Разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов с использованием бионанотехнологических подходов

Игнатов, Сергей Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов с использованием бионанотехнологических подходов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов с использованием бионанотехнологических подходов"

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

«Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

ФГУН ГНЦ ПМБ

На правах рукописи УДК 579.22.577.121

ИГНАТОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ 0046И <

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

- 2 СЕН 2010

Оболенск- 2010

004607764

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Дятлов Иван Алексеевич

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук

Гапьченко Валерий Федорович Шемякин Игорь Георгиевич Коломбет Любовь Васильевна

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет

Защита диссертации состоится 06 октября 2010 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Оболенск Серпуховского района Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «ZS » U^-t? tot. 2010 г.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим отправлять по адресу:

142279, Оболенск Серпуховского района Московской области, ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, ученому секретарю совета Н.К. Фурсовой. Факс 8(4967) 36-00-10, e-mail: fursova@obolensk.org

Ученый секретарь

диссертационного совета, /

кандидат биологических наук ¿3/---- Н.К. Фурсова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Разработка новых методов анализа в микробиологии имеет большое значение для развития науки и применения ее результатов в различных отраслях народного хозяйства. Одним из наиболее востребованных направлений в микробиологии является разработка быстрых и чувствительных методов изучения и идентификации бактерий на основе бионанотехнологий.

В настоящее время разнообразный анализ бактериальных клеток имеет большое значение в биотехнологии и медицине при создании биопрепаратов, оптимизации микробиологического синтеза продуктов и других биотехнологических процессов, а также при разработке новых методов контроля и диагностики. Наличие между клетками и измерительным прибором промежуточного звена в виде поддерживающей среды обуславливает ряд недостатков этих методов: инерционность процесса измерений и усреднение измеряемых параметров. Поэтому электрооптический метод анализа, основанный на исследовании клеток как электрофизических объектов со слоистой структурой и измерении поляризационных характеристик клеточных структур, представляет собой новый подход к оценке прижизненных физиологических параметров клеток и их гетерогенности (Guliy et al., 2007). Различие электрических свойств среды культивирования (поддерживающей среды) и бактериальных клеток приводит к появлению индуцибельных зарядов при наличии поля. Взаимодействие индуцированных зарядов с электрическим полем является причиной возникновения вращательного момента, задающим ориентацию клеткам. Изменение ориентации бактериальных клеток приводит к изменению оптических свойств суспензии. Оптическая плотность суспензии может изменяться на 1-2%, однако этого достаточно для электрооптического анализа бактериальных клеток (Bunin and Angersbach, 2008). Этот метод измерений является прижизненным, он не использует дополнительных меток и не вызывает изменений в исследуемом объекте. Преимуществом данного метода яв-

ляется то, что влияние среды на точность измерения поляризационных параметров является незначительным и предсказуемым. Воздействие на бактериальные клетки измерительной процедуры также незначительно, и при этом микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность. С помощью электрооптического метода возможно определить количество и жизнеспособность бактерий. Метод является оперативным, причем процесс измерений может быть полностью автоматизирован.

Применение электрооптического метода для оценки состояния микроорганизмов в ходе технологического процесса и для анализа взаимодействия бактерий со специфическими антителами и фагами является актуальной и будет раскрыта в данной работе

систем на основе оптоволоконных пучков для идентификации бактерий. Перспективным направлением является разработка биосенсора для анализа антиоксидантной активности веществ с последующим изучением их влияния на защитные функции макроорганизма.

Бионанотехнология - современная биологическая наука, оперирующая наноразмерными объектами. Возможности получения нанообъектов и способность анализировать их качественно изменяют уже существующие подходы в исследованиях. Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) получила такое название благодаря ключевому элементу, обязательно присутствующему во всех её модификациях — зонду (Cuenat, 2010). Микроскопический зонд двигается, как правило, построчно вдоль поверхности исследуемого образца, взаимодействуя с ним таким образом, что становится возможным детектировать количественную характеристику этого взаимодействия, которая, в конечном счёте, и несёт информацию о свойствах объекта. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) принадлежит к семейству проксимальной зон-довой микроскопии для анализа поверхности и ее свойств на атомно-молекулярном уровне. В течение последних десятилетий достигнут большой прогресс в развитии АСМ как инструмента изучения нанообъектов в микробиологии (Dufrene 2002, Dufrene et al., 2009). С помощью АСМ можно получить трехмерное изображение поверхностных ультраструктур на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях путем анализа взаимодействия между анализируемой поверхностью и специальным наконечником - кантилевером. Однако все исследования с применением АСМ в основном сводились лишь к наноразмерному анализу бактериальной поверхности. До проведения настоящей работы не была осуществлена специфическая иммобилизация вирусов и бактериальных клеток и/или их на-нофрагментов для анализа и идентификации бактерий.

Важным аспектом бионанотехнологии является определение бактерицидной активности наносоединений (Nel et al., 2006). Следует учитывать, что

наряду с этим, важна также их роль в функционировании макрофагов при фагоцитозе патогенов.

Бионатехнологии открывают новые перспективы для значительного увеличения чувствительности анализа и идентификации микроорганизмов. Результаты работы очень важны для микробиологии, поскольку существенно расширяют и дополняют представления о методах идентификации прокариот и вносят существенный вклад в понимание процессов анализа бактериального мира.

Цель исследования

Основной целью работы является разработка и применение новых высокоэффективных методов изучения и идентификации бактерий на основе элетрооптических, биосенсорных и бионанотехнологических подходов.

Задачи исследования

1. Разработка электрооптического метода для анализа и контроля физиологического состояния бактерий и их выживаемости в ходе биотехнологических процессов.

2. Выявление электрооптических изменений микробиологических систем, которые могут служить удобным инструментом идентификации микроорганизмов при анализе взаимодействия бактерий со специфическими антигенами и фагами.

3. Разработка биосенсоров с применением системы искусственного носа на основе высокоплотных оптоволоконных пучков для бесконтактной идентификации микроорганизмов.

4. Изучение возможности использования глюкозного биосенсора для контроля синтеза авермиктина.

5. Разработка биосенсоров на основе бактериальных клеток или их фрагментов для определения глюкозы, лактата и определения концентрации бактерий.

6. Разработка биосенсора для определения антиоксидантной активности веществ.

7. Определение наличия микроорганизмов по анализу летучих компонентов бактериальной культуры. Изучение возможности использования простой модификации метода спектрофотометрического анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов либо по выделению ими летучих компонентов, либо по их поглощению из окружающей среды.

8. Получение аффинных поверхностей и их анализ для использования бионанотехнологического подхода на основе атомно-силовой микроскопии для высокоспецифичной идентификации микроорганизмов.

9. Изучение токсического действия наносоединений на микроорганизмы.

Научная новизна

Разработан электрооптический метод диагностики физиологического состояния бактериальных клеток в процессе производства биологических препаратов и идентификации бактерий.

Впервые предложено использовать цитоплазматические мембраны бактерий для конструирования новых биосенсоров для определения лактата и оценки бактериальной обсемененности свежего коровьего молока. Использованы новые подходы для определения антиоксидантной активности веществ и их роли в ходе инфекционного процесса. Разработан новый простой метод определения бактерий по анализу органических летучих компонентов.

Впервые разработана система специфической визуализации прокариот с помощью АСМ. Предложены методы оценки бактерицидной активности наносоединений.

Практическая значимость

биосенсорами на основе бактериальных клеток. Реализована методология специфической визуализации прокариотических клеток и их фрагментов для сверхчувствительной идентификации микроорганизмов с помощью АСМ на основе аффинных поверхностей (Патент России RU 2261279 С1). Разработанные методические рекомендации широко используется Институтом теоретической и экспериментальной физики (г. Москва) в вопросе исследования микроорганизмов с помощью атомно-силовой микроскопии. Разработан метод оценки бактерицидной активности наносоединеий для микроорганизмов и фагоцитарной активности макрофагов (готовится заявка на патент). Результаты работы применяются Национальным исследовательским технологическим университетом «МИСиС» при разработке новых видов нанопокрытий с учетом их бактерицидных свойств и функциональной активности фагоцитов.

Личный вклад соискателя

Соискателю принадлежит решающая роль в выборе направлений исследований, в формулировании проблемы, постановке целей и задач, разработке экспериментальных подходов и обобщении результатов. Соискатель принимал участие во всех этапах исследований. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель принимал участие в проведении экспериментальной работы, в обобщении и интерпретации научных результатов, в подготовке научных публикаций, а также выступал с научными докладами.

Апробация работы

родном рабочем совещании НАТО «Новые направления в развитии биосенсоров» (Киев, 1998 г.), на международной конференции «Биокатализ-98» (Пущино, 1998 г.), на международной конференции «Биокатализ-2000» (Москва, 2000 г.), на Всероссийской конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии», (Оболенск, 1999 г.), на международной конференции «Современные проблемы биохимии и биотехнологии бактерий» (Пущино, 2000 г.), на международной конференции «Биосенсоры 2000» (Сан-Диего, США, 2000 г.), на международной конференции «Окись азота: фундаментальные исследования и применение в клинике» (Эриче, Италия, 2001 г.), на международных конференциях «IT + ME» (Гурзуф, 2003 г., 2007 г.), на международной конференции «Канадский биологический коллоквиум» (Москва, 2004 г.), на 5 международном совещании МНТЦ/Корея (Сеул, Корея, 2004 г.), на 37 международном совещании МНТЦ-Япония по наноматериалам (Цукуба, Япония, 2004 г.), на международной конференции «Нанотех» (Бостон, США, 2006 г.), на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ" (Оболенск, 2006 г.), на IX ежегодном зимнем совещании «Успехи в исследованиях на молекулярном уровне для биологии и нанонауки» (Линц, Австрия, 2007 г.), на Первой Всероссийской Школе-семинаре «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2007 г.), на Международной конференции «Сенсоры для окружающей среды, здравоохранения и безопасности (Виши, Франция, 2007 г.), на IV международной конференции «НаноБио и другие новые перспективные биотехнологии» (Пущино, 2007 г.), на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 2007 г.), на Международном совещании экспертов по разработке лекарств (Москва, 2007 г.), на Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008 г), на Международной научно-практической конференции «Нанотехнологии в сельском хозяйстве» (Москва, 2008 г.), на Международ-

ной конференции «Евромат-2009» (Глазго, Великобритания, 2009 г.) и на Семинаре «Производство и применение наноматериалов в России: токсикологическое воздействие и нормативные вопросы" (Москва, 2009 г.).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 229 страницах, содержит 11 таблиц, 88 рисунков. Список литературы включает 223 работы.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 74 печатные работы, 18 из которых представлены в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, издана одна монография, получен один патент, приняты две заявки на патент.

Место выполнения работы

Работа проводилась в ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск) в рамках НИР и международных проектов.

Основные защищаемые положения

1. Электрооптический метод анализа бактерий позволяет контролировать физиологическое состояние бактерий и их выживаемость в ходе биотехнологических процессов.

2. Новые биосенсоры на основе системы искусственного носа, ферментов, фагов, бактериальных клеток или их фрагментов увеличивают чувствительность и скорость определения глюкозы, лактата и определения концентрации бактерий в анализируемой системе.

3. Использование бионанотехнологического подхода на основе атомно-силовой микроскопии (АСМ) совместно с получением аффинных поверхностей повышает чувствительность выявления микроорганизмов и их идентификации.

4. Применение АСМ позволяет более нативно анализировать аффинные взаимодействия в микробиологии.

5. Токсичность наноматериалов может оцениваться с помощью микробиологических приемов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследований

В работе использовали бактерии Escherichia coli. Micrococcus luteus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Acetobacter aceti, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pseudotuberculosis, Streptomyces avermitilis и ac-комицет Neurospora crassa. Для индукции специфических ферментативных активностей микроорганизмы культивировали на минимальных средах с различными источниками углерода. Мицелий аскомицета выращивали на модифицированной среде Фогеля, содержащей минеральные соли, сахарозу и биотин.

Выделение мембран проводили путем осмотического лизиса сферопла-стов (Игнатов и др. 1981), полученных после обработки клеток лизоцимом с последующей промывкой центрифугированием при охлаждении. Путем субстратной индукции получали цитоплазматические мембраны (ЦПМ) с заранее заданными ферментативными свойствами. Наличие нативной иммобилизации ферментативных ансамблей в липидном бислое обеспечивает более стабильную и чувствительную систему анализа. Поверхностный заряд ЦПМ изменяли, используя положительно заряженные цетилтриаммоний бромид и полилизин и отрицательно заряженные додецилсульфат натрия и полиаспа-рагиновую кислоту.

Для проведения криоиммобилизации клетки и мембраны смешивали с заранее приготовленным 10 %-ным раствором поливинилового спирта. Суспензию раскапывали по пластиковой поверхности и помещали в холодильник для формирования криогеля. После 24 ч экспозиции при низкой температуре гранулы иммобилизованных клеток и мембран оттаивали, промывали несколько раз фосфатным буфером (pH 7,4) и хранили в нем. Приготовлен-

ные заранее навески иммобилизованных биокатализаторов использовали для детекции соответствующих активностей.

Для размножения и титрования фагов использовали полужидкий L-arap с 0,4 %-ной глюкозой. Для экспериментов использовали заранее размноженные фаги в концентрации - 101О-10" частиц/мл.

Исследования антиоксидантной активности соединений проводили в электрохимической ячейке, имеющей трехэлектродную конфигурацию. Ячейка объемом 1мл включала Ag/AgCl/ 1М КС1 электрод сравнения и Pt обратный (рабочий) электрод. Циклическую вольтаметрию осуществляли с использованием системы "Автолаб". Для измерения антиоксидантной активности модифицированный золотой электрод поляризовали при +150мВ по отношению к Ag/AgCl. В качестве потенциостата использовали «Биоанализатор» фирмы Kreijci Engineering (Чехия).

При определении лактата для приготовления чувствительной к кислороду волоконно-оптической системы готовили тонкую силановую пленку с чувствительным к кислороду флуоресцентным красителем, рутений дифе-нилфенантролином, которую механически крепили на конце оптического волокна. Пленку готовили путем приготовления фотополимеризующего раствора, содержащего мономер силоксана, раствора красителя и индуктора на поверхности чашки. При помощи УФ лампы индуцировали полимеризацию раствора и механическое включение красителя в полимер. Полимерную пленку помещали в раствор дистиллированной воды и хранили в темноте перед использованием. На поверхность этого чувствительного к кислороду слоя помещали препарат ЦПМ, адсорбированный на целлюлозном диске. Всю конструкцию крепили на оптическое волокно нейлоновой сеточкой с помощью резинового кольца.

АСМ-измерения проводили на атомно-силовом микроскопе Nanoscope Illa (Digital Instruments, США) в режимах постоянного и прерывистого контакта. При измерениях в контактном режиме сканирования использовали коммерческие кантилеверы из нитрида кремния (Si3N4) с жёсткостью 0,06,

0,32, 0,58 и 0,12 Н/м (в зависимости от объекта). Для измерений в режиме прерывистого контакта на воздухе использовали коммерческие кантилеверы из кремния с номинальной жесткостью 42 Н/м. Резонансная частота сканирования лежала в диапазоне 280-310 кГц. Измерения в жидкости проводили с использованием жидкостной ячейки (Digital Instruments, США) для режима прерывистого контакта, применяя коммерческие кантилеверы из нитрида кремния жесткостью 0,58 Н/м, при частоте сканирования 8-10 кГц.

Мышиные перитонеальные макрофаги получали путем инъекции стерильного раствора NaCl (0,9 %) в перитонеальную область мышей. После абдоминального массажа собирали перитонеальную жидкость, которую помещали на покровное стекло в присутствии среды 199 с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой в стерильной чашке Петри с нанообразцами. Затем добавляли 100 мкл бактериальной суспензии (106 клеток/мл) и культивировали 2 час при 37 °С. После инкубации монослой макрофагальных клеток на покровном стекле фиксировали этанолом и окрашивали по Романовскому. Изменения бактерицидной активности макрофагов изучали с помощью светового микроскопа Olympus ВХ41.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 1 Электрооптические методы исследования

На примере клеток Е. coli и В. thuringiensis показана эффективная возможность оценки жизнеспособности бактерий на основных этапах биотехнологического производства биопрепаратов - этапах ферментации, концентрирования и сушки. На получение и обработку электрооптических данных уходит не более 20 мин. При определении интактных клеток учитывался тот факт, что в интервале 7,5 < lgf0 < 7,8 (где f0 частота задаваемого поля) электрооптический сигнал практически равен нулю. Оценку инактивирующего воздействия оценивали (в %) путем сравнения величины электрооптического эффекта (ЭОЭ) до и после воздействия в выбранном нами интервале частоты электрического поля. Электрооптические результаты сравнивали с результа-

тами, полученными путем высева бактериальных клеток на твердые питательные среды, с последующим подсчетом колониеобразующих единиц (КОЕ). Как видно из табл. 1, электрооптический метод позволяет аккуратно и быстро оценить жизнеспособность микроорганизмов после определенного экстремального воздействия.

Таблица 1 - Изменение ЭОЭ и жизнеспособности клеток Е.соИ и В. Лиг-на этапах ферментации, концентрирование и сушки_

Биотехнологический этап Е. coli В. thuringiensis

Выживаемость клеток, % ЭОЭ, % Выживаемость клеток, % ЭОЭ, %

Инокулят 100 100 100 100

Ферментация 80±8 78±8 82±8 80±8

Концентрирование 67±8 65±8 68±8 67±8

Сушка 13±7 9±7 40±7 39±7

Небольшое занижение результатов выживаемости бактериальных клеток, получаемое электрооптическим методом, объясняется тем, что данный метод регистрирует как летальные, так и сублетальные повреждения бактерий. Данные повреждения и их репарация детально исследованы при изучении замораживания и оттаивания клеток, а также при их лиофилизации. Оказалось, что при замораживании-оттаивании активность мембраносвязанных оксидазных и дегидрогеназных ферментов, а также содержание цитохромов не меняется. Не наблюдается также структурных перестроек в липидной фазе мембраны и изменений в ее липидном составе. Однако замораживание-оттаивание вызывает повреждение целостности клеточного барьера, с последующим разобщением окислительного фосфорилирования. В ходе восстановительных процессов (репарации) после экстремальных воздействий наблюдается восстановление целостности клеточного барьера, с последующим восстановлением синтеза АТФ в ответ на искусственно созданную протондви-жущую силу.

Выбор электрофизических параметров эксперимента определялся тем, чтобы для данного вида микроорганизмов электрооптический сигнал успевал за минимально возможное время достичь максимума при включении поля и

вернуться к исходному уровню при его выключении. Измерение поляризационных параметров клеток как функции частоты электрического поля или частотной дисперсии анизотропии поляризуемости (ЧДАП) - позволяет определить физиологическую активность клеток. После оптимизации состава поддерживающей среды и электрофизических параметров электрооптических измерений было изучено влияние реакции антиген-антитело на ЧДАП комплекса микроорганизм - антитело. К суспензии бактерий (Е. coli или S. enteritidis) в фосфатно-солевом буфере добавляли раствор антител, специфичных, соответственно, к Е. coli или S. enteritidis. Полученную смесь инкубировали 20 мин при 37 °С и легком помешивании. Полученную суспензию помещали в измерительную ячейку электрооптического анализатора. Под действием переменного электрического поля (напряженность Е=100 в/см; время действия t=2 сек.; диапазон частот f=10-30000 кГц) происходили изменения оптических свойств суспензии, которые регистрировали в виде ЧДАП (рис. 1-2). В качестве контроля использовали бактерии, не взаимодействовавшие с антителами.

Рисунок 1 - ЧДАП суспензии бактерий Е. coli после взаимодействия со специфическими антителами

На основании полученных результатов можно дать некоторую оценку электрофизических и морфометрических параметров полученных комплексов ан-

тиген-антитело. Общее снижение амплитуды электрооптического сигнала в присутствии антител может быть следствием образования конгломератов бактериальных клеток. Сдвиг максимума ЧДАП в область низких частот указывает на возможное нарушение целостности бактериальных мембран.

500 1 450 • ОТ. ед. —•—S.e. •-■■-• -S.e.- AT

♦00 ■ 350 ■ / \ /.'' я \

300 ■ /■-'* \

250 у ■ \

200 / т

160 ■ Г (Д

100 ■-»■■'j

50 0 'W1*^ kHz

10 100 1000 10000 100000

Рисунок 2 - ЧДАП суспензии бактерий 5. еМегШсНз после взаимодействия со специфическими антителами

Рисунок 3 - ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии клеток E.coli 057 с фагом V18/A157

Была изучена возможность использования электрооптического метода для идентификации микроорганизмов путем анализа специфического взаимодействия микробных клеток с бактериофагом. На рис. 3 представлены ЧДАП контрольной суспензии бактерий Е. coli и ЧДАП тех же бактерий по-

еле 30-минутной инкубации с фагом V18/A157. На рис. 4 показаны ЧДАП контрольной суспензии S. eníeriditis и суспензии тех же бактерий после 30-минутной инкубации с фагом 39. Здесь же представлена ЧДАП суспензии бактерий S. eníeriditis после 30-минутной инкубации с фагом V18/A157 -специфичным для Е. coli, очевидно, невзаимодействующим с бактериями S. eníeriditis. Полученные данные подтверждают возможность использования бактериофагов для идентификации микроорганизмов.

Рисунок 4 - ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии клеток S. enteriditis с фагами VI 8/А157 и 39

При исследовании взаимодействия клеток ß. thuringiensis с фагом Vf, было обнаружено, что если проводить инкубацию бактерий с фагом без аэрации (как в вышеуказанных случаях с Е. coli и S. enteriditis), то даже спустя 90 минут не наблюдается существенного изменения ЧДАП (рис. 5).

Однако при инкубации клеток В. thuringiensis с бактериофагом Vf в условиях аэрации результаты получаются сходными с теми, которые были получены при изучении взаимодействия с фагами факультативно анаэробных бактерий Е. coli и S. enteriditis (рис. 6). Через 60 мин инкубации бактерий с фагами ЧДАП практически исчезает, что указывает на драматическое нарушение целостности бактериальных оболочек в этих условиях определения.

Рисунок 5 - ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии клеток В. //шп'н£геи.п'.у без аэрации с фагом

1600 —Ф— В.(контроль

1400- £ В.1.М

1200

1000-

800 •

600 -

400

200- ____ А \

-200- 10 100 1000 10000 100000

Рисунок 6 - ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии клеток В. при аэрации с фагом

Для улучшения измерения ЭОЭ при низкой величине напряженности ориентирующего поля был разработан численный алгоритм определения анизотропии поляризуемости бактериальных клеток, снимающий существенные ограничения на проведение эксперимента.

Глава 2 Биосенсоры

Целью данной части работы является разработка новой генерации биосенсоров на основе системы искусственного носа, ферментов, фагов, бактериальных клеток или их фрагментов для увеличения чувствительности и скорости определения глюкозы, лизина, лактата, а также для определения концентрации бактерий.

2.1 Бесконтактное определение микроорганизмов

Разработан бесконтактный метод определения бактерий с применением системы искусственного носа на основе высокоплотных волоконно-оптических биосенсорных пучков. Принцип определения бактерий основан на анализе воздушного пространства над образцом для определения летучих компонентов (ЛК). Известно, что выделяемые бактериями ЛК определяют специфический запах бактерий, что может служить характерным признаком данной бактерии. Сенсорным элементом являются полистирольные микросферы с флуоресцентным красителем интерколированные в проксимальный конец волоконной системы. ЛК способны влиять на микроокружение микросфер, изменяя флуоресцентные характеристики красителя. Таким образом, анализируя летучие вещества, можно идентифицировать бактерии (рис. 7).

м* (>.>

8 *

щщ

•и

Шы

соН

....

0Вода

Среда

•V'

В. эиЬШй „ №

да •

о¿г

02Я

к. . ц : ■ . . ________

Рисунок 7 - Бесконтактная идентификация бактерий при использовании системы искусственного носа

Развивая данный подход, была показана принципиальная возможность использования простой модификации метода спектрофотометрического анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов либо по выделению ими ЛК, либо по их поглощению из окружающей среды. Кроме того, данный метод позволяет различить мутанты N. сгазза, дефектные по метаболизму азота, от штамма дикого типа. По-видимому, пИ-2 и пИ-6 гены гриба связаны с образованием ЛК у этого организма.

2.2 Биосенсор для определения глюкозы

Биосенсоры представляют собой недорогую альтернативу классическому анализу веществ в ходе биотехнологических процессов. Антибиотик авермиктин играет большую роль как в медицине, так и в ветеринарии. Он продуцируется бактериями 5. тегтШШ в ходе процесса длительного культивирования (72 ч). Характерно, что максимальный выход этого антибиотика наблюдается в короткий промежуток времени при минимальной концентрации глюкозы в среде. Для оптимизации условий выделения антибиотика важно определить минимальную концентрацию глюкозы в среде очень быстро, так как авермиктин быстро распадается при отсутствии глюкозы. Был разработан глюкозный биосенсор для контроля концентрации авермиктина. Для приготовления глюкозного модуля использовали бычий сывороточный альбумин, глюкозооксидазу и глутаровый альдегид. Глюкозный модуль помещали на торец р02-электрода. Линейный ответ биосенсора наблюдали в диапазоне концентраций глюкозы от 1 до 30 мМ. Данная система очень перспективна для быстрого определения глюкозы в среде культивирования бактерий с целью увеличения выхода антибиотика.

2.3 Разработка бисенсорной системы узнавания на основе бактериальных клеток и их фрагментов с помощью криоиммобилизацин

Бактериальные клетки можно рассматривать как систему, содержащую различные ферменты в их естественном окружении, для конструирования биосенсоров. Такая биокаталитическая система на основе бактерий осуществляет ферментативные реакции в оптимальных, естественных условиях, и,

как ожидается, будет более стабильной по сравнению с ферментами, полученными путем выделения и очистки. Для создания потенциально новых систем биологического узнавания на основе бактериальных клеток и их фрагментов исследовали три типа бактерий со специфически индуцированными ферментативными системами. Для индукции лактатоксидазной системы культивировали штаммы Е. coli и М. luteus в среде, где в качестве источника углерода использовали соли лактата. Клетки А. aceti выращивли в анаэробных условиях для индукции этанолоксидазной системы.

На примере метода криоиммобилизации были отработаны методы иммобилизации бактериальных клеток и их фрагментов. Сущность метода состоит в замораживании микробных клеток в растворе поливинилового спирта, в ходе которого происходит формирование макро- и микроструктуры матрицы криогеля, при этом поликристаллы замороженного растворителя выступают в роли порообразователей. Получаемые гранулы (пленки) обладают, наряду с высокой пластичностью, достаточно высокой механической прочностью. Матрица криогеля, будучи высокопористой структурой, не создает диффузионных затруднений для основной массы соединений.

Установлено, что удельная респираторная активность иммобилизованных клеток и мембран бактерий была постоянной во всех образцах и не зависела от величины навески, а количество потребляемого кислорода в реакционной ячейке зависело от количества иммобилизованного биокатализатора.

2.4 Биосенсоры на основе ЦПМ

Цитоплазматические мембраны (ЦПМ) бактерий представляют собой липидный бислой с инкорпорированными белками. Бактериальные ЦПМ играют важную роль в многочисленных биологических процессах, таких как дыхание и перенос энергии. Способность индукции определенных ферментативных систем в ЦПМ в ходе культивирования бактерий делает мембраны весьма привлекательным инструментом при конструировании биосенсора путем выделения таких мембраносвязанных ферментативных комплексов с

последующей иммобилизацией их на твердой подложке с сохранением на-тивности и биологической активности.

Была изучена возможность модификации поверхностного заряда ЦПМ бактерий для дальнейшего изучения его влияния на чувствительность и стабильность биосенсорного узнающего элемента. Для этого мы использовали модификаторы поверхностного. заряда: цетиптриметиламмоний бромид (ЦТАБ) (положительно заряженный) и додецилсульфат натрия (SDS) (отрицательно заряженный). Первоначально было показано, что добавление ЦТАБ в диапазоне концентраций 10-50 мкМ увеличивает потребление кислорода ЦПМ бактерий в присутствии НАДН, отрицательно заряженного субстрата дыхания. Добавление же SDS в диапазоне концентрации 10-50 мкМ в этих же условиях, наоборот, уменьшало потребление кислорода мембранами. По-видимому, данное изменение потребления кислорода ЦПМ и связано с электростатическим взаимодействием заряженного субстрата с заряженной поверхностью бактериальных мембран. Для доказательства наличия зарядовой модификации поверхности мембран мы решили оценить изменения поверхностного заряда с помощью положительно заряженного флуоресцентного зонда disC и отрицательно заряженного флуоресцентного зонда ANS. В качестве модификаторов поверхностного заряда мы использовали ЦТАБ и SDS. Добавление к мембранам положительно заряженного модификатора ЦТАБ увеличивало интенсивность флуоресценции отрицательно заряженного зонда ANS. В свою очередь, добавление отрицательно заряженного модификатора SDS уменьшало интенсивность данного флуоресцентного зонда.

Таким образом, была установлена возможность модификации поверхностного заряда бактериальных ЦПМ с помощью положительно заряженного модификатора ЦТАБ и отрицательно заряженного модификатора SDS. Дальнейшие исследования показали, что поверхностный заряд является барьером проницаемости мембранного аппарата для заряженных субстратов и должен учитываться при конструировании биологической системы узнавания биосенсора.

2.5 Оптоволоконный биосенсор для определения лактата на основе ЦПМ

Лактат является важным метаболитом при анализе пищи, поэтому для его определения создано большое количество биосенсорных измерителей. Данные подходы анализа лактата требуют присутствия НАДН или ДЕАЕ-декстран:лактинола, а также присутствия термостабильной пероксидазы из сои. Нестабильность таких комплексов и необходимость присутствия коэн-зимов существенно ограничивают их практическое применение.

Держатель ЦПМ и силановая РЕЕК трубка

250 мкм оптическое волокно

нейлоновая сеточка

Рисунок 8 - Схема волоконно-оптического биосенсора для определения лактата

В нашей работе описана конструкция волоконно-оптического биосенсора, основанного на новом типе биологического узнающего элемента - бактериальных цитоплазматических мембран (ЦПМ). В качестве вторичного преобразователя использовали волоконно-оптический сенсор для определения кислорода, а в качестве биологического узнающего элемента - ЦПМ. В результате такой комбинации был сконструирован новый тип биосенсора для определения лактата (рис. 8). Его специфичность оценивали по влиянию таких биологически важных соединений как глюкоза, фруктоза и глутаминовая кислота на сигнал прибора.

На рис. 9 видно, что присутствие данных субстратов в концентрации 50 мМ не влияет на определение лактата. Нами было обнаружено, что кова-лентное связывание чувствительного к кислороду слоя красителя на поверх-

о,- -

+ 50 mM

« в - , ,. Г.тгтамоновая /

+ э0тМ кислота / о? . Глюком | у

I п, " +2.5шМ

в ол + ?0тМ

= . лактат

£ «PpvKToia

О 0.2 • 0.1 ■

0.0--1---1-1-

О Л 6 9 12 I?

Время (min)

Рисунок 9 - Специфичность лактатного биосенсора к другим субстратам

ность оптического волокна улучшает механическую стабильность сенсора. Другие инструментальные приспособления при конструировании данного сенсора не оказывали значительного влияния на его ответ. Таким образом, была показана способность конструирования биосенсора на основе ЦПМ бактерий. Полученный биосенсор специфически реагирует с лактатом и нечувствителен к наличию в среде измерения таких субстратов как глюкоза, фруктоза и глутаминовая кислота. Уникальная организация ЦПМ совместно с высокой чувствительностью волоконно-оптической системы позволяет применять данные сенсоры как для анализа активных субстратов, так и для косвенного определения бактериальных клеток.

Для определения лактата в молоке был разработан биосенсор на основе бактериальных цитоплазматических мембран (ЦПМ). Нативная организация ферментативных комплексов в липидных бислоях ЦПМ обеспечивала стабильность и высокую чувствительность узнающего элемента биосенсора.

Для подсчета бактериальных клеток в свежем молоке коровы его образцы высевали на плотные питательные среды и подсчитывали колонии после 18 час инкубации. С помощью биосенсора удалось установить корреляцию между концентрацией лактата в молоке и его бактериальной обсемененно-

+ 50 mM

л. -п «г Глутаминовая

+ э0тМ кислота Глюком I

' + 2.5 mM

J*0nAI лактат Фрукточа

стью. Концентрация лактата в молоке, равная 5 мМ, соответствует 0,3x106 клеток/мл. После 3 ч инкубации при 37 °С концентрация лактата составляла 10 мМ, а бактерий -106 клеток/мл; после 6 час инкубации - 20 мМ лактата и 107 клеток/мл. С помощью нашего биосенсора можно определить критическую точку, характеризующую качество молока, которая соответствует концентрации бактерий 106 клеток/мл или 10 мМ лактата.

2.6 Амперометрический биосенсор для определения аитиоксидант-ной активности

На рис. 10 представлена схема определения антиоксидантной активности различных субстратов. нА 3 4 5 6

и н

Рисунок 10 - Схема отклика сенсорного электрода на образование супероксида при добавлении антиокисиданта и супероксиддисмутазы. 1 - добавление 100 мМ гипоксантина; 2 - добавление ксантиноксидазы, 50 мЕ/мл; 3,4,5 - добавление антиокисиданта; 6 - добавление супероксиддисмутазы, 2 Е/мл. А, А' и А"- понижение сигнала при различной концентрации антиокисиданта в среде

Как известно, антиоксиданты предохраняют организмы от вредного воздействия активных форм кислорода. Поэтому использование биосенсорного подхода для регистрации антиокидантных свойств веществ нашло важное

применение в медицине и пищевой промышленности. Для определения анти-оксидантной активности различных веществ показана высокая эффективность использования супероксидно-специфического амперометрического биосенсора (рис. 10).

Антиоксидантная активность субстратов представлена в табл. 2.

Таблица 2 - Антиоксидантная активность субстратов, где 150 ^.ас - концентрация аскорбиновой кислоты, вызывающая 50% ингибирование генерации супероксида, Г 50- концентрация субстрата, вызывающая 50% ингибирование генерации супероксида, Е мсдс - Единицы аскорбиновой кислоты (I 50

Вещество Сигнал I 50 As.ас, I 50, Е asc.ac

электрода, нА мкМ иМ

(-) Эпигаллокатехин 0,8 9,0 83,7 107,5

(+) Катехин 0,4 9,6 600,0 16,0

(+/-) Катехин 0,8 V 9,0 277,0 32,4

Пирогаллол 0,8 9,0 262,7 34,3

Мирицетин 0,6 7,7 454,7 17,0

Кверцетин 0,7 4,8 2400,0 2,0

Танниновые кислоты 0,8 6,6 473,0 14,0

Исследование данных веществ показало их высокую антиоксидантную активность. Установлено, что обработка бактериальных клеток данными ан-тиоксидантами частично предотвращает их элиминацию в мышиных макрофагах.

Глава 3 Бионанотехнологические подходы исследования в микробиологии

3.1 АСМ микроскопия вирусов

Вирусы были выбраны для исследования как наименьшие живые биологические структуры. Существует два метода иммобилизации вирусов: специфическая и неспецифическая. Неспецифический метод заключается в нанесении капли вирусной суспензии на поверхность. Специфический метод основан на предварительной модификации поверхности специфическими антителами. Стандартные методы получения монослоев вирусных антител базируются на ковалентном связывании антител с поверхностью. Хорошо известно, что монослои антител и ферментов могут терять свою активность.

Чтобы этого не происходило, используют амфифильные полиэлектролиты и липиды. Был разработан метод с использованием лэнгмюровских пленок антител на амфифильном полиэлектролите для иммобилизации ротавирусов и аденовирусов с последующей визуализацией методом АСМ. Аденовирусы и ротавирусы - важные патогены человека. На рис. 11 представлены АСМ изображения аденовирусов и ротавирусов, полученные с помощью неспецифической иммобилизации.

А Б

Рисунок 11 - АСМ изображение аденовирусов (А) и ротавирусов (Б) на поверхности. Справа показан вертикальный профиль поверхности

Такие образцы очень нестабильны и быстро разрушаются при хранении. Чтобы повысить специфичность и стабильность иммобилизованных вирусов, использовали антитела для их специфического связывания с поверхностью. Для этого применяли лэнгмюровские пленки антител на амфифильных электролитах - полиэтиленимине и полибензилгистидине. Применение таких электролитов делает возможным предохранение конформации белковой глобулы от действия инактивирующих факторов на границе раздела фаз воздух/вода и приводит к усилению взаимодействий между компонентами лэнгмюровских пленок. Были протестированы различные условия образования монослоев полиэлектролитов. В качестве критерия использовали степень шероховатости получаемых пленок. В случае полибензилгистидина стало возможным получать пленки толщиной 1,5-2 нм и шероховатостью 0,2 нм, что в результате приводит к увеличению аффинности пленок полимер/антитело.

После месяца хранения при +5 °С пленки антител оставались целыми, сохраняя свою иммунную активность. Для определения толщины получен-

ной пленки антител специально разрушали небольшую область ее поверхности. Разница в высоте разрушенного и целого слоев интерпретировалась как толщина пленки, которая составляла 8-12 нм в зависимости от выбранной области и материала субстрата (рис. 12).

шшш ш&зш

Рисунок 12 - Пленка аденовирусных антител на поверхности подложки. Слева (А) показан участок пленки, специально разрушенный для оценки толщины пленки. Справа (В) показана нативная пленка

Используя этот подход, можно получать специфически иммобилизованные аденовирусы и ротавирусы. На рис. 13 представлены АСМ изображения ротавирусов и трехмерное изображение аденовирусов.

А Б

Рисунок 13 - АСМ изображение ротавирусов (А), и трехмерное АСМ изображение аденовирусов (Б), специфически связанных с пленкой соответствующих антител, образованной на амфифильном полимере

3.2 АСМ микроскопия бактерий

Существует множество методов исследования бактерий. Качественную и количественную характеристики бактериальных клеток можно получить методами световой и электронной микроскопии, фотоэлектронной микроскопии Х-лучей, ИК-спектроскопии, измерениями контактного угла и элек-трофоретической мобильности. Однако многие из этих методов требуют спе-

циальной подготовки и условий вакуума во время анализа и не могут быть использованы для нативных исследований. В последние годы в микробиологии открыт новый способ исследования бактерий. АСМ микроскопия обеспечивает получение 3D изображения поверхностных ультраструктур с молекулярным разрешением, в режиме реального времени и физиологических условиях. Поверхность живых бактериальных клеток - это очень сложная гетерогенная структура, содержащая липидные, белковые и углеводные компоненты. Организация некоторых мембранных областей играет важную роль во взаимодействии клеток с поверхностью и между собой. Вместе с тем, несмотря на то, что ультраструктура микробной поверхности изучается методом электронной микроскопии уже более 30 лет, прямой информации о ее строении в нативном состоянии получить таким способом нельзя. Понимание процессов адгезии и агрегации бактериальных клеток требует не только знания физико-химических свойств (гидрофобности и электрических свойств) и химического состава, но также наномеханических свойств и ультраструктуры их поверхности. Уникальная возможность АСМ представлять бактериальный мир в субнанометровом диапазоне и в водном растворе может быть использована для исследования как самих клеток, так и их поверхности в физиологических условиях. АСМ дает изображения бактериальных клеток и их поверхности с высоким разрешением. Эти изображения используются для анализа внешнего вида и свойств поверхности бактерий. АСМ может быть использована для изучения физиологических процессов, таких как клеточный рост и прорастание спор, а также доя исследования морфологических изменений живых бактерий под действием антибиотиков. В водных средах микроорганизмы имеют тенденцию образовывать колонии на твердых поверхностях, создавая биопленки. Это вызывает загрязнение трубопроводов, морских сооружений и кораблей. Протекающие при этом коррозиционные процессы также изучаются методами АСМ.

В данной работе мы использовали АСМ для идентификации патогенных бактериальных клеток. Некоторые АСМ изображения получены с использованием неспецифической адсорбции бактерий (рис. 14).

Рисунок 14 - АСМ изображение клеток М tuberculosis

Для специфической визуализации бактерий был разработан новый подход, основанный на иммобилизации специфических антител непосредственно на твердой подложке через связывание антител стафилококковым белком А. Белок А специфически узнает и связываег Fc-фрагменты антител. Получены изображение слоя белка А (рис. ] 5) и 3D изображения специфически иммобилизованных бактерий и спор (рис. 16) с использованием слоя белка А для чувствительной иммобилизации специфических антител.

Рисунок 15 - Трехмерное реконструированное АСМ изображение слоя белка А

АСМ очень важна при быстрой и суперчувствительной детекции патогенов. Уникальные возможности АСМ можно использовать в дальнейших исследованиях в нанобиотехнологии не только для детекции бактериальных клеток и вирусов, но и для очень чувствительного определения нанофрагмен-тов этих объектов.

Рисунок 16 - Трехмерное реконструированное изображение клеток (слева) и спор (справа) В. thuringiensis с использованием слоя белка А

3.3 Изучения взаимодействия фаг-бактерия

Был разработан протокол приготовления образцов для визуализации с помощью АСМ взаимодействия бактерий с бактериофагами. Для этого растворы, содержащие живые бактерии Е. coli и бактериофаги, специфичные к данному штамму, смешивали и помещали в термостат при 37 °С. Через определенные промежутки времени из термостатируемого раствора извлекали 510 мкп смеси для нанесения на слюду и АСМ-мониторинга. Полученные результаты показали эффективность использования АСМ для такого рода систем. На рис. 17 и 18 хорошо видна динамика взаимодействия фаг-бактерия.

А Б

Рисунок 17 - АСМ изображение E.coli при отсутствии фагов (А) и через 15 мин после добавления фагов (Б)

PK«: worn ооз rm мсояоо.о«

1тэв9 «la H«lgiH lm»o« isla MetgM

Рисунок 18 - ACM изображение клетки E. coli после 35 мин (А) и 65 мин (Б) инкубации с фагом

На рис. 17А приведено изображение единичной бактериальной клетки при отсутствии бактериофагов. Через 15 мин после добавления бактериофагов (рис. 17Б) изображение бактериальной клетки изменяется и можно видеть фаговую "шубу" на поверхности бактерии. После 35 мин инкубации бактерий с фагами (рис. 18А) наблюдается выход большого количества фагов из бактериальной клетки в результате ее лизироваиия. На рис. 18Б изображена бактериальная клетка после фагового лизиса (видны морфологические изменения бактерии и следы выхода бактериофагов). Данная картина является типичной после инкубирования бактерий с бактериофагом более 1 ч.

Кроме этого, были проведены исследования наноструктуры аффинных поверхностей, представляющих собой антитела, закрепленные на латексных и магнитных частицах. Получены изображения высокого разрешения, позволяющие произвести визуальную оценку процесса агглютинации латексных частиц, несущих специфичные антитела, с антигеном и изображения биона-нообъектов, отражающие динамику взаимодействия фагов с бактериальной клеткой - мишенью.

3.4 Изучение фрагментов бактериальных клеток

Для изучения специфического связывания фрагментов бактерий с аффинной поверхностью нами была предложена следующая структура этой поверхности: активированная слюда - белок в - антитело. Активированная в тлеющем разряде слюда улучшает адсорбцию на нее белка в, который в свою очередь увеличивает степень адгезии на него антител (в силу их специфического взаимодействия). Толщина слоя белка О возрастает с увеличением его концентрации в растворе, причем оптимальная величина находится в диапазоне 0,1-0,6 мг/мл, при которой толщина слоя составляет до 1,3 нм (рис. 19).

НИИ ,|н Щ Щщщ -1щ г В ■н

rJ j 1 \ 3.2 4 um

ÖK 0.8144 мт №6.33 пг

Рисунок 19 - АСМ изображения обработанной в тлеющем разряде (0,2 мА, 60 с) поверхности слюды, (А) экспонированной в растворе (0,1 мг/мл) моноклональных антител к Е. coli; (Б) экспонированной последовательно в растворе белка G (0,1 мг/мл), а затем (после промывки) в растворе моноклональных антител к Е. coli.

Поверхности, модифицированные «родными» антителами (к Е. coli), а также «чужими» антителами (к Salmonella), были изучены как поверхности для связывания с фрагментами клеток Е. coli. Из АСМ-изображений, представленных на рис. 20, следует, что количество нанофрагментов, адсорбиро-

ванных «родными» антителами, в сотни раз больше, чем «чужими». При приготовлении образцов, представленных на рис. 20, время экспозиции поверхности с нанофрагментами составляло 3 мин, а объем раствора с антигеном -5 мкл. При таких параметрах адсорбции поверхность переставала эффективно адсорбировать антиген с концентрациями 107 клеток/мл и ниже. В связи с этим, параметры адсорбции подбирались таким образом, чтобы позволять детектировать малые концентрации.

Рисунок 20 - АСМ изображения модифицированных антителами к Е. coli (А) и к Salmonella (Б) поверхностей после их экспонирования в растворе, содержащем разрушенные фрагменты клеток Е. coli с концентрацией (по целым клеткам) 109 клеток/мл

Для этого уменьшали концентрацию антигена в суспензии, в которую помещали изготовленную поверхность. На рис. 21 показано АСМ изображение поверхности слюды, активированной в тлеющем разряде, модифицированной белком G и антителами к Е. coli, экспонированной в течение 10 мин в суспензии фрагментов клеток Е. coli, с исходной концентрацией клеток 102 клеток/мл. Как видно из АСМ изображения, на нем присутствуют частицы, которые и являются предположительно фрагментами бактерий. На рис. 21Б и 22В представлены сечения, проведенные по верхней и нижней

пунктирным линиям на АСМ изображении. Верхнее сечение демонстрирует профиль бактериального нанофрагмента, а нижнее - глубину белковых слоев на поверхности слюды (белок G + антитело), целостность которых была нарушена в ходе царапающего эксперимента кантилевером атомно-силового микроскопа.

Рисунок 21 - АСМ изображение поверхности слюды, активированной в тлеющем разряде, модифицированной белком G и антителами к Е. coli, экспонированной в течение 10 мин в суспензии, содержащей фрагменты клеток Е. coli с исходной концентрацией 102 клеток/мл (А); (Б) - сечение, проведенное по верхней пунктирной линии на АСМ изображении, демонстрирующее профиль бактериального фрагмента; (В) - сечение, проведенное по нижней пунктирной линии на АСМ изображении, демонстрирующее результат царапающего эксперимента

При дальнейшем уменьшении концентрации антигена его количество становится настолько маленьким, что вероятность даже специфического связывания очень мала. Поэтому требуется повысить эффективность специфического связывания, понизив при этом эффективность неспецифического. Для решения этой задачи модифицировали методику нанесения следующим образом. Во-первых, связывание антигена с аффинной поверхностью и последующую промывку стали проводить при pH 8,2 и температуре 32 °С, что благоприятствует специфическому связыванию. Во-вторых, промывку проводили погружением подложки в буфер с последующим вращением на шей-кере в течение 10 мин, чтобы повысить эффективность очищения от неспецифически связавшегося с поверхностью материала за счет дополнительно возникающих гидродинамических потоков вблизи поверхности.

"С

0,1

sH- : -ilr/: ЧЙ '''!-'г" Л ■ - -v' ' ■ ..... ► " : 1 Щ 9 ■Щ

• : • 1 j

'в ■ ■■ 7 ■ >г "^ИвшВЯв ■ vr--1.' * ■ 1 •'•V • /.!■ у/-.- . • TV . " •. ч,. - - •

контроль

E.coö 10*0

Рисунок 22 - ACM изображения поверхностей, модифицированных белком G и антителами к Е. coli, экспонированных в (А) суспензии, содержащей фрагменты клеток Е. coli с концентрацией (по целым клеткам) 10° кпеток/мл, (Б) суспензии, содержащей фрагменты клеток Е. coli с концентрацией (по целым клеткам) 101 клеток/мл. Все изображения приведены к одному масштабу по высоте. Размеры изображений составляют 50 мкм. (В) - диаграмма значений V для образцов, полученных при экспонировании аффинных к Е. coli поверхностей в суспензии Е. coli с концентрациями 10° и 10' клеток/мл в сравнении с контрольным изображением

Для того, чтобы оперировать количественными критериями изучаемого взаимодействия, была разработана схема статистического анализа АСМ изображений. Сначала строится гистограмма распределения по высотам всех объектов на контрольном изображении и выбирается такая высота hmi„, ниже которой лежит подавляющее большинство объектов. В дальнейшем анализируются лишь объекты, высоты которых превышают /im,„. Такое отбрасывание более низких объектов позволит избежать анализа примесей. После этого для анализируемого изображения (с бактериальными фрагментами) строится

распределение изображенных на нем объектов с высотами, большими /¡„,„„ по объемам и рассчитывается суммарный объем объектов V на АСМ изображении. Затем суммарный объем нормируется на площадь АСМ изображения v=V/S. Таким образом, величина v, имеющая смысл количества присоединившегося к поверхности материала на единицу площади, служит критерием для оценки наличия или отсутствия специфического связывания.

Разработанная методика оценки чувствительности аффинной поверхности была применена к антигену со сверхмалыми концентрациями - 10° и 101 клеток/мл. Соответствующие АСМ изображения приведены на рис. 22А, Б, а значения параметра v - на рис. 22В. Сравнение значений параметра v показывает, что чувствительность к определению малых концентраций становится значительно меньше, а для концентрации 10° клеток/мл значение v практически совпадает с контрольным.

Таким образом, была показана возможность специфической визуализации (идентификации) не только целых бактериальных клеток, но и их фрагментов с помощью АСМ. Глава 4 Изучение токсичности нанообъектов

Для анализа бактерицидной активности были приготовлены 6 групп образцов с многофункциональными биоактивными наноструктурными покрытиями (МБНП). Их получали путем магнетронного напыления в атмосфере аргона или смеси аргона с азотом.

Грамотрицательные бактерии Е. coli X-blue, Е. coli 09, S. typhimurium и P. aeruginosa и грамположительные бактерии В. brevis и В. subtilis выращивали на твердой среде LB с 2 % агара в течение ночи в присутствии 6 образцов с МБНП. Не обнаружено разницы в росте бактерий, как в присутствии, так и в отсутствии образцов.

Кроме того, грамотрицательные бактерии Е. coli X-blue и Р. aeruginosa и грамположительные бактерии В. brevis и В. subtilis выращивали в жидкой среде LB. Исходная концентрация бактерий составляла 106 клеток/мл. Бактериальный рост анализировали по изменению оптической плотности при

625 нм. После 4 ч культивирования в контролях и опытах не было обнаружено разницы в росте. Таким образом, установлено, что образцы с МБНП не обладали бактерицидной активностью при культивировании бактерий как на твердых, так и в жидких питательных средах.

Анализ функциональной активности перитонеальных фагоцитов против клеток Y. pseudotuberculosis проводили в присутствии тех же 6-ти образцов с МБНП. Полученные результаты не выявили статистически достоверной разницы в бактерицидной активности макрофагов в присутствии всех протестированных образцов с МБНП. Это означает, что данные МБНП не изменяют бактериальный статус и системы защиты макроорганизма. Таким образом, данные МБНП могут использоваться для имплантантов, работающих под нагрузкой.

При анализе наноповерхностей титана, модифицированных одной из трех активных добавок - ЮСаО + 2КМп04, или 20%Zr02 (TiZrCON), или на-носеребром, показано, что после первых 3 ч культивирования оптическая плотность уменьшалась в 1,5 раза при инкубации образца с добавлением Ag с клетками Е. coli по сравнению с оптической плотностью бактерий при отсутствии образцов в среде культивирования. Для остальных образцов бактерицидный эффект не был обнаружен.

Анализ фагоцитарной активности показал, что в присутствии образца (TiC+lOCaO + 2КМп04) в среде бактерицидная активность макрофагов не изменялась. В присутствии образца (TiC+20%ZT02 (TiZrCON)) количество живых макрофагов уменьшалось вдвое, при этом оставшиеся (живые) макрофаги обладали нормальной фагоцитарной активностью. В присутствии образца Ag почти все макрофаги были повреждены, а оставшиеся живые макрофаги не обладали фагоцитарной активностью.

Таким образом, с помощью микробиологических приемов можно оценивать токсичность наноматериалов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные методы анализа и идентификации микроорганизмов направлены на повышение чувствительности и уменьшение времени процедур. С этой точки зрения применений электрооптического и биосенсорного подходов изучения бактерий представляется весьма привлекательным благодаря нативности и чувствительности ¡(для электрооптики), и чувствительности и быстроте (для биосенсоров), а использование бионанотехнологических подходов способствует не только визуализации процессов в нанометровом разрешении, но и увеличению чув'ртвительности определения бактериальных клеток.

Электрооптический метод анализа клеток обеспечивает контроль электрофизических и связанных с ними морфологических и функциональных параметров бактерий. Интерпретация электрофизических параметров клеточных структур, фракционного состава популяции и морфометрии построена на взаимосвязи структуры и функций клетки. Результаты электрооптических исследований взаимодействия микроорганизмов с антителами или с частицами, модифицированными антителами, позволяют оценить возможность совмещения достижений в области иммуноидентификации и электрофизических измерений. Электрооптическое исследование взаимодействия фаг-бактерия также может быть применено для обнаружения и идентификации микроорганизмов. На основании итогов многолетней работы по разработке основ электрооптики микроорганизмов, можно сделать обобщающий вывод о создании теоретической и методической базы для широкого внедрения электрофизического метода анализа клеточных структур и определения гетерогенности клеточных популяций.

рения и улучшая ее качество. В данной работе расширена область применения известных биосенсоров и разработаны новые биосенсорные элементы.

В представленной работе предпринята попытка идентификации микроорганизмов путем анализа летучих компонентов (ЛК) бактерий. Принцип определения бактерий основан на анализе воздушного пространства над образцом для определения ЛК компонентов с помощью системы искусственного носа. Разработаны два метода неконтактного определения бактерий. Первый - простой анализатор летучих компонентов (термостатируемый и для постоянного мониторинга) для определения бактерий и грибов по анализу газов над микробными культурами. Второй метод - система искусственного носа на основе оптических волокон высокой плотности, позволяющая определять бактерии. Пористые силиконовые микросферы с флуоресцентным красителем, инкорпорированные в оптоволоконные системы, использовали для оценки изменения их флуоресценции после взаимодействия с ЛК. Анализ достоверности результатов эксперимента показал возможность применения системы искусственного носа на основе оптоволоконной системы для определения бактерий.

Известно, что максимальный выход антибиотика авермиктина наблюдается при полном потреблении глюкозы в среде роста микроорганизма. Биосенсор на глюкозу позволяет оперативно контролировать уровень содержания данного углевода в среде культивирования. Биосенсорная система определения глюкозы на основе фермента глюкозооксидазы и кислородного датчика была успешно применена для оптимизации условий выделения антибиотика авермиктина.

Применение микроорганизмов в качестве узнающего элемента биосенсора широко практикуется при анализе окружающей среды и пищи. Однако микроорганизмы представляют собой сложные полиферментные системы, а наличие сложных метаболических процессов мешает интерпретации сигнала. Поэтому разработка узнающего элемента биосенсора на основе цитоплазма-тической мембраны микроорганизмов позволяет увеличить специфичность и

чувствительность биосенсора. Более того, путем индукции ферментативных комплексов при культивировании можно получить биосенсор на определенный субстрат.

Особенно стоит отметить разработку биосенсора для оценки антиокси-дантной активности. Влияние ангиоксидантов на выживание бактериальных клеток в настоящее время не изучено. Поэтому разработка такого типа биосенсора является перспективным инструментом оценки антиоксидантной активности соединений для выяснения их роли в процессах переживания микроорганизмов в макрофагах.

Бионанотехнологические подходы в микробиологии - современный тренд в исследовательских направлениях, позволяющий детализировать процессы в микробиологии на нано-уровне. Применение атомно-силовой микроскопии позволило визуализировать такие процессы, как реакция гемагглюти-нации и взаимодействие фагов с бактериальными клетками. Кроме того, данный подход с использованием антител позволил специфически визуализировать нанофрагменты бактерий. Следует учитывать, что работа в новых областях с применением наноподходоз требует хотя бы предварительного изучения возможных рисков при работе с наноматериалами. Предварительные данные показали, что, несмотря на инертность наноповерхностей, в особых случаях мы можем наблюдать токсический и бактерицидный эффект наноча-стиц.

ВЫВОДЫ

1. Показана принципиальная возможность применения электрооптического метода для анализа физиологического состояния бактерий и их выживаемости в ходе биотехнологических процессов. Разработан численный алгоритм определения анизотропии поляризуемости бактериальных клеток, снимающий существенные ограничения на проведение эксперимента.

2. Выявлены электрооптические изменения микробиологических систем, которые могут служить удобным инструментом идентификации микроорга-

низмов при анализе взаимодействия бактерий со специфическими антителами или магнитными частицами с иммобилизованными специфическими антителами и фагами.

3. Разработаны биосенсоры с применением системы искусственного носа на основе высокоплотных оптоволоконных пучков для бесконтактной идентификации микроорганизмов. Показана принципиальная возможность использования простой модификации метода спектрофотометрического анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов по выделению или поглощению ими летучих компонентов, из окружающей среды. Кроме того, данный метод позволяет различить мутанты N. сгазьа, дефектные по метаболизму азота, от штамма дикого типа.

4. На примере синтеза антибиотика авермиктина бактериями 5. ауегтШШ показана принципиальная возможность использования биосенсора для контроля продукции антибиотика. Биосенсорная система определения глюкозы на основе фермента глюкозооксидазы и кислородного датчика была успешно применена для оптимизации условий выделения данного антибиотика.

5. Впервые сконструирован оптоволоконный биосенсор на основе цито-плазматических мембран бактерий для анализа концентрации лактата и установлена корреляция между содержанием лактата и бактериальной обсеме-ненностью коровьего молока.

6. Разработан амперометрический супероксидный биосенсор для анализа антиоксидантной активности веществ, с последующим изучением действия антиоксидантов на выживаемость бактерий в макрофагальных клетках.

7. Впервые показано использование бионанотехнологического подхода на основе атомно-силовой микроскопии совместно с получением аффинных поверхностей для специфической визуализации бактериальных нано-фрагментов, позволяющих повысить чувствительность выявления микроорганизмов и их идентификации.

8. Для визуализации и анализа взаимодействия фаг-бактерия использованы уникальные возможности АСМ для получения трехмерного изображения ультраструктур на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях.

9. Для поверхностей с многофункциональными биоактивными наност-руктурными покрытиями и наноматериалов разработаны методы оценки токсичности с помощью микробиологических приемов. Разработана методика оценки бактерицидной активности макрофагов в присутствии наносоедине-ний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Нефедова М.В., Игнатов С.Г., Чигалейчик А.Г., Виноградов Б.Д., Егоров Н.С. Биосинтез L-аспарагиназ л II Bacillus polimixa var Ros. II Прикл. био-хим. и микробиол. - 1978. - Т. 14. -№4. - С. 510-515.

2. Решетняк В.И., Игнатов С.Г., Вострокнутова Г.Н. Влияние естественной и искусственной модификации мембран на энергетику бактериальной клетки. // Энергетика и углеводный обмен у микроорганизмов. Рига. -1979.-С.64-65.

3. Игнатов С.Г., Александрова Л.А., Евдокимова O.A., Перелыгин В.В., Ка-прельянц A.C. Роль липидов в процессе репарации и восстановлении мембранных функций после низкотемпературного замораживания E.coliJI Липиды биологических мембран. Ташкент. - 1980. - С. 59.

4. Игнатов С.Г., Андреева О.В., Евдокисова O.A., Арцатбанов В.Ю., Перелыгин В.В., Капрельянц A.C., Островский Д.Н. Роль липидов в процессе репарации и восстановления мембранных функций после низкотемпературного замораживания.// Тезисы Научной Конференции молодых ученых, Оболенск. - 1980. - С. 187-199.

5. Игнатов С.Г., Красильников В.А., Перелыгин В.В., Капрельянц A.C., Островский Д.Н. Изучение функциональных и структурных изменений мембран E.coli после низкотемпературного замораживания.// Биохимия. -1981.-Т. 46.-№11. -С. 1996-2003.

6. Игнатов С.Г., Андреева О.В., Евдокимова O.A., Арцатбанов В.Ю., Перелыгин В.В., Капрельянц A.C., Островский Д.Н. Изучение репарации мембранных повреждений, вызванных низкотемпературным замораживанием клеток E.coliJI Биохимия. - 1982. - Т. 47. - №10. - С. 1621-1628.

7. Игнатов С.Г., Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е. Методика электрооптического анализа сухих препаратов.// Методика Т-4061. - 1986. - мбВ 1/1725. - м. 15.-С. 130-138.

8. Игнатов С.Г., Драгунова С.Ф., Перелыгин В.В., Воробьев A.A. Роль комплемента в защите макроорганизма от бактерий.// Журнал микробиол. эпидемиол. и иммунол. - 1987. - № 5. - С. 97-102.

9. Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Светогоров Д.Е. Измерение электрооптических свойств E.coli.// XI научная конференция по итогам НИР 1986, сек-ция-8", Оболенск. - 1987. - С. 15.

10.Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Брезгунов В.Н., Волошин А.Г., Бунин В.Д., Светогоров Д.Е., Щепкина А.Н. Использование электрооптического метода для оперативного определения жизнеспособности бактериальных клеток.// Микробиол. - 1989. - Т. 58. - № 3. - С. 515-517.

И.Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е., Игнатов С.Г., Бунин В.Д. Анализ возможности использования нелинейной области электрооптического эффекта для определения концентрации и анизотропии поляризуемости бактериальных клеток.// Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем, Велегож. - 1990. - С. 15.

12.Светогоров Д.Е., Бунин В.Д., Волошин А.Г., Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Брезгунов В.Н. Оперативная диагностика состояния бактериальных клеток в процессе производства препаратов по результатам ЭО исследований.// Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем, Велегож. -1990. - С. 19-20.

1 З.Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е. Использование электрооптического метода и кратковременных экстремальных воздействий для оценки устойчивости бактериальных клеток к процессу высушивания.// Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем, Велегож. - 1990. - С. 24.

14.Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Светогоров Д.Е. Изменение электрооптических свойств E.coli в ходе сушки клеток.// Научная конференция по итогам НИР 1989, Оболенск. - 1990. - С. 40.

15.Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е., Игнатов С.Г. Определение анизотропии поляризуемости бактериальных клеток при средней степени ориентации.// Коллоидный журнал. -1991. - Т. 55. - С. 365-367.

16.Игнатов С.Г., Андреев С.Н., Драгунова С.Ф. Биосенсор на лизин на основе рС02 кондуктометрического электрода.// Биотехнология. - 1992. - № 5. -С. 110-111.

17.Игнатов С.Г., Андреев С.Н., Драгунова С.Ф. L-лизиновый биосенсор на основе рС02 кондуктометрического электрода.// Биотехнология. - 1992. -№ 6. - С. 63-64.

18.Ignatov S.G., Dragunova S.F. Surface charge controls the barrier properties of the E.coli cell envelope.// J. Biochem. Org. - 1994. - V. 1. - P. 363-373.

19.Игнатов С.Г. Новый метод определения комплемент-опосредованного бактериолитического действия сыворотки на клетки E.coli.// Журнал микробиол. эпидемиол. и иммунол. - 1994. - № 6. - С. 99-100.

20.Игнатов С.Г., Бесаева С.Г., Кувичкин В.В. Изучение потребления глюкозы при культивировании S.avermitilis 130J с использованием биосенсорного измерителя.// Биотехнология. - 1995. - Т. 32. - № 1/2. - С. 54-55.

21.Волошин А.Г., Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Бунин В.Д. Использование электрооптического метода для контроля бактериальных препаратов. Прикладная биохим. и микробиол. - 1996. - Т. 32. - № 6. - С. 669-670.

22.Ignatov S.G. Biosensors based on CPM In International Symposium "Development of medical equipment technology converted from weapon sciences", Podolsk, Moscow Region. -199,6. - P. 54.

23.Ignatov S.G. The role of diamines on bacterial survival after freezing. In "International symposium on stress and inorganic nitrogen assimilation & the 2nd FOHS biostress symposium". Moscow. - 1996. - P. 34.

24.Ignatov S.G. Rapid method fori bacterial counting in the milk by using biosensor based on E.coli cells. NATO ASI SERIES Workshop "Rapid Methods for the Analysis of Biological Materials in the Environment". Warsaw. - 1997. - P. 33. i

25.Ignatov S.G. Biosensor based on bacterial cytoplasmic membranes. ARW "New trends in biosensor development". Kiev, Ukraine. - 1998. - P. 25.

26.Ignatov S.G. Bacterial cytoplasmic membranes as a native organized biocata-lysis system in biosensorology.// Biocatalysis-98: fundamental and applications. Pushino. - 1998. - P. 18.

27.Ignatov S.G. New recognition element for biosensor based on cytoplasmic membranes.// 6th SAS-Deauville Conference-98. Valencia, Spain. - 1998. - 98P. -P. 375.

28.Ignatov S.G. Biosensors, biotechnology.// German-Russia ISTC workshop Biotechnology, DEHEMA-99. Wiesbaden, Germany. - 1999. - P. 25.

29.Ignatov S.G. Biosensor based pn the bacterial cells for glucose monitoring in the blood.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 1999. - P. 100.

30.1gnatov S.G. Development of the rapid method for determination of complement-mediated serum bactericidal activity against gram-negative bacteria.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 1999. - P. 100.

31.Ignatov S.G., Besaeva S.G. Avermitelis controlling in cultivation media by using glucose biosensor.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 1999. - P. 101.

32.Бикетов С.Ф., Игнатов С.Г., Гаврюшкин A.B. Современные тенденции в области определения возбудителей инфекционных болезней.// Проблемы медицинской и экологической биотехнологии. Оболенск. - 1999. - С. 271.

33.Бесаева С.Г., Игнатов С.Г. Контроль глюкозы в среде культивирования Streptomyces avermititlis с помощью биосенсора.// Проблемы медицинской и экологической биотехнологии. Оболенск. - 1999. - С. 228.

34.Makhlis Т., Efremenko Е., Varfolomeev S., Kaprelyants A.S., Ignatov S.G. Elaboration of stable biosensors based on the membranes of regular and dormant cells Micrococcus luteus, immobilized in poly (vinyl alcohol) cryogen for the detection of NADH and lactate.// Biocatalysis-2000. Moscow. - 2000. - P. 121.

35.Ignatov S.G. Rapid method for bacterial counting in the milk by using biosensor based on E.coli cells.// In book "Rapid Methods for the Analysis of Biological Materials in the Environment" (Ed.P.J.Stopa, M.A.Bartoszcze), NATO ASI Series. - 2000. - V. 30. - P. 93-100.

36.Ignatov S.G., Ge В., Shishniashvili D., Scheller F.W., Lisdat F. The antioxidant activity detection of the flavonoids using superoxide sensor.// Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology. Pushchino. - 2000. - P. 95.

37.Ge В., Lisdat F., Shishniashvili D., Ignatov S.G., Scheller F.W. Detection of antioxidant activity using a superoxide sensor.// Biosensor-2000. San Diego USA. - 2000. - P. 251.

38.Ignatov S.G., Ge В., SchelleT F.W., Lisdat F. Detection of the antioxidant activity of flavonoids by using superoxide sensor.// In book "Nitric oxide: basic research and clinical application" (Ed.R.J.Gryglewski, P.Minuz) IOS Press, NATO Science Series, Science A: Life Science. - 2001. - V. 317. - P. 168-180.

39.Ignatov S.G., Ferguson J.A., Walt D.R. A fiber-optic lactate sensor based on bacterial cytoplasmic membranes.// Biosensors and Bioelectronics. - 2001. - V. 16.-№ l.-P. 109-113.

40.Stitzel S.E., Albert K.A., Ignatov S.G., Walt D.R. Artificial nose employing microsphere sensor for detection of volatile organic compounds.// Proc. SPIE. -2002,-V. 4575.-P. 132-137.

41.Ignatov S., Shishniashvili D., Ge В., Scheller F.W., Lisdat F. Amperometric biosensor based on a functionalized gold electrode for the detection of antioxidants.// Biosensors and Bioelectronics. - 2002. - V. 17. - № 3. - P. 191-199.

42.Ignatov S. G., Viijasov S. N., Kozodaev M.A., Ignatyuk Т. E., Suvorov A. L. AFM study of bacteriaphages.// IT f ME. Gurzuf, Ukraine. - 2002. - P. 356357.

43.Ignatov S. G., Viijasov S. N., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk Т. E., Suvorov A. L. Nanobiotechnology for microbiology.// MicroRobots, MicroMachines and MicroSystems. Moscow. - 2003. - P. 345.

44.Ignatov S. G., Viijasov S. N., Golutvin I, A., Nasikan N. S., Ignatyuk Т. E., Suvorov A. L. AFM study for specific visualization of bacteria and spores.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 2003. - P. 218-219.

45.Ignatov S. G. Atomic force microscopy for nano analysis of bacteria.// Canadian Biological Colloquium. Moscow. - 2004. - P. 79.

46.Ignatov S.G. Bionanotechnological analysis of affinity surfaces.// The 5-th ISTC/Korea workshop on biotechnology, Korea. - 2004. - P. 67-102.

47.Ignatov S. G., Viijasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk Т. E., Suvorov A. L. Bionanotechnological analysis of affinity surfaces for sensitive bacteria detection.// The proceedings for the 37 ISTC Japan Workshop on Advances Nanomaterials in Russia/CIS. Tsukuba, Japan.-2005.-P. 148-162.

48.Вирясов C.H., Голутвин И.А., Насикан H.C., Бикетов С.Ф., Игнатов С.Г., Игнатюк Т.Е. Способ приготовления аффинных поверхностей на основе химически прошитого белка А Л Патент РФ 2005. RU 2261279 С1.

49. Ignatov S. G., Virjasov S. N„ Fedjukina G.N., Baranova E.V., Biketov S.F. Nano-approach for sensitive monitoring of bacteria.// NSTI Nanotech. Boston. USA. - 2006. - P. 57.

50.Волошин А.Г., Бесаева С.Г., Веревкин В.В., Игнатов С.Г. Адаптация элекгрооптичесхого метода для изучения взаимодействия фаг-бактерия.// VII Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ". Обйленск. - 2006. - С. 190-192.

51.Федюкина Г.Н., Баранова е|в., Акимова JI.A., Волошин А.Г., Вирясов С.Н., Косарев Н.В., Дубровин Е.В., Краевский С.В., Игнатюк Т.Е., Игнатов С.Г. АСМ визуализация |взаимодействия латексных частиц, модифицированных антителами в присутствии антигена.// VII Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ". Оболенск. - 2006. - С. 250-25 lj.

52.Dubrovin Е., Fedyukina G., Ignatov S., Ignatyuk Т., Kraevsky S., Voloshin A., Yaminsky I. Visualization of pathogen-host interaction using AFM.// 8th International EMBL PhD Student Symposium. Heidelberg, Germany. - 2006. - P. 46.

53.Ignatov S. G., Viijasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk Т. E. Specific visualization of bacteria and spores by AFM.// IX Annual Linz Winter Workshop "Advances in Single-Molecule Research for Biology & Nanoscience". Austria. - 2007. - P. 4-14.

54.Игнатов С.Г., Федюкина Г.Н., Мочалов B.B., Акимова JI.A., Баранова Е.В., Колосова Н.В., Рудницкий С.Ю. Визуализация аффинных взаимодействий методом атомно-силовой микроскопии.// Материалы XV международной конференции IT+ME. Гурзуф, Украина. - 2007. - С. 315-317.

55.Dubrovin Е., Ignatov S., Ignatyuk Т., Kraevsky S., Voloshin A., Yaminsky I. Visualization of pathogen-host interaction using AFM. Biophysical Journal. -2007. - Suppl. S. - P. 514A-515A.

56.Краевский С, Волошин А., Дубровин B.E., Игнатов С.Г., Игнатюк Т.Е., Яминский И.В. Изучение влияния бактериофагов на бактерии с помощью АСМ.// Сборник тезисов «Современные достижения достижения биона-носкопии» Первая Всероссийская Школа-семинар. Москва. - 2007. - С. 29.

57.Ignatov S., Walt D. Bacteria detection - biosensors.// ASI "Sensors for environment, health and security: Advanced materials and technologies". Vichy, France. - 2007. - P. 29-30.

58.Ignatov S., Voloshin A., Ignatyuk T. Bionano - microbiology.// ASI "Sensors for environment, health and security: Advanced materials and technologies". Vichy, France. - 2007. - P.31-32.

59.Ignatov S. G., Viijasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Ganina E. A., Mochalov V.V., Dubrovin E.V., Kraevsky S.V., Ignatyuk Т.Е. Specific AFM visualization of bacteria and bactericidal activity of nano-objects.// IV International conference on "NanoBio and related new and perspective biotechnologies". Pushchino. - 2007. - P. 193-195.

60.Kholodenko V.P., Chugunov V.A., Kobzev E.N., Borzilov A.I., Gerasimov V.N., Biketov S.F., Ignatov S.G., Potapov V.D., Turin E.A., Dyatlov I.A.. Na-notechnologies and problems of biosafety.// IV International conference on "NanoBio and related new and perspective biotechnologies". Pushchino. -2007.-P. 199-200.

61.Игнатов С.Г., Вирясов C.H., Федюкина Г.Н., Баранова Е.В., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Е.В. Дубровин, С.В. Краевский, Т.Е. Игнатюк. Применение АСМ для специфической визуализации микроорганизмов.// VI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика -2007» - 2007. - Т. 1. - С. 81-82.

62.Ignatov S. G„ Voloshin A.G., Virjasov S. N.. Fedjukina G.N., Mochalov V.V., Dubrovin E.V., Kraevsky S.V., Ignatyuk Т.Е.. International expert meeting drug design and development. Moscow. - 2007. - P. 14-15.

63.Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Бунин В.Д., Дятлов И.А. Электрооптический анализ в микробиологии.// Монография - Оболенск, ГУП МО «Серпуховская типография» - 2007. - С. 1 - 161.

64.1gnatyuk Т.Е., Ivanova О.Е., Efremova Т.Р., Fedjukina G.N., Voloshin A.G., Akimova L.A., Mochalov V.V., Ignatov S. G. Immobilization of viruses using Langmuir antibody films based on amphiphilic polyelectrolites for Atomic Force microscopy.// In book "Proceedings of the IX Linz Winter workshop 2007". Austria. - 2008. - P. 86-90.

65.Дубровин E.B., Игнатов С.Г., Игнатюк Т.Е., Краевский С.В., Федюкина Г.Н., Яминский И.В.// АСМ-исследование биоспецифичных взаимодействий на поверхностях. «Современные достижения бионаноскопии». Вторая международная конференция. Москва. - 2008. - С. 22.

66.Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Федюкина Г.Н., Баранова Е.В., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Перовская О.Н., Дубровин Е.В., Краевский С.В., Игнатюк Т.Е. Специфическая АСМ визуализация бактериальных нанофрагментов.// Международный форум по нанотехнологиям. Сб. тезисов докладов научно-технологических секций, т. 2. Москва. - 2008. - С. 150-151.

67.Dubrovin Е. V., Voloshin A. G., Kraevsky S. V., Ignatyuk Т. Е., Abramchuk S. S., Yaminsky I. V. , Ignatov S. G. Atomic Force Microscopy Investigation of Phage Infection of Bacteria.// Langmuir. - 2008. - V. 24. - № 22. - P. 1306813074.

68.Ишатов С.Г., Волошин А.Г., Вирясов C.H., Федюкина Г.Н., Баранова Е.В., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Перовская О.Н., Дубровин Е.В., Краевский С.В., Игнатюк Т.Е. Нано в микробиологии: специфическая визуализация бактериальных нанофрагментов и нанотоксичность,// Нанотехноло-гии в сельском хозяйстве. Доклады Международной научно-практической конференции. Москва. - 2008. - С. 34-36.

69.Ignatov S. G., Voloshin A.G.,. Filippovich S. Yu, Walt R.D. Bacteria detection - biosensors.// In book: Sensors for Environment, Health and Security. M.-I. Baraton (ed.), © Springer Science + Business Media B.V. - 2009. - P. 267-276.

70.Ignatov S. G., Voloshin A.G.,. Vitjasov S. N, Fedjukina G.N., Mochalov V.V., Ganina E.A., Dubrovin E.V., Kraevsky S.V., Ignatyuk Т.Е. Bionano - microbi-

ology.// In book: Sensors for Environment, Health and Security. M.-I. Baraton (ed.), © Springer Science + Business Media B.V. - 2009. - P. 333-345.

71.Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Вирясов C.H., Федюкина Г.Н., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Перовская 0,Н., Е.В. Дубровин, С.В. Краевский, Т.Е. Игнатюк. АСМ анализ взаимодействия фаг-бактерия.// Материалы 1-ой Международной научной школы "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах". - 2009. - С. 32

72.Ignatov S.G., Bachurina G.P., Filippovich S.Yu. Evaluation of Antifungal Activity of Multi-functional Bioactive Nano-structured Films for Load-bearing Implants.// European Congress on Advanced Materials and Processes. Glasgow, Scotland. - 2009. - P. 66. j

73.Игнатов С.Г., Волошин А.Г., ¡Федюкина Г.Н., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Филиппович С.Ю., Перовская О.Н. Оценка бактерицидной активности многофункциональных биоктивных наноструктурных покрытий, работающих под нагрузкой.// Тезисы международной конференции «Токсикологические и нормативные аспекты производства и применения нанома-териалов в России». Москва. - 2009. - С. 74.

74.Волошин А.Г., Филиппович С.Ю., Бачурина Г.П., Бесаева С.Г., Игнатов С.Г. Спектрометрический ацапиз летучих компонентов микроорганизмов.//Приклад. биохим. и мшфобиол. -2010. - Т. 46. - №3. - С. 331-335.

Подписано в печать 23.06.2010 г. Формат 60 х 84 '/16.

Объем 3,0 п. л. Тираж 120 экз. Заказ 928.

ГУЛ МО «Серпуховская типография» Министерство по делам печати и информации Московской области

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Игнатов, Сергей Георгиевич

ГЛАВА 1 ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

1.1 Основы электрооптического метода

1.2 Электрофизические параметры клеток и клеточных 20 структур

1.3 Физиологические параметры клеток

1.4 Показатели гетерогенности клеточной популяции

1.5 Морфометрические параметры клеток и методы их 24 измерения

1.5.1 Прямые оптические методы измерения размера клеток

1.5.2 Прямой электрический метод измерения размеров и 26 концентрации клеток

1.6 Методы измерения поляризационных, электрофизических 27 и электрокинетических параметров суспендированных клеток

1.6.1 Измерение поляризационных и электрофизических 27 параметров суспендированных клеток

1.6.2 Измерение электрокинетических параметров клеток

1.7 Электрооптический метод анализа клеток 32 1.7.1 Феноменология электрооптического эффекта

1.8 Применение электрооптического метода для исследования 35 клеток, клеточных структур и биомолекул

1.8.1 Методологические аспекты применения метода

1.8.2 Направления использования электрооптического метода

ГЛАВА 2 БИОСЕНСОРЫ

2.1 Биосенсорные измерения

2.2 Типы биосенсоров

2.2.1 Амперометрические биосенсоры

2.2.2 Сенсоры, основанные на пьезоэлектрических кристаллах

2.2.3 Оптические сенсоры

2.2.4 Биосенсоры на основе фагов

2.3 Иммунологические методы определения бактерий

2.3.1 Получение антител

2.3.1.1 Поликлональные антитела

2.3.1.2 Моноклональные антитела

2.3.1.3 Рекомбинантные антитела

2.3.2 Иммуноферментный анализ

2.3.3 Иммуносенсоры

2.4 Биосенсор для определения антиоксидантной активности

2.4.1 Супероксид

2.4.2 Патофизиологическая роль свободных радикалов

2.4.3 Механизмы повреждений

2.4.3.1 Липиды

2.4.3.2 Белки

2.4.3.3 ДНК

2.4.4 Защитные механизмы против АФК

2.4.5 Свободные радикалы в биологических системах 61 2.4.5.1 Повреждения при реперфузии

2.4.6 Определение свободных радикалов 64 2.4.6.1 Электрохимический метод определения супероксида

ГЛАВА 3 ПРИМЕНЕНИЕ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

3.1 Бионанотехнология,.

3.2 Анализ наноорганизации аффинных поверхностей с помощью зондовой микроскопии.

3.2'Л.- Антитела-.

3.2.2. Аффинность антител.

3.3 Основные принципы сканирующей зондовой микроскопии

3.3.1 Сканирующая туннельная микроскопия.

3.3.2 Атомно-силовая микроскопия.

3.4 Артефакты зондовой микроскопии и способы их учёта.

3.5 АСМ вирусов.

3.6 АСМ бактерий.

3.6.1 Нанесение бактериальных клеток на подложку для АСМ

3.7 Изучеиие взаимодействия фаг-бактерия с помощью АСМ микроскопии.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 4 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1 Культивирование микроорганизмов и фагов.

4.2 Электрооптический метод.

4.2.1 Подготовка клеток к анализу.

4.2.2 Измерение ориентационных спектров, к леток.

4.2.3 Идентификация микроорганизмов с использованием электрооптического метода и магнитных частиц.

4.3 Биосенсор на основе клеток или мембран.

4.3.1 Методика криоиммобилизации.

4.3.1.1 Перекристаллизация поливинилового спирта.

4.3.1.2 Концентрирование выращенной биомассы.

4.3.1.3 Приготовление суспензии клеток или мембран в растворе гелеобразователя.

4.3.1.4 Гранулирование с одновременным замораживанием

4.3.1.5 Реактивация и хранение иммобилизованных клеток или бактериальных мембран.

4.3.1.6. Криоиммобилизация клеток и мембран.

4.3.2 Приготовление сенсора на основе кислородного датчика

4.3.3 Тонкопленочные электроды.

4.3.4 Биосенсорные измерения антиоксидантных свойств веществ.

4.3.5 Оптический сенсор.

4.4 Иммунологические методы

4.4.1 Получение поливалентных сывороток к адено- и ротовирусам

4.4.2 Определение титра антител методом реакции диффузной преципитации (РДП).

4.4.3 Получение поликлональных антител.

4.4.4 Получение и характеристика моноклональных антител

4.4.5 Характеристика кроличьих специфических антител к S. typhimurium■

4.4.5.1 Получение гипериммуннойгкроличьей сыворотки

4.4.5.2 Выделение IgG фракций из.гипериммунных кроличьих сывороток

4.4.5.3 Дот-блот анализ

4.4.5.4 Тестирование сыворотки.

4.4.6 Подготовка латексных частиц для АСМ микроскопии

4.4.7 АСМ микроскопия.

4.4.8 Получение макрофагов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 5 ЭЛЕКТЕООПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 6 БИОСЕНСОРЫ.

6.1 Бесконтактное определение микроорганизмов

6.2 Биосенсор для определения глюкозы.

6.2.1 Глюкозный биосенсор для контроля синтеза авермиктина

6.2.2 Применение глюкозного биосенсора для определения фенол ьных соединений.

6.3 Разработка бисенсорной системы узнавания на основе бактериальных клеток и их фрагментов с помощью криоиммобилизации.

6.4 Биосенсоры на основе ЦПМ.

6.5 Дормантные клетки как узнающий элемент биосенсора

6.6 Оптоволоконный биосенсор для определения лактата на основе ЦПМ.

6.7 Амперометрический биосенсор для определения антиоксидантной активности.

ГЛАВА 7 БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ.

7.1 Визуализация латексных частиц, сенсибилизированных антителами, в присутствии антигена методом атомно-силовой микроскопии.

7.2 АСМ микроскопия вирусов.

7.3 АСМ микроскопия бактерий.

7.4 Аффинные подложки.

7.5 Изучения взаимодействия фаг-бактерия.

7.6 Изучение фрагментов бактериальных клеток.

7.7 Изучение токсичности нанообъектов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов с использованием бионанотехнологических подходов"

В настоящее время разнообразный анализ бактериальных клеток имеет большое значение в биотехнологии и медицине при создании препаратов на основе клеток, оптимизации микробиологического синтеза продуктов и других биотехнологических процессов, а также при разработке новых методов контроля и диагностики в микробиологии. Большинство методов для определения физиологического состояния бактерий, используемых микробиологией, основано на измерениях параметров внешней среды. Наличие между клетками и измерительным прибором промежуточного звена в виде поддерживающей среды обуславливает ряд недостатков этих методов: инерционность процесса измерений и усреднение измеряемых параметров. Поэтому электрооптический метод анализа, основанный на исследовании клеток как электрофизических объектов со слоистой структурой и измерении поляризационных характеристик клеточных структур, представляет собой новый подход к оценке прижизненных физиологических параметров клеток и их гетерогенности (ОиНу е! а1., 2007). Различие электрических свойств среды культивирования (поддерживающей среды) и бактериальных клеток приводит к появлению индуцибельных зарядов при наличии поля. Эти заряды образуются на границе любой пары электрически разных сред. Известно, что индуцированные электрическим полем заряды образуются и на границах клеточных структур. Их величина зависит от отношения электрических свойств соприкасающихся структур (8ЬсЬуо§о1еу е1 а1., 1994). Частным случаем измерений, который представляет особый интерес, является определение электропроводности цитоплазмы на поверхности контакта с мембраной. Взаимодействие индуцированных зарядов с электрическим полем приводит к возникновению вращательного момента, задавая ориентацию клеткам. Данная ориентация определяется минимальной потенциальной энергией и соответствует параллельной направлению электрического поля ориентации клеток. Изменение ориентации бактериальных клеток приводит к изменению оптических свойств суспензии. Оптическая плотность суспензии может изменяться на 1-2%, однако этого достаточно для электрооптического анализа бактериальных клеток (Bunin and Angersbach, 2008). Измерение вариаций оптических свойств суспензии после воздействия на нее электрического поля лежит в основе фотометрического метода (Stoylov, 1991).

Этот метод измерений является прижизненным. Он не использует дополнительных меток или химических компонент и не вызывает изменений в исследуемом» объекте. Преимуществом данного метода является то, что влияние среды измерения на точность измерения поляризационных параметров является незначительным и. предсказуемым. Воздействие на бактериальные клетки измерительной процедуры также незначительно, и при этом микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность. С помощью электрооптического метода возможно определить, количество и жизнеспособность бактерий. Метод является оперативным, причем процесс измерений может быть полностью автоматизирован.

Возможность применения" электрооптического метода для оценки состояния микроорганизмов в ходе технологического процесса и для анализа взаимодействия бактерий со специфическими антителами и фагами является актуальной и будет раскрыта в данной работе

Классические методы определения бактерий, основанные на культивировании микроорганизмов с последующим микробиологическим и биохимическим анализом, являются трудоемкой и длительной процедурой с использованием дорогостоящего оборудования. Биосенсоры являются аналитически чувствительной и недорогой альтернативой стандартным методам, применяемым сегодня для идентификации бактерий (Cardosi, Turner 1987). Они представляют собой аналитические приборы для селективного определения веществ и организмов, в которых используется комбинация биологической системы узнавания и физического преобразователя. В зависимости от физического преобразователя можно выделить три основных класса биосенсоров- электрохимические, оптические и масс-метрические (Vo-Din and Cullum, 2000). Электрохимические биосенсоры в основном представлены амперометрическими и потенциометрическими биосенсорами. С помощью амперометрических биосенсоров измеряют величину тока при постоянном потенциале, используя окислительно-восстановительные процессы узнающего элемента (Zhang et al., 2010). Пользуясь потенциометрическими биосенсорами, анализируют изменение потенциала преобразователя после взаимодействия* узнающего элемента с аналитом (Wang et al., 2010). Оптические- биосенсоры делятся на флуоресцентные и интегрированные оптические сенсоры. С помощью флуоресцентных биосенсоров измеряют изменение флуоресценции после специфического взаимодействия (Doong and Shih, 2010); Интегрированные оптические сенсоры - это сложные системы, анализирующие оптические изменения (Ноа et.al., 2007). На основе масс-метрических систем анализируют изменение массы после специфического взаимодействия. Они могут быть представлены пьезоэлектрическими сенсорами и сенсорами на основе микрокантилевера. Пьезоэлектрические биосенсоры делятся на кварце-кристаллические и поверхностно-акустические (Fu et al., 2010), с их помощью измеряют изменение резонансной частоты и величину поверхностной амплитуды соответственно. Биосенсоры на основе микрокантилевера анализируют частоту колебания микрокантилевера после специфического связывания с аналитом (Boisen and Thundat, 2010). В последнее время интенсивно развивается применение биосенсоров высокой плотности и системы искусственного носа. Биосенсоры высокой плотности характеризуются наличием системы, объединяющей до тысячи и более микросенсоров со сложной системой анализа данных для проведения большого массива исследовательских работ (LaFratta and Walt, 2008). Система искусственного носа - это набор измерителей анализирующих газовую фазу, подобно настоящему носу (Knobloch et al., 2010).

Наблюдается заметный рост интереса в области определения бактерий в реальном времени, в широком диапазоне дисциплин, включая медицинский анализ, анализ продовольствия и мониторинг окружающей среды (Tothill 2001, Walt and Franz, 2001, Ivnitski et al., 1999). В ряде случаев для увеличения чувствительности измерений применяются магнитные частицы (Laschi et al., 2009) и «квантовые точки» (Roda et al., 2009)

Увеличение числа анализируемых образцов,- требующих проверки и КОНТРОЛЯ-, И ПОТребнОСТЬ, В ВЫСОКОЙ ЧуВСТВИТеЛЬНОСТИ, СКОРОСТИ И ТОЧНОСТИ' аналитических измерений стимулировали значительный-, интерес к развитию, биосенсоров в качестве мощной-и недорогой альтернативы по отношению к стандартным химическим и энзимологическим методам, используемым на сегодняшний день. Несмотря на использование биосенсоров на основе бактериальных клеток (Buchinger et al., 2010), практически нет данных по использованию' клеточных фрагментов или субклеточных структур для повышения чувствительности и специфичности- измерений субстратов. Отсутствуют также литературные данные и по использованию простых систем «искусственного носа» и систем на основе оптоволоконных пучков для идентификации бактерий. Перспективным направлением является разработка биосенсора для анализа антиоксидантной активности веществ с последующим изучением их влияния на защитные функции макроорганизма.

Микроскопический зонд двигается, как правило, построчно вдоль поверхности исследуемого образца, взаимодействуя с ним таким образом, что становится возможным детектировать количественную характеристику этого взаимодействия, которая, в конечном счёте, и несёт информацию о свойствах объекта. Передвижение зонда относительно поверхности образца осуществляет пьезосканер. Современные зондовые микроскопы обладают большим количеством режимов работы, позволяя изучать различные классы образцов. В настоящее время разработано более 20 модификаций СЗМ и их количество продолжает расти. В зависимости от типа зонда и детектируемого взаимодействия, выделяют следующие разновидности зондовой микроскопии: сканирующая- туннельная (измеряется сила тока туннелирования, электронов (Binning and Rohrer 1983), атомно-силовая (измеряется силовое взаимодействие атомов зонда и образца (Binning and Quate 1986), магнитно-силовая (измеряется магнитное взаимодействие (Saens et al., 1987), кельвин-микроскопия (измеряется контактная разность потенциалов (Nonnenmacher et al., 1991) и др.

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) принадлежит к семейству проксимальной зондовой микроскопии* для анализа поверхности и ее свойств на атомно-молекулярном уровне. В течение последних десятилетий достигнут большой прогресс в применении АСМ как инструмента изучения нанообъектов в микробиологии (Dufrene 2002, Dufrene et al., 2009). С помощью АСМ можно- получить - трехмерное изображение поверхностных ультраструктур на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях путем анализа взаимодействия между поверхностью и специальным наконечником — кантилевером. Однако все исследования с применением АСМ в основном сводились к наноразмерному анализу бактериальной поверхности. Не была осуществлена специфическая иммобилизация вирусов и бактериальных клеток и/или их нанофрагментов для анализа и идентификации бактерий.

Важным аспектом бионанотехнологии является определение бактерицидной активности наносоединений (Кс1 еХ. а!., 2006). Следует учитывать, что наряду с бактерицидной активностью наносоединений, важна также их роль в функционировании макрофагов при фагоцитозе патогенов.

Цель исследования

Основной целью работы является разработка и применение новых высокоэффективных методов анализа и идентификации бактерий на основе элетрооптических, биосенсорных и бионанотехнологических методов.

Задачи* исследования

1. Разработка электрооптического метода анализа и контроля физиологического состояния бактерий и их выживаемости в ходе биотехнологических процессов, а также идентификации микроорганизмов при специфическом взаимодействии с антителами и фагами.

4. Изучение возможности использования глюкозного биосенсора для контроля синтеза авермиктина.

6. Разработка биосенсора для определения антиоксидантной активности веществ.

8. Получение аффинных поверхностей для. идентификации бактерий и использование бионанотехнологического подхода-на основе, атомно-силовой микроскопии для высокоспецифичной идентификации микроорганизмов.

9. Изучение токсического действия наносоединений на микроорганизмы.

Научная новизна

Впервые предложено использовать цитоплазматические мембраны бактерий при конструировании новых биосенсоров для определения лактата и оценки бактериальной обсемененности свежего коровьего молока. Использованы новые подходы для определения антиоксидантной активности веществ и их роли в ходе инфекционного процесса. Разработан новый простой метод идентификации бактерий по анализу органических летучих компонентов.

Практическая значимость

Разработан электрооптический метод анализа выживаемости бактериальных клеток и оценки целостности клеточной оболочки в биотехнологических процессах, а также идентификации микроорганизмов (подана заявка на патент). Создана новая система биологического узнавания биосенсора на основе цитоплазматической мембраны бактерий, увеличивающая чувствительность определения лактата по сравнению с биосенсорами на основе бактериальных клеток. Реализована методология специфической визуализации прокариотических клеток и их фрагментов для сверхчувствительной идентификации микроорганизмов с помощью АСМ на основе аффинных поверхностей < (Патент России RU 2261279 С1). Разработанный подход широко используется Институтом Теоретической и Экспериментальной Физики (г. Москва) в вопросе исследования микроорганизмов с помощью атомно-силовой микроскопии. Разработан метод оценки бактерицидной активности наносоединеий для микроорганизмов и фагоцитарной активности макрофагов (готовится заявка на патент). Результаты работы применяются Национальным исследовательским технологическим университетом «МИСиС» при разработке новых видов нанопокрытий с учетом их бактерицидных свойств и функциональной активности фагоцитов.

Личный вклад соискателя

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были представлены: на Всесоюзной конференции «Липиды биологических мембран» (Ташкент, 1980 г.), на XI научной конференции по итогам НИР ВНИИ ПМ (Оболенск, 1986 г.), на Всесоюзной конференции «Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем» (Велегож, 1990 г.), на международной конференции «Развитие медицинского оборудования» (Подольск 1996 г.), на международном симпозиуме «Стресс и азотный обмен» (Москва, 1996 г.), на международном рабочем совещании НАТО «Быстрые методы анализа биологических материалов в окружающей среде» (Варшава, 1997 г.), на международном рабочем совещании НАТО «Новые направления* в развитии биосенсоров» (Киев, 199& г.), на международной конференции «Биокатализ-98» (Пущино, 1998 г.), на международной конференции «Биокатализ-2000» (Москва, 2000 г.), на Всероссийской- конференции «Проблемы^ медицинской и экологической биотехнологии», (Оболенск, 1999 г.), на международной конференции «Современные проблемы биохимии и биотехнологии бактерий» (Пущино, 2000 г.), на международной конференции «Биосенсоры 2000» (Сан-Диего, США, 2000 г.), на международной конференции «Окись азота: фундаментальные исследования и применение в клинике» (Эриче, Италия, 2001 г.), на международной конференции «IT + ME» (Гурзуф, 2003 г., 2007 г.), на международной конференции «Канадский биологический коллоквиум» (Москва, 2004 г.), на 5 международном совещании МНТЦ/Корея (Сеул, Корея, 2004 г.), на 37 международном совещании МНТЦ-Япония по наноматериалам (Цукуба, Япония, 2004 г.), на международной конференции «Нанотех» (Бостон, США, 2 006 г. ), на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ" (Оболенск, 2006 г.), на IX ежегодном зимнем совещании «Успехи в исследованиях на молекулярном уровне для биологии и нанонауки» (Линц, Австрия, 2007 г.), на Первой Всероссийской Школе-семинаре «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2007 г.), на Международной конференции «Сенсоры для окружающей среды, здравоохранения и безопасности (Виши, Франция, 2007 г.), на IV международной конференции «НаноБио и другие новые перспективные биотехнологии» (Пущино, 2007 г.), на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 2007 г.), на Международном совещании экспертов по разработке лекарств (Москва, 2007 г.), на Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008 г), на Международной научно-практической конференции «Нанотехнологии в сельском хозяйстве» (Москва, 2008 г.), на Международной конференции «Евромат-2009» (Глазго, Великобритания, 2009 г.) и на Семинаре «Производство и применение наноматериалов в России: токсикологическое воздействие и нормативные вопросы" (Москва, 2009 г.).

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Игнатов, Сергей Георгиевич

212 ВЫВОДЫ

2. Выявлены электрооптические изменения микробиологических систем, которые могут служить удобным инструментом идентификации микроорганизмов при? анализе взаимодействия бактерий со специфическими антителами или магнитными частицами с иммобилизованными специфическими антителами и фагами.

3. Разработаны биосенсоры с применением системы искусственного носа на основе: высокоплотных оптоволоконных; пучков для» бесконтактной идентификации микроорганизмов. Показана принципиальная; возможность использования? простой модификации метода спектрофотометрическош анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов либо- по выделению; ими летучих компонентов,' либо по их поглощению: из; окружающей среды. Кроме того, данный метод позволяет различить мутантыt' N. crassa, дефектные по метаболизму азота, от штамма дикого типа.

4. На примере синтеза антибиотика авермиктина бактериями S. avermitilis показана принципиальная возможность использования биосенсора для контроля; биотехнологического процесса. Биосенсорная система определения глюкозы на основе фермента глюкозооксидазы и кислородного датчика, была успешно применена для: оптимизации условий выделения данного антибиотика.

5. Впервые сконструирован оптоволоконный биосенсор на основе цитоплазматических мембран бактерий для анализа концентрации лактата и установлена корреляция между содержанием лактата и бактериальной обсемененностью коровьего молока.

9. Для поверхностей с мн ого функциональными биоактивными наноструктурными покрытиями и наноматериалов разработаны методы оценки токсичности с помощью микробиологических приемов. Разработана методика оценки бактерицидной активности макрофагов в присутствии наносоединений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные методы анализа и идентификации микроорганизмов направлены на повышение чувствительности и уменьшение времени процедур. С этой точки зрения применение электрооптического и биосенсорного подходов анализа и идентификации бактерий представляются весьма привлекательными благодаря нативности и чувствительности (для электрооптики), и чувствительности и быстроте (для биосенсоров), а применение бионанотехнологических подходов способствует не только визуализации процессов в нанометровом разрешении, но и увеличению чувствительности определения бактериальных клеток.

К сожалению, в силу многообразия существующих особенностей морфологии и физиологии клеток, не существует универсального рецепта использования^ данного метода для исследования любых клеток в любых условиях. Однако основные направления применения электрооптического метода анализа достаточно строго обоснованы. К их числу можно отнести:

-определение абсолютной концентрации клеток и фракционного состава клеточной суспензии при существовании электрофизической или морфометрической гетерогенности образца;

-контроль качества препаратов на основе целых клеток при их производстве и при хранении;

-анализ физиологических процессов в клетках по их электрофизическим проявлениям;

-идентификация состояния клеток в ходе технологического процесса при воздействии факторов замораживания и лиофилизации;

-определение и идентификация микроорганизмов с применением иммунологических подходов;

-определение механизмов действия на клеточные биотест-системы вновь синтезированных биологически активных веществ.

Перечень направлений использования электрооптического метода анализа клеток, и клеточных структур достаточно внушителен и он опирается на результаты завершенной объемной методической работы, литературные данные и итоги экспериментов. Результаты электрооптических исследований взаимодействия микроорганизмов с антителами или с частицами, модифицированными антителами, позволяют оценить возможность, совмещения достижений в области иммуноидентификации и электрофизических измерений: Электрооптическое исследование взаимодействия фаг-бактерия также может быть применено для обнаружения и идентификации- микроорганизмов. Следует остановиться- на некоторых ограничениях метода. В первую очередь они касаются размеров и формы клеток Клетки должны, обладать ассиметрией формы и иметь, размеры, не превышающие 5-8 мкм. Последнее ограничение в значительной степени «относится' к корректности используемой оптической модели и строгости интерпретации полученных результатов. Второе ограничение метода касается требований к электропроводности поддерживающей среды, которая не должна превышать величины 2-10 /Ом-м. Данное ограничение может быть преодолено с помощью достаточно простых методических или технических средств.

На основании итогов многолетней работы по разработке основ электрооптики микроорганизмов, можно сделать обобщающий вывод о создании теоретической и методической базы для широкого внедрения электрофизического метода анализа клеточных структур и определения гетерогенности клеточных популяций.

Современные методы анализа и идентификации микроорганизмов могут быть чувствительными, недорогими, с хорошими количественными и качественными характеристиками. Однако их применение требует обученного персонала и длительных временных процедур. Биосенсоры представляют собой- разумную альтернативу традиционным методам, сокращая процедуру измерения и улучшая ее качество. В данной работе были предприняты попытки расширения применения известных биосенсоров и создание новых биосенсорных элементов.

Ранее оптоволоконные биосенсоры применялись, в основном, для анализа процессов гибридизации ДНК, при оценке взаимодействия антиген -антитело или для изучения летучих органических соединений. В представленной работе предпринята попытка идентификации микроорганизмов путем, анализа летучих компонентов (ЛК) бактерий. Принцип определения бактерий основан на анализе: воздушного пространства над образцом- для определения ЛК компонентов с помощью системы искусственного носа. Разработаны два метода неконтактного определения' бактерий. Первый — простой анализатор летучих, компонентов (термостатируемый и для постоянного мониторинга) для определения бактерий-, и грибов, по анализу газов над микробными культурами. Метод основан на анализе спектральной оптической плотности сольвента после пропускания через него газовой смеси, образовавшейся над микробными культурами: Показана принципиальная возможность использования простой модификации, метода спектрофотометрического анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов либо по выделению ими ЛК, либо по их поглощению из окружающей среды. Кроме того, данный метод позволяет различить мутанты Кеигоярога сгаяБа, дефектные-по метаболизму азота, от штаммов дикого типа. По-видимому, пИ-2 и пЫ-б гены гриба связаны с образованием ЛК у этого организма. Второй метод - система искусственного носа на основе оптических волокон высокой плотности, позволяющая определять бактерии. Пористые силиконовые микросферы с флуоресцентным красителем, инкорпорированные в оптоволоконные системы, использовали для оценки изменения их флуоресценции после взаимодействия с ЛК. Анализ достоверности результатов эксперимента показал возможность применения системы искусственного носа на основе оптоволоконной системы для определения бактерий.

Известно, что максимальный выход антибиотика авермиктина наблюдается при полном потреблении глюкозы в среде роста микроорганизма. Биосенсор на глюкозу позволяет оперативно контролировать уровень содержания глюкозы в среде культивирования. Биосенсорная система определения глюкозы на основе фермента глюкозооксидазы и кислородного датчика была успешно применена для оптимизации условий выделения антибиотика авермиктина.

Известно, что применение микроорганизмов в качестве узнающего элемента биосенсора широко практикуется при анализе окружающей среды и пищи. Однако- микроорганизмы представляют собой- сложные полиферментные системы, а наличие сложных метаболических процессов мешает интерпретации сигнала. Поэтому разработка узнающего элемента биосенсора на основе цитоплазматической мембраны» микроорганизмов позволяет увеличить специфичность и чувствительность биосенсора. Более того, путем индукции ферментативных комплексов при культивировании» можно получить биосенсор на определенный субстрат.

Важным условием оценки качества биосенсора является повышение-стабильности биомодуля. Показано, что применение криоиммобилизации позволяет увеличить срок действия биомодуля. Использование другого подхода, основанного на получении мембран из дорматных бактерий, не привело к существенному улучшению стабильности биомодуля.

Особенно стоит отметить разработку биосенсора для оценки антиоксидантной активности. Влияние антиоксидантов на выживание бактериальных клеток в настоящее время не установлено. Поэтому применение биосенсора является удобным инструментом оценки антиоксидантной активности соединений для выяснения их роли в процессах переживания микроорганизмов в макрофагах.

Бионанотехнологические подходы в микробиологии - современный тренд в исследовательских направлениях, позволяющий детализировать процессы в микробиологии на нано-уровне. Применение атомно-силовой микроскопии позволило визуализаровать такие процессы, как реакция гемагглютинации и взаимодействие фагов с бактериальными клетками. Кроме того, данный подход с использованием антител позволил специфически визуализировать нанофрагменты бактерий. Следует учитывать, что работа в новых областях с применением наноподходов требует хотя бы предварительного изучения возможных рисков при работе с наноматериалами. Предварительные данные показали, что, несмотря на инертность наноповерхностей, в особых случаях мы можем наблюдать токсический и бактерицидный эффект наночастиц.

В заключение хочется сказать, что полученные результаты являются определенным этапом при изучении электрооптики, биосенсоров и наноподходов в микробиологии и могут являться отправной точкой для дальнейших исследований в данном направлении.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Игнатов, Сергей Георгиевич, Оболенск

1. Аненко М. И., Дубовик А. С. Прикладная оптика.-М.: Наука, 1971.-250 с.

2. Бирюков В. В., Кантере В. М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза.-М.: Наука, 1985.-291 с.

3. Борн М., Вольф Э. Основы оптики.-М.: Наука, 1960.-415 с.

4. Брезгунов В. Н., Бунин В. Д., Швец Н. В., Волошин А. Г., Светогоров Д. Е., Щепкина А. Н. Определение электрооптическим методом числа неповрежденных бактериальных клеток после экстремальных воздействий. // Микробиология.-1985.-Т.54.- № 4.- С. 616-620.

5. Войтылов В. В., Какорин С. А., Трусов А. А. Исследование анизотропии электропроводности коллоидов и суспензий, наведенной внешним электрическим полем. //Колл. журн.-1986.-Т.48.- № 1.-С. 139-141.

6. Войтылов В. В., Рудакова Е. В., Спартаков А. А., Толстой Н. А. Электрооптические явления в лиофобных коллоидах. Развитие метода вращающегося-поля, //Колл. журн.-1981.-Т.45.-№ 1.- С. 107-112

7. Войтылов В! Bs, Спартаков А. А., Трусов А. А. Электрооптический метод определения распределения дихроичных коллоидных частиц по размерам, учитывающий их коэффициенты ослабления. // Колл. журн.-1978.-Т.44.-№ З.-С. 604-606.

8. Войтылов В. В., Трусов А. А. Электрооптика и кондуктометрия полидисперсных систем.-Л: Изд. Ленинградского ун-та, 1989.-88 с.

9. Голубев О. А., Груббер И. М. Исследование ^-потенциала и иммуногенных свойств Salmonella typhi при различных условиях культивирования. // ЖМЭИ.-1972.- № 1.-С. 121-125.

10. Гузев В. С., Голубев В. И., Звягинцев Д. Г. Обнаружение микрокапсул у микроорганизмов и контролирование полноты их декапсулирования методом микроэлектрофореза. // Микробиология.-1972.-Т.41.-№ 1.- С. 115-120.

11. Гузев В. С., Звягинцев Д. Г. Микроэлектрофорез в микробиологии: Сб. Микробные метаболиты.-М., 1979.-С. 150-164.

12. Духин С. С. Электрооптика коллоидов.-Киев: Наукова думка, 1977.- 246 с.

13. Дягтерева Т. В., Кузнецова А. Н., Степанов Г. В., Терешкова Г. М. Поведение клеток хлореллы в неоднородном переменном электрическом поле: Сб. Управляемый биосинтез и биофизика популяции-Красноярск, 1969.-С. 68-70.

14. Дятлов И. А., Филиппов А. Ф., Космаенко О. М. Контроль биотехнологических процессов с использованием новых физико-химических методов анализа биообъектов: Сб. Достижения биотехнологии агропромышленному комплексу-Черновцы, 1991.-Т.2.-С. 160.

15. Емельянов В. М., Котов Н. В., Сахно Т. В., Чугунов А. В. Исследование движения дрожжевых клеток под действием электрического поля впрямоугольной ячейке замкнутого типа-Казан, хим.- технол. ин-т.- Казань, 1989.-С. 11.

16. Иванов А. И., Угодчиков Г. Н. Гетерогенность клеточных популяций М.: Наука, 1989.-266 с.

17. Кривошеин Ю. С., Федорина О. А., Сергиева В. И., Сарачан Т. А. Использование электрофореза в борат-полиольной системе для изучения гетерогенности популяции Escherichia coli. П Биофизика микробных популяций.-Красноярск, 1987.-С. 120.

18. Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е., Игнатов С.Г. Определение анизотропии поляризуемости бактериальных клеток при средней степени ориентации.// Коллоидный журнал. 1991. Т. 55. С. 365-367.

19. Леви А., Сикевиц Ф. Структура и функции клетки.-М.: Мир, 1971.-383 с.

20. Лопатин В. Н., Сидко Ф. Я. Введение в оптику клеточных суспензий — Новосибирск: Наука, 1988.- 202 с.

21. Мирошников Ф. И., Фомченков В:, М. Иванов А. Ю: Электрофизический анализ и разделение клеток-М^: Наука, 1986.- С.181

22. Октябрьский О; Н., Смирнова Г. В: Зависимость изменения редокс-потенциала среды при* остановке роста бактерий от характера клеточной поверхности и параметров среды. // Известия АН СССР; серия биологическая-1986.-№ 4.-С. 616-619.

23. Позмогова И. Н. Культивирование микроорганизмов в переменных условиях-М.: Наука, 1983.-104с.

24. Рабинович Ф. М. Кондуктометрический метод дисперсного анализа.- Л: Химия, 1970.-135 с.

25. Сигал В. Л. Количественная- интерпретация экспериментальных данных клеточного^электрофореза. //Лаб. Дело.-1985.-№2.-С. 123*.

26. Тамм И. Е. Основы теории электричества.-М.: Наука, 1976.-380 с.

27. Фомченков В. М., Денисюк А. И. Теоретическая модель высокочастотной релаксации электроориентации бактериальных клеток. // Электрон, обр. материалов-1980.-№ 2.-С. 65-70.

28. Фомченков В. М., Иванов А. Ю., Ажермачев А. К. Влияние поверхностно-активных веществ на электрические свойства бактериальных клеток. // Микробиология.-1986:-Т.55.-№ 4.-С.01-606.

29. Фомченков В. М.,. Мазанов А. Л., Брезгунов В. Н. Влияние дисперсии электрических параметров клеток на их ориентацию в переменном электрическом поле. // Биофизика.-1982.-Т.27.-С. 445-669.

30. Фомченков В. М., Мазанов А. Л., Брезгунов В. Н. Влияние дисперсии электрических параметров клеток на их ориентацию в переменном электрическом поле. //Биофизика.-1982.-Т.27.-С. 445-669.

31. Фролов Ю. Г. Курс коллоидной химии. Поверхностные явления и дисперсные системы.-М.: Химия, 1988.-464 с.

32. Хамер Г. Химическая технология и биотехнология. Принципы и применение.-М.: Мир, 1988.-С.395-465.

33. Хасанов В.В., Рыжова Г.Л.,. Мальцева Е.В. Методы определения антиоксидантов. //Химия раст. Сырья, 2004. Т.З. С. 63-75.

34. Хлебцов Н. Г. Матрица рассеяния для анизотропных эллипсоидов сравнимых с длиной волны света. // Оптика и спектроскопия.-1979.-Т.46.-№ 2.-С. 341-346.

35. Хлебцов Н. Г. Теоретическая интерпретация исследования электрического пробоя клеточных мембран электрооптическим методом. // Биолог, мембраны.-1993.-Т. 10.-№ 1.-С. 88-93

36. Хлебцов Н. Г. Теория дихроизма и двулучепреломления в аксиально ориентированных дисперсных системах: Препринт.-Ин-т биохимии и микробиол. раст. и микроорг. АН СССР-Саратов: изд. Саратовского ун-та.-1988.-34 с.

37. Хлебцов Н. Г., Кутузов*Ю. И. Угловые функции светорассеяния сфероидов в приближении Релея-Ганса-Стивенсона. // Оптика и спектроскопия.-1980.-Т.49:-№ 2.-С. 341-346.

38. Челидзе Т. Д., Кикнадзе В. Д., Кевлишвили Г. Е. Диэлектрическая спектроскопия крови. 1 Диэлектрические спектры нормальной крови человека. //Биофизика-1973 -Т. 18.-С. 932-935.

39. Шван Г. Диэлектроскопия биологических веществ в поле переменного тока. // Электроника и кибернетика в биологии и медицине.-М., 1963.- С. 71-108.

40. Швец Н'. В., Волошин А. Г., Брезгунов В. Н. Электрооптический метод оценки жизнеспособности микроорганизмов после сублимационной сушки. // Биотехнология.-1987.-Т.З.-№ 4.-С. 528-531.

41. Шифрин К. С. Введение в оптику океана.-Л: Гидрометеоиздат, 1983.- 180 с.

42. Эккерт Р. Разделение клеток иммунной системы. // Иммунологические методы. / Под ред. Г. Фримеля.-М.: Медицина, 1987.-С. 226-254.

43. Abdel-Hamid I., Ivnitski D., Atanasov P., Wilkins E. (19990 Flow-through immunofiltration assay system for rapid detection of E. coli 0157:H7. Biosens. Bioelectron. -1999.-V. 14.- P: 309-316.

44. Albert K.J., Lewis N.S., Schauer C.L., Sotzing G.A., Stitzel S.E., Vaid T.P., Walt D.R. Cross-reactive sensor arrays. Chem. Rev.- 2000.- V.100.- P. 2595-2626.

45. Allen P. M., Allen H., Hill O., Walton N. J. Surface modifiers for the promotion of direct electrochemistry of cytochrome с J. Electroanal. Chem.-1984.-V. 178,-N. l.-P. 69-86.

46. Armstrong F.A. Probing metalloproteins by voltammetry. Structure & Bonding, Springer Berlin / -Heidelberg.-1990.-V.72.-P. 137-221.49.

Информация о работе

Игнатов, Сергей Георгиевич
доктора биологических наук
Оболенск, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов с использованием бионанотехнологических подходов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы