Электрохимические биосенсоры на основе микробных клеток, ферментов и антител

Решетилов, Анатолий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Электрохимические биосенсоры на основе микробных клеток, ферментов и антител
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Электрохимические биосенсоры на основе микробных клеток, ферментов и антител"

С■:,'"( На правах рукописи

РЕШЕТИЛОВ Анатолий Николаевич

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК, ФЕРМЕНТОВ И АНТИТЕЛ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Специальность:

биотехнология 03.00.23

Москва - 1998

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина Российской Академии наук, г. Пущино

Научный консультант:

чл.-корр. РАН, профессор Бороиин А.М.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Евдокимов. Ю.М.

доктор химических наук, профессор Курганов Б.И.

доктор биологических наук, профессор Будаицев А.Ю.

Ведушая организация:

Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН.

Защита состоится "27 " 0^7511998 г. //Г на заседании Диссертационного совета № Д.053.05.76 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: Москва, 119899, ГСП-3, Воробьевы горы, Химический факультет, МГУ, ауд. 202 кафедры химической энзимологии.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан "26 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат химических наук

Кост О. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Последнее десятилетие отмечено интенсивным изучением аналитических возможностей и практическим применением биосенсорных систем. Потребности медицинской диагностики, различных областей биотехнологии, промышленности, экологических служб ставят перед аналитической химией комплекс задач, связанных с разработкой простых в применении, недорогих, высокочувствительных и специфичных методов и приборов на их основе для обнаружения заданных веществ в образце. Одновременное удовлетворение указанным требованиям достаточно проблематично. Вместе с тем в биосенсорах, совмещающих идеи и достижения современной биологии, электронных технологий , химических наук многие из перечисленных условий выполняются.

Принцип детекции, реализованный в биосенсорах, 'основан на том, что биоматериал (ферменты, клетки, антитела и др.), иммобилизованный на физическом датчике (преобразователе), при взаимодействии с определяемым соединением генерирует зависимый от его концентрации сигнал, который регистрируется преобразователем электрохимического, оптического или иного типа и после обработки данных представляется в численном виде. Простота устройства, оперативность, специфичность и низкая стоимость биосенсорного анализа создают развитию этой области аналитической биотехнологии высокую степень приоритета.

Ион-селективные полевые транзисторы (ПТ) относятся к полупроводниковым потенциометрическим преобразователям, широко используемым для создания биосенсоров; интерес к ПТ обусловлен рядом их достоинств: миниатюрностью, возможностью размещать на одном кристалле полупроводника несколько электродов, сопряженных со схемой обработки сигнала, низкой себестоимостью при массовом производстве. На основе таких приборов созданы биосенсоры, в рецепторной части которых находится биоматериал, катализирующий реакции, сопровождающиеся изменением рН.

Несмотря на значительное количество публикаций, потенциал этого типа преобразователей к настоящему времени полностью не использован. Так, сравнительно мало изучены аналитические возможности биосенсоров, сочетающих ПТ и бактериальные клетки. В моделях иммуносенсо-ров, основанных на ПТ, как правило, используется только уреаза в качестве ферментной метки, что сужает представления о перспективах применения иных ферментов. Незначительно число публикаций, описывающих использование ПТ для регистрации зарядового состояния рецепторного элемента.

Большое внимание уделяется изучению свойств биосенсоров ампе-рометрического типа, в которых в качестве преобразователя используется электрод Кларка. Типичным для биосенсоров этого типа является применение микроорганизмов в рецепторном элементе.

К важным проблемам в области создания амперометрических микробных биосенсоров следует отнести повышение селективности анализа; поиск штаммов, окисляющих чужеродные соединения с целью создания приборов эффективного экологического мониторинга; исследование возможности высокоэффективной детекции ксенобиотиков штаммами, несущими плазмиды их деградации; возможность использовать генно-инженерные методы для получения микроорганизмов с заданными свойствами для повышения аналитического потенциала микробных сенсоров.

Анализ упомянутых проблем и вопросов, направленный на создание и изучение свойств новых биосенсоров потенциометрического типа на основе ПТ, светоадресуемых сенсоров, амперометрических преобразователей служит продвижению в решении основных задач биосенсорики -созданию надежных, высокочувствительных и селективных методов и устройств биодетекции. Цель работы

Исследования были ориентированы на теоретическое и экспериментальное развитие биосенсорной методологии и создание моделей биосенсорных анализаторов на основе электрохимических преобразователей -полевых транзисторов, светоадресуемых сенсоров и амперометрических преобразователей.

Основной критерий при формулировке задач состоял в получении более совершенных по сравнению с известными биосенсорных систем.

Достижение поставленной цели требовало решения ряда задач, основными из которых являлись

Для группы полупроводниковых биосенсоров:

* исследование параметров микробного (детекция глюкозы, ксилозы) и ферментного (детекция ингибиторов холинэстеразы) биосенсоров на основе pH-чувствительного полевого транзистора;

* разработка модели иммуносенсора и метода формирования унифицированного рецепторного элемента для детекции низкомолекулярных соединений, белков, клеток микроорганизмов;

* создание фоточувствительных сенсоров на основе полевого транзистора и белков бактериального родопсина, уреазы;

* разработка макета светоадресуемого потенциометрического сенсора;

* применение биосенсорной техники для изучения особенностей метаболизма растущих и хемотактирующих популяций бактерий E.coli.

* разработка макета светоадресуемого потенциометрического сенсора и регистрирующего усилителя с функциями первичной обработки сигнала.

Для группы амперометрических биосенсоров на основе электрода Кларка:

* изучение характеристик микробных сенсоров для детекции легкоути-лизируемых субстратов: углеводов, спиртов, полиолов;

* оценка возможности детекции микробными сенсорами веществ чужеродной природы - ароматических ксенобиотиков, ПАВ;

* разработка модели микробного медиаторного электрода;

* повышение селективности биосенсорной детекции: применение элементов теории распознавания образов;

* использование принципа стабилизации параметров микробных биосенсоров путем дополнительной оксигенации среды измерения с помощью полностью фторированных углеродов.

Научная новизна

Работа является комплексным исследованием по оценке аналитического потенциала полевого транзистора и светоадресуемого сенсора как преобразователей в биосенсорах ферментного, иммунохимического и микробного типов. Впервые для группы биосенсоров, основанных на полевых транзисторах, выполнен детальный анализ эффективности использования сменного биорецепторного элемента для иммобилизации ферментов, бактериальных клеток и иммунокомпонент. Предложены две новые модели, содержащие фото-чувствительные элементы на основе белка бактериального родопсина и аналога красителя спиробензопирана. Модели перспективны с точки зрения технологий будущего, сопрягающих процессы переноса/разделения зарядов в органических и биологических материалах с приборами твердотельной электроники; такие системы уже в ближайшее время могут найти эффективное применение в качестве устройств ввода-вывода информации в биологических компьютерах.

Иммунобиосенсоры характеризуются новым, разработанным в диссертации подходом к формированию рецепторного элемента, позволяющим отказаться от традиционно используемого метода химической обработки поверхности ПТ для ковалентной иммобилизации иммунокомпонент. Впервые в практике биосенсоров на основе ПТ в качестве ферментной метки использована пероксидаза хрена (ПХ). Предложена новая композиция субстратов ПХ, обеспечивающая высокую эффективность ее электрохимической детекции, что показано на примере анализа пестицида 2,4-дихлрфеноксиуксусной кислоты, иммуноглобулина G (IgG) человека, термофильных микроорганизмов Clostridium thermocellum. Метод сменных мембран был эффективно применен при создании биосенсора, определяющего содержание пестицидов на основании их ин-гибирующего воздействия на фермент холинэстеразу.

Биосенсоры, основу которых составляют клетки микроорганизмов и амперометрические преобразователи характеризуется следующими элементами новизны:

- впервые использованы штаммы бактерий рода Pseudomonas в электрохимических биосенсорах для детекции ароматических соединений, представляющих серьезную опасность для экосистем - нафталина, бифе-нила, бензоата, хлорароматических соединений, поверхностно-активных соединений (ПАВ);

- получены новые данные о возможности создания медиаторных ам-перометрических электродов с использованием в качестве биокатализатора бактериальных клеток Gluconobacter oxydans. Результаты создают основы формирующегося в настоящее время нового направления - медиа-торных клеточных электродов и открывают новые перспективы практического применения микробных биосенсоров;

- разработана концепция применения элементов теории распознавания образов и экспериментально реализован принцип повышения селективности детекции микробным биосенсором при анализе двухкомпонент-ной среды "глюкоза-этанол". Подход перспективен своей общностью в решении проблемы повышения селективности биосенсорной детекции.

- впервые предложена и экспериментально реализована идея стабилизации условий измерения микробными биосенсорами и способ повышения их чувствительности за счет дополнительной оксигенации среды измерения с помощью перфтордекалина - полностью фторированного органического соединения.

Практическая значимость

Созданные модели биосенсоров позволяют представить рекомендации по их наиболее эффективному практическому использованию.

Амперометрический биосенсор на основе бактериальных клеток G. oxydans имеет высокую стабильность и точность, высокую чувствительность к глюкозе (нижний предел определения находится в области 20 мкМ) и позволяет производить надежную оценку ее содержания в сыворотке крови человека. Эта же модель сенсора успешно апробирована в биотехнологической практике для определения содержания глюкозы в ферментационной среде при культивировании грибов рода Мисог; показана возможность оценки содержания ксилозы, глицерина, этанола в однокомпонентных средах.

Модель биосенсора на основе pH-чувствительного полевого транзистора с иммобилизованной холинэстеразой (ХЭ) имеет высокую чувствительность и позволяет оценивать присутствие в образце модельных ингибиторов эзерина и прозерина, начиная с концентраций 10'8 М, а

также присутствие фосфорорганических пестицидов, начиная с концентраций порядка 10'7 М. Биосенсор можно применять для проведения экологического мониторинга с целью обнаружения соединений, модифицирующих активность ХЭ - ионов тяжелых металлов, фосфор-, хлороргани-ческих соединений, веществ нервно-паралитического типа действия.

Создана унифицированная модель иммуносенсора, содержащая минимально необходимый набор элементов, которая дополнена разработанными схемами иммуноанализа и оптимизированным набором субстратной смеси. Биосенсоры эффективны при детекции гербицида 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (нижний предел чувствительности 1 нг/мл); определении иммуноглобулина й человека (диапазон детектируемых концентраций 10'" - 10'7 М); обнаружении в образце микробных клеток (минимальная детектируемая концентрация клеток 104 клеток/мл.

Разработан компактный вариант регистрирующего усилителя, позволяющего производить обработку сигналов (начальной скорости и амплитуды) биосенсоров, основанных на ПТ. Создан автономный прибор - основа биосенсоров потенциометрического типа - светоадресуемый потен-циометрический сенсор, обеспечивающий высокоточные измерения сигналов иммобилизованных ферментов, клеток микроорганизмов и составляющий базу для разработок многоканальных сенсоров нового поколения.

Созданные модели биосенсоров можно рассматривать как прототипы для разработки промышленных высокочувствительных и надежных биосенсорных систем для эффективного использования в медицине, биотехнологии, службах санитарно-эпидемиологического контроля для анализа качества питьевых источников, продуктов питания; службах экологического мониторинга; на промышленных предприятиях для анализа состава и концентрации загрязнителей, поступающих в сточные воды.

Методы исследования

Область проблем, сформулированных в работе, является междисциплинарной и относится к биотехнологии, аналитической химии, электрохимии, биохимии, иммунохимии, микробиологии, электронному приборостроению. В этой связи в работе были использованы соответствующие методы, а именно:

- разработка регистрирующих электронных усилительных устройств;

- потенциометрический и амперометрический методы регистрации биохимической активности иммобилизованных биоматериалов;

- методы иммобилизации бактериальных клеток, ферментов, имму-нокомпонент в полимерные носители различной природы;

- оценка кинетических параметров реакций, протекающих в биорецепторе сенсоров;

- методы иммуноанализа и их адаптация для детекции заданного типа антигена;

- компьютерные программы регистрации и обработки данных.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на III Всесоюзной конференции "Химические сенсоры" (Ленинград, 1989); Международной конференции "Сенсор-91", (Ленинград, 1991); Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 1991); 8th International Conference of Young Scientists on Organic and Biological Chemistry (Riga, 1991); International Simposium on Biosensors (Moscow, 1992); Международной конференции "Сенсорные системы и компоненты" (Санкт-Петербург, 1993); CIS-German Workshop Biosensors (Muenster, 1993); Конференции грантодержа-телей "Биотехнология защиты окружающей среды" (Пущино, 1994 ); The Third World Congress on Biosensors (New Orleans, 1994); Международной конференции "Enzymatic and Genetic Aspects of Environmental Biotechnology" (Пущино, 1995); Международной научно-практической конференции "Проблемы экологически безопасных технологий производства, переработки и хранения сельскохозяйственой продукции (Сергиев Посад, 1996); Международной конференции памяти А.А.Баева (Москва, 1996); Second Workshop on Biosensors and Biological Techniques in Environmental Analysis (Lund, 1996); 3rd NEXUSPAN Workshop on Microsystems in Environmental Monitoring (Moscow, 1996); 2м Съезде общества биохимиков (Москва, 1997); Fourth International Workshop "Biosensors and biosensing devices in medicine and environmental sciences (Tashkent, 1997); Российско-Германском семинаре по технологической кооперации (Потсдам, 1997); The Fifth World Congress on Biosensors (Berlin, 1998).

Исследования были поддержаны программами "Новейшие методы биоинженерии", направления "Биотехнология защиты окружающей среды", "Инженерная энзимология"; контрактом с Национальным центром по утилизации сельхозпродукции (США); Международным Российско-Американским Консорциумом по техническому, образовательному и экономическому развитию.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 64 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из 3 глав, Введения, Заключения, Выводов и списка цитируемой литературы ( ЧСО наименований). Объем диссертации составляет чЪО стр., в том числе /3 0 рис. и 2. табл.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Анализ литературных данных

1.1. Применение полупроводниковых преобразователей в качестве основы биосенсоров

Анализируется вопрос об использовании полупроводниковых преобразователей в биосенсорах - ион-селективных полевых транзисторов и светоадресуемых потенциометрических сенсоров.

1.2. Физиолого-биохимические особенности микроорганизмов рода Gluconobacter и перспективы их использования в биотехнологии и биосенсорных системах

Рассмотрены физиолого-биохимические особенности микроорганизмов и вытекающие из них возможности их использования в рецепторных элементах биосенсоров.

1.3. Информационное обеспечение исследований. Библиографическая база данных "Биосенсоры и биоэлектроника"

Создана специализированная библиографическая база данных (ББД) "Биосенсоры и Биоэлектроника", обеспечивающая информационную поддержку исследований. ББД реализована в виде компьютерной программы с использованием Системы управления базой данных "ИРИС 2.10". Количество документов в ББД составляет 9850.

Глава 2. Биосенсоры на основе рН-чувствительных полевых транзисторов и светоадресуемых потенциометрических сенсоров

2.1. Модель сенсора на основе бактериальных клеток Gluconobacter oxydans

Перспективность применения штаммов G. oxydans как типичных представителей рода Gluconobacter в биосенсорах обусловлена широким спектром субстратов, окисляемых клетками и накоплением продуктов окисления в среде. Изменение рН среды при окислении ряда субстратов бактериальными клетками, иммобилизованными на рН-чувствительном полевом транзисторе, приводит к изменению тока и составляет основу аналитического сигнала биосенсора.

Характеристика способов иммобилизации клеток на транзисторе.

Изучали эффективность функционирования бактерий G. oxydans при включении в гелеобразующие полимеры: альгинат натрия, к-каррагинан, хитозак, зостерин, поли-Ы-винилкапролактам (ПВК, мв 900000), агарозу, желатин, коллаген и поливиниловый спирт (ПВС, мв 10 000, 20 000 и 90 000).

Сопоставительный анализ показал, что включение клеток в гели обеспечивало прочность пленок в сочетании с их высокой адгезионной способностью; каждый тип материала имел свои особенности. Полиуро-нидные гели отличались механической прочностью, однако отслаивались от поверхности ПТ. Низкомолекулярный ПВС (мв 10000, 20 000) не обеспечивал достаточной прочности геля даже при сшивке боратами, а прочная пленка высокомолекулярного ПВС (мв 90 000) отслаивалась от поверхности транзистора.

Выполненная оценка позволила установить преимущества использования ПВК и хитозана при создании биорецепторов микробных сенсоров.

Детекция глюкозы.

Определение содержания глюкозы в крови человека является актуальной задачей для медицинской диагностики в связи с возможно-

стью предупреждения и лечения сахарного диабета; в биотехнологии контроль за содержанием глюкозы важен для оптимизации ферментационных процессов, протекающих в присутствии этого субстрата. Несмотря на разнообразие существующих лабораторных моделей биосенсоров, а также значительное количество выпускаемых промышленностью глюкозоанали-заторов, все еще открытыми остаются многие вопросы, в частности, сравнительных оценок параметров ферментных и микробных электродов.

Для выяснения подобных вопросов в диссертации исследованы параметры модели микробного биосенсора для детекции глюкозы на основе специально отобранных для этих целей бактерий в. охуйат № 6, содержащих высокоактивную РОО-зависимую альдозодегидрогеназу (АлДГ).

Окисление глюкозы клетками сопровождается образованием глюко-нолактона, спонтанно превращающегося в глюконовую кислоту, что позволяет использовать ПТ в качестве преобразователя. Бактерии иммобилизовали включением в хитозановый гель. Биосенсор характеризовался малым временем отклика (30-50 с) и высокой чувствительностью к глюкозе - нижний предел ее детекции составлял 20-50 мкМ, линейный участок калибровочной кривой находился в диапазоне концентраций от 2x10"4 до 4x10"3 М (Рис.1). Максимальная амплитуда ответа соответствовала значениям рН среды 7.0-7.2. Воспроизводимость ответов была высокой - при средней величине сигнала, равного 0.65 ед. рН, коэффициент вариации составлял 2% (N=10 измерений, концентрация глюкозы 1 мМ).

Глюкоза, М

Рис.1. Зависимость сигналов сенсора от концентрации глюкозы в пробе. На вставке приведены виды ответов сенсора.

При хранении в сухом состоянии при +4° С потеря активности за два месяца составляла 60%. Операционная стабильность, проверяемая в условиях ежедневного функционирования, показала, что выходные сигналы

сенсора практически не изменялись в течение 7-10 суток, что представляет практическую ценность.

Детекция ксилозы.

Интерес к процессам утилизации растительной биомассы обусловлен возможностью производства в промышленных масштабах полезных биологически активных продуктов из растительных отходов. Гемицеллюлоза, получаемая в результате гидролиза растительной биомассы, может содержать высокий процент остатков ксилозы, которую затем химически или биологически трансформируют в пищевой сахар ксилит. Для контроля за этим процессом требуется периодическое определение концентрации ксилозы в среде. Вопрос о применении бактериальных клеток для детекции ксилозы не исследован.

Выявленная в экспериментах чувствительность клеток С7. охуйат №6 к ксилозе явилась основанием для изучения возможности их использования при детекции этого субстрата. Окисление ксилозы сопровождается образованием ксилоновой кислоты и позволяет применять ПТ для регистрации этого процесса. Клетки й. охуЛапя иммобилизовали сорбцией на хроматографической бумаге, которую фиксировали на затворной области ПТ. Сенсор имел достаточную для практических целей чувствительность и позволял оценивать концентрации ксилозы в диапазоне от 0.5 до 30 мМ. В интервале концентраций от 5 до 30 мМ сигналы сенсора линейно зависели от содержания ксилозы в образце. Из Сахаров основной помехой являлась глюкоза. Присутствие ксилита (конечного продукта переработки ксилозы) в пробе в концентрациях до 100 мМ практически не влияло на сигналы сенсора, что позволяло достаточно точно оценивать концентрацию ксилозы в его присутствии.

Полученные результаты показали, что субстратная специфичность микробного сенсора не уступает селективности ферментного электрода на основе АлДГ, выделенной из бактерий О. охуйат (Бшокпёег е1 а1, 1993). Модель можно рассматривать как перспективную для анализов ксилозы в образцах, имеющих низкую буферную емкость и не содержащую легко-утилизируемых субстратов типа глюкозы.

2.2. Сенсор на основе бутирилхолинэстеразы

Ингибирование активности холинэстераз (ХЭ) фосфорорганическими соединениями используют при создании биосенсорных систем для детекции пестицидов, соединений нервно-паралитического действия, лекарственных препаратов. ХЭ на ПТ иммобилизуют путем ее ковалентной пришивки к активированной поверхности диэлектрика. Такой подход имеет определенные ограничения: химическая обработка поверхности транзистора может приводить к изменению его характеристик; детекция необратимых ингибиторов требует регенерации ХЭ, которая, как правило, восстанавливает активность фермента лишь частично; после ограниченного числа циклов чувствительность детекции падает, что делает невозможным

дальнейшие измерения. В связи с этим оптимальным вариантом представляется возможность производить формирование рецепторного элемента вне преобразователя, не сопрягая эту процедуру с химической обработкой поверхности, после чего ПТ использовать как регистрирующий сенсор.

В работе изучена возможность применения сменных мембран, которые формируются вне ПТ, а затем на стадии измерения фиксируются на его поверхности. Рецепторный элемент биосенсора создавали а) включением бутирилхолинэстеразы (БХЭ) в пористую нитроцеллюлозную матрицу при смешивании водного раствора белка с раствором нитроцеллюлозы в органическом растворителе и б) ковалентной пришивкой БХЭ на активированные ацетилцеллюлозные мембраны фирмы МПНроге. Полученные мембраны фиксировали на затворной области ПТ с помощью специально разработанного для этих целей миниатюрного держателя. Активность БХЭ оценивали по изменению рН при гидролизе бутирилтиохолин иодида (БТХИ). Исследовали чувствительность сенсора к модельным ингибиторам эзерину, прозерину и фосфорорганическим пестицидам - ме-тафосу, 3-хлорметафосу, фозалону, диизопропилфторфосфату. Минимальные детектируемые концентрации метафоса, 3-хлорметафоса и фоза-лона не зависели от способа иммобилизации фермента и находились в области 10"7 М; минимальные детектируемые концентрации диизопропил-фторфосфата находились в области 10'12 М (ее оценку выполнили для сенсора, содержащего ковалентно иммобилизованный на ацетилцеллюлозной мембране фермент).

В течение двух недель хранения в растворе фосфатного буфера при 4°С потеря активности фермента составляла 42 и 27% для нитроцеллю-лозной и МПНроге мембран, соответственно.

Предложенный метод сопряжения мембран с ПТ позволяет производить быструю замену рецепторного элемента (время замены 3-5 мин) и делает излишней процедуру реактивации сенсора при детекции необратимо связывающихся с ферментом ингибиторов. Сопоставляя трудоемкость использованных процедур иммобилизации (формирование нитроцеллю-лозной мембраны более трудоемко) с полученными параметрами сенсора можно заключить, что ковалентная пришивка фермента на мембраны МПНроге представляется более предпочтительной, т.к. позволяет использовать коммерчески доступные мембраны, имеющие стандартизованные параметры.

2.3. Модели иммуносенсоров. Рецепторные элементы для детекции низкомолекулярных соединений, белков, клеток микроорганизмов

При разработке иммуносенсоров наши усилия были направлены на создание унифицированной модели, основанной на полевом транзисторе, которая содержала бы минимально необходимый набор элементов (преобразователь, матрицу-носитель для иммобилизации иммунокомпо-

нент, оптимизированный набор субстратной смеси) в сочетании с разработанными схемами иммуноанализа. Указанный комплекс должен составлять необходимый минимум, который позволяет проводить иммунофер-ментный анализ (ИФА) широкого спектра антигенов при незначительных изменениях процедур и элементов.

Характеристики сенсора исследовали при анализе гербицида 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты), который представлял модель низкомолекулярных веществ; IgG человека был использован как модель антигенов белковой природы; клетки Clostridium thermocellum использовали как модель антигенов, имитирующих микроорганизмы.

Общая характеристика модели.

Иммуноактивные компоненты иммобилизовали ковалентной пришивкой на полимерную матрицу, фиксируемую при измерениях на поверхности транзистора. Особенностью данного подхода являлось то, что биорецептор первоначально формировали вне транзистора и только после его готовности для измерений фиксировали на транзисторе; это позволило подойти к созданию заменяемого биорецептора, который не требовал процедур регенерации (диссоциации комплекса "антиген-антитело") для проведения очередных измерений.

Новым элементом иммунодетекции, реализованным в биосенсоре, явилось применение в качестве ферментной метки пероксидазы хрена (ПХ). Для этого был произведен поиск оптимальной субстратной смеси для ПХ, обеспечивающей высокие значения сигналов сенсора, связанных с изменениями рН в биорецепторе.

Оценка эффективности некоторых субстратов для рН-детекции пероксидазной активности.

До настоящего времени опыта применения рН-чувствительных ПТ для регистрации активности пероксидазы хрена не имелось. При использовании рН-чувствительного ПТ в качестве преобразователя возникает вопрос поиска пероксидазных субстратов, для которых изменение рН среды будет значительным и пропорциональным концентрации ПХ. С этой целью нами был проведен скрининг субстратов, принадлежащих ряду анилинов и фенолов (Таблица).

Исследованные субстраты относились к группе легко окисляемых с электрондонорными заместителями и к группе среднеокисляемых субстратов с электронакцепторными заместителями в бензольном кольце. Наибольшие значения скоростей наблюдали для анилинов и фенолов с электрондонорными заместителями. Для субстратов с электронакцепторными заместителями не происходило значительных изменений рН в период, ограниченный временем детекции (300 сек).

Низкие значения скорости окисления указанных в Таблице фенолов и анилилов делают малоэффективным их использование при детекции ПХ на основе изменения рН среды. Это лимитирующее влияние может быть

преодолено благодаря использованию субстратов-усилителей по аналогии с использованием двухсубстратной смеси "р-.1-фенол ~ люминол" в реакции усиленной хемилюминесценции. Нашли, что таким субстратом-усилителем является аскорбиновая кислота (АК). Окисление АК, растворы которой имеют слабокислую реакцию, приводит к образованию дегид-роаскорбиновой кислоты, имеющей реакцию, близкую к нейтральной. Этот процесс сопровождается сдвигом рН в щелочную область. Общая скорость пероксидазного окисления АК невысокая, что не позволяет использовать ее как единственный субстрат для детекции ПХ с помощью рН чувствительного транзистора. Скорость процесса при участии ортофени-лендиамина в качестве электронного медиатора существенно повышается. Это позволило в 10 раз увеличить сигнал в сравнении с сигналами, регистрируемыми для субстратной смеси, содержащей р-иодофенол и люминол.

Таблица. Начальная скорость изменения рН в реакциях пероксидазного окисления восстановительных субстратов.

Субстрат, 10'3 М; ПХ, 10"9 М; Н202,Ю-3 М Начальная скорость изменения рН х 104, (рН/с) Знак изменения рН раствора

2,4-динитрофенол <2 -

р-хлоранилин <2 +

р-иоданилин 2 ± 1 +

Резорцин 8.4 ± 0.6 -

Пирокатехол 9.6+1 -

р-иодофенол, люминол 40 ±4 -

о-фенилендиамин 106 ± 12 +

о-фенилендиамин, аскорбиновая кислота 440 ± 42 +

Примечание: "+" и "-" - увеличение и уменьшение рН раствора.

Детекция 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-0).

Для детекции гербицида 2,4-0 использовали конкурентную схему ИФА, в которой молекулы 2,4-Э исследуемого образца конкурировали с конъюгатами 2,4-О-ПХ за связывание с антителами к 2,4-0, ковалентно иммобилизованными на пористой фотоактивированной целлюлозной матрице. В качестве субстратной смеси была использована композиция, включающая аскорбиновую кислоту, о-фенилендиамин и пероксид водорода. Биосенсор позволял оценивать присутствие 2,4-0, начиная с концентраций порядка 1 нг/мл (Рис. 2); верхний передел детекции зависел от концентрации конъюгата пестицид-ПХ и составлял 15 и 6 нг/мл при концентрациях конъюгата 6.6 и 1.0 нг/мл, соответственно. В анализе была использована техника сменных мембран, содержащих иммобилизованные

антитела, что значительно снижало время подготовки транзистора к измерениям и их проведение; так, время, требуемое для оценки концентрации пестицида в десяти образцах, не превышало двух часов.

Рис. 2. Калибровочные зависимости для определения 2,4—Э, полученные при двух концентрациях конъюгатов.

Детекция иммуноглобулина С человека (^О).

Концентрация в плазме крови человека является важным показателем процессов общего метаболизма белков в организме. При детекции этого белка мы применили сэндвич-схему ИФА. Антитела к кова-лентно иммобилизовали на мембране, размещаемой на затворе полевого транзистора, затем, для построения калибровочной зависимости мембраны выдерживали 60 мин в растворах, содержащих известные концентрации ^О диапазоне от 10"11 до 10'6 М. Формирование сэндвича завершали, погружая Мембрану в раствор антител к иммуноглобулину, меченных пе-роксидазой хрена.

Минимальная детектируемая концентрация составляла 10'" М (Рис. 3). Линейный участок зависимости находился в диапазоне от Ю"10 до 10"8 М, т.е. созданная модель сенсора имела высокую чувствительность и позволяла определять в концентрациях значительно более низких, чем содержание его в крови человека. Важным преимуществом метода является простота измерений, которые можно производить вдали от крупных биохимических лабораторий.

2.0

10'11 10-' I0J ю-7 IgG, M

Рис.3.

10J 10« 10s 10s 10' Концентрация клеток, [кл/мл]

Рис.4.

Рис. 3. Калибровочная кривая сенсора для определения IgG. Измерения выполнены в 150 мМ растворе NaCl, содержащем 1 мМ буфер Трис-HCl (рН 8.7)

Рис. 4. Иммунодетекция бактериальных клеток при предварительной их сорбции на активированную поверхность полимерной мембраны. 1 и 2 - калибровочные зависимости для клеток C.thermocellum и Mb. thermoautotrophicum, соответственно.

Определение концентрации клеток Clostridium thermocellum.

На основании подхода, аналогичного описанному выше, была создана модель иммуносенсора для детекции микробных клеток. В экспериментах использовали поликлональные антитела к С. thermocellum. Контрольной культурой для проверки специфичности анализа служили бактерии Mycobacterium thermoautotrophicum. При создании этой модели сенсора отрабатывали следующие схемы анализа:

- иммуносвязывание клеток с антителами в гомогенных условиях, разделение иммунокомпонент, детекция пероксидазной метки;

- предварительная сорбция клеток на активированную поверхность полимерной мембраны и дальнейшее проявление клеток антителами и белком А, конъюгированным с пероксидазой хрена.

Более надежную регистрацию обеспечивал второй вариант анализа; минимальная детектируемая концентрация клеток составляла 10 клеток/мл, максимальная исследованная - 107 клеток/мл (Рис.4). Разработанная схема анализа представляется перспективной для проведения экспресс-оценок содержания микроорганизмов в образцах водных сред, поскольку позволяет использовать простую аппаратуру для измерений и обеспечивает высокую чувствительность детекции.

2.4. Фоточувствительные сенсоры

В последнее время повышенное внимание уделяется новому классу сенсоров - фоточувствительным, характеризующимся наличием мембраны, генерирующей фотоэлектродвижущую силу (фотоЭДС) при освещении. В одних случаях генерация фотоЭДС обеспечивается встраиванием в

диэлектрические мембраны ориентированно расположенных молекул красителя, в других - за счет их модификации фоточувствительными белками, например, бактериальным родопсином.

Использование протон-транспортирующих свойств бактериального родопсина для формирования фоточувствительного потенциометриче-ского сенсора.

Биосенсор состоял из двух элементов - полевого транзистора и аце-тилцеллюлозной (АЦ) матрицы, содержащей встроенный БР.Освещение матрицы приводило к возникновению фотоответов сенсора, амплитуда которых составляла 8-12 мВ.

Созданную модель фоточувствительного биосенсора можно использовать как в исследовательских, так и в практических целях. Потенциально она может быть применена для оценки функционального состояния БР (протон-транспортных свойств и их изменений под влиянием биологически активных соединений). Данное устройство может представлять интерес также для создания биокомпьютерных элементов, к которым в последнее время проявляется повышенный интерес и в которых биологические молекулы применяют в комбинации с твердотельными электронными компонентами - транзисторами, приборами с зарядовой связью и т.д.

Химический и ферментный сенсоры, содержащие фоточувствительную мембрану. Определение концентраций ионов аммония и мочевины.

Интерес к разработкам искусственных мембран с регулируемыми физико-химическими свойствами - мембранным потенциалом, ионной проницаемостью, проводимостью связан с возможностью решения ряда важных практических задач. Описанные в литературе методы регистрации электрической активности основаны на использовании электрохимических ячеек или электродов, которые имеют размеры порядка сантиметров, т.е. являются макросистемами. Нами создана система регистрации фото-ЭДС с помощью транзистора, представляющего более удобный вид преобразователя, поскольку ПТ имеют малые размеры, низкое выходное сопротивление, обеспечивают быстрое время ответа и позволяют достаточно простыми способами осуществлять температурную и шумовую компенсацию для повышения точности регистрации.

Мебраны, модифицированные красителем, изготавливали двумя методами - поливом и вытяжкой. В первом случае основой мембраны являлся поливинилхлорид (ПВХ). Для формирования мембран ПВХ растворяли в тетрагидрофуране, содержащем диоктилфталат в качестве пластификатора, и производное спиробензопирана Г-гексадецил-3',3'-диметил-6-нитроспиро[2Н-1-бензопиран-2,2'-индолин]. Для регистрации фотоответов мембрану размещали на затворной области ПТ, содержащего свето-изолирующий экран.

Метод вытяжки ("крейзинг"-метод) позволял получить мембраны, обладающие высокой механической прочностью/В этом случае фоточувствительную мембрану изготавливали из пленки полиэтилентерефталата (ПЭТФ). Нонактин использовали для придания ионной чувствительности мембран к ионам аммония. Краситель и ионофор в процессе вытяжки встраивались в поверхностные дефекты (крейзы). Внешнее проявление ионной чувствительности сенсора состояло в зависимости его фотосигналов от концентрации ЫН4+ в среде и было выражено уменьшением амплитуды при росте концентрации >Ш4+. Нижний предел детекции находился в области 10 мкМ, линейная часть калибровочной зависимости заключалась между 0.1 и 3.0 мМ (Рис. 5).

Фотоответ, 6. Освещение

% от контрольного

100-,

80-

Концентрация N1-1)0, [М]

Рис. 5. Калибровочная зависимость (а) химического сенсора для детекции ионов аммония, виды ответов и схематическое представление элементов сенсора (б) : 1 - электрод сравнения; 2 - мембрана, модифицированная нонактином и аналогом спиробензопирана 1'-гексадецил-3',3'-диметил-6-нитроспиро[2Н-1-бензопиран-2,2'-индолин]; 3 - светозащитный экран; 4 - внутренний электролит; 5 - уплотняющее кольцо; 6 - внешний электролит.

Чувствительность мембраны к ионам аммония была использована для создания биосенсора на основе фермента уреазы для определения концентрации мочевины. Ионы аммония, возникающие в реакции гидролиза мочевины уреазой (мн2)гСО ур"" >СО,+2Ш3 >мн;+НОТ; изменяют величину фотоответов, регистрируемую транзистором, в соответствии с

калибровочной зависимостью. Этот эффект служил основой для оценки концентрации мочевины в пробе. Компонентами для приготовления ферментной мембраны являлись водный 80% раствор уреазы, водный 10% раствор бычьего сывороточного альбумина, 8% раствор глутарового альдегида. Растворы смешивали и наносили на мелкоячеистую капроновую сетку размером 3x3 мм2, расположенную на поверхности аммонийселек-тивной мембраны. Зависимость фотоответов биосенсора от концентрации мочевины была линейна в интервале 10"5 -10"3 М.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что используя полевой транзистор и фоточувствительную мембрану, можно путем модификации мембраны ионофорами и иммобилизации соответствующих ферментов достаточно простыми способами создавать высокочувствительные миниатюрные сенсоры. Перспективность практического использования сенсоров определяется тем, что их элементы "транзистор/ионселективная фоточувствительная мембрна/пленка с иммобилизованным ферментом" относятся к легко заменяемым компонентам, вследствие чего возможна их оперативная замена и быстрая настройка на анализ широкого спектра биологически активных соединений.

2.5. Светоадресуемый полупроводниковый сенсор (СПС). Регистрация биохимических реакций.

СПС позволяют достаточно простыми способами создавать многоканальные системы. СПС основан на принципе световой адресации сигнала; в СПС считывание локальных значений электрохимического потенциала (в частности, значений рН) в различных точках поверхности производится путем их освещения видимым или ИК-светом. В основе функционирования сенсора лежит зависимость тока, генерируемого при освещении, от поверхностного потенциала, возникающего на границе "электролит -диэлектрик".

Созданный прибор состоит из иоветной ("1" на схеме) и измерительной частей (Рис. 6а). Кювета содержит собственно сенсор - кремниевую пластину л-типа (КЭФ-500, кристаллографическая ориентация [100]) и светодиод, обеспечивающий импульсную подсветку. В качестве рН - чувствительной мембраны использован окисел тантала. Кремниевая пластина через уплотняющее кольцо прижимается к окну кюветы объемом, которая заполняется исследуемым электролитом; для перемешивания служит магнитная мешалка (5). Измерительная часть включает генератор линейного напряжения (2), приемный импульсный усилитель (3), детектор (4), компаратор (8), на вход которого поступает опорный сигнал с выхода детектора, блок цифровой индикации (9). Для питания светодиода используется генератор прямоугольных импульсов тока (6). В приборе имеется выходное гнездо для подключения внешнего ХУ-регистратора (7).

Потенциал смещения, В

а) б)

Рис. 6. Функциональная схема СПС и вольт-амперные характеристики:

а) Блок-схема прибора. 1 - кюветная часть (а - корпус, б - светодиод, в - собственно сенсор, г - уплотняющее кольцо, д - исследуемый раствор, е - электрод сравнения).

б) Зависимость фототека 1ф сенсора от потенциала смещения при различных рН раствора.

Прибор позволяет регистрировать вольт-амперные характеристики (ВАХ); в периодическом/ однократном режимах производить регистрацию потенциала смещения (исм); регистрировать зависимости фототока (1ф) от времени при заданном ис„.

Линейное изменение во времени исы на электроде сравнения приво дит к генерации ВАХ, отражающих зависимость 1ф в полупроводнике от иси, типичный вид которых для электролитов с различными значениями рН приведен на рис. 66. Зависимость 1ф от рН раствора составляет основу использования СПС для регистрации как абсолютных значений, так и изменений рН, которые возникают на границе "электролит-диэлектрик" в зоне иммобилизованного биоматериала.

Основные технические характеристики прибора.

Диапазон изменения частоты импульсов

генератора питания светодиода 0.5... 10 кГц

Диапазон изменения UCM 0...-3.0 В.

Входное сопротивление приемного усилителя 107 Ом

Общий коэффициент усиления тракта 200

Прибор выполнен на микросхемах серий 544 и 561, конструктивно оформлен в виде блока с габаритами 70 мм х 150 мм х 230 мм; масса 700 г. Питание от сети переменного тока 220 В, 50 Гц, потребляемая мощность 20 Вт.

Созданный прибор использовали для оценки начальной скорости реакций окисления глюкозы в присутствии ппокозооксидазы и гидролиза этилового эфира К-ацетил-Ь-тирозина с участием а-химотрипсина.

Глюкозооксидазу (ГОД) и а-химотрипсин (ХТ) иммобилизовали на поверхности СПС двумя способами: включением в бычий сывороточный альбумин (гидрофильная матрица) и в полимерную матрицу модифицированного полиэтиленимина (гидрофобная матрица). Константы Михаэлиса для ГОД и ХТ в матрице полиэтиленимина составили 6.0 и 3.1 мМ, а рН-оптимум лежал в диапазоне 6.0 - 7.2 и 7.0 1 8.0, что совпадает с данными, полученными другими методами и свидетельствует об эффективности использования СПС в комбинации не только с гидрофильными, но и с гидрофобными матрицами; последняя возможность позволяет рассматривать вопрос о создании биосенсоров потенциометрического типа для детекции соединений, слаборастворимых в водной фазе.

Характеристики преобразователя свидетельствуют о возможности использования Таг05 в качестве рН-чувствительного диэлектрика в свето-адресуемых сенсорах, а также о возможности использования созданного прибора как основы биосенсоров потенциометрического типа для регистрации рН-генерирующих биохимических реакций, происходящих как в гомогенных условиях, так и в зоне иммобилизованного биоматериала. Прибор является основой для разработки нового поколения многоканальных биосенсоров.

2.6. рН-волны, генерируемые популяцией растущих и хемотак-тирующих бактерий Е.со1и

Переход биологических структур (здесь рассматривается на примере бактериальных колоний) из одной формы в другую может осуществляться в виде волновых либо монотонно протекающих процессов; для исследования механизма, лежащего в основе таких трансформаций прибегают к помощи теоретических и экспериментальных моделей. Интенсивно изучаемой в последнее время моделью динамической структуры, характеризующейся волновым типом трансформации, являются популяционные волны микроорганизмов.

Теоретические и экспериментальные модели показали, что возможность и характер перехода от одних структур к другим зависят от рН питательной среды. рН существенно влияет на скорость распространения волн, на характер их взаимодействия. Стандартная техника стеклянных рН-электродов не позволяет регистрировать такие изменения. Вместе с тем успехи в разработке миниатюрных рН-чувствительных полевых транзисторов, используемых в биосенсорах, позволяют подойти к решению такой задачи.

Целью исследования являлось создание метода количественной оценки изменений локальных значений рН среды, которые происходят в процессе распространения популяционной бактериальной волны. Задача решена двумя способами: а) измерением рН среды путем отбора проб малого (5-15 мкл) объема с последующим определением значений рН и б) с помощью непрерывной регистрации изменений рН транзистором, встро-

енным в агаризованную среду. Оба разработанных способа позволили показать, что профили рН претерпевают изменения на фронтах популяцион-ных волн. Закисление происходит в средах, содержащих глюкозу, защела-чивание - в средах на основе пептона (Рис. 7).

8.0 -1

7.20

7.15

3 4

Расстояние, см Время после инокуляции, ч

а) б)

Рис 7. Генерация рН-волн расширяющейся популяцией бактерий Е.соИ.

а) Распределение рН в популяциях, растущих на агаре, содержащем глюкозу в концентрациях 2 г/л (зависимость 1) и 0.2 г/л (зависимость 2). б) Распределение рН в популяции, растущей на пептоне (непрерывная регистрация встроенным ПТ).

Для биосенсорных исследований данный подход также представляется важным, поскольку позволяет устанавливать связь эффектов формирования популяционных волн с условиями/составом внешней среды, что в сущности относится к одной из задач биосенсорики.

2.7. Регистрирующий усилитель с предобработкой сигналов

Создан регистрирующий усилитель, предназначенный для выполнения процедур первичной обработки сигналов биосенсора. Регистрируемыми параметрами являются начальная скорость и амплитуда рН изменений. Измерительным электродом служит ПТ, содержащий иммобилизованный биоматериал. Устройство имеет два режима работы: а) режим поиска и определения максимального значения скорости реакции и б) режим измерения амплитуды сигнала в заданный момент времени.

В состав устройства входят таймер, световые и звуковые индикаторы. Программный блок информирует экспериментатора о параметрах исследуемого объекта: при работе в автоматическом режиме в течение первой фазы измерения индикатор представляет информацию о скорости изменения рН. По сигналу таймера максимальное значение этой величины запоминается, а в конце измерения на индикаторе появляется значение амплитуды сигнала. О текущей фазе измерения сообщают светодиодные индикаторы.

Созданный прибор значительно упрощает процедуру регистрации сигналов биосенсора на основе ПТ и может служить основой/прототипом для разработки серийно выпускаемых биосенсорных анализаторов.

Глава 3. Амперометрические микробные сенсоры

3.1. Сравнительная оценка эффективности бактерий рода Gluconobacter. Амперометрические биосенсоры для детекции легко-утилизируемых субстратов.

Многие штаммы микроорганизмов обладают способностью к неполному окислению спиртов, Сахаров и органических кислот, однако наиболее отчетливо это свойство проявляется у бактерий рода Gluconobacter.

Данная часть исследований была посвящена изучению субстратной специфичности и чувствительности 25 штаммов рода Gluconobacter с целью выявления наиболее активных микроорганизмов как основы рецеп-торного элемента амперометрических биосенсоров для определения углеводов, спиртов, органических кислот. Штаммы G. oxydans subsp. industrius, G. oxydans subsp. melanogenes, G. oxydans subsp. suboxydans, G. cerinus, a также Gluconobacter spp. B-1284 и В-1285 получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, далее группа 1), штаммы Gluconobacter spp. №№1, 2.8, 3, 3.9, 4, 4.1, 6, 9.4 и 9.7 (группа 2) и G. oxydans №№ 1-10 - из коллекции НПО "Витамины", Москва (группа 3).

Помимо обнаруженных значительно различающихся для штаммов группы 1 абсолютных значений ответов на глюкозу выявлены существенные различия относительной субстратной специфичности. Эти факты говорят о том, что эффективность ферментативных систем, обеспечивающих метаболизм исследованных субстратов, для штаммов группы 1 существенно различается. Так, для штамма G. oxydans subsp. melanogenes можно отметить высокую относительную чувствительность к пирувату; штамм G. oxydans subsp. industrius характеризовался высокой относительной чувствительностью к ксилиту; тем не менее, низкая абсолютная чувствительность этих штаммов к перечисленным субстратам ограничивает их эффективное использование в биосенсорах.

Штаммы группы 2 характеризовались достаточно близкой, субстратной специфичностью. Среди бактерий группы 3 следует выделить штаммы 4, 9 и 10, обладающие высокой абсолютной чувствительностью к глюкозе и этанолу; штамм 4 характеризовался также высокой селективностью к этим двум субстратам. Штамм № 8, напротив, имел низкую абсолютную чувствительность ко всем исследованным субстратам. В целом, штаммы G. oxydans были более разнородны в отношении субстратной специфичности, чем штаммы Gluconobacter spp.

Сравнительная оценка свойств штаммов рода Gluconobacter показала, что культуры G. oxydans subsp. industrius, G. oxydans subsp. melanogenes, G. oxydans subsp. suboxydans, G. cerinus, Gluconobacter spp. B-1284 и В-1285 характеризуются большой разнородностью и, за

исключением G. oxydans subsp. industrius и G. cerinus, низкой чувствительностью ко всем исследованным субстратам, что не позволяет обеспечивать удовлетворительные параметры биосенсорной детекции. В то же время штаммы Gluconobacter spp. №№ 1, 2.8, 3, 3.9, А, АЛ, 6, 9.4 и 9.7 и G. oxydans №№ 1-10 характеризуются значительным сходством субстратных специфичностей, а также высокой чувствительностью к этанолу, глюкозе, глицерину и могут рассматриваться в качестве основы микробных биосенсоров для детекции этих соединений.

3.2. Мембраносвязанные дегидрогеназы целых клеток Gluconobacter oxydans как основа сенсоров для определения Сахаров, спиртов, полиолов

Активность мембраносвязанных дегидрогеназ иммобилизованных клеток Gluconobacter oxydans была использована нами в биосенсорах ам-перометрического типа для определения глюкозы, этанола, глицерина. Модель применили для анализа глюкозы в крови человека, глицерина в ферментационных средах и паров этанола в воздухе. Биосенсоры оказались эффективными при анализе образцов, которые не включали, кроме искомого, других субстратов, утилизируемых микроорганизмами. Нами детально исследованы характеристики сенсора на основе бактерий G. oxydans № 6. Сенсор с высоким отношением "сигнал/шум" позволял регистрировать присутствие в образцах глюкозы, этанола, глицерина, ксилозы; определение концентраций этанола и глюкозы было возможно в диапазоне 0.05-5.0 мМ, глицерина - в диапазоне 5-50 мМ, ксилозы - в диапазоне 0.5- 50 мМ. Время измерения составляло 30-90 секунд.

Исследование ошибки и вариабельности сигналов для рецепторных элементов, приготовленных из одной партии клеток, показало, что ошибка не превышает 7%, а стандартное отклонение в серии из 12 рецепторных элементов составляет 23% от среднего, что свидетельствует о малом разбросе параметров измерительных элементов.

Оценивая влияние внешних условий на сигналы сенсора, изучали их зависимость от рН, температуры, осмотической нагрузки. рН-оптимум находился в области рН от 5.0 до 6.0; максимум амплитуды ответов приходился на 40-45° С; максимальные сигналы наблюдали при концентрации хлористого натрия 20 мМ. Полученные зависимости свидетельствуют о достаточно стабильном характере параметров сенсоров и представляют полезную информацию при их использовании в практических целях.

Оценка возможности применения амперометрического биосенсора на основе бактерий G. oxydans для определения содержания ксилозы была выполнена в модельных условиях. Были исследованы зависимости ответов от концентрации ксилозы, арабинозы и ксилита в диапазоне от 0.01 до 50 мМ. Сенсор позволял производить оценку содержания ксилозы в диапазоне от 0.5 до 50 мМ. При оценке уровня ксилозы в диапазоне концентраций от 0.5 до 20 мМ ксилит, присутствующий в концентрации 13 мМ,

не влиял на результат анализа. Этот факт важен с практической точки зрения и свидетельствует о том, что в случае биологической или химической трансформации ксилозы присутствие ксилита в высоких концентрациях не будет влиять на точность оценок содержания ксилозы. В целом же субстратная специфичность модели была не хуже, чем специфичность медиаторного биоэлектрода, основанного на альдозодегидрогеназе, выделенной из бактерий б. охуйат и описанного в серии работ М. 8то1апс1ег (1993-1994 гг.).

Практическое применение созданных моделей.

Содержание глюкозы в сыворотке кроеи. На рис. 8 представлены результаты измерения содержания глюкозы в сыворотке крови человека. В случайной выборке присутствовали образцы, взятые как у больных сахарным диабетом, так и у клинически здоровых людей. Измерения производили тремя способами: 1) с помощью микробного сенсора, 2) выпускаемым промышленностью анализатором глюкозы "Эксан-Г" и 3) ортото-луидиновым методом, принятым в биохимических лабораториях медицинских учреждений России.

Номер пробы

Рис. 8. Детекция глюкозы в образцах сыворотки крови человека тремя независимыми методами.

Результаты измерений образцов микробным сенсором хорошо коррелировали с результатами оценок ортотолуидиновым методом, а также с данными, полученными с помощью ферментного анализатора глюкозы "Эксан-Г". Коэффициент корреляции для обоих случаев составлял 0.97. Микробный сенсор позволял производить оценку содержания глюкозы с ошибкой измерения, не превышающей 5%. Эти данные, а также нечувствительность сенсора к присутствию аскорбиновой кислоты, находящейся в крови человека в концентрациях до 5 мМ, свидетельствует о возможности применения микробного сенсора для детекции глюкозы в сыворотке крови как у здоровых, так и у больных сахарным диабетом людей.

Оценка содержания глюкозы в ферментационной среде. Показана возможность использования микробного сенсора для оценки содержания

глюкозы в ферментационных средах. Ценными биологически активными веществами являются полиненасыщенные жирные кислоты типа линоле-новой и арахидоновой, синтезируемые грибами рода Мисог. При их культивировании используют глюкозу как единственный источник углерода и энергии. Микробный сенсор применили для оценки содержания этого субстрата в ферментационной среде при культивировании штамма Мисог sp. 1, что позволило получить зависимость концентрации глюкозы от времени культивирования. Данные, полученные независимыми методами (методом Сомоджи-Нельсона и глюкозоанализатором "Эксан-Г"), оказались близки. Результаты статистического анализа, выполненного с помощью t-теста Сгьюдента с уровнем значимости 5%, показали, что статистически достоверного различия между оценками не существуют.

Детекция глицерина в ферментационной среде. Определение концентраций глицерина относится к одной из наиболее сложных практических задач биотехнологии. Глицеролдегидрогеназная активность G. oxydans была использована для измерения концентрации глицерина в ферментационной среде при биотрансформации ситостерина в андроста-диендион культурой Mycobacterium sp.; анализируемая среда кроме глицерина не содержала других компонент, окисляемых G. oxydans, что позволило без помех, обусловленных присутствием субстратов, оценить динамику изменения его содержания. В течение 80 часов культивирования был выполнен анализ 9 проб; результаты замеров показали, что первые 40 часов процесса характеризовались практически линейно снижающейся концентрацией глицерина от начального уровня 80 мМ до нуля. С учетом сложного гетерофазного состава ферментационной среды, требующего предобработки проб при анализе глицерина традиционными методами, биосенсорный способ детекции глицерина представляется наиболее удобным и простым.

Отметим в заключение данного раздела, что созданные модели демонстрируют принципиальную возможность эффективного использования активности целых клеток G. oxydans в биосенсорах амперометриче-ского типа. Сенсоры обладают высокой чувствительностью и позволяют выполнять анализ глюкозы в сыворотке крови человека, глицерина и глюкозы в ферментационных средах, не содержащих других окисляемых G. oxydans субстратов. Факторами, которые делают указанные модели практически полезными, являются

- низкая стоимость бактериальных клеток, используемых для формирования рецепторного элемента, по сравнению с применением очищенных ферментов;

- высокая чувствительность к субстратам, которые часто используются в биотехнологических процессах;

- стабильность рецепторного элемента.

Приведенные характеристики сенсоров и примеры их использования свидетельствуют о том, что в ряде случаев широкая специфичность биосенсора не должна рассматриваться как его недостаток; выход может состоять в поисках ситуаций, в которых возможно наиболее эффективное применение его характеристик, например, анализ однокомпонентных сред или сред, не содержащих других утилизируемых субстратов. Полученные результаты говорят о перспективности использования клеток данной культуры как основы биосенсоров, имеющих практическую полезность для медицины, биотехнологии.

3.3. Сравнительная оценка алкогольокисляюхцей активности культур Gluconobacter oxydans и Pichia meianolica с целью их использования в биосенсорах для детекции этанола.

Определение концентрации этилового спирта относится к актуальным задачам во многих отраслях химической, пищевой промышленности и биотехнологии. Перспективным направлением при конструировании биосенсоров для анализа этанола является использование микробных клеток в качестве основы рецепторного элемента.

Нами произведена сравнительная оценка характеристик моделей сенсоров на основе дрожжевых клеток Pichia meianolica MN4, содержащих высокоактивную алкогольоксидазу, и бактерий Gluconobacter oxydans с высокоактивной алкогольдегидрогеназой. На основе этих микроорганизмов были созданы модели сенсоров и выполнена оценка их чувствительности и специфичности в лабораторных условиях.

Диапазон измеряемых концентраций охватывал область от 0.05 до 10 мМ этанола. Сигналы сенсора на основе G. oxydans превышали ответы сенсора на основе P. meianolica в 1.5-2 раза во всем диапазоне использованных концентраций субстрата.

Сенсор на основе P. meianolica характеризуется высокой селективностью - для исследованных субстратов зарегистрирована чувствительность только к этанолу и метанолу, в то время как сенсор на основе клеток G. oxydans реагировал на широкий спектр субстратов. Изучены зависимости ответов сенсоров от рН и температуры раствора. Максимальные ответы наблюдались при использовании фосфатного буфера, имеющего рН 6.0 (для G. oxydans) и 8.0 (для P. meianolica). Температурные зависимости, исследованные для обеих моделей, имели максимум при 45-50°С.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности эффективного использования исследованных культур микроорганизмов для практического анализа этанола; высокая селективность сенсора на основе Р. meianolica делает эту биосенсорную систему детекции более перспективной при анализе проб, содержащих мешающие субстраты.

3.4. Бактерии рода Pseudomonas как основа рецепторного элемента микробных сенсоров для детекции ксенобиотиков и поверхностно-активных веществ.

Развиваемые в .настоящее время биотехнологические методы восстановления окружающей среды от техногенных загрязнений основаны на использовании микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков. Способность микроорганизмов к деградации вредных веществ обусловлена наличием у них специфических ферментных систем - так, в деградации ароматических соединений ключевую роль играют оксигеназы, катализирующие реакции окисления ароматических колец. Наличие подобных реакций в путях метаболизма делает возможным использование микроорганизмов в рецепторных элементах биосенсоров для детекции ксенобиотиков.

Цель наших исследований состояла в оценке принципиальной возможности создания на основе штаммов рода Pseudomonas биосенсорных устройств амперометрического типа для детекции ароматических соединений и ПАВ. В качестве модельных ароматических соединений были использованы нафталин, бифенил и хлорированные бензоаты, толуолсуль-фонат; додецилсульфат натрия был выбран как представитель анионных ПАВ. Задачи исследования включали изучение эффективности штаммов, входящих в состав биорецепторного элемента, и оценку специфичности полученных моделей.

При создании модели сенсора для детекции бифенила использовали 4 природных штамма Pseudomonas putida, способных к росту на бифениле р качестве единственного источника углерода и энергии и штамм Pseudomonas aeruginosa 142 в модели сенсора для детекции хлорированных бензоатов, характеризующийся способностью к их деградации. Штамм Pseudomonas putida BS238, несущий плазмиду биодеградации нафталина и салицилата pBS2, служил основой сенсора для детекции нафталина. При культивировании штаммов в качестве единственного источника углерода и энергии использовали предполагаемый субстрат (т.е. бифенил, нафталин, толуолсульфонат либо 2-хлорбензоат).

По результатам предварительной оценки эффективности штаммов Р. putida в процессах окисления бифенила были отобраны как наиболее эффективные штаммы Р. putida 2д-8 и 14д2-3.

Модели сенсоров на их основе позволяли производить детекцию бифенила в водных средах, начиная с концентрации 1.5 мкМ (Рис.9а). Два других штамма характеризовались значительно меньшей активностью и не представляли интерес для создания биосенсорных устройств.

Сенсор на основе Р. aeruginosa 142 был чувствителен к присутствию в среде различных хлорпроизводных бензоата. Так, для 2,5-дихлорбензоата нижней границей детекции является концентрация 4 мкМ, для 2- и 4-хлорбензоатов - 8 мкМ (Рис.9б).

1 10 100 ю 100 1000 10000

Бифенил, цМ Концентрация, цМ

а) б)

Рис. 9. Калибровочные зависимости для сенсоров на основе штаммов рода Pseudomonas. Детекция а) бифенила, б) хлорбензоатов.

Для детекции нафталина использовали бактериальные клетки Р. putida BS238, несущие плазмиду pBS2 его деградации. Сенсор позволял производить определение концентрации нафталина в однокомпонентной среде с нижним пределом детекции около 1.0 мкМ.

Для амперометрического определения п-толуолсульфоната создана модель сенсора на основе иммобилизованных клеток Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010). Нижний предел детекции составлял 5 мкМ. Оптимальной измерительной средой для сенсора являлся 30 мМ калий-фосфатный буферный раствор (рН 7.6). Ответы сенсора были стабильны в течение двух недель.

Исследованы оптимальные условия функционирования сенсоров. Субстратная специфичность биосенсоров приведена на рис. 10. Среди рассмотренных моделей, сенсор на основе штамма P. putida BS238 характеризуется более высокой селективностью; из диаграммы следует, что его ответы на нафталин значительно превышают ответы на остальные анализируемые соединения. Более низкую селективность наблюдали у сенсоров на основе бифенильных штаммов P. putida и P. aeruginosa 142; с их помощью были зафиксированы значительные ответы на ряд органических соединений, в частности, углеводов и ароматических спиртов и кислот.

Широкое применение ПАВ в различных областях промышленности и в быту приводит к их появлению в сточных водах и интенсивному загрязнению водных резервуаров. Поскольку полностью исключить попадание ПАВ в окружающую среду невозможно, необходима разработка простых и надежных методов контроля их содержания, в первую очередь экспресс-Методов, основанных на применении микробных биосенсоров.

100

О 80

г 1 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18 19

Субстраты, 25 мкМ

Рис. 10. Субстратная специфичность сенсоров на основе штаммов Pseudomonas. Ответы на бифенил P. putida 7 и 9, на нафталин P. putida BS238 (pBS2) и на 2,5-дихлорбензоат Р. aeruginosa приняты за 100%. Концентрация всех соединений равна 25 мкМ. Обозначения: (1) бифенил; (2) нафталин; (3) 2-хлорбензоат; (4) 4-хлорбензоат; (5) 2,5-дихлорбензоат; (6) салицилат; (7) фенол; (8) катехол; (9) бензоат; (10) гентизат; (11) глюкоза; (12) этанол; (13) ксилоза; (14) ксилит; (15) арабиноза; (16) арабит; (17) глицерин; (18) пируват; (19) цитрат.

Нами разработана модель биосенсора амперометрического типа для определения ПАВ; в качестве модельного был выбран додецилсульфата натрия (ДСН), принадлежащий к анионным поверхностно-активным веществам. Рецепторный элемент был основан на бактериальных клетках Р. ratonis Т, содержащих плазмиду деградации анионных ПАВ.

Созданный биосенсор позволял производить измерение ДСН в диапазоне концентраций от 0.75 мг/л до 1.0 г/л. Время измерения образца не превышало 5 мин; нижний предел обнаружения ДСН находился в области 0.25-0.75 мг/л. Характерным являлась узкая субстратная специфичность. Наиболее высокую чувствительность обнаружили при детекции ДСН. Высокий уровень сигналов наблюдали также при детекции таких ПАВ, как волгонат, децилбензолсульфонат, метаупон. Ответы, вызванные присутствием в среде этанола, составляли 40% от ответов на ДСН. Присутствие глюкозы в анализируемом образце вызывало лишь незначительные сигналы. Сенсор был нечувствителен к ароматическим ксенобиотикам - сали-цилату, фенолу, катехолу, бензоату. Учитывая, что ПДК в России для ДСН составляет 0.5 мг/л, можно предположить, что созданная модель сенсора позволит производить его обнаружение в реальных образцах на уровне концентраций, соответствующих природоохранным стандартам.

В заключении по данному разделу отметим, что отобранные для экспериментов штаммы могут составлять основу рецепторных элементов микробных сенсоров для детекции ароматических соединений и ПАВ.

Биосенсоры, основанные на бактериальных клетках P. putida и P. aeruginosa, могут быть использованы для детекции высоких концентраций би-фенида и хлорированных бензоатов. Вопрос об их эффективном практическом применении в настоящее время является открытым, поскольку нижний предел детекции на два порядка превышает значения, принятые в России в качестве ПДК. Этот факт, а также низкая селективность сенсоров частично снижают их практическую ценность. Вместе с тем, эти сенсоры могут быть эффективно использованы для оценки интегральных показателей типа индекса биологической потребности кислорода (БПК) в средах, загрязненных указанными ксенобиотиками. Сенсор, основанный на бактериях P. putida BS238, имел более высокую селективность; кроме того, высокое значение ПДК для нафталина в России (около 0.8 мкМ) делает возможным практическое использование этого сенсора для выполнения экологического мониторинга.

3.5. Электрокаталитическое окисление субстратов иммобилизованными клетками Gluconobacter oxydans в присутствии медиатора электронного переноса.

Оксидазы, катализирующие реакции биологического окисления, используют молекулярный кислород в качестве естественного акцептора электронов, вместе с тем в ряде случаев его можно заменить медиатором, осуществляющим транспорт электронов. Подавляющее большинство описанных к настоящему времени медиаторных биосенсоров основано на использовании ферментов. Новым направлением является разработка клеточных, в том числе микробных, медиаторных электродов. Микробные медиаторные биосенсоры представляют более сложную систему в сравнении с ферментными; a priori неизвестно, какие виды микроорганизмов и какие медиаторы следует использовать для создания клеточного биоэлектрода, какими характеристиками будет обладать данная система. Перспективность данного направления связана с возможностью использования преимуществ медиаторных электродов при сохранении достоинств микробных сенсоров.

В работе исследовали принципиальную возможность электрокаталитического окисления субстратов иммобилизованными клетками G. oxydans № 6 в присутствии медиатора электронного переноса 1,1-диметилферроцен [бис-метилциклопенто-диенил) железа]; выполнена оценка основных характеристик этой модели биосенсора. Медиаторный электрод формировали на основе композиции "графитовая пудра-парафиновое масло-медиатор", клетки иммобилизовали сорбцией.

Максимальные ответы соответствовали потенциалам в диапазоне 500-550 мВ. При сравнении характеристики медиаторного сенсора с аналогичными характеристиками сенсора на основе кислородного электрода Кларка, в котором был использован этот же штамм, нашли принципиальное отличие, проявляющееся в измененном портрете субстратной специ-

фичности. Для сенсора на основе электрода Кларка соотношение откликов для этанола, глюкозы и глицерина составляло 150:100:30; для медиа-торного электрода характерным являлось соотношение 25:100:2. Мы полагаем, что наблюдаемое изменение чувствительности микроорганизмов к указанным субстратам может быть обусловлено применением медиатор-ной схемы регистрации сигналов; нельзя исключить также влияние на субстратную специфичность и примененного метода иммобилизации.

Созданная модель сенсора на основе клеток G. oxydans свидетельствует о принципиальной возможности использования данной культуры для формирования медиаторных электродов и расширяет спектр микроорганизмов, пригодных для конструирования подобных систем. Дальнейший анализ свойств модели представляется важным как для создания аналогичных биоэлектродор, так и для возможности изучения механизма транспорта электронов в дыхательной цепи микробных клеток.

3.6. Повышение селективности детекции: определение концентрации этанола в двухкомпонентной смеси "глюкоза - этанол" с использованием неселективного микробного сенсора и глюкозного ферментного электрода. Применение элементов теории распознавания образов

Микробным биосенсорам присуща широкая субстратная специфичность. В тех случаях, когда требуется селективная оценка, широкая субстратная специфичность является помехой.

Описанные в литературе способы повышения селективности микробных сенсоров (субстратная адаптация, использование мутантных микроорганизмов, поиск специфичных штаммов, использование селективных мембран) представляют примеры частного решения проблемы. Более общим подходом может явиться применение элементов теории распознавания образов (ТРО). Элементы ТРО широко используются в хемосенсори-ке, однако их адаптация к биосенсорным измерениям практически не известна.

Мы оценили возможность применения процедуры Мюллера для повышения селективности биосенсорного определения. Целью исследования являлось использование элементов ТРО для селективной детекции этанола в смеси "глюкоза - этанол" системой сенсоров, состоящей из микробного и ферментного.

В микробном сенсоре использовали целые клетки G. oxydans. Содержание глюкозы в образцах измеряли промышленно выпускаемым ферментным глюкозоанализатором "Эксан-Г". Выбор субстратов был продиктован актуальностью задач контроля ферментационных процессов, в которых этанол и глюкоза зачастую являются субстратами, присутствующими одновременно.

Поверхность отклика микробного сенсора Отклик сенсора, нА/с

Этанол, мМ Глюкоза, мМ

Рис. 11. Зависимость величины отклика микробного сенсора от концентраций глюкозы и этанола для диапазона 0.05 мМ + 10.0 мМ. Линия "а" получена пересечением калибровочной поверхности микробного сенсора плоскостью его ответа (как пример, 0.6 нА/с) на анализируемый образец; Линии "Ь" ограничивают допустимый разброс результатов областью ошибки ±8%; Линия "с" является проекцией линии "а" на плоскость концентрации субстратов и определяет абсолютные значения концентраций при их различных соотношениях, вызывающих данный (0.6 нА/с) отклик микробного сенсора.

Стандартная схема биосенсорного анализа "один сенсор - одно вещество" подразумевает построение градуировочной зависимости, с помощью которой определяется концентрация искомого вещества. В случае "один сенсор - два вещества" соответствующая зависимость представляет собой поверхность. На Рис. М представлена градуировочная поверхность, отражающая зависимость откликов микробного сенсора от содержания в смеси глюкозы (диапазон концентраций 0-10 мМ) и этанола (диапазон концентраций 0-10 мМ). Для осуществления двухкомпонентного анализа с помощью рассмотренной системы сенсоров необходимо выполнить следующие действия:

1) построить градуировочную поверхность (рис. 11);

2) определить отклики двух сенсоров на исследуемый образец;

3) получить линии отклика каждого сенсора, для чего произвести сечение градуировочной поверхности этого сенсора, полученной в пункте 1, горизонтальной плоскостью со значением ординаты, равным величине отклика данного сенсора (см. пункт 2);

4) получить изоклины проекцией линии отклика на плоскость концентраций.

5) определить точку пересечения изоклин. Ее координаты и являются искомыми концентрациями составляющих образец субстратов.

Исследованы области линейности и аддитивности откликов сенсора. Показано, что в указанном диапазоне концентраций возможно селектив-

ное определение концентрации этанола указанным способом с ошибкой, не превышающей 12%.

Предложенный подход повышения селективности анализа с помощью микробных сенсоров ранее не использовался. Полученные результаты важны с практической точки зрения, поскольку создают основы нового в биосенсорном анализе подхода по повышению селективности детекции.

3.7. Эффекты высоких концентраций кислорода. Гипероксиге-нация среды измерения с помощью перфтордекалина.

Распространенной конфигурацией микробного сенсора является иммобилизация клеток на электроде типа Кларка, в которой для измерения используется эффект изменения скорости дыхания при появлении в среде анализируемого соединения. Недостатком микробных биосенсоров является зависимость сигналов от концентрации кислорода в среде измерения.. Изучение эффектов дополнительной оксигенации при измерениях микробными сенсорами до настоящего времени не проводили.

Мы изучили эффекты гипероксигенации (увеличения уровня кислорода в среде измерения на 200-400%) при выполнении анализа с помощью микробного биосенсора. Основу рецепторного элемента составляли клетки G. oxydans (штамм Gluconobacter oxydans subsp. industrius (B-1280)), в качестве модельного анализируемого соединения была выбрана глюкоза. Оксигенацию среды осуществляли с помощью перфтордекалина - полностью фторированного органического соединения, обеспечивающего высокую растворимость кислорода.

Увеличение содержания растворенного кислорода в среде приводило к существенному возрастанию амплитуды ответов биосенсора при повышенной плотности биомассы в биорецепторе (выше 0.01 мг/мм2) и концентрации субстрата (выше 1 мМ). Так, при плотности клеток 0.025 мг/мм2 и концентрации глюкозы 3 мМ степень увеличения амплитуды ответов Ао/Ак (А0 and Ак - амплитуда сигналов сенсора при гипероксигенации измерительной среды и в контрольных условиях, соответственно) составляла 250%, а при плотности клеток 0.1 мг/мм2 и той же концентрации глюкозы этот показатель увеличивался до 1000%. Характерным для этих условий являлось также возрастание наклона калибровочной кривой, т.е. чувствительности биосенсора. При высоком содержании 02 в области значений плотности биомассы 0.1 мг/мм2 максимальный наклон калибровочной кривой составлял 142 нА/мМ по сравнению с 4.8 нА/мМ при нормальных условиях (рис. 12 а, б).

Гипероксигенация расширяла диапазон детекции за счет увеличения верхнего предела измерений. Как видно из рис. 12, при плотности биомассы 0.1 мг/мм2 и концентрациях глюкозы выше 0.5 мМ калибровочная зависимость практически достигала насыщения, которое исчезало при повышении содержания кислорода до 41 мг/л.

Ответ, нА

а) б)

Рис.! 2. Зависимости ответов сенсора от концентрации клеток в рецепторном элементе и субстрата, а) контрольные условия (концентрация кислорода равна 9.2 мг/л); б) при окси-генации среды измерения (концентрация кислорода равна 41.0 мг/л).

Результаты свидетельствуют о возможности направленного изменения характеристик биосенсора путем изменения концентрации растворенного кислорода. Гипероксигенация позволяет расширить диапазон детекции с помощью увеличения его верхнего предела, а также повысить чувствительность сенсора. Указанные эффекты наиболее выражены з области высоких концентраций субстрата и в случае, когда используется высокая концентрация иммобилизованной биомассы. Полученные результаты являются новыми, подобных исследований ранее не проводилось. Дальнейший анализ этого вопроса представляется важным для оптимизации режимов функционирования биосенсоров, основанных на различных культурах микроорганизмов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ситуации, сложиршейся к настоящему времени в области биосенсорных разработок, достаточно важными и обоснованными являются исследования типа "первичного скрининга", т.е. поисковые, основанные на широкой экспериментальной проверке эффективности различных подходов в создании новых типов биосенсоров. Результаты таких оценок позволяют в дальнейших исследованиях сузить поиск и остановиться на детальном изучении наиболее перспективных моделей. Для реализации указанного поискового направления исследований в диссертации были предложены новые идеи и экспериментально реализованы не использовавшиеся ранее подходы для создания широкого спектра моделей биосенсоров электрохимического типа. Из возможных типов преобразователей были выбраны электроды электрохимического типа - полупроводниковые по-тенциометрические - рН-чувствительный полевой транзистор и светоад-

ресуемый сенсор как одни из наиболее перспективных для создания биосенсоров; в качестве амперометрического использован электрод Кларка, зарекомендовавший себя как надежная основа микробных сенсоров. При использовании полупроводниковых преобразователей внимание было направлено на создание биосенсоров, содержащих принципиально новые элементы. При разработке биосенсоров на основе электрода Кларка и клеток микроорганизмов исследования были ориентированы на поиск новых решений, позволяющих повысить качество детекции и/или получить новые аналитические системы, потенциально полезные для экологического мониторинга, биотехнологии, медицины. Предложенный подход оказался плодотворным и позволил создать и исследовать параметры разнообразных моделей биосенсоров, имеющих высокую степень новизны и практической полезности.

Для группы биосенсоров на основе полупроводниковых преобразователей к принципиально новым результатам относятся: применение сменных биорецепторных элементов; применение пероксидазы хрена в качестве фермента-маркера в иммуносенсорах; использование аскорбиновой кислоты как косубстрата для получения высоких сигналов сенсора при детекции активности пероксидазы хрена; параметры унифицированной модели иммуносенсора для детекции гаптенов, белков, бактериальных клеток; созданная модель химического/биологического фоточувствительного сенсора на основе фотохромного красителя и фермента уреазы; новый метод оценки метаболизма бактериальных популяций, на основе которого возможно создание биоиндикаторных систем; разработанный комплекс регистрирующей аппаратуры, включающий измерительный усилитель и светоадресуемый потенциометрический сенсор.

К наиболее важным результатам, полученным при создании амперо-метрических биосенсоров следует отнести: теоретический анализ физио-лого-биохимических свойств бактерий рода Gluconobacter и экспериментально продемонстрированную возможность эффективного применения клеток для биосенсорной детекции глюкозы в сыворотке крови человека и ферментационных средах, оценки содержания глицерина в однокомпо-нентной ферментационной среде, детекции этанола; отбор наиболее активных культур рода Pseudomonas, преимущественно содержащих плаз-миды деградации соответствующих ксенобиотиков, для создания сенсоров для детекции ароматических соединений (нафталина, бифенила, хлорированных бензоатов, толуолсульфоната) и поверхностно-активных веществ; разработку модели медиаторного амперометрического биосенсора, содержащего бактерии Gluconobacter oxydans в качестве биокатализатора; применение элементов теории распознавания образов для повышения селективности биосенсорной детекции; разработку основ метода стабилизации параметров микробных биосенсоров путем гипероксигенации среды измерения с помощью полностью фторированных углеводородов. Дан-

ные, полученные при изучении характеристик микробных биосенсоров, существенно расширяют представления о свойствах ферментных систем микроорганизмов, что прежде всего находит отражение в портретах субстратной специфичности.

Полученные результаты вносят вклад в теоретические и экспериментальные основы биосенсорики, представляющей ветвь аналитической биотехнологии; они расширяют существующие представления о возможных схемах и принципах создания биосенсоров, их параметрах. Созданные модели обладают высокой чувствительностью, стабильностью, просты в изготовлении. Результаты имеют важное прикладное значение: многие из созданных лабораторных моделей после определенной степени доработки и модификации могут рассматриваться как прототипы биосенсорных анализаторов для передачи в промышленное производство с рекомендациями по использованию в биотехнологии, медицине, экологическом мониторинге.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны принципы измерения, созданы и исследованы параметры 12 новых моделей биосенсоров, в которых использованы микробные клетки, ферменты, антитела. 7 моделей на основе pH-чувствительных полевых транзисторов характеризуются новым методом формирования биорецепторной части, состоящим в применении сменных мембран, который значительно повышает экспрессность анализа, упрощает технику формирования биорецептора, снижает стоимость измерений. 5 моделей микробных сенсоров амперометрического типа предназначены для детекции Сахаров, спиртов, полиолов, ароматических углеводородов; характеризуются применением не исследованных ранее типов микроорганизмов как основы биосенсоров. Модели могут служить прототипами промыш-ленно выпускаемых анализаторов для использования в биотехнологии, медицине, экологическом мониторинге.

2. Впервые экспериментально обоснована возможность использования пероксидазы хрена как ферментной метки в иммунобиосенсорах на основе pH-чувствительных транзисторов. Предложенная субстратная композиция "о-фенилендиамин - аскорбиновая кислота" обеспечивает эффективную детекцию фермента в составе иммунных комплексов. Им-муносенсоры применили для детекции гербицида 2.4-дихлорфенокси-уксусной кислоты, иммуноглобулина G человека, определения концентрации бактериальных клеток Clostridium thermocellum. Результата расширяют области аналитического применения пероксидазы хрена как метки иммуноферментного анализа, pH-чувствительных полевых транзисторов - как основы биосенсоров и свидетельствуют о возможности использования предложенных моделей для анализа широкого спектра антигенов.

3. Сформулирован принцип и разработаны модели фоточувствительных биосенсоров на основе белка бактериального родопсина и аналога

фотохромного красителя спиробензопирана. Перспективность модели сенсора, содержащего бактериальный родопсин, связана с актуальностью разработок гибридных технических устройств, трансформирующих сигналы физической природы в электрические с помощью биоматериала. Сенсор, содержащий краситель и иммобилизованную уреазу, позволяет оценивать содержание мочевины, начиная с концентрации 10 цМ; его перспективность обусловлена высокой чувствительностью и возможностью направленного изменения функций путем изменения композиции биорецептора.

4. Дегидрогеназная активность бактерий рода Gluconobacter использована в биосенгорах потенциометрического и амперометрического типов. Экспериментальная оценка свойств 25 штаммов позволила выделить наиболее эффективные культуры, составившие основу высокочувствительных и стабильных биосенсоров для определения содержания глюкозы в образцах сыворотки крови человека, ферментационных средах; глицерина в ферментационной среде; ксилозы, этанола - в модельных средах. Полученная информация является новой и важна для рационального выбора при создании ферментного либо клеточного анализатора для решения конкретной аналитической задачи.

5. Показана принципиальная возможность осуществления режима электрокаталитического окисления субстратов бактериальными клетками Gluconobacter oxydans в присутствии медиатора электронного транспорта. Результаты развивают новое направление - создание медиаторных клеточных биоэлектродов, сочетающих преимущества медиаторных и клеточных биосенсоров.

6. Впервые бактерии родов Pseudomonas, Comamonas, несущие плазмиды деградации соответствующих ксенобиотиков, использованы в сенсорных анализаторах амперометрического типа для решения актуальной задачи - детекции поллютантов типа поверхностно-активных веществ, ароматических соединений - нафталина, бифенила, хлорированных бен-зоатов, толуолсульфоната. Продемонстрирована возможность направленного изменения селективности детекции нафталина путем элиминирования плазмиды его деградации. Созданные модели могут служить основой при разработке промышленных биосенсорных систем для детекции ксенобиотиков.

7. Разработан метод селективной оценки содержания этанола в смеси "этанол-глюкоза" путем измерения проб неселективным микробным биосенсором и ферментным глюкозоанализатором. Данный подход, в котором использованы элементы теории распознавания образцов, перспективен своей общностью в решении проблемы повышения селективности биосенсорной детекции.

8. Впервые предложена и экспериментально реализована идея управления параметрами микробных биосенсоров за счет дополнительной ок-

сигенации среды измерения; для указанной цели использован перфторде-калин - полностью фторированное органическое соединение. Гиперокси-генация приводит к увеличению чувствительности и расширяет диапазон детекции; данный эффект не был известен ранее и может быть использован в практических целях.

9. Создана новая методика изучения особенностей метаболических процессов в растущих и хемотактирующих колониях бактерий E.coli, использующая рН-чувствительные полевые транзисторы. Метод позволил оценить особенности метаболизма клеток в различных условиях хемотаксиса и роста и может быть полезен при создании биоиндикаторных систем для обнаружения высокоспецифических внешних воздействий.

10. Оригинальные технические решения реализованы при создании регистрирующего усилителя, производящего первичную обработку сигналов биосенсоров, и светоадресуемого потенциометрического сенсора, обеспечивающего высокоточное измерение сигналов иммобилизованных клеток микроорганизмов, ферментов. Созданные приборы являются базовыми для разработки новых моделей биосенсоров, в том числе многоканальных, и могут рассматриваться как прототипы промышленных биосенсорных анализаторов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1.Решетилов А.Н., Корнилов В.В. Перспективы использования биологического материала бактериального родопсина в микроэлектронике. -Межвузовский сб. "Вопросы кибернетики. Устройства и системы", Московский институт радиотехники, электроники и автоматики, Москва, 1987, с.120-128.

2.Решетилов А.Н., Абрамочкина Ф.Н., Литвинов Е.Г., Зайцев С.Ю., Зубов В.П. Генерация электрохимического потенциала мембранами, содержащими мономолекулярные пленки бактериального родопсина. -Журнал аналитической химии, 1990, т.45, вып.7, с.1410-1415.

3.Решетилов А.Н., Егоров A.M. Иммунохимическое тестирование на основе потенциометрических преобразователей. - Итоги науки и техники, ВИНИТИ, серия "Биотехнология", Москва, 1990, т.26, с.1-70.

4.Решетилов А.Н.. Оптические иммуносенсоры (использование эффектов полного внутреннего отражения и нефелометрических методов). -Итоги науки и техники, ВИНИТИ, серия "Биотехнология", Москва, 1990, т.26, с.71-80.

5.Решетилов А.Н., Волков В.Н., Елисеева Т.П., Попов В.В. Особенности использования полевых транзисторов в биологических сенсорах при помехе в виде внешней засветки. - Приборы и системы управления, 1991, N7, с. 35-36.

6.Решетилов А.Н., Донова М.В., Кощеенко К.А. Иммобилизованные на рН-чувствительном транзисторе клетки Gluconobacter oxydans как мо-

дель микробного биосенсора. - Прикл. биохимия и микробиология, 1992, т.28, N4, с.518-524.

7. Решетилов А.Н., Медвинский А.Б., Елисеева Т.Н., Шахбазян И.Ю. Цыганов М.А., Воронин A.M., Иваницкий Г.Р. Формирование рН-волны, вызванное расширением популяции бактерий в агаризованной питательной среде. - Доклады Академии наук, 1992, т.323, N 5, с.971-975.

8.Reshetilov A., Medvinsky A., Elyseyeva Т., Shakhbazian V., Tsyganov М., Boronin A., Ivanitsky G. pH-track of expanding bacterial population. -FEMS Microbiology Letters, 1992, v.94, p.59-62.

9.Kazanskaya N.F., Reshetilov A.N., Manenkova M.A., Eremeev N.L., Sigolaeva L.V. Light - and thermosensitive enzyme membranes as the components of analytical devices. - Abstracts of International Simposium on Biosensors, March 4-8, 1992, Moscow, p.31.

10. Reshetilov A.N., Khomutov S.M., Egorov A.M.. FET-Based Immunosensor for Human IgG Detection. - Abstracts of Iternational Simposium on Biosensors, March 4-8, 1992, Moscow, p.34.

11. Reshetilov A.N., Khomutov S.M. Electrochemical detection of horseradich peroxidase. - Abstracts of CIS-German Workshop Biosensors, Muenster, Germany. 1993, p.52.

12. А.Н.Решетилов, М.А.Маненкова, Н.Ф.Казанская, Н.Г.Рамбиди, Г.Р. Иваницкий. Фототестируемый химический сенсорный элемент на основе полевого транзистора. - Докл. РАН, 1993, т.328, N 5, р.637-640.

13. Решетилов А.Н. Биосенсоры на основе полевых транзисторов и светоадресуемых потенциометрических сенсоров. - Материалы конференции "Сенсорные системы и компоненты", июнь 22-23, 1993, Санкт-Петербург, с. 127.

14. Решетилов А.Н., Маненкова М.А.,Кухтин А.В., Елисеева Т.П., Казанская Н.Ф. Фототестируемый, чувствительный к ионам аммония химический сенсор. - Материалы конференции "Сенсорные системы и компоненты", июнь 22-23, 1993, Санкт-Петербург, с.296.

15. Решетилов А.Н., Соломин Н.С., Елисеева Т.П., Довбня Д.В., Донова М.В. Изучение характеристик светоадресуемого преобразователя, содержащего иммобилизованные клетки микроорганизмов. - Материалы конференции "Сенсорные системы и компоненты", июнь 22-23, 1993, Санкт-Петербург, с.297.

16. Хомутов С.М.,Образцова А .Я., Елисеева Т.П., Решетилов А.Н., Акименко В.К. Ферментный иммуносенсор на базе рН-чувствительного полевого транзистора. - Материалы конференции "Сенсорные системы и компоненты", июнь 22-23,1993, Санкт-Петербург, с.339.

17. Решетилов А.Н., Корнилова Н.М., Колоколов А.Б. Библиографическая база данных "Биосенсоры и биоэлектроника". - Журнал аналитической химии, 1994, т.49, N 5, с.538-539.

18. Khomutov S.M., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Reshetilov A.N. Immunodetection of herbicide 2,4-dichlorophenxyacetic acid by field-effect transistors- based biosensor. - Analytical letters, 1994, v.27, N 15, p.2983-2995.

19. Reshetilov A.N., Donova M.V., Dovbnya D.V., Boronin A.M.,Leathers T.D., Greene R.V. Characteristics of an FET and Gluconobacter oxydans based microbial electrode for xylose assay. - Abstracts of "Biosen-sors'94", 1994. The Third World Congress on Biosensors, New Orleans, USA.

20. Решетилов A.H., Казанская Н.Ф., Маненкова M.A., Кухтин А.В., Ярышева Л.М., Аржакова О.В., Волынский АЛ., Бакеев Н.Ф. Фоточувствительная ионселективная мемебрана - рецепторный элемент хемо - и биосенсора на основе полевого транзистора. - Докл. РАН, 1995, т.341, N 4, с.495-498.

21. Решетилов А.Н., Федосеева О.В., Елисеева Т.П., Сергеев Ю.В., Медянцева Э.П., Будников Г.К. Характеристики биохимического сенсора на основе иммобилизованной на полевом транзисторе холинэстеразы. -Журнал аналитической химии, 1995, т.50, N 4, с.453-456.

22. Хомутов С.М., Решетилов А.Н., Гаврилова Е.М., Егоров A.M. Изучение эффективности некоторых субстратов для рН-детекции перок-сидазной активности. - Журнал аналитической химии, 1995, т.50, N 6, с.659-662.

23. Решетилов А.Н., Кондратьева Е.Г., Ярополов А.И., РАН Ива-ницкий Г.Р. Регистрация ДрН-генерирующих биохимических реакций светоадресуемым сенсором с диэлектриком из Та205. - Доклады РАН, 1995, т.342, N 5, с.700-702.

24. Решетилов А.Н., Горохов A.JI., Елисеева Т.П. Полупроводниковый потенциометрический сенсор с ИК-подсветкой для биосенсорных, биохимических и химимческих исследований. - Приборы и техника эксперимента, 1995, N6, с. 179-180.

25. Решетилов А..Н., П.В.Ильясов, М.В.Донова, Д.В.Довбня, А.М.Боронин. Определение концентрации глюкозы в образцах сыворотки крови человека микробным биосенсором. - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1995, N 8, с.218-221.

26. Dovbnya D., Reshetilov A.N., Donova M.V.. Dehydrogenase Activity of Gluconobacter oxydans as a Base of Sensitivity of Microbial Sensors. -Proceedings of 7th International Summer School of Chemical Engineering. Varna, 19-25 September Bulgaria, 1995,p.307.

27. Reshetilov A.N., Khomutov S.M.,. Development of FET and LAPS-based biosensors. Advances in Biosensors. Eds. Turner A. and Yevdokimov Yu. JAI - Press LTD, London, England. P.R.Allen, Publishing Director. 1995, v.3, p.53-76.

28. Решетилов A..H., П.В.Ильясов, Л.В.Лахина, Е.В.Панкратова, Р.В.Першиков. Практическое применение микробного сенсора для экс-

пресс-оценки глюкозы в пробах сыворотки крови человека. - Клиническая и лабораторная диагностика, 1996, N 2, с.26-29.

29. Кондратьева Е.Г., Решетилов А.Н., Яковенко JI.B., Твердислов, Ярополов А.И.. Характеристики и применение электрохимического све-тоадресуемого сенсора на основе кремния с диэлектриком из Та205 для регистрации биохимических реакций. - Электрохимия, 1996, т.32, N 6, с.682-688.

30. Кравченко В.В., Медвинский А.Б., Решетилов А.Н., Лысоченко И.В., Иваницкий Г.Р. Динамика популяционных волн в гетерогенной системе "хищник-жертва": на примере взаимодействия волн, формируемых амебами Dictyostelium Discoideum и пространственно распределенной популяции иммобилизованных бактериальных клеток E.Coli. - Докл. РАН, 1996 ,т.347, N 5, с.689-692.

31. Решетилов А.Н., Ильясов П.В, Слепенькин А.В, Старовойтов И.И., Гречкина Г.М., Воронин A.M. Бактерии Pseudomonas как основа ре-цепторного элемента микробных сенсоров для детекции ароматических ксенобиотиков. -Докл. РАН, 1996, т.348, N 4, с.552-555.

32. Решетилов А.Н. Модели биосенсоров на основе потенциомет-рических и амперометрических преобразователей для использования в медицине, биотехнологии, мониторинге объектов окружающей среды. -Прикладная биохимия и микробиология, 1996, т.32, N 1, с.79-95.

33. Ильясов П.В., Емельянова Е.В., Ерошин В.К., Решетилов А.Н. Определение глюкозы в ферментационных средах с помощью микробного сенсора при культивировании грибов рода Мисог. - Прикладная биохимия и микробиология, 1996, f.32, N 1, с.96-101.

34. Решетилов А.Н. Биосенсорные экспресс-методы оценки вида и степени загрязнений объектов окружающей среды. - Сб."Проблемы экологически безопасных технологий производства, переработки и хранения сельскохозяйственой продукции" Вып.2. 1996, Сергиев Посад, с.66-76.

35. Морозова Н.О., Ильясов П.В., Ашин В.В., Решетилов А.Н. Изучение алкоголь-окисляющей активности культур G. o.xydans и Р. metanolica с целью их использования в биосенсорах для детекции этанола. - Сб. трудов городской научной конференции молодых ученых, 1996, Пу-щино, с.52-55.

36. Семенчук И.Н., Ильясов П.В., Таранова JI.A., Решетилов А.Н. Амперометрический микробный сенсор для детекции ДСН. - Сб. трудов городской научной конференции молодых ученых, 1996, Пущино, с.66-69.

37. Reshetilov A.N, Donova M.V., Dovbnya D.V., Boronin A.M., Leathers T.D. & Greene R.V. FET-microbial sensor for xylose detection based on Gluconobacter oxydans cells. - Biosensors&Bioelectronics, 1996, v.l 1, N 4, p.401-408.

38. Akimenko V.K., Khomutov S.M., Obraztsova A.Ya., Vishnivetskii, Chuvilskaya N.A., Laurinavichus K.S., Reshetilov A.N. A Rapid Method for

Detection of Clostridium thermocellum by field-effect transistor-based immunodetection. - J. Microbiological Methods,1996, v.24, p.203-209.

39. Kazanskaya N.F., Kukhtin A.V., Manenkova M.A., Reshetilov A.N. Yarisheva L.M., Arjakova O.V., Volinskii A.L., Bakeev N.F. FET-based sensor with robust photosensitive polymer membrane for detection of ammonium ions and urea. - Biosensors&Bioelectronics, 1996,. v.l 1, N 3, p.253-261.

40. Iliasov P.V., Starovoitov I.I., Reshetilov A.N. Pseudomonas-hzsti amperometric detection of chlorinated benzoates. - Proceedings of "Eurosensors X", 1996, Leuven, Belgium, v.3, p.913-916.

41. Morozova N.O., Iliasov P.V., Ashin V.V., Aleksandrova I.F., Reshetilov A.N. Comparative characteristics of Gluconolbacter oxydans B-1280 and Pichia pinus MN4 cells at biosensoric ethanol detection. - Proceedings of "Eurosensors X", 1996, Leuven, Belgium, v.2, p. 421-424.

42. Semenchuk I.N., Iliasov P.V., Taranova L.A., Reshetilov A.N. A model of microbial Pseudomonas rathonis based biosensor for surfactants detection. Second workshop on Biosensors and Biological Techniques. - Environmental Analysis, Sweden, 1996, p.24.

43. Dzantiev B.B., Zherdev A.V., Reshetilov A.N., Romanenko O.G.. Izumrudov V.A.. New immunoanalytical microsystems for controlling of pesticides content. -Abstracts of 3rd NEXUSPAN Workshop on Microsystems in Environmental Monitoring, December 13-14, 1996, Moscow, p.21-22.

44. Semenchuk I.N., Iliasov P.V., Taranova L.A., Reshetilov A.N. Models of microbial sensors for detection of xenobiotics.- Abstracts of 3rd NEXUSPAN Workshop on Microsystems in Environmental Monitoring, December 13-14, 1996, Moscow, p.62-63.

45. Решетилов A.H., Донова M.B., Хомутов C.M., Елисеева Т.П. Сенсоры на основе полевых транзисторов. - Ж. аналит. химии, 1997, т. 52, N 1, с.74-82.

46. Решетилов А.Н. Биосенсоры потенциометрического и амперо-метрическкого типов на основе микробных клеток и ферментов для использования в медицине, биотехнологии и экологическом контроле. -Сенсорные системы, 1997 , т.11, N 4, с.465-482.

47. Решетилов А.Н., Китанина Н.В., Мазанова A.A., Манолов Т.В. Поиск оптимальных методов иммобилизации клеток микроорганизмов в медиаторных биосенсорах. - Тезисы II съезда биохимического общества РАН, 19-23 мая, 1997, г.Москва, с.526.

48. Reshetilov A.N., P.V. Iliasov, A.E.Filonov, R.R.Gayazov, I.A.Kosheleva, A.M.Boronin. Pseudomonas putida as a receptor element of microbial sensor for naphthalene detection- - Process Biochemistry, 1997, v.32, N6, p.487-493.

49. Reshetilov A.N., Semenchuk I., Iliasov, P.V., Taranova, L.A. The amperometric biosensor for detection of sodium dodecyl sulfate. - Analytica ChimicaActa, 1997, v.347,N 1-2, p. 19-26.

50. Reshetilov.A.N., Iliasov P.V., Donova M.V., Dovbnya D. and Boronin A.M., Leathers T.D. and Greene R.V. Evaluation of a Gluconobacter oxydans Whole Cell Biosensor for Amperometric Detection of Xylose. - Biosensors and Bioelectronics, 1997, v.12, N 3, p. 241-247.

51. Reshetilov A.N., Iliasov P.V., Makarenko A.A. Biosensoric detection of xenobiotics. Fourth International Workshop "Biosensors and biosensing devices in medicine and environmental sciences,Tashkent, 1997, Uzbekistan, p.8.

52. Reshetilov A.N., Makarenko A.A., Balashov S.V., Iliasov P.V., Boronin A.M. The Comamonas testosteroni BSD 10 (pBSlOlO) cells based sensor for toluene sulfonate detection. - Proceedings of Eurosensors XI, September 21-24, 1997, Warsaw, Poland, v.3, p. 1457-1460.

53. Khomutov S.M.,Sidorov L.A. & Reshetilov A.N. FET based biosensor for estimation of effect of Ca2+ and Mg2+ on the immobilized butyrylcholin-esterase. - Proceedings of Eurosensors XI, September 21-24, 1997, Warsaw, Poland, v.3, p. 1441-1444.

54. Morozova N.O., Ashin V.V., Reshetilov A.N. Use of alcohol oxidase from methylotrophic yeast Pichia pirns MN4 amperometric determination of aliphatic alcohols. - Proceedings of Eurosensors XI, September 21-24, 1997, Warsaw, Poland, v.3, p.1225-1228.

55. Кондратьева Е.Г, Решетилов A.H , Ярополов А.И. Исследование с помощью светоадресуемого сенсора кинетических параметров глюкозооксидазы и а-химотрипсина, иммобилизованных в полимерные матрицы. - Прикладная биохимия и микробиология, 1997, т. 33, № 6, стр. 595-599.

56. Решетилов А.Н., Ефремов Д.А., Ильясов П.В., Кукушкин Н.И., Грин Р., Леазерс Т., Воронин A.M.. Эффекты высоких концентраций кислорода при измерениях микробным биосенсором. Гипероксигенация среды измерения с помощью перфтордекалина. - Докл. РАН, 1998, т.358, №6, с. 833-835.

57. Решетилов А.Н., Мазанова А.А., Китанина Н.В, Гортон Л., Воронин A.M. Электрокаталитическое окисление субстратов иммобилизованными клетками Gluconobacter oxydans в присутствии медиатора электронного переноса. - Докл. РАН, 1998, т. 358, № 2, с. 263-265.

58. Khomutov S.M., Sidorov L.A., Reshetilov A.N. FET based biosensor for estimation of effect of Ca2+ and Mg2+ on the immobilized butyrylcholin-esterase. - Sensors and Actuators, 1998, B. Chemical, Vol.48/1-3, pp.467-470.

59. Решетилов A.H., Донова M.B., Довбня Д.В., Ильясов П.В., Воронин A.M., Леазерс Т., Грин Р. Мембракосвязанные дегидрогеназы целых клеток Gluconobacter oxydans как основа сенсоров для определения Сахаров, спиртов, полиолов. - Бюллетень экспериментальной биохимии и медицины, 1998, №7, с.151-155.

60. Луста К.А., Решетилов А.Н.,. Физиолого-биохимические особенности Gluconobacter oxydans и перспективы использования в биотехнологии и биосенсорных системах. - Прикладная биохимия и микробиология, 1998, том 34, N 4, с. 339-353.

61. Решетилов А.Н., Лобанов А.В., Морозова И.О., Греен Р.В., Леа-зерс Т.Д. Применение элементов теории распознавания образов для определения содержания этанола в смеси при помощи микробного сенсора. Сенсорные системы, 1998, №4, с.280-287.

62. Reshetilov, A. N., Efremov, D. A., Iliasov P.V., Kukushkin N.I., Greene, R. V., Leathers, Т. D. & Boronin, A. M. Effects of High Oxygen Concentrations on Microbial Biosensor Signals. Hyperoxygenation by Means of Perfluorodecaline, Biosensors and Bioelectronics, 1998 , v.13/7-8, p.795-799.

63. Ильясов П.В., Шмалько T.A., Луста K.A., Королев П.Н., Решетилов А.Н. Сравнительная оценка свойств бактерий рода Gluconobacter для биосенсорной детекции органических субстратов. Прикладная биохимия и микробиология, 1998, т.34, №5, с.78-82.

64. Reshetilov, A. N., Lobanov, А. V., Morozova, N. О., Gordon, S. Н., Greene, R. V. and Leathers, Т. D. Detection of Ethanol in a Two-Component Glucose/Ethanol Mixture Using a Nonselective Microbial Sensor and a Glucose Enzyme Electrode, Biosensors and Bioelectronics, 1998, v.13/7-8, p.787-793.

Научное издание

Автореферат Решетилова А.Н.

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции ОК-005-93, том 2; 953000 - книги и брошюры.

Зак. 8119Р. Тир. 100 экз. Усл.печ.л. 2,75.

Отпечатано с оригинала-макета в Отделе научно-технической информации ИФПБ РАН. £.£ оЧ ЯЗ

142292, г.Пущино Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ ИФПБ РАН

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора химических наук, Решетилов, Анатолий Николаевич, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

им Г.К. Скрябина

РЕШЕТИЛОВ Анатолий Николаевич

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК, ФЕРМЕНТОВ,

АНТИТЕЛ

Специальность: биотехнология 03.00.23

1x9

Диссертация

на соискание ученой степфи доктора химических наук

.ЬМ'

Р"

„А

№

Москва 1998

Содержание

Стр.

Введение 6

Глава 1

1. Обзор литературы

1.1. Применение полупроводниковых преобразователей в

качестве основы биосенсоров .......................................15

1.2. Физиолого-биохимические особенности микроорганизмов рода Gluconobacter и перспективы их использования

в биотехнологии и биосенсорных системах..........................................82

2. Информационное обеспечение исследований...........................................115

3. Материалы и методы 118 Глава 2. Биосенсоры на основе pH-чувствительных полевых транзисторов и светоадресуемых потенциометрических сенсоров

2.1. Модель сенсора на основе бактериальных клеток

Gluconobacter oxydans.......................................................................................156

- Характеристика способов иммобилизации клеток..........................156

- Детекция глюкозы...........................................................................................159

- Детекция ксилозы............................................................................................169

2.2. Сенсор на основе бутирилхолинэстеразы.................................................190

2.3. Модели иммуносенсоров. Рецепторные элементы для детекции низкомолекулярных соединений, белков, клеток микроорганизмов..............................................................................................214

- Общая характеристика моделей................................................................215

- Оценка эффективности некоторых субстратов для

pH-детекции пероксидазной активности. Активирующее влияние аскорбиновой кислоты................................................................215

- Детекция 2.4-дихлорфеноксиуксусной кислоты...............................222

- Детекция иммуноглобулина G человека...............................................227

- Определение концентраций клеток Clostridium thermocellum 230

2.4. Фоточувствительные сенсоры.

- Использование протон-транспортирующих свойств бактериального родопсина для формирования фоточувствительного потенциометрического сенсора................................................................238

- Химический и ферментный сенсоры, содержащие фоточувствительную мембрану. Определение концентраций

ионов аммония и мочевины........................................................................253

2.5. Светоадресуемый потенциометрический сенсор (СПС). Регистрация биохимических реакций.......................................................268

- Принцип функционирования СПС...........................................................272

- Химическая чувствительность кремниевых сенсоров с диэлектриком из Ta2Os..................................................................................277

- Оценка кинетических параметров глюкозооксидазы и а-химотрипсина, иммобилизованных в полимерные матрицы................................................................................................................281

2.6. pH-волны, генерируемые популяцией растущих и хемотак-тирующих бактерий E.coli.............................................................................290

2.7. Разработка аппаратуры: регистрирующий усилитель с предобработкой сигналов.........................................................................................296

Глава 3. Амперометрические микробные сенсоры

3.1. Сравнительная оценка эффективности бактерий рода Gluconobacter. Амперометрические биосенсоры для

детекции легкоутилизируемых субстратов.............................................300

3.2. Мембраносвязанные дегидрогеназы целых клеток

Gluconobacter oxydans как основа сенсоров для определения Сахаров, спиртов, полиолов..........................................................................309

3.3. Сравнительная оценка алкогольокисляющей активности культур Gluconobacter oxydans и Pichia metanolica с целью

их использования в биосенсорах для детекции этанола...................328

3.4. Бактерии рода Pseudomonas как основа рецепторного элемента микробных сенсоров для детекции ксенобиотиков

и поверхностно-активных веществ............................................................331

- Детекция бифенила, хлорбензоатов 332

- Модель биосенсора для детекции нафталина 343

- Микробный сенсор для определения и-толуолсульфоната на основе клеток Comamonas testosteroni BS 1310

(pBSlOlO)............................................................................................................358

- Микробный сенсор для детекции анионных поверхностно-активных веществ............................................................................................365

3.5. Электрокаталитическое окисление субстратов иммобилизованными клетками Gluconobacter oxydans в присутствии медиатора электронного переноса..............................................................376

3.6. Повышение селективности детекции: определение концентрации этанола в двухкомпонентной смеси "глюкоза - этанол"

с использованием неселективного микробного сенсора и глюкозного ферментного электрода. Применение элементов теории распознавания образов.....................................................................382

- Чувствительность микробного сенсора к этанолу и

глюкозе.................................................................................................................385

- Двухкомпонентный анализ..........................................................................385

- Алгоритм оценки соотношения компонент........................................392

3.7. Эффекты высоких концентраций кислорода. Гипероксигена-

ция среды измерения с помощью перфтордекалина.........................396

Заключение......................................................................................................................403

Выводы...............................................................................................................................406

Список литературы..................................................................................................410

Список сокращений

АДГ - алкогольдегидрогеназа

АК, ДАК - аскорбиновая, дегидроаскорбиновая кислота

АлДГ - альдозодегидрогеназа

Ат/Аг - антитело/антиген

АТЭЭ - этиловый эфир ТЧ-ацетил-Ь-тирозин

БР - бактериальный родопсин

БСА - бычий сывороточный альбумин

БС - биосенсор

БТХИ - бутиритиохолин иодид

гдг - глюкозодегидрогеназа

год - глюкозооксидаза

ДГ - дегидрогеназы

дкгк - дикетоглюконовая кислота

ДОА - диоксиацетон

дсн - додецилсульфат натрия

ИмК - иммобилизованные клетки

ИФА - иммуноферментный анализ

кгк - кетоглюконовая кислота

кдг - ксилозодегидрогеназа

КРК - концентрация растворенного кислорода

ЛБ - Лэнгмюра-Блоджетт техника

мдг - метанолдегидрогеназа

МОП - металл-окисел-полупроводник

нк - нуклеиновые кислоты

ОФД - орто-фенилендиамин

пвк - поли-Ы-винилкапролактам

пвс - поливиниловый спирт

пт, испт - полевой транзистор, ион-селективный полевой транзистор

пх - пероксидаза хрена

ПФЦ - пентозофосфатный цикл

пэи - полиэтиленимин

с - спиропиран

СПС - светоадресуемый потенциометрический сенсор

хэ - холинэстераза

цпм - цитоплазматическая мембрана

цтк - цикл трикарбоновых кислот

этц - электронтранспортная цепь

Введение

Актуальность проблемы

Последнее десятилетие отмечено интенсивным изучением аналитических возможностей и применением биосенсорных систем. В этой связи перед аналитической химией поставлены задачи, связанные с разработкой простых, недорогих, высокочувствительных и специфичных методов и приборов на их основе для обнаружения заданных веществ в образце. Одновременное удовлетворение указанным требованиям достаточно проблематично. Вместе с тем в биосенсорах, совмещающих идеи и достижения современной биологии, электронных технологий, химических наук многие из перечисленных условий выполняются.

Основные достижения, а также анализ проблем, связанных с развитием этого направления за рубежом и в России, отражены в ряде обзоров [Соро-чинский, Курганов, 1997, 1998; Решетилов, 1997; Евдокимов, 1998; Riedel, 1994; Racek, 1995; Bergveld, 1986; Turner et al., 1987; Yevdokimov et al., 1995; Gorton, 1995].

Принцип детекции, реализованный в биосенсорах, основан на том, что биоматериал (ферменты, клетки, антитела и др.), иммобилизованный на физическом датчике (преобразователе), при взаимодействии с определяемым соединением генерирует зависимый от его концентрации сигнал, который регистрируется преобразователем электрохимического, оптического или иного типа и после обработки данных представляется в численном виде. Свойство биологических макромолекул селективно, с высокой чувствительностью "узнавать" различные соединения делает возможным создание биосенсоров для анализа широкого спектра веществ. Простота устройства, оперативность, специфичность и низкая стоимость биосенсорного анализа создают развитию этой области аналитической биотехнологии высокую степень приоритета.

Состояние вопроса

Ион-селективные полевые транзисторы (ПТ) относятся к полупровод-

никовым потенциометрическим преобразователям, широко используемым для создания биосенсоров; интерес к ПТ обусловлен рядом их достоинств: миниатюрностью, возможностью размещать на одном кристалле полупроводника несколько электродов, сопряженных со схемой обработки сигнала, низкой себестоимостью при массовом производстве. В настоящее время наиболее стабильные параметры имеют рН-чувствительные полевые транзисторы, избирательно реагирующие на присутствие протонов в среде. На основе таких приборов созданы биосенсоры, в рецепторной части которых находится биоматериал, катализирующий реакции, сопровождающиеся изменением рН. Новые перспективы в биосенсорике открываются в связи с появившимся сравнительно недавно светоадресуемым потенциометрическим сенсором, позволяющим создавать многоканальные анализаторы.

Несмотря на значительное количество публикаций, представляющих биосенсоры на основе ПТ, потенциал этого типа преобразователей к настоящему времени полностью не использован. Так, сравнительно мало изучены аналитические возможности биосенсоров, сочетающих ПТ и бактериальные клетки. В моделях иммуносенсоров, основанных на ПТ, как правило, используется только уреаза в качестве ферментной метки, что ограничивает представления о перспективах применения иных ферментов. Незначительно число работ, описывающих использование ПТ для регистрации зарядового состояния рецепторного элемента, хотя данный подход расширяет возможности биосенсорного анализа.

Большое внимание уделяется изучению свойств биосенсоров амперо-метрического типа, в которых в качестве преобразователя используется электрод Кларка. Типичным для биосенсоров этого типа является применение микроорганизмов в рецепторном элементе; уникальные особенности микробных клеток, обусловленные неповторяющейся композицией ферментных

систем у различных штаммов, позволили создать модели биосенсоров для детекции более 80 различных соединений.

Анализ упомянутых проблем и вопросов, направленный на создание и изучение свойств новых биосенсоров потенциометрического типа на основе ПТ, светоадресуемых сенсоров, амперометрических преобразователей служит продвижению в решении основных задач биосенсорики - созданию надежных, высокочувствительных и селективных методов и устройств биодетекции.

Цель работы

Исследования были ориентированы на теоретическое и экспериментальное развитие биосенсорной методологии и создание моделей биосенсорных анализаторов на основе электрохимических преобразователей - полевых транзисторов, светоадресуемых сенсоров и амперометрических электродов.

Достижение поставленной цели требовало решения ряда задач, основными из которых являлись

Для группы полупроводниковых биосенсоров:

* исследование параметров микробного (детекция глюкозы, ксилозы) и ферментного (детекция ингибиторов холинэстеразы) биосенсоров на

основе рН-чувствительного полевого транзистора;

* применение биосенсорной техники для изучения особенностей метаболизма растущих и хемотактирующих популяций бактерий Е.соИ.

Для группы амперометрическьос биосенсоров на основе электрода Кларка:

* разработка модели микробного медиаторного электрода с целью создания новых, более совершенных биосенсорных систем;

* повышение селективности биосенсорной детекции: применение элементов теории распознавания образов;

* использование принципа стабилизации параметров микробных биосенсоров путем дополнительной оксигенации среды измерения с помощью полностью фторированных углеводородов.

Научная новизна

Диссертация вносит вклад в развитие биосенсорной методологии и является комплексным исследованием, направленным на расширение аналитических возможностей потенциометрического и амперометрического типов

преобразователей при создании биосенсоров ферментного, иммунохимиче-ского и микробного типов. Впервые для группы биосенсоров, основанных на полевых транзисторах, выполнен детальный анализ эффективности использования сменного биорецепторого элемента для иммобилизации ферментов, бактериальных клеток и иммунокомпонент. Предложены две новые модели, содержащие фоточувствительные элементы на основе белка бактериального родопсина и аналога красителя спиробензопирана. Модели перспективны с точки зрения технологий будущего, сопрягающих процессы переноса/разделения зарядов в органических и биологических материалах с приборами твердотельной электроники; такие системы уже в ближайшее время могут найти неожиданное эффективное применение в качестве устройств ввода-вывода информации в биологических компьютерах.

Иммунобиосенсоры характеризуются новым, разработанным в диссертации подходом к формированию рецепторного элемента, позволяющим отказаться от традиционно используемого метода химической обработки поверхности ПТ для ковалентной иммобилизации иммунокомпонент. Впервые в практике биосенсоров на основе ПТ в качестве ферментной метки использована пероксидаза хрена (ПХ). Предложена новая композиция субстратов ПХ, обеспечивающая высокую эффективность ее электрохимической детекции, что показано на примере анализа пестицида 2,4-дихлорфенокси-уксусной кислоты, иммуноглобулина G (IgG) человека, термофильных микроорганизмов Clostridium thermocellum. Метод сменных мембран был эффективно применен при создании биосенсора, определяющего содержание пестицидов на основании их ингибирующего воздействия на фермент холинэ-стеразу.

Биосенсоры, основу которых составляют клетки микроорганизмов и ам-перометрические преобразователи характеризуются следующими элементами новизны:

- на основе теоретического анализа предсказана и экспериментально подтверждена эффективность использования бактерий рода Gluconobacter в биосенсорах для определения Сахаров, спиртов, полиолов. Показана их потенциальная практическая полезность для оценок концентрации глюкозы в сыворотке крови человека; глюкозы, ксилозы, глицерина в ферментационных средах, не включающих другие утилизируемые субстраты. В литературе не представлены аналоги биосенсоров, содержащих целые клетки Gluconobacter в биорецепторе амперометрического электрода для детекции указанных соединений.

- впервые использованы штаммы бактерий рода Pseudomonas в электрохимических биосенсорах для детекции ароматических соединений, представляющих серьезную опасность для экосистем - нафталина, бифенила, хлорароматических соединений, поверхностно-активных соединений (ПАВ);

- получены новые данные о возможности создания медиаторных ампе-рометрических электродов с использованием в качестве биокатализатора бактериальных клеток Gluconobacter oxydans. Результаты создают основу формирующегося в настоящее время нового направления - медиаторных клеточных электродов и открывают новые перспективы практического применения микробных биосенсоров;

- разработана концепция применения элементов теории распознавания образов и экспериментально реализован принцип повышения селективности детекции микробным биосенсором при анализе двухкомпонентной среды "глюкоза-этанол". Подход перспективен своей общностью в решении проблемы повышения селективности биосенсорной детекц

Информация о работе

Решетилов, Анатолий Николаевич
доктора химических наук
Москва, 1998
ВАК 03.00.23

Диссертация

Электрохимические биосенсоры на основе микробных клеток, ферментов и антител - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Электрохимические биосенсоры на основе микробных клеток, ферментов и антител ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Электрохимические биосенсоры на основе микробных клеток, ферментов и антител"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора химических наук, Решетилов, Анатолий Николаевич, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Электрохимические биосенсоры на основе микробных клеток, ферментов и антител
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология