специфической фосфатазной активности ПЩФ и по данным клинической апробации может бьггь использована для экспресс-диагностики ряда неопластических заболеваний, скрининга и мониторинга онкологических больных. С помощью разработанных тестов возможно определять в исследуемом образце наличие ПШФ, получать информацию о ферментативной активности (в Е/л), концентрации (в нг/мл) и, исходя из этих данных, рассчитывать удельную ферментативную активность Ш№ (в Е/мг).

Клиническая апробация разработанных ИФ тест-систем для определения уровней общего и специфического к аллергену домашней пыли 1кЕ человека показала, что созданные диагностикумы не уступали по чувствительности и воспроизводимости коммерческим тест-системам и давали сравнимые результаты при высокой чувствительности детекции.

Разработанный конкурентный ИФ тест для детекции бета-2-М в '.ыворотке крови на основе аффинно очищенного АГ по данным клини-[еской апробации может быть использован для определения фиэиологи-юских концентраций бета-2- Ы.

- 22 -ВЫВОДЫ

1. Предложены методические подходы получения и очистки поли-и моноклональных антител и оценки их специфичности для использования при создании ИФ тест-систем. Модифицированы методы иммуноаф-финной очистки ряда антигенов для применения в тИФА. Разработан универсальный набор неспецифических компонентов для проведения анализа

2. Разработана методика синтеза конъюгатов антител и антигенов с бета-лактамазой на основе периодатного метода для создания ИФ тест-систем с визуальным учетом результатов тИФА.

3. Разработаны и апробированы ИФ тест-системы для диагностики вирусных инфекций человека- комплекс ИФ тестов для выявления HBsAg и антител к нему для диагностики вирусного гепатита В и ИФ тест-система для выявления антигена ротавирусов группы А для диагностики острого гастроэнтерита

4. Созданы и апробированы ИФ тест-системы для диагностики дизентерии Зонне и Фдекснера, основанные на количественном определении соматических О-антигенов шигелл и микробных клеток. Показана их диагностическая ценность. Разработанная методология получения аффинно очищенных антител к О-антигенам шигелл может быть применена для создания тест-систем, предназначенных для выявления других бактериальных антигенов.

5. Предложен и апробирован комплекс иммуноферментных тестов для выявления плацентарной щелочной фосфатазы человека Показано, что эндогенный ИФ тест для детекции ПШФ на основе аффинно очищенных антител имеет важное значение в якспресс-диагностике некоторых онкологических заболеваний.

6. Созданы и апробированы ИФ тест-системы для определения общего и специфического IgE и S>z -микроглобулина человека продемонстрирована их диагностическая ценность.

Список работ, опубликованных по теме дисертации: .

1. Ventrerov Yu. Yu., Cud 1 ma S. О., Voronov A. V., Votrin I. I. "Immunochemical studies of human placental alkaline phosphatase in normal and neoplastic tissues". Advances in enzyme regulation, ed. Weber G., - Oxford, N. Y.: Pergamon Press, 1987, Vol. 27,

P. 345-354.

2. Воронов A. E , Гудима С. О., Миериня А. А., Венгеров Ю. Ю., Вотрин И. И. "Исследование эффективности методов выделения специфических кроличьих антител класса G для иммуноферментного определе-

ния плацентарной щелочной фосфатазы человека". Бюл. экспериментальной биологии и медицины, 1988, Т. СУ1, N8, С. 156-159.

3. Воронов А. а , Сазыкин А. КХ , Венгеров (0. К1 , Серебряков М. КХ , Налов а А., Пак С. Г. "Определение О-антигена БЫгеПа Зоппе! конкурентным иммуноферментным методом". Антибиотики и химиотерапия, 1988, Т. XXXIII, N1, С. 43-46.

4. Сазыкин А. КХ, Воронов А. Е , Потапова А. К , Александровская Т. Н., Адахов а КХ , Гроздова И. Д., Гудима С. О., Венгеров К1КХ, Северин Е. С. "Получение и иммуноферментное определение рг -микроглобулина человека". Антибиотики и химиотерапия, 1988, Т.XXXIII, N6, С. 433-436.

5. Воронов А. В., Сакаян Н. Н., Злиас Е. Е., Бальсис А. Б., Симонов Е И., Грамоткина Е. А., Кущ А. А., Сущенко И. Б., Глемжа А. А., Венгеров КХ & "Мэноклонаяьная иммуноферментная тест-система для определения НВэ-Аг на основе ферментных маркеров - пероксидазы и бета-лактамазы". Материалы докладов VI Всесоюзного симпозиума "Инженерная энаишлогия", часть И, Вильнюс, 1988, С.7-8.

6. Северин Е. С., Венгеров КХКХ Сакаян Н. Е , Воронов А. Е , Львов Д. К., Кущ А. А. и др. Изменение N3 к временной фармакопейной статье 42-24ВС-86 "Тест-система иммуноферментная для определения КВв-антигена", Мэсква, 1989.

7. Пашинцева Л. А., Гудима С. О., Козырева Е. А., Воронов А. Е , Мйериня А. А., Бассалык Л. с:, Венгеров КХ КХ , Вотрин И. И. "Плацентарная щелочная фосфатаза - маркер злокачественных новообразований". Вопросы медицинской химики, 1989, Т. 35, N3, С. 68-71.

8. Пак С. Г., Воронов А. Е , Гурский XI Е , Малов Е А., Турья-нов М. X , Волчкова Е. Е , Серебряков М. КХ, Грамоткина Е. А., Венгеров КХ КХ "Использование иммуноферментного анализа в экспресс-диагностик и изучении особенностей циркуляции О-антигена в биологических жидкостях больных острой дизентерией зонне". Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1989, N6, С. 77-81.

9. Резник И. Б., Воронов А. Е , Иванов Е Г. , Турина И. Е., Караулов А. Е , Венгеров КХ КХ "Диагностическое значение определения общего 1&Е при атопии у детей". Лабораторное дело, 1989, N3, С. 20-24.

10. Сакаян Е Н., Элиас Е. Е. , Воронов А. Е , Попова А. Б., Ыо-мот А. и., Воробьев С. М. , Кущ А. А., Супценко И. Б. , Венгеров КХ Ю. , Ананьев ЕА. "Расширенная апробация моноклональной иммунофермент-ной тест-системы для детекции НВзАг у доноров и больных". Вопросы вирусологии, 1989, N9, 0.168-171.

11. Воронов A.B., Сакаян.ЕЕ, Кветкаускайте Р. П., Грамотки-на Е. А., Федорова 0. Е , Куц А. А., Вэнгеров ß Ш "Система иммуно-ферментных диагностических тестов для выявления HBsAg и антител к нему". Материалы III Взероссийского съевда инфекционистов, Шск-ва-Смоленск, 1889, С. 158-150.

12. Slmonov V.l., Kvietkauskaite R.P., Vorobyev S. M., Voro-nov A. V., Qranovsky N. N., Gibadulin R. A., Kushoh A. A., Venge-

rov Yu. Yu. "Imainoaffiñlty purification of natural and recombinant hepatitis В surface äntieens". 10-th meeting of FEES, Rome, 1989, P. FR210.

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ BOHU АМН СССР

ПОДП. К ПНЧАТИ Ц ,3 o Л -

3 AK.6I ?» ТИРАЖ |00