Разработка технологии формирования биосенсорных тест-систем на основе композиционных материалов

Филиппова, Анастасия Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка технологии формирования биосенсорных тест-систем на основе композиционных материалов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии формирования биосенсорных тест-систем на основе композиционных материалов"

На правах рукописи

0050^°""

Филиппова Анастасия Михайловна

Разработка технологии формирования биосенсорных тест-систем на основе композиционных материалов

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 ФЕВ 2013

Ставрополь - 2013

005049800

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Кавказский федеральный университет»

Научный руководитель: кандидат биологических наук, Воробьева Оксана Владимировна

Официальные оппоненты:

Тюменцева Ирина Степановна, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное казённое учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, заведующая научно-производственной лабораторией препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций

Ядерец Вера Владимировна, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, научный сотрудник лаборатории биотехнологии стероидов

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Защита диссертации состоится «26» февраля 2013 г. в 14.00 час. на заседании диссертационного совета Д 208.109.01 при ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора по адресу: 355035, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора.

Автореферат разослан «_» января 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Жарникова Ирина Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На сегодняшний день одним из перспективных направлений развития биотехнологии является разработка композиционных материалов различной структуры. Полученные композиции обладают уникальными свойствами, которых не имеют отдельные их составляющие, что значительно расширяет спектр их применения. Преимуществом высокомолекулярных композиций перед обычными материалами является возможность варьирования различных свойств и характеристик в зависимости от предназначения получаемого материала.

Технологии создания композиционных материалов включают в себя ряд открытий последних лет в области химии и физики высокомолекулярных систем и структур (Володькин Д.В., 2005; Тулинов А.Б., Корнеев A.A., Овчаренко JI.B., Гармаш И.И., 2007; Андрианова Г.П., 2010; Буниятзаде И.А., Мамедов Г.Г. и др., 2010; Межиковский С.М., 2010; Олтаржевская Н.Д., Коровина М.А., 2010).

Использование научных подходов при конструировании композиционных материалов, направленных на изменение их структуры, реакционной способности и др., позволяет получить новый материал с заранее заданными свойствами в качестве основы для иммобилизации ферментов.

Иммобилизация открывает новые перспективы применения биокатализаторов, повышая их стабильность при хранении и позволяя использовать фермент многократно.

Работы по созданию биосенсоров на основе иммобилизованных ферментов актуальны и востребованы. Все большее количество ферментов используется при получении уникальных устройств, детектирующих наличие ингибиторов в различных объектах окружающей среды.

В настоящее время проблема загрязнения окружающей среды имеет приоритетное социальное и экономическое значение. Отходы производства, газообразные, жидкие и твердые вещества, поступающие в окружающую среду от различных источников, вызывают деградацию среды обитания и наносят ущерб здоровью населения, влияя на нервную и сердечно-сосудистую системы, органы кроветворения, репродуктивную сферу (Ушаков И.Б., Володин A.C., Губин В.В. и др., 2003).

Для повышения урожайности в сельском хозяйстве часто используются разнообразные фосфорорганические и хлорорганические пестициды (дихлор-дифенилтрихлорэтан (ДДТ), гексахлоран, хлорофос, метафос, тиофос, карбофос, метилмеркаптофос, дихлофос, диазинон, хлорпирифос), медьсодержащие ядо-

химикаты (бордосская жидкость, сульфат меди, хлорокись меди), обладающие высокой токсичностью и избирательным действием, значительная часть которых попадает в продукты растениеводства и животноводства.

Одним из наиболее часто используемых пестицидов в агропромышленное™ является карбофос — высокотоксичный фосфорорганический инсектицид, хорошо проникающий через кожу, способный угнетать действие фермента ацетилхо-линэстеразы.

В результате прямого окисления сульфидов меди кислородом воздуха или сульфатредуцирующими бактериями происходит загрязнение природных гидросистем токсичными ионами меди. Миграция меди в природных поверхностных и грунтовых водах связана с высокой подвижностью ее иона в сульфатных средах (Патент ЬШ № 2182131).

Существующие физико-химические методы контроля достаточно трудоемки и малопригодны для проведения анализа вне лаборатории (Стойкова Е.Е, 1997; Евтюгин Г.А., 1999).

Ферментативные методы анализа являются перспективным направлением в диагностике окружающей среды при проведении эколого-аналитического мониторинга. Высокая селективность и чувствительность к ингибиторам ферментов -загрязнителям окружающей среды - является основанием для создания на их основе биосенсорных тест-систем с такими параметрами, как простота и удобство в применении, высокая чувствительность и надежность (Ильичева Н.Ю., 2002).

Цель диссертационной работы: разработка биотехнологии получения высокомолекулярных композиционных полимерных материалов, обладающих ферментативным действием, и биосенсорных тест-систем на их основе.

Основные задачи исследования:

1. Синтезировать композиционные материалы на основе высокомолекулярного природного полисахарида, белкового комплекса и пластификатора.

2. Исследовать физико-химические свойства полученного биополимерного материала (спектры поглощения в УФ - области, предел прочности, статический коэффициент, относительное удлинение при разрыве).

3. Разработать метод иммобилизации фермента ацетилхолинэстеразы и исследовать влияние различных факторов на его активность (рН среды, температура). Изучить динамику потери удельной активности в различных температурных условиях в процессе хранения.

4. Иммобилизовать фермент панкреатин в композиционные материалы и исследовать влияние некоторых факторов на его удельную активность (рН сре-

ды, температура). Изучить влияние времени постановки реакции, динамику потери удельной активности фермента панкреатина при хранении в течение длительных интервалов времени в различных температурных условиях.

5. Сконструировать биосенсорные тест-системы на основе высокомолекулярных композиционных материалов с иммобилизованными ферментами аце-тилхолинэстерой и панкреатином.

6. Провести апробацию биосенсорных тест-систем на содержание токсикантов в модельных системах.

Научная новизна работы. Получены новые композиционные материалы, способные к разложению в естественных условиях и обладающие следующими преимуществами: прозрачность, пластичность, механическая прочность структуры при разрывном напряжении.

Впервые проведена иммобилизация ферментных препаратов ацетилхо-линэстеразы и панкреатина в структуру высокомолекулярных композиционных материалов с высоким процентом сохранения их удельной активности.

Проведены исследования факторов, влияющих на чувствительность, селективность и снижение удельной активности ферментов при их иммобилизации в структуру композиционных материалов.

Впервые разработаны биосенсорные тест-системы на основе композиционных материалов с иммобилизованными ферментами ацетилхолинэстеразой, панкреатином, которые могут быть использованы для контроля остаточных количеств карбофоса и ионов меди (II) в объектах окружающей среды.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработаны технологические приемы получения высокомолекулярных композиционных материалов, обладающих ферментативным действием.

Получены высокомолекулярные композиционные материалы с иммобилизованными в их структуру ферментами, способные выступать в качестве биосенсорных тест-систем для определения ионов меди (II) и карбофоса в анализируемых образцах.

Разработан метод определения активности фермента панкреатина по прототипу определения амилазной активности. Упрощена методика определения активности фермента ацетилхолинэстеразы относительно ранее известной.

Разработаны методические подходы к использованию полученных биосенсорных тест-систем.

Материалы диссертации используются в лекциях и на практических занятиях курсов «Высокомолекулярные соединения» (лекция «Композиционные

биополимерные материалы как основа для иммобилизации ферментов»), «Введение в нанотехнологии» (лекция «Структура и свойства наноматериалов») ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет». Имеются акты испытаний: «Акт испытаний биосенсорной тест-системы на основе панкреатина» (от 10 октября 2012 г.), составленный в лаборатории биогеохимии и экологической экспертизы Института естественных наук ФГАОУ ВПО «СевероКавказский федеральный университет»; «Акт испытаний биосенсорной тест-системы на основе ацетилхолинэстеразы» (от 18 сентября 2012 г.), составленный в лаборатории защиты растений ГНУ Ставропольский НИИСХ Россельхоз-академии. На разработанные биосенсорные тест-системы составлены стандарты организации: «Тест-система биосенсорная для обнаружения остаточных количеств карбофоса в объектах внешней среды» (СТО 02067965-003-2012 от 15 октября 2012 г.); «Тест-система биосенсорная для обнаружения остаточных количеств меди в объектах внешней среды» (СТО 02067965-002-2012 от 15 октября 2012 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Методические подходы к конструированию композиционных полимерных материалов нелинейной архитектуры на основе природного полисахарида -метилцеллюлозы, пластификатора - глицерина и белкового комплекса - желатина, их физико-химические свойства.

2. Определены физико-химические параметры иммобилизации ферментов ацетилхолинэстеразы и панкреатина в структуру композиционной матрицы, обеспечивающие сохранение их высокой удельной активности.

3. Сконструированные биосенсорные тест-системы на основе композиционных материалов с иммобилизованными ферментами для обнаружения инсектицида карбофоса, детектирования ионов меди (II) в объектах окружающей среды и методические подходы к их использованию отличаются экспрессностью, специфичностью, не требуют дорогостоящего оборудования.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на: Московской международной конференции «Мир биотехнологии» (Москва, 2010), 55 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2010), I Международной научной конференции «Наука в современном обществе» (Ставрополь, 2011), IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011), 56 научно-практической конференции «Университетская

наука - региону» (Ставрополь, 2011), 57 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2012).

Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена самостоятельно. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с кандидатом биологических наук Воробьевой О.В. (ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет»).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 15 опубликованных работах (в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК - 6 статей).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 139 страницах, содержит 19 таблиц и 42 рисунка. Список литературы включает 126 отечественных и зарубежных литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована цель проведения исследований.

Материалы и методы исследований

Были использованы композиции, содержащие в качестве основы возобновляемый природный полисахарид - метилцеллюлозу (МЦ). В качестве реагента-пластификатора, для придания пластичности материалу, использовали глицерин. Для получения прочного композиционного материала в его структуру вводили природный белковый комплекс - желатин.

Прочность композиционных материалов определяли при деформации путем растяжения (ГОСТ 17035-86). Для испытания использовали разрывные и универсальные испытательные машины с электромеханическим приводом (ГОСТ 7855-84).

Относительное удлинение при разрыве определяли на разрывной машине (ГОСТ 14236-81). За результат испытаний принимали среднее арифметическое результатов пяти определений отдельно в продольном и поперечном направлениях.

За статический коэффициент трения принимали значение тангенса угла наклона плоскости, при котором начиналось скольжение двух поверхностей испытуемой пленки (ГОСТ 10354-82).

Номинальную толщину композиции определяли по ГОСТ 17035-86. Для измерений применяли устройства и приборы по ГОСТ 10593-74, ГОСТ 6933-81, ГОСТ 11007-66, ГОСТ 11098-75.

Каталитическую активность фермента ацетилхолинэстеразы оценивали по количеству уксусной кислоты в продуктах расщепления ацетилхолин хлорида. Оптическую плотность замеряли на ФЭК-КФК-2 в пробе против контроля в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 540 нм (Филиппович Ю.Б., Егорова Т. А., Севастьянова Г.А., 1982).

Количественное определение удельной активности панкреатина проводили по методу определения амилазной активности фермента, в качестве субстрата использовали крахмал.

Биосенсорные тест-системы с иммобилизованными ферментами ацетилхо-линэстеразой и панкреатином были апробированы на модельных системах.

Математическую обработку результатов экспериментов осуществляли на компьютере (программы Microsoft Excel, Statistica 6.0). Для подтверждения достоверности результатов, полученных при исследовании, применяли статистические методы (Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., 1969; Скутч Д., Уэст Д., 1979).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Формирование структуры основы высокомолекулярных композиций для иммобилизации ферментов

В основу синтеза материалов, обладающих деструктивной способностью, положен принцип разрушения межмолекулярных и внутримолекулярных связей в естественных условиях среды (Воробьева О.В., Иванова А.М., Аванесян С.С. и др., 2011).

Получали 3-5% раствор метилцеллюлозы. Для этого метилцеллюлозу вносили в воду температурой 50+60°С. Смесь выдерживали 1,5-¡-2 часа. В полученный коллоидный гель метилцеллюлозы вводили белок животного происхождения — желатин в концентрации от 3 до 8% от общей массы составляющих композиции. В качестве пластификатора, придающего изделию гибкость, использовали глицерин в концентрации от 0,5 до 1% от общей массы составляющих композиции. Полученную композицию наносили на гладкую стеклянную поверхность желаемой формы толщиной от 1 до 3 мм и оставляли на воздухе при температуре 20н-22°С на 2-3 суток до полного высыхания (Патент № 2395540). Для анализов использовали по пять экспериментальных серий каждого препарата.

Для получения данных сравнительного анализа спектров поглощения в УФ - области разработанных композиционных материалов и традиционных материалов проводили измерения оптической плотности на спектрофотометре СФ-46 (рисунок 1).

Результаты свидетельствуют о повышении барьера поглощения, что может быть связано с повышением плотности упаковки в аморфных областях МЦ за счет модификации структуры молекулами глицерина и желатина (Воробьева О.В., Андрусенко С.Ф., Волосова Е.В. и др., 2011). £ 4,0

X - длина волны

—♦—Полиэтилен -»-Целлофан -»-Синтезируемая пленка Рисунок 1 - Сравнение спектров поглощения полученных композиционных

материалов, целлофана и полиэтилена Композиции исследованы на прочность по длине и ширине, относительное удлинение при разрыве по длине и ширине, определен статический коэффициент трения. Полученные данные сравнили с показателями полиэтилена марки Н (таблица 1).

Таблица 1 - Сравнительные механические характеристики полиэтилено-

вой пленки (марки Н) и разработанного образца

Наименование показателя Образцы материалов

Полиэтилен марки Н (ГОСТ 10354-82) Разработанный образец Состав композиции: МЦ (53,8 масс. %); желатин (33,3 масс. %); глицерин (10,3 масс. %); вода (2,6 масс. %)

Номинальная толщина материала, мм 0,040 0,047

Прочность при растяжении, МПа (кгс/см2), не менее <*по ширине 13,70 15,20

®подлине 14,70 15,26

Относительное удлинение при разрыве, %, не менее: О..0 ширине 350 200

<т„„ длине 300 150

Статический коэффициент трения 0,1-0,5 0,1-0,5

мм 0,60 0,71

1о, мм 15 15

ts=4,3; Р=0,95

Из таблицы 1 видно, что разработанные композиционные материалы по механическим свойствам не уступают пленкам из полиэтилена.

Иммобилизация фермента ацетилхолинэстеразы

Способность карбофоса ингибировать действие фермента ацетилхолинэстеразы можно использовать для конструирования биосенсорной тест-системы по обнаружению остаточных количеств инсектицидов в объектах окружающей среды. Фосфатный участок инсектицида карбофоса, имитируя сложную группу ацетилхолина, выступающего в качестве субстрата для фермента ацетилхолинэстеразы, блокирует активный центр фермента. Положительно заряженный атом фосфора притягивается к свободной гидроксильной группе серина, а один из спиртовых остатков притягивается к карбоксилат-аниону.

Для иммобилизации ацетилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.7) в структуру композиционного материала использовали водный раствор фермента в объеме 0,1 мл с концентрацией 0,15%. Для анализа активности растворимого и иммобилизованного фермента была модифицирована методика с использованием в качестве субстрата ацетилхолин хлорида.

К 0,1 мл раствора фермента ацетилхолинэстеразы (15 мг в 10 мл дистиллированной воды) добавляли 2 мл буферного раствора (рН 8,4) и термостатирова-ли 30 минут при 37°С. Параллельно термостатировали 2% водный раствор ацетилхолин хлорида. К анализируемому раствору ацетилхолинэстеразы добавляли 0,5 мл 2% водного раствора ацетилхолин хлорида, смесь перемешивали и инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Ферментативную реакцию останавливали, добавляя по 0,2 мл 1% водного раствора карбофоса. В качестве контрольной пробы использовали смесь, в состав которой ингибитор вносили перед термо-статированием. По окончании реакции в каждую пробу вносили по 2,1 мл дистиллированной воды и по 0,3 мл индикатора фенолового красного (0,02% водный раствор). Выделившееся количество уксусной кислоты оценивали по малиновой окраске на ФЭК-КФК-2 при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Количество выделившейся кислоты определяли по разности экс-тинкции контрольной и опытной проб.

С целью оптимизации количества фермента ацетилхолинэстеразы в составе биосенсорной тест-системы использованы растворимый и иммобилизованный ферменты в количествах 0,01; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25 и 0,30 мг. Количество фермента 0,2 мг соответствует оптимуму разности удельной активности ацетил-

холинэстеразы реакций без ингибирования и с ингибированием при определении карбофоса (рисунки 2, 3).

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Количество фермента, мг Введение инсектицида в конце —■—Введение инсектицида в начале

Рисунок 2 - Влияние количества фермента на удельную активность растворимого фермента ацетилхолинэстеразы

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Количество фермента, мг —♦—Введение инсектицида в конце —»—Введение инсектицида в начале

Рисунок 3 - Влияние количества фермента на удельную активность иммобилизованного фермента ацетилхолинэстеразы

Оптимизация количества субстрата предполагала определение карбофоса, используя различные количества ацетилхолин хлорида: 0,027; 0,055; 0,082; 0,110 и 0,220 ммоль. Оптимальное количество субстрата ацетилхолин хлорида на 0,2 мг растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы - 0,055 ммоль (рисунки 4, 5).

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25

Количество субстрата, ммоль

—^Введение инсектицида в конце ■ Введение инсектицида в начале

Рисунок 4 - Влияние количества субстрата на удельную активность растворимого фермента ацетилхолинэстеразы

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 Количество субстрата, ммоль —♦—Введение инсектицида в конце ■ Введение инсектицида в начале

Рисунок 5 - Влияние количества субстрата на удельную активность иммобилизованного фермента ацетилхолинэстеразы

С целью изучения влияния рН среды на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы проводили постановку ферментативной реакции в буферном растворе с различным значением рН: 5,0; 7,5; 8,4; 10,0; 11,0; 12,0. Определено, что для растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы рабочий диапазон рН от 7 до 9, оптимум при рН = 8,4.

Для изучения влияния температуры на удельную активность фермента проводили постановку ферментативных реакций при температурах 25°С, 37°С, 45°С, 55°С и 60°С. При введении инсектицида с увеличением температуры удельная активность растворимого и иммобилизованного фермента увеличивается, что можно объяснить изменениями в структуре карбофоса — вследствие чего его способность как ингибитора снижается. Оптимум температуры, при которой разность удельной активности растворимого и иммобилизованного фермента ацетилхолинэстеразы в контрольной и опытной пробах максимальна, соответствует 37°С.

Для выбора оптимальных условий проведения ферментативной реакции исследованы влияние времени ингибирования и времени постановки ферментативной реакции. Оптимумы времени ингибирования и времени ферментативной реакции совпадают и равны 30 минутам, как для растворимого, так и для иммобилизованного фермента ацетилхолинэстеразы.

Проведены исследования по сохранению удельной активности иммобилизованного фермента и фермента, находящегося в растворе во времени.

К третьему месяцу хранения иммобилизованный фермент ацетилхолинэсте-раза сохраняет 75% удельной активности, а фермент ацетилхолинэстераза, находящийся в растворе, сохраняет 8,4% удельной активности. Полученные данные по сохранению активности фермента-анализатора, иммобилизованного в композиционные материалы, делают возможным создание на его основе биосенсорной тест-системы.

Разработана тест-система для обнаружения остаточных количеств инсектицида карбофоса в объектах окружающей среды, представляющая собой композиционный материал (ш = 37 мг), включенный в него фермент ацетилхолинэстераза (т = 0,2 мг) и индикатор феноловый красный (ш = 0,02 мг).

Для разработки способа обнаружения инсектицида была составлена модельная система, которая представляла собой почву с внесенными количествами карбофоса: 0,76х10"3 ммоль; 3,8* 10"3 ммоль; 8,5х10"3 ммоль; 15x10"3 ммоль; ЗОх 10"3 ммоль; 45х 10"3 ммоль.

Анализ проводили в следующей последовательности. Образцы почвы массой 5 г, предварительно обработанные раствором карбофоса, помещали в коническую колбу V = 250 мл и заливали 20 мл дистиллированной воды. Колбу с суспензией встряхивали в течение 60 минут на аппарате для встряхивания с частотой 50 Гц. После декантации отбирали апиквоту (V = 2,6 мл) для анализа. В исследуемую апиквоту помещали тест-систему, содержащую фермент в количестве 0,2 мг и индикатор в количестве 0,02 мг (масса композиции 37 мг). Далее смесь термостатировапи 30 минут при 37°С. После термостатирования прибавляли 2% раствор субстрата в объеме 0,5 мл, 2 мл буферного раствора (рН = 8,4), смесь термостатировали 30 минут при 37°С. По истечении времени фиксировали изменение окраски исследуемого раствора визуально в соответствии со шкалой и на ФЭК-КФК-2 (рисунки 6,7).

50 п

£ £ 45 -

в ^ 40 -

е « 35 -

а ■Л 30 -

.м л -

§ й 20 -15 -

г- 10 -

2 £ 5; 5 -0

10 15 20 25 30 35 40 45

Количество инсектицида, ммоль* 10~3 -Введение инсектицида в конце -Введение инсектицида в начале

Рисунок 6 - Влияние количества карбофоса на растворимый фермент аце-тилхолинэстераза

Количество инсектицида, ммольх10~3 —•—Введение инсектицида в конце -е-Введение инсектицида в начале

Рисунок 7 - Влияние количества карбофоса на иммобилизованный фермент ацетилхолинэстераза

Количество карбофоса, равное 0,76x10"3 ммоль, снижает удельную активность растворимого и иммобилизованного фермента ацетилхолинэстеразы на 21,4% и 20,8% соответственно. Дальнейшее увеличение количества инсектицида с 0,76хЮ"3 до 45* 10"3 ммоль полностью угнетает действие фермента. Таким образом, чувствительность определения концентрации инсектицида карбофоса лежит в диапазоне от 0,76*103 до 45,0* 10"3 ммоль для разработанной тест-системы следующего состава: композиционный материал (т = 37 мг), содержащий фермент ацетилхолинэстеразу (ш = 0,2 мг) и индикатор феноловый красный (т = 0,02 мг) в исследуемой пробе V = 2,6 мл.

Иммобилизация фермента панкреатина

Разработка биосенсорной тест-системы для определения ионов меди предполагает использование в качестве одного из компонентов тест-системы фермента, активность которого зависит от действия ионов меди на активный центр. Установлено, что за ферментативную амилазную активность панкреатина ответственны свободные аминогруппы, поэтому при действии ионов меди, вероятнее всего, образуется комплекс аминогруппы с ионами меди, который блокирует фермент.

Для иммобилизации фермента панкреатина (это пищеварительное ферментное средство, представляющее собой экстракт содержимого поджелудочной железы) в структуру композиционного материала разработана методика, согласно которой фермент в структуру композиций вводили в виде его раствора объемом 1 мл (15 мг порошкового панкреатина в 50 мл дистиллированной воды).

Исследования по оптимизации количества фермента и субстрата в биосенсорной тест-системе показало, что массовое соотношение компонентов в системе субстрат-фермент при постановке ферментативной реакции следующее: 1 мг крахмала на 0,003 мг фермента. Анализ влияния времени ингибирования и времени ферментативной реакции свидетельствует о том, что оптимум времени ингибирования для растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина совпадает и равен 30 минутам, при этом наблюдается максимум разности удельной активности опытной и контрольной проб.

Для исследования длительности сохранения каталитической активности ферментного препарата, заключенного в композиции, образцы тест-систем хранили в течение 4 месяцев при температурах +4°С и +20°С. При этом остаточную активность измеряли один раз в месяц. Из полученных данных можно сделать вывод: композиции, хранившиеся при температуре +4°С, к четвертому месяцу имели стабильный процент сохранения биокаталитической активности, а композиции, хранившиеся при температуре +20°С, потеряли 78% своей удельной активности. При включении протеолитических ферментов в композиционные покрытия можно добиться стабилизации их против автолиза за счет изменения микроокружения.

Было изучено влияние рН среды и температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина. Полученные данные указывают на то, что оптимумы рН среды и температуры проведения ферментативной реакции совпадают как для растворимого, так и для иммобилизованного ферментов панкреатина и соответственно равны 6,9 и 37СС (рисунки 8, 9,10,11).

Рисунок 8 - Динамика изменения удель- Рисунок 9 - Динамика изменения удель-

ной активности растворимого фермента панкреатина от температуры и рН при введении ионов меди в конце анализа (контроль)

ной активности растворимого фермента панкреатина от температуры и рН при введении ионов меди в начале анализа (опыт)

Рисунок 10 - Динамика изменения удельной активности иммобилизованного в композиционные материалы фермента панкреатина от температуры и рН при введении ионов меди в конце анализа

Рисунок 11 - Динамика изменения удельной активности иммобилизованного в композиционные материалы фермента панкреатина от температуры и рН при введении ионов меди в начале анализа

(контроль) (опыт)

Разработана биосенсорная тест-система для обнаружения ионов меди в объектах окружающей среды, представляющая собой композиционный материал (т = 33 мг), включающий фермент (т = 0,003 мг).

Для разработки способа обнаружения меди была составлена модельная система, которая представляла собой образцы дистиллированной воды, содержащие ионы меди в следующих количествах: 0,25 мкг; 2,5 мкг; 25 мкг; 125 мкг; 250 мкг и 375 мкг. Для анализа использовали шесть экспериментальных серий препарата иммобилизованного фермента панкреатина.

Анализ проводили в следующей последовательности. В анализируемую пробу (V = 2,75 мл) помещали композиционный материал с иммобилизованным ферментом (ш = 0,003мг) и термостатировали 30 минут при 37°С. Затем прибавляли буферный раствор (рН = 6,9; V = 1,6 мл) и раствор субстрата (V = 1 мл 0,1% раствора крахмала) и инкубировали в течение 5 минут. По истечении времени реакцию останавливали подкисленным раствором индикатора йода (раствор, приготовленный разведением в 50 раз 0,2Ы раствором соляной кислоты основного раствора, состав которого: 2 г йода, 0,66 г йодида калия в 20 мл воды). Содержание меди определяли качественно по окраске раствора и количественно на ФЭК-КФК-2 при X = 430 нм (рисунки 12, 13).

„ 1,8

£ I

1.6 1,4 1,2 1.0 0.8 0,6 0.4

£ ?

25 125 250 375

1,25

!,5 . 25 125 250 375

¡1 5 I

I & І -е-

1,6 1.4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4

'¿5 2£0 3^5

11 0,25

; 0,25

•^25

125 250 375

С 0 50 100 150 200 250 300 350 400

Количество меди, мкг

—»—Введение меди в начале -•—Введение меди в конце

Рисунок 12 - Влияние количества ионов меди (II) на растворимый фермент панкреатин

С. О 50 100 150 200 250 300 350 400 Количество меди, мкг —♦—Введение меди в начале -^Введение меди в конце

Рисунок 13 - Влияние количества ионов меди (II) на иммобилизованный фермент панкреатин

Из полученных данных видно, что 125 мг меди полностью ингибируют 3 мкг фермента панкреатина. Сравнительный анализ метода обнаружения ионов меди (II) с использованием биосенсорной тест-системы на основе фермента панкреатина и существующих методов по ГОСТ 4388-72 показал специфичность и высокую чувствительность разработанной биосенсорной тест-системы. Определению ионов меди не мешают ионы висмута, железа и свинца. Постановка анализа требует небольшого объема исследуемой пробы (V = 2,75 мл). Анализ позволяет проводить детекцию ионов меди на уровне предельно допустимой концентрации (ПДК) меди в объектах внешней среды.

Таким образом, возможно получение экспрессных биосенсорных тест-систем на основе высокомолекулярных композиционных материалов с включенными ферментными препаратами, обладающими специфичностью и чувствительностью, которые не требуют дорогостоящего оборудования и специально подготовленного персонала для проведения анализа.

выводы

1. Синтезированы композиционные материалы нелинейной архитектуры на основе высокомолекулярного природного полисахарида - метилцеллюлозы, пластификатора - глицерина и белкового комплекса - желатина. Прочность разработанных композиционных материалов на разрыв по длине и ширине, статический коэффициент трения соответствуют данным полиэтилена марки Н при одинаковых условиях и составляют 15,26 и 15,20 МПа и 0,1 - 0,5 соответственно.

2. Разработан метод и оптимизированы параметры иммобилизации фермента ацетилхолинэстеразы в структуру высокомолекулярных композиционных материалов, обеспечивающие сохранение высокой удельной активности фермента: количество ацетилхолинэстеразы - 0,2 мг; количество субстрата ацетилхолин хлорида - 0,055 ммоль; рН буферного раствора - 8,4; температура - 37°С; время ингибирования — 30 минут; время постановки ферментативной реакции - 30 минут.

3. Проведена иммобилизация фермента панкреатина в композиционные материалы и определены оптимальные параметры синтеза: рН среды - 6,9; температура - 37°С; количество фермента - 0,003 мг; время ингибирования - 30 минут; время постановки ферментативной реакции - 5 минут.

4. На основе полученных высокомолекулярных биоразлагаемых композиций разработаны биосенсорные тест-системы и определены диапазоны концентраций остаточных количеств ингибитора фермента ацетилхолинэстеразы - инсектицида карбофоса (от 0,76х10"3 до 45*10"3 ммоль) и блокатора активного центра фермента панкреатина - ионов меди (II) (от 0,02 до 1,45 мг/л), детектируемых с помощью сконструированных тест-систем.

5. Биосенсорные тест-системы, обладающие высокой специфичностью, чувствительностью, не требующие дорогостоящего оборудования и специально подготовленного персонала для проведения анализа, могут быть использованы для энзиматического определения фосфорорганического инсектицида карбофоса и ионов меди (II) в объектах окружающей среды.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Андрусенко С.Ф., Воробьева О.В., Филь A.A., Волосова Е.В., Аванесян С.С., Иванова A.M., Каданова A.A. Пленка для «авоськи» // Экология и жизнь. -2009. - № 10. - С. 30-32 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).

2. Воробьева О.В., Иванова А.М., Аванесян С.С., Волосова Е.В., Андрусенко С.Ф., Каданова A.A. Получение ферментативных пленочных материалов на основе природных полисахаридов // Известия высших учебных заведений. Химия и химическая технология. Иваново. - 2011. - Т. 54, Вып. I. - С. 53-56 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).

3. Воробьева О.В., Андрусенко С.Ф., Волосова Е.В., Аванесян С.С., Иванова A.M., Каданова A.A. Модификация природных полимеров для синтеза материалов, подвергающихся биодеградации // Химия в интересах устойчивого развития. - 2011. - № 19. - С. 137-140 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).

4. Филиппова A.M., Аванесян С.С., Воробьева О.В. Тест-системы на основе иммобилизованных ферментов для определения пестицида паратион-метила и ионов меди // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. - 2011. - Т. 7., № 4. - С. 7-12 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).

5. Воробьева О.В., Филиппова A.M., Аванесян С.С. Иммобилизация фермента панкреатина в композиционные материалы и создание на их основе тест-систем для обнаружения остаточных количеств меди // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 6; URL: www.science-education.ru/106-7946 дата обращения: 29.12.2012 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).

6. Филиппова A.M., Воробьева О.В., Аванесян С.С. Биосенсорная тест-система на основе иммобилизованного фермента ацетилхолинэстеразы для определения карбофоса // Современные проблемы науки и образования. - 2012. — № 6; URL: vvww.science-education.ru/106-8023 дата обращения: 29.12.2012 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).

7. Филь A.A., Волосова Е.В., Воробьева О.В., Аванесян С.С., Ростова М.С., Иванова A.M. Иммобилизация ß - гиалуронидазы методом включения в био-разлагаемые полимерные пленки // Материалы V съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: Москва 2-4 декабря 2008 г. / Под ред. Р.Г. Васильева. - М.: ИАЦ, 2008. - С. 187-188.

8. Волосова Е.В., Иванова A.M., Воробьева О.В., Филь A.A., Аванесян С.С. Гиалуронидазные биоразлагаемые полимерные материалы // Материалы V еже-

годной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр южного научного центра РАН: 8-27 апреля 2009 г. - Ростов-на-Дону: ЮНЦ РАН, 2009. -С. 11-12.

9. Иванова A.M., Воробьева О.В., Аванесян С.С. Получение пленочных материалов с иммобилизованным ферментом ß-гиалуронидаза // Материалы IV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Научный потенциал студенчества в XXI веке» Том первый. Естественные и технические науки. - Ставрополь: СевКавГТУ, 2010. - С. 457-460.

10. Иванова A.M., Аванесян С.С., Волосова Е.В. Биосенсоры для обнаружения фосфорорганических пестицидов // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: Материалы 55 научно-методической конференции «Университетская наука - региону» (6-30 апреля 2010 года).-Ставрополь: СГУ, 2010. - С. 101-102.

11. Иванова A.M., Аванесян С.С., Воробьева О.В., Филь A.A. Тест-системы для обнаружения метафоса // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: Материалы 56 научно-методической конференции "Университетская наука - региону" (7-30 апреля 2011 года). - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2011.-С. 168-171.

12. Иванова A.M., Аванесян С.С., Воробьева О.В. Разработка тест-системы для обнаружения ионов Си2+ в объектах окружающей среды // Материалы IV Международной научно-практической конференции - Ростов-на-Дону, 22-25 сентября 2011 г. Ростов н/Д: Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2011. - С. 213.

13. Иванова А.М., Аванесян С.С., Воробьева О.В. Разработка тест-системы на основе иммобилизованного фермента для обнаружения ионов Си2+ в объектах окружающей среды // Наука в современном обществе: материалы I Международной научной конференции. - Ставрополь: Центр научного знания «Логос», 2011.-С. 3-5.

14. Филиппова A.M., Аванесян С.С., Воробьева О.В. Иммобилизация панкреатина в пленочные материалы // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: Материалы 57 научно-методической конференции "Университетская наука - региону" (2-30 апреля 2012 года). - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2012 - С. 125-128.

15. Филиппова A.M., Воробьева О.В., Аванесян С.С. Разработка тест-системы на основе иммобилизованного фермента холинэстеразы // Физико-химическая биология. Материалы международной научной интернет-конференции - Ставрополь: СтГМА, 2012 - С. 29-32.

Выражаю искреннюю благодарность инженеру кафедры медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет» Аванесян Светлане Суреновне за помощь, оказанную при постановке и проведении научных исследований.

ПЕРЕЧЕНЬ

УФ

оп

ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет» МЦ МПа ДДТ

УК/г фермента ПДК

ФЭК-КФК-2

СОКРАЩЕНИИ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИИ, СИМВОЛОВ И ЕДИНИЦ

- ультрафиолетовая область

- оптическая плотность

- федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Кавказский федеральный университет»

- метилцеллюлоза

- мега паскаль

- дихлордифенилтрихлорэтан

- количество уксусной кислоты на 1г фермента

- предельно допустимая концентрация

- фотоэлектроколориметр КФК-2

Подписано в печать 21.01.2013 Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Уч. печ. л. 1,34. Тираж 100 экз. Заказ № 013

Отпечатано в типографии ООО «Губерния» 356231, Ставропольский край, с. Татарка, ул. Тельмана д. 1/17 т. 956-626, 955-282, e-mail: kavpoly@bk.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Филиппова, Анастасия Михайловна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ И ЕДИНИЦ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Носители для построения биосенсорных тест-систем.

1.2. Биосенсорные тест-системы на основе иммобилизованных биологически активных веществ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ, ОБОРУДОВАНИЕ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и реактивы.

2.2. Оборудование.

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Определение удельной активности растворимого фермента ацетилхолинэстеразы.

2.3.2. Приготовление фосфатного буферного раствора.

2.3.3. Метод определения прочности полимерных материалов при деформации растяжения (ГОСТ 17035-86).

2.3.4. Определение относительного удлинения при разрыве.

2.3.5. Определение статического коэффициента трения.

2.3.6. Определение номинальной толщины пленки (ГОСТ 17035-86).

2.3.7. Определение массовой концентрации меди (ГОСТ 738872).

2.3.8. Приготовление буферного раствора (рН = 8,4).

2.3.9. Методы математической и статистической обработки данных.

Глава 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ КОМПОЗИЦИОННЫХ МАТЕРИАЛОВ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ ФЕРМЕНТАМИ

3.1 Формирование структуры основы высокомолекулярных композиций для иммобилизации ферментов.

3.2. Иммобилизация фермента ацетилхолинэстеразы.

3.2.1 Оптимизация количества фермента ацетилхолинэстеразы в составе биосенсорной тест-системы.

3.2.2. Влияние количества субстрата на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы.

3.2.3. Изучение влияния рН среды на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы.

3.2.4. Влияние температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы.

3.2.5. Влияние времени ингибирования и времени постановки ферментативной реакции на изменение удельной активности растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы

3.2.6. Конструирование тест-системы и разработка способа обнаружения инсектицида карбофоса в почве.

3.3. Иммобилизация фермента панкреатина.

3.3.1. Оптимизация количества фермента панкреатина в составе биосенсорной тест-системы.

3.3.2. Изучение влияния рН среды и температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина.

3.3.3. Влияние времени ингибирования на изменение удельной активности растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина.

3.3.4. Влияние времени ферментативной реакции на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина.

3.3.5. Конструирование биосенсорной тест-системы на основе фермента панкреатина и разработка методики обнаружения ионов меди в воде.

3.3.6. Изучение влияния сопутствующих ионов тяжелых металлов на определение ионов меди с использованием биосенсорной тест-системы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии формирования биосенсорных тест-систем на основе композиционных материалов"

На сегодняшний день одним из перспективных направлений развития биотехнологии является разработка композиционных материалов различной структуры. Полученные композиции обладают уникальными свойствами, которых не имеют отдельные их составляющие, что значительно расширяет спектр их применения. Преимуществом высокомолекулярных композиций перед обычными материалами является возможность варьирования различных свойств и характеристик в зависимости от предназначения получаемого материала.

Технологии создания композиционных материалов включают в себя ряд открытий последних лет в области химии и физики высокомолекулярных систем и структур (Володькин Д.В., 2005; Тулинов А.Б., Корнеев A.A., Овча-ренко Л.В., Гармаш И.И., 2007; Андрианова Г.П., 2010; Буниятзаде И.А., Ма-медов Г.Г., Азизов A.A. и др. 2010; Межиковский С.М., 2010; Олтаржевская Н.Д., Коровина М.А., 2010).

В настоящее время проблема загрязнения окружающей среды имеет приоритетное социальное и экономическое значение. Отходы производства: газообразные, жидкие и твердые вещества, поступающие в окружающую среду из различных источников, вызывают деградацию среды обитания и наносят ущерб здоровью населения, влияя на нервную и сердечнососудистую системы, органы кроветворения, репродуктивную сферу (Ушаков И.Б., Володин А. С., Губин В. В. и др., 2003).

Для повышения урожайности в сельском хозяйстве часто используются разнообразные фосфорорганические и хлорорганические пестициды (ди-хлордифенилтрихлорэтан (ДДТ), гексахлоран, хлорофос, метафос, тиофос, карбофос, метилмеркаптофос, дихлофос, диазинон, хлорпирифос), медьсодержащие ядохимикаты (бордосская жидкость, сульфат меди, хлорокись меди), обладающие высокой токсичностью и избирательным действием, значительная часть которых попадает в продукты растениеводства и животноводства.

Одним из наиболее часто используемых в агропромышленное™ пестицидов является карбофос - высокотоксичный фосфорорганический инсектицид, хорошо проникающий через кожу, способный угнетать действие фермента ацетилхолинэстеразы.

Существующие физико-химические методы контроля достаточно трудоемки и малопригодны для проведения анализа вне лаборатории (Стойкова Е.Е., 1997; Евтюгин Г. А., 1999).

Ферментативные методы анализа являются перспективным направлением в диагностике окружающей среды при проведении эколого-аналитического мониторинга. Высокая селективность и чувствительность к ингибиторам ферментов - загрязнителям окружающей среды является основанием для создания на их основе биосенсорных тест-систем с такими параметрами, как простота и удобство в применении, высокая чувствительность и надежность (Ильичева Н.Ю., 2002).

Основные задачи исследования:

4. Иммобилизовать фермент панкреатин в композиционные материалы и исследовать влияние некоторых факторов на его удельную активность (рН среды, температура). Изучить влияние времени постановки реакции, динамику потери удельной активности фермента панкреатина при хранении в течение длительных интервалов времени в различных температурных условиях.

5. Сконструировать биосенсорные тест-системы на основе высокомолекулярных композиционных материалов с иммобилизованными ферментами ацетилхолинэстерой и панкреатином.

6. Провести апробацию биосенсорных тест-систем на содержание токсикантов в модельных системах.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Получены новые композиционные материалы, способные к разложению в естественных условиях и обладающие следующими преимуществами: прозрачность, пластичность, механическая прочность структуры при разрывном напряжении.

Впервые разработаны биосенсорные тест-системы на основе композиционных материалов с иммобилизованными ферментами ацетилхолинэстера-зой, панкреатином, которые могут быть использованы для контроля остаточных количеств карбофоса и ионов меди (II) в объектах окружающей среды. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

РАБОТЫ

Разработаны технологические приемы получения высокомолекулярных композиционных материалов, обладающих ферментативным действием.

Разработаны методические подходы к использованию полученных биосенсорных тест-систем.

Материалы диссертации используются в лекциях и на практических занятиях курсов «Высокомолекулярные соединения» (лекция «Композиционные биополимерные материалы как основа для иммобилизации ферментов»), «Введение в нанотехнологии» (лекция «Структура и свойства наноматериа

- юлов») ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет». Имеются акты испытаний: «Акт испытаний биосенсорной тест-системы на основе панкреатина» (от 10 октября 2012 г.), составленный в лаборатории биогеохимии и экологической экспертизы Института естественных наук ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет»; «Акт испытаний биосенсорной тест-системы на основе ацетилхолинэстеразы» (от 18 сентября 2012 г.), составленный в лаборатории защиты растений ГЫУ Ставропольский НИИСХ Россельхозакадемии. На разработанные биосенсорные тест-системы составлены стандарты организации: «Тест-система биосенсорная для обнаружения остаточных количеств карбофоса в объектах внешней среды» (СТО 02067965-003-2012 от 15 октября 2012 г.); «Тест-система биосенсорная для обнаружения остаточных количеств меди в объектах внешней среды» (СТО 02067965-002-2012 от 15 октября 2012 г.).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Методические подходы к конструированию композиционных полимерных материалов нелинейной архитектуры на основе природного полисахарида - метилцеллюлозы, пластификатора - глицерина и белкового комплекса - желатина, их физико-химические свойства.

3. Сконструированные биосенсорные тест-системы на основе композиционных материалов с иммобилизованными ферментами для обнаружения инсектицида карбофоса, детектирования ионов меди (II) в объектах окружающей среды и методические подходы к их использованию отличаются экс-прессностью, специфичностью, не требуют дорогостоящего оборудования.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты диссертационной работы были представлены на: Московской международной конференции «Мир биотехнологии» (Москва, 2010), 55 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2010), I Международной научной конференции «Наука в современном обществе» (Ставрополь, 2011), IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011), 56 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2011), 57 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2012).

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Диссертационная работа выполнена самостоятельно. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с кандидатом биологических наук Воробьевой О.В. (ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет»).

ПУБЛИКАЦИИ

Основное содержание диссертации отражено в 15 опубликованных работах (в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК - 6 статей).

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 139 страницах, содержит 19 таблиц и 42 рисунка. Список литературы включает 126 отечественных и зарубежных литературных источников.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Филиппова, Анастасия Михайловна

выводы

1. Синтезированы композиционные материалы нелинейной архитектуры на основе высокомолекулярного природного полисахарида - метилцел-люлозы, пластификатора - глицерина и белкового комплекса - желатина. Прочность разработанных композиционных материалов на разрыв по длине и ширине, статический коэффициент трения соответствуют данным полиэтилена марки Н при одинаковых условиях и составляют 15,26 и 15,20 МПа и 0,1 - 0,5 соответственно.

2. Разработан метод и оптимизированы параметры иммобилизации фермента ацетилхолинэстеразы в структуру высокомолекулярных композиционных материалов, обеспечивающие сохранение высокой удельной активности фермента: количество ацетилхолинэстеразы - 0,2 мг; количество субстрата ацетилхолин хлорида — 0,055 ммоль; рН буферного раствора - 8,4; температура - 37°С; время ингибирования - 30 минут; время постановки ферментативной реакции - 30 минут.

3. Проведена иммобилизация фермента панкреатина в композиционные материалы и определены оптимальные параметры синтеза: рН среды -6,9; температура - 37°С; количество фермента - 0,003 мг; время ингибирования - 30 минут; время постановки ферментативной реакции - 5 минут.

4. На основе полученных высокомолекулярных биоразлагаемых композиций разработаны биосенсорные тест-системы и определены диапазоны концентраций остаточных количеств ингибитора фермента ацетилхолинэстеразы - инсектицида карбофоса (от 0,76x10"3 до 45x10"3 ммоль) и блокатора активного центра фермента панкреатина - ионов меди (II) (от 0,02 до 1,45 мг/л), детектируемых с помощью сконструированных тест-систем.

- 117

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка биосенсорных тест-систем на основе композиционных материалов с иммобилизованными в их структуру ферментными препаратами представляет большой интерес с точки зрения использования в качестве анализаторов остаточных количеств токсикантов в объектах окружающей среды.

Синтезированы высокомолекулярные композиционные материалы на основе природного полисахарида метилцеллюлозы с использованием глицерина как реагента-пластификатора и белкового комплекса желатина для модификации реологических характеристик с иммобилизованными в их структуру ферментами классов гидролаз и протеаз. В ходе выполнения исследований было доказано, что иммобилизованные ферменты сохраняют свою способность к деструкции субстрата на 95-98% по сравнению с растворимыми ферментами.

Структурные особенности высокомолекулярных композиционных материалов были подтверждены исследованием их физико-химических свойств.

Спектры поглощения в УФ - области свидетельствуют о повышении барьера поглощения разработанных композиционных материалов по сравнению с полиэтиленовыми пленочными материалами марки Н. Это может быть связано с повышением плотности упаковки в аморфных областях МЦ за счет модификации структуры молекулами глицерина и желатина.

Прочностные характеристики материала-основы обеспечивают его практическое применение. Полученные данные по величинам прочности на разрыв по длине и ширине- 15,26 и 15,20 (МПа), статический коэффициент трения - от 0,1 до 0,5 при одинаковых условиях соответствуют данным полиэтилена марки Н. Относительное удлинение при разрыве разработанных композиционных материалов по длине и ширине составляет 150% и 200% соответственно. Такие характеристики обусловлены изменением потенциальной энергии межмолекулярного взаимодействия, преимущественно по

-111 тенциальной энергии вращения вокруг ковалентных связей монозвеньев МЦ.

Процесс построения биосенсорной тест-системы для обнаружения карбофоса предполагал разработку и оптимизацию метода иммобилизации фермента ацетилхолинэстеразы в высокомолекулярные композиционные материалы и метода определения активности растворимого и иммобилизованного фермента, где в качестве субстрата использовали ацетилхолин хлорид. Удельная активность иммобилизованного фермента - 43,1 ммоль УК/г фермента, что составляет 96% удельной активности растворимого фермента ацетилхолинэстеразы.

Оптимизация количества фермента, необходимого для анализа, показала, что при использовании 0,2 мг фермента ацетилхолинэстеразы наблюдается максимум разности удельной активности фермента в реакции без ин-гибирования и с ингибированием.

Следующим этапом являлось исследование количества субстрата, необходимого для анализа. Полученные данные свидетельствуют о том, что оптимальное количество субстрата ацетилхолин хлорида на 0,2 мг растворимого и иммобилизованного фермента ацетилхолинэстеразы составляет 0,055 ммоль.

С целью анализа влияния рН буферного раствора на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы был поставлен ряд экспериментов, которые показали, что для растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы рабочий диапазон рН - от 7 до 9, оптимум рН - 8,4.

Анализ влияния температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы показал, что оптимум температуры, при которой разность удельной активности растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы в контрольной и опытной пробах максимальна, соответствует 37°С. В опытной пробе с увеличением температуры удельная активность растворимого и иммобилизо

- 112ванного ферментов увеличивается вследствие снижения его активности как ингибитора. В контрольной пробе с увеличением температуры активность фермента снижается, что связано с термоинактивацией фермента.

Установлено, что время ингибирования и время постановки ферментативной реакции растворимого и иммобилизованного ферментов ацетил-холинэстеразы одинаково и составило 30 минут.

В процессе длительного хранения иммобилизованный фермент сохраняет высокую ферментативную активность по сравнению с растворимым ферментом. В результате хранения иммобилизованного препарата в течение четырех месяцев при температуре +4°С удельная активность фермента составила 64%, а при температуре +18-25°С - 11,2%. Следует отметить, что ферменты, являясь биологически активными субстанциями, способны терять активность в процессе хранения.

Проведенные исследования по сохранению удельной активности иммобилизованного фермента и фермента, находящегося в растворе во времени (температура хранения +4°С) показали, что к третьему месяцу хранения иммобилизованный фермент ацетилхолинэстераза сохраняет 75% удельной активности, а фермент ацетилхолинэстераза, находящийся в растворе, сохраняет 8,4% удельной активности. Полученные данные по сохранению активности фермента-анализатора, иммобилизованного в композиционные материалы, подтверждают возможность создания на его основе биосенсорной тест-системы.

Сконструированная тест-система для обнаружения остаточных количеств инсектицида карбофоса в объектах окружающей среды представляет собой композиционный материал (ш = 37 мг), включенный в него фермент ацетилхолинэстеразу (ш = 0,2 мг) и индикатор феноловый красный (ш = 0,02 мг). Для разработки способа обнаружения инсектицида была составлена модельная система, которая представляла собой образцы почвы с внесенными количествами карбофоса. Полученные данные свидетельствуют о том, что количество карбофоса, равное 0,76x10"3 ммоль, снижает удельную актив

-113ность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы на 21,4% и 20,8% соответственно. Дальнейшее увеличение количества инсек

3 3 тицида с 0,76x10" до 45x10' ммоль полностью угнетает действие фермента. Таким образом, чувствительность разработанной тест-системы при определении концентрации инсектицида карбофоса лежит в диапазоне от 0,76x10"3 до 45,0x10"3ммоль.

С целью получения биосенсорной тест-системы для детекции ионов меди был разработан и оптимизирован метод иммобилизации фермента панкреатина в высокомолекулярные композиционные материалы и метод определения активности растворимого и иммобилизованного фермента, где в качестве субстрата использовали крахмал. Удельная активность иммобилизованного фермента составляет 2,73x105 мг крахмала/г фермента или 97,5% удельной активности растворимого фермента панкреатина.

В результате оптимизации количества фермента панкреатина, выяснили, что количество фермента, приходящееся на 1 мг субстрата крахмала, составляет 3 мкг и соответствует оптимуму разности удельной активности в контрольной и опытной пробах. Повышение удельной активности фермента при увеличении его количества в условиях количественного сохранения ингибитора (2,5 мкг) связано с высокой каталитической активностью амилазы, входящей в состав панкреатина.

Установлено, что оптимумы рН среды и температуры проведения ферментативной реакции совпадают как для растворимого, так и для иммобилизованного фермента панкреатина и равны 6,9 и 37°С соответственно.

Анализ влияния времени ингибирования фермента панкреатина показал, что в опытной пробе с увеличением времени ингибирования удельная активность растворимого и иммобилизованного ферментов уменьшается. Оптимум времени ингибирования для растворимого и иммобилизованного ферментов совпадает и равен 30 минутам, при этом наблюдается максимум разности удельной активности в опытной и контрольной пробах.

При исследовании влияния времени ферментативной реакции на удельную активность панкреатина было определено, что оптимум по времени, при котором наблюдается максимум удельной активности в опытной и контрольной пробах, соответствует 5 минутам. Это является одним из преимуществ при построении биосенсорных тест-систем.

Важным аспектом является вопрос длительности сохранения каталитической активности ферментного препарата, заключенного в композиции. В этой связи образцы тест-систем хранились в течение 4 месяцев при температурах +4°С и +20°С. Композиции, которые хранились при температуре +4°С, к четвертому месяцу хранения имели стабильный процент сохранения биокаталитической активности, а композиции, которые хранились при температуре +20°С, потеряли 78% удельной активности.

Проведенные исследования по сохранению удельной активности иммобилизованного фермента и растворимого фермента панкреатина во времени позволили сделать вывод о том, что к третьему месяцу хранения при температуре +4°С иммобилизованный фермент сохранил 70% удельной активности, а фермент, находящийся в растворе, сохранил 10,1% удельной активности. Полученные данные свидетельствуют о том, что иммобилизация фермента предотвращает потерю его активности при длительном хранении.

Была разработана биосенсорная тест-система для обнаружения ионов меди в объектах окружающей среды, представляющая собой композиционный материал (ш =33 мг), включающий фермент панкреатин (ш = 0,003 мг). Для разработки способа обнаружения меди были составлены модельные системы, которые представляли собой образцы воды, содержавшие ионы меди в различных количествах. Анализ полученных данных позволил сделать вывод, что 125 мг меди полностью ингибируют 3 мкг фермента панкреатина. При наличии минимально определяемого количества меди в анализируемом растворе удельная активность растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина снижается на 13% и 14% соответственно.

Полученные высокомолекулярные композиции с иммобилизованным ферментом панкреатином удобны в использовании, не токсичны, прочны.

Сравнительный анализ метода обнаружения ионов Си2+ с использованием биосенсорной тест-системы на основе фермента панкреатина и существующих методов (ГОСТ 4388-72) показал специфичность разработанной биосенсорной тест-системы и широкий диапазон определения ионов меди. Определению ионов меди не мешают ионы кадмия, железа и свинца в количестве 10 мкг в 1 мл. Постановка анализа требует небольшого объема исследуемой пробы (V = 2,75 мл). Анализ позволяет проводить детекцию меди на уровне предельно допустимой концентрации (ПДК) меди в объектах внешней среды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Филиппова, Анастасия Михайловна, Ставрополь

1. Абзалов Р.Ф., Юсупов P.A., Гиматдинова В.Р., Сопин В.Ф. Контроль ионов токсичных металлов в сточных водах гель-иммобилизованными сорбентами // Вестник Казанского технологического университета. -2009. -№ 1.-С. 12-18.

2. Автина Н.В., Панкрушева Т.А., Автина Т.В., Спичак И.В. Микробиологические исследования при разработке стоматологической пленки антибактериального действия // Вестник новых медицинских технологий.- 2010. Т. XVII. № 1. - С. 120-121.

3. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. М.: Высшая школа, 1988. - С. 44-69.

4. Алесковский В.Б. Стехиометрия и синтез твердых соединений. М.: Наука, 1976. - 140 с.

5. Алесковский В.Б. Химия твердых веществ. М.: Высшая школа, 1978. -350 с.

6. Аль-Вадхав Х.А. Углеродные носители и синтез палладиевых катализаторов на их основе // Вестник МИТХТ им. М.В. Ломоносова.- 2012. Т. 7. № 1.-С. 3-18.

7. Амелин В. Г., Третьяков А. В. Ткани из искусственных и натуральных волокон с иммобилизованными реагентами в химических тест-методах анализа // Журнал аналитической химии. Академиздатцентр "Наука" РАН, 2006. Т.61. № 4 - С. 430-435.

8. Андрианова Г.П. Физико-химические основы создания и модификации многослойных композиционных пористых и волокнисто-пористых полимерных материалов // Дизайн и технологии. 2010. - № 17. - С. 70-81.

9. Архипова В. Н., Дзядевич С. В., Жаффрезик-Рено Н., Мартле К., Сол-даткин А.П. Биосенсоры для анализа гликоалкалоидов в клубнях картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. - Т. 44. № 3. -С. 347-352.

10. Атаханов A.A. О возможности создания лекарственной формы микрокристаллической целлюлозы, полученной из хлопковой целлюлозы

11. Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья. Материалы IV Всероссийской конференции. 21-23 апреля 2009 г.: в 2 кн. / под ред. Базарновой Н.Г., Маркина В.И. Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2009. - Кн. 1. - 306 с.

12. Аюпов Р.Х., Акберова Н.И., Тарасов Д.С. Докинг производных пири-доксина в активном центре холинэстераз // Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки. 2011. - Т. 153. № 3. - С. 107-118.

13. Балекаев А.Г., Балаян М.А. Способ определения сернистого ангидрида в воздухе // СССР № 1797054. БИ, 1993. № 7.

14. Белова A.B., Юданова Т.Н., Гальбрайх JI.C. Получение биологически активных целлюлозных волокон, модифицированных обработкой кси- 119бетеном-цел // Химия растительного сырья. 2010. - № 4. - С. 11-15.

15. Белова С.А., Ефимова H.A., Мальцева Н.В. Индикатор влажности газо-во-воздушных потоков на основе силикагеля с ванадийоксидным монослоем на поверхности // Химические нанотехнологии и функциональные наноматериалы. Сб. науч. тр. СПб, 2003. - С. 32-33.

16. Белых И.А., Грек A.M., Сакун A.B., Марущенко В.В., Гаташ C.B. Ана-литы в биосенсорах // Бюф1зичний вюник. -2010. № 25 (2).

17. Борисова Л.И., Некрасов Л.И., Киселев A.B. Адсорбция сывороточного глобулина на макропористых силикагелях // Журнал физической химии. 1979. - Т.43. № 2.- С. 529-531.

18. Брайнина Х.З., Стожко Н.Ю., Малахова H.A., Иванова A.B. Вольтампе-рометрические сенсоры для on-site анализа // Нано- и микросистемная техника. 2002. - № 2. - С. 10-14.

19. Бредихина Т.А., Панкрушева Т.А., Медведева O.A., Шведов Г.И. Разработка геля с азитромицином для лечения урогенитальных инфекционных заболеваний // Вестник новых медицинских технологий. 2011. - Т. 18. №4.-С. 177-179.

20. Брей В.В. Соотношение равновесной и кинетической кислотности твердых катализаторов // Теоретическая и экспериментальная химия. -2009. Т.45. № 3. - С. 173 - 175.

21. Брыляков В.М., Хасанханова М.Н., Шаповалов О.И. Способ получения микрокристаллической целлюлозы// SV 1479455.С08В15/02. -1974.

22. Буниятзаде И.А., Мамедов Г.Г., Азизов A.A., Алосманов P.M., Магер-рамов A.M. Магнитный сорбент для удаления тонких нефтяных пленок // Известия вузов. Химия и химическая технология. 2010. - Т. 53. Вып.- 1204.-С. 114-117.

23. Введение в прикладную энзимологию / Березин И.В., Мартинек К., Под ред. Березина И.В., Мартинека К. М.: МГУ, 1982. - С. 26.

24. Волова Т.Г. Биотехнология. Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. - С. 106.

25. Володькин Д.В. Иммобилизация белков в микрочастицы, сформированные методом последовательной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов: автореф. дис. . канд. хим. наук: 02.00.15, 03.00.23. М., 2005. - 24 с.

26. Волосникова Е.А. Исследование процесса образования конъюгатов для создания вакцинных конструкций // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2011. - Т. 31. № 6. - С. 141145.

27. Воробьева О.В. Биосорбенты для иммобилизации белковых комплексов ферментных препаратов // Биотехнология. 2004. - № 2. - С. 70.

28. Воробьева О.В., Иванова A.M., Аванесян С.С., Волосова Е.В., Андру-сенко С.Ф. Модификация природных полимеров для синтеза материалов подвергающихся биодеградации // Химия в интересах устойчивого развития.-2011.-№ 19. С. 137-140.

29. Галанов С.И., Сидорова О.И., Максимов Ю.М., Кирдяшкин А.И., Гущин А.Н. Катализаторы перовскитной структуры на металлокерамиче-ском носителе // Известия Томского политехнического университета. -2006. Т. 309. № 5. - С. 77-80.

30. Джулиева Г.Х., Махкамов K.M., Мухидинов З.К. Композиция на основе карбоксиметилцеллюлозы и казеина как носитель лекарственных веществ // Доклады Академии наук Республики Таджикистан. 2009. - Т. 52. № 11.-С. 868-872.

31. Дзантиев Б.Б. Современные биохимические методы анализа: возможности и перспективы // Астраханский медицинский журнал. 2011. - Т. 6. №2.-С. 209-210.

32. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.-539 с.

33. Дубей JI.B., Дубей И.Я. Получение бифункционального полимерного носителя на основе силикагеля для синтеза 3-меченных олигонуклео-тидов // Biopolymers and cell. 2005. - T. 21. № 4. - С. 365-369.

34. Евтюгин Г.А. Электрохимические биосенсоры на основе холинэстеразы для группового определения токсикантов и диагностики загрязнения объектов окружающей среды: автореф. дис. . д-р. хим. наук: 02.00.02 -Саратов, 1999.-401 с.

35. Егорова Л.С., Теслина O.A. Тест-метод определения пероксида водорода реагентными индикаторными полосами // Известия Алтайского государственного университета. 2009. - № 3. - С. 73-74.

36. Ефременко В.И. Магнитоуправляемые иммобилизованные системы в микробиологическом мониторинге природных очагов и объектов внешней среды на наличие возбудителей опасных инфекционных болезней // Микробиология. 1997. - № 2. - С. 102-106.

37. Жарникова И.В. Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей: дис. . д-р биол. наук: 03.00.23. Ставрополь, 2004.

38. Жижаев A.M., Брагин В.И., Михайлов А.Г. Способ локализации техногенной меди // Патент РФ № 2182131, C02F1/62, C02F1/28. 10.05.2002 г.

39. Зейналов H.A., Ахмедов И.Д., Тапдыгов Ш.З. Поли-п-винил-пирролидон как носитель для иммобилизации трипсина // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. 2010. - № 8. - С. 39-43.

40. Золотов Ю.А., Иванов В.М., Амелин В.Г. Химические тест-методы анализа. М.: Едиториал УРСС, 2002.

41. Иванов В.М., Кузнецова О.В. Иммобилизованный 4-(2тиазолилазо)-резорцин как аналитический реагент. Тест- реакции на кобальт, палладий, уран // Журнал аналитической химии. 1995. - Т. 50. № 5. - с. 498.

42. Ильичева Н.Ю., Бейлинсон P.M., Медянцева Э.П., Будников Г.К., Ваня-гина О.Н. Холинэстеразные биосенсоры для определения гербицида пропанила // Вестник Московского университета. Сер. 2. Химия. 2002. - Т. 43., № 6. - С. 409-413.

43. Инженерная энзимология / Березин И.В., Клесов A.A., Швядас В.К., Угарова H.H., Варфаломеев С.Д., Яропалов А.И., Казанская Н.Ф., Егоров A.M. М.: Высшая школа, 1987.- 123

44. Капранчиков B.C., Жеребцов H.A., Попова Т.Н. Некоторые физико-химические свойства липазы зародышей семян пшеницы // Биотехнология. 2003. - № 5. - С. 44-52.

45. Касько Н.С., Панченко O.A. Синтез химически однородных 2,3-динитратов целлюлозы // Химия растительного сырья. 1997. - № 2. - С. 46-52.

46. Кирдяшкин А.И., Юсупов P.A., Максимов Ю.М., Китлер В.Д. Закономерности технологического горения порошковых систем на минеральной основе при получении пористых керамических материалов // Физика горения и взрыва. 2002. - Т. 38. № 5. - С. 85-89.

47. Кирилина Ю.О. Органо-неорганические гибридные гидрогели на основе поли-Ы-виниламидов и продуктов гидролитической поликонденсации тетраметоксисилана: автореф. дис. . канд. хим. наук: 02.00.06 -М., 2009.

48. Китова А.Е. Амперометрические микробные и ферментные биосенсоры для детекции углеводов, спиртов и нитроароматических соединений: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.23. Саратов, 2009.

49. Ковалева Т.А., Кожокина О.М., Багно О.П., Трофимова О.Д., Беленова

50. A.C. Иммобилизация гидролитических ферментов на анионитах // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. - Т.8. Вып.6.

51. Ковалева Т.А., Холявка М.Г., Taxa A.C. Исследование иммобилизации инулиназы на ионогенных и неионогенных носителях // Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. - Т. 7. № 5. - С. 804-810.

52. Коровина М.А. Разработка технологии получения лечебных текстильных материалов для хирургии и онкологии: автореф. дис. . канд. техн. наук: 05.19.03. М., 2000. - 32 с.

53. Котельникова Н.Е., Михайлова С.А., Власова E.H. Иммобилизация протеолитических ферментов трипсина и а-химотрипсина на целлюлозной матрице // Журнал прикладной химии. 2007. - Т. 80. № 2. - С. 323-330.

54. B.И. Маркина. Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2009. - Кн. 1. - 306 с.

55. Котельникова Н.Е., Лашкевич О.В., Панарин Е.Ф. Способ получения серебросодержащих целлюлозных материалов. Патент RU 2256675 // БИ. 2005. - № 20.

56. Кряжев В.Н., Романов В.В., Широков В.А. Последние достижения химии и технологии производных крахмала // Химия растительного сырья.-2010.-№ 1.-С. 5-12.

57. Купцова C.B. Получение, свойства и применение композитных поли-125мерных гидрогелей с иммобилизованными белками и пептидами: авто-реф. . канд. дис. хим. наук: 03.00.04. М., 2000. - 24 с.

58. Манченко JI.B. Аэросил, его свойства, применение и технические условия. -Львов, 1965. 183 с.

59. Методы определения макроколичеств пестицидов в продуктах питания, нормах и внешней среды, под ред. М.П. Клименко М.: Колос, 1986. -304 с.

60. Моисеенко Т.И., Гашев С.Н., Петухова Г.А., Елифанов A.B., Селюков А.Г. Биологические методы оценки качества вод: биотестирование // Вестник Тюменского государственного университета. 2010. - № 7. - С. 40-51.

61. Морозко С.А., Иванов В.М. Тест-методы в аналитической химии. Иммобилизованный 1-(2-пиридилазо)-2-нафтол как аналитический реагент // Журнал аналитической химии. 1996. - Т. 51., № 6. - 631с.

62. Назаренко JI.B., Загоскина Н.В. Водоросли и продукты промышленного назначения на их основе // Вестник Московского городского педагогического университета. Серия: Естественные науки. 2011. - № 2. - С. 85-96.

63. Олтаржевская Н.Д., Коровина М.А. Текстиль для медицины: новые лечебные композиционные материалы // Текстильная промышленность. -2010.-Т. 5.-С. 58-62.

64. Островская В.М., Золотов Ю.А., Давыдов A.B. Экспрессное тест-определение пероксида водорода реагентными индикаторными полосами // Журнал аналитической химии. 1999. — №8.

65. Пешкова В.Н., Саяпина О.Я., Солдаткин A.A., Дзядевич С.В. Ферментный кондуктометрический биосенсор для определения мальтозы-126

66. Biopolymers and cell. 2009. - Т. 25., № 4. - С. 272-278.

67. Патент RU 2101033, А61 L 15/22. Перевязочный материал с пролонгированным лечебным действием / Васильева Т.С., Субботко O.A. Опубл. 10.01.98, Бюл.№ 1.

68. Писарев O.A., Ежова Н.М. Современные подходы к конструированию структуры полимерных сорбентов для препаративной хроматографии биологически активных веществ // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. - Т. 8. № 4. - С. 535-552.

69. Раднаева Л.Д., Попов Д.В., Елохина В.Н. Амфифильные производные ß-циклодекстрина как носители лекарственных препаратов // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. 2009. - Т. 2., № 2. -С. 288-289.

70. Роговина С.З. Химическая модификация природных полисахаридов целлюлозы, хитина и хитозана в твердой фазе под действием сдвиговых деформаций: дис. д-р хим. наук: 02.00.06. М., 2003. - 232 с.

71. Стойкова Е.Е. Экспресс-определение загрязнителей окружающей среды с помощью ферментативных колориметрических тестов: автореф. дис. . канд. хим. наук: 02.00.02. Казань, 1997.

72. Тернер Э., Карубе И., Уилсон Дж. Биосенсоры: основы и приложения. -М.: Мир, 1992.

73. Тертых В.А. Исследование природы и реакционной способности фиксированных центров на поверхности кремнеземов: автореф. дис. . д-р хим. наук: 02.00.04.- Киев, 1977.

74. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. М.: Мир, 1983. - С. 208.

75. Трофимова H.H., Бабкин В.А. Целлолигниновый остаток древесины лиственницы как сырье для получения кристаллической глюкозы // Хвойные бореальной зоны. 2003. - № 1.

76. Тюркин Ю.В., Мосин Ю.М., Чесалов JI.A. Метод СВС для изготовления катализаторов и носителей // Блочные носители и катализаторы сотовой структуры: Междунар. семинар. СПб., 1995. - Т. 1. - С. 104— 105.

77. Ульянова М.А., Гурова A.C., Шредер В.Е. Водостойкие силикагели и области их применения // Вестник Тамбовского государственного технического университета. 2006. - Т. 12., № 1. - С. 83-91.

78. Ушаков И. Б., Володин А. С., Губин В. В., Фесенко В. В., Прокопенко Ю. И. Медицинские последствия химических загрязнений окружающей среды и некоторые решения данной проблемы // Экология человека. -2003.-№4.-С. 3-7.

79. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А., Практикум по общей химии: уч. пособия для студентов хим. спец. пед. институтов. М.: Просвещение, 1982. - 311 с.

80. Хиггинс И., Бест Д., Джонс Дж. Биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 1988. - 480 с.

81. Черкасов А.Н., Пасечник В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии.-JL: Химия, 1991.-240 с.

82. Шаскольский Б. JI. Композитные иммобилизованные биокатализаторы с частицами ферментных препаратов, включённых в матрицу криогеля поливинилового спирта: автореф. дис. .канд. хим. наук: 03.00.23. -Москва, 2009. 22 с.

83. Шишкин М.М., Штильман М.И., Юлдашева Н.М., Артюхов A.A.

84. О возможности применения сшиваемого поливинилового спирта в качестве носителя лекарственных веществ для интравитреального введения // Вестник Национального медико-хирургического центра им. Н.И. Пирогова. -2010. Т. 5, № 1. - С. 16-21.

85. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Кучеренко Е.Ю., Лунина В.В. Применение волокнистых полиэлектролитов в качестве носителей а-амилазы // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. - Т. 8., № 5. - С. 858-862.

86. Юданова Т.Н., Решетов И.В. Современные раневые покрытия: получение и свойства. Раневые покрытия с иммобилизованными протеолити-ческими ферментами (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. -2006.-Т. 40., №8.-С. 24-31.

87. Янкаускайте Д.П., Дикчювене A.A., Паулюконис А.Б. Способ модификации полисахаридов // АС 732278. С 08В15/06. 1980.-129

88. Antiochia R., Lavagnini I., Magno F. Amperometric mediated carbon nano-tube paste biosensor for fructose determination // Anal. Lett. 2004. - 37. N 8.-P. 1657-1669.

89. Cheng H. C., Abo M., Okubo A. Development of dimethyl sulfoxide biosensor using a mediator immobilized enzyme electrode // Analyst. 2003. -128, N6.-P. 824-827.

90. Chivrac F., Pollet E., Schmutz M., Averous L. New approach to elaborate exfoliated starch-based nanobiocomposites // Biomacromolecules. 2008. -№ 9. - P. 896-900.

91. Fischer S. Natural biopolymers reinforced by inorganic nano-particles // TNO Industrial Technology: Eindhoven. The Netherlands. 2005. - 23 p.

92. Gaiduk O.V., Pantaler R.P., Grebenyuk N.N., Ostrovskaya V.M. Rapid determination of copper (I, II) ions using reagent indicator paper // Journal of Analytical Chemistry. 2009. - V. 64., № 2. - P. 201-205

93. Hristov S.M., Boukoureshtieva R.I., Kaisheva A.R., Iliev I.D. Tyrosinase sensor for amperometric detection of plenol / Scientific Session of "Sofia Impedance Days", 2003 // Buld. Chem. Commun. 2004. - 36, N 1. -P. 53-56.

94. Kabanov V.A., Skobeleva V.B., Rogacheva V.B. and Zezin A.B. Sorption of Proteins by Slightly Cross-Linked Polyelectrolyte Hydrogels: Kinetics and

95. Mechanism. J. Phys. Chem. B. 2004. - V. 108. - P. 1485-1490.

96. Kotelnikova N., Vainio U., Pirkkalainen K., Serimaa R. Novel approaches to metallization of cellulose by reduction of cellulose-incorporated copper and nickel ions // Macromol. Symp. 2007. - V. 254. - P. 74-79.

97. Kuselman I., Lev O. Organically-doped soigel-based tube detectors: determination of iron (II) in aqueous solutions // Talanta. 1993. - V. 43. - 7491. P

98. Langer R., Peppas N.A. Advances in Biomaterials, Drug Delivery, and Bi-onanotechnology // Biomaterials. 2003. - V. 49, N.12. - P. 2990-3006.

99. Lun-han Ding etc. // Chinese J.of Polymer Science. 2000. - V.18. № 4. - P. 343-349.

100. Mailley P., Coming E.A., Mailley S.C. Composite carbon paste biosensor for phenolic derivatives based on in situ electrogenetated polyporrole binder // Anal. Chem. 2003. - 75, N 20. - P. 5422 - 5428.

101. Markvicheva E.A., Bronin A.S., Kudryavtseva N.E. // J.Biotechnology Techniques. 1994. - V.8. № 3. - P.143-148.

102. Martens P., Anseth K.S. Characterization of hydrogels formed from acrylate modified poly(vinyl) alcohol macromers // Polymer. 2000. - V. 41. - P. 7715-7722.

103. Morozova O.V., Zaytseva E.A, Hadunina A.S. Amperometricheskie biosen-sory na osnove med'so-derzhaschih oksidaz dlya opredeleniya fenol'nyh soedineniy // EMMA 2004.-P. 71-73.

104. Nano Letters. 2003. - N 3(6). - P. 829 - 832.

105. Richardson J., Hill A., Luxton R et al. A novel measuring system for the determination of paramagnttic particles labels for use in magetj-immunossays. Biosens Bioelectron. 2001. - V. 16. - P. 1127.

106. Rocha C., Ducso L., Goncalves M.P. etc // 2nd Mercosur Congress on Chemical Eng, Enpromer, Costa Verde, Brazil. 2005. - P.342-344.

107. Short B.G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations // Toxicol. Pathol. 2008. - Vol. 36, N.l.-131-P. 49-62.

108. Tanaka T., Matsunaga T. Detection of HbA (Ic) by boronate affinity immunoassay using bacterial magnetic particles // Biosens Bioelectron. 2001. — P. 1089.

109. Tudorachi Nita, Lipsa Rodica. Modified starch copolymers with possible biomedical applications // Rev. roum. chim. 2005. - V. 50, № 3. - P. 175184.

110. Wu Xiao Jun, Choi Martin M.F. An optical glucose biosensor based on en-trapped-glucose oxidase in silicate xerogel hybridised with hydroxyethyl carboxymethyl cellulose //Anal. chim. acta. 2004. - V. 514, № 2. - P. 219226.

Информация о работе

Филиппова, Анастасия Михайловна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка технологии формирования биосенсорных тест-систем на основе композиционных материалов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы