Амперометрические микробные и ферментные биосенсоры для детекции углеводов, спиртов и нитроароматических соединений

Китова, Анна Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Амперометрические микробные и ферментные биосенсоры для детекции углеводов, спиртов и нитроароматических соединений
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Амперометрические микробные и ферментные биосенсоры для детекции углеводов, спиртов и нитроароматических соединений"

На правах рукописи

003462828

Китова Анна Евгеньевна

АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЕ МИКРОБНЫЕ И ФЕРМЕНТНЫЕ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ УГЛЕВОДОВ, СПИРТОВ И НИТРОАРОМАТИЧЕСКИХ

СОЕДИНЕНИЙ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.00.23 - биотехнология

Саратов - 2009 г.

003462828

Работа выполнена в лаборатории биосенсоров Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Решетилов Анатолий Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гоготов Иван Николаевич

доктор биологических наук, профессор Игнатов Олег Владимирович

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится "25" марта 2009 г. в 10 час на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат диссертации размещен на сайте http.V/www.ibppm.saratov.ru/obyav_dis.html

Автореферат разослан "/3 " февраля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук В.Е. Никитина

Актуальность проблемы. В последнее десятилетие показана высокая эффективность применения биосенсорного анализа для решения ряда практических задач. По статистическим данным основными областями наиболее успешного использования биосенсоров являются промышленная биотехнология, экология, пищевая промышленность, клиническая диагностика. По данным объема рынка продаж за последние 8 лет его рост составил 2.5 раза для биосенсоров, применяемых в промышленной биотехнологии, и 5 раз для биосенсоров, используемых для решения экологических проблем.

Аналитические задачи, характерные для биотехнологии, в определенной части совпадают с аналитическими задачами для пищевой промышленности и экологического мониторинга. Ввиду общности проблем анализа в различных областях в данной работе рассмотрены вопросы создания микробных и ферментных биосенсоров, которые могли бы быть эффективно использованы для мониторинга в пищевой промышленности, биотехнологии и экологии. При этом в единый блок задач объединены достаточно удаленные, на первый взгляд, тематики биосенсорной детекции соединений, относящихся к различным классам. В диссертации представлены исследования, рассматривающие детекцию нитроароматических соединений, углеводов и первичных спиртов. Работа направлена на создание и изучение параметров амперометрических биосенсоров.

Отметим актуальность и связанность задач детекции некоторых важных для пищевой промышленности и биотехнологии. В спиртопроизводстве для оптимального проведения технологического процесса необходимо иметь информацию о содержании крахмала в исходном сырье, содержании крахмала и Сахаров на стадиях разваривания и осахаривания крахмалосодержащего сырья, содержании Сахаров и спирта на стадии брожения и содержании спирта в отгоняемых водно-спиртовых парах, содержании крахмала, Сахаров и спирта в остаточной барде. Применение биосенсоров на основе ферментов и клеток микроорганизмов для оценки содержания указанных компонентов оптимизирует процесс производства и снижает за счет этого стоимость конечного продукта. Обнаружение суммарного содержания органических соединений, включая спирты и углеводы, требуется для экологического мониторинга (оценка присутствия углеводов в сточных водах, основанная на измерении индекса БПК (биологическое потребление кислорода); оценка содержания метилового спирта в объектах, принадлежащих регионам газодобычи). В настоящее время для указанной цели используются трудоемкие аналитические методы (например, оценка БПК5), которые не позволяют получать оперативную информацию о присутствии поллютантов в сточных водах.

взрывчатые вещества, красители, пестициды. 2,4-Динитрофенол (2,4-ДНФ) токсичен для живых организмов - его присутствие подавляет иммунную систему, вызывает нарушение процессов энергетического метаболизма клеток, вызывает мутагенное и канцерогенное действия. Нитрофенолы, в частности, 2-4-ДНФ, могут быть определены спектрофотометрически и хроматографически. Эти методы являются высокочувствительными, но в то же время дороги и трудоемки, в связи с чем актуальным является разработка биосенсорного подхода. Биосенсорная детекция токсичных нитроароматических соединений может быть использована для оценки состояния объектов окружающей среды на стадии экологического мониторинга, а также при использовании биотехнологических подходов ремедиации объектов окружающей среды.

Распространенным и надежным типом аналитических устройств являются биосенсоры, основанные на электрохимических преобразователях. В диссертации для разработок моделей биосенсоров использован преобразователь электрохимического типа - полярографический электрод, измеряющий содержание кислорода в среде, модификация которого известна как кислородный электрод Кларка.

Клетки микроорганизмов обеспечивают широкие возможности по созданию биосенсорных аналитических устройств. В настоящей работе для создания биорецепторов были использованы штаммы бактерий и дрожжей, окисляющие сахара и низшие спирты.

Бактерии рода Gluconobacter, обладающие такими особенностями, как широкий спектр окисляемых субстратов, неполное окисление и накопление продуктов в среде, энергетически малоэффективная организация дыхательной цепи, могут успешно использоваться для создания биосенсоров для контроля ферментационных процессов, а также для экологического мониторинга.

Метилотрофные дрожжи Pichia angusta характеризуются наличием высокоактивных алкогольоксидазы и алкогольдегидрогеназы, что позволяет их использовать в создании биосенсоров для детекции низших спиртов. Выбранный для исследования штамм Р. angusta ВКМ Y-2518 обладает высокой чувствительностью по отношению к этанолу и метанолу и практически не окисляет глюкозу (после индукции метанолом), что важно при анализе реальных образцов, содержащих смесь Сахаров и спиртов.

Использование в качестве рецепторного элемента клеток микроорганизмов, которые обладают специфическими ферментными системами деградации ксенобиотиков, является одним из наиболее распространенных подходов при создании биосенсорных анализаторов, предназначенных для экологического контроля. Бактерии Rhodococcus erythropolis HL РМ-1, способные использовать 2,4-ДНФ и пикриновую кислоту в качестве единственного источника азота и углерода, были выбраны для создания рецепторного элемента биосенсора реакторного типа для детекции нитроароматических соединений.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось создание амперометрических микробных и ферментных биосенсоров для детекции крахмала, низших спиртов, а также разработка микробного биосенсора реакторного типа для детекции нитроароматических соединений (2,4-ДНФ).

Задачи исследования:

1. Разработка моделей биосенсоров для определения крахмала.

2. Разработка моделей биосенсоров для определения низших спиртов.

3. Разработка модели биосенсора реакторного типа на основе иммобилизованных клеток бактериального штамма R. erythropolis HL РМ-1 для детекции 2,4-ДНФ.

Научная новизна.

1. Использован новый способ иммобилизации ферментов в слое ДЭАЭ-декстрана, ковалентно связанного с нитроцеллюлозной мембраной посредством бензохинона, позволяющий получить биорецепторы, обладающие высокой чувствительностью и стабильностью.

2. Исследована трансформация 2,4-ДНФ бактериями R. erythropolis HL РМ-1. Показано, что ферменты, участвующие в катаболизме 2,4-ДНФ, являются индуцибельными.

3. Создана модель микробного биосенсора реакторного типа для детекции 2,4-ДНФ и общего содержания нитроароматических соединений на основе бактериальных клеток R erythropolis HL РМ-1 и кислородного электрода.

Практическая значимость.

Предложена схема биосенсорного анализа крахмала с помощью микробного сенсора на основе бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industries BKM B-1280 и промышленно применяемой глюкоамилазы.

Созданные модели микробных и ферментных сенсоров для детекции крахмала, глюкозы, этанола и метанола могут использоваться на предприятиях пищевой промышленности (контроль ферментационного получения спирта), для определения содержания состава пищевых продуктов (крахмал, глюкоза), процесса культивирования метилотрофных дрожжей (детекция метанола).

Микробный сенсор на основе клеток R. erythropolis HL РМ-1 может быть использован на предприятиях химической промышленности, производящих пестициды, красители, взрывчатые вещества, где необходим быстрый и недорогой метод анализа содержания нитроароматических соединений в сточных водах.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Биосенсор на основе клеток штамма G. oxydans subsp. industries BKM B-1280 позволяет определять содержание крахмала в пробе при добавлении в измерительную кювету раствора глюкоамилазы. Биосенсор применим для анализа крахмала в реальных образцах.

2. На основе нового способа иммобилизации алкогольоксидазы в слое ДЭАЭ-декстрана на мембранах, активированных бензохиноном

возможно получение стабильных биорецепторов, применяемых для создания биосенсора для детекции этилового и метилового спиртов.

3. Биосенсор на основе штамма R. erythropolis HL РМ-1 и кислородного электрода позволяет определять общее содержание нитроароматических соединений в модельных образцах. Данный тип сенсора может быть использован либо самостоятельно, либо как элемент комплексной аналитической системы для детекции нитроароматических соединений.

Апробация работы. Работа была представлена на Всероссийской конференции "Сенсор 2000" (Санкт-Петербург, 2000 г.), Международной конференции "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000 г), XIV Зимней международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2002 г.), VII Школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003 г.), II Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003 г.), II Международной научной конференции "Ксенобиотики и живые системы" (Минск, 2003 г.), The Ninth World Congress on Biosensors (Toronto, 2006), Российской школе-конференции молодых ученых "Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы, технологии" (Пущино, 2006), XV Международной конференции по крахмалу (Москва, 2007 г), III Международной молодежной школы-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2007 г). Присуждена премия им. Г.К. Скрябина (2005 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 статей, в том числе 5 статей в рецензируемых журналах из списка ВАК, 10 тезисов, 1 патент на полезную модель.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего ]79 ссылок. Работа изложена на 111 страницах, содержит 40 рисунков и 17 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Формирование биорецепторов и условия измерений. В работе были использованы ферменты: глюкозооксидаза (ЕС 1.1.3.4, выделена из Aspergillus niger, активность - 265 ед/мг, ICN, США), промышленный препарат глюкоамилазы - Алкоголаза И 400 (выделена из Aspergillus niger активность -2700 Ед/мл, Alltech), алкогольоксидаза (выделена из Hansenula polymorpha NCYC 495 In, активность 14 ед/мг).

Глюкозооксидазу (ГОД) иммобилизовали на нитроцеллюлозной мембране Millipore (Sigma, США) кросс-сшивкой глутаровым альдегидом в соответствии с методикой, описанной ранее (Вудворд, 1988). Алкогольоксидазу (АО) иммобилизовали на нитроцеллюлозной мембране Synpor (Чехия) двумя способами: 1) на мембране, активированной бензохиноном и 2) в слое ДЭАЭ-декстрана, ковалентно связанного с нитроцеллюлозной мембраной, активированной бензохиноном. Указанные способы иммобилизации также использовали для совместной иммобилизации ГОД и глюкоамилазы (ГА).

Глюкоамилазу предварительно диализовали. Диализ проводили против натрий-фосфатного буфера (30 мМ, рН 5.8) в течение 24 ч в стакане объемом 1 л с трехкратной сменой буфера при перемешивании. Диализованный фермент лиофилизировали. Полученный фермент использовали в экспериментах.

Для создания микробных биосенсоров были использованы: бактериальный штамм G. oxydans subsp. industries ВКМ В-1280, штамм метилотрофных дрожжей P. angusta ВКМ Y-2518 (получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН), бактериальный штамм R. erythropolis HL РМ-1 (получен из Штугстартского Института микробиологии, Германия). Штамм G. oxydans subsp. industries ВКМ В-1280 выращивали на среде, содержащей сорбит (20%), дрожжевой экстракт (2%), дистиллированную воду. Штамм R. erythropolis HL РМ-1 поддерживали на минеральной агаризованной среде следующего состава (г/л): Na2HP04-12H20 - 10.860, КН2Р04 - 1.800, СаС12-2Н20 - 0.010, FeCl3 - 0.002, MgS04-7H20 - 0.020, 2,4-ДНФ - 0.092, янтарная кислота -2.360, агар - 1.5 %, (рН 7.0) (Lenke, Knackmuss, 1992). Для получения биомассы использовали жидкую питательную среду (г/л): аминопептид из гидролизата крови животных - 60.0, триптон - 50.0, экстракт кормовых дрожжей - 10.0, экстракт сои - 30.0. Штамм P. angusta ВКМ Y-2518 выращивали на жидкой среде следующего состава (г/л): (NH4)2S04 - 2.5; MgS04 - 0.2; К2НР04 - 0.7; NaH2P04 - 3.0; дрожжевой экстракт - 0.5; 100 мкл раствора витаминов на 100 мл среды (тиамин и биотин - 5 мг в 10 мл метанола); 1 мл раствора микроэлементов на 100 мл среды (СаСЬх2Н20 - 0.11; FeS04x7H20 -0.017; ZnS04*6H20 - 0.009; MnS04*5H20 - 0.00023; CuS04x5H20 - 0.0045); глицерин (1%, об/об). Затем, пересевали на среду того же состава, но в качестве источника углерода использовали метанол (1%, об/об). Клетки выращивали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл ростовой среды при перемешивании на качалке (200 об/мин, 28 °С), затем отделяли

центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин и дважды отмывали буферным раствором.

При формировании микробных биосенсоров мембранного типа Г иммобилизацию клеток осуществляли их физической сорбцией на фильтрах из стекловолокна (тип GF/A, Whatman). Для этого 5 мкл клеточной суспензии, содержащей биомассу в концентрации 100 мг сырого веса/мл, наносили на I фильтр и подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин.

Биорецептор (иммобилизованные на мембранах ферменты или клетки) I размером 3x3 мм2 фиксировали на измерительной поверхности кислородного электрода типа Кларка (ООО «Кронас», Россия). Среднее значение тока | электродов при 20° С составляла в дистиллированной воде, насыщенной воздухом (9.17 мг/л 02), величину 90 нА. Время ответа электрода на полное , удаление кислорода из кюветы 2% сульфитом натрия не превышало 10 с; ток в бескислородной среде не превышал 2 - 5% от величины тока в дистиллированной < воде, насыщенной воздухом. Скорость перемешивания растворов магнитной мешалкой составляла 400 об/мин. Измерения проводили в открытой кювете с помощью гальваностата-потенциостата 1РС2Ь (ООО «Кронас», Россия) I интегрированного с персональным компьютером. Регистрируемым параметром ; являлась максимальная скорость изменения сигнала (нА/с).

Для формирования биосенсора реакторного типа на основе клеток /?. [ егуЛгороИз иммобилизованные клетки помещали в колонку диаметром 1.6 см и высотой заполнения 3 см. Рабочий объем биореактора составлял 3 мл. Клетки 1 иммобилизовали включением в агаровый и кальций-альгинатный гели (Вудворд, 1988), сорбцией на порошковой целлюлозе и керамическом носителе (Аринбасарова, 1985). В качестве преобразователя был использован кислородный электрод Кларка, подключенный к выходу колонки. Измерение уровня кислорода на выходе давало возможность регистрировать интенсивность процесса деградации. Измерение было основано на пропорциональной I зависимости между концентрацией 2,4-ДНФ на входе реактора и степенью | снижения концентрации кислорода на выходе. Регистрируемым параметром являлась максимальная скорость изменения сигнала (пА/с). Для регистрации сигнала сенсора была использована система "1гщоМ" (США).

Проба

Перистальтический насос

Гальванопотен-циоатат IPC21, компьютер

Колонка с иммобилизованными клетками R. eiythropolis

Электрод Кларка

Сток

Рис. 1. Схема биосенсора реакторного типа.

Определение содержания крахмала. Для определения содержания крахмала в измерительную кювету сенсора на основе ГОД или клеток в. охус!ат вводили анализируемую пробу (крахмал или крахмалосодержащие образцы) и раствор ГА. Глюкоза, образующаяся в результате гидролиза крахмала, окислялась микробными клетками, что приводило к уменьшению тока кислородного электрода. Содержание крахмала в муке также определяли поляриметрическим методом (метод Эверса) по стандартной методике (Рухлядева, Полыгалина, 1981). Схема биосенсора приведена на рис. 2.

Электрод

Биорецептор

Буфер,

глюкоамилаза

Магнитная мешалка

Рис. 2. Схема биосенсора мембранного типа.

Трансформация 2,4-ДНФ клетками R. erythropolis HL РМ-1.

Трансформацию 2,4-ДНФ свободными и иммобилизованными клетками R. erythropolis осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл буфера. В реакционную среду вносили 2,4-ДНФ в виде водного раствора. Начальные концентрации 2,4-ДНФ варьировали от 25 до 1000 мкМ. Для построения зависимости скорости деградации от концентрации 2,4-ДНФ рассчитывали значения скорости по максимальному наклону касательной к квазилинейному участку кинетических кривых. Скорость деградации выражали в единицах удельной активности, нмоль 2,4-ДНФ/мин/мг клеток.

Для изучения индуцибельности ферментов деградации 2,4-ДНФ в реакционную среду добавляли 2,4-ДНФ и левомицетин (Методы общей бактериологии, 1984). Процесс деградации 2,4-ДНФ в непрерывных условиях осуществляли иммобилизованными клетками в колонке (реактор идеального вытеснения) диаметром 1.6 см и высотой заполнения 3 см. Степень трансформации субстрата (в процентах от исходного) и производительность (нмоль 2,4-ДНФ/мин/мг клеток) оценивали, измеряя концентрацию 2,4-ДНФ в элюате. 2,4-ДНФ определяли спектрофотометрически по величине оптической плотности (D362) (Сингирцев с соавт., 1994) и методом ВЭЖХ (Lenke et al, 1992 (а)). Концентрацию нитрита определяли спектрофотометрически (Новиков с соавт, 1990).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Биосенсорный подход к анализу крахмала.

Биосенсорный анализ крахмала основан, как правило, на следующих реакциях:

крахмал —> мальтоза + декстрины ГА

мальтоза + декстрины-> /? - D - глюкоза

Гу-J гт

Р — D — глюкоза + 02-Н-ftl + ¿люконовая кислота

Как правило, крахмал полностью гидролизуют до глюкозы а-амилазой и глюкоамилазой (ГА) (Hamid et al., 1990). Renneberg с соавт. (1983) показали возможность анализа крахмала без предварительного гидролиза, но с использованием а-амилазы для проведения частичного гидролиза крахмала до мальтозы и декстринов, которые анализировали с помощью сенсора на основе совместно иммобилизованных ГОД и ГА.

Нами была исследована возможность анализа крахмала с использованием одного амилолитического фермента - глюкоамилазы и ГОД-сенсора, а также при совместной иммобилизации ГОД и ГА.

При сохранении известного последовательности "гидролиз крахмала амилазой, детекция глюкозы" были введены новые элементы анализа: 1) в качестве рецепторного элемента, помимо ГОД, были использованы клетки бактерий G. oxydans, содержащие высокоактивную альдозодегидрогеназу и обладающие высокой чувствительностью по отношению к глюкозе; 2) был использован промышленный ферментный препарат глюкоамилазы Алкоголаза II 400, которая, представляет собой фермент, выделенный из Aspergillus nigex, катализирует расщепление крахмала до глюкозы; 3) был применен новый способ иммобилизации ГОД и ГА в слое ДЭАЭ-декстрана ковалентно связанного с нитроцеллюлозгюй мембраной с помощью бензохинона.

1.1. Биферментный биосенсор для детекции крахмала.

Исследована возможность анализа крахмала в модельных образцах с помощью биосенсора на основе совместно иммобилизованных ГОД и ГА. ГОД и ГА иммобилизовали тремя способами: 1) на нитроцеллюлозной мембране, активированной бензохиноном; 2) в слое ДЭАЭ-декстрана ковалентно связанного с нитроцеллюлозной мембраной посредством бензохинона; 3) с использованием глутарового альдегида (референтный метод).

Параметры калибровочных зависимостей для крахмала при использовании трех способов иммобилизации ГОД и ГА приведены в Таблице 1. Линейный диапазон калибровочных зависимостей биосенсоров был одинаковым и составлял 0.05 - 1.00 г/л. Наибольшая чувствительность была получена при иммобилизации ГОД и ГА с использованием глутарового альдегида. Наибольшей стабильностью при хранении обладал биорецептор на основе мембраны, активированной бензохиноном и ДЭАЭ-декстраном.

Таблица 1. Параметры калибровочных зависимостей для крахмала при использовании трех способов совместной иммобилизации ГОД и ГА._

Метод иммобилизации Линейный диапазон детекции, г/л Чувствительное ть, (нА/с)/(г/л) Стабильность при хранении в буфере

Иммобилизация на мембране, активированной бензохиноном 0.05-1.00 0.87 9 сут (50% остаточной активности)

Иммобилизация в слое ДЭАЭ-декстрана 0.05-1.00 0.78 3 мес (67%)

Кросс-сшивка глутаровым альдегидом 0.05-1.00 1.10 3 мес (42%)

В качестве оптимального метода была выбрана иммобилизация в слое ДЭАЭ-декстрана. Метод обеспечивает мягкие условия иммобилизации, позволяет поддерживать конформацшо фермента в устойчивом для анализа состоянии, а также сохраняет стабильность биорецептора в течение длительного времени.

Недостатком модели биосенсора на основе совместно иммобилизованных ГОД и ГА является наличие ответа на глюкозу, которая может присутствовать в реальных образцах. Для анализа проб, содержащих одновременно глюкозу и крахмал, возможно использование дополнительного ГОД сенсора (Hamid et al., 1990) или дополнительной защитной мембраны на основе ГОД и каталазы, разрушающей эндогенную глюкозу в пробе (Renneberg et al., 1983). Схема анализа, использующая дополнительную защитную мембрану, не позволяет определять уровень глюкозы, изначально присутствующей в пробе. Двухэлектродная схема также усложняет процедуру анализа. В этой связи, наиболее простым вариантом анализа является использование глюкозного биосенсора на основе клеток G. oxydans и глюкоамилазы в виде раствора. Микробный биосенсор в данной схеме позволяет одновременно регистрировать уровень глюкозы в крахмалсодержащей пробе и скорость расщепления крахмала амилазой в измерительной кювете.

1.2. Биосенсор на основе штамма G. oxydans и раствора глюкоамилазы для

детекции крахмала.

Схема анализа крахмала на основе микробного биосенсора и ГА в виде раствора, была применена для анализа проб, содержащих одновременно глюкозу и крахмал. Первоначально в кювету вносили пробу, регистрировали ответ на глюкозу, затем вносили раствор ГА и регистрировали ответ на крахмал.

Калибровочная зависимость микробного сенсора приведена на рис. 3. Диапазон детекции крахмала составил 0.03 - 0.50 г/л. Период измерения одной

пробы (время ответа сенсора и время восстановления сигнала) составлял 10-15 мин.

Крахмал, г/л

Рис. 3. Калибровочная зависимость микробного биосенсора для детекции

крахмала.

Микробный сенсор применили для определения содержания крахмала в пшеничной и ржаной муке. В качестве референтного метода использовали метод Эверса (ГОСТ 10845 - 98) (табл. 2).

Таблица 2. Содержание крахмала в муке, определенное микробным сенсором и поляриметрическим методом (метод Эверса)._

Объект исследования Содержание крахмала, %

Поляриметрический анализ Биосенсорный анализ

Пшеничная мука 70.2 ±0.6 69 ± 1

Ржаная мука 56.3 ±0.6 55 ± 1

Уровень значимости сходства результатов, полученный с помощью критерия Фишера, составил не менее 95%.

Таким образом, предложены две схемы анализа крахмала для образцов содержащих и не содержащих глюкозу. Для проб крахмала, не содержащих глюкозу, разработан биферментный сенсор на основе совместно иммобилизованных ГОД и ГА. Был использован новый способ иммобилизации ферментов в слое ДЭАЭ-декстрана ковалентно связанного с нитроцеллюлозной мембраной посредством бензохинона, обеспечивающий более высокую стабильность биорецепторов при хранении по сравнению с другими исследованными методами. Для анализа проб, содержащих глюкозу, предложена простая схема анализа на основе микробного сенсора и ГА в виде раствора, которая позволяет одновременно регистрировать уровень глюкозы, изначально присутствующей в пробе и скорость расщепления крахмала амилазой.

2. Модели биосеисоров для детекции низших спиртов.

2.1. Биосенсор на основе апкогольоксидазы.

Важным этапом при разработке биосенсора является стадия закрепления фермента, поскольку чувствительность и воспроизводимость показаний биосенсора существенно зависят от способа иммобилизации биоматериала. Несмотря на большое количество исследований, посвященных иммобилизации АО, еще не выбраны условия формирования рецепторного элемента амперометрических биосенсоров, сочетающие высокую активность биорецептора и его стабильность. Поэтому актуальной задачей является поиск способа иммобилизации биоматериала обеспечивающего высокую стабильность и чувствительность рецепторных элементов.

Нами были разработаны способы иммобилизации ферментов и исследованы параметры биосенсора на основе АО. АО иммобилизовали двумя способами: на нитроцеллюлозных мембранах, активированных бензохиноном и в слое ДЭАЭ-декстрана, ковалентно связанного с нитроцеллюлозной мембраной посредством бензохинона (табл. 3).

Таблица 3. Аналитические параметры биосенсоров на основе АО, иммобилизованной на мембранах, активированных бензохиноном, и в слое ДЭАЭ-декстрана. _

Параметры биосенсоров Способы иммобилизации

Иммобилизация на мембране активированной бензохиноном Иммобилизация в слое ДЭАЭ-декстрана

Субстрат

Метанол Этанол Метанол Этанол

Диапазон детекции, мМ 0.015-1.00 0.03 - 5.00 0.015-1.00 0.03-1.00

Чувствительность, (нА/с)/мМ 6.80±0.60 1.64±0.03 12.40±0.10 5.00±0.15

Операционная стабильность 6 сут при падении активности на 43% 9 сут без потери активности

Снижение чувствительно сти при хранении в течение 5 мес в 5 раз в 17 раз в 2 раза в 1.5 раза

Время ответа, с 60

Период измерения, мин 5

Коэффициент вариации, % 5-6

Из данных представленных в Таблице 3 можно видеть, что чувствительность к метанолу биорецепторов на основе АО, иммобилизованной в слое ДЭАЭ-декстрана, в два раза превышала чувствительность биорецептров на основе АО, иммобилизованной на мембране, активированной бензохиноном. Более высокой стабильностью обладали биорецепторы на основе АО, иммобилизованной с использованием ДЭАЭ-декстрана. Иммобилизация АО с использованием ДЭАЭ-декстрана позволяла хранить биорецепторы в высушенном состоянии: в течение 4 мес, чувствительность биорецептора к метанолу снижалась в 3 раза.

Субстратная специфичность АО, иммобилизованной в слое ДЭАЭ-декстрана, представлена в Таблице. 4.

Таблица 4. Субстратная специфичность АО сенсора и сенсора на основе клеток Р. ап^Ша.__

Субстрат Ответ сенсора, %

Алкогольоксидаза Р. ап%ша

метанол 100 100

этанол 64.5 43.9

пропанол 32 13.3

бутанол 2.3 12.2

изопропанол 0 8.2

изобутанол 0 8.2

изоамиловый спирт 0 8.7

бензиловый 0 5.1

глицерин 0 1.6

2,3-бутандиол 0 0

4-метилгексанол 0 0

метилциклогексанол 0 0

метиламиноэтанол 0 0

трифторэтанол 0 0

трихлорэтанол 0 0

метоксибензиловый спирт 0 0

Ответ сенсора к метанолу был принят за 100 %; ответ сенсора на этанол при этом составлял 64%, величина сигнала сенсора к пропанолу составила 32%, незначительная чувствительность была отмечена по отношению к бутанолу.

Были исследованы параметры микробного сенсора на основе штамма Р. ап%т1а ВКМ У-2518. В Таблице 5 приведены параметры ферментного и микробного биосенсоров.

Таблица 5. Параметры биосенсоров на основе АО, иммобилизованной в слое ДЭАЭ-декстрана и клеток Р. ап%ш1а__

Параметры биосенсора АО Р. augusta

Метанол Этанол Метанол Этанол

Чувствительность, (нА/с)/мМ 12.40 5.87 2.62 0.53

Диапазон детекции, мМ 0.015-1.00 0.03-1.00 0.05-2.50 0.05-5.00

Стабильность при хранении 4 мес при снижении чувствительности в 2 раза 7 мес при снижении чувствительности на 40%

Субстратная специфичность микробного сенсора на основе штамма Р. angusta представлена в Таблице 4. Относительная чувствительность сенсора к метанолу была принята за 100%, ответ сенсора на этанол составил, соответственно, 44%. Сенсор характеризовался незначительной чувствительностью к пропанолу, бутанолу, изопропанолу, изобутанолу, изоамиловому спирту и бензиловому спирту, ответ на глюкозу отсутствовал.

Таким образом, субстратная специфичность микробного сенсора на основе клеток Р. нечувствительного к глюкозе, сопоставима с

субстратной специфичности АО бйосенсора. Диапазоны детекции метанола и этанола микробного сенсора близки соответствующим диапазонам детекции ферментного сенсора. Чувствительность микробного сенсора несколько ниже чувствительности АО биосенсора и время ответа в два раза превышает время ответа ферментного сенсора, что относится к недостаткам микробного сенсора. Тем не менее, существенным преимуществом микробных сенсоров является их низкая по сравнению с ферментными сенсорами стоимость.

2.3. Применение алкоголъоксидазного и микробного биосенсоров для детекции спиртов в реальных образцах

Для осуществления мониторинга ферментационных процессов необходимо быстрое и точное определение концентраций субстратов и продуктов процесса культивирования. Одним из таких процессов является культивирование штаммов метилотрофных дрожжей. Применение биосенсоров на основе АО и клеток метилотрофных дрожжей для мониторинга процессов культивирования, где контролируемым соединением является метанол, ранее не было описано.

Нами были использованы биосенсоры на основе АО и штамма Р. ап%и$1а для контроля содержания метанола в ферментационной среде. Анализировали содержание метанола в ферментационной среде в процессе культивирования

дрожжей Р. ап^(а. Метанол являлся индуктором синтеза рекомбинантного белка (урокиназы), не потреблялся клетками в процессе роста, но снижение концентрации метанола происходило за счет его испарения. В качестве источника углерода использовали глицерин (2%). Метанол (1%) вносили в ферментационную среду после утилизации клетками глицерина, на 23 ч культивирования. Далее, каждые 24 ч доводили концентрацию метанола в ферментере до 1%. Первую пробу отбирали сразу после внесения метанола в среду. Далее пробы отбирали перед очередным добавлением метанола через 24 ч (табл. 6).

Таблица 6. Содержание метанола в культуральной среде, определенное ферментным и микробным биосенсорами.

№ пробы Содержание метанола, %об

АО Р. ап%и$1а

0 0.96±0.014 1.00±0.058

24 0.60±0.001 0.65±0.010

48 0.65±0.035 0.64±0.030

72 0.65±0.015 0.69±0.043

Вышеописанный подход показал, что биосенсоры на основе АО и клеток метилотрофных дрожжей могут быть применены для контроля содержания метанола в процессе культивирования. Высокая корреляция (0.98) данных полученных ферментным биосенсором и микробным позволяет сделать вывод о том, что микробный биосенсор может заменить ферментный.

Сенсоры были использованы для регистрации этилового спирта в образцах спирта-ректификата. Образцы были получены из ГНУ ВНИИ Пищевой биотехнологии РАСХН (Отдел технологии спирта и комплексной переработки сырья), с которым проводились совместные исследования по экспресс-анализу спирта в процессе его производства. В Таблице 7 приведены результаты анализа содержания этанола в образцах, содержащих этиловый спирт в высокой концентрации (>60%).

Таблица 7. Содержание этанола в реальных образцах, определенное биосенсором на основе АО и методом газовой хроматографии.

№ образца Содержание спирта, %

АО Газовая хроматография

1 78.6±4.1 71

2 68.6±2.2 68

"Ч Э 60.9±5.2 62

Коэффициент корреляции данных биосенсорного анализа и данных газовой хроматографии составил 0.96, что позволяет сделать вывод о достаточно высокой точности биосенсорных измерений.

Измерение концентрации этанола играет важную роль в определении качества алкогольных напитков. В Таблице 8 приведены результаты определения содержания спирта в спиртных напитках.

Таблица 8. Определение содержания спирта в спиртных напитках биосенсором на основе АО.

Образец Содержание этанола, % (АО биосенсор) Содержание этанола, указанное производителем, %

Вино Carranc, красное сухое, Испания 12.1 ±0.3 12.0

Вино Vilamor, розовое столовое, сухое, Португалия 11.2±0.22 11.0

Вино San Marco, mission Cabernet sauviginon, полусухое, Чили 13.2+0.16 12.5

Водка Империал, Россия 40.7±1.62 40.0

Таким образом, на основе АО, иммобилизованной на мембране, активированной бензохиноном и ДЭАЭ-декстарном, создан биосенсор, обладающий высокой стабильностью и чувствительностью, позволяющий с высокой точностью проводить анализ этилового и метилового спиртов в реальных образцах.

3. Биосенсор реакторного типа для определения 2,4-динитрофенола.

3.1. Трансформация 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками R. erythropolis в периодических условиях.

Ранее для родственных штаммов Rhodococciis erythropolis HL 24-1 и HL 24-2 была показана способность использовать при росте в качестве единственного источника азота 2,4-ДНФ и изучена его трансформация в неростовых условиях при концентрации 500 мкМ (Lenke et al., 1992). Для штамма R. erythropolis HL РМ-1 (мутанта штамма R. erythropolis HL 24-2) была изучена деградация пикриновой кислоты при концентрации 500 мкМ и исследованы продукты ее трансформации. Было показано, что деградация 2,4-ДНФ начинается с нуклеофильной атаки ароматического кольца (Lenke, Knackmuss, 1992, 1996, Lenke et al., 1992). Начальные реакции восстановления были также исследованы для штамма Nocardioides simplex FJ2-1A, для которого показано наличие двухкомпонентной ферментной системы, катализирующей реакции аэробного гидрирования нитроароматического кольца, состоящей из NADPH-зависимой F420 редуктазы и гидрид трансферазы (Ebert et al., 1999). Для

исследуемого штамма Я. егу^юроИх НЬ РМ-1 ранее не была доказана индуцибельность ферментов деградации 2,4-ДНФ, не был показан характер зависимости скорости деградации 2,4-ДНФ от концентрации субстрата, что необходимо учитывать при создании биосенсора на основе микробных клеток.

Целью данного раздела являлось изучение особенностей деградации 2,4-ДНФ свободными и включенными в агаровый гель клетками Я. е/у1ИгороИч НЬ РМ-1 в периодических условиях, что является необходимым условием дальнейшего изучения деградации 2,4-ДНФ иммобилизованными клетками в биореакгоре колоночного типа.

Для выяснения эффекта индуцибельности ферментов была изучена деградация 2,4-ДНФ с добавлением ингибитора синтеза белка - левомицетина. Деградация 2,4-ДНФ в отсутствие левомицетина (рис. 5, кривые 1 и 2) проходила полностью. При этом, в случае деградации предварительно инкубированными с 2,4-ДНФ клетками (рис. 5, кривая 1) начальный лаг-период практически отсутствовал, в то время как, процессу деградации неинкубированными клетками (рис. 5, кривая 2) предшествовал лаг-период длительностью около 2 ч. При добавлении в трансформационную среду левомицетина (рис. 5, кривые, 3 и 4) неинкубированные с 2,4-ДНФ клетки практически не разрушали субстрат (рис. 5, кривая 4). Предварительно инкубированные с 2,4-ДНФ клетки в присутствии левомицетина (рис. 5, график 3) разрушали 2,4-ДНФ на 70%. Эти данные свидетельствуют о том, что, определенные ферменты пути деградации 2,4-ДНФ индуцибельны,

Время, ч

Рис. 5. Деградация 2,4-ДНФ свободными клетками без добавления левомицетина (1, 2) и в присутствии (5, 4) левомицетина, предварительно инкубированными (/, 3) и не инкубированными (2, 4) с 2,4-ДНФ. (Коэффициент вариации не превышал 12%, п=3).

Была изучена динамика деградации 2,4-ДНФ при его начальных концентраций в среде от 25 до 1 ООО мкМ. Кинетические кривые убыли 2,4-ДНФ

представлены на рис. 6, кривые / - 3. Для всех изученных концентраций субстрата отмечалась его полная утилизация. На начальных стадиях процесса, начиная с концентрации 150 мкМ, наблюдался лаг-период, величина которого возрастала с 0.5 до 5 ч при увеличении концентрации 2,4-ДНФ от 150 до 1000 мкМ. Деградация 2,4-ДНФ клетками R. erylhropolis сопровождалась накоплением в среде ионов нитрита (рис. 6, кривые 4-6), с предшествующим лаг-периодом, величина которого была несколько больше, чем при убыли 2,4-ДНФ и составляла 1.5 - 6.0 ч при соответствующих концентрациях субстрата 150 - 1000 мкМ. К окончанию процесса трансформации на 1 М 2,4-ДНФ образовывалось 2 М нитрита.

Время, ч

Рис. 6. Потребление 2,4-ДНФ (/ - 3) и накопление нитрита (4-6) в процессе его деградации свободными клетками в периодических условиях. (Коэффициент вариации не превышал 12%, п=3)

График зависимости скорости потребления 2,4-ДНФ свободными клетками от его начальной концентрации имеет вид, характерный для кинетики субстратного ингибирования (рис. 7, кривая /). Об ингибировании также свидетельствует факт наличия на кривых убыли 2,4-ДНФ лаг-периода, который увеличивается с возрастанием исходной концентрации субстрата. Полное превращение субстрата в пределах исследуемых концентраций (25-1000 мкМ) позволяло исключить вероятность ингибирования продуктом реакции. Для иммобилизованных клеток график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата, также как и в случае свободных клеток, имеет вид, характерный для кинетики субстратного ингибирования (рис. 7, кривая 2). Максимальное значение скорости реакции деградации 2,4-ДНФ отмечалось при более высокой концентрации субстрата по сравнению со свободными клетками, а именно при 500 мкМ.

Рис. 7. Зависимость скорости деградации 2,4-ДНФ свободными (7) и включенными в агаровый гель (2) клетками от начальной концентрации

субстрата.

Таким образом, показано, что ферменты деградации 2,4- ДНФ являются индуцибельными, что необходимо учитывать при работе биосенсора, так как предварительная индукция клеток позволяет повысить чувствительность биорецептора к 2,4-ДНФ. Следует также отметить, что график зависимости скорости деградации от концентрации 2,4-ДНФ имеет вид субстратного ингибирования, что соответствует виду калибровочных зависимостей для биосенсора.

3.2. Модель биореактора на основе иммобилизованных клеток.

Для изучения трансформации 2,4-ДНФ включенными в агаровый гель клетками в непрерывных условиях была использована модель реактора идеального вытеснения. На рис. 8 представлены зависимости степени деградации 2,4-ДНФ (кривая 1) и производительности иммобилизованных клеток (кривая 2) от скорости протока субстрата через колонку. Высокая степень превращения 2,4-ДНФ (100 - 93 %) сохранялась при удельной скорости протока менее 20 ч"1, после чего наблюдалось резкое снижение степени превращения (рис. 8, кривая 1). Максимальная производительность клеток составляла 0.45 нмоль 2,4-ДНФ/мин/мг клеток при удельной скорости протока 2,4- ДНФ, равной 20 ч"1 (рис. 8, кривая 2). Без потери активности указанный биореактор функционировал в течение 14 сут, время полужизни составило 16 сут.

0.0 я

0 5 10 15 20 25 30 g,

Удельная скорость протока 2,4-ДНФ, ч"1 с

Рис. 8. Зависимость степени деградации 2,4-ДНФ (7) и производительности (2)

включенных в агаровый гель клеток R. eiythropolis от удельной скорости протока. Исходная концентрация 2,4-ДНФ составляла ЗОмкМ. (Коэффициент вариации не превышал 12 %, п=3).

Таким образом, определены оптимальные условия функционирования биореактора, показана возможность полной деградации 2,4-ДНФ в модельных условиях.

3.3. Параметры биосенсора для определения 2,4-дшштрофенола.

Ряд работ посвящен созданию биосенсоров для детекции нитроароматических соединений, тем не менее, биосенсоры реакторного типа для детекции 2,4-ДНФ не были описаны. Представляется важным изучение вопроса о возможности применения колоночного реактора (реактор идеального вытеснения с непрерывной подачей субстрата) в качестве рецепторного элемента бносенсора. Эффективность биосенсора такого типа в детекции поверхностно-активных веществ была показана ранее (Nomura et al., 1994). Измерение содержания кислорода на выходе реактора может позволить непосредственно оценить концентрацию 2,4-ДНФ, подаваемого на вход реактора, поскольку, как было описано ранее, процесс деградации 2,4-ДНФ клетками R. erythropolis HL РМ-1 сопровождается потреблением молекулярного кислорода (Emelianova, Reshetilov, 2002). Использование колоночного реактора позволяет также осуществить косвенную оценку концентрации 2,4-ДНФ путем регистрации нитрита, образующегося в результате деградации нитроароматических соединений (Lenke et al., 2002), с помощью сенсора на основе нитрифицирующих бактерий (Reshetilov et al., 2000). Данный подход в целом может повысить селективность анализа реальных образцов, содержащих помимо

нитроароматических соединений фенол, бензол и другие ароматические соединения.

Ранее в работе (ЕшеНапоуа, ЯезЬеШоУ, 2002) был описан биосенсор мембранного типа для детекции 2,4-ДНФ. Нами была показана возможность детекции 2,4-ДНФ биосенсором реакторного типа. Биореактор на основе иммобилизованных клеток являлся рецепторным элементом биосенсора для определения 2,4-ДНФ. В качестве преобразователя был использован кислородный электрод Кларка, подсоединенный к выходу биореактора. Биореактор на основе иммобилизованных клеток Я. егуМгороШ был также использован в качестве элемента селективной биосенсорной системы детекции 2,4-ДНФ.

Было исследовано влияние различных носителей и способов иммобилизации клеток на такие характеристики биосенсора, как диапазон детекции, стабильность и воспроизводимость (Таблица 9).

Таблица 9. Характеристики биосенсора на основе клеток К егуМгороШ, иммобилизованных различными способами._

Способ иммобилизации

Включе- Включе- Адсорб- Адсорб-

Параметры колоночного ние в ние в Са- ция на ция на

биореактора и биосенсора агаровый альгинат- керами- порошко-

на его основе гель ныи гель ческом вой

носителе целлю-

КН-1 лозе

Актив- нмоль 2,4-ДНФ/ч/мг клеток 32 16 51 48

ность мкмоль 2,4-

ДНФ/ч/мл 0.56 0.25 0.64 0.80

носителя

Стабильность, сут 11*(16**) 3*(5**) 5*(8**) 10*(17**)

Нижний предел детекции, мкМ 30 10 5 30

Время измерения, мин 15-20 45-60 15-25 15-25

Скорость протока, мл/мин 0.4

Оптимум рН 7.6-7.8

Коэффициент вариации, % 9.5

* стабильность без потери активности ** потеря активности на 50%

Согласно полученным данным, оптимальным носителем для иммобилизации клеток по таким характеристикам, как активность и стабильность, является целлюлоза.

Субстратная специфичность биосенсора на основе клеток Я. егу&гороШ представлена в Таблице 10.

Таблица 10. Субстратная специфичность биосенсора на основе клеток Д. егу1НгороУк._

Субстрат Ответ сенсора. %

фенол 228.6

2,4-ДНФ 100

/¡-нитрофенол 72

о-нитрофенол 20

я-нитрофенилацетат 9

2,4-динитрофешш-пщразин 0

2-амино-4-нитрофенол 0

я-нитробензоат 8.8

д(-нитробензоат 11.7

бензоат 17.8

и-нитроанилин 14.7

2-хлор-4-нитроанилин 17.6

2,4,6-тринитробензо-сульфонат 17.6

пикриновая кислота 18

катехол 57

глюкоза 64

нитрит 0

Величина ответа на 2,4-ДНФ принята за 100%. Высокая чувствительность сенсора была отмечена к фенолу, л-нитрофенолу и катехолу. Фенол и и-нитрофенол также относятся к токсичным соединениям и могут содержаться в промышленных сточных водах наряду с 2,4-ДНФ. Наличие чувствительности клеток К. егу1ИгороШ к данным веществам делает возможным использование сенсора для осуществления интегральной оценки токсичности образцов сточных вод.

3.4. Использование биосенсора реакторного типа в составе многоканального биосенсорного анализатора.

Поскольку деградация 2,4-ДНФ клетками Я. егуМгороШ НЬ РМ-1 сопровождается накоплением нитрита, с целью повышения селективности анализа 2,4-ДНФ (при наличии в сточных водах нитрофенолов и других мешающих соединений) возможно использование реактора в многоканальном биосенсорном анализаторе, включающем сенсор на основе нитрифицирующих бактерий для определения нитрита (патент РФ № 2207377). Многоканальный биосенсорный анализатор для детекции 2,4-ДНФ, пикриновой кислоты и ионов нитрита в водных средах при их совместном присутствии был разработан в лаборатории биосенсоров.

Использование системы сенсоров позволяло повысить селективность и точность анализа; с этой целью конструкция прибора содержала четыре

биосенсора (три мембранного типа и один реакторного типа), одновременно измеряющие данную пробу. Измерение проводилось в проточном режиме. Система из трех мембранных сенсоров включала два сенсора для детекции 2,4-ДНФ и сенсор для детекции нитрита. Рецепторные элементы сенсоров для детекции 2,4-ДНФ были основаны на бактериях Я. егу^гороШ", один из сенсоров был предназначен для измерения содержания нитрофенолов на входе колоночного реактора, другой - на выходе реактора. Для детекции ионов нитрита использовался мембранный сенсор на основе бактерий рода ШйгоЪаМег, сенсор служил для измерения концентрации нитрита на выходе колоночного биореактора, (рис. 9).

Рис. 9. Принцип измерения и схема экспериментальной установки для определения 2,4-ДНФ

В заключение отметим, что представленную модель биосенсора реакторного типа на основе клеток Я. егуМгороШ можно рекомендовать как основу анализатора для детекции 2,4-ДНФ и нитроароматических соединений в пробе. Рецепторный элемент в виде колоночного реактора позволяет получить надежную регистрацию 2,4-ДНФ в модельных образцах. Субстратная специфичность, что является типичным для сенсоров на основе клеток микроорганизмов, не является высокой, вместе с тем сенсор можно использовать для оценки интегральной токсичности образцов, содержащих фенол и нитроароматические соединения. Один из возможных способов повышения селективности состоит в измерении содержания ионов нитрита на выходе колоночного реактора — они могут появляться только в случае поступления на

вход реактора ннтроароматичееких соединений и их денитрификации иммобилизованными бактериями. В целом данный тип сенсора может быть использован либо самостоятельно, либо как элемент комплексной аналитической системы для детекции ннтроароматичееких соединений.

В Таблице 11 представлены основные характеристики разработанных биосенсоров.

Таблица 11. Параметры разработанных ферментных и микробных биосенсоров.

Параметры сенсоров Субстраты

Крахмал Этанол Метанол 2.4-ДНФ

ГОД+ ГА раств. в. охуйапь + ГА АО Р. а^изт АО Р. к егуМ-горо-1у$

Диапазон детекции 0.03-0.5 г/л 0.03-0.5 г/л 0.03-2 мМ 0.05-5 мМ 0.015-1 мМ 0.052.5 мМ 20-200 мкМ

Чувствительность 3.2 (нА/с)/ (г/л) 0.85 (нА/с)/ (г/л) 5.9 (нА/с)/ мМ 0.5 (нА/с)/ мМ 12.4 (нА/с)/ мМ 2.6 (нА/с)/ мМ 0.3 (пА/с)/ мкМ

Период анализа 10 мин 15 мин 5 мин 10 мин 5 мин 10 мин 15-25 мин

Таким образом, микробные биосенсоры обладают более низкой чувствительностью VI более длительным временем анализа по сравнению с ферментными. Тем не менее, анализ крахмала и метилового спирта в реальных образцах показал, что микробные сенсоры могут в ряде случаев заменять ферментные.

Для детекции крахмала и низших спиртов возможно использование как ферментов так и клеток микроорганизмов, в то время как для детекции 2,4-ДНФ возможно использование только микроорганизмов, ввиду сложности и многостадийности пути деградации данного соединения и трудоемкости выделения ключевого(вых) фермента(ов).

выводы

1. Исследованы параметры новой схемы биосенсорного анализа крахмала, основанной на использовании микробного сенсора и промышленно применяемой глюкоамилазы. Измерения проводятся без предварительного гидролиза крахмала. В качестве биорецептора использованы бактерии Gluconobacter oxydans subsp. industries BKM B-1280. Диапазон детекции крахмала составлял 0.03 - 0.50 г/л, период измерения составлял 10-15 мин, коэффициент вариации не превышал 10%. Показана применимость биосенсора для анализа крахмала в реальных образцах.

2. Показана высокая стабильность алкоголъоксидазы, иммобилизованной новым способом с применением бензохинона и диэтиламиноэтилдекстрана. Биосенсор на ее основе позволял производить измерения метанола и этанола в диапазоне 0.015 - 1.0 и 0.03 - 1.0 мМ, соответственно. Операционная стабильность биорецепторов составляла 10 сут, стабильность при хранении - 5 мес при сохранении неизменного диапазона детекции и потере чувствительности в 2 раза; коэффициент вариации не превышал 5%.

3. Алкогольоксидазный биосенсор был применен для контроля этилового и метилового спирта в реальных образцах. Коэффициент корреляции с данными микробного биосенсора и метода газовой хроматографии составил 0.98 и 0.96, соответственно.

4. Впервые создан биосенсор реакторного типа (реактор идеального вытеснения) на основе иммобилизованных клеток Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 и кислородного электрода для детекции 2,4-ДНФ. Нижний предел детекции составлял 10-30 мкМ. Время измерения концентраций 2,4-ДНФ с последующим восстановлением величины сигнала занимало 15-25 мин.

5. Изучены особенности деградации 2,4-ДНФ бактериями R. erythropolis HL РМ-1. Установлено, что участвующие в деградации 2,4-ДНФ ферменты индуцибельны.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Лобанов A.B., Шувалова Ю.В., Зырина Н.В., Китова А.Е., Макаренко A.A., Кувичкина Т.Н., Фесай А.П., Решетилов А.Н. Биосенсоры для экологического контроля // Экологические системы и приборы. 2001, № 6. С. 7276.

2. Китова А.Е., Кувичкина Т.Н., Ильясов П.В., Аринбасарова А.Ю., Решетилов А.Н. Биосенсор реакторного типа на основе клеток Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 для определения 2,4-динитрофенола // Прикл. биохимия и микробиология. 2002. V. 38. № 5. С. 585 - 590.

3. Китова Л.Е., Кувичкина T.I {., Аринбасарова Л.Ю., Решетилов А.Н. Деградация 2,4-дшштрофенола свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 // Нрикл. биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. №3. С. 307-311.

4. Китова А.Е., Алферов В.А., Понаморева О.Н., Кузмичев А.В., Ежков А.А., Решетилова Т.А., Решстилов А.Н. Ферментные биосенсоры для экспресс-анализа содержания глюкозы, этанола и крахмала в ферментационных средах Н Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК. Москва. Пищепромиздат. 2004. С. 255-262.

5. Китова А.Е., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Кузмичев А.В., А.А. Ежков, Д.В. Арсеньев, Решетилов А.Н., Перспективы применения биосенсорных экспресс анализаторов при производстве спирта // Производство спирта и ликеро-водочных изделий. 2004. Т. 4. С. 11-13.

6. Reshetilov A.N., Kitova А.Е., Alferov V.A., Ponamoreva O.N., Kuzmichev A.V., Ezhkov A.A. Biosensor assay of starch using a glucose oxidase electrode and glucoamylase // Starch: from starch containing sources to isolation of starches and their applications // Yuryev V.P., Tomasik P. and Ruck H. eds. - New York, Nova Science Publishers, Inc. 2004. Chapter 20. P. 17-28.

7. Kitova A.E., Alferov V.A., Ponamoreva O.N., Ashin V.V., Kuzmichev A.V., Ezhkov A. A., Arsenyev D.V., Reshetilov A.N. Enzyme biosensors for starch, glucose and ethanol concentrations express-analysis // Biotechnology and Industry // G.E. Zaikov ed. - New York, Nova Science Publishers, Inc. 2004. Chapter 3. P. 19-29.

8. Рыбакова E.B., Понаморева O.H., Алферов В.А., Китова А.Е., Кузмичев А.В., Решетилов А.Н. Биосенсорный анализ крахмала: применение гомогенного гидролиза с детекцией глюкозы ферментным и микробным сенсорами // Сенсорные системы. 2005. Т. 19. № 1. С. 93-99.

9. Решетилов А.Н., Китова А.Е. Биосенсорные экспресс-анализаторы в производстве спирта // Интернет-журнал "Коммерческая биотехнология". 2005. (http://www.cbio. ru/v5/modu!es/news/article.php?storyid=l 112)

10. Китова А.Е., Решетилов А.Н., Кутышенко В.П., Кутышенко А.В. Применение ЯМР-спектроскопии для изучения трансформации сорбита и глюкозы бактериями Gluconobacter oxydans II Биофизика. 2006. Т. 51. Вып. 2. С. 306-309.

Тезисы.

1. Кувичкина Т.Н., Ильясов П.В., Китова А.Е., Аринбасарова А.Ю., Решетилов А.Н. Подход к созданию колоночного биосенсора для определение 2,4-динитрофенола с помощью иммобилизованных клеток Rhodococcus erythropolis HL РМ-1. // Сборник тезисов Всероссийской конференции "Сенсор 2000". Санкт-Петербург, 2000 г., с. 65.

2. Кувичкина Т.Н., Ильясов П.В., Макаренко А.А., Китова А.Е., Аринбасарова А.Ю., Решетилов А.Н. Определение токсичных моноароматических соединений с использованием микробных сенсоров //

Сборник тезисов Международной конференции "Проблемы биологической и экологической безопасности". Оболенск, 2000 г., с. 402.

3. Китова А.Е., Ильясов П.В., Кувичкина Т.Н., Решетилов А.Н. Биосенсорное определение 2,4-динитрофенола с помощью бактерий Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 // Сборник тезисов XIV Международной молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва, 2002 г., с. 23.

4. Китова А.Е., Ильясов П.В. Деградация 2,4-динитрофенола бактериями Rhodococcus erythropolis HL РМ-1. // Сборник тезисов VII Школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино, 2003 г., с. 106.

5. Китова А.Е., Кувичкина Т.Н., Аринбасарова А.Ю., Решетилов А.Н.. Микробный сенсор реакторного типа для определения 2,4-динитрофенола // Материалы II международной научной конференции «Ксенобиотики и живые системы». Минск, 2003 г, с. 110-113.

6. Китова А. Е., Алферов В. А., Понаморева О. Н., Ашин В. В., Кузмичев А. В., Ежков А. В., Арсеньев Д. В., Решетилов А. Н. Ферментные биосенсоры для экспресс-анализа концентраций крахмала, глюкозы и этанола // II Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Материалы конгресса. Часть 1. Москва, 2003 г., с. 283-284.

7. Kitova А.Е., Reshetilov A.N., Leathers T.D., Cotta M.A. Screening of the substrate properties of microorganisms for biosensor detection of oligosaccarides // Proceedings of The Ninth World Congress on Biosensors. Sheraton Centre, Toronto, Canada. 2006, P40.

8. Китова A.E. Деградация 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 // Российская школа-конференция молодых ученых "Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии". Сборник статей. Пущино, 2006 г., с. 48-49.

9. Арляпов В.А., Рогова Т.В., Понаморева О.Н., Китова А.Е., Решетилов А.Н. Экспресс-определение крахмала и БПК сточных вод предприятий крахмалоперерабатывающей промышленности с помощью микробных биосенсоров // Сборник тезисов XV Международной конференции по крахмалу Москва-Краков. Москва, 2007 г., с. 41-42.

10. Китова А.Н., Ашин В.В., Решетилов А.Н. Биосенсор на основе алкогольоксидазы для детекции низших спиртов // Сборник тезисов III Международной молодежной школы-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва, 2007 г., с. 42.

Патенты:

Китова А.Е., Понаморева О.Н., Решетилов А.Н. Патент РФ № 66815. Устройство для определения олиго- и полисахаридов. (Бюллетень изобретений полезных моделей. 2007. № 27) Заявка на патент № 2007111202. 2007.

Подписано в печать: 16.02.2009

Заказ Лг° 1572 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Китова, Анна Евгеньевна

Список сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Ферментные амперометрические биосенсоры.

2.2. Способы иммобилизации ферментов.

2.3. Амперометрические биосенсоры на основе клеток микроорганизмов.

2.4. Способы иммобилизации клеток микроорганизмов.

2.5. Детекция крахмала и олигосахаридов.

2.5.1. Ферментные биосенсоры для детекции олиго- и полисахаридов.

2.5.2. Микробные сенсоры для детекции крахмала и олигосахаридов.

2.6. Биосенсоры для детекции низших спиртов.

2.6.1. Биосенсоры на основе алкогольоксидазы.

2.6.2. Микробные биосенсоры для детекции спиртов.

2.7. Детекция нитроароматических соединений.

2.7.1. Микроорганизмы-деструкторы нитроароматических соединений.

2.7.2. Микробные сенсоры для определения нитроароматических соединений.

3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Способы иммобилизации ферментов.

3.1.1. Иммобилизация с использованием глутарового альдегида.

3.1.2. Иммобилизация ферментов на мембранах активированных бензохиноном.

3.1.3. Иммобилизация ферментов в слое ДЭАЭ-декстрана на нитроцеллюлозной мембране.

3.2. Условия культивирования штаммов.

3.3. Способы иммобилизации клеток.

3.3.1. Адсорбция.

3.3.2. Включение в гели.

3.4. Формирование биосенсоров и условия измерения.

3.5. Условия трансформации 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Я. егуМгороШ НЬРМ-1.

3.6. Анализ реальных образцов. Пробоподготовка.

3.7. Альтернативные методы.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Биосенсоры для детекции крахмала.

4.1.1. Биосенсор на основе совместно иммобилизованных глюкозооксидазы и глюкоамилазы.

4.1.2. Анализ крахмала с помощью глюкозооксидазного биосенсора и раствора глюкоамилазы.

4.1.3. Анализ крахмала с помощью микробного сенсора на основе клеток Gluconobacter oxydans subsp. industries В-1280 и раствора глюкоамилазы.

4.2. Скрининг микроорганизмов для биосенсорной детекции олигосахаридов.

4.3. Модели биосенсоров для детекции низших спиртов.

4.3.1. Биосенсо'ры на основе алкогольоксидазы.

4.3.1.1. Биосенсор на основе алкогольоксидазы, иммобилизованной на мембранах, активированных бензохиноном.

4.3.1.2. Биосенсор на основе алкогольоксидазы, иммобилизованной в слое ДЭАЭ-декстрана.

4.3.2. Биосенсор на основе клеток метилотрофных дрожжей Pichia angusta BKMY-2518.

4.3.3. Применение алкогольоксидазного и микробного биосенсора для детекции спиртов в реальных образцах.

4.4. Модель биосенсора реакторного типа для детекции 2,4-динитрофенола.

4.4.1. Трансформация 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis в периодических условиях.

4.4.2. Трансформация 2,4-динитрофенола иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis в непрерывных условиях (реактор идеального вытеснения).

4.4.3. Подбор способа иммобилизации клеток для формирования рецепторного элемента сенсора реакторного типа для определения 2,4-динитрофенола.

4.4.4. Оптимизация параметров биосенсора для определения 2,4-динитрофенола.

4.4.5. Использование биосенсора реакторного типа в составе многоканального биосенсорного анализатора.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Амперометрические микробные и ферментные биосенсоры для детекции углеводов, спиртов и нитроароматических соединений"

Актуальность проблемы. В последнее десятилетие показана высокая эффективность применения биосенсорного анализа для решения ряда практических задач. По статистическим данным основными областями наиболее успешного использования биосенсоров являются промышленная биотехнология, пищевая промышленность экология, клиническая диагностика. По данным объема рынка продаж за последние 8 лет его рост составил 2.5 раза для биосенсоров, применяемых в промышленной биотехнологии, и 5 раз для биосенсоров, используемых для решения экологических проблем.

Отметим актуальность и связанность задач детекции некоторых важных для пищевой промышленности и биотехнологии соединений. В спиртопроизводстве для оптимального проведения технологического процесса необходимо иметь информацию о содержании крахмала в исходном сырье, содержании крахмала и Сахаров на стадиях разваривания и осахаривания крахмалосодержащего сырья, содержании Сахаров и спирта на стадии брожения и содержании спирта в отгоняемых водно-спиртовых парах. Применение биосенсоров на основе ферментов и клеток микроорганизмов для оценки содержания указанных компонентов оптимизирует процесс производства и снизит за счет этого стоимость конечного продукта. Обнаружение суммарного содержания органических соединений, включая спирты и углеводы, требуется для экологического мониторинга (оценка присутствия углеводов в сточных водах, основанная на измерении индекса БПК5 (биологическое потребление кислорода); оценка содержания метилового спирта в объектах, принадлежащих регионам газодобычи). В настоящее время для указанной цели используются трудоемкие аналитические методы (например, оценка БПК5), которые не позволяют получать оперативную информацию о присутствии поллютантов в сточных водах.

Актуальной проблемой экологического контроля является детекция поллютантов в сточных водах промышленных предприятий. К числу распространенных групп ксенобиотиков относятся нитроароматические соединения (2,4-динитрофенол, пикриновая кислота, 2,4,6-тринитротолуол и др.), которые присутствуют в стоках химических предприятий, производящих взрывчатые вещества, красители, пестициды. 2,4-Динитрофенол токсичен для живых организмов - его присутствие подавляет иммунную систему, вызывает нарушение процессов энергетического метаболизма клеток, вызывает мутагенное и канцерогенное действия. Нитрофенолы, в частности, 2-4-ДНФ, могут быть определены спектрофотометрически и хроматографически. Эти методы являются высокочувствительными, но в то же время дороги и трудоемки, в связи с чем, актуальным является разработка биосенсорного подхода. Биосенсорная детекция токсичных нитроароматических соединений может быть использована для оценки состояния объектов окружающей среды на стадии экологического мониторинга, а также при использовании биотехнологических подходов ремедиации объектов окружающей среды.

Распространенным и надежным типом аналитических устройств являются биосенсоры, основанные на электрохимических преобразователях. В диссертации для разработок моделей биосенсоров использован преобразователь электрохимического типа — полярографический электрод, измеряющий содержание кислорода в среде и известный как кислородный электрод типа Кларка.

Бактерии рода СЫсопоЪасгег, обладающие такими особенностями, как широкий спектр окисляемых субстратов, неполное окисление и накопление продуктов в среде, энергетически малоэффективная организация дыхательной цепи, могут успешно использоваться для создания биосенсоров для контроля ферментационных процессов, а также для экологического мониторинга.

Метилотрофные дрожжи Р1сЫа ап%и$1а характеризуются наличием высокоактивных алкогольоксидазы и алкогольдегидрогеназы, что позволяет их использовать в создании биосенсоров для детекции низших спиртов. Выбранный для исследования штамм Р. ап§ш1а ВКМ У-2518 обладает высокой селективностью по отношению к этанолу и метанолу и практически не окисляет глюкозу (после индукции метанолом), что важно при анализе реальных образцов, содержащих смесь Сахаров и спиртов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось создание амперометрических микробных и ферментных биосенсоров для детекции глюкозы, крахмала, низших спиртов, а также разработка микробного биосенсора реакторного типа для детекции нитроароматических соединений (2,4-ДНФ).

Задачи исследования:

1. Разработка моделей биосенсоров для определения крахмала:

2. Разработка моделей биосенсоров для определения низших спиртов:

3. Разработка модели биосенсора реакторного типа на основе иммобилизованных клеток бактериального штамма Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 для детекции 2,4-ДНФ:

Научная новизна.

3. Создана модель микробного биосенсора реакторного типа для детекции 2,4-ДНФ и общего содержания нитроароматических соединений на основе бактериальных клеток R. erythropolis HL РМ-1 и кислородного электрода.

Практическая значимость. Предложена и разработана схема биосенсорного анализа крахмала с помощью микробного сенсора на основе бактерий G. oxydans subsp. industries В-1280 и глюкоамилазы.

Созданные модели микробных и ферментных сенсоров для детекции крахмала, глюкозы, этанола могут быть использованы на предприятиях пищевой промышленности (контроль ферментационного получения спирта), для определения содержания состава пищевых продуктов (крахмал, глюкоза), содержания этанола в спиртных напитках.

Микробный сенсор на основе клеток R. erythropolis HL РМ-1 может быть использован на предприятиях химической промышленности, производящих пестициды, красители, взрывчатые вещества, где необходим быстрый и недорогой метод рнализа содержания нитроароматических соединений в сточных водах.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биосенсор на основе клеток штамма Gluconobacter oxydans subsp. industries BKM B-1280 позволяет определять содержание крахмала в пробе при добавлении в измерительную кювету раствора глюкоамилазы. Биосенсор применим для анализа крахмала в реальных образцах.

2. На основе нового способа иммобилизации алкогольоксидазы в слое ДЭАЭ-декстрана на мембранах, активированных бензохиноном возможно получение стабильных биорецепторов, применяемых для создания биосенсора для детекции этилового и метилового спиртов.

3. Биосенсор на основе штамма Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 и кислородного электрода позволяет определять общее содержание нитроароматических соединений в модельных образцах. Данный тип сенсора может быть использован либо самостоятельно, либо как элемент комплексной аналитической системы для детекции нитроароматических соединений.

Апробация работы. Работа была представлена на Всероссийской конференции "Сенсор 2000" (Санкт-Петербург, 2000 г.), Международной конференции "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000 г), XIV Зимней международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2002 г.), VII Школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003 г.), П Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003 г.), II Международной научной конференции "Ксенобиотики и живые системы" (Минск, 2003 г.), The Ninth World Congress on Biosensors (Toronto, 2006), Российской школе-конференции молодых ученых "Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы, технологии" (Пущино, 2006), XV Международной конференции по крахмалу (Москва, 2007 г), III Международной молодежной школы-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2007 г). Присуждена премия им. Г.К. Скрябина (2005 г.).

По материалам диссертации опубликовано 10 статей (из них 5 статей в рецензируемых журналах из списка ВАК).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Китова, Анна Евгеньевна

ВЫВОДЫ

2. Показана высокая стабильность алкогольоксидазы, иммобилизованной новым способом с применением бензохинона и диэтиламшюэтилдекстрана. Биосенсор на ее основе позволял производить измерения метанола и этанола в диапазоне 0.015 — 1.0 и 0.03 — 1.0 мМ, соответственно. Операционная стабильность биорецепторов составляла 10 сут, стабильность при хранении - 5 мес при сохранении неизменного диапазона детекции и потере чувствительности в 2 раза; коэффициент вариации не превышал 5%.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я глубого благодарна всем, кто помогал при создании данной работы. Особую признательность я хотела бы выразить своему научному руководителю А.Н. Решетилову. Искренне признательна П.В. Ильясову и Т.Н. Кувичкиной, за помощь в проведении экспериментов и ценные советы. Благодарю А.Ю. Аринбасарову за консультации в проведении экспериментов по исследованию деградации 2,4-ДНФ. Глубоко признательна В.В. Ашину за проведение совместных исследований по созданию биосенсора на основе иммобилизованной алкогольоксидазы. Благодарю О.Н. Понамореву за проведение совместных исследований по созданию микробного биосенсора для детекции крахмала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка методов экспресс-анализа ключевых параметров ферментационных процессов, контроля качества пищевых продуктов, мониторинга окружающей среды является актуальной проблемой. Данная проблема потребовала решения следующих задач.

1) Разработка биосенсоров для контроля процесса спиртопроизводства и мониторинга ферментационных производств.

В решении этой задачи предложены модели биосенсоров для детекции крахмала, этилового и метилового спиртов. Впервые представлена схема анализа крахмала с использованием биосенсора на основе клеток Gluconobacter oxydans и ГА в растворимом виде, которая позволяла учитывать присутствие эндогенной глюкозы в пробе. Показана возможность применения промышленного ферментного препарата Алкоголаза II 400 для создания биосенсорного метода оценки содержания крахмала. Содержание крахмала в реальных образцах, определенное микробным и ГОД сенсором с использованием глюкоамилазы в растворимом виде находилось в соответствии с реальным содержанием крахмала в исследованных образцах.

При создании биосенсора для детекции низших спиртов (этанола, метанола) использован новый способ иммобилизации ферментов, позволяющий получать высокочувствительные и стабильные биорецепторы. Метод, основанный на связывании фермента с ДЭАЭ-декстраном на поверхности нитроцеллюлозной мембраны, был применен для иммобилизации АО и ГОД. Проведено сравнительное изучение параметров микробного биосенсора на основе клеток P. angusta и ферментного на основе АО. Микробный сенсор характеризовался более низкой чувствительностью, а также более длительным временем анализа, что может быть объяснено диффузионными ограничениями субстратов и образующихся продуктов. Тем не менее, параметры микробного сенсора (нижний предел детекции, чувствительность) сопоставимы с параметрами ферментного, что позволяет использовать микробный сенсор для анализа реальных образцов. Биосенсоры были применены для анализа содержания этилового спирта в спиртных напитках и контроля концентрации метанола в процессе культивирования метилотрофных дрожжей.

2) Разработка биосенсора для детекции 2,4-динитрофенола.

Метод детекции, основанный на амперометрической регистрации убыли кислорода в процессе потребления кислорода клетками микроорганизмов, был применен для определения содержания поллютанта 2,4-ДНФ в водных средах. Рецепторный элемент в виде колоночного реактора позволял получать надежную регистрацию 2,4-ДНФ в модельных образцах. Субстратная специфичность, не является высокой, что типично для сенсоров на основе клеток микроорганизмов, вместе с тем сенсор можно использовать для оценки интегральной токсичности образцов, содержащих фенол и нитроароматические соединения. Один из возможных способов повышения селективности состоит в измерении содержания ионов нитрита на выходе колоночного реактора — они могут появляться только в случае поступления на вход реактора нитроароматических соединений и их денитрификации иммобилизованными бактериями. В этой связи данный тип сенсора может быть использован как элемент комплексной аналитической системы для детекции нитроароматических соединений.

Полученные в ходе выполнения работы результаты показали, что разработанные модели биосенсоров удовлетворяют требованиям контроля биотехнологических процессов и экологического мониторинга и могут применяться как в исследовательских целях, так и для решения практических задач.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Китова, Анна Евгеньевна, Саратов

1. Авдусъ П.Б., CanootcHUKoea A.C. Определение качества зерна, муки и крупы. Изд. 2-е. М.: Колос, 1967. С. 166 -169.

2. Аринбасарова А. Ю. Трансформация гидрокортизона свободными и иммобилизованными клетками Arthrobacter globiformis 193: Дис. на соискание ученой степени канд. биол. наук. Пущино, 1985. - 214 с.

3. Вудворд Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. М.: Мир. 1988.256 с.

4. Звягинг{ев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. Изд. Московского ун-та, 1973.175 с.

5. Корженевич В.И., Игнатов О.В., Миронов А.Д., Кривопалов Ю.В., Борковский АЛ. II Активность штаммов-деструкторов ароматических соединений, иммобилизованных в гранулах агарового геля Прикл. биохимия и микробиология. 1991. Т. 27. № З.С. 365 -369.

6. Кощеенко К.А., Аринбасарова А.Ю., Тюрин B.C., Никитин B.C., Скрябин Г.К. Дегидрирование гидрокортизона адсорбированными клетками Arthrobacter globiformis 193. // Биотехнология. 1987. Т. 3. № 2. С. 204-209.

7. Луста К, Решетилов А.Н. Физиолого-биохимические особенности Gliiconobacter oxydans и перспективы использования в биотехнологии и биосенсорных системах // Прикл. биохимия и микробиология. 1998. V. 34. Р. 339-353.

8. Методы общей бактериологии: Пер. с англ. / Под ред. Ф. Герхардта и др. М.: Мир, 1984. 472 с.

9. Мельников H.H. Химия и технология пестицидов. М.: Химия, 1974. С. 141.

10. Мизгунова У. М., Шеховг{ова Т.Н., Долманова И.Ф. Ферментативные методы определения алифатических спиртов// Журнал аналитической химии. 1998. Т. 53. № 10. С. 1014-1029.

11. Новиков Ю.В., Ласточкина КО., Болдина З.Н. Методы исследования качества воды водоемов. М.: Медицина, 1990. С. 80-82.

12. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука. 1985. 536 с.

13. Плате H.A., Чупов В.В. Полимерные системы, содержащие иммобилизованные микроорганизмы и биосенсоры на их основе // Высокомолекулярные соединения. 1994. Т. 36. №11. С. 1862-1875.

14. Полыгалипа Г. В. Технохимический контроль спиртового и ликеро-водочного производства (Учеб.-практ.пособие). М.: Колос. 1999. 334 с.

15. Решетгшов А. Н., Ильясов П. В., Слепенъкин А. В. и др. Бактерии Pseudomonas как * основа рецепторного элемента микробных сенсоров для детекции ароматических ксенобиотиков //ДАН. 1996. Т. 348. № 4. С. 552-555.

16. Рыбакова Е.В., Пономарева О.Н., Алферов В.А., Китова А.Е., Кузмичев A.B., Решетшов А.Н. Биосенсорный анализ крахмала: применение гомогенного гидролиза с детекцией глюкозы ферментным и микробным сенсорами // Сенсорные системы. 2005. Т. 19. № 1.С. 93-99.

17. Сингирцев H.H., Крестъянинов В.Ю., Корженевич В.И. // Прикл. биохимия и микробиология. 1994. Т. 30. № 2. С. 250-255.

18. Старовойтов И.И., Селифонов С.А., Нефедова М.Ю. и др. Путь катаболизма бифенила, контролируемый плазмидой pBS241 у Pseudomonas putida BS893 // ДАН. 1986. Т. 288. № 3. С. 751-755.

19. Тернер Э., Карубе И., Уилсон Дж. Биосенсоры: основы и приложения. М.: Мир, 1992. 614 с.

20. Туркова Я. Аффинная хроматография. Пер. с англ. JI.B. Козлова. М.: Мир. 1980.471 с.

21. Федоров А.Ю., Волченко Е.В., Сингирцев КН., Корженевич В.И., Шуб Г.М. Защитное действие агара при иммобилизации штаммов-деструкторов ароматических соединений. // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 2. С. 165-172.

22. Эмсли Дж., Финней Дж., Сатпклиф JI. Спектроскопия ЯМР высокого разрешения. 1 том. М.: Мир, 1969. 630 с.

23. Яшин А.Я., Яшин Я. И. Аналитические возможности жидкостного хроматографа «ЦветЯуза» с электрохимическими детекторами // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2002. Т. XLVI, № 4. С. 109-115.

24. Acquisticii R, Bucci R., Magri A.D., Magri A.L. Thermal analysis of food carbohydrates by determination of starch gelatinization phenomena // Fresen. J. Anal. Chem. 1997. V. 357. P. 97-100.

25. Akyilmaz E., Dingkaya E. A new enzyme electrode based on ascorbate oxidase immobilized in gelatin for specific determination of L-ascorbic acid // Talanta. 1999. V. 50. P. 87-93.

26. Akyilmaz E., Dingkaya E. An amperometric microbial biosensor development based on Candida tropicalis yeast cells for sensitive determination of ethanol // Biosens. Bioelectron. 2005. V. 20. № 7. P. 1263-1269.

27. Amer.Assoc.Cereal Chem. Approved Methods, 9th ed., 1995. P. 76-88.

28. AravanisA. M., DeBusschere B. D., Chruscinski A. J., Gilchrist K. #., Kobilka В. K., Kovacs G. T. A genetically engineered cell-based biosensor for functional classification of agents // Biosens. Bioelectron. 2001. V. 16. № 7-8. P. 517-577.

29. Barsan M.M., Brett C.M.A. An alcohol oxidase biosensor using PNR redox mediator at carbon film electrodes // Talanta. 2007. (In press).

30. Belghith H., Romette J.L., Thomas D. An enzyme electrode for on-line determination of ethanol and methanol // Biotechnol. Bioeng. 1987. V. 30. № 9. P. 1001-1005.

31. Bertrand C., Coulet P.R., Gautheron D.C. Multipurpose electrode with different enzyme systems bound to collagen films // Anal. Chim. Acta. 1981. V. 126. P. 23—34.

32. Blasco R., Castillo F. Light dependent degradation of nitro-phenols by the phototrophic bacterium Rhodobacter capsula-tus E1F1 // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 690695.

33. Blasco R., Castillo F. Characterization of a nitrophenol re-ductase from the phototrophic bacterium Rhodobacter capsu-latus E1F1 // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 1774-1778.

34. Blaut M. Relationship of prebiotics and food to intestinal microflora // European Journal of Nutrition. 2002. V. 41. Supplement 1.

35. Boley N.P., Burn M.J.S. The determination of starch in composite foodstuffs by highperformance liquid chromatography // Food Chemistry. 1990. V. 36. P. 45-51.

36. Boujtita M., Hart J.P., Pittson R. Development of a disposable ethanol biosensor based on a chemically modified screen-printed electrode coated with alcohol oxidase for the analysis of beer I I Biosens. Bioelectron. 2000. V. 15. № 5-6. P. 257-263.

37. Boyaci I.H., §eker U.O.§., Mutlu M. Determination of 0-glucan content of cereals with an amperometric glucose electrode. // Eur. Food Res. Technol. 2002. V. 215. P. 538-541.

38. Bruhn C., Lenke H„ Knackmuss H.-J. Nitrosubstituted Aromatic Compounds as Nitrogen Sourse for Bacteria. //Appl. Environ. Microbiol. 1987. V.53. № 1. P. 208-210.

39. Cancino B., Rossier F., Orellana C. Corn starch waste water treatment with membrane technologies: pilot test // Desalination. 2006. V. 200. № 1-3. P. 750-751.

40. Cassidy M.B., Lee H., Trevors J.T. Environmental applications of immobilized microbial cells: a review// Journal of industrial microbiology. 1996. V. 16. P. 79-101.

41. Chapatwala K.D., Babu G.R.V., Wolfram J.H. Screening of encapsulated microbial cells for the degradation of inorganic cyanides // J. Ind. Microbiol. 1993. V. 11. P. 69-72.

42. Chibata I., Tosa T., Sato T. Immobilised aspartate-containing microbial cells: preparation and ensymaticproperties. //Appl. Microbiology. 1974. V. 27. P. 878-885.

43. Clarkson S.P., Onnrod I.H.L., Sharpe F.R. Determination of ethanol in beer by direct injection gas chromatography. A comparison of 6 identical systems // J. Inst. Brew. 1995. V. 101. P. 191-193.

44. Corcoran C.A., Kobos R.K. Selectivity enhancement of a bacterial arginine electrode // Anal. Lett 1983. V. 16. P. 1291-1302.

45. Cosnier S. Biomolecule immobilization on electrode surfaces by entrapment or attachment to electro chemically polymerized films. A review // Biosens. Bioelectron. 1999. V. 14. 443456.

46. Cosnier S., NovoaA., Mousty C., Marks R.S. Biotinylated alginate immobilization matrix in the construction of an amperometric biosensor: application for the determination of glucose // Analytica Chimica Acta. 2002. V. 453. P. 71-79.

47. D'Souza S.F. Microbial biosensors // Biosens. Bioelectron. 2001. V. 16. P. 337-353.

48. Daunert S., Barrett G., Feliciano J.S., Shetty R. S., Shrestha S., Smith-Spencer W, Genetically engineered whole-cell sensing systems: coupling biological recognition with reporter genes // Chem. Rev. 2000. V. 100. P. 2706-2738.

49. Delgado A., Wubbolts M.G., Abril M.-A., Ramos J.L. Nitroa-romatics are substrates for the TOL plasmid upper-pathway enzymes // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 415417.

50. Di Paolantonio C.L., Rechnitz G.A. Induced bacterial electrode for the potentiometric measurement of tyrosine // Anal. Chim. Acta. 1982. V. 141. № 1. P. 1-13.

51. Di Paolantonio C.L., Rechnitz G.A. Stabilized bacteria-based potentiometric electrode for pyruvate // Anal. Chim. Acta. 1983. V. 148. P. 1-12.

52. Dickel O., Knackmuss H.-J. Catabolism of 1,3-dinitrobenzene by Rhodococcus sp. QT-1 // Arch. Microbiol. 1991. V. 157. P. 76-79.

53. Ebert S., Rieger P.G., Knackmuss H.J. Function of coenzyme F420 in aerobic catabolism of 2,4,6-TNP and 2,4-dinitrophenol by Nocardioides simplex FJ2-1A // Journal of Bacteriology 1999. V. 181. P. 2669-2674.

54. El-Aassar S.A., Omar S.H. Rehm H.J. Oxidation of «-tetradecane by Candida parapsilosis KSh 21 adsorbed on different glass rings.// Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988. V. 29. № 5. 442-466.

55. Emelianova E. V., Reshetilov A.N. Rhodococcus erythropolis as the receptor of a cell based sensor for 2,4- dinitrophenol detection: effect of co-oxidation // Proc. Biochem. 2002. V.37. P.683-692.

56. Fernando T., Bumpus J.A., Aust S.D. Biodégradation of TNT (2,4,6-trinitrotoluene) by Phanerochaete chrysosporium II Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 1666-1671.

57. Fukui S., Tanaka A. Immobilized Microbial Cells. // Annual Reviews of Microbiology. 1982. V. 36. P. 145-172.

58. Gibson, T.D., Woodward, JR., 1992. Protein stabilisation in biosensor systems. In: Edelman, P.G., Wang, J. (Eds.), Biosensors and Chemical Sensors. ACS, Washington, pp. 40-55.

59. Godia F„ Casas C., Sola C. A survey of continuous ethanol fermentation systems using immobilized cells//Process Biochemistry. 1987. V. 22. № 2. P. 43-48.

60. Gorton L. Carbon paste electrodes modified with enzymes, tissues, and cells // Electroanalysis 1995. V. 7. № 1. P. 23-45.

61. Groenewegen P.E.J., de Bont J.A.M. Degradation of 4-nitro-benzoate via 4-hydroxylaminobenzoate and 3,4-dihydroxyben-zoate in Comamonas acidovorans NBA-10 // Arch. Microbiol. 1992. V. 158. P. 381-386.

62. Giiilbault G.G., Danielsson B., Mandenius C.F., Mosbach K. Enzyme electrode and termistor probes for determination of alcohols with alcohol oxidase // Anal. Chem. 1983. V. 55. №.9. P. 1582-1585.

63. Gulce H., Gulce A., Kavanoz M., Coskun IL, Yildiz A. A new amperometric enzyme electrode for alcohol determination // Biosens. Bioelectron. 2002. V. 17. № 6-7. P. 517-521.

64. Guliy O.I., Ignatov O.V., Makarov O.E., Ignatov V.V. Determination of organophosphorus aromatic nitro insecticides and p-nitrophenol by microbial-cell respiratory activity // Biosens. Bioelectron. 2003. V. 18. P. 1005-1013.

65. Haigler B.E., Spain J.C. Biotransformation of nitrobenzene by bacteria containing toluene degradative pathways // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 3156-3162.

66. Hallas L. E„ Alexander M. Microbial transformation of nitroaromatic compounds in sewage effluent // Appl. Environ. Microbiol. 1983. V.45. № 4. P. 1234-1241.

67. HamidA., Moody G., Thomas J. Multi-enzyme electrodes for the determination of starch by flow injection//Analyst. 1990. V. 115. № 10. P. 1289-1295.

68. Hanne L.F., Kirk L.L., Appel S.M., Narayan A.D., Bains K.K. Degradation and induction specificity in actinomycetes that degrade p-nitrophenol // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 3505-3508.

69. Hikuma M. Microbial electrode sensor for alcohols // Biotechnol. Bioeng. 1979. V. 21. № 10. P.1845-1853.

70. Hofrichter M., Gunther T., Fritsche W. Metabolism of phenol, chloro- and nitrophenols by the Pénicillium strain Bi 7/2 isolated from a contaminated soil // Biodégradation. 1993. V. 3. P. 415-421.

71. Hu T., Zhang X.-E„ Zhang Z.-P. Disposable screen-printed enzyme sensor for simultaneous determination of starch and glucose. // Biotechnol. Techniques. 1999. V. 13. P. 359-362.

72. Ivanov A.N., Evtugyn G. A., Gyurcsanyi R. E„ Toth K, Budnikov H.C. Comparative investigation of electrochemical cholinesterase biosensors for pesticide determination // Analytica Chimica Acta. 2000. V. 404. № 1. P. 55-65.

73. Jawaheer S., White S. F., Rughooputh S. D., Cullen D. C. Development of a common biosensor format for an enzyme based biosensor array to monitor fruit quality // Biosens. Bioelectron. 2003. V. 18. № 12. P. 1429-1437.

74. Jia J., Tang M., Chen X., Qi L, Dong S. Co-immobilized microbial biosensor for BOD estimation based on sol-gel derived composite material // Biosens. Bioelectron. V. 18. P. 1023-1029. 2003.

75. Karube I., Mitsuda S„ Suzuki S. Glucose sensor using immobilized whole cells of Pseudomonasfluorescens II Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1979 V. 7. P. 343-350.

76. Kennedy J.F. Microbiol Cells immobilised and living on solid supports and their application to fermentatoin processes. // Ensyme Eng. 1980. V. 4. P. 323-328.

77. Keweloh H., Heipieper H.-J., Rehm H.-J. Protection of bacteria against toxyty of phenol by immobilisation in calcium alginate // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. V. 31. P. 383-389.

78. Klasen R., Bringer-Meyer S., Sahm H. Incapability of Gluconobacter oxydons to produce tartaric acid // Biotechnol. Bioeng. 1992. V. 40. P. 183-186

79. Kobatake E., Niimi T., Haruyama T., Ikariyama Y., Aizawa M. Biosensing of Benzene Derivatives in the Environment by Luminescent Escherichia coll. Il Biosens. Bioelectron. 1995. V. 10. № 6-7. P. 601-605.

80. Koenig A., Zaborosch C., Muscat A., Vorlop K.D., Spener F. 1996. Microbial sensors for naphthalene using Sphingomonas sp. Bl or Pseudomonas fluorescens WW4. Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 844-850.

81. Krug I.A., Daugulis A.J. Ethanol Production Using Zimomonas mobilis Immobilised on an Ion Exchange Resin. II Biotechnol. Lett. 1983. V. 5. № 3. P. 159-164.

82. Kulys J.J., Samalius A.S., Svirmickas G.J.S. Electron exchange between the enzyme active centre and organic metal // FEBS Lett. 1980. V. 114. P. 7-10.

83. Kumakura M., Yoshida M., Asano M. Preparation of immobilized yeast cells with porous substrates // Process Biochemisrty. 1992. V. 27. P. 225-229.

84. Layton A.C., Muccini M., Ghosh M.M., Sayler G.S. Construction of a bioluminescent reporter strain to detect polychlorinated biphenyls // Applied and environmental microbiology. 1998. T. 64. № 12. P. 5023-5026.

85. Lee C.M, Lu CJ., Chuang M.S. Effects of immobilized cells on the biodégradation of chlorinated phenols // Water Sci Technol. 1994. V. 30. P. 87-90.

86. Lenke H., Knackmuss H.-J. Initial hydrogénation and extensive reduction of substituted 2,4-dinitrophenols //Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. № 3. P. 784-790.

87. Lenke H, Pieper D.H., Bruhn C., Knackmuss H.-J. Degradation of 2,4-dinitrophenol by two Rhodococcus erythropolis strains, HL 24-1 and HL 24-2. // Appl. Environ. Microbiol. 1992 (a). V. 58. No 9. P. 2928-2932.

88. Lenke H., Knackmuss H.-J. Initial hydrogénation during catabolism of picric acid by Rhodococcus erythropolis HL 24-2. // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. № 9. 29332937.

89. Liden H., Vijayakumar A.R., Gorton L., Marko Varga G. Rapid alcohol determination in plasma and urine by column liquid chromatography with biosensor detection // J. Pharm. Biomed. Anal. 1998. V. 17. P. 1111-1128.

90. Liu J., Mattiasson B. Microbial BOD sensors for wastewater analysis // Water Research. 2002. V. 36 P. 3786-3802.

91. Lozinsky V.I., Plieva F.M. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments // Enzyme and Microbial Technology. 1998. V. 23. P. 227-242.

92. Lyngberg O.K., Thiagarajan V.r Stemke D.J., Schottel J.L., Scriven L. E., Flickinger M.C. // Biotechnol. Bioeng. 1999. V. 62. P. 44-55.

93. Marcipar A., Cochet N„ Brackenridge L„ Lebeanlt J.M. Immobolozation of yeasts on ceramic supports // Biotechnol. Lett. 1979. V. 1. P. 65-70.

94. Marvin-Sikkema F.D., de Bont J.A.M. Degradation of nitroaromatic compounds by microorganisms // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 42. P. 499-507.

95. Matsunaga T„ Kcirube I., Suzuki S. Rapid Determination of Nicotinic Acid by Immobilized Lactobacillus arabinosus // Anal. Chim. Acta. 1978. V. 99. №> 2. P. 233-239.

96. Messing R.A. Immobilised microbes and high rate, continuousw processor for high Btu gas and the reduction of pollutants // Biotechn. Bioeng. 1982. V. 24. № 5. P. 1115-1123.

97. Mitra D„ Vaidyanathan C.S. A new 4-nitrophenol 2-hydro-xylyase from a Nocardia sp. // Biochem. Int. 1984. V. 8. P. 609-615.

98. Moody G.J., Sanghera G.S., Thomas J.D.R. Amperpmetric enzyme electrode system for the flow injection analysis of glucose // Analyst. 1986. V. 111. P. 605-609.

99. Morales A., Cespedes F., Martinez-Fabregas E., Alegret S. Ethanol amperometric biosensor based on an alcohol oxidase-graphite-polymer biocomposite // Electrochimica Acta. 1998. V. 43. №23. P. 3575-3579.

100. Mulchandani P., Lei Y., Chen W., Wang J., Mulchandani A. Microbial biosensor for p-nitrophenol using Moraxella sp. //Anal. Chim. Acta. 2002. V. 470. P. 79-86.

101. Neujah H.Y., Kjellen K.G. Bioprobe Electrode for Phenol. // Biotechn. Bioeng. 1979. V. 21. № 4. P. 671-678.

102. Nilsson G.S., Andersson M., Ruzgas T., Gorton L. Oligosaccharide Dehydrogenase-Catalyzed Assay for the Determination of Polysaccharides // Analytical Biochemistry. 1998. V. 265. № l.P. 151-156.

103. Nishuda Y., Nabe K, Yanada S., Chibata I. Ensymatic Continuous Production ofN-acetil-L-metionine from N-acetil-DL-metioninamide with Erwinia carotovora Containing a New Amidase Activity. // Ensyme Mirobial Techn. 1984. V. 6. P. 85-90.

104. Nomura Y„ Ikebukuro K, Yokoyama K., Takeuchi T., Arikawa Y., Ohno S., Karube I. Application of a linear alkylbenzene sulfonate biosensor to river water monitoring // Anal. Lett. 1994. V. 27. № 35. P. 3095-3108.

105. Nordling, M., ElmgrenM., StalbergJ., PettersonJ., Lindquist S.-E. A combined cellobiose oxidase/glucose oxidase biosensor for HPLC determination on-line of glucose and soluble cellodextrines // Anal Biochem. 1993. V. 214. № 2. P. 389-396.

106. Oehrle S.A. Analysis of nitroamine and nitroaromatic explosives by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1996. V. 745. P. 233-237.

107. Okada T., Karube I., Suzuki S. Hybrid Urea Sensor Using Nitrifying Bacteria. // Eur. J. Appl. Microbiol, and Biotechn. 1982. V.14. № 3. P. 149-154.

108. Osawa H.,AMyama S., Hamada T. Proceedings of yhe 1st Sensor Symposium. 1981. P.163.

109. Oubina A., Barcelo D., Marco M.-P. Effect of competitor design on immunoassay specificity: Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for 2,4-dinitrophenol // Analytica Chimica Acta. 1999. V. 387. P. 267-279.

110. Parrish F. W. Fungal transformation of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene // Appl. Environ. Microbiol. 1977. V. 34. P. 232-233.

111. Pfeiffer D., Scheller F., Janchen M, Bertermann K. Glucose Oxidase Bienzyme Electrodes for ATP, NAD+, Starch and Disaccharides // Biochimie. 1980. V. 62. P. 587-593.

112. Purohit V., Basu A.K. Mutagenicity of nitroaromatic compounds // Chemical research in toxicology. 2000. V. 13. № 8. P. 673-692.

113. Qian Z, Tan T.C. Response characteristics of a dead-cell BOD sensor // Wat. Res. 1998. V. 32. № 3. P. 801-807.

114. Quinto M„ Ciancio A., Zambonin P.G. A molecular resolution AFM study of gold-adsorbed glucose oxidase as influenced by enzyme concentration // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1998. V. 448. P. 51-59.

115. Quinto M., Losito I., Palmisano F., Zambonin C.G. Needle-type glucose microbiosensor based on glucose oxidase immobilised in an overoxidised polypyrrole film (an in-vitro study) // Fresenius J. Anal. Chem. 2000. V. 367. № 8. P. 692-696.

116. RacekJ. Cell-based biosensors. Technomic Publishing Company Inc.; Lancaster Basel, 1995.

117. RankM., Gram J., Nielsen K. S., Danielsson B. On-line monitoring of ethanol, acetaldehyde and glycerol during industrial fermentations with Saccharomyces cerevisiae II Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 42. № 6. P. 813-817. 1995.

118. Reshetilov AN., Hiasov P. V., Knackmuss H.-J., BoroninA.M. //Anal. Lett. 2000. V. 33. № 1. P. 29-41. The nitrite oxidizing activity of Nitrobacter strains as a base of microbial biosensor for nitrite detection

119. Riedel K, Renneberg R., Wollenberger JJ., Kaiser G., Scheller F. Microbial Sensors: Fundamentals and Application for Process Control. // J. Chem. Tech. Bioiechnol. 1989. V. 44. № 2. P. 85-106.

120. Riedel K., Renneberg R., Scheller F. Adaptable microbial sensors // Analytical Letters. 1990. V. 23. № 5. P. 757-770.

121. Reiss M„ Heibges A., Metzger J., Hartmeier W. Determination of BOD-values of starch-containing waste water by a BOD-biosensor // Biosens. Bioelectron. 1998. V. 13. P. 10831090.

122. Renneberg R., Scheller F., Rieldel K, Litschko E., Richter M. Development of anti-interference enzyme layer for a-amylase measurements in glucose containing samples // Anal. Lett. 1983. V. 16 (B12). P. 877-890.

123. Renneberg R., Riedel K, Liebs P., Scheller F. Microbial and hybrid sensors for determination of a-amylase activity // Anal. Lett. 1984. V. 17 (B5). P. 349-358.

124. Reshetilov A.N., Hiasov P. V., Knackmuss H.-J., Boronin A.M. The nitrite oxidizing activity of Nitrobacter strains as a base of microbial biosensor for nitrite detection // Anal. Lett. 2000. V. 33. № l.P. 29-41.

125. Romette J.L., Yang J.S., Kusakabe H., Thomas D. Enzyme electrode for specific determination of L-lysine. Biotechnol. Bioeng. 1983. V. 25. P. 2557-2566.

126. Ryu Y.W., Navarro J.M., Durand G. Comparative Study of ethanol production by an immobilized yeast in a tubular reactor and in a multistage reactor // European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology. 1982. V. 15. P. 1-8.

127. Sankpal N.V., Joshi A.P., Kulkarni B.D. Citric acid production by Aspergillus niger immobilized on cellulose microfibrils: influence of morphology and fermenter conditions on productivity // Proc. Biochem. 2001. V. 36. № 11. P. 1129-1139.

128. Scheller F. W., Schubert F., Neumann B., Pfeiffer D., Hintsche R„ Dransfeld I., Wollenberger U., Renneberg R., Warsinke A., Johansson G. Second generation biosensors //Biosens. Bioelectron. 1991. V. 6. № 3. P. 245-253.

129. Skladal, P., Morozova, N. O., Reshetilov, A. N. Amperometric biosensors for detection of phenol using chemically modified electrodes containing immobilized bacteria I I Biosens. Bioelectron. 2002. T. 17. № 10. P. 867-873.

130. Selvaraj Y., Kumar R., Pal D.K. Changes in sugars, organic acids, amino acids, lipid constituents and aroma characteristics of ripening Mango (Mangifera induca L) fruit // J. Fd. Sci. Technol. 1989. V. 26. № 6. P. 308-313.

131. Shkotova L. K, Slast'iaE. A., Zhyliakova T. A., Soldatki, O. P., Schuhmann W„ Dziadevych S. V. Amperometric biosensor for ethanol analysis in wines and grape must during wine fermentation. Ukr. Biokhim. Zh. 2005. V. 77. № 1. P. 96-103.

132. Sinner M, Puis J. Non-corrosive dye reagent for detection of reducing sugars in borate complexion-exchange chromatography // Journal of Chromatography. 1978. V. 156. P. 197204.1.i

133. Situmorang M„ Gooding J. J., Hibbert D.B., Barnett D. Electrodeposited polytyramine as an immobilisation matrix for enzyme biosensors // Biosens. Bioelectron. 1998. V. 13. № 9. P. 953-962.

134. Smolander, M., G. Marko-Varga, Gorton, L. Aldose dehydrogenase-modified carbon paste electrodes as amperometric aldose sensors // Analytica Chimica Acta. 1995. V. 302. P. 233240.

135. Spain J. C., Gibson D.T. Pathway for biodégradation of/?-nitrophenol in a Moraxella sp. // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 812-819.

136. Spain J.C., Wyss 0., Gibson D.T. Enzymatic oxidation of p-nitrophenol // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. V. 88. P. 634-641.

137. Spanggord R.J., Spain J.C., Nishino S.F., Mortelmans K.E. Biodesradation of 2,4-dinitrotoluene by a Pseudomonas sp. // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 32003205.

138. Stahl J.D., Aust S.D. Plasma membrane dependent reduction of 2.4,6-trinitrotoluene by Phanerochaete chrysosporium II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 192. P. 471476.

139. Stergiou D.V., Prodromidis MX., Veltsistas P.G. and Evmiridis N.P. Ozone monitoring based on a biosensor concept utilizing a reagentless alcohol oxidase electrode // Anal. Chem. 2006. V. 78. № 13. P. 4676-4682.

140. Sun M., Lee C.S. Enzyme array-amperometric detection in carbohydrate analysis // Biotechnol Bioeng. 1998. V. 57. № 5. P. 545-551.

141. Svitel J., Curilla O., Tkac J. Microbial cell-based biosensor for sensing glucose, sucrose or lactose // Biotechnol. Appl. Biochem. 1998. V. 27. № Pt 2. P. 153-158.

142. Svorc J., Miertus S., Barlikova A. Hybrid biosensor for the determination of lactose // Anal. Chem. 1990. V. 62. № 15. P. 1628-1631.

143. Tanriseven A., Uludag Y. B., Dogan A novel method for the immobilization of glucoamylase to produce glucose from maltodextrin // Enzyme and Microbial Technology. 2002. V. 30. P. 406-409.

144. Tkac J., Vostiar I., Gemeiner P., Sturdik E. Monitoring of ethanol during fermentation using a microbial biosensor with enhanced selectivity // Bioelectrochemistry. 2002. V. 56. P. 127— 129.

145. Umoh E. F., Shugerl K. A flow injection system for simultaneous determination of starch and glucose concentrations // J. Chem. Tech. Biotechnol. 1994. V. 61. P. 81-86.

146. Valli K, Brock B. J., Joshi D.K., Gold M.E. Degradation of 2,4-dinitrotoluene by the lignin-degrading fungus Phanerochaete chrysosporium // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 221-228.

147. Vaidyanathan S., Macaloney G., Vaughan J., McNeil B., Harvey L. M. Monitoring of Submerged Bioprocesses // Critical Reviews in Biotechnolog. 1999. V. 19. № 4. P. 277-316.

148. Verduyn C, Van Dijken J.P., Schejfers W.A. A simple, sensitive, and accurate alcohol electrode // Biotechnol. Bioeng. 1983. V. 25. P. 1049-1055.

149. Vojtisek V., Zeman R., Barta M., Culic K., Drobnik J. Immobilised Microbial Cells as Industrial Biocatalists. // Biol. Listy. 1980. V. 44. № 3. P. 192-211.

150. Vojtisek V., Guttman T., Barta M. et al. Preparation of L-Aspatic Acid by means of immobilized Alcaligenes metalcaligenes Cells. // Biotechnol. Bioeng. 1986. V. 28. № 7. P. 1072-1079.

151. Xiao D., M.M.F. Choi. Aspartame optical biosensor with bienzyme-immobilized eggshell membrane and oxygen-sensitive optode membrane // Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 863-870.

152. Wagner K, Bilitewski U., Schmid R. D. Flow injection analysis of wine accomplishments and needs // Microchemical Journal. 1992. V. 45. P. 114-120.

153. Walters R.R., Morarty B.E., Buck R.P. Pseudomonas Bacterial Electrode for Determination of L-Histidine. // Anal. Chem. 1980. V. 52. № 11. P. 1680-1684.

154. Wang S., Li S., Yu Y. Immobilization of cholesterol oxidase on cellulose acetate membrane for free cholesterol biosensor development // Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 2004. V. 32. № 8. P. 413-425.

155. Williams S. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 15th ed. Inc. Washington DC: Association of Official Analytical Chemists. 1990. P. 702.

156. Wilson Scoggins M. Determination of trace quantities of alcohols by ultraviolet spectrophotometry of alkyl nitrobenzoates // Anal. Chem. 1964. V. 36. № 6. P. 1152 -1154.

157. Wu L., Mcintosh M., Zhang X., Ju H. Amperometric sensor for ethanol based on one-step electropolymerization of thionine-carbon nanofiber nanocomposite containing alcohol oxidase // Talanta. 2007. V. 74. P. 387-392.

158. Xiao D., Choi M.M.F. Aspartame optical biosensor with bienzyme-immobilized eggshell membrane and oxygen-sensitive optode membrane // Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 863-870.

159. Ye J., Singh A., Ward O.P. Biodégradation of nitroaromatics and other nitrogen-containing xenobiotics // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2004. V. 20. V. 117-135.

160. Zeyer J., Kocher H.P. Purification and characterization of a bacterial nitriphenol oxygenase which converts ortho-mtrophenol to catechol and nitrite // J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 1789-1784.

161. Zeyer J., Kearney P.C. Degradation of o-nitrophenol and m-nitrophenol by a Pseudomonas putida II J. Agric. Food Chem. 1984. V. 32. V. 238-242.

162. Zhang Y.-Q. Natural silk fibroin as a support for enzyme immobilization // Biotechnology Advances. 1998. V. 17. № 5-6. P. 961-971.

163. Zhou W., Baldwin R. P. Capillary electrophoresis and electrochemical detection of underivatized oligo- and polysaccharides with surfactant-controlled electroosmotic flow // Electrophoresis. 1996. V. 17. № 2. P. 319-324.

Информация о работе

Китова, Анна Евгеньевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Амперометрические микробные и ферментные биосенсоры для детекции углеводов, спиртов и нитроароматических соединений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы