Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль свободнорадикального окисления в процессах микробиологической деградации нефти

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль свободнорадикального окисления в процессах микробиологической деградации нефти"

На правах рукописи

Сазыкин Иван Сергеевич

РОЛЬ ПРОЦЕССОВ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ НЕФТИ

03.01.04 - биохимия 03.02.08 - экология

2 9 МАР 2012

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 2012

005012888

Работа выполнена в НИИ биологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону)

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Внуков Валерий Валентинович

доетор биологических наук Чистяков Владимир Анатольевич

доктор биологических наук, профессор Корниенко Галина Гавриловна (г. Ростов-на-Дону)

доктор биологических наук, профессор Хоружая Татьяна Алексеевна (г. Ростов-на-Дону)

Ведущая организация:

Ставропольский государственный университет

Защита диссертации состоится «12» апреля 2012 г, в «10» часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1, акт. зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148.

Автореферат разослан «05» марта 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, с.н.с.

Е.В. Асланян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Увеличение потребления топлива и смазочных материалов, различных пластических масс и других продуктов нефтехимии и, как следствие, постоянный рост добычи и объемов транспортировки нефти связаны с растущим загрязнением окружающей среды нефтью и нефтепродуктами.

Для ускорения восстановления загрязненных нефтяными углеводородами экосистем необходимо использовать не только технические средства, но и биологические резервы микробных сообществ, так как окисление углеводородов микроорганизмами - это ведущий фактор процесса биодеградации нефти.

В связи с интенсивным развитием нефтегазового комплекса в Южном регионе изучение штаммов микроорганизмов, участвующих в деструкции нефти в экосистемах Азовского и Черного морей, приобретает особую значимость.

До настоящего времени считалось, что основным, практически единственным, путем биологической деградации соединений нефти является ферментативное окисление углеводородов (Van Hamme et al., 2003). Однако для высокомолекулярных и полиароматических углеводородов с пятью и более кольцами, а также смол и асфальтенов, не известны механизмы ферментативной деградации, в лучшем случае, описан феномен их кометаболизма.

В последние годы постепенно накапливались данные о том, что микроорганизмы Moiyr производить активные формы кислорода, которые потенциально способны окислять нефтепродукты (van Beilen, Funhoff, 2005; Stephen et al., 2007; Imlay, 2008; Kato et al., 2009). В свете имеющейся к настоящему моменту информации, изучение неферментативных механизмов биодеградации нефти с участием активных форм кислорода и свободных радикалов представляется черезвычайно актуальным. Это поможет глубже понять процессы, протекающие при биоремедиации, и использовать их при борьбе с нефтяными загрязнениями наиболее эффективным образом.

Цель работы: исследовать динамику бактериоценозов нефтеокисляющих микроорганизмов в Керченском проливе после аварии танкера «Волгонефть-139» в ноябре 2007 г. и изучить роль процессов свободнорадикального окисления в микробиологической деградации нефти.

Задачи исследования:

выделение и идентификация чистых культур нефтеокисляющих микроорганизмов из проб воды и донных отложений, отобранных на месте аварии танкера в Керченском проливе, а также в зоне загрязнения акватории Азовского моря нефтепродуктами (нефть, мазут, дизельное топливо, льяльные воды) и определение уровня биодеградации различных фракций нефти выделенными штаммами нефтеокисляющих микроорганизмов;

оценка количественных изменений бактериоценозов нефтеокисляющих микроорганизмов в Керченском проливе и прилегающих акваториях Черного и Азовского морей в период с ноября 2007 года по июнь 2008 года включительно;

определение уровня свободнорадикальных процессов и антиоксидантной защиты методами хемилюминесценции и в системе биологической детекции с биосенсором Е. соИ \1G1655 (р5ох8-]их), а также активности ферментов антиоксидантнош комплекса (каталазы и супероксиддисмутазы) нефтеокисляющих микроорганизмов, выращиваемых в присутствии и в отсутствии нефти;

исследование влияния различных антиоксидантов на биодеградацию нефти выделенными штаммами нефтеокисляющих микроорганизмов;

изучение путей биодеградации соединений нефти, для которых неизвестны ферментные системы утилизации, в процессе инкубации с исследуемыми нефтеокисляющими микроорганизмами.

Научная новизна результатов. Впервые исследован и описан неферментативный путь биодеградации соединений нефти с участием активных форм кислорода.

Впервые описан феномен ингибирования антиоксидантами микробиологического окисления нефти, что служит прямым доказательством участия активных форм кислорода в микробиологической деструкции нефти.

Исследована и количественно охарактеризована биодеградация различных фракций нефти (углеводородов, смол и асфальтенов) 14 штаммами нефтеокисляющих микроорганизмов.

Исследована и количественно охарактеризована индукция супероксиддисмутазы некоторыми углеводородами у штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов АсИготоЬа^ег ху1о$ох1йап5 и АстеюЬа^ег ссйсоасейст.

Исследована динамика изменений бактериоценоза нефтеокисляющих

микроорганизмов в течение длительного периода (более 10 месяцев) на месте аварии танкера «Волгонефть-139» в Керченском проливе и на прилегающих акваториях Азовского и Черного морей.

Научно-практическая значимость работы. Из воды и донных отложений Керченского пролива выделено 14 штаммов, относящихся к 8 видам нефтьдеградирующих микроорганизмов.

Создана плотная селективная питательная среда и получен патент на изобретение № 2415919 «Способ выделения нефтеокисляющих микроорганизмов из окружающей среды».

Отобраны активные штаммы нефтеокисляющих микроорганизмов, которые можно применять для биоремедиации нефтяных загрязнений. Два наиболее активных деструктора углеводородов нефти из выделенных штаммов бактерий — Achromobacter xylosoxidans № 4 и Acinetobacter calcoaceticus № 13 приняты на национальное патентное депонирование во Всероссийскую Коллекцию Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП «ГосНИИГенетика» под регистрационными номерами ВКПМ В-10344 и ВКПМ В-10353.

Подготовлены рекомендации по использованию нефтеокисляющих бактерий Керченского пролива для получения препарата для борьбы с нефтяным загрязнением на Юге России.

Создана база данных по нефтеокисляющим микроорганизмам Керченского пролива (таксономическая принадлежность, биохимические свойства).

В результате проведенных исследований заложены теоретические основы нового подхода к изучению процесса биодеградации нефти и предложена схема путей свободнорадикальной биодеградации как легких, так и тяжелых фракций нефти (углеводородов, смол и асфальтенов).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В воде и донных отложениях Керченского пролива присуствуют микроорганизмы - нефтедеструкторы, относящиеся к видам Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas anguilliseptica, Micrococcus luteus, Kocuria rosea, Kocuria rhizophila, Shewanella putrefaciens, Exiguobacterium undae. Наиболее активными нефтедеструкторами из 14 выделенных штаммов являются два: Achromobacter xylosoxidans № 4 и Acinetobacter calcoaceticus № 13.

2. После аварии танкера «Волгонефть-139» в ноябре 2007 г. отмечен интенсивный процесс микробиологической трансформации углеводородов, что

подтвеждает высокая численность нефтеокисляющих бактерий, зарегистрированная в поверхностных горизонтах воды в Таманском заливе и в районе косы Тузла. Титр нефтеокисляющих микроорганизмов в поверхностных горизонтах воды Керченского пролива оставался достаточно высоким до мая 2008 года и несколько снизился только летом. Осенью показатели численности нефтеокисляющего бактериоценоза оставались практически неизменными, что свидетельствует о длительном характере процессов биодеградации нефтепродуктов после данной аварии.

3. Культивирование изучаемых штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов Acinetobacter calcoaceticus на среде, содержащей нефть в качестве единственного источника углерода, приводит к увеличению содержания в клетках как прооксидантных веществ, так и антиоксидантов, а выращивание нефтьдеградирующих микроорганизмов Achromobacter xylosoxidans и Acinetobacter calcoaceticus в среде, содержащей декан, гексадекан и сырую нефть, приводит к значительной индукции супероксиддисмутазы.

4. Культивирование штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter calcoaceticus и Bacillus subtilis ВКПМ B-1895 с антиоксидантами (аскорбиновая кислота, маннитол, а-токоферола ацетат и ионол) подавляет биодеградацию нефти, в отдельных случаях вплоть до практически полного ее ингибирования.

5. В дополнение к ферментативному, существует свободнорадикальный путь биодеградации соединений нефти. При этом могут происходить процессы, сходные с перекисным окислением липидов.

Апробация работы. Результаты диссертации доложены на Всероссийской конференции «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2009); III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, 2009); Научно-практической конференции грантодержателей Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (Краснодар, 2009); Международной конференции «Антропогенная трансформация природной среды» (Пермь, 2010); 4-й Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (Томск, 2011); 5-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием

«Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2011); IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011) и Ученых Советах НИИ биологии ЮФУ.

Конкурсная поддержка работы. Автор как ответственный исполнитель участвовал в работе по гранту № 2.1.1/5232 «Исследование свободнорадикальных механизмов биодеградации углеводородов» аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, среди которых 6 статей в изданиях, рекомендованных ВАК, 1 патент и 1 электронная база данных по нефтеокисляющим микроорганизмам.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 178 страницах печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложений; содержит 15 таблиц, 11 рисунков. Приложения включают 28 таблиц и 14 рисунков. Список литературы включает 197 источников, из них 125 на иностранных языках. Структура исследований приведена на Рис. 1.

Автор выражает глубокую признательность за помощь в работе и научные консультации к.б.н., доценту М.А. Сазыкиной.

Рис. 1. Структура исследований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе были использованы штаммы микроорганизмов - деструкторов нефти, выделенные из воды и донных отложений, отобранных на месте аварии танкера «Волгонефть-139» в Керченском проливе в ноябре 2007 г., а также в зоне загрязнения акватории Азовского моря нефтепродуктами. Также в работе использовался штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-1895 и биосенсор Escherichia coli MG1655 (pSoxS-lux).

Чистые культуры микроорганизмов выделяли после инкубации в жидкой минеральной среде, содержащей нефть в качестве единственного источника углерода, методом пассирования на чашках Петри с нефтяным агаром.

Идентификация нефтеокисляющих микроорганизмов была проведена по морфологическим, биохимическим и купьтуральным признакам, а также путем секвенирования генов 16S рибосомальной РНК.

Нефтеокисляющие микроорганизмы для проведения модельных опытов выращивали в конических колбах с минеральной средой Ворошиловой-Диановой, содержащей 1-2% сырой нефти Октябрьского месторождения Ростовской области или индивидуальных углеводородов (декан и гексадекан) в качестве единственного источника углерода, в течение 7 суток при температуре 30°С и скорости вращения платформы 220 об/мин.

Для определения ингибирования окисления углеводородов сырой нефти и пофракционной биодеградации нефти микроорганизмами в питательную среду вносили аскорбиновую кислоту, маннит, а-токоферола ацетат и ионол. Конечная концентрация антиокидантов составляла 1 мМ.

Количественное определение пофракционной биодеградации компонентов нефти проводили спектрофотометрическим и флюориметрическим методами (ФР.1.31.2005.01511, 2005; ФР. 1.31.2005.01512, 2005), а также весовым методом.

Измерение оптических характеристик растворов проводили на спектрофотометре Beckman DU 800, ИК-спектрофотометре IR-270 фирмы Hitachi, УФ-спектрофотометре UV-2450 фирмы Shimadzu, спектрофлюориметрах RF-510 и RF-5301PC фирмы Shimadzu.

Бесклеточные экстракты микроорганизмов готовили с использованием физиологического раствора (0,85% раствор NaCl с добавлением 0,1% Тритона Х100) и смеси органических растворителей ацетон-этанол (1:1). Экстракты были получены путем растирания бактериальной массы с измельченным стеклом в присутствии экстрагента в течение 15 минут в фарфоровой ступке при температуре +4 °С.

Определение активности хемилюминесценции (XJ1) в бактериальных экстрактах в системе Н202-люминол индуцированной (Шестаков и др., 1979) и Ре(П)-индуцированной (Шерстнев, 1990) XJI проводили на установке для регистрации индуцированной XJI на базе сцинцилляционного счетчика масс-спектрометра 22028 RFT (Германия).

Водные экстракты были протестированы с биосенсором Escherichia coli MG1655 (pSoxS-lux) в присутствии 110"2 М параквата дихлорида, который эффективно вызывает окислительный стресс в клетках данного биосенсора. Измерения бактериальной люминесценции проводились на микропланшетном люминометре LM-01T (Immunotech).

Активность каталазы определяли по методу Королюк (Королкж и др., 1988). Активность супероксидцисмутазы (СОД) определяли по методу Сироты (Сирота, 1999).

Статистическую обработку проводили по стандартным биометрическим формулам. Величины доверительных интервалов рассчитывали для р<0,05. Для оценки статистической значимости различий использовали t-критерий Стьюдента и непараметрический критерий Манна-Уитни (Владимирский, 1983; Лакин, 1990). Все рассчеты производили с использованием программы Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Динамика нефтеокисляющих бактериоценозов в Керченском проливе и

прилегающих акваториях после аварии танкера в ноябре 2007 г.

Общая численность нефтеокисляющих бактерий (ноябрь-декабрь 2007 г.) в воде в Азовского моря изменялась от 0 до 1103 клеток/мл и в среднем составила у поверхности 1102 клеток/мл, на горизонте 5 м и у дна - около 0,5-101 клеток/мл. В воде Черного моря численность бактерий-нефтедеструкторов в среднем составляла 2-Ю2 клеток/мл. Численность углеводородокисляющих бактерий в донных отложениях Азовского моря составляла в среднем 1 • 102 клеток/г (от 1 ■ 101 до 1 -103 клеток/г), Черного моря — 2,5 ■ 102 клеток/мл (от 1 ■ 102 до 1 • 103 клеток/г).

В воде Керченского пролива численность нефтеокисляющих микроорганизмов изменялась от 0 до МО6 кл./мл. В поверхностном горизонте численность бактерий была максимальной и в среднем составила 3-104 клеток/мл. С увеличением глубины титр бактерий существенно снижался (до 0,5 lO'-l lO2 клеток/мл). Максимально высокая численность нефтеокисляющих бактерий (1-105—1-106 клеток/мл) зарегистрирована в поверхностном горизонте воды у косы Тузла и в Таманском заливе. Высокий титр нефтеокисляющих

бактерий, обнаруженный на ряде станций в Керченском проливе (на уровне 1Ю4-1106 клеток/г), свидетельствовал об активно протекающих в поверхностном горизонте воды процессах биотрансформации углеводородов нефтяного происхождения.

В мае 2008 г. в пробах воды из Темрюкского залива и Керченского пролива численность нефтедеструкторов у поверхности оставалась достаточно высокой и составляла 4104 клеток/мл. В придонном горизонте эти показатели были ниже (на уровне 2-Ю2 клеток/мл). Численность нефтеокисляющих бактерий в донных отложениях достигала средних значений 3 105 (от 1-Ю3 до 110б) клеток/г. Летом в указанном районе численность нефтеокисляющих бактерий несколько снизилась - средний титр бактерий в воде колебался от 3-Ю1 до З-Ю3 клеток/мл, а в донных отложениях - от 1-Ю2 до 1-Ю5клеток/г. До конца осени показатели численности оставались практически неизменными.

Идентификация выделенных нефтеокисляющих микроорганизмов

Из данных, представленных в таблице 1, видно, что всего было выделено 14 штаммов, относящихся к 8 видам нефтеокисляющих бактерий. Из воды выделено 6 штаммов микроорганизмов, из донных отложений - 8.

Все культуры являются каталазоположительными. Из 14 культур только 4 - оксидазоотрицательные, остальные 10 - оксидазоположительные.

На основании морфологических, культуральных и биохимических признаков бактерий была проведена идентификация выделенных штаммов согласно определителю бактерий Берджи (Определитель бактерий Берджи, 1997).

Окончательная идентификация штаммов методом анализа сиквенсов вариабельных участков 16S рДНК проведена на базе ФГУП «ГосНИИГенетика».

Среди выделенных микроорганизмов были идентифицированы представители 7 родов микроорганизмов: Pseudomonas (2 культуры), Achromobacter (4 культуры), Acinetobacter (2 культуры), Exiguobacterium (1 культура), Kocuria (3 культуры), Micrococcus (1 культура), Shewanella (1 культура).

Наличие плазмид у изучаемых штаммов нефтеокисляющих бактерий

Плазмиды были обнаружены у восьми из четырнадцати исследованных штаммов. Все обнаруженные плазмиды имели приблизительно одинаковый размер, который составлял 10-11 тысяч пар оснований. Полученные бесплазмидные варианты показали способность к росту на минеральной среде Ворошиловой-Диановой с добавлением сырой нефти в качестве единственного

источника углерода. Таким образом, плазмиды, найденные в исследованных штамах, по всей видимости, не несут уникальных копий генов, необходимых для утилизации углеводородов нефти.

Таблица 1.

Результаты идентификации нефтеокисляющих микроорганизмов, выделенных в Керченском проливе Азовского моря

№ штамма Видовое название штаммов нефтеокисляющих бактерий Гомология вариабельных участков 16S рДНК

1 Exiguobaclerium undae 97%

2 Achromobacter xylosoxidans 99%

3 Kocuria rosea 98%

4 Achromobacter xylosoxidans 99%

5 Achromobacter xylosoxidans 97%

6 Acinetobacter calcoaceticus 97%

7 Achromobacter xylosoxidans 97%

8 Kocuria rosea 97%

9 Pseudomonas anguilliseptica 97%

10 Shewanella putrefaciens 97%

11 Pseudomonas anguilliseptica 97%

12 Micrococcus luteus 98%

13 Acinetobacter calcoaceticus 97%

14 Kocuria rhizophila 97%

Пофракционная утилизация нефти изучаемыми нефтеокисляющими

микроорганизмами

Основной задачей этого этапа работы являлось определение того, какие именно компоненты нефти и в какой степени подвергаются биодеградации со стороны изучаемых штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов.

Для всех 14 выделенных бактериальных штаммов было проведено определение степени биодеградации различных фракций нефти. Для сравнения использовали штамм Bacillus subtilis ВКПМ-1895, полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.

Было определено, что все исследованные штаммы в процессе инкубирования утилизировали смолы и асфальтены. Таким образом, происходила биодеградация тяжелых фракций нефти, для которых не описаны ферментные метаболические системы.

На фоне биодеградации нефти всеми исследованными штаммами было отмечено увеличение концентраций углеводородов и асфальтенов для некоторых штаммов (табл. 2). Для смол, независимо от штамма, отмечено

падение их концентраций. Для асфальтенов при инкубации с большинством штаммов также отмечено уменьшение концентраций, тогда как инкубация со штаммами №№ 1, 2, 3 и 6 приводила к значительному достоверному (до 55%) росту количества асфальтенов. Содержание углеводородов в процессе инкубации с десятью штаммами из пятнадцати исследованных снижалось, в некоторых случаях более чем на 10% (штаммы №№ 4, 5, 7, 13 и ВКПМ В-1895).

Таблица 2.

Изменение концентраций компонентов нефти в ходе экспериментов с

различными штаммами микроорганизмов, %

Штамм Углеводороды Смолы Асфальтены Л нефтяных компонентов

№1 -1,3 -32,7* +46,6* -3,9*

№2 +0,7 -32,7* +55,2* -2,0

№3 +1,1 -32,7* +53,4* -1,7

№4 -14,7* -36,9* -8,6 -17,3*

№5 -14,1* -35,7* -6,9 -16,7*

№6 -9,6* -35,0* +32,8* -11,5*

№7 -12,9* -36,9* -6,9 -15,8*

№8 -3,1 -16,3* -3,4 -4,7*

№9 -7,4* -24,7* -3,4 -9,4*

№10 -0,5 -32,7* -17,2* -4,2*

№ 11 +2,1 -33,5* -17.2* -2,9

№12 +2,5 -32,7* -15,4* -2,4

№13 -16,7* -17,1* -15,4* -16,6*

№14 -0,7 -33,5* -8,6 -5,1

ВКПМ В-1895 -12,8* -14,4* -6,9 -12,7*

Снижение концентрации обозначено знаком «-», повышение - знаком «+». * - Статистически значимый эффект изменения концентрации соединений нефти, ^-критерий (р<0,05).

При анализе биодеградации нефти наблюдали заметную утилизацию микроорганизмами смол (молекулярная масса 600-1000) и асфальтенов (молекулярная масеа 1000-10000), которую невозможно объяснить при помощи ферментативных процессов метаболизма углеводородов нефти. Но, зная о продукции активных форм кислорода (АФК) нефтеокисляющими микроорганизмами, можно прийти к предположению об участии свободнорадикальных процессов в биодеградации нефти и повышении ее биологической доступности.

НгОг-индуцированная люминолзависимая хемилюминесценцня экстрактов нефтеокисляющих микроорганизмов Ас'таоЪасШ са1соасеНсш

Для проверки гипотезы об участии свободных радикалов в микробиологической биодеградации нефтепродуктов были исследованы водные и ацетон-этанольные экстракты штаммов Лс1пе1оЬас1ег ссйсоасейст № 6 и

№ 13, выращенных на питательной среде без нефти и среде, содержащей 2% нефти.

При исследовании водных экстрактов данных штаммов, выращенных на среде с нефтью, было обнаружено усиление Н202-индуцированной люминолзависимой ХЛ, как по высоте быстрой вспышки (208-700%), так и по светосумме за 100 и 500 сек свечения по сравнению с экстрактами микроорганизмов, выращенных без нефти.

Исследование ацетон-этанольных экстрактов данных штаммов, выращенных на среде, содержащей нефть, также свидетельствовало об усилении интенсивности Н202-индуцированной люминолзависимой ХЛ, проявляющейся в увеличении светосуммы свечения за 500 сек на 53% для штамма № 6 и 250% - для штамма № 13.

Таким образом, выращивание бактерий данных штаммов на среде, содержащей нефтепродукты, приводило к увеличению прооксидантных свойств экстрактов бактериальных клеток и, очевидно, к усилению продукции активных форм кислорода у данных микроорганизмов.

Ее(Н)-индуцированная люминолзависимая хемилюминесценция экстрактов нефтеокисляющих микроорганизмов АшШоЬасХег сакоасейсю

Для выяснения баланса между уровнем свободнорадикального окисления и антиоксидантной активностью исследовали влияние водных экстрактов штаммов АстеюЬас1ег сакоасеНст № 6 и № 13 (выращенных на среде без нефти и среде, содержащей нефть) на окисление фосфолипидов яичного желтка в системе Ре(П)-индуцированной ХЛ.

Было выявлено увеличение светосуммы быстрой вспышки на 63% для штамма № 6 и на 41% - для штамма № 13, что свидетельствовало об увеличении содержания гидроперекисей липидов. В то же время сокращался латентный период на 74% для штамма № 6 и на 87% - для штамма № 13, что указывало на возрастание скорости окисления ионов двухвалентного железа. Увеличивалось время выхода на максимум свечения и светосуммы до наступления максимума свечения медленной вспышки для штамма № 6 на 15% и 26%, для штамма № 13 - на 140% и 400%, соответственно. Возрастала высота медленной вспышки на максимуме свечения для штамма № 6 на 15% и для штамма № 13 - на 300%.

Таким образом, водные экстракты данных штаммов, выращенных на среде, содержащей нефть, вызывали увеличение медленной вспышки, что свидетельствовало об усилении инициирования свободных радикалов.

Исследование ХЛ ответа ацетон-этанольных экстрактов

микроорганизмов, выращенных на среде, содержащей нефть, в отличие от выращенных на питательной среде без нефти, выявило возрастание антиоксидантных свойств для обоих штаммов, выразившееся в удлинении латентного периода на 29-33% и уменьшении остальных показателей XJL

Влияние бесклеточных экстрактов нефтеокисляющих микроорганизмов

Acinetobacter calcoaceticus на биосенсор Е. coli MGI 655 (pSoxS-lux)

Водные экстракты исследуемых штаммов были протестированы в биологической системе детекции с биосенсором Е. coli MG 1655 (pSoxS-lux), реагирующим на повышение уровня супероксид-анион радикала в клетке, то есть на вещества, индуцирующие окислительный стресс.

Экстракты бактериальной массы этих штаммов, выращенных на среде без нефти, значительно снижали уровень генерации АФК, вызванный паракватом в клетках Sox-lux биосенсора.

Экстракт штамма № 6 снижает ответ Sox-lux биосенсора при воздействии параквата в 10 раз (Рис. 2а), а экстракт штамма № 13 - в 8 раз (Рис. 26). Экстракты клеток этих штаммов, выращенных на среде с нефтью, не снижали окислительный стресс по сравнению с контролем (клетки Sox-lux биосенсора, обработанные паракватом).

Таким образом, можно утверждать, что клетки обоих штаммов Acinetobacter calcoaceticus при выращивании в среде, содержащей сырую нефть, образовывали прооксиданты, провоцирующие окислительный стресс в клетках Sox-lux биосенсора и продуцирующие активные формы кислорода. С другой стороны, эти же штаммы производили антиоксиданты, защищающие клетки биосенсора от окислительного стресса и снижающие XJI-ответ при индукции Fe(II). По всей видимости, функцией этих антиоксидантов является защита нефтьдеградирующих микроорганизмов от производимых ими же АФК.

Ингибирование биодеградации нефти антиоксидантами

Для изучения ингибирования антиоксидантами биодеградации углеводородов нефти были отобраны наиболее активные деструкторы углеводородов (штаммы №№ 4, 5, 6, 7, 13 и Bacillus subtilis ВКПМ В-1895).

Антиоксиданты вносили в среду Ворошиловой-Диановой с добавлением 2% сырой нефти в конечной концентрации 1мМ.

В таблице 3 приведены изменения (в %) количества углеводородов, смол, асфальтенов и суммы компонентов нефти, происходящие в результате инкубации в течение семи дней с различными микроорганизмами без антиоксидантов и в присутствии 1мМ аскорбиновой кислоты, маннитола, а-токоферола ацетата и ионола.

отн. ед. 70000

штамм № 6

отн. ед.

450000:

400000

350000

300000;

250000 \

200000|

150000i / // //

100000

50000:

0-— 0 1

штамм № 13

Рис. 2. Ответ биосенсора Е. coli MG1655 (pSoxS-lux) на действие метилвиологена в присутствии водных экстрактов Acinetobacter calcoaceticus, штамма № 6 и штамма № 13. Обозначения: люминесценция биосенсора под действием метилвиологена при отсутствии экстрактов (контроль) - 1, в присутствии экстракта штамма № 6 и штамма № 13, выращенных на среде с нефтью - 2,

и без нефти - 3.

Таблица 3.

Изменение концентрации компонентов нефти в отсутствии и при воздействии антиоксидантов в ходе экспериментов с различными штаммами микроорганизмов (%). Контролем служила стерильная проба без антиоксидантов, обработанная так же, как опытные пробы.

Штамм Антиоксидант Углеводороды Смолы Асфальтены 2 нефтяных компонентов

АскготоЬасІег хуіоьохісіат №4 без антиоксиданте -14,7* -36,9* -8,6 -17,3*

аскорбиновая к-та -3,2 -17,9* -19,0* -5,5*

маннитол -6,5* -18,6* -29,3* -8,6*

а-токоферол -11,8* -16,7* -27,6* -12,7

ионол -3,3* -24,7* -29,3* -6,7*

АсЬготоЬасієг хуіо.чохісіат №5 без антиоксиданта -14,1* -35,7* -6,9 -16,7*

аскорбиновая к-та +0,8 -7,6* -17,2 -0,8

маннитол +0,5 -7,2 -22,4* -1,0

а-токоферол +0,2 -6,5 -27,5* -1,3

ионол -1,4 -7,2* -24,1* -2,6

ЛапеїоЬасІег саісоасеисия №6 без антиоксиданта -9,6* -35,0* +32,8* -11,5*

аскорбиновая к-та -10,9* -28,1* -15,5 -13,2*

маннитол -15,4* -31,6* -27,5* -17,8*

а-токоферол -13,5* -19,4* -15,5 -14,3*

ионол -3,5 -19,4* -15,5 -5,8*

АсіпеіоЬасіег саісоасеіїсш № 13 без антиоксиданта -16,7* -17,1* -15,5* -16,6*

аскорбиновая к-та -8,7* -15,9* -17,2* -9,7*

маннитол -10,5* -15,5* -17,2* -11,2*

а-токоферол -8,0* -14,1* -24,1* -8,8*

ионол +0,6 -8,0* -18,9* -0,9

Васіїїш .чиЬііїіа ВКПМВ-1895 без антиоксиданта -12,8* -14,4* -6,9 -12,7*

аскорбиновая к-та -14,9* -35,4* -3,4 -13*

маннитол -11,4* -39,1* 0 -14,7*

а-токоферол -7,0* -33,9* +1,7 -9,9*

ионол -7,3* -36,1* +1,7 -10,7*

* - статистически значимое отличие от контроля (р<0,05).

Безусловным ингибитором биодеградации нефти для тестируемых штаммов являлся ионол, активность которого колебалась от полного подавления биодеградации углеводородной фракции и почти полного подавления

биодеградации нефти штаммом № 13 до подавления деструкции углеводородов на 43% и незначительного подавления деструкции нефти в целом на 2 % в случае Bacillus subtilis ВКПМ В-1895.

Диапазон активности других антиоксидантов оказался гораздо шире — от полного ингибирования биодеструкции углеводородной фракции и нефти в целом (штамм № 5) до полуторакратной стимуляции деградации углеводородов и нефти в целом (штамм № 6 в присутствии маннитола).

В большинстве случаев у штаммов активных нефтеокисляющих микроорганизмов видов Achromobacter xylosoxidans и Acinetobacter calcoaceticus антиоксиданты подавляли утилизацию смол, но при этом стимулировали биодеградацию асфальтенов. Напротив, у штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-1895 присутствие антиоксидантов (кроме аскорбиновой кислоты) вызывало полное прекращение деградации асфальтенов, стимулируя при этом утилизацию смол более чем в два раза.

Исследованные штаммы Achromobacter xylosoxidans оказались более чувствительными к действию антиоксидантов, так как все протестированные соединения в той или иной степени (иногда полностью) предотвращали окисление углеводородов. Кроме того, у них была гораздо более выражена реакция на введение в среду антиоксидантов (например, ингибирование биодеградации смол) по сравнению со штаммами Acinetobacter calcoaceticus.

Индукция каталазы и СОД углеводородами нефти в процессе инкубации с нефтеокисляющими микроорганизмами Achromobacter xylosoxidans и Acinetobacter calcoaceticus

Синтез каталазы и супероксиддисмутазы индуцируют те активные формы кислорода, на элиминацию которых нацелена их энзиматическая активность. Таким образом» активность каталазы и СОД может служить надежным индикатором присутствия в среде псрокеида водорода и супероксид-анион радикала. Результаты определения индукции СОД и каталазы у штаммов Achromobacter xylosoxidans Ж№ 4, 5 и 7 и Acinetobacter calcoaceticus Ж№ 6 и 13 приведены в таблице 4.

Максимальный уровень индукции каталазы достигался при инкубации бактерий в полноценной питательной среде, сопровождающейся бурным размножением клеток, во время которого имело место заметное повышение уровня генерации пероксида водорода, от негативного действия которого бактериальная клетка должна себя защитить. Результатом являлась индукция каталазы, активность которой в 5—20 раз превышала показатели при инкубировании в минеральной среде, содержащей углеводороды.

Таблица 4.

Удельная активность каталазы и супероксиддисмутазы и количество микробного белка нефтеокисляющих микроорганизмов после 24-часовой инкубации с углеводородами, нефтью и разбавленной полной питательной средой.

Штамм Вид анализа Белок (мкг/мл) Каталаза (мМЕ/мг белка) СОД (у.е./мг белка*мин)

субстрат среднее стандарт ное отклонение доверительный интервал (р<0,05) среднее стандарт ное отклонение доверительный интервал (р<0,05) среднее стандарт ное отклонение доверительный интервал (р<0,05)

Achromo-bacter xylosoxidans штамм N° 04 1/3 МПБ 824,27 17,05 19,30 250,53 30,56 34,58 0,38 0,12 0,14

1% декана 23,33 0,58 0,65 29,97 2,18 2,47 37,71 1,98 2,24

1% гексадек. 24,67 2,31 2,61 41,37 2,86 3,23 29,71 0,89 1,00

1% нефти 26,67 3,79 4,28 51,25 2,06 2,33 33,52 4,45 5,03

Achromo-bacter xylosoxidans штамм № 05 1/3 МПБ 678,70 5,04 5,70 331,40 3,15 3,57 0,49 0,06 0,06

1% декана 91,67 1,53 1,73 37,38 1,26 1,43 7,47 0,43 0,48

1% гексадек. 94,67 7,51 8,49 33,90 5,96 6,74 5,36 2,83 3,20

1% нефти 97,33 7,09 8,03 40,91 5,23 5,92 7,77 0,96 1,08

Achromo-bacter xylosoxidans штамм Яз 07 1/3 МПБ 711,70 53,36 60,38 276,87 17,70 20,03 0,54 0,09 0,10

1% декана 80,33 2,08 2,36 29,93 7,43 8,40 7,37 0,75 0,84

1% гексадек. 84,00 1,00 1,13 29,51 3,74 4,24 6,63 0,88 1,00

1% нефти 86,00 6,56 7,42 35,96 3,54 4,01 8,07 0,55 0,62

Acinetobacter calcoaceticus штамм № 06 1/3 МПБ 391,23 15,02 16,99 229,37 15,55 17,60 0,97 0,62 0,70

1% декана 29,33 8,08 9,15 29,73 15,65 17,70 27,65 8,78 9,94

1% гексадек. 185,17 16,03 18,14 15,67 4,19 4,74 2,86 0,33 0,37

1% нефти 45,67 1,53 1,73 14,59 2,52 2,85 15,58 0,72 0,82

Acinetobacter calcoaceticus штамм № 13 1/3 МПБ 361,90 23,82 26,96 246,70 15,71 17,78 1,64 0,06 0,07

1% декана 20,00 1,00 1,13 18,22 4,94 5,59 39,98 0,80 0,90

1% гексадек. 152,53 4,58 5,18 17,79 1,51 1,71 4,04 0,26 0,29

1% нефти. 26,33 1,15 1,31 13,66 2,54 2,87 31,49 0,99 1,12

В условиях, когда в среде культивирования единственным источником углерода является нефть или индивидуальные углеводороды, по-видимому, запускался механизм генерации супероксид-анион радикала, о чем свидетельствовала мощная индукция СОД, достигавшая 99-кратного уровня у Achromobacter xylosoxidans (штамм № 4) при инкубации в минеральной среде с деканом.

Причем, чем лучше на данном субстрате рос исследуемый штамм нефтеокисляющего микроорганизма, тем ниже был уровень индукции супероксиддисмутазы.

Схема путей свободиорадикалыюй биодеградации фракций нефти

На основании данных литературы и результатов собственных исследований можно предложить следующую схему путей свободно-радикальной биодеградации углеводородов (СРДУ), дополняющую предложенную ранее Young и МсЕпепу (2001) схему перекисного окисления липидов (ПОЛ).

В процессе СРДУ также, как и в случае ПОЛ, логично выделить 4 этапа: инициирование цепи реакций, продолжение, разветвление, обрыв цепи (Рис.3).

Образовавшиеся при СРДУ радикалы могут взаимодействовать, образуя молекулярные продукты, в том числе, свободно метаболизируемые бактериями органические кислоты, альдегиды и спирты. Обрыв цепи возможен также через взаимодействие радикалов с молекулами антиоксидантов.

Рис. 3 - Схема свободно-радикальной биодеградации углеводородов. Обозначения: 1 - углеводород; 2 - инициация; 3 - углеводородный радикал; 4 - углеводородный пероксильный радикал; 5 - разветвление; 6 - органическая гидроперекись (за основу взята схема из статьи Young I.S. и МсЕпепу J., 2001, с изменениями автора).

НО

R

г

Свободнорадикальная биодеградация компонентов нефти, кроме использования их в качестве пищевых субстратов, может приводить к возрастанию удельной доли высокомолекулярных компонентов за счет рекомбинации органических радикалов, и в этот процесс могут быть вовлечены даже углеводороды.

Выводы

1. Из воды и донных отложений, отобранных на месте аварии танкера «Волгонефть-139» в Керченском проливе в ноябре 2007 г., а также в зоне загрязнения акватории Азовского моря нефтепродуктами, выделено 14 штаммов нефтьдеградирующих бактерий, идентифицированных как: Pseudomonas anguilliseptica (2 штамма); Achromobacter xylosoxidans (4 штамма); Acinetobacter calcoaceticus (2 штамма); Exiguobacterium undae (1 штамм), Kocuria rosea (2 штамма), Kocuria rhizophila (1 штамм), Micrococcus luteus (1 штамм), Shewanellaputrefaciens (1 штамм).

2. Высокая численность нефтеокисляющих бактерий, обнаруженная после аварии танкера в Керченском проливе, свидетельствует об активно протекающих микробиологических процессах деградации углеводородов, источником которых явились разлившиеся в результате аварии нефтепродукты. Повышенный титр нефтеокисляющих микроорганизмов, наблюдавшийся в Керченском проливе весной и летом 2008 г., свидетельствует о длительном характере процессов биодеградации не фтепродукгов.

3. Рост штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов на среде, содержащей нефть или индивидуальные углеводороды, приводит к усилению свободнорадикальных процессов, а также к значительному росту содержания супероксид-анион радикала и антиоксидантов в бактериальных клетках.

4. Выращивание штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов на среде с нефтью в качестве единственного источника углерода в присутствии антиоксидантов (аскорбиновая кислота, маннитол, а-токоферола ацетат и ионол) приводит к подавлению утилизации нефти, вплоть до практически полного ее ингибирования. Особенно эффективным среди протестированных антиоксидантов являлся ионол.

5. Выявлены эффекты микробиологической деградации смол и асфальтенов нефти, для утилизации которых не известны пути метаболизма, опосредованные ферментами. Существует свободнорадикальный путь микробиологического разрушения соединений нефти, протекающий

наряду с ферментативными процессами ее биодеградации. Особенностью свободнорадикальной биодеградации соединений нефти является способность их радикалов к рекомбинации с образованием более высокомолекулярных продуктов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации, в журналах рекомендованных ВАК

1. Сазыкин И.С. Ферментативные и неферментативные механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами / Сазыкин И.С., Чистяков В.А., Сазыкина М.А. // Труды Кубанского государственного аграрного университета. 2009. Т. 6. С. 50-57 (0,88 пл., личн. вк. 80%).

2. Сазыкин И.С. Проблемы развития методологии мониторинга токсичности природных сред: необходимость синтеза / Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Латышев A.B. // Проблемы региональной экологии. 2009. Т. 5. С. 152-156 (0,33 пл., личн. вк. 25%).

3. Сазыкин И.С. Разложение нефти микроорганизмами. Экологические аспекты / Сазыкин И.С., Сазыкина М.А., Чистяков В.А. // Известия Высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. 2009. Т. 6. С. 8893 (0,63 пл., личн. вк. 80%).

4. Сазыкин И.С. Характеристика процессов самоочищения морской среды с участием нефтеокисляющих микроорганизмов в районе аварии танкера в Керченском проливе / Цыбульский И.Е., Корпакова И.Г., Белова JI.B., Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Афанасьев Д.Ф., Коленко М.А. // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2010. № 1. С. 78-82 (0,54 пл., личн. вк. 20%).

5. Сазыкин И.С. Утилизация углеводородов, смол и асфальтенов нефтеокисляющими микроорганизмами Керченского пролива / Сазыкин И.С., Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Кленкин A.A., Павленко Л.Ф. // Вода: Химия и Экология. 2011. № 1. С. 29-34 (0,29 пл., личн. вк. 60%).

6. Сазыкин И.С. Хемилюминесценция экстрактов нефтеокисляющих бактерий Acinetobacter calcoaceticus и их действие на PsoxS'::lux биосенсор / Сазыкин И.С., Прокофьев В.Н., Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Внуков В.В. // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47, № 4. С. 443-447 (0,24 пл., личн. вк. 50%).

Патент:

7. Сазыкин И.С. Пат. 2415919. Российская Федерация, МПК C12N1/20. Способ выделения нефтеокисляющих микроорганизмов из окружающей среды / Сазыкин И.С., Сазыкина М.А., Чистяков В.А.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Южный федеральный университет". - 2009134737/10, заявл. 16.09.09; опубл. 2011.04.10, Бюл. № 10. - 9 е.: табл. 1 (0,37 п.л., личн. вк. 80%).

Программный комплекс:

8. Сазыкин И.С. Программный комплекс «База данных по нефтеокисляющим микроорганизмам Керченского пролива (таксономическая принадлежность, биохимические свойства)»: свидетельство о регистрации электронного ресурса № 16517 / Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Чистяков В.А., Денисенко Ю.В. № 50201050308; заявл. 15.12.2010; выдано 12.01.2011. (личн. вк. 40%).

Статьи и тезисы в других изданиях:

9. Сазыкин И.С. Выделение ассоциаций микроорганизмов - деструкторов нефти, участвующих в биоремедиации Азовского моря и характеристика их биохимических и генетических свойств / Цыбульский И.Е., Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Афанасьев Д.Ф., Коленко М.А. // Материалы конференции получателей грантов регионального конкурса Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края «ЮГ» «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края». -Краснодар: ООО «Просвещение - Юг», 2008. С. 156 (0,04 п.л., личн. вк. 30%).

10. Сазыкин И.С. Выделение ассоциаций нефтеокисляющих бактерий, участвующих в биоремедиации Азовского моря / Сазыкина М.А., Цыбульский И.Е., Сазыкин И.С., Коленко М.А., Чистяков В.А. // Сборник научных трудов «Экологические проблемы промышленных городов» / под ред. Т.И. Губиной. Саратов. 2009. С.58-60 (0,12 п.л., личн. вк. 25%).

11. Сазыкин И.С. Действие живых клеток и экстрактов бактериальной массы двух штаммов нефтеокисляющих бактерий Acinetobacter sp. на биосенсор Е. coli MG 1655 (pSoxS-lux) / Сазыкин И.С., Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Манухов И.В. // Материалы III Международной научно-

практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, 1-4 октября 2009 г. / под ред. Т.П. Шкурат, А.Е. Панича. - Ростов-на-Дону: Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2009. С. 28-30 (0,12 п.л., личн. вк. 80%).

12. Сазыкин И.С. Неферментативные механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами / Сазыкин И.С., Сазыкина М. А., Чистяков В.А., Манухов И.В. // Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии, 26-30 октября 2009 г., Пущино-Тула» / под ред. Т.А. Решетиловой, В.А. Алферова - Пущино: ИБФМ РАН, 2009. С. 52-54 (0,12 п.л., личн. вк. 80%).

13. Сазыкин И.С. Выделение ассоциаций микроорганизмов - деструкторов нефти, участвующих в биоремедиации Азовского моря и характеристика их биохимических и генетических свойств / Цыбульский И.Е., Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Афанасьев Д.Ф., Коленко М.А. // Тезисы научно-практической конференции грантодержателей Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края». - Краснодар: ООО «Просвещение - Юг», 2009. С. 107 (0,04 пл., личн. вк. 25%).

14. Сазыкин И.С. Влияние антиоксидантов на микробиологическую деградацию компонентов нефти / Сазыкин И.С., Сазыкина М.А., Чистяков В.А. // Материалы Международной конференции «Антропогенная трансформация природной среды» (18-21 октября 2010 г.) / Перм. Гос. Ун-т. Пермь, 2010. Т. 1, Ч. 2 С. 184-189 (0,24 п.л., личн. вк. 80%).

15. Сазыкин И.С. Усиление Н202-люминол индуцированной хемилюминесценции суспензии клеток нефтеокисляющих микроорганизмов А. ху1о$ох'к1апх и А. са1соасеИс№ при инкубировании с различными углеводородами / Сазыкин И.С., Сазыкина М.А. // Проблемы и перспективы современной науки. Т. 3, № 1. Межвузовский сб. науч. работ с материалами трудов участников 4-й Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (Томск 22 февраля - 4 марта, 2011). Томск: СибГМУ, 2011. С. 76 (0,04 пл., личн. вк. 80 %).

16. Сазыкин И.С. Биодеградация различных фракций нефти микроорганизмами, выделенными на месте аварийного разлива нефти в Керченском проливе / Сазыкин И.С., Сазыкина М.А. // Сборник научных

трудов на основе материалов 5-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (г. Саратов 12-14 апреля 2011 г.) / под ред. Е.И. Тихомировой. Т. 2. Саратов: СГТУ, 2011. С. 152-154 (0,12 пл., личн. вк. 80%).

17. Сазыкин И.С. Антиоксидантное ингибирование биодеградации нефти нефтеокисляющими микроорганизмами / Сазыкин И.С., Сазыкина М.А. // Материалы IV Междунар. науч.-практич. конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 22-25 сентября 2011 г.) Ростов н/Д: Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2011. С. 29-30 (0,08 пл., личн. вк. 80 %).

18. Сазыкин И.С. Изучение индукции супероксидцисмутазы и каталазы нефтьдеградирующих микроорганизмов углеводородами нефти / Сазыкин И.С., Сазыкина М.А., Москвичев Д.В.// Материалы IV Междунар. науч.-практич. конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 22-25 сентября 2011 г.) Ростов н/Д: Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2011. С. 30 (0,04 пл., личн. вк. 70%).

Перечень использованных сокращений

АФК — активные формы кислорода

ВКПМ — Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов

ПОЛ — перекисное окисление липидов

РНК - рибонуклеиновая кислота

рДНК - ДНК, кодирующая рибосомальную РНК

СОД — супероксидцисмутаза

СРДУ — свободно-радикальная биодеградация углеводородов ХЛ — хемилюминесценция

Подписано в печать 28.02.2012. Формат 60х84І/іб-Бумага офсетная. Печать офсетная. Объем 1 ф.п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 30.

ИПОПИЮФУ: 344082, г. Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, 33.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сазыкин, Иван Сергеевич, Ростов-на-Дону

61 12-3/764

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Южный федеральный университет"

На правах рукописи

Сазыкин Иван Сергеевич

УДК: (579.26; 579.222)

РОЛЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЫЮГО ОКИСЛЕНИЯ В ПРОЦЕССАХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ НЕФТИ

Специальность 03.01.04. - биохимия; 03.02.08.-экология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Внуков В.В.; доктор биологических наук Чистяков В.А.

Ростов-на-Дону - 2012

Содержание

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 6

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................7

Актуальность исследования....................................................................7

Цель и задачи исследования....................................................................8

Научная новизна........................................................................................9

Положения, выносимые на защиту........................................................10

Научно-теоретическое и практическое значение результатов

исследования..............................................................................................11

Апробация работы....................................................................................12

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................14

1.1 Использование микробных сообществ как наиболее перспективный путь ремедиации нефтяного загрязнения....................14

1.2 Свободнорадикальные процессы и их регуляция в биологических системах..........................................................................................17

1.2.1 Характеристика основных форм свободных радикалов........................17

1.2.2 Регуляция свободнорадикальных процессов....................................20

1.3 Современные представления о ферментативной и неферментативной деградации нефти и других поллютантов............23

1.3.1 Ферментативные процессы деградации углеводородов нефти............25

1.3.2 Генерация микроорганизмами АФК как возможная основа неферментативных механизмов деградации нефти..............................30

1.4 Механизмы неферментативной утилизации нефти как путь повышения эффективности биоремедиации нефтяных загрязнений . 35

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..................................39

2.1 Штаммы и питательные среды................................................................39

2.1.1 Определение численности нефтеокисляющих микроорганизмов.... 39

2.1.2 Штаммы микроорганизмов, использованные в экспериментах и их выделение........................................................................................39

2.1.3 Идентификация выделенных штаммов микроорганизмов................41

2.1.4 Использованные питательные среды........................... 43

2.2 Постановка экспериментов с исследуемыми штаммами микроорганизмов..............................................................................44

2.2.1 Элиминация плазмид из штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов при помощи бромистого этидия............... 44

2.2.2 Выращивание нефтеокисляющих микроорганизмов для . определения пофракционной биодеградации компонентов нефти... 44

2.2.3 Выращивание нефтеокисляющих микроорганизмов, для определения индукции ферментов антиоксидантного комплекса (СОД и каталазы)........................................... 45

2.2.4 Определение торможения антиоксидантами окисления углеводородов нефти нефтьдеградирующими микроорганизмами.. 45

2.3 Приготовление бесклеточного экстракта микроорганизмов........ 46

2.4 Выделение плазмидной ДНК............................... 47

2.5 Проведение электрофореза ДНК в агарозном геле................ 48

2.6 Определение пофракционной биодеградации компонентов нефти.. 48

2.7 Анализ бактериальных экстрактов в системе Н202-люминол-идуцированной и Ре(П)-идуцированной хемилюминесценции..... 52

2.8 Определение антиоксидантных свойств бесклеточных экстрактов исследуемых микроорганизмов при помощи биосенсора Escherichia coli MG1655 (pSoxS-lux)........................... 53

2.9 Определение концентрации белка............................. 54

2.10 Определение активности СОД................................ 54

2.11 Определение активности каталазы............................. 55

2.12 Статистическая обработка и достоверность результатов........... 56

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.......................... 57

3.1 Выделение и идентификация изучаемых штаммов

нефтеокисляющих микроорганизмов и динамика изменения бактериоценозов нефтеокисляющих микроорганизмов в Керченском проливе (2007-2008 гг)......................... 57

3.1.1 Динамика изменения бактериоценозов нефтеокисляющих микроорганизмов в Керченском проливе и прилегающих акваториях Азовского и Черного морей после аварии танкера в ноябре 2007 г....................................................................................57

3.1.2 Выделение штаммов из воды и донных отложений Азовского моря. 63

3.1.3 Идентификация выделенных штаммов микроорганизмов.......... 65

3.2 Определение присутствия плазмид у изучаемых штаммов нефтеокисляющих бактерий.................................. 76

3.3 Утилизация нефти бесплазмидными вариантами штаммов

А. calcoaceticus № 6 и № 13................................... 78

3.4 Пофракционная утилизация нефти изучаемыми нефтеокисляющими микроорганизмами........................ 78

3.5 Н202-индуцированная люминолзависимая хемилюминесценция бесклеточных экстрактов нефтеокисляющих микроорганизмов Acinetobacter calcoaceticus.................................... 86

3.6 Ре(П)-индуцированная люминолзависимая хемилюминесценция бесклеточных экстрактов нефтеокисляющих микроорганизмов Acinetobacter calcoaceticus.................................... 88

3.7 Влияние бесклеточных экстрактов нефтеокисляющих микроорганизмов Acinetobacter calcoaceticus на биосенсор

Е. coli MG1655 (pSoxS-lux).................................. 91

3.8 Влияние инкубации с живыми клетками нефтеокисляющих микроорганизмов Acinetobacter calcoaceticus на биосенсор Е. coli MGI655 (pSoxS-lux) в присутствии бензола..................... 93

3.9 Ингибирование биодеградации нефти антиоксидантами........... 94

3.10 Изменение активности супероксиддисмутазы и каталазы в процессе инкубации нефтеокисляющих микроорганизмов Achromobacter xylosoxidans и Acinetobacter calcoaceticus в среде с индивидуальными углеводородами и сырой нефтью............ 101

3.11 Схема путей свободнорадикальной биодеградации различных фракций нефти........................................... 110

3.12 Особенности свободнорадикальной биодеградации смоло-

асфальтеновых фракций нефти................................ 112

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................ 115

ВЫВОДЫ................................................. 119

Список использованной литературы........................... 121

Приложения............................................... 140

Приложение А. Результаты идентификации нефтеокисляющих

микроорганизмов посредством секвенирования 16s рДНК........ 140

Приложение Б. Справка о депонировании штамма Achromobacter

xylosoxidans № 4................................................................175

Приложение В. Справка о депонировании штамма Acinetobacter

calcoaceticus № 13.......................................... 176

Приложение Г. Предложения по использованию нефтеокисляющих бактерий Керченского пролива для получения препарата для борьбы с нефтяным загрязнением на Юге России................ 177

Перечень использованных сокращений

АФК - активные формы кислорода

ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов

КОЕ - колониеобразующая единица

МЕ А - Мальц-агар

МПА - мясо-пептонный агар

мтДНК- митохондриальная ДНК

HCT - нитросиний тетразолий

ПАВ - поверхностно-активные вещества

ПАУ - полиароматические углеводороды

ПОЛ - перекисное окисление липидов

рДНК - ДНК, кодирующая рибосомальную РНК

СОД - супероксиддисмутаза

СРДУ - свободнорадикальная биодеградация углеводородов ХЛ - хемилюминесценция

ЦПХ - микробиологическая среда, содержащая цетилпиридиний хлорид ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

CY20S - агар Чапека с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозы

CYA -агар Чапека с дрожжевым экстрактом

DNA - дезоксирибонуклеиновая кислота

G25N -нитратный агар с глицерином

Ша - килодальтон

LB - среда Луриа-Бертрани

NAD(P)H - никотинадениндинуклеотидфосфат восстановленный NADH; НАДФН - никотинадениндинуклеотид восстановленный OF - среда окисление-ферментация (среда Хью - Лейфсона) pda - картофельно-глюкозный агар

RDBII - база данных по рибосомам, проект II (RibosomalDatabaseProjectll) rDNA- ДНК, кодирующая рибосомальную РНК SDS - додецил сульфат натрия

Введение

Актуальность исследования

Научно-техническое развитие принесло человечеству кроме новых возможностей и растущего качества жизни целый ряд серьезных экологических проблем. Увеличение потребления энергии, топлива и смазочных материалов, различных пластических масс и других продуктов нефтехимии и, как следствие, постоянный рост добычи и объемов транспортировки нефти связаны с растущим загрязнением окружающей среды нефтью и нефтепродуктами (Atlas, Bartha, 1992; Миронов, 2002; Prince, 1993; Swannell et al., 1996).

Для ускорения восстановления загрязненных нефтяными углеводородами экосистем необходимо использовать не только технические средства, но и биологические резервы микробных сообществ, так как окисление углеводородов микроорганизмами - это ведущий фактор процесса биодеградации нефти.

В связи с интенсивным развитием нефтегазового комплекса в Южном регионе изучение штаммов микроорганизмов, участвующих в деструкции нефти в экосистемах Азовского и Черного морей, приобретает особую значимость.

Биоремедиация — наиболее низкозатратный и, при этом, наиболее безопасный и естественный для природных экосистем способ очистки от нефтяных загрязнений (Коронелли, 1996; Логинов и др., 2000; Черных и др., 2004).

Для эффективного использования какого-либо биологического механизма необходимо детальное знание о процессах, которые при этом происходят. До настоящего времени считалось, что основным, практически единственным путем биологической деградации соединений нефти является ферментативное окисление углеводородов. Энзиматическая утилизация углеводородов микроорганизмами подробно изучена за последние четыре десятилетия (Van Hamme et al., 2003). При этом для высокомолекулярных углеводородов, полиароматических углеводородов с пятью и более кольцами, а также смол и асфальтенов не известны механизмы ферментативной деградации, в лучшем случае, описан феномен их кометаболизма.

В последние годы появились работы, посвященные комплексной химико-

биологической обработке нефтезагрязненных почв, при которой происходило свободнорадикальиое окисление соединений нефти (Goi et al., 2006; Ndjou'oua, Cassidy, 2006; Palmroth et al, 2006; Rojas-Avelizapa et al.,2005; Ye et al., 2006). При этом показана ее более высокая эффективность по сравнению с биологической очисткой.

Параллельно постепенно накапливались данные о том, что сами микроорганизмы могут производить пероксид водорода и другие виды активных форм кислорода в весьма заметных количествах (Imlay, 2008; Stephen et al., 2007; van Beilen, Funhoff, 2005; Porasuphatanaa et al., 2003; Kato et al., 2009).

В свете имеющейся к настоящему моменту информации, изучение неферментативных механизмов биодеградации нефти с участием активных форм кислорода и свободных радикалов представляется черезвычайно актуальным. Это поможет глубже понять процессы, протекающие при биоремедиации, и использовать их при борьбе с нефтяными загрязнениями наиболее эффективным образом.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было исследовать динамику бактериоценозов нефтеокисляющих микроорганизмов в Керченском проливе после аварии танкера «Волгонефть-139» в ноябре 2007 г. и изучить роль процессов свободнорадикального окисления в микробиологической деградации нефти.

Основные задачи, решенные в процессе выполнения работы:

выделение и идентификация чистых культур нефтеокисляющих микроорганизмов из проб воды и донных отложений, взятых с места аварии танкера в Керченском проливе в ноябре 2007 г., а также в зоне загрязнения акватории Азовского моря нефтепродуктами (нефть, мазут, дизельное топливо, льяльные воды) и определение уровня биодеградации различных фракций нефти выделенными штаммами нефтеокисляющих микроорганизмов;

оценка количественных изменений бактериоценозов

нефтеокисляющих микроорганизмов в Керченском проливе и прилегающих

акваториях Черного и Азовского морей в период с ноября 2007 года по июнь 2008 года включительно;

определение уровня свободнорадикальных процессов и антиоксидантной защиты методами хемилюминесценции и в системе биологической детекции с биосенсором Е. coli MGI655 (pSoxS-lux), а также активности ферментов антиоксидантного комплекса (каталазы и супероксиддисмутазы) нефтеокисляющих микроорганизмов, выращиваемых в присутствии и в отсутствии нефти;

исследование влияния различных антиоксидантов на биодеградацию нефти выделенными штаммами нефтеокисляющих микроорганизмов;

изучение путей биодеградации соединений нефти, для которых неизвестны ферментные системы утилизации в процессе инкубации с исследуемыми нефтеокисляющими микроорганизмами.

Научная новизна

Впервые исследован не описанный ранее неферментативный путь биодеградации соединений нефти с участием активных форм кислорода.

Впервые описан феномен ингибирования антиоксидантами микробиологического окисления нефти, что служит прямым доказательством участия активных форм кислорода в микробиологической деструкции нефти.

Исследована и количественно охарактеризована биодеградация различных фракций нефти (углеводородов, смол и асфальтенов) 14 штаммами нефтеокисляющих микроорганизмов.

Исследована и количественно охарактеризована индукция ферментов антиоксидантного комплекса (супероксиддисмутазы и каталазы) некоторыми углеводородами у штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов Achromobacter xylosoxidans и Acinetobacter calcoaceticus.

Исследована динамика изменений бактериоценоза нефтеокисляющих микроорганизмов в течение длительного периода (более 10 месяцев) на месте

аварии танкера «Волгонефть-139» в Керченском проливе и на прилегающих акваториях Азовского и Черного морей.

Положения, выносимые на защиту

1. В воде и донных отложениях Керченского пролива присуствуют микроорганизмы - нефтедеструкторы, относящиеся к видам Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas anguilliseptica, Micrococcus luteus, Kocuria rosea, Kocuria rhizophila, Shewanella putrefaciens, Exiguobacterium undae. Наиболее активными нефтедеструкторами из 14 выделенных штаммов являются два: Achromobacter xylosoxidans № 4 и Acinetobacter calcoaceticus № 13.

2. После аварии танкера «Волгонефть-139» в ноябре 2007 г. отмечен интенсивный процесс микробиологической трансформации углеводородов, что подтвеждает высокая численность нефтеокисляющих бактерий, зарегистрированная в поверхностных горизонтах воды в Таманском заливе и в районе косы Тузла. Титр нефтеокисляющих микроорганизмов в поверхностных горизонтах воды Керченского пролива оставался достаточно высоким до мая 2008 года и несколько снизился только летом. Осенью показатели численности нефтеокисляющего бактериоценоза оставались практически неизменными, что свидетельствует о длительном характере процессов биодеградации нефтепродуктов после данной аварии.

3. Культивирование изучаемых штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов Acinetobacter calcoaceticus на среде, содержащей нефть в качестве единственного источника углерода, приводит к увеличению содержания в клетках как прооксидантных веществ, так и антиоксидантов, а выращивание нефтьдеградирующих микроорганизмов Achromobacter xylosoxidans и Acinetobacter calcoaceticus в среде, содержащей декан, гексадекан и сырую нефть, приводит к значительной индукции супероксиддисмутазы.

4. Культивирование штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter calcoaceticus и Bacillus subtilis ВКПМ B-1895 с антиоксидантами (аскорбиновая кислота, маннитол, а-токоферола ацетат и

ионол) подавляет биодеградацию нефти, в отдельных случаях вплоть до практически полного ее ингибирования.

5. В дополнение к ферментативному, существует свободнорадикальный путь биодеградации соединений нефти. При этом могут происходить процессы, сходные с перекисным окислением липидов.

Научно-теоретическое и практическое значение результатов исследования

Из воды и донных отложений Керченского пролива выделено 14 штаммов нефтьдеградирующих микроорганизмов.

Исследована динамика изменений бактериоценоза нефтеокисляющих микроорганизмов в течение длительного периода (более 10 месяцев) на месте аварии танкера в Керченском проливе и на прилегающих акваториях Азовского и Черного морей.

Создана плотная селективная питательная среда и получен патент на изобретение № 2415919 «Способ выделения нефтеокисляющих микроорганизмов из окружающей среды» (Сазыкин и др., 2011-6).

Для всех выделенных штаммов микроорганизмов количественно охарактеризована биодеградация различных фракций нефти (углеводородов, смол и асфальтенов). Использование такого подхода позволяет отбирать перспективные для биоремедиации штаммы и содавать ассоциации взаимодополняющих микроорганизмов, ориентированных на биодеградацию различных фракций нефтепродуктов.

Отобраны активные шаммы нефтеокисляющих микроорганизмов, которые можно применять для биоремедиации нефтяных загрязнений. Два наиболее активных деструктора углеводородов нефти из выделенных штаммов бактерий -АскготоЪааег ху\о$ох1с1ат № 4 и Асте1оЪас1ег са1соасейсш № 13 приняты на национальное патентное депонирование во Всесоюзную Коллекцию Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП «ГосНИИГенетика» под

регистрационными номерами ВКПМ В-10344 и ВКПМ В-10353 (Приложения Б и В).

Подготовлены «П