Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение иммобилизованных ферментов и твердофазных диагностико-аналитических тест-систем на основе композиционных сорбентов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение иммобилизованных ферментов и твердофазных диагностико-аналитических тест-систем на основе композиционных сорбентов"

О",

О

Г"т«-

яг

■'А- см

На правах рукописи

ВОРОБЬЕВА ОКСАНА ВЛАДИМИРОВНА у

ПОЛУЧЕНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ И ТВЕРДОФАЗНЫХ ДИАГНОСТИКО-АНАЛИТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ КОМПОЗИЦИОННЫХ СОРБЕНТОВ

- Специальность ОЗ.ООЛЗ-биотехнолотя

АВТОРЕФЕРАТ днссертацна на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Стяврополь-1997

- -

Работа выполнена в Ставропольской государственной сельскохозяйственной академии

Научный руководитель - доктор химических наук, профессор Брыкалов Анатолий Валерьевич

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки-РФ, доктор биологических наук, профессор Дмитриев Анатолий Федорович, доктор биологических наук, с.н.с. Майский Виктор Григорьевич

Ведущая организация - Ставропольская государственная медицинская академия

Защита диссертации состоится года в

часов ь ауд. на заседании диссертационного совета'

К.120.53.05 ь Ставропольской государственной сельскохозяйственной академии, по адресу: 355017, Р1>, г.Ставрополь, пер. Зоотехнический. 1".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольской государственной сельскохозяйственной академии.

Автореферат разослан 1' У/11 ¿)Я7 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор сельскохозяйственных наук .

В.А.Погодаев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Основные направления современной биотехнологии предусматривают разработку сорбционных материалов и дальнейшее их применение в направлениях получения знзимоаналитических тест-систем, применяемых в областях медицины, сельского хозяйства и пищевой промышленности, а также конструирование высскозффектив-ных препаратов иммобилизованных ферментов, отличающихся термостабильностью, длительным сохранением активности.

Среди различных методов синтеза носителей для иммобилизации ферментов перспективно направление по технологии получения композиционных органскремнеземных сорбентов, основанное на химической сборке структурных единиц и методе формирования пористой структуры кремнеземных матриц в присутствии полимера и высокоселектиЕных лигандов (БрыкалоЕ, 1993). Данные носители отличаются стандартностью состава, исключают неспецифическую сорбцию, подверженность микробиологической атаке.

Для решения многих проблем в биохимии и биотехнологии проводятся исследования по определен™ активности энзимов в объектах растительного происхождения, что обусловленно влиянием ферментов на качество сельскохозяйственной продукции. Существующие методики определения активности знзимое, в частности уреазы, в биологических объектах имеют ряд недостатков (длительность экспозиции при инкубации, .низкие пределы чувствительности, трудоемкость операций) . Все это приводит к необходимости проведения научных исследований по разработке эффективных, высокоспецифичных методов, отличающихся простотой к воспроизводимостью, обеспечивающих получение достоверных данных при ферментативном анализе в различных биологических объектах.

В области медицины существует проблема разработки и применения эффективных диагностических тест-систем для обнаружения хели-кобактерной инфекции, отличающихся высоким уровнем специфичности, достоверности и доступности для' применения в малых специализированных лабораториях по гастроэнтерологии.

Цель работы. Разработка биотехнологии иммобилизованных фер1 ментов и ТЕердофазных диагностико-аналитических тест-систем на основе композиционных органокремнеземных сорбентов и исследование их свойств.

Задачи:

- получение композиционных органокремнеземных матриц с оптимальным составом и структурными характеристиками, легко поддающихся модифицированию и активированию для иммобилизации ферментов, коЕалентного связывания лигандов диагностических тест-систем;

- разработка методов иммобилизации ферментов (пепсина, липазы) с максимумом сохранения активности и стабильности;

- исследование влияния параметров (pH, температура, кратность использования) на активность иммобилизованных ферментов;

- разработка методов ковапентной иммобилизации индикатора шенолового красного на твердом носителе с сохранением его свойств;

- конструирование диагностических тест-систем для экспресс диагностики хеликобактер пилори (Y.pylori);

- конструирование аналитических тест-систем для определения активности уреазы в биологических объектах.

Настоящие исследования по иммобилизации пепсина и липазы перспективны для разработки других твердофазных энзимных препаратов.

Научная новизна. Впервые на основе разработанных композиционных органокремнеземных носителей создана биотехнология иммобилизованных ферментов - липазы и пепсина, включающая адсорбцию и ковалектное связывание фермента с носителями, полученными методом формирования пористой структуры на основе двуокиси кремния (аэросила A-3S0), оксида железа (Ш) и органических компонентов синтеза полисахаридного полимера декстрана, а также г -аминопропилт-ризтоксисилана, поверхность которых была активирована методами окисления, диазотирования и бензохиноноЕЫм методом. Данные методы позволили получить иммобилизованные препараты с сохранением активности липазы е пределах 88-99 %, а пепсина - до 100

Иммобилизованные препараты липазы по сравнению с растворимым Ферментом более чем на 35 % термостабильнее, имеют оптимум активности при значении pH 7,9-8,3. Возможности направленной регуляции смещения pH оптимума активности иммобилизованной липазы и достижение максимального уровня энзимной активности определяются оптимизацией выбора матриц, их кислотно-основными свойствами, а также методом иммобилизации.

На основе композиционных органокремнеземных матриц получен

- о -

ТЕердофазный индикационный сорбент методом коваяентного связывания с носителем фенолового красного.

Сконструированы диагностические тест-системы для экспресс-диагностики хеликобактер пилори i.H. pylori). Данные тест-системы характеризуются достоверностью и объективностью диагностики. возможностью многократного использования при соответствующих подготовительных операциях, имеют высокий уровень специфичности по уреазной реакции, а также исключают дорогостоящее оборудование и могут быть использованы не только б крупных диагностических центрах, но и е лабораториях эндоскопии и гастроэнтерологии любого уроЕня.

Для определения уреазной активности в биогумусе, соевом молоке, почвах и других объектах впервые разработана аналитическая тест-система на основе твердофазного индикатора, который при ферментативной реакции изменяет окраску с желтой в малиновую при значениях pH 7,4-9,2. Данная тест-система характеризуется низким пределом обнаружения активности уреазы (не менее 1СГб моль/л, а также простотой этапов проведения анализа и возможностью многоратного использования ферментспецифичного электрода.

Практическая значимость. На основе новых биотехнологических композиционных органокремнеземных сорбентов получены иммобилизованные препараты ферментов липазы и пепсина. Иммобилизованные препараты липазы были апробированы на кафедре технологии молока и молочных продуктов в лаборатории биохимии и биотехнологии Ставропольского технического университета. Данные препараты показали высокую эффективность при использовании в технологии получения лечебных продуктов для детского питания, что подтверждено заключением.

Сконструированные диагностические тест-системы прошли клинические испытания при диагностике Н.pylori больных язвенной болезнью в Ставропольском краевом диагностическом центре и детской городской клинической больнице им.Г.К.Филиппского. Результаты апробации с рекомендациями к внедрению в производство новых твердофазных тест-систем представлены в актах испытаний.

Для определения уреазной активности в различных биологических объектах (соевое молоко, биогумус) сконструирована аналитическая тест-систе&а на основе твердофазного индикатора.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на науч-

- б -

ных конференциях Ставропольской государственной сельскохозяйственной академии в 1995, 1996, 1997 годах; на I конференции Северо-Кавказского региона по биотехнологии (Ставрополь, 1995 г.); на Всероссийской конференции по современным достижениям биотехнологии (Ставрополь, 1996 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, С глав обзора литературы, з глав 'собственных исследований, заключения, выводоб и списка литературы, включающего 102 работы отечественных и 50 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 151 странице машинописи, иллюстрирована 13 таблицами и 14 рисунками и 4 приложениями.

Материалы и методы исследования. В качестве материалов были использованы Ферментные препараты: пепсин завода медицинских препаратов Стаьропрольского мясоконсервного комбината (ТУ49-215-73); липаза, полученная из молочного сырья методом, разработанным на кафедре ■ технологии молока и молочных продуктоь Ставропольского государственного технического университета.

Ферментативную активность растворимого и иммобилизованного пепсина определяли по методу Аксона. Дипазную активность определяли методом тонкослойной хроматографии по Прохоровой и Тупиковой, а также титрометрическим методом, основанном на титровании сьободных жирных кислот, выделяющихся в процессе липолиза.

Для сопоставления и подтверждения результатов использования разработанной нами твердофазной энзимоспеиишической тест-системы для диагностики хеликобактер пилори применяли тест-систему, основанную на иммуноферментком методе .анализа и цитологический метод определения хеликобактер пилори б биоптате после проведения эндоскопических исследований. Микроструктуру композиционных магно-сорбентов исследовали по методу_Д.Фрайфелдера на электронном микроскопе 1 Мй-ТЗООО. Обработка результатов эксперимента осуществлялась на основе общепринятых математических методик на персональном компьютере ЭВМ А336.

Результаты исследования. Синтез композиционных оргакокремне-земных носителей, используемых в направлениях получения энзи-мо-аналитических тест-систем и для конструирования высокоэффективных препаратов иммобилизованных Ферментов, осуществляли с использованием азросила А-380 в присутствии органических компонентов: полисахарндного полимера декстрана, поливинилового спирта

(ПВО, а также у - аминопропилтриэтоксисилана (АГМ-9). Технология получения органокремнеземных сорбентов Еключает 7 стадий' и представлена в виде схемы ниже. Сталин Ь6 характеризуют процесс получения композиционных органокремнеземных сорбентов, а стадия У отражает этап конструирования акалитикодиагностических тест-систем и иммобилизованных препаратов липазы и пепсина.

Полученные органокремнеземнне сорбенты состоят из композиционных аморфных частиц кремнезема, модифицированных органическими веществами. Величина удельной поверхности, объем и радиус пор определяется плотностью упаковки и размером корпускулярных частиц, связанных друг с другом в пространственном каркасе. Механизм образования композиционных сорбентов согласуется с данными, полученными по результатам исследования структурных характеристик и свойств исследованных сорбентор,. Воспроизводимость технологии получения органокремнеземных сорбентов подтверждается результатами, представленными в таблице 1. /

Разработанные композиционные сорбенты использованы для гсова-лентного связывания лигандов тест-систем и для иммобилизации липазы и пепсина.

При получении иммобилизованных ферментов важными факторами, влияющими на активность энзима, являются природа и структура носителя, способ иммобилизации, а также характер микроокружения активного центра фермента. Исследование кислотно-основных сеойств матрицы, значительно определяющих характер микроокружения иммобилизованного энзима, дает возможность регулирования активности энзимов путем направленного контролирования синтеза матриц с заданными кислотно-основными свойствами.

БренстедсЕскую кислотность 'и константы равновесия ионного обмена исследовали в водном растворе уксуснокислого аммония.

Рассчитанные для разных образцов органокремнеземных сорбентов средние значения Кср констант равновесия ионного обмена лежат в пределах 0,13-0,94 (х10б), а константы бренстедовских кислотных центров имеют значения в пределах 0,4х10~3 - 2,0х10~3мг.экв/м2

В результате системных исследований получен набор композиционных органокремнеземных сорбентов с оптимизированными структурными характеристиками, изучены кислотные свойства сорбционных материалов, которые далее использовались для химического модифицирования поверхности активными группами с последующим испсльзова-

I Схема

получения композиционных органокремнеземных сорбентов

Стадия 1.

Стадия 2.

Стадия 3.

Стадия 4.

Стадия 5.

Стадия 6.

Стадия 7.

[Получение гидрогеля из аэросила |А-380 и компонентов синтеза 1(Ре^Оз. декстрзна,поливинилового спирта и т -аминопропилтри-|этоксисилана

|СозреЕание и синерезис компо-|зиционного гидрогеля

¡Термообработка гидрогеля и об-

|разование ксерогеля __

|Механическое размельчение кСе-|рогеля органокремнеземного сор-|бента

I Выделение высокодисперсной |фракции органокремнеземного ¡сорбента методом рассева

¡Химическое модифицирование органокремнеземного сорбента активными группами (метод окисления, алкилирования, диазотиро-|рания,бензохиноновый,глутараль-|дегидный методы,карбодиимидный)

•/ \

ана- | ¡Синтез иммобилизованных |

¡Синтез твердофазных ан; |литико-диагностических I тест-систем

|препаратов липазы и пеп- | ¡сина |

Структурные характеристики композиционных органокремнеземных сорбентов

N п/п1Массовые соотношения компо-1 Структурные характеристики 1нентов синтеза I

1Ре20э1 декстран I З1О2 ¡Удельная ' ¡объем пор!Рйдиус I I или АГМ-9, I ¡поверхность¡см3/г шор.нм

I ¡ПВС I I м2/г ! I

ФДКС*

1. 1 1,8 ь 82 1,8 43

2. 1 1,8 5 по ОХ. 1,79 44

о О. 1 1.8 г 83 1.С1 44

4. 1 -1,8 5 82 1,78 43

ФАКС*

1. 1 П а. 5 117 1,73 29

2. 1 2 5 115 1,70 30

3. 1 2 5 116 1,71 29

ФПВКС*

1. 1 1,2 5 111 1,64 29

2. 1 . 1,2 5 111 1,65 30

3. 1 1,2 5 111 1,64 30

* ФДКС - ферродекстранокремнеземный сорбент

* ФАКС - ферроаминокремнеземный сорбент

* ФПВКС - феррополивинилкремнеземный сорбент

нием их при конструировании аналитико-диагностических тест-систем и для иммобилизации энзимов.

С целью получения активных групп на поверхности носителя нами разработаны методы химического модифицирования органокремнеземных сорбентов методом окисления, бензохиноновым, глутаральде-гидным, карбодиимидными методами, а также методами диазотирова-ния, алкилирования, активирования п-нитробензоилхлоридом и М-по-ливинилпирролидоном. Характеристики композиционных органокремне-

земных сорбентов представлены в таблице 2.

Характеристики органокремпеземных сорбентов

Наименование синтеза | Функциональные 1 группы

Поимечание

1.Аминирование аэросила А-380

- КН2

Получение диагностических тест-систем

2.Глутаральдегидный //0

метод - С

Иммобилизация фермен-

ТОБ

3.Активирование п-нитробензоил-хлоридсм

4.Аминирование макропористого 'стекла

5.Метод молекулярного наслаивания

6.Метод окисления

7.Метод алкилиро-вания

8.Бензохиноновый метод

9.Диазотирование

_// \\ _ Н02 - мн2 он

\ /

Э где Э-П / \

ОН;

- С

0 I !

//0 \ Н

- с - СН2С1 о

<0

о

= мсг

Иммобилизация ферментов

Иммобилизация ферментов

Иммобилизация фермен-,Зп,А1 тов

Иммобилизация ферментов

Иммобилизация-ферментов

Иммобилизация ферментов

//

Получение диагностических тест-систем, иммобилизация ферментов

10.Активирование Ы-поливинилпир-ролидоном

\ /

N

:сн2-сн2-

\\

Иммобилизация ферментов

Набср сорбционных композиционных органокремнеземных материалов применяли для ковалентной- иммобилизации индикатора (феноловый красный) различными методами. Методом факторного эксперимента установлено, что наилучшие результаты по иммобилизации красителя имеет метод азосочетания, обеспечивающий прочное закрепление ли-ганда на поверхности сорбента с сохранением его свойств. Полученный твердофазный индикатор (феноловый красный) использовали для разработки твердофазных тест-систем для диагностики хеликобактер пилори (Н.pylori) по уреазной реакции. Схема получения твердофазной тест-системы для обнаружения,Н.pylori представлена ниже.

Стадии 1, 2 характеризуют процесс получения твердофазного сорбента с ковалентно иммобилизованным на поверхности индикатором. Стадии 3, 4 включают перевод твердофазной индикационной формы сорбента из ионизированного в неионизированное состояние, с последующим высушиванием продукта. Стадия 5 отражает завершающий этап процесса получения диагностико-аналитической тест-системы для обнаружения Н.pi lory. На этой стадии был оптимизирован состав твердофазной (ТФ) тест-системы, включающий индикационный сорбент и субстрат энзимной реакции - мочевину в соотношении 1:0,03 по массе соответственно.

С использованием разработанной твердофазной тест-системы в отделении эндоскопии Ставропольского диагностического центра про-Еедены клинические испытания диагностики Н.pylori у 26 больных, проходящих курс лечения в гастроэнтерологическом отделении. Полученные данные клинических испытаний разработанной тест-системы согласуются по диагностике Н.pylori методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-системы "Анти-Н.pylori ИФА<Диаплюс>".

Преимуществами разработанной тест-системы являются: экспресс-диагностика, достоверность и объективность, высокий уровень специфичности уреазной реакции; возможность многократного использования твердофазной тест-системы, применение ТФ тест-системы в лабораториях эндоскопии и гастроэнтерологии любого ранга.

■С целью упрощения синтеза конструирования ТФ,тест-системы и сокращения времени проведения анализа для диагностики Н.pylori с использованием индикационных тест-систем нами разработан Еторой вариант энзимоспецифической тест-системы, основанный на включении индикатора (фенолового красного) в органический гель. В состав

- IS -

СХЕМА

получения энзимоспецифической диагностико-аналитической тест-системы для обнаружения Н.pylori

Стадия 1. ¡Синтез бензидинсодержащих композици- i i онных носителей на основе модифициро-I ¡ванного аминокремнеземного сорбента I

Стадия .2. Жовалентная иммобилизация индикатора (феноловый красный) реакцией Iазосочетания •

Стадия 3. ¡Перевод твердофазного индикационного ¡носителя из ионизированной в неиони-¡зироЕанную форму

Стадия 4. ¡Высушивание твердофазного индикаци- 1 Iонного сорбента 1

Стадия 5.

¡Получение ТЕердофазной индикационно- I

¡субстратной системы (индикационный I

¡сорбент в комплекте с субстратом эн- I

¡зимной реакции - мочевиной) I

данной тест-системы наряду с индикатором в гель включается субс-' трат энзимной реакции - мочевина. Хелико-тест основан на изменении окраски геля от желтой до розовато-красной в зависимости от концентрации ионов аммония, выделяющихся в результате энзимной реакции расщепления мочевины уреазой, продуцируемой Н.pylori.

Результаты клинических испытаний тест-системы на основе геля, с включенными в него индикатором и субстратом-мочевиной, согласуются с данными по диагностике Н.pylori цитологическим методом, широко применяемым в гастроэнтерологии.

■ Определение активности ферментоЕ в различных биологических объектах (соевое молоко, биогумус, почвы) имеет важное теоретическое и практическое значение в направлениях исследований сельскохозяйственной биотехнологии. Комплексное исследование биологических свойств соеЕого молока, биогумуса, почв е настоящее время необходимо для определения их качественных показателей.

Для определения уреазной активности биологических объектов методом, отличающимся простотой проведения анализа, воспроизводимостью, высокоспецифичнсстью разработана аналитическая тест-система на основе твердофазного индикационного сорбента. Полученный твердофазный индикатор при ферментативной реакции расщепления мочевины уреазой изменяет окраску с желтой в малиновую при значениях рН 7,2-9,2. В момент изменения окраски индикатора фенолового красного фиксировали значение рН раствора с помощью рН-метра марки рН-340. Концентрацию ионов аммония, выделявшегося в результате разложения мочевины уреазой,рассчитьшали по .известным 'формулам. Рассчитанные концентрации ионое аммония, соответствующие активности уреазы в соевом молоке и в биогумусе, полученном биотехнологическим методом с субстратом - наЕОз крупного рогатого скота и смешанных отходов сельского хозяйства, равна соответственно 5,48х10~б моль/л и 3,01х10~б моль/л .

Разработанная аналитическая тест-система на основе твердофазного индикатора позволяет упростить этапы проведения анализа и даёт возможность многократного использования ферментспецифичного электрода. Основным преимуществом данной тест-системы является низкий предел обнаружения активности уреазы, не менее 10~б моль/л.

С целью расширения области применения ферментов, повышения продолжительности их действия, термической устойчивости и стабильности нами исследован процесс иммобилизации ферментов (липазы и пепсина) на 15 типах носителей.

Исследованы методы получения иммобилизованных ферментов путем ковалентного связывания с носителем и физической адсорбцией. Полученные результаты по иммобилизации липазы наиболее эффективными методами представлены в таблице 3.

Анализ данных, полученных при расчете величин сохранения удельной активности, позволяет заключить, что найболее эффективны следующие методы иммобилизации липазы: адсорбция на аминоазроси-

Данные по иммобилизации липазы различными методами

Носители 1 | Белок | % иммоби- |Сохранение

| Группа | мг/г носи-| лизации ¡удельной ак-

1 | тель | тивности, X

1 1 2 1 3 | 4 1 5

Аминоаэроси- - МН2 логель на основе А-380

Ферродекстра-ноаэросилогель, - С метод окисления

//

16,7

12

41

28,4

99

97

Ферродекстра-ноаэросилогель, бензохиноновый метод

16,5

39,5

97

Аминоаэросило-гель,метод ал-' килирования

Ферроаминоаз-росилогель, метод диазоти-рования

Аминоаэросило-гель, активированный арил-' нитрогруппами

Аминированное макропористое стекло

//

С - СН2С1

- СН2-0Н

.// \\ _ш2 \ — /

- Ш2

20,6

17,8

15,8

37,2

48,9

42,5

37,5

88,6

72

88

64

63

\

догеле. полученном на основе аминированного аэросила А-.^'О: иммобилизация на аминоферроаэросилогел», активированием м^-тоеом виа-зотирования; ковалентное связывание липазы с феррез<-кстраназроси-догелем, активированном лерхлоратным окислением: ковалентное связывание с Ферродекстранаэросилогелем, активированном сензохиноно-еым методом.

Для этих методов иммобилизации липазы изучена кинетика процесса иммобилизации и рассчитаны величины констант скорости иммобилизации. Определены значения рн, при которых иммобилизованное препараты липазы имеют оптимум активности. Установлены диапазоны термостабильности иммобилизованной липазы.

Показана возможность путем выбора носителя и метода иммосг-лизации проводить направленную регуляцию смещения оптимума рН активности липазы изменением характера микроокружения носителя, действующего на активный центр иммобилизованного энзима.

Сравнительные данные по характеристикам иммобилизованной различными методами липазы представлены в таблице 4.

Иммобилизованные препараты липазы сохраняли активность ъ пределах У8-9У имели оптимум активности при рн ''.3-8.3.

Для определения диапазона термостабильностп растворимой и иммобилизованной липазы были использованы буферные растворы со значением рн, при которых наблюдалась наибольшая активность Фермента. Активность растворимой и иммобилизованной липазы определяли в диапазоне температур от 5 до 80 С° при инкубации в течение £4 часов в фосфатном буферном растворе с рН 7,94-8.'.:-.

Сравнительная характеристика растворимой и иммобилизованное липазы, включающая такие параметры как диапазоны термостабильности и рН стабильности, представлена в таблице п.

Полученные препараты липазы исследовали для изучения стабильности иммобилизованного энзима и для определения времени сохранения активности. Исследования показали, что наиболее эффективны с точки зрения многократности использования в технических процессах препараты ковалентно иммобилизованной липазы, в частности, содержаще магнитный компонент, обеспечивающий упрощение стадий отделения иммобилизованного энзима в реакторах непрерывного действия .

Иммобилизованные препараты липазы сохраняли' первоначальную активность'в течение ;•: месяцев и эффективны при' использовании в

Характеристики иммобилизованнои различными способами липазы

Носитель. |Иммобилизация|Удельная ¡Актив-способ иммо- I по белку |активность|ность

билизации 1-------------1 мкмоль/г | иммоби-

! мг/г|% иммо-|фермента !лизован-

5 сор- I билиза-1 | ной ли-

¡бента1ции | ¡пазы ЕО/г

¡•| \ | носителя

Ферроаэросило-гель. бензохи-коновый метод Ферроаэросило-гель. метод окисления Аминоаэросило-гель

Ферроаминоаэ-росилогель, метод диазотиро-ьания

16,5 39,5

28

16.

17,8

41

803

720

875 752

2000

1300

2200 1900

Оптимум РН

|Сохранение ак-|тивности.

7,94 97

8,3

7,94 7,94

97

99 88

Таблица 5 Сравнительные свойства растворимой и иммобилизованной липазы

в о и с т в а'

Растворимая липаза

| Иммобилизованная липаза

Оптимум активности энзима, °С Диапазон теомоста-бильности, &С Оптимум рН . Диапазон рН стабильности

Сохранение активности. ео времени

40

30-45

7,94 7,0-8,0

2,5 недели

40-80

40-80

7,94-8,3 7,0-8,5

Более 2-х месяцев

технологии лечебных препаратов детского питания.

Проведены исследования по получению препаратов иммобилизованного пепсина. В качестве носителей для иммобилизации пепсина использовали 15 типов сорбентов. Для растворимого и иммобилизованного пепсина были определены величины ферментативной активности методом Ансона.

■Анализируя значение величин удельных активностей ;; процент сохранения активностей, можно' отметить, что .100 сохранение

активности наблюдалось у фермента, иммобилизованного на «iw-ppo-декстраназросилсгеле. активированном бензехиноном. Высокий процент сохранения активности - 66-69 Z - соответствует пепсину, иммобилизованному на аминоазросилогеле, модифицированном методом алкилирования; на ферроаминоаэросилогеле. методом диазотирования, а также на поливинилаэросилогеле и ферродекстранаэросилсгеле. поверхность которого активирована методом окисления.

В результате проведенных исследований разработана технология эффективных препаратов иммобилизованного пепсина., сохраняющих 68-100 %-ную ферментативную активность. Полученные препараты могут быть использованы в пищевой промышленности и биотехнологии медицинских препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения композиционных органо-кремнеземных матриц для иммобилизации ферментов на основе метода направленного формирования пористой структуры, и проведены исследования структурных характеристик, кислотных свойств декстрано-кремнеземного, поливинилкремнеземнего сорбентов, а также Ферро-декстранкремнеземного и феррополивинилкремнеземного сорбентов. Достигнуто регулирование кислотных свойств поверхности матриц в пределах 0,25 х 106 - 0,46 х Ю6 среднего значения Кср константы равновесия ионного обмена при изменении компонентов синтеза оксида железа (III), декстрана и поливинилового спирта.

2. Методами иммобилизации липазы получены каталитически стабильные твердофазные знзимопрепараты с удельной активностью от 720 до 878 мкмоль/г фермента. Установлено, что на активность иммобилизованных ферментов оказывают влияние структурные, шизи-ко-химические характеристики композиционных органокремнеземных матриц и методы иммобилизации. Вензохиноковый и метод окисления обеспечивают 97 Z сохранения удельной активности иммобилизованного препарата фермента по сравнению с растворимой липазой. При иммобилизации методом адсорбции на аминоазросилогеле'и Ферроачино-азросилсг.еле, активированном методом диазотирования, сохранение удельной активности составило 88-99 X.

Полученные ковалентным связыванием липазУ с коипогищгон--

_ -1 о _

ными органокремнеземными матрицами твердофазные энзимопрепараты проявляют оптимальную активность при значениях рН 7,94-8,3: термостабильны при 40-80 °С при многократном применении, не набухают в различных растворителях. Магнитный компонент (ГеоОз) в составе композиционных матриц обеспечивает упрощение операций извлечения иммобилизованного фермента при использовании в реакторах непрерывного действия.

4. Разработаны иммобилизованные препараты пепсина методами физической адсорбции и ковалентного связывания с поверхностью композиционных органокремнеземных матриц, модифицированного си-лохрома, макропористого стекла. Обнаруженные отличия в значениях удельной активности твердофазных, энзимопрепаратов связаны с различиями в способах иммобилизации и влиянием микроокружения матрицы на активный центр пепсина. . Бензохиноновый метод модифицирования поверхности ферродекстранкремнеземного сорбента позволяет получить препараты иммобилизованного пепсина с сохранением ферментативной активности до 100 X.

5. Впервые на основе композиционного органокремнеземного сорбента аминоаэросилогеля методом ковалентного Связывания с носителем получен твердофазный индикатор феноловый красный, сконструирована тест-система для экспресс-диагностики по уреазной реакции хеликобактер пилори в слизистой гастродуоденальной зоне больных язвенной болезнью, отличающаяся простотой выполнения анализа, высоким уровнем достоверности, надежности и воспроизводимости, что подтверждено клиническими испытаниями в .Ставропольском краевом диагностическом центре.

6. На -основе гелеобразующих компонентов (а^ар-агар) и индикатора - феноловый красный разработана экспресс-диагностическая тест-система для обнаружения в клинической практике Н.руГог! по уреазной реакции, характеризующаяся сокращенными и упрощенными этапами технологии.

7. Впервые сконструирована аналитическая тест-система на основе твердофазного индикатора для определения активности уреазы в биологических объектах, которая отличается от общепринятых методов экспрессностью проведения анализа, упрощением этапов его проведения, имеет предел обнаружения ферментативной активности 10_б моль/л при возможности многократного использования твердофазного индикатора аналитической тест-системы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Целесообразно внедрение в практику сельскохозяйственного' производства твердофазной энзимо-аналитической тест-системы для определения активности уреазы в различных биологических объектах-. Изучение возможности расширения направлений • применения разработанной тест-системы.

2. На основе результатов клинической апробации тест-системы ■для определения хеликобактер пилори при заболеваниях гастритом типа В, язвой желудка и двенадцатиперстной кишки необходима разработка документации и внедрёние тест-системы в практику здравоохранения.

3. Результаты изучения свойств иммобилизованных препаратов липазы с высоким уровнем удельной активности, возможностью регулирования оптимума pH активности необходимо реализовать для определения направлений практического использования иммобилизованного фермента в сельском хозяйстве, пищевой промышленности, а также при решении экономических проблем.

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ:

1. Брыкалов A.B., Воробьева О.В. Новые композиционные носители для иммобилизации ферментов //Современные достижения биотех-

' нологии: Материалы Всероссийской конференции. - Ставрополь, 1996, - С.279.

2. Исследование процессов иммобилизации в биотехнологии получения препаратов липазы /А.В.Брыкалов, О.В.Воробьева, Т.П.Кузь-минова, С.М.Кунижев //Теоретические и практические аспекты основных положений расчета процессов и аппаратов пищевых производств: Тезисы докладов к 65-летию Московского государственного университета прикладной биотехнологии. - М., 1996. - С.14.

3. Брыкалов A.B., Воробьева О.В.Пасечников В.Д. Разработка твердофазной тест-системы для диагностики хеликобактер . пилори //Современные, достижения биотехнологии: Материалы Всероссийской конференции. - Ставрополь, 1996, - С.274.

4; Брыкалов A.B., Воробьева О.В. Способы иммобилизации липазы на органокремнеземных носителях //Информ. лист.,-. N 86-97. -СтавЦНТИ.'- Ставрополь, Í997. - 3 с.

5. Брыкалов A.B., Воробьева О.В., Романенко Е.С. Определение уреазной активности в биотехнологических объектах на основе твердофазной тест-системы //Информ. лист, N 85-97. СтавЦНТИ. -Ставрополь, 1997. -2с.

3.97. Т.100 экз. Печ.л.1. СтГСХА. 1997 г.