Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование методов лабораторной диагностики дизентерии

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов лабораторной диагностики дизентерии"

РГ6 он

1 6 ДВ

На правах рукописи

АЛИЕВА Елена Васильевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ДИЗЕНТЕРИИ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Ростов - на - Дону -1996

Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор В.И.Ефременко

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

И.С.Тюменцева

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.И.Васильева

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник

О.В.Шеремет

Ведущая организация - Волгоградский научно-исследовательский

противочумный институт

Защита состоится " 1996 г. в час, на

заседании диссертационного совета Д 084.53.01 при Ростовском государственно« медицинском университете (3440^2, г.Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета.

Авторефеоат разослан " /&_1896 г.

"ченый секретарь диссертационного совета, доцент

Н.Я.Корганов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Острые желудочно-кишечные инфекции занимают одно из ведущих мест в структуре инфекционной заболеваемости, а в отдельные годы, опережая грипп и острые респираторные инфекции, выходят на первое место. Среди них значительный удельный вес принадлежит острой дизентерии (Покровский В.И.и др., 1979, 1994; Наркевич М.И. и др., 1989; Солодовников Ю.П., 1989, 1990 и др.). До сих пор регистрируются случаи одновременного заболевания дизентерией от нескольких десятков до нескольких сот и тысяч человек. Среди факторов, неблагоприятно влияющих на эффективность профилактических мероприятий по борьбе с дизентерией, одним из основных является отсутствие метода надежной и быстрой диагностики, этой инфекции (Абдурахманова Э.Г.с соавт., 1984; Покровский В.И., Юцук Н.Д., 1994). Распространенные в настоящее время бактериологический и серологический методы диагностики не могут Быть использованы для быстрого и эффективного лабораторного контроля (Нуркина Н. М., Каральник Б.В., 1983; Трясучев И.О. с соавт., 1989). В связи с этим остается актуальным совершенствование существующих и поиск новых высокочувствительных, достаточно специфичных, простых в выполнении, доступных широкому кругу исследователей экспрессных методов лабораторного анализа дизентерии (Пак С.Г.с соавт., 1989).

Особое место среди экспрессных методов диагностики инфекционных заболеваний принадлежит иммуносорбционным методам (Шахани-на К.Л.с соавт., 1969; Сербезов A.B. и др. 1973; Закревский В.И., 1980; Шимко Т.А., Леви М.Н., 1990 и др.). Значительные преимущества экспрессных методов перед общепринятыми методами появились с началом использования сорбентов с магнитными свойствами, которые используются в качестве твердой фазы для селективного концентрирования на их поверхности различных антигенов и микроорганизмов (Пушкарь В.Г., Ефременко В.И., Климова И.М. и др., 1985; Smith К.О., 1977; Lea Т.et al., 1985). Широкий диапазон объемов исследуемых проб (от нескольких сот микролитров до многих кубических метров жидкостей), возможность исследования сильно загрязненных объектов позволяют проводить более качест-

венную диагностику инфекционных заболеваний, а также значительно расширяют возможность мониторинга внешней среды на наличие различных инфекционных агентов.

Разработка медико-иммунобиологических препаратов (МИБП) на основе магносорбентов для экспресс-диагностики дизентерии является актуальной и проводится впервые.

Цель и основные задачи исследования.

Цель работы - совершенствование экспрессных методов лабораторной диагностики дизентерии.

Для достижения указанной цели предполагалось решить следующее задачи:

- выявить эпидемиологически значимые виды возбудителей дизентерии для Ставропольского края на основе анализа заболеваемости за 1986-1995 гг.;

- оптимизировать условия наиболее полного извлечения водорастворимых антигенных комплексов шигелл;

- получить высокоактивную, специфичную полигрупповую дизентерийную иммунную сыворотку;

- на основе иммуноглобулинов из полигрупповой иммунной сыворотки изготовить экспериментально-производственные серии дизентерийных люминесцирующих и иммуноферментных конъюгатов;

- сконструировать дизентерийный магноиммуносорбентный диаг-ностикум на основе органокремнеземного сорбента;

- проверти лабораторные и полевые испытания тест-системы полигрупповой дизентерийной диагностической магноиммуносорбент-ной для ИФА и РИФ.

Научная новизна работы:

- проведенный анализ зпидснтуавди по дизентерии в Ставропольском крае выявил тенденцию к многолетнему подъему заболеваемости ^этиологически обусловленной видами Флекснера и Зонне, начиная с 1993 года, с преобладанием водного и пищевого путей передачи инфекции;

- разработаны научно-методические подходы к получению полигрупповой адсорбированной гипериммунной дизентерийной сыворотки, используемой для производства различных диагностических им-

- Б -

мунобиологических препаратов;

- получены высокоактивные и специфичные иммуноферментные и иммунофлуоресцентные полигрупповые конъюгаты, дающие возможность выявлять все виды, типы и подтипы возбудителей дизентерии;

- впервые разработан дизентерийный полигрупповой магноимму-носорбентный диагностикум на основе кремнеземноорганической матрицы;

Практическая ценность работы:

- на основе новых биотехнологичных органокремнеземных маг-ноиммуносорбентов сконструирована тест-система диагностическая полигрупповая для экспресс-диагностики возбудителей дизентерии в иммунофлуоресцентном и иммуноферментном анализах;

- оформлены методические рекомендации "Использование магно-иммуносорбентов в иммунологических методах выявления корпускулярных и водорастворимых антигенов возбудителей инфекционных заболеваний (бактериологический, иммуноферментный, иммунофлуоресцент-ный", одобренные Ученым Советом СтавНИПЧИ и утвержденные директором института (протокол N 10 от 23.12.1994); "Приготовление органокремнеземных магносорбентов с иммобилизованными лигандами белковой природы (иммуноглобулины, антигены, ферменты)", утвержденные Госкомсанэпиднадзором РФ 15 мая 1996 г.

Сконструированная дизентерийная диагностическая полигрупповая магноиммуносорбентная тест-система успешно апробирована в лабораторных и полевых условиях (акты о внедрении от 02.02.96 г. ЦГКСЭН Карачаево-Чекрессии; от 03.04.96 г. Кисловодского городского центра ГКСЭН; от 15.04.96 г. Кисловодской инфекционной больницы) .

Основные положения, выносимые на защиту. Разработаны научно-методические подходы к получению полигрупповой адсорбированной гипериммунной дизентерийной сыворотки, используемой для производства различных МИБП; предложена технология изготовления полигрупповых адсорбированных дизентерийных люминесцирующих, иммуноферментных, магноиммуносорбентных диагностикумов; получена диагностическая полигрупповая магноиммуносорбентная тест-система для экспресс-диагностики возбудителей дизентерии (ИФА и РИФ).

Апробация работы и публикации.

Основные результаты диссертационной работы были доложены и представлены на межгосударственной научно-практической конференции "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний", посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (Ставрополь, 1994); научной конференции молодых сотрудников и ассистентов СГМА (апрель, 1994 г.; апрель, 1995); научной конференции Ставропольского отделения Российского научного общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Ставрополь, февраль, 1995); межлабораторной научной конференции Ставропольского НИПЧИ (июль, 1995 г.).

Основные результаты диссертации изложены в 6 научных публикациях, 2 методических рекомендациях.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Она изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 15 рисунков. Список литературы включает 187 отечественных и 60 зарубежных литературных источников.

Материалы у. методн исследования.

В работе были использованы 37 штаммов дизентерийных микробов, представляющие все подгруппы (А, В, С, Д), виды-, типы, подтипы: 10 штаммов Shigella dlsenteriae, 12 штаммов Shigella flex-neri, 14 - Shigella boydii и 1 штамм - Shigella sonnei; кроме этого: Salmonella typhi - 4, Salmonella typhimurium - 1, Salmonella typhiabdominalis - 1, Yersinia enterocolitis - 8, E.coli - 6 штаммов.

Водорастворимые антигенные комплексы микроорганизмов извлекали последовательно водно-солевой экстракцией и ультразвуковой дезинтеграцией.

Иммуноглобулины фракционировали из гипериммунных сывороток: полиэтиленгликоль 6000 (ПЭГ-6000) (Poison A. al, 1964) и капри-ловой кислотой (Steibuch G. Andran R, 1969). Конъюгацию иммуноглобулинов с флуоресцеин-изотиоционат натрия (ФИТЦ) проводили по A.Stortz (1987). Иммунопероксидазные конъюгаты получали по P.K.Nakane, A.Kawaoi (1974) в модификации Е.А.Ткаченко (1982).

Иммунофлуоресдентный анализ осуществляли: прямым методом'окраски препаратов по А.Н.Coons, M.H.Kaplan (1950) и непрямым методом -по T.H.Weller,. А.Н.Coons (1954).

Количественный иммунофлуоресдентный анализ проводили по методу К.Г.Стоева с соавт. (1981). Количественное определение белка осуществляли по O.Warburg и W.Christian (1941) на спектрофотометре СФ-46. Реакцию преципитации в агаровом геле проводили по O.Ouchterlony (1949). Сублимационную сушку - в камере TG-5. В опытах были использованы 50 кроликов обоего пола породы "Шиншилла", весом 3-3,5 кг.

Эпидемиологический анализ проводили по методикам В.Д.Беляковой (1981) и Д.В.Сепеглиеву (1968).

Экспериментальные данные были обработаны методами вариационной статистики, изложенными в работах П.И.Сызранцева (1938), И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева (1962), В.Ю.Урбаха (1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ заболеваемости дизентерией в Ставропольском крае показал, что данная проблема стоит очень остро, как и по всей России. Уровень заболеваемости населения края на протяжении 1986-1995 гг.выше республиканских по острой дизентерии на 6,6 Z. В многолетней динамике острой дизентерии с 1965 по 1995 гг. зарегистрировано два периода подъема (1965-1975 гг. и 1981 -1986 гг.) и два снижения (1975-1980 гг. и 1987-1992 гг.). С 1993 г. и по настоящее время наблюдается подъем заболеваемости (Рис.1).

За счет постоянно действующих причин круглогодичная заболеваемость дизентерией по краю составила в среднем 65 % от ОКИ, а сезонная - 35 %. Распространенность ОКИ на административных территориях края различна, что, вероятно, отражает существующие как количественные, так и качественные особенности эпидемиологического процесса на каждой из них. По усредненным данным за последние три года с учетом уровня заболеваемости и её тенденции в Ставропольском крае выделены, как наиболее неблагополучные по заболеваемости дизентерией, следующие территории: города Пятигорск, Ессентуки, Невинномысск, Ставрополь, Кисловодск; районы

1200 1000 800 600 400 200 О

1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 199* 1995 L и ДИзентерия__□ СКИ__^J

Рис. 1. Заболеваемость дизентерией и ОКИ в Ставропольском крае

Труновский, Георгиевский, Влагодарненский, Ипатовский, Петровский, Буденновский и Арзгирский. В период с 1986 по 1995 гг. удельный вес детей до 14 лет составил 60-65 7, от общего числе заболевших. Заболеваемость дизентерией городского населения i среднем за исследуемые 10 лет выше сельского в 1,7 - 2 раза. Чтс же касается этиологической структуры шигеллеза на Ставрополье, можно отметить, что если до 1987 года значительно превалировалг дизентерия Флекснера, то с 1987 года и по настоящее время преобладает дизентерия Зонне, хотя и дизентерия Флекснера сохранеяч достаточно высокий удельный вес (Рис. 2). Это можно связать с неблагополучным водоснабжением, несоблюдением санитарно-гигиенических норм, не последнюю роль среди этих факторов играют активные миграционные процессы, идущие в последние годы на Северно* Кавказе, в том числе и на Ставрополье.

_

1 1 1 : 1 1 —; — - —. -- i i 1 I 4 -Нн i

1 1 ~ J 1 1! II

1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995

Фпекснэра

Рис.2. Заболеваемость дизентерией Флекснера и Зонне в Ставропольском крае

Таким образом, анализ, зпидситуации по дизентерии в Ставропольском крае за последние 10 лет свидетельствует о начале (с 1993 года) многолетнего подъема заболеваемости. Этиологически заболевания обусловлены двумя видами возбудителей дизентерии -Флекснера и1 Зонне. Это свидетельствует о преобладании двух путей передачи инфекции: водного и пищевого, что согласуется с теорией соответствии В.И.Покровского и Ю.П.Солодовникова (1978).

Единственным источником возбудителя инфекции при дизентерии является больной человек или бактериовыделитель. Больной наиболее опасен в первые дни болезни, когда с частым жидким стулом 'выделяется большое количество шигелл, и если своевременно не начата специальная терапия, то бактериовыделение может продолжаться в течение нескольких недель и даже месяцев. Вот почему нужна правильная и ранняя диагностика. Наиболее чувствительными, обладающими высокой специфичностью, позволяющими получить ответ в течение 1-3 часов, являются методы экспресс-диагностики, такие

как иммунофлуоресцентный, иммуноферментный и другие.

В технологии изготовления медицинских иммунобиологических диагностических препаратов одним из основных звеньев является получение высокоактивных, специфичных гипериммунных сывороток. Основой для этого служат полноценные антигены. Для дизентерийных микробов характерно, что различные их виды и типы обладают своеобразным набором антигенов. Учитывая это обстоятельство, для изолирования антигенов нами подобрано 37 штаммов, представляющих различные подгруппы (А, В, С, D), виды (Sh.dysenteriae, Sh.flex-neri, Sh.boydii и Sh.sonnei), типы и подтипы дизентерийных микробов. Для выделения полноценных водорастворимых антигенов мы применили комплексную схему: водно-солевую экстракцию и ультразвуковую дезинтеграцию (Рис.3).

Для выращивания биомассы использовали штаммы, типичные для каждого вида дизентерийных микробов. Бактерии выращивали на матрацах с агаром Хоттингера pH (7,2+0,2) в течение 48 часов при (37+1) °С. Биологическую массу смывали 0,15 М раствором NaCl и стерилизовали холодным ацетоном (минус 30 °С).. После проведения бактериологического контроля на специфическую стерильность бактериальную массу центрифугировали, промывали холодным ацетоном и высушивали в анаэростате. Ацетонвысушенные порошки всех тридцати семи штаммов объединяли в равных пропорциях. Далее цельные микробные клетки экстрагировали 2,5 7. раствором NaCl в течение 48 часов. После центрифугирования осадок клеток подвергали ультразвуковому воздействию на аппарате "Fisher model 300" (США) при режиме: частота колебаний 15 кГц, акустическая мощность 35-40 Вт/см2. После центрифугирования детрит повторно экстрагировали 2,5 % раствором NaCl и ещё раз центрифугировали. Полученный осадок удаляли. Надосадочные жидкости объединяли и после диализа (против дистиллированной воды) лиофилизировали. Выход водорастворимых белковых компонентов при использовании этой схемы составлял не менее 15-18 мг/мл. Высушенный препарат имел вид пористой "таблетки" белого цвета. В запаянных (в атмосфере азота) ампулах такой препарат может сохраняться в течение длительного время.

Рис. 3. Схема получения водорастворимых антигенных комплексов возбудителей дизентерии

Экстракция ацетонвысушен-ных микробных клеток 2,5% раствором МаС1; центрифугирование при 4000 г 60 мин

I

Осадок клеток УЗ дезинтеграция;

центрифугирование при 20000 ш 60 мин

\

Экстракция 2,5 % раствором МаС1; центрифугирование при 20000 § 60 мин

I

Осадок удаляют

супернатант I

супернатант II

супернатант III

|Диализ супернатан-|тов- (1+П+1П)

Лиофилизация

I

- is -

В научной литературе приводится ряд схем иммунизации животных по получению дизентерийных антисывороток для различных целей. Для иммунизации кроликов авторы использовали живые микробы, бактерии, прогретые прй 120 °€ в течение 2 часов, 0-антиген, корпускулярные антигены, обработанные 0,3 7> формалином (Тимаков В.Д., Скавронская А.Г., 1961; Дулатова Н.В. и др., 1973; Петру-хин В.Г. с соавт., 1973; Горбунова Е.С. и др., 1981; Воронов A.B. и др., 1988).

Для получения поли- и моновалентных гипериммунных кроличьих сывороток чумных, туляремийных, бруцеллезных, сибиреязвенных, сапных и мелиоидозных И.С.Тюменцевой с соавт. (1994) предложена оригинальная схема иммунизации водорастворимыми антигенами с использованием иммуномодулятора - феракрила, который представляет собой смесь железных (II, III) солей полиакриловой кислоты: [(СзН402)т X C6H6Fe04]n х [(СзН^гЬ х CgHgFeOß]!-, т > 150, п = 50-100 М.т. 600000-800000 (Ф.С. 42-2742-90). Авторы указывают, что количество антителооб-разующих кроликов-продуцентов с высокими производственными титрами составляло 95-100 Эта схема иммунизации животных был& использована нами в опытах (Рис.4).

Способ гипериммунизации заключался в следующем: кроликам-продуцентам вводили по 0,6 мл 3 % водно-спиртового растворе феракрила в подушечки задних лап. На 5-7 день дизентерийный полигрупповой антиген смешивали с 1,0 мл 1 X водно-спиртового раствора феракрила и по 0,6 мл вводили в подколенные лимфатически« узлы. Через три дня такую же смесь вводили внутримышечно трехкратно с промежутками в 4 дня. На 30 день от животных получали пс 4 мл иммунной сыворотки, добавляли половинную дозу антигена ] каждую сыворотку. Полученный комплекс антиген-антитело (Аг-Ат' вводили четырехкратно по 1 мл с промежутками в 3-4 дня внутривенно тому же животному, от которого получена иммунная сыворотка.

В процессе иммунизации, при отработке указанной схемы мы провели ряд опытов на животных по варьированию дозы полигруппового антигена. £0 кроликов были разделены на 4 группы. Животных первой группы иммунизировали по названной схеме, вводя по 1 мг

Рис.4. Схема гипериммунизации животных для получения полигрупповой дизентерийной сыворотки

| Грундиммунизация

[ 5 инъекций смеси антигена с ферак-

| рядом с интервалом 3-5 дня в поду-

| шечки лап, подколенные лимфоузлы,

I бедро

| Отдых животных 30 дней, взятие крови, | | приготовление комплекса антиген-анти- | | тело 1

| Основной цикл иммунизации |

| 4 инъекции с интервалом 4 дня комплекса! | антиген-антитело, внутривенно |

антигена каждому кролику на одну инъекцию. Второй группе вводили по 2 мг, третьей - по 3 мг, четвертой группе - по 4 мг. Специфическую активность полученных гипериммунных сывороток оценивали в непрямой реакции иммунофлуоресценции (НРИФ) и в реакции иммуно-диффузии в агаровом геле по Оухтерлони (РИД). Динамика накопления антител в зависимости от дозы антигена представлена на рис.5. Пробные взятия крови проводили у всех животных через 7 дней после грундиммунизации, перед третьей инъекцией основного цикла и через 7 дней после окончания всего курса гипериммунизации.

У животных первой и второй групп развивалась ответная иммунологическая реакций, но титры специфических антител в сыворотках были невысокими и не превышали в НРИФ - 1:307,2+80,2 -1:512, а в РИД 1:2,4+0,62 - 1:5,6+1,25.

Рис.5. Динамика накопления антител в зависимости от дозы дизентерийного антигена в РИД

Титры специфической активности гипериммунных сывороток у всех животных третьей группы повышались в течение' всей гипериммунизации и достигали показателей 1:1228,8+427,2 1:1638,4+320,8 в НРИФ, 1:3,8+0,62 - 1:48+0 в РИД после окончания основного цикла.

Иммунологическая реакция животных четвертой группы отличалась от предыдущей. У двух животных после грундиммунизации титры антител составляли 1:120,0+20,05 и 1:3,75+0,62 в НРИФ и РИД соответственно. Дальнейшее введение антигена этим кроликам не сопровождалось повышением титра антител. У остальных животных после окончания всего курса гипериммунизации титры специфических антител были: 1,640+160,1 (НРИФ) и 1:4 (РИД) - у одного кролика, 1:320+80,7 и 1,5+1,25 - у двух остальных в НРИФ и РИД соответственно. По-видимому, у животных этой группы произошло возникновение специфической иммунологической реактивности (толерантности) .

Таким образом, оптимальная однократная доза полигруппового дизентерийного антигена составила 3 мг. Выбранная нами схема гипериммунизации позволяла получить высокотитражные полигрупповые дизентерийные антисыворотки практически у 100 % животных. При этом иммунный ответ наблюдался на все составляющие компоненты полигруппового дизентерийного антигена.

Как известно, шигеллы имеют антигенные связи как внутри рода (Хоменко H.A., 1977, 1981; Дмитриев В.А., Кочетков К.Н., 1979; Тимаков В.Д. с соавт., 1980; Kenne L. et al., 1978; Dmit-riev V.A. et al., 1979 и др.), так и с другими представителями семейства Enterobacteriaceae. Наиболее тесное родство, вплоть до идентичности некоторых О-антигенов, они имеют с сальмонеллами и эшерихиями (Перс И.Ф., 1961; Хоменко H.A., 1977-, Покровский В.И., 1991). Изучение специфичности полученной полигрупповой гипериммунной дизентерийной сыворотки в НРИФ и РИД показало наличие перекрестных реакций с рядом штаммов S.typhi и E.coli. Результаты свидетельствовали о необходимости проведения адсорбции сывороток, для удаления перекрестно реагирующих антител путем контакта с антигенами, которые обладают общими с индуцирующим антигеном детерминантами.

Попытки истощения сывороток при использовании в качестве адсорбентов микробных клеток, широко применяемых в сывороточном производстве (Карпов С.П. и др., 1976; Смирнов В.В. и др., 1980), приводили к получению высокоспецифичных иммунных сывороток, но при этом происходило значительное снижение их специфической активности. В связи с этим для удаления неспецифических антител мы использовали твердофазные иммуносорбенты. Преимуществами этих сорбентов являются: упрощение манипуляций, отпадает необходимость постоянного получения биомассы микроорганизмов штаммов-адсорбентов; возможность длительного (в течение нескольких лет) их использования после проведения регенерации, и что самое главное, в процессе адсорбции происходит незначительное снижение специфической активности сывороток (Рис.6).

Для адсорбции использовали 3 штамма E.coli и 2 S.typhi, из которых получали водорастворимые антигены по описанной выше схеме. Далее антигены инсолюбилизировали путем механического вклю-

1:1600 1:1400 1:1200 1:1000 1:800 1:6001:400 1:200.

Рис.6. Специфическая активность в НРИФ гипериммунной полигрупповой дизентерийной сыворотки после иммуно-сорбции (ИС) и истощения микробными клетками (ИМКл)

1 - специфическая активность сыворотки до адсорбции

2 - специфическая активность сыворотки после ИС

3 - специфическая активность сыворотки после ИМКл

чения их в решетку полиакриламидного геля. Сомономеры реакции полимеризации (акриламид, Ы^-метиленбисакриламид, М^Ма^-тет-раметилэтилендиамин и персульфат аммония) вносили в раствор водорастворимых антигенов (на каждый вид микроорганизмов иммуносор-бент готовили отдельно). Реакцию полимеризации проводили при тщательном перемешивании на холоде (+4) °С в течение 1 часа. Полученный полимерный блох продавливали через фильеры, что позволяло получать мелкие гранулы иммуносорбентов одинаковой величины. Отмывание иммуносорбентов от несвязавшегося белка проводила 10-кратным объемом 0,3 М раствора калия роданистого и центрифугированием. Затем иммуносорбент отмыеэли 10-кратным объемом 0,9" % забуференным раствором ИаС1 для удаления роданистого калия и несвязавшегося белка. Операцию отмывания геля проводили до исчезновения несвязавшегося белка, концентрацию которого определяли спектрофотометрически, и ионов- под контролем качественной

реакции с 1 % раствором треххлорного железа.

Иммуносорбцию неспецифических антител из дизентерийной полигрупповой антисыворотки осуществляли следующим образом. Имму-носорбенты, смешанные в равных количествах, добавляли в сыворотку из расчета 10 мл сорбента на 20-40 мл сыворотки и выдерживали при температуре (37+1) °С в течение 20 часов и при температуре 22 °С 4 часа. Центрифугированием при 4000 g в течение 15-20 мин иммуносорбенты отделяли от сыворотки. Супернатант сливали и фильтровали через бумажный фильтр.

Для повторного использования иммуносорбента проводили его регенерацию ЗМ раствором роданистого калия или натрия, обеспечивающую диссоциацию комплекса "иммобилизованный антиген-антитело" с последующим отмыванием физиологическим раствором.

Адсорбированная дизентерийная полигрупповач сыворотка обладала высокой специфической активностью, проявляя четкие отрицательные результаты в НРИФ и РИД со всеми изученными штаммами E.coli и S.typhi.

Анализ результатов свидетельствует о том, что нами отрабо-' тана оптимальная схема иммунизации для получения полигрупповой дизентерийной гипериммунной кроличьей сыворотки, являющейся высококачественным сырьем для дальнейшего получения различных МИВП.

На основе полигрупповой дизентерийной адсорбированной гипериммунной кроличьей сыворотки получены иммуноглобулины диагностические люминесцируюшие. Всего изготовлено 5 серий этих диаг-ностикумов. Оценка физико-химических свойств люминесцирующих иммуноглобулинов (внешний вид, растворимость, прозрачность, цветность, щелочность, остаточная влажность, концентрация белка, количественное соотношение ФЙТЦ/белок) показала соответствие их ОМБТ, предъявляемый к люминесцирующим препаратам. Специфическая активность всех приготовленных серий характеризовалась красящим титром,-равным разведению 1:32 - 1:64 при исследовании мазков гомологичных возбудителей, рабочее разведение препаратов - 1:16 - 1:32.

Для определения чувствительности люминесцирующих иммуноглобулинов использовали гомологичные штаммы в следующих концентра-

циях: 5xl06 ; lxlO6 ; 5xl05 ; 2,5x10s ; lxlO5; 5xl04 микробных клеток в 1 мл. Установлено, что рабочее разведение испытанных серий препаратов давало возможность обнаруживать микробы в мазках, приготовленных из 5х105 и более микробных тел в 1 мл. С помощью всех серий удалось выявить единичные бактерии в мазках, приготовленных из взвесей, содержащих 2,5х105 микробных клеток в 1 мл.

Диагностическая ценность люминесцирующих антител определялась не только на чистых культурах, но и в имитированных пробах (смывы с предметов обихода, пробы воды, пищевые продукты, испражнения). Для проведения этого этапа работы использовали по пять нативных взвесей гомологичных штаммов шигелл в концентрациях, равных чувствительности препаратов (5х105 м.к./мл -2,5х105 м.к./мл). В результате проведенной работы установлено, что в мазках, приготовленных из проб, содержащих в 1 мл 5х105 м.к., имеются единичные клетки с интенсивным специфическим свечением.

Для изучения специфичности испытываемых серий люминесцирующих иммуноглобулиновых препаратов в опыт было взято 20 штаммов гетерологичных микроорганизмов ( E.coli, S.typhimurium, 3.typhi,' S.typhiabdominalis, Y.enterocolitica). Для приготовления мазков использовали микробные взвеси указанных культур в концентрации 5х105 м.к./мл. В результате константировано отсутствие специфической иммунофлуоресценции у всех гетерологичных микроорганизмов, взятых в опыт и окрашенных рабочим разведением люминесцирующих дизентерийных антител.

Используя иммуноглобулины, выделенные из дизентерийной полигрупповой адсорбированной гипериммунной сыворотки с помощью ПЭГ-6000, методом предварительного окисления фермента (перокси-дазы хрена) до альдегидной формы перйодатом натрия получены им-мунопероксидазные конъюгаты (5 серий). Рабочий титр иммунофер-ментных полигрупповых дизентерийных, конъюгатов всех изготовленных серий, определенных в "сэндвич"-варианте ИФА, составил 1:200 - 1:400. Чувствительность конъюгатов по водорастворимым антигенам - 50-100 нг/мл, по корпускулярным антигенам - lxlO5 - 1х10б м.к./мл. Контроль их специфичности при постановке "сэндвич"-ме-тода ИФА с антигенами из гетерологичных штаммов дал отрицатель-

ные результаты.

Качественно новым этапом усовершенствования иммуносорбцион-ных методов является разработка и применение магнитных сорбентов (MC), которые используются в качестве твердой фазы для селективного концентрирования, на их поверхности различных антигенов и микроорганизмов (Smith К.О., Gehl W.D., 1974; LeaL.etal., 1985). Магнитные свойства иммуносорбентов позволяют быстро и эффективно отделять твердую фазу с иммобилизованным лигандом из реакционной среды, избегая многократного процесса центрифугирования. Дополнительное преимущество применения MC имеет место на этапах перемешивания. Наконец, процесс анализа с использованием MC легко поддается автоматизации (Ефременко В.И. с соавт., 1989). Магнитные сорбенты на основе полиакриламидного геля нашли применение для концентрирования и выделения различных микроорганизмов из загрязненных микрофлорой объектов внешней среды и биологических жидкостей (Ефременко В.И.с соавт., 1990; Ефременко В.И., Тюменцева И.С., 1995; Dodin А. et al., 1983), в прямом и непрямом иммунофлуоресцентном (Пушкарь В.Г., Трофимов E.H.,, 1986; Подзолкова Г.Г.' с соавт., 1988; Ефременко В.И., Тюменцева И.С., 1995а) и иммуноферментном анализах (Трофимов E.H., Васильев В.П., 1986; Ефременко В.И., 1988; Ефременко В.И. с соавт., 1989; Василенко Н.Ф. с соавт., 1993, 1993а, 1994; Ефременко В.И., Тюменцева И.С., 19956). Они позволяют значительно ускорить целый ряд этапов анализа антигенов, а в ряде случаев повысить качественные характеристики методов. Отмечена еысок&ч воспроизводимость результатов, возможность проведения анализа с большим количеством проб, снижение трудоемкости процессов и высокая корреляция с другими современными методами анализа.

В доступной нам литературе, публикаций об использовании MC при выявлении возбудителей дизентерии нам найти не удалось. В связи с этим изучение возможности применения магноиммуносорбен-тов для. диагностики дизентерии представляет несомненный научный и практический интерес.

Наше внимание привлекли работы по конструированию магносор-бентных тест-систем на основе пирогенной формы диоксида кремния (аэросила А-380) для диагностики чумы, туляремии, сибирской язвы

и других особо опасных инфекций в ИФА и РИФ (Жарникова И. В. и др., 1994, 1995; Тюменцева И.О. с соавт., 1994, 1995). Как указывают эти авторы, преимуществами сконструированных композиционных магноиммуносорбентов (МИС) являются: использование нетоксичных отечественных компонентов, их дешевизна, простота технологии изготовления, механическая и химическая прочности, высокая специфичность и чувствительность - 1х102 м.к./мл, возможность лио-филизации, что подтверждено многочисленными лабораторными и полевыми испытаниями диагностикумов.

Используя принципы получения биотехнологических композиционных магноиммуносорбентов на основе полисорба А-380 (Жарникова И.В.,1995), нами впервые разработана технология получения дизентерийных магноиммуносорбентов на основе полисорба А-700. Поли-сорб представляет собой высокочистый и высокодисперсный пироген-ный кремнезем с химической брутто-формулой Si02. Средний размер частиц полисорба 5x10 нм, удельная поверхность не менее 300 м.кв./г. Благодаря пористой структуре вся поверхность полисорба легко доступна для сорбирующих молекул любого размера. Активными центрами на поверхности полисорба являются, в основном, гидрок-сильные группы, которые могут взаимодействовать посредством водородных связей (Чуйко A.A., 1971). В настоящее время усилиями многих исследователей проведено значительное число химических превращений с участием центров поверхности кремнезема (Тертых В.А., 1983, 1993; Алесковский^ В.Б., ЮффаА.Я., 1989; ГайдаА.В., Староверов С.М., 1989; Bascom W.D. , Timmons R.B., 1972, Tanaka К.et al., 1980 и др.).

В качестве неорганических компонентов синтеза использованы магнитный порошок и пирогенная форма диоксида кремния (аэросил А-700). Модифицирование матрицы проводили декстраном и 0,2 М раствором перйодата натрия с последующим ковалентным связыванием белкового лиганда - иммуноглобулинов из гипериммунной полигрупповой дизентерийной адсорбированной кроличьей сыворотки (Рис.7):

Способ получения МИС заключался в следующем: смесь, состоящую из 5 г аэросйла А-700 и 5 г магнитного порошка (РегОз), суспендировали в 80 мл 3,5 Z раствора декстрана и выдерживали при температуре (22+4) °С в течение 1 часа. Полученный сорбент высу-

Рис. 7. Схема конструирования дизентерийных магноиммуносорбентов

| Формирование корпускулярной структуры !

Стадия 1 | кремнеземного агента из частиц аэросила|

I А-700 и включение в состав полимера и |

I окиси железа I

Стадия 2 | Созревание и высушивание геля

Стадия 3 | Измельчение и просеивание магносорбента | I (МС) !

Стадия 4 ¡Модифицирование МС перйодатом натрия для | [образования активных групп |

Стадия 5 I Иммобилизация МС иммуноглобулинами I дизентерийными

Стадия 6 ¡Стабилизация магноиммуносорбента (МИС) !

!методом сублимации )

ивали при 100-110 °С в течение 30-40 минут. Далее растирали в тупке, просеивали через сито с диаметром 100 мкм. К 5 мг полу-

ченного препарата добавляли 0,2 мл 0,2 М раствора перйодата натрия, инкубировали при температуре (22+4) °С в течение 1 часа. Останавливали реакцию 0,64 М раствором этиленгликоля, добавляя последний в количестве 250 мкл, выдерживали 1 час при температуре (22+4) °С. Затем сорбент отмывали 5-10 объемами 0,1 М раствора ФСБ (7,2+0,1) ед рН. К 0,2 г сорбента приливали 0,3 мл иммуноглобулинов с концентрацией 20 мг/мл, предварительно доводя рН иммуноглобулинов до 9,5 с помощью 0,2 М раствора КББ. Иммобилизацию проводили в течение 1-2 часов при температуре (22+4) °С. Далее надосадочную жидкость удаляли, а носитель трижды промывали 0,9 % раствором хлорида натрия и проводили блокирование оставшихся несвязавшихся групп бычьим сывороточным альбумином в течение 1 часа. Длительность получения магноиммуносорбента составляла 5,5-6 часов. Технология приготовления МИС изложена в методических рекомендациях "Приготовление органокремнеземных магносор-бентов с иммобилизованными лигандами белковой природы (иммуноглобулины, антигены, ферменты", утвержденных Госкомсанэпиднадзо-ром РФ 15 мая 1996 г.

Магноиммуносорбенты представляли собой высокодиспврсные микрогранулы размером от 70 до 150 мкм, неправильной'формы с ярко выраженными магнитными свойствами, обладающие хорошей смачиваемостью и эффективным оседанием в растворе, отсутствием.склонности к конгломерации. Среднее значение их удельной поверхности, определенное методом Клячко-Гурвича (1991) по низкотемпературной сорбции азота - 70 м2/г, суммарный объем пор -°1,2 см3/г и средний радиус пор - 35 нм..

Изготовлено 7 серий дизентерийных МИС и дана их оценка по чувствительности и специфичности в иммуноферментном анализе и методе количественной иммунофлуоресценции. Корпускулярными антигенами служили обеззараженные и высушенные ацетоном клетки типичных штаммов шигелл всех видов и штаммы культур гетерологичных микроорганизмов (всего в опыт было взято 30 штаммов), из которых готовили взвеси с концентрацией 1х105 до 1х102 м.к./мл. Диагностическими препаратами служили люминесцирующие иммуноглобулины и конъюгаты пер'оксидазные.

Для работы с МИС необходимы специальные технические уст-

ройства, обеспечивающие эффективное автоматическое перемешивание, сепарацию, перенос, фиксацию магнитных сорбентов в заданном режиме, которые были разработаны сотрудниками Ставропольского и Волгоградского научно-исследовательских противочумных институтов. Устройства размещены в компактной укладке, легко транспортируемой ручным способом, работа с которой возможна как в лабораторных, так и в полевых условиях. Конструктивно укладка представляет собой чемодан типа "Дипломат", в котором размещены: пульт "Электроника" с гребенкой для проведения иммуноферментного анализа, 15 ловушек ("конус" и "проточная") со съемными магнитными пробками, 15 контейнеров для транспортировки проб, 15 металлических стержней для сбора магносорбента с магнитных поверхностей ловушек и цанговый держатель стержней, магнитные палочки со стеклянными чехлами для сепарации магносорбента от жидкой фазы, дозатор для нанесения магносорбента на магнитную поверхность ловушек, постоянный магнит.

Принципы и приемы работы с магноиммуносорбентными диагн'ости-кумами и техническими устройствами изложены в методических рекомендациях "Использование магноиммуносорбентов в иммунологических методах выявления корпускулярных и водорастворимых антигенов возбудителей инфекционных заболеваний (бактериологический, иммуно-ферментный, иммунофлуоресцентный)", которые одобрены на Ученом Совете Ставропольского НИПЧИ и утверждены директором института (протокол N 10 от 23.12.1994 г.)". Схема проведения иммунобиологических анализов при дизентерии представлена на рис.8. Для проведения иммуноферментного анализа, кроме традиционного метола постановки'реакции в микропланшетах, нами отработан вариант проведения ИФА с использованием МИС во флаконах (типа пенициллино-вых). Проведенные исследования показали, что чувствительность дизентерийного полигрулпового магноиммуносорбентного диагностикума, оцененная в экспресс-иммуноанализах (ИФА и КИФА), во всех проведенных опытах была не менее 1х103 м.к./мл. Специфичность препаратов позволяла проводить анализы без перекрестных реакций с исследованными гетерологичными микроорганизмами.

Кроме лабораторных, проведены полевые испытания диагности-кумов. Исследования проводили в ГЦСЭН г.Кисловодска, инфекцион-

178»

СО Л.

О 2

"6=,

Диагностическая ЛЮМ сыворотка в рабочем разве дении

о

О! Ь

Обеззараженная проба (прогреванием, формалином и т.п.)

-

ной больнице, а также ЦГСЭН Карачаево-Чекркессии. Исследованию подвергали материал от больных и из объектов внешней среды. Методом ИФА в 20 пробах от 32 больных с клиническим диагнозом "Дизентерия", не подтвержденных бактериологическим методом, получены положительные результаты. При исследовании объектов внешней среды положительные результаты удалось получить в 4-5 % случаях.

Таким образом, нами сконструирована тест-система диагностическая полигрупповая магносорбентная для обнаружения всех видов, типов и подтипов возбудителей дизентерии в иммуноферментном и иммунофлуоресцентном анализах. Проведенные лабораторные и полевые испытания дизентерийной магносорбентной тест-системы свидетельствуют о её высокой чувствительности, специфичности, надежности и перспективности использования в эпиднадзоре за дизентерией и её экспресс-диагностике (акты о внедрении от 02.02.96 г. ЦГКСЭН Карачаево-Черкессии; от 03.04.96 г. Кисловодского городского центра ГКСЭН; от 15.04.96 г. Кисловодской инфекционной больницы).

ВЫВОДЫ

1. Анализ эпидситуации по дизентерии в Ставропольском крае за последние 10 лет свидетельствует о начале многолетнего ( с 1993 г.) подъема заболеваемости, этиологически обусловленной двумя видами возбудителей дизентерии - Флекснера и Зонне, что подтверждает актуальность исследований по совершенствованию экспрессных методов лабораторной диагностики дизентерии при выявлении больных, установлении факторов зараженности внешней среды, факторов передачи.

2. Для изолирования полноценных антигенных комплексов подобраны 37 штаммов с характерным набором антигенов для всех подгрупп, видов, типов и подтипов шигелл. Получение антигенов проводили по комплексной схеме (водно-солевая экстракция и ультразвуковая дезинтеграция микробных клеток), обеспечивающей наиболее полное извлечение водорастворимых компонентов шигелл с сохранением их нативности.

3. Подобрана оптимальная схема иммунизации для получения полигрупповой дизентерийной гипериммунной кроличьей сыворотки,

обеспечивающая высокий выход животных-продуцентов, при этом иммунный ответ наблюдался на все составляющие компоненты полигруппового дизентерийного антигена. Специфическая активность сыворотки в НРИФ достигала 1:12288,8+427,2 - 1:1638,4+320,8, а в РИД - 1:8,8+0,62 - 1:48+0.

4. Показано, что-наиболее эффективным способом истощения полигрупповой гипериммунной дизентерийной сыворотки является применение твердофазной иммуносорбции вместо широко используемой в сывороточном производстве адсорбции микробными клетками.

5. На основе полигрупповой дизентерийной адсорбированной гипериммунной сыворотки изготовлены экспериментально-производственные серии иммуноглобулинов диагностических полигрупповых люминесцирующих и иммунопероксидазных конъюгатов, имеющие высокую чувствительность и специфичность, дающие возможность выявлять все виды, типы и подтипы возбудителей дизентерии.

6. Сконструирован дизентерийный магноиммуносорбентный диаг-ностикум на основе пирогённой формы диоксида кремния (полисорб А-700), модифицированной декстраном и перйодатом натрия. На его основе создана тест-система диагностическая магноиммуносорбент-ная полигрупповая адсорбированная для экспресс-диагностики возбудителей дизентерии в ИФА и РИФ, имеющая высокую чувствительность (1хЮ3 м.к.) и специфичность.

7. Лабораторные и полевые испытания тест-системы полигрупповой диагностической магноиммуносорбентной дизентерийной свидетельствуют об информативности,высокой чувствительности,специфичности, надежности и перспективности её использования в диагностике и микробиологическом мониторинге объектов внешней среды на наличие'возбудителей дизентерии в экспрессных методах анализа.

ГЛГ)

- .о (

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Современное состояние изученности лабораторной диагностики возбудителей дизентерии (Обзор литературы) (И.С.Тюменцева, E.H.Афанасьев, Е.В.Жданова) - //Деп. в ВИНИТИ 04.11.94, N2506-В94.

2. К вопросу об усовершенствовании препарата для люминес-центно-серологической диагностики возбудителя дизентерии (И.С.Тюменцева, Е.Н.Афанасьев, Е.В.Жданова). - /'/Акт. вопр. профилактики чумы и др. инфекц.забол. Материалы межгосуд. научно- практич. конф., посвящ. 100~летига открытия Еозб.чумы. - Ставрополь, 1994. - С.237-238.

3. Особенности эпидемиологии дизентерии в Ставропольском крае (И.С.Тюменцева, В.И.Ефременко, Д.Г.Дворников и др.). -//Деп. в ВИНИТИ 30.01.95 г., N258-B95.

4. Усовершенствование методов экспресс-диагностики бактериальной дизентерии. Сообщение I. Получение дизентерийной полигрупповой адсорбированной гипериммунной сыворотки ( И.С.Тюменцева, В.И.Ефременко, E.H.Афанасьев). - //Деп. в ВИНИТИ 01.03.1996. - N2577-В96.

5. Усовершенствование методов экспресс-диагностики бактериальной дизентерии. Сообщение II. Разработка дизентерийного полигруппового диагностикума для иммуноферментного анализа (И.С.Тюменцева, В.И.Ефременко, Е.Н.Афанасьев).- //Деп. в ВИНИТИ 01.08.1996а.N2578-B96.

6. Усовершенствование методов экспресс-диагностики бактериальной дизентерии. Сообщение Ш. Разработка диагностической полигрупповой дизентерийной тест-системы для иммуноферментного анализа и количественной иммунофлуоресценции на основе магносор-бентов (И.С.Тюменцева, В.И.Ефременко, Е.Н.Афанасьев). - //Деп. в ВИНИТИ 01.08.19966. - N2579-B96.